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INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER

Pós-Graduação em Oncologia

Brunna Luiza Misael Alves

PAPEL DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO HA-G NA INFECÇÃO E PERSISTÊNCIA DO HPV EM UMA COORTE DE GESTANTES HIV+ DO RIO DE

JANEIRO

Orientador: Dra. Esmeralda Augusta Jardim Machado Soares

RIO DE JANEIRO

2014

Ministério da Saúde

Instituto Nacional de Câncer

Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu

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BRUNNA LUIZA MISAEL ALVES

Papel do antígeno leucocitário humano HLA-G na infecção e persistência do HPV

em uma coorte de gestantes HIV+ do Rio de Janeiro

Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Câncer como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Oncologia

Orientador: Dra. Esmeralda Augusta Jardim Machado Soares

RIO DE JANEIRO

2014




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AUTOR: Brunna Luiza Misael Alves

PAPEL DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO HLA-G NA INFE CÇÃO E PERSISTÊNCIA DO HPV EM UMA COORTE DE GESTANTES HIV+ DO RIO DE

JANEIRO

ORIENTADOR: Dra. Esmeralda Augusta Jardim Machado S oares

Aprovada em: 26 / 03 / 2014

EXAMINADORES:

Prof. Dr. Miguel Angelo Martins Moreira

Prof. Dr. André Felipe Andrade dos Santos

Prof. Dra. Sheila Coelho Soares Lima

Prof. Dra. Claudia Esther Alicia Rocio Hassan – Suplente I

Prof. Dra. Anke Bergmann – Suplente II

RIO DE JANEIRO

2014




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DEDICATÓRIA

À minha família e aos meus amigos por

sempre acreditarem e me incentivarem a

ir mais longe

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AGRADECIMENTOS

Aos pacientes que aceitaram participar do estudo;

Ao Dr. Hector Seuánez pelo espaço cedido no laboratório e aos pesquisadores e funcionários do laboratório de genética, por toda ajuda e pela manutenção da ordem no laboratório;

Ao CNPq, FAPERJ e INCT do Câncer pelo apoio financeiro;

À Dra. Esmeralda Soares, minha orientadora, pelos ensinamentos, pela confiança, por todas as oportunidades e principalmente por acreditar que somos capazes;

Ao Dr. Marcelo Soares por todos os conhecimentos transmitidos, pela atenção e cuidado e por nos incentivar a sermos sempre melhores no que fazemos;

À Dr. Anke Bergmann por todo o auxílio indispensável nas análises estatísticas, por toda a gentileza e disponibilidade durante todo o processo de finalização da dissertação, meus sinceros agradecimentos;

À Fabi Germano, Val, Mirela, Sabrina e Livinha por todo o carinho, por todas as aulas que recebemos e principalmente por ajudarem a transformar o INCA na nossa segunda casa;

À Adriana e Mariana por estarem sempre presentes e dispostas a ajudar, por permanecerem do meu lado na “semana mais corrida do século”, por todas as purificações, placas e por todo o consolo tão importantes em vários momentos;

À Juliana, por ser mãe e amiga, pela paciência de ensinar mil vezes o que precisasse desde a iniciação até hoje, por toda a ajuda e apoio, sempre cheios de carinho e atenção, enfim por estar ao meu lado em todos os momentos, sejam os de comemoração ou os de completa indecisão;

À Isabel, minha gêmea postiça, sempre cheia de carinho e compreensão, por tantas vezes me dar à mão e um ombro amigo, por confiar tanto em mim e por essa amizade tão bonita e sólida que construímos. Sei que a cada passo você estará lá para me apoiar e da mesma forma sempre te incentivarei a ir cada vez mais longe, enfim por ser a sempre querida Isabel Maria;

À Amannda por ser meu porto seguro carioca, por sempre me ensinar, me incentivar, me corrigir e principalmente estar ao meu lado. Todo o cuidado, todo o amor e toda a dedicação foram fundamentais nessa jornada.

À minha família, por serem meu alicerce, meu exemplo e minha força. Por todo o colo, por todas as palavras de conforto e por me darem a certeza de que tudo é possível, basta tentar. A confiança de que vocês estarão sempre comigo me faz ir muito mais longe. Estaremos sempre unidos independente de qualquer distância;

E a todos que, de alguma forma, contribuíram para que esta dissertação chegasse ao fim, muito obrigado.

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PAPEL DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO HLA-G NA INFE CÇÃO E

PERSISTÊNCIA DO HPV EM UMA COORTE DE GESTANTES HIV+ DO RIO DE JANEIRO

RESUMO -DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Brunna Luiza Misael Alves

Introdução: A persistência da infecção pelo papilomavírus humano (HPV) é uma etapa intermediária na progressão para a neoplasia intraepitelial cervical de alto grau e para o consecutivo câncer invasivo. Acredita-se que o sistema imune, a genética do hospedeiro e do vírus estejam entre os fatores não-comportamentais que determinam a aquisição e a persistência da infecção. Pacientes com o sistema imune comprometido apresentam lesões intra-epiteliais mais graves, com progressão mais rápida e com elevada taxa de recorrência, além de um risco aumentado para o câncer cervical. Através da expressão de HLAs-C, -E e –G, capazes de atuar como ligantes inibitórios de células “natural killers”, o vírus consegue estabelecer a infecção evitando a erradicação de células infectadas pelo sistema imune. Devido ao seu potencial em modular a resposta imune contra o HPV, estudos recentes vêm investigando polimorfismos nestes loci que possam estar associados com a susceptibilidade e a com a persistência do vírus no hospedeiro. Objetivo: Caracterizar molecularmente os alelos do HLA-G e analisar sua associação com a aquisição e a persistência do HPV em uma população de gestantes HIV+ do Rio de Janeiro. Relacionar os dados da citologia oncótica, genótipos encontrados e fatores de risco demográficos e clínicos com os alelos encontrados; além de correlacionar os alelos com a infecção por diferentes tipos, espécies, múltiplas infecções e persistência da infecção pelo HPV. Material e Métodos: Foram convidadas a participar do estudo 140 gestantes HIV+ em acompanhamento no Ambulatório de HIV/aids do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira da UFRJ, Rio de Janeiro. A partir do DNA genômico já extraído, foi amplificado por PCR um fragmento compreendendo os éxons 2-4 do HLA-G. Esses produtos foram então sequenciados e analisados para a determinação dos alelos. Para a caracterização de alelos novos e determinação de certos casos de heterozigose foi realizada a clonagem, com posterior sequenciamento e análise dos produtos. Resultados: No total, 126 pacientes foram analisadas, totalizando 22 alelos que compõem 52 diferentes genótipos. A variedade de alelos observada é condizente com a alta diversidade genética associada à população brasileira. No total, encontramos 44% dos alelos já descritos na literatura. Foi possível evidenciar uma associação entre dos alelos G:01:03 e G:01:01:02 à proteção contra a infecção por espécies do grupo B e C, respectivamente. Os dados relativos à citologia oncótica permitiram observar um efeito protetor contra a ocorrência de lesões em pacientes com o alelo G:01:01:02. Além disso, pudemos evidenciar pela primeira vez a associação do alelo G:01:04 à persistência da lesão em pacientes com citologia alterada. Quanto aos parâmetros clínicos, foi possível correlacionar o alelo G:01:05N a contagem de cels CD4>=350 cels/mm3. Em conjunto, esses dados contribuem para uma melhor compreensão sobre o impacto dos alelos do HLA-G em mulheres HIV/HPV positivas a fim de esclarecer o papel desses alelos na susceptibilidade e persistência do vírus HPV, além do desfecho clinico e de parâmetros associados a ele.




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ROLE OF HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN HLA-G IN INFECTION AND PERSISTENCE OF HPV IN A COHORT OF HIV + PREGNANT WO MEN IN RIO

DE JANEIRO

ABSTRACT- MASTER THESIS Brunna Luiza Misael Alves

Introduction : Persistent infection with human papillomavirus (HPV) is an intermediate step in the progression to high grade cervical intraepithelial neoplasia and to invasive cancer. It is believed that the gene of HPV and the host immune system are among the non-behavioral factors that determine the acquisition and persistence of infection. Patients with compromised immune systems have more severe intraepithelial lesions, more rapidly progression and a high recurrence rate, beside an increased risk for cervical cancer. By expressing HLAs -C ,-E and –G, capable of acting as inhibitory ligands of "natural killers" cells, the virus can establish infection avoiding the elimination of infected cells by the immune system . Because of its potential to modulate the im4mune response against HPV, recent studies have investigated polymorphisms at these loci that may be associated with susceptibility and persistence of the virus in the host. Objective: To molecularly characterize the alleles of HLA-G and analyze its association with acquisition and persistence of HPV in a population of HIV + pregnant women in Rio de Janeiro. Relate data from cytology, genotypes found and demographic and clinical risk factors with alleles found, besides correlating alleles with infection with different types, species, multiple infections and persistence of HPV infection. Material and Methods: We invited to participate in the study 140 HIV+ pregnant women followed at the HIV/aids of the Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira-UFRJ, Rio de Janeiro. From already extracted genomic DNA, was amplified by PCR a fragment comprising exons 2-4 of HLA-G. These products were then sequenced and analyzed to determine the alleles. For characterization of novel alleles and determination of heterozygosis in certain cases the cloning was performed, with subsequent cloning and analysis of the product. Results: Altogether, 126 patients were analyzed, totaling 22 alleles that compound 52 different genotypes. The variety of alleles observed is consistent with the high genetic diversity associated with the Brazilian population. In total we found 44% of the alleles described in the literature. The results showed an association between alleles G:01:03 and G:01:01:02 to protection against infection by species of the group B and C, respectively. Data on cytology allowed to observe a protective effect against the occurrence of lesions in patients with the allele G:01:01:02. Additionally, we demonstrate for the first time the association of the allele G:01:04 and persistence of the lesion in patients with abnormal cytology. Regarding clinical parameters, it was possible to correlate the allele G:01:05N to cels CD4 count >=350 cels/mm3. Together, these data contribute to a better understanding of the impact of the alleles of HLA-G in HIV/HPV positive women in order to clarify the role of these alleles in susceptibility and persistence of HPV, in addition to clinical outcome and it associated parameters.

Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu

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SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS................................................................................................. XI

LISTA DE FIGURAS................................................................................................. XII

LISTA DE ABREVIATURAS..................................................................................... XIII

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 15

1.1. Epidemiologia do Câncer de colo uterino e do Papilomavírus Humano....... 15

1.2. O papilomavírus humano.............................................................................. 16

1.2.1. Descrição, história natural e aspectos clínicos.......................................... 16

1.2.2. Partícula viral, genoma e ciclo replicativo.................................................. 18

1.2.3. Classificação molecular do HPV................................................................ 20

1.2.4. Classificação do HPV quanto ao potencial oncogênico............................. 21

1.2.5. Epidemiologia molecular do HPV.............................................................. 22

1.3. Evasão da Resposta Imunológica do HPV e do Câncer............................... 23

1.4. O sistema gênico HLA................................................................................... 24

1.4.1. Histórico do gene HLA-G........................................................................... 26

1.4.2. O gene HLA-G, proteínas, isoformas e funções........................................ 26

1.4.3. HLA-G e evasão da resposta imune.......................................................... 30

1.4.4. HLA-G e Polimorfismos associados ao HPV............................................. 32

1.4.5. HLA-G e polimorfismos associados ao HIV............................................... 34

1.5. Co-infecção HPV e HIV na gestação, persistência e câncer........................ 34

2. OBJETIVOS......................................................................................................... 36

3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 37

3.1. Casuística...................................................................................................... 37

3.2. Análise Molecular.......................................................................................... 39

3.2.1. Amplificação por PCR dos genes que codificam os domínios α1, α2 e α3 do HLA-G................................................................................................................ 39

3.2.2. Purificação dos produtos de PCR.............................................................. 40

3.2.3. Sequenciamento das regiões genômicas de interesse............................. 41

x

3.2.4. Edição, Alinhamento das sequências e definição dos alelos.................... 42

3.2.5. Clonagem de heterozigotos e investigação de novos alelos..................... 42

3.3. Análises Estatísticas..................................................................................... 43

4. RESULTADOS..................................................................................................... 45

5. DISCUSSÃO........................................................................................................ 55

6. CONCLUSÕES.................................................................................................... 63

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 64

8. ANEXOS.............................................................................................................. 79

8.1. Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva................................................................................. 79

8.2. Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira...................................................................................... 80

8.3. Questionário aplicado as pacientes.............................................................. 81

8.4. Tabelas estatísticas....................................................................................... 82

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.2.2.1. Característica das regiões gênicas do Papilomavírus Humano e suas

principais funções no hospedeiro...............................................................................19

Tabela 3.1.1: Perfil clínico-epidemiológico da amostragem estudada (n=140).........38

Tabela 3.2.1.1: Descrição dos iniciadores utilizados ................................................40

Tabela 4.1 . Informações dos seis alelos novos de HLA-G encontrados no estudo ..47

Tabela 4.2. Genótipos encontrados nas pacientes do estudo (n=126).....................48

Tabela 4.3 . Correlação entre os alelos de HLA-G e a infecção por diferentes tipos de HPV...........................................................................................................................50

Tabela 4.4. Correlação entre os genótipos de HLA-G e a infecção pelo HPV..........52

Tabela 4.5: Correlação entre os alelos de HLA-G e a presença de alterações citológicas (LSIL e/ou HSIL) ......................................................................................54

Tabela 8.4.1: Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a persistência da infecção pelo HPV.....................................................................................................82

Tabela 8.4.2. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a infecção pelo HPV ..........................................................................................................................82

Tabela 8.4.3. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a ocorrência de casos de múltipla infecção pelo HPV ........................................................................83

Tabela 8.4.4. Correlação entre os alelos de HLA-G e os casos de melhora citológica..................................................................................................................................83

Tabela 8.4.5 . Correlação entre os alelos de HLA-G e pacientes com contagem de cels TCD4>= 350 cels/mm3.......................................................................................84

Tabela 8.4.6. Correlação entre os alelos de HLA-G e pacientes com carga viral do HIV indetectável durante o período de estudo ..........................................................84

Tabela 8.4.7. Correlação entre os alelos de HLA-G e infecção pelo HPV-16...........85

Tabela 8.4.8. Correlação entre os alelos de HLA-G e infecção persistente pelo HPV-16 ..............................................................................................................................85

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1.1 : Prevalência mundial do HPV em mulheres com citologia normal........15

Figura 1.2.1.1: Relação entre incidência da infecção cervical pelo HPV, pré-câncer e câncer. ......................................................................................................................17

Figura 1.2.2.1: Reconstrução de uma partícula semelhante a vírus (VLP) de HPV-11 e fotomicrografia eletrônica da estrutura do papilomavírus humano observado ao microscópio eletrônico de transmissão .....................................................................18

Figura 1.2.3.1: Árvore filogenética de 100 tipos de papilomavírus humano. ............21

Figura 1.2.5.1: Prevalência da infecção pelo HPV e prevalência dos cinco tipos de alto risco mais frequentes entre mulheres com citologia normal nas diferentes regiões do mundo......................................................................................................23

Figura 1.4.1: Mapa da região HLA ...........................................................................25

Figura 1.4.2.1: Processamento alternativo e isoformas do HLA-G...........................27

Figura 1.4.2.2: Nomenclatura dos alelos de HLA-G. ................................................28

Figura 1.4.2.3: Funções imunorreguladoras mediadas pelo HLA-G, células-alvo e receptores .................................................................................................................29

Figura 1.4.4.1: Polimorfismos do HLA-G associados à infecção pelo HPV..............33

Figura 3.2.1.1 : Organização genômica do HLA-G....................................................39

Figura 4.1. Alinhamento da sequência da paciente 110 com a referência do HLA-G, destacando o pico duplo na posição 1381 ................................................................45

Figura 4.2. Alinhamento contendo os clones obtidos de HLA-G da paciente 121....46

Figura 4.3 . Frequências alélicas dos variantes de HLA-G encontrados no estudo com valor superior a 3%............................................................................................49

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LISTA DE ABREVIATURAS

°C- graus Celsius

CD8+- do inglês cluster of direferentiation 8 (grupamento de diferenciação 8)

CDC – NPIN- Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos, do inglês Center for Disease Control and Prevention- National Prevention Information Network-

DNA- ácido desoxirribonucléico

dNTP- trifosfato de desoxirribonucleotídeo

DST- doenças sexualmente transmissíveis

GM-CSF - fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos

HAART- Terapia Antirretroviral Altamente Ativa, do inglês High Active Antiretroviral Therapy

HIV- vírus da imunodeficiência humana

HLA – Antígeno Leucocitário Humano

HPV- Papiloma Vírus Humano (do inglês Human Papillomavirus)

HR-HPV- HPV de alto risco oncogênico (do inglês High Risk)

HSIL- lesões escamosas intraepiteliais de alto grau

HWV- do inglês human wart vírus

IARC- Internacional Agency for Research on Cancer

ICO- Institut Català d'Oncologia

ICTV- Comitê Internacional para a Taxonomia dos Vírus

IFN- Interferon

IL- Interleucina

ILT-2- Immunoglobuline-Like Transcripts

INCA- Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva

IPPMG- Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira

Kb- Quilobase

KV- Quilovolt

LB- Meio de cultura Luria-Bertani Broth

LIF- Fator inibitório de leucócitos

LR-HPV- HPV de baixo risco oncogênico (do inglês Low Risk)

xiv

LSIL- Lesões escamosas intraepiteliais de baixo grau

LT-α- Linfotoxina alfa

LT-β- Linfotoxina beta

MgCl2- cloreto de magnésio

Min- minuto

ml- mililitro

NaOH- hidróxido de sódio

NK- do ingles Natural Killer

OMS- Organização Mundial da Saúde

pb- pares de base

PBS- tampão fosfato salina

PCR- reação em cadeia da polimerase

rpm- rotação por minuto

seg- segundo

TCD4+- linfócitos T CD4 positivos

TCD8+- linfócitos T CD8 positivos

TH1- Linfócitos T helper perfil 1

Th2- Linfócitos T helper perfil 2

TNF-α- Fator de Necrose Tumoral α

UFRJ- Universidade Federal do Rio de Janeiro

WHO- World Health Organization

ηg- nanograma

µg- micrograma

µL- microlitro

µFD- Microfarad

ρmol- picomol

Ω- Ohm

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Epidemiologia do Câncer de colo uterino e do P apilomavírus Humano

O papilomavírus humano (HPV, do inglês Human Papillomavirus) é

atualmente uma das infecções virais sexualmente transmitida mais comuns em todo

o mundo. Estima-se que 11,4% das mulheres na população geral mundial estejam

infectadas pelo vírus (WHO/ICO, 2010) (Fig. 1.1.1). Estudos realizados com

mulheres com câncer cervical apontaram a presença do vírus em praticamente

100% dos casos (WALBOOMERS et al., 1999).

Figura 1.1.1: Prevalência mundial do HPV em mulheres com citologia normal (Modificado de

WHO/ICO, 2010).

O câncer do colo do útero é o segundo tipo de câncer mais comum na

população feminina mundial. Estima-se que em 2008, mais de 530 mil novos casos

(aproximadamente 86% desses em regiões menos desenvolvidas) e mais de 275 mil

óbitos ocorreram em todo o mundo devido a esse tipo de câncer (WHO/ICO, 2010).

Projeções globais estimam que em 2030 os novos casos de câncer cervical irão

aumentar para 770 mil (BOSCH et al., 2013).

No Brasil, esperam-se 15.590 novos casos para o ano de 2014, o que o torna

o terceiro em prevalência dos casos de câncer no país. Entretanto, tal distribuição é

bastante heterogênea: enquanto a taxa de incidência estimada para a região

Sudeste é de aproximadamente 10 casos para cada 100.000 mulheres no ano de

16

2014, na região Norte estimam-se 24 casos para cada 100.000 mulheres (INCA,

2014).

Diversos estudos têm mostrado que a infecção por HPV é significativamente

mais comum em mulheres infectadas pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV).

A prevalência da infecção pelo HPV nesta população varia de 44 a 98%

(GONCALVES et al., 1999; LEVI et al., 2002a; LEVI et al., 2004; CAMPOS et al.,

2005; LEIBENSON et al., 2011; LUZ et al., 2012; GARBUGLIA et al., 2012).

1.2. O papilomavírus humano

1.2.1. Descrição, história natural e aspectos clíni cos

A utilização da microscopia eletrônica – a partir da década de 1930 – e do

cultivo de células – na década de 1940 – possibilitou um grande avanço na virologia.

Em 1949, Maurice Strauss e outros pesquisadores da Escola de Medicina da

Universidade de Yale, usando um microscópio eletrônico, observaram partículas

semelhantes aos vírus em amostras retiradas de papilomas da pele (STRAUSS et al.,

1949). O vírus então foi denominado de HWV (do inglês human wart virus), mas

apenas em 1965 dois grupos caracterizaram o material genético viral (CRAWFORD,

1965; KLUG e FINCH, 1965). Em 1975, o Comitê Internacional para a Taxonomia

dos Vírus (ICTV – International Committee on Taxonomy of Viruses) decidiu chamá-

lo de HPV – papillomavírus humano. Em 1983, foram isolados, pelo grupo do

pesquisador Harald zur Hausen, dois importantes genótipos do HPV, a partir de

tecido de biopsias de câncer cervical (DURST et al., 1983; BOSHART et al., 1984).

O pico de infecção em homens e mulheres ocorre logo após a primeira

exposição sexual, o que faz com que as maiores taxas de prevalência da infecção

sejam associadas a indivíduos com menos de 25 anos, diminuindo ao longo do

tempo em diversas populações. Estima-se que aproximadamente 75% da população

sexualmente ativa entrará em contato com um ou mais tipos de HPV durante sua

vida (KOUTSKY, 1997; TROTTIER e FRANCO, 2006).

A transmissão do vírus ocorre através do contato do epitélio ou da mucosa

infectada com outra região mucosa ou epitelial. Além da transmissão sexual, pode

ocorrer a transmissão perinatal da infecção (BURCHELL et al., 2006). O HPV possui

17

um tropismo por células epiteliais cutâneas ou mucosas da camada basal, na qual

penetra através de microlesões presentes nessa região.

Diferente da maioria das infecções genito-urinárias, a infecção pelo HPV não

está usualmente associada a sintomas imediatos como dor, prurido, queimação e

corrimento vaginal (MAO et al., 2003). A maioria dos casos permanece sem

sintomas clínicos ou produzem lesões não aparentes (ZUR HAUSEN, 1996). A

forma clínica da infecção apresenta verrugas genitais, caracterizadas por sua

elevada transmissibilidade e recorrência comum (FERENCZY et al., 1985).

Estudos revelam que até 90% das infecções pelo HPV são eliminadas ou

suprimidas a níveis indetectáveis após 12 a 24 meses, enquanto os outros 10%

serão infecções persistentes, com um risco aumentado de desenvolvimento do

câncer cervical. Apenas 1,5% dos indivíduos com infecção persistente irão

desenvolver câncer cervical após vários anos da infecção (HO et al., 1998; FRANCO

et al., 1999; SCHIFFMAN et al., 2011) (Fig. 1.2.1.1).

Figura 1.2.1.1: Relação entre incidência da infecção cervical pelo HPV, pré-câncer e câncer. A curva

azul representa o pico de prevalência de infecções transitórias pelo HPV, que ocorre entre as

mulheres após o início da atividade sexual. O pico de prevalência das lesões pré-cancerosas (curva

verde) ocorre cerca de dez anos depois. O pico de prevalência do câncer do colo do útero (curva

vermelha) reflete o intervalo relativamente longo entre a lesão pré-cancerosa e o câncer (Modificado

de SCHIFFMAN et al., 2005).

As lesões escamosas intraepiteliais associadas ao vírus vêm sendo

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classificadas desde 1988 pelo sistema de Bethesda, o qual introduziu duas

terminologias, LSIL (lesões escamosas intraepiteliais de baixo grau) e HSIL (lesões

escamosas intraepiteliais de alto grau), para classificar a diversidade de

anormalidades escamosas cervicais não-invasivas. A classificação foi mantida após

o Workshop de Bethesda de 2001. Essa divisão reflete evidências virológicas,

moleculares e clínicas de que LSIL é uma infecção pelo HPV geralmente eliminada

de 6 a 12 meses após o aparecimento, enquanto HSIL está mais frequentemente

associado à persistência viral e a um maior risco de progressão (ZUR HAUSEN,

2000).

Cabe destacar que a persistência de tipos de HPV de alto risco é necessária,

mas não suficiente para a progressão para o câncer (WALBOOMERS et al., 1999).

A persistência é definida como infecções detectadas mais de uma vez em um

intervalo de seis meses ou mais. Além dela, outros fatores estão envolvidos na

progressão da doença, como a variabilidade tanto do genoma do hospedeiro quanto

do DNA viral e co-fatores como o estilo de vida do indivíduo, o DNA viral circulante,

co-infecções por múltiplos tipos de HPV e co-infecções por outros agentes.

1.2.2. Partícula viral, genoma e ciclo replicativo

O papilomavírus pertence à família Papillomaviridae, composta por vírus não

envelopados, com cerca de 50-55 nm de diâmetro e capsídeo formado por duas

proteínas, L1 e L2, que se organizam em 72 subunidades (capsômeros) num arranjo

icosaédrico (Fig. 1.2.2.1).

Figura 1.2.2.1: Reconstrução de uma partícula semelhante a vírus (VLP) de HPV-11 feito em

colaboração com Merck & Co. disponível em http://nramm.scripps.edu/hpv-type-11-vlp/ (esquerda) e

fotomicrografia eletrônica da estrutura do papilomavírus humano observado ao microscópio eletrônico

de transmissão (direita), disponível em www.cdcnpin.org/scripts/std/std.asp#1e.

19

O HPV possui um DNA genômico circular de dupla fita de aproximadamente

8000 pb, que pode ser divido em três regiões: precoce ou E (early), responsável pela

patogenicidade (E1-E8); tardia ou L (late), que codifica as proteínas estruturais L1 e

L2; e uma região não-codificante, contendo elementos genéticos para replicação e

transcrição do genoma viral (Tabela 1.2.2.1) (SCHEFFNER et al., 1994; ZUR

HAUSEN, 2002; HOORY et al., 2008).

Tabela 1.2.2.1. Característica das regiões gênicas do Papilomavírus Humano e suas principais

funções no hospedeiro. Adaptado STANLEY et al., 2007.

Genes Função Principal E6 Ligação e degradação de p53, transformação celular

E7 Ligação a proteína retinoblastoma (pRB), desregulação da checagem do

ciclo em G1/S, transformação celular; coopera com E6 para imortalização celular

E1 Helicase, ATPase, essencial para replicação do DNA viral

E2 Regulação da transcrição viral. Liga-se a E1 para facilitar início da

replicação do DNA E3/E8 Função desconhecida

E4 Ligação e desarranjo da citoqueratina E5 Transformação celular, interação com receptores do fator de crescimento L1 L2

Proteína primária do capsídeo viral Proteína secundária do capsídeo viral

O genoma viral pode permanecer de duas formas dentro da célula, epissomal

e linear. A forma epissomal está presente nos estágios precoces da infecção, se

localiza dentro do núcleo da célula, sob a forma circular, e não está integrada ao

genoma. Já a forma linear é observada com frequência nas infecções por tipos de

HPV associados ao câncer cervical e representa o DNA do vírus integrado a um

cromossomo do hospedeiro (VILLA, 1997), através de uma quebra na região de E2

(DOORBAR, 2006).

O vírus infecta exclusivamente células epiteliais indiferenciadas da camada

basal (por serem as únicas células em divisão ativa) após essa ter sido exposta

através de feridas ou abrasões. O DNA viral é mantido na forma epissomal no

núcleo das células epiteliais basais com baixo número de cópias, variando de 50 a

100 cópias por célula (HEBNER e LAIMINS, 2006). Nessa fase inicial da infecção as

proteínas virais são expressas em baixos níveis e confinadas principalmente ao

núcleo (DOORBAR, 2005). A expressão desses genes é fortemente controlada

durante a diferenciação dos queratinócitos e aumenta apenas quando esses migram

20

para as camadas superiores do epitélio. Nessa etapa, a expressão de todos os

genes virais é induzida a fim de acelerar a replicação do genoma viral, aumentando

o número de cópias virais para milhares de cópias por célula (DOORBAR, 2006;

HEBNER e LAIMINS, 2006). O estágio final da infecção leva ao empacotamento dos

genomas amplificados em partículas infecciosas formadas pelas proteínas virais L1

e L2, que são liberadas na forma de capsídeos icosaédricos. Novas partículas virais

são produzidas dentro da camada superior do epitélio e eliminadas através do

processo natural de liberação das células epiteliais que ocorre ao fim do seu ciclo de

vida (DOORBAR, 2006).

1.2.3. Classificação molecular do HPV

Variações na sequência genômica do HPV permitem a classificação dos vírus

em diferentes níveis taxonômicos: gêneros, espécies e tipos; além disso, variações

no genoma completo ainda diferenciam os tipos em subtipos e variantes (DE

VILLIERS et al., 2004). O HPV é dividido em cinco gêneros: Alfapapillomavirus,

Betapapillomavirus, Gamapapillomavirus, Mupapillomavirus e Nupapillomavirus (Fig.

1.2.3.1). Diferentes gêneros possuem identidade menor que 60% entre as

sequências nucleotídicas do gene L1. O gênero Alfapapillomavirus é o principal

responsável pelas lesões em mucosas, incluindo as anogenitais, enquanto os

demais infectam principalmente regiões cutâneas (BERNARD et al., 2010).

Os gêneros ainda são divididos em espécies, que apresentam de 60 a 70%

de identidade no gene L1 (DE VILLIERS et al., 2004). Dois tipos diferem entre si

quando a sequência do gene L1, que é a mais conservada do genoma viral, possui

mais de 10% de divergência nessa região ( DE VILLIERS et al., 2004; BERNARD et

al., 2010). Atualmente, os vírus estão agrupados em 189 tipos identificados por

números de acordo com a ordem de sua descoberta, dos quais 151 afetam humanos

(BERNARD et al., 2010). Por sua vez, os subtipos são definidos considerando o

genoma completo com 2 a 10% de diferenças em relação a outro tipo. Por fim, o

HPV é dividido em variantes, que possuem menos de 2% de diferença no genoma

completo (DE VILLIERS et al., 2004). Poucos tipos são classificados em variantes, e

cada tipo possui uma nomenclatura de variantes diferente (CHEN et al., 2011).

21

Figura 1.2.3.1: Árvore filogenética de 100 tipos de papilomavírus humano. Em laranja estão

destacados os tipos de alto risco do gênero alfa (IARC, 2012)

1.2.4. Classificação do HPV quanto ao potencial onc ogênico

Uma outra forma de classificação do vírus se baseia no potencial oncogênico,

sendo este estabelecido considerando a frequência em diversos estudos

epidemiológicos dos diferentes tipos do HPV envolvidos no desenvolvimento do

câncer cervical. Foram definidos os grupos de HPV de alto risco ou HR-HPV (High

Risk) e de baixo risco ou LR-HPV (Low Risk).

Em 2003, Muñoz e colaboradores dividiram os vírus em alto risco (HPV 16,

22

18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, e 82), baixo risco (HPV 6, 11, 40,

42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, e 89) e provável carcinogênico (HPV 26, 53 e 66)

(MUNOZ, 2003). Em 2007, Varnai e colaboradores sugeriram que os tipos HPV 32,

62, 74, 83, 84, 86, 87, 91 são de baixo risco e os tipos HPV 69, 30, 67, 34 de

provável alto risco (VARNAI et al., 2007). Atualmente, o IARC classifica as espécies

5, 6, 7, 9 e 11 do gênero Alphapapilomavirus em alto risco. Estas espécies incluem

os tipos descritos pelos outros autores como alto risco e provável alto risco

(BOUVARD et al., 2009).

1.2.5. Epidemiologia molecular do HPV

A prevalência dos tipos de HPV de alto risco varia nas diferentes regiões no

mundo. Entretanto, nas mulheres com citologia normal o HPV16 é o mais prevalente

em todo o mundo (Fig. 1.2.5.1) (IARC, 2012). Estudos apontam a presença dos

HPVs 16 e 18 em aproximadamente 50% e 20% dos casos de câncer cervical,

respectivamente (LI et al., 2011). Os cinco tipos de HPV mais prevalentes em todo

mundo são o HPV-16 (3,2%) seguido pelos HPVs 18 (1,4%), 52 (0,9%), 31 (0,8%) e

58 (0,7%) (BOSCH et al., 2013). No entanto, a freqüência dos tipos de HR-HPV

podem variar de acordo com fatores geográficos, demográficos e clínico-patológicos

(CLIFFORD et al., 2005; LI et al., 2011), além de haver uma grande influência dos

métodos utilizados para a detecção. Estudos têm mostrado uma prevalência maior

do tipo 16 no Brasil, embora a prevalência dos outros tipos de alto risco varie de

acordo com a região analisada (OLIVEIRA-SILVA et al., 2011; CASTRO et al., 2011;

FERNANDES et al., 2011; MIRANDA et al., 2013).

23

Figura 1.2.5.1: Prevalência da infecção pelo HPV e prevalência dos cinco tipos de alto risco mais

frequentes entre mulheres com citologia normal nas diferentes regiões do mundo (Modificado de

IARC, 2012).

1.3. Evasão da Resposta Imunológica do HPV e do Cân cer

A resposta imune do hospedeiro é fator determinante no processo de

evolução da infecção viral e no desenvolvimento neoplásico. A maioria das infecções

pelo HPV é eliminada dentro de um ano, como resultado da resposta imune mediada

por células. Dessa forma, o vírus não persiste no organismo tempo suficiente para

desregular a expressão gênica (DOORBAR et al., 2012).

Grande parte dos indivíduos com lesões benignas montam uma resposta

imune efetiva mediada por células que induz a regressão da lesão. Essa regressão

está histologicamente acompanhada por uma resposta com perfil Th1 dos linfócitos

TCD4+ (MONNIER-BENOIT et al., 2006). A falha no desenvolvimento de uma

resposta imune efetiva capaz de eliminar ou controlar a infecção resulta na

persistência, e nos casos dos tipos de HPV oncôgenicos, no aumento do risco de

progressão para HSIL e câncer cervical.

Contribui também para o escape imune do HPV o fato de que o ciclo

replicativo viral é exclusivamente intra-epitelial, Assim, não há viremia, processos de

citólise ou morte celular induzidos pelo vírus. Por fim, os processos de replicação e

liberação viral não estão associados à inflamação (STANLEY, 2012). A natureza

não-lítica da infecção pelo HPV limita a produção de antígenos virais que são

24

processados e apresentados ao sistema imune adaptativo. As proteínas codificadas

pelo vírus, em sua maioria, não são secretadas através da célula infectada. As

proteínas E são expressas em níveis baixos e, sobretudo, no núcleo celular, e a

produção das proteínas do capsídeo, altamente imunogênicas, é limitada à camada

mais diferenciada e liberada ao epitélio, distante das células circulantes do sistema

imune.

As células tumorais são capazes de escapar da imunovigilância do sistema

imune por diversas alternativas. Entre elas está a habilidade de alguns tumores em

diminuir a expressão de antígenos de HLA (Human Leukocyte Antigen) de classe I, o

que permite ao tumor evitar o reconhecimento e destruição por células TCD8+, mas

tornando-o susceptível à lise mediada por células NK (do inglês natural killer). As

proteínas do sistema HLA são fundamentais para a resposta imune adaptativa

mediada por células T porque são essenciais à apresentação dos antígenos. Um

dos exemplos é o efeito da proteína E5 do HPV, que causa a diminuição da

expressão de HLA-A e B na superfície das células, mas não interfere na expressão

dos ligantes inibidores de células NK, como o HLA-C, E e G (ASHRAFI et al., 2005).

Já a proteína E7 dos HPV 16 e 18 é capaz de reprimir o gene promotor da cadeia

pesada do HLA de classe I, levando a uma perda do reconhecimento de células

infectadas por HPV pelos linfócitos T citotóxicos (MEGRET et al., 2007).

1.4. O sistema gênico HLA

O primeiro sistema gênico caracterizado como Complexo Principal de

Histocompatibilidade foi descrito em camundongos, e recebeu esta denominação por

sua constatada influência nos transplantes de tecidos nesses animais. Por sua vez,

o sistema HLA foi descoberto na década de 50 quando Dausset, Payne e van Rood

realizavam estudos sorológicos em pacientes politransfundidos e observaram a

presença de anticorpos leucoaglutinantes. Esse sistema apresenta um elevado

polimorfismo nas populações e está situado num segmento de aproximadamente

4Mb do braço curto do cromossomo 6 humano. Seus genes e suas proteínas podem

ser agrupados em três classes de acordo com a estrutura e função: classe I, classe

II e classe III (Fig. 1.4.1).

25

Figura 1.4.1: Mapa da região HLA (banda 6p21.3 do cromossomo 6). Os genes e pseudogenes não-

clássicos classe I estão representados por retângulos não preenchidos.

A região de HLA de classe I pode ser subdividida em moléculas de HLA

clássicas (HLA-Ia) e não-clássicas (HLA-Ib). Seus receptores interagem com

linfócitos TCD8+ que detectam alterações de expressão nas células que podem

ocorrer devido a infecções ou durante o desenvolvimento de células tumorais

(GERAGHTY et al., 1987). As moléculas HLA de classe Ia, que incluem os genes

HLA-A, -B e -C, são expressas na superfície de quase todas as células nucleadas e

possuem um alto grau de polimorfismo, já que devem ser capazes de apresentar

uma grande diversidade de peptídeos antigênicos intracelulares para linfócitos T

citotóxicos. Já as moléculas Ib incluem os genes HLA-E, -F, -G que ao contrário dos

clássicos, são pouco polimórficos e possuem distribuição limitada a certos tecidos.

Há também os loci HLA-H, -J, -K e –L, que constituem pseudogenes (HUGHES,

1995).

As moléculas de classe II são codificadas por diferentes loci e mapeadas nas

sub-regiões HLA-DR, -DQ, -DP. Sua expressão é restrita às células apresentadoras

de antígenos (APC), células endoteliais e linfócitos T ativados. Elas interagem com

linfócitos TCD4+ para a apresentação de antígenos exógenos (MURPHY et al.,

2010).

A região de classe III, localizada entre as regiões de classe I e II, possui a

maior densidade gênica das três regiões de HLA, contendo um gene a cada 14.500

bases (SHIINA et al., 2004). Destaca-se o seu papel na codificação de proteínas

solúveis importantes na modulação e regulação da resposta imunitária. Essa região

abriga genes atuantes no processo de ativação do sistema complemento (Bf, C2,

26

C4A, C4B) e genes da 21-hidroxilase, da hemocromatose, TNF e LT-α, que

codificam as citocinas TNF-α e LT-β (antigo TNF-β) respectivamente, entre outros

(XIE et al., 2003).

1.4.1. Histórico do gene HLA-G

O gene HLA-G foi primeiramente descrito por GERAGHTY et al. (1987),

quando realizavam uma análise de DNA genômico que revelou genes similares aos

bem conhecidos genes de HLA classe Ia (GERAGHTY et al., 1987). Ele descreveu o

gene e lhe deu o nome de HLA-6.0 (por estar localizado no interior de um fragmento

de restrição gerado pela enzima de restrição Hind III de aproximadamente 6.0 Kb).

Estudos de Loke, juntamente com Ellis, Kovats e seus respectivos colaboradores

foram os primeiros a identificar a molécula de HLA-G em citotrofoblastos extravilosos

(ELLIS et al., 1990; GRABOWSKA et al., 1990; KOVATS et al., 1990). Somente em

1990 foi possível unificar a nomenclatura do HLA-6.0 para HLA-G.

1.4.2. O gene HLA-G, proteínas, isoformas e funções

O HLA-G é um gene não-clássico de classe Ib, composto por oito éxons, sete

íntrons e uma região 3´ não traduzida. O éxon 1 é responsável por codificar o

peptídeo-sinal, os éxons 2, 3 e 4 codificam os domínios extracelulares de ligação α1,

α2 e α3, respectivamente, o éxon 5 codifica a região transmembrana e os éxons 6, 7

e 8 codificam o domínio citoplasmático da molécula. Devido a um códon de término

de leitura no éxon 6, a cauda citoplasmática apresenta apenas 6 aminoácidos

enquanto a cauda das moléculas de classe Ia apresenta aproximadamente 30.

Devido ao códon de terminação, o éxon 7 está sempre ausente do RNAm maduro e

o éxon 8 não é traduzido.

A sequência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene HLA-G possui

86% de identidade com as proteínas codificadas pelos genes HLA-A, -B, e -C

(O'CALLAGHAN e BELL, 1998). Mais especificamente, a molécula de HLA-G exibe

um alto grau de similaridade com a molécula funcional HLA-A2 (todas as posições

relevantes para interação com b2-microglobulina - uma condição básica para a

manutenção da conformação nativa das moléculas HLA classe I - são conservadas

entre as duas sequências) (VAN DER VEN et al., 2000).

27

O processamento alternativo do RNAm origina sete isoformas diferentes da

proteína, sendo HLA-G1, -G2, -G3 e -G4 ligadas à membrana, e -G5, -G6, e -G7

solúveis. O HLA-G1 é a isoforma completa, contendo uma estrutura similar às

moléculas de HLA clássicas ligadas à membrana e associadas a β2-microglobulina.

A forma solúvel ocorre devido à presença de um códon de término de leitura nos

íntrons 2 (para –G7) e 4 (para –G5 e –G6), o qual impede a tradução do domínio

transmembrana da proteína (codificada pelo éxon 5) (BAINBRIDGE et al., 2001;

CAROSELLA et al., 2001; LILA et al., 2002). Dependendo do tipo de célula e

condição fisiopatológica, diferentes isoformas de HLA-G são produzidas (LILA et al.,

2000) (Fig. 1.4.2.1). Entre as isoformas, o HLA-G1 e sua forma solúvel G5 são as

mais frequentemente observadas.

Figura 1.4.2.1: Processamento alternativo e isoformas do HLA-G. Adaptado de BAINBRIDGE et al.,

2001.

Diferente dos genes clássicos Ia que exibem centenas de alelos, o lócus HLA-

G possui um polimorfismo discreto, com 50 alelos descritos até o momento,

responsáveis por codificar 16 distintas proteínas funcionais e 2 alelos nulos (IMGT –

International Immunogenetics Information Systems, http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla,

acessado em 17 de janeiro de 2014). Atualmente, o nome dos alelos deve conter 4,

28

6 ou 8 dígitos. Os primeiros dois dígitos se referem à família do alelo e o 3º e o 4º se

referem à ordem de descrição dos alelos (Fig. 1.4.2.2). Portanto, um alelo que difere

nos primeiros quatro dígitos deve ter ao menos uma substituição não-sinônima, ou

seja, uma modificação na sequência dos aminoácidos que define a proteína.

Figura 1.4.2.2: Nomenclatura dos alelos de HLA-G. Padronização da nomenclatura dos alelos de

acordo com o WHO Nomenclature Committee for Factors of the HLA System (adaptado de STEVEN,

2012 )

A expressão do HLA-G é ativada in vivo através de estímulos ambientais,

como condições de stress (como a hipóxia existente no microambiente adjacente a

tumores de rápido crescimento), citocinas e variações epigenéticas (MENIER et al.,

2009). Além disso, essa expressão é restrita a alguns tecidos e ocorre

principalmente em órgãos imunoprivilegiados, em alguns órgãos durante o

desenvolvimento e em células da linhagem hematopoiética, como placenta, timo,

córnea, pâncreas, eritroblastos e células-tronco mesenquimais. Entretanto, o

aumento da expressão pode ser induzido durante o curso de inúmeras patologias e

condições, como câncer, transplante, esclerose múltipla, doenças inflamatórias e

infecções virais (PAUL et al., 1998; LILA et al., 2000; ARACTINGI et al., 2001;

LOZANO et al., 2002; LAFON et al., 2005; WIENDL et al., 2005).

Em relação à sua função, o HLA-G exerce suas propriedades

imunossupressivas devido à sua capacidade de se ligar a receptores inibitórios

expressos em diferentes células imunes, incluindo ILT-2 (Immunoglobuline-Like

Transcript) expresso por células mielóides e linfóides, ILT-4 expresso apenas por

células mielóides e KIR2DL4, presente apenas em células NK (COLONNA et al.,

1998; RAJAGOPALAN e LONG, 1999). Através da ligação a esses receptores, o

HLA-G inibe a citotoxicidade das células TCD8+ e NK, além de inibir a resposta

29

alogênica proliferativa das células TCD4+. Recentemente, estudos também

demonstraram a capacidade das moléculas de HLA-G solúveis em diminuir a

expressão dos receptores de quimiocina em células T, o que leva ao

comprometimento da quimiotaxia. Outra forma de indução de células supressoras T

e NK se refere a uma propriedade adquirida temporariamente por essas células

através da transferência de fragmentos de membrana de células apresentadoras de

antígenos ou de células tumorais contendo o HLA-G, processo denominado

trogocitose (LE MAOULT et al., 2004). Além disso, o HLA-G é capaz de induzir a

apoptose de células TC8+ e NK e afetar a função das células dendríticas, em

particular sua maturação, migração, apresentação de antígenos e o processo de

comunicação entre as células T e NK (CAROSELLA et al., 2008a; LOUSTAU et al.,

2013). Todas as funções estão sintetizadas na figura 1.4.2.3.

Figura 1.4.2.3: Funções imunorreguladoras mediadas pelo HLA-G, células-alvo e receptores

(adaptado de Veit et al., 2010).

Várias citocinas podem induzir a expressão de HLA-G, tais como GM-CSF

(fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos), interleucina (IL)-10,

Interferons (IFNs) e LIF (fator inibitório de leucócitos) (CAROSELLA e DAUSSET,

2003; ROUAS-FREISS et al., 2007). Tanto IFN-β como IFN-γ parecem reforçar a

30

expressão de HLA-G na superfície celular, como demonstrado in vitro e mais

recentemente in vivo (CAROSELLA e DAUSSET, 2003; MITSDOERFFER et al.,

2005).

1.4.3. HLA-G e evasão da resposta imune

Diversas linhas de pesquisa tem evidenciado o papel do HLA-G como uma

molécula tolerogênica, desempenhando um importante papel na supressão da

resposta imune. O HLA-G está envolvido na patogenia de diversas doenças

humanas, como as infecções virais crônicas (HIV, citomegalovírus, hepatite C e

hepatite B), rejeição a transplante de órgãos sólidos (rim e coração), neoplasias e

doenças autoimunes (artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose

sistêmica e diabetes mellitus tipo I) (CAROSELLA et al., 2008a, CAROSELLA et al.,

2008b).

De maneira geral, todos os segmentos da molécula estão envolvidos nesse

processo. A cauda citoplasmática curta é responsável por reter o HLA-G por um

tempo maior no retículo endoplasmático e prolongar a meia-vida das moléculas na

superfície celular devido à ausência de um domínio ativador da endocitose (PARK et

al., 2001), permitindo assim múltiplas interações com células do sistema imune. Já

os domínios extracelulares interagem com os receptores inibitórios de leucócitos,

incluindo CD8, LILRB1, LILRB2 e KIR2DL4 (GAO e JAKOBSEN, 2000; SHIROISHI

et al., 2006).

Apesar dos efeitos inibitórios do HLA-G em células citotóxicas exibindo CD8

em sua superfície, outras interações entre a molécula de HLA-G e as células CD8

merecem atenção. Moléculas de HLA-G solúveis podem induzir em taxas similares a

apoptose em linfócitos TCD8 ativados e em células NK CD8+ (com a ausência do

receptor de células T) através do aumento da produção de Fas e da interação

Fas/FasL (CONTINI et al., 2003). Em condições nas quais as moléculas solúveis de

HLA-G estão presentes em elevadas quantidades, incluindo gravidez, alguns

tumores e transplantes com bom prognóstico, esse mecanismo pode representar um

efeito imunomodulatório adicional do HLA-G (DONADI et al., 2011).

Outra estratégia potente das células tumorais para induzir um ambiente

imunossupressor e escapar do controle imune, consiste na indução pelo HLA-G do

aumento da frequência das células T supressoras regulatórias (Tregs) e células

31

supressoras mielóides (MDSCs), assim como a mudança do perfil dos linfócitos T de

Th1/Th17 para Th2 (MORANDI et al., 2010; AGAUGUE et al., 2011, AMIOT et al.,

2011). As células Treg ou células T supressoras são uma subpopulação de células T

capazes de modular o sistema imune, manter a tolerância a antígenos próprios e

anular as doenças autoimunes. A mudança para o perfil Th2 é caracterizada pela

secreção de IL-10 e associada com a progressão das lesões pré-malignas para o

câncer (BAIS et al., 2007, CLERICI et al., 1997). Essa citocina contribui na

interferência da resposta imune antitumoral tanto através da diminuição da

expressão de HLA classe I quanto pelo aumento da expressão de HLA-G.

Por mecanismos indiretos, o HLA-G também induz a expressão do HLA-E,

outro gene HLA classe Ib capaz de inibir a atividade de células T e NK através da

interação com o receptor inibitório CD94/NKG2A (PENDE et al., 1997).

Dependendo da presença de fatores no microambiente que podem aumentar

a produção do HLA-G e da composição genética do indivíduo, a expressão do HLA-

G pode ser benéfica ou prejudicial, estando sujeito ao ajuste da reposta imune. Essa

expressão pode ser prejudicial em condições patológicas onde uma resposta imune

vigorosa e permanente são desejáveis, como no caso das infecções virais crônicas e

do câncer. Em contraste, quando uma resposta imune vigorosa é indesejável, a

expressão do HLA-G se mostra benéfica, como no caso de doenças autoimunes e

no transplante alogênico de organismos e tecidos (DONADI et al., 2011).

A proteína do HLA-G tem sido encontrada em praticamente todos os tipos de

câncer, independente de sua origem celular (ectodérmica, mesodérmica ou

mesenquimal). A proporção de tumores expressando HLA-G varia de 10 a 95%,

incluindo tumores sólidos e hematopoiéticos. O exame de fluidos biológicos de

pacientes com câncer permitiu observar que altos níveis da forma solúvel do HLA-G

estão associados a estágios mais avançados da doença, lesões de alto grau na

histologia e pior prognóstico (MENIER et al., 2009).

Recentes estudos sobre o comportamento da molécula HLA-G em lesões

cervicais associadas ao HPV demonstraram baixa expressão de HLA-G associado

ao grau de diferenciação da neoplasia intra-epitelial cervical (GONCALVES et al.,

2008; GUIMARAES et al., 2010). Dentre os diferentes graus histológicos, a

expressão da molécula HLA-G aparece aumentada nas lesões benignas, lesões pré-

32

malignas e carcinomas in situ de laringe, e diminui progressivamente entre as lesões

malignas (SILVA-ALVES, 2009).

1.4.4. HLA-G e Polimorfismos associados ao HPV

O grau de polimorfismo do HLA-G só é considerado baixo quando comparado

às moléculas clássicas de HLA. Os polimorfismos presentes tanto na região

codificante quanto na região 3’ não traduzida (3’UTR) podem afetar todas as funções

biológicas do gene. A variabilidade nucleotídica na região promotora e 3’UTR pode

influenciar os níveis de HLA-G através da modificação da afinidade entre a

sequência-alvo do gene e os fatores de transcrição ou fatores pós-transcricionais.

Da mesma maneira, a variabilidade na região codificante pode produzir mudanças

conformacionais na molécula, o que pode modificar suas principais funções como as

interações com os receptores celulares, a produção de diferentes isoformas, a

modulação da resposta imune, as características de polimerização e a habilidade de

formar peptídeos duplos.

Dado o potencial do HLA-G de modular a resposta imune contra o HPV,

diversos trabalhos vêm investigando polimorfismos nestes loci que possam estar

associados à susceptibilidade e à persistência do HPV no hospedeiro. Um estudo

recente conduzido em Montreal observou a associação dos alelos HLA-G*01:01:02 e

HLA-G*01:01:08 com o risco aumentado de infecção pelo HPV-16 e por alguns tipos

do HPV das espécies 1, 8, 10 e 13. O mesmo estudo associou também os alelos de

HLA-G*01:01:02 e G*01:03 com a persistência da infecção por HPV-16 e pelas

espécies 2, 3, 4 e 15 (FERGUSON et al., 2011). Em um trabalho publicado

posteriormente, esse mesmo grupo também encontrou uma associação entre os

genótipos homozigotos G*01:01:02 e G*01:06 e o aumento do risco do câncer

cervical invasivo, e de portadores do alelo G*01:01:01 a uma redução no risco do

câncer invasivo (FERGUSON et al., 2012). Outras associações entre polimorfismos

no HLA-G e a história natural da infecção pelo HPV foram identificadas por Metcalfe

e colaboradores, como a associação entre o HLA-G*01:01:02 e a diminuição do

risco de infecção por qualquer tipo de HPV, do alelo G*01:01:01 (incluindo genótipos

heterozigotos) ao aumento do risco de infecção pelas espécies 1, 3, 8, 10, 13 e 15.

Além disso, o genótipo homozigoto G*01:04:01 foi associado a uma redução do risco

de infecção pelas espécies 3 e 15. Entretanto, diferente dos estudos de Ferguson e

colaboradores, nenhuma associação foi encontrada entre os alelos de HLA-G e a

33

persistência. Por fim, foi observada uma correlação entre o alelo G*0:01:01 e o

aumento do risco de múltiplas infecções, e entre o alelo G*01;01:02 e genótipo

homozigoto G*01:04:01 e a diminuição do risco de múltiplas infecções quando

comparado a mulheres HPV-negativas (METCALFE et al., 2013).

Figura 1.4.4.1: Polimorfismos do HLA-G associados à infecção pelo HPV (com dados extraídos de

FERGUSON et al., 2011; FERGUSON et al., 2012; METCALFE et al., 2013)

34

1.4.5. HLA-G e polimorfismos associados ao HIV

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) desenvolveu inúmeros

mecanismos de escape do sistema imune, incluindo um mecanismo dependente da

proteína viral Nef, responsável pela diminuição da expressão de moléculas de HLA

classe I, de forma a evitar o reconhecimento das células infectadas por linfócitos

TCD8+ (COLLINS et al., 1998). Entretanto, a expressão de HLA-C, -G e –E

permanece inalterada para inibir a resposta inata executada pelas células NK

(COHEN et al., 1999; PIZZATO et al., 2004). Além disso, a proteína gp41 do

envelope viral aumenta a síntese de IL-10 por monócitos, o que leva ao aumento da

expressão das moléculas de HLA-G a fim de controlar a resposta imune e facilitar a

infecção (MATTE et al., 2004).

Estudos na região codificante do HLA-G encontraram uma associação entre o

alelo G*01:01:01 e a resistência a infecção pelo HIV em mulheres, e entre o alelo

G*01:04:04 e a susceptibilidade à infecção (TURK et al., 2013). Além disso, Matte e

colaboradores encontraram uma correlação do alelo G*01:05N (alelo nulo que

impede a produção de uma molécula de HLA-G funcional) com a proteção contra a

infecção pelo HIV (MATTE et al., 2004; LAJOIE et al., 2006), diferente do encontrado

por Segat e colaboradores, que mostraram um significativo aumento na frequência

desse alelo em mulheres HIV+ em relação a controles HIV- (SEGAT et al., 2010).

Uma associação entre o alelo G*01:01:08 e o aumento do risco de infecção pelo HIV

também foi encontrada (MATTE et al., 2004).

1.5. Co-infecção HPV e HIV na gestação, persistênci a e câncer

A frequência da infecção genital pelo HPV, bem como a progressão para

lesões displásicas ou mesmo o câncer, é mais comumente observada em mulheres

imunodeficientes (como as pacientes com aids e gestantes), quando comparadas a

mulheres imunocompetentes (PANTANOWITZ, 2010). Uma maior presença de tipos

de alto risco e de infecções por múltiplos tipos de HPV também pode ser observada

nesta população (GRINSZTEJN et al., 2009; MACLEOD et al., 2011; GARBUGLIA et

al., 2012; LUZ et al., 2012). Além disso, a imunossupressão causada pelo HIV

aumenta a persistência do HPV, aumentando o risco para lesões cervicais

(VERNON et al., 1994). A taxa de múltipla infecção nesta população varia de 44 a

35

79% (LEVI et al., 2002b; LEVI et al., 2004; LUQUE et al., 2006; GARBUGLIA et al.,

2012).

A gestação também é uma condição que está associada ao aumento da

prevalência de HPV, principalmente de alto risco (FIFE et al., 1996; HERNANDEZ-

GIRON et al., 2005). Além disso, mulheres gestantes têm uma rápida progressão da

lesão intraepitelial ao carcinoma durante a gestação e após o parto (ARMBRUSTER-

MORAES et al., 2000; PALLE et al., 2000).

Embora já esteja bem estabelecido que indivíduos HIV+ possuam um maior

risco de desenvolvimento de neoplasias anogenitais associadas ao HPV, os

mecanismos dessa interação ainda são pouco entendidos. Acredita-se que o HIV

possa interagir diretamente com o HPV, variando de acordo com o estágio da

doença neoplásica (PALEFSKY, 2003).

Considerando mulheres e homens infectados pelo HIV, existe uma correlação

entre a quantidade de DNA e a prevalência da infecção pelo HPV e baixos níveis de

células TCD4+ (< 500/mm3, com risco ainda maior entre indivíduos com contagens

menores de 200/mm3), indicando que a resposta imune pode exercer um importante

papel no controle da replicação do HPV (SUN et al., 1997; MOSCICKI et al., 2000,

PALEFSKY, 2003). Além disso, nessa população, baixas contagens de CD4+ estão

associados a um aumento no número de tipos de HPV presentes em amostras

cervicais (PALEFSKY et al., 1999).

Quanto ao uso da terapia antirretroviral altamente ativa (HAART- do inglês

High Active Antiretroviral Therapy) em indivíduos co-infectados, as análises

examinando o efeito do tratamento na história natural das lesões cervicais tem

obtido diferentes resultados, mostrando desde efeitos benéficos até a ausência de

efeitos (HEARD et al., 1998; LILLO et al., 2001; MINKOFF et al., 2001). Entretanto,

há um consenso de que mulheres com lesões cervicais em estágio mais avançado

falham na regressão das lesões mesmo após o início da HAART, inclusive em

pacientes com aumento nos níveis de células TCD4+ (HEARD et al., 2002).

Considerando seu potencial em modular a resposta imune contra o HPV, a

diversidade populacional encontrada no Brasil e a pequena quantidade de estudos

correlacionando a infecção pelo HPV ao HLA-G, nós conduzimos esse estudo

envolvendo gestantes HIV+ acompanhadas no Instituto de Puericultura e Pediatria

Martagão Gesteira da UFRJ, Rio de Janeiro, a fim de correlacionar os alelos de

HLA-G à susceptibilidade a infecção e persistência do HPV.

36

2. OBJETIVOS

Objetivo principal:

Analisar a associação dos alelos do HLA-G com a aquisição e a persistência

do HPV em uma população de gestantes HIV+ do Rio de Janeiro.

Objetivos secundários:

• Determinar os alelos de HLA-G da coorte de pacientes gestantes HIV+ em

acompanhamento no Programa de Assistência Integral à Gestante HIV

positiva do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira da UFRJ,

Rio de Janeiro.

• Correlacionar os alelos de HLA-G com infecção por diferentes tipos, espécies,

múltiplas infecções, evolução clínica e persistência da infecção pelo HPV.

• Relacionar os dados da citologia oncótica, fatores de risco e aspectos clínicos

com os alelos encontrados.

37

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Casuística

Este é um estudo longitudinal onde foram incluídas pacientes em

acompanhamento no Programa de Assistência Integral à Gestante HIV positiva do

Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG) da UFRJ, Rio de

Janeiro. O projeto foi aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa do Instituto

Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA) e do IPPMG (Anexos I e

II).

As pacientes foram convidadas a participar do estudo durante suas visitas

regulares de acompanhamento pré-natal no período entre abril de 2009 e maio de

2011 e foram acompanhadas por ao menos um ano. As pacientes incluídas no

estudo assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, e para as

pacientes menores de 18 anos foi ainda requerida à assinatura do responsável. Os

critérios de inclusão estabelecidos foram: ser infectada pelo HIV e estar no início do

segundo trimestre de gestação.

Cada paciente teve uma amostra de esfregaço cérvico-vaginal coletada no

ambulatório do IPPMG no início do segundo trimestre de gestação e seis meses

após o parto. As amostras foram acondicionadas em 1 ml de salina tamponada com

fosfato (PBS). Na primeira consulta um questionário com dados demográficos e

clínicos foi preenchido para cada gestante, incluindo: idade da menarca, idade da

primeira relação sexual, número de parceiros sexuais, uso de métodos

contraceptivos, paridade, doenças sexualmente transmissíveis (DST) prévias e

tabagismo (Tabela 3.1.1 e Anexo III).

38

Tabela 3.1.1: Perfil clínico-epidemiológico da amostragem estudada (n=140)

Dados epidemiológicos Mediana de idade (anos) 27 Mediana da menarca (anos) 12 Mediana da idade da primeira relação sexual (anos)

15

Alto risco de exposição ao HPV * (n)

116

Nº de parceiros sexuais ao longo da vida (n) 1 a 3 47 4 ou mais 90 Profissionais do sexo 2 Sem resposta 1

Status HPV+ (nº pacientes HPV+/ nº total analisado) No início do primeiro trimestre da gestação

80% (110/138)

Um ano após o parto 39% (38/97) * Alto risco de exposição ao HPV definido pela idade da primeira relação sexual igual

ou menor que 17 anos, ou mais de cinco parceiros sexuais ao longo da vida.

Informações relacionadas à infecção pelo HIV como contagem de células T

CD4+, carga viral e exames para detecção de outras DST foram obtidas na UFRJ

durante a rotina de acompanhamento das gestantes. A citologia foi classificada de

acordo com o sistema de Bethesda 2001 (SOLOMON et al., 2002). As amostras

coletadas foram enviadas para o Programa de Genética do Centro de Pesquisas do

INCA, e armazenadas em freezer a -80ºC para a realização dos estudos

moleculares.

O DNA genômico destas pacientes já havia sido extraído anteriormente para

outro estudo desenvolvido pelo nosso grupo durante o projeto de mestrado da aluna

Juliana Domett Siqueira. A definição do status da infecção pelo HPV, bem como o

tipo viral e a existência de múltiplas infecções já foram analisados e publicados

(MEYRELLES et al., 2013).

Das 138 amostras coletadas no início do segundo trimestre da gestação, 80%

(n=110) eram HPV+. Das 97 amostras coletadas um ano após o parto, 39% (n=38)

estavam infectadas pelo vírus. Com isso, puderam ser observados 13 casos de

novas infecções (quando o HPV da primeira e da segunda amostra eram de tipos

39

diferentes) e 32 casos de persistência tipo-específica (definida como a manutenção

da infecção com o mesmo tipo de HPV nos dois pontos analisados). A partir do

questionário com dados demográficos e clínicos, foi definido um subgrupo composto

por mulheres com alto risco de exposição ao vírus HPV, definido pela idade da

primeira relação sexual igual ou menor que 17 anos e/ou que tiveram mais de cinco

parceiros sexuais ao longo da vida.

3.2. Análise Molecular

3.2.1. Amplificação por PCR dos genes que codificam os domínios α1,

α2 e α3 do HLA-G

A região genômica de interesse foi amplificada pela técnica de reação em

cadeia da polimerase (PCR), incluindo os éxons 2, 3 e 4 do HLA-G, totalizando um

fragmento de aproximadamente 1.718 pb. A reação de PCR utilizou iniciadores

específicos como descrito por Fegurson e colaboradores (FERGUSON et al., 2011;

Tabela 3.2.1.1) e esquematizados na figura 3.2.1.1.

Figura 3.2.1.1 : Organização genômica do HLA-G, destacando-se a região de anelamento dos

iniciadores utilizados. Os nomes de iniciadores terminados com R especificam os iniciadores anti-

senso (modificado de http://humupd.oxfordjournals.org/content/12/3/209/F2.expansion).

40

Tabela 3.2.1.1: Descrição dos iniciadores utilizados na amplificação e sequenciamento da região

genômica estudada

Iniciador Sequência TM (ºC) Orientação Uso

G25 TCCATGAGGTATTTCAGCGC 55.1 Senso PCR

G26 GTGAGTAACTCCGGCCCAG 57.7 Senso Sequencimento

G26R CTGGGCCGGAGTTACTCAC 57.7 Anti-senso Sequencimento

G3R GGGTCACGTGTGTCTTGGG 58.4 Anti-senso Sequencimento

G4R CACCACCGACCCTGTTAAAG 55.7 Anti-senso PCR

As reações padronizadas de PCR foram utilizaram: 5 µL de tampão 10X, 1,5

µL de MgCl2 a 25 mM, 0,4 µL de dNTP mix a 25 mM, 0,5 µL de cada iniciador a 25

ρmol/µL, 0,4 µL de Taq Platinum polimerase (Invitrogen, São Paulo, Brasil) 5 U/µL,

100 ng de DNA e água ultrapura (Life Technologies, Carlsbad, EUA) para um volume

final de 50 µL. As reações foram realizadas em uma única etapa em termocicladores

modelo Veriti® 96 Well Thermal Cycler (Life Technologies, Carlsbad, EUA). A

ciclagem foi iniciada com ativação da enzima a 94°C por 2 minutos, seguida de 35

ciclos de três etapas compreendendo desnaturação a 94° por 30 segundos,

anelamento a 60°C por 30 segundos e extensão a 72°C por 1min/kb. Um ciclo final

de extensão submetia as amostras à temperatura de 72°C por 8 minutos.

Para analisar se a amplificação fora bem sucedida, uma alíquota de 5,0 µL do

produto amplificado de cada amostra era misturada em 1 µL do corante BlueGreen

(LGCBiotecnologia) e submetida à eletroforese horizontal (100 mAmp) com tampão

NaOH 1X em gel de agarose 1%. A visualização do gel foi realizada em um

transiluminador de ultravioleta (Bio-Rad, Tokyo, Japão) utilizando o programa

“KODAK Molecular Imaging Software©” (East Kodak Company, Nova York, EUA).

Para estimar o tamanho do fragmento desejado foi utilizado o marcador “1000 pb

DNA Ladder” (Amershan Biosciences, Baie-D'urfe, Canadá).

3.2.2. Purificação dos produtos de PCR

Os produtos de PCR foram purificados utilizando o conjunto de reagentes

“HiYield Gel/PCR DNA Mini Kit” (Real Genomics, Bio America Inc, Miami, USA),

segundo protocolo do fabricante. Brevemente, a purificação visa eliminar todos

reagentes não incorporados ao final da PCR. Foram adicionados 500 µL de tampão

41

de ligação (DF Buffer) ao produto, que foi posteriormente transferido para uma

membrana de sílica de alta capacidade, na qual o DNA é adsorvido na passagem

por centrifugação a 13.000 rpm por um minuto. Após essa etapa, 600 µL de tampão

de lavagem (Wash Buffer) foram adicionados, sendo novamente a amostra

centrifugada em duas etapas, cada uma delas com duração de um minuto e

velocidade de 13.000 rpm. O processo de purificação terminou com a eluição do

DNA com 40 µL do tampão de eluição depositado diretamente sobre a membrana da

coluna de purificação.

Os produtos foram novamente analisados em gel de agarose a 1% utilizando

2 µL do purificado para verificar sua integridade e estimar a concentração do DNA

através da intensidade da banda comparada à 2 µL do marcador de massa

molecular, Low DNA Mass Ladder (Life Technologies, Carlsbad, EUA). Esse

marcador permite estimar o valor aproximado da concentração dos produtos através

da comparação com bandas de diferentes concentrações definidas no manual do kit.

Após todo o procedimento, as amostras foram armazenadas em freezer a -20°C.

3.2.3. Sequenciamento das regiões genômicas de inte resse

As reações de sequenciamento foram realizadas com os reagentes do “Big

Dye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit” (Life Technologies, Carlsbad, EUA)

seguindo o protocolo do fabricante. Para cada reação utilizou-se de 5 a 20 ng de

DNA purificado, 1 µL (5 ρmol/mL) de cada iniciador, 1 µL de Big Dye, 1,5 µL de

tampão de sequenciamento 5x e água ultrapura para um volume final de 10 µL por

reação. As reações foram feitas em termociclador nas seguintes condições: 35 ciclos

de 96ºC por 10 segundos (desnaturação), 50º C por 5 segundos (anelamento) e

60ºC por quatro minutos (extensão).

A precipitação foi feita adicionando-se 80 µL de isopropanol a 75%, seguida

da incubação por 15 minutos a temperatura ambiente e posterior centrifugação por

45 minutos a 4ºC. Após o sobrenadante ser eliminado, foi realizada uma lavagem

com etanol a 70% e centrifugação por 5 minutos a temperatura ambiente.

Desprezou-se cuidadosamente o sobrenadante e o DNA foi ressuspendido em 10 µL

de formamida. As amostras foram sequenciadas em um aparelho ABI3130xl (Life

Technologies, Carlsbad, EUA).

42

3.2.4. Edição, Alinhamento das sequências e definiç ão dos alelos

Os eletroferogramas obtidos a partir de cada iniciador foram agrupados e

editados manualmente no programa “DNASTAR Lasergene 7” (DNAstar, Wisconsin,

EUA), com a ferramenta “SeqMan”, gerando uma sequência-consenso. Os

consensos gerados e as sequências-referência para todos os alelos descritos

retiradas do banco de dados IMGT/HLA

(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/ipd/imgt/hla/G_gen.fasta) foram alinhados no

programa Bioedit (HALL et al., 1999) para definição dos alelos. O site especifica

todas as sequências utilizadas como referência, sendo única para cada alelo, com

seus respectivos números de acesso, nome do alelo e tamanho do fragmento. A

definição foi baseada em análises de similaridade das sequências com as

referências através de uma inspeção visual.

Amostras heterozigotas que não puderam ser definidas seja por suspeita de

novos alelos quanto pela presença de picos duplos em posições definidoras de

alelos, foram submetidas à clonagem a fim de definir os alelos presentes.

3.2.5. Clonagem de heterozigotos e investigação de novos alelos

As reações de clonagem usaram o conjunto de reagentes do “TOPO® TA

Cloning® Kit for Sequencing” (Life Technologies, Estados Unidos) seguindo

instruções do protocolo do fabricante. Este se baseia no fato de que os produtos de

PCR amplificados com a enzima Taq® frequentemente possuem uma adenosina

projetada nas extremidades 3’, dessa forma o sistema de clonagem T-A possui uma

sequencia com timinas complementares projetadas para se ligarem ao fragmento de

interesse amplificado pela PCR.

Como o tamanho do inserto (aproximadamente 1800 pb) dificultou a

realização da clonagem da sequência completa em um único experimento, optamos

por dividir nossa região de interesse em dois fragmentos com cerca de 1300 pb

cada, o que confere uma região de sobreposição entre esses fragmentos de cerca

de 600 pb. Dessa forma cada amostra teve de ser clonada em duas reações

diferentes. Os produtos utilizados nessas reações foram obtidos através de uma

reação de PCR semi-aninhada a partir do produto de PCR obtido inicialmente para

ser utilizado no sequenciamento direto. Nessas novas reações foram utilizados os

iniciadores G25 e G3R em uma reação e G26 e G4R em outra. As condições da

PCR foram semelhantes as já descritas.

43

Na primeira etapa da clonagem, a 4 µl produto de PCR foi adicionado 1 µl de

TOPO Cloning Vector e 1 µl de Salt Solution diluído quatro vezes. Essa reação foi

incubada por 30 minutos em temperatura ambiente. As reações de ligação (2 µl)

foram adicionadas em 50 µL de células eletrocompetentes “Gene Hogs” (Life

Technologies, EUA). Em seguida, as amostras foram transferidas para uma cubeta

de eletroporação de 0,2 cm e submetidas a um choque elétrico (Capacitância 25

µFD, resistência 200Ω-500 Ω, voltagem 2,5 KV). Após o choque, em cada tubo

foram adicionados 400 µl de meio SOC (contido no kit). Posteriormente as bactérias

incubadas foram incubadas para recuperação a 37°C por 1 hora no agitador (LAB-

LINE Incubator-Shaker, ORBIT, modelo 3525, EUA). Após o período de recuperação

das bactérias, a cultura líquida foi plaqueada em meio LB ágar contendo o antibiótico

de seleção.

A reação de transformação foi dividida em duas partes iguais e cada metade

foi colocada em uma placa com meio sólido contendo ampicilina, totalizando duas

placas por vírus clonado. Usando uma alça de vidro previamente flambada em

álcool, a transformação foi espalhada em ambas às placas que foram incubadas na

estufa (REVCO\Lindberg, modelo RCO3000TABA, EUA) a 37°C por 12-16 horas.

Para cada placa foram selecionadas aleatoriamente no mínimo 20 colônias. A

confirmação de que os clones continham o inserto de interesse foi feita através de

PCR de colônia ajustados para um volume final de 25 µL, utilizando-se os

iniciadores M13 senso (5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’) e anti-senso (5’-

CAGGAAACAGCTATGAC-3’) fornecidos pelo kit. Cada colônia foi tocada com uma

ponteira de micropipeta estéril e colocada na mistura da PCR. A ciclagem utilizada

foi similar a da PCR aninhada, descrita anteriormente, somente alterando a

temperatura de anelamento para 55°C por trinta segundos. Para cada amostra,

foram incluídos controles negativos contendo apenas os reagentes utilizados na

PCR para verificar a presença de contaminantes. Posteriormente, foi verificada a

existência do inserto desejado em gel de agarose 1%. Confirmada a presença do

inserto, o produto foi purificado, sequenciado, editado e analisado como descrito

anteriormente.

3.3. Análises Estatísticas

Para as análises de correlação dos alelos do HLA-G com a susceptibilidade à

44

infecção e à persistência do HPV, foram utilizados os conjuntos HLA G:01:01:01

(que abrange os alelos G:01:01:01:01/02 e G:01:01:01:03/04/05), G:01:01:02 (com

os alelos G:01:01:02:01 e G:01:01:02:02), G:01:03 (G:01:03:01:02) e G:01:04 (que

inclui os alelos G:01:04:01, G:01:04:04 e G:01:04:05). A estimativa do efeito de cada

alelo na infecção foi feita comparando os indivíduos testados positivamente para a

presença de um determinado alelo com indivíduos que não o possuem. Foram feitos

testes para inúmeros desfechos clínicos e características da infecção.

Além disso, as espécies do HPV foram compiladas em três grupos baseados

nas análises filogenéticas feitas por de Villiers e colaboradores, 2004, como

proposto por Ferguson e colaboradores, 2012. O grupo A incluiu as espécies 1, 8, 10

e 13; o grupo B incluiu as espécies 5, 6, 7, 9 e 11; e o grupo C incluiu as espécies 2,

3, 4 e 15. O grupo B compreende os tipos de HPV com alto risco oncogênico,

enquanto os grupos A e C são formados por tipos de baixo risco.

A frequência dos alelos presentes na casuística foi determinada por contagem

direta. As associações entre os alelos e os diferentes desfechos foram investigados

através do valor de odds ratio (OR) e 95% de Intervalo de Confiança (IC) obtido

através da análise de regressão logística ajustada por diferentes fatores no

programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, Armonk, NY: IBM

Corp).

Os ajustes foram feitos testando-se a influência dos fatores de risco

associados ao HPV como o número de parceiros sexuais ao longo da vida,

tabagismo, número de gestações, uso de anticoncepcional, múltipla infecção e idade

da primeira relação sexual com o desfecho final a ser considerado na análise.

O teste Qui-quadrado com distribuição de Poisson foi usado para avaliar

associações entre as variáveis categóricas. Um valor de p ≤ 0,05 foi considerado

como estatisticamente significativo e os valores menores que 0,1 foram

considerados como uma tendência de associação. Todas as análises estatísticas

foram feitas em colaboração com a Profa. Dra. Anke Bergmann.

45

4. RESULTADOS

Todas as 140 pacientes arroladas no estudo tiveram a região genômica do

HLA-G amplificada e sequenciada. Dessas, apenas 14 não puderam ter o seu alelo

definido devido ao tamanho insuficiente do fragmento sequenciado. As outras 126

pacientes foram analisadas e tiveram seu alelo definido através da similaridade entre

as sequências obtidas e sequências-referência de cada alelo retiradas do banco de

dados IMGT/HLA. Cabe destacar que durante as análises dos eletroferogramas

foram observados picos duplos nas sequências, indicativo de heterozigose de

determinadas amostras (Fig. 4.1).

Figura 4.3.3.1. Alinhamento da sequência obtida com o iniciador G4R da paciente 110 com a

referência do HLA-G, destacando o pico duplo na posição 1381 (cujo nucleotídeo está destacado em

vermelho na sequência consenso gerada). A visualização do alinhamento foi feita no programa

Seqman (DNA Star).

Para serem classificadas, as sequências obtidas das pacientes deveriam

possuir total similaridade à sequência-referência de determinado alelo, caso

contrário levantou-se a possibilidade da presença de um novo alelo, fato confirmado

apenas após a realização da clonagem. Das quatorze amostras clonadas, foram

identificados seis alelos novos (não descritos na base de dados) (Tabela 4.1),

presentes em sete indivíduos, e esclarecidos sete genótipos heterozigotos que não

puderam ser definidos através do sequenciamento direto das amostras.

As amostras foram clonadas em dois fragmentos, totalizando 28 reações de

clonagem. De cada reação foram selecionadas em média 15 colônias (6-20). Para a

determinação dos alelos presentes nesses indivíduos foram feitos alinhamentos

contendo as sequências obtidas a partir dos clones de ambos os fragmentos, as

sequências utilizadas como referência para cada alelo e a sequência obtida através

do sequenciamento direto da amostra, permitindo assim a verificação da presença

46

de clones contendo os dois nucleotídeos presentes nos picos duplos, como pode ser

visualizado na figura 4.2.

Figura 4.3.3.2. Alinhamento contendo os clones obtidos de HLA-G da paciente 121. Destacado pela

seta vermelha está a troca G para C na posição 1249, definidora do novo alelo por distingui-lo do

HLA:G*:01:01:02:01. As referências iniciam com HLA:G*, a sequência obtida através do

sequenciamento direto está identificada como 121HLA-G e os demais representam os clones obtidos.

A sequência definida como modelo do novo alelo está nomeada como AN121-5 HLA-G F1.

A localização das mudanças nucleotídicas identificadas nos seis novos alelos

encontrados no estudo estão especificadas na Tabela 4.1.

47

Tabela 4.1 . Informações dos seis alelos novos de HLA-G encontrados em heterozigose no estudo

Número de

pacientes

contendo o

novo alelo

Denominação

utilizada no

estudo

ID das pacientes

Troca

nucleotídica

(Posição)*

Localização

Genômica no

gene HLA-G

4 A 2, 114, 121, 125 G1249C Íntron 3

1 B 28

G294A;

C503T

C901G

Íntron 2

Éxon 3

Íntron 3

1 C 91 C89T Éxon 2

1 D 98 G707A Éxon 2

1 E 54 C278T Íntron 2

1 F 54 A76T Éxon 2

*A posição foi definida com base na classificação do banco de dados IMGT/HLA. A paciente 54 é um

heterozigoto com 2 alelos novos.

Os novos alelos encontrados ainda serão submetidos ao Comitê de

Nomenclatura da Organização Mundial da Saúde a fim de validar os novos alelos e

incorporá-los ao banco de dados mundial IMGT/HLA.

Foi possível identificar 52 genótipos nessa casuística, todos representados na

Tabela 4.2. Além disso, 41 pacientes foram identificadas como homozigotos no gene

HLA-G, abrangendo um total de oito genótipos. Cabe destacar a presença de um

alelo novo em específico que foi observado em quatro indivíduos compondo três

diferentes genótipos.

48

Tabela 4.2. Genótipos encontrados nas pacientes do estudo ordenados por ocorrência (n=126)

As letras de A-F presentes na tabela representam os novos alelos encontrados como definido na tabela 4.1; em roxo está destacado o novo alelo que pode ser encontrado em três genótipos diferentes. Os demais novos alelos foram encontrados em apenas um individuo e, portanto, cada um representa um novo alelo único.

Os genótipos encontrados na casuística compreendem vinte e dois diferentes

alelos de HLA-G dos cinquenta descritos até o momento. Aqueles com frequência

maior que 3% estão representados na figura 4.3.

Alelo A Alelo B N Alelo A Alelo B N

G:01:01:01:01/02 G:01:01:01:01/02 14 G:01:04:04 G:01:01:01:06 2

G:01:01:02:01 G:01:01:02:01 11 G:01:01:01:01/02 B 1

G:01:01:01:01/02 G:01:03:01:02 7 G:01:01:01:01/02 D 1

G:01:01:01:01/02 G:01:01:01:03/04/05 5 G:01:01:01:01/02 G:01:01:16 1

G:01:01:01:01/02 G:01:01:02:01 5 G:01:01:01:03/04/05 G:01:01:02:01 1

G:01:01:01:03/04/05 G:01:04:04 4 G:01:01:01:03/04/05 G:01:01:06 1

G:01:04:04 G:01:04:04 4 G:01:01:01:03/04/05 G:01:01:19 1

G:01:05N G:01:05N 4 G:01:01:01:03/04/05 G:01:04:01 1

G:01:01:01:01/02 G:01:01:03:03 3 G:01:01:01:03/04/05 G:01:05N 1

G:01:01:01:01/02 G:01:04:01 4 G:01:01:01:03/04/05 G:01:01:15 1

G:01:01:01:01/02 G:01:05N 3 G:01:01:02:01 G:01:01:03:03 1

G:01:01:01:03/04/05 G:01:01:01:03/04/05 3 G:01:01:02:01 G:01:04:05 1

G:01:01:01:03/04/05 G:01:01:03:03 3 G:01:01:02:01 A 1

G:01:01:02:01 G:01:04:01 3 G:01:01:02:02 G:01:01:02:02 1

G:01:01:02:01 G:01:04:04 3 G:01:01:02:02 G:01:04:04 1

G:01:01:02:01 G:01:06 3 G:01:01:02:02 G:01:01:06 1

G:01:01:01:01/02 G:01:06 2 G:01:01:03:03 G:01:01:06 1

G:01:01:01:03/04/05 G:01:03:01:02 2 G:01:01:19 G:01:04:04 1

G:01:01:02:01 G:01:01:06 2 G:01:01:19 G:01:05N 1

G:01:01:02:01 G:01:03:01:02 2 G:01:03:01:02 G:01:04:01 1

G:01:01:19 G:01:01:19 2 G:01:04:01 G:01:06 1

G:01:04:01 G:01:04:01 2 G:01:01:01:01/02 G:01:01:06 1

G:01:04:01 G:01:05N 2 G:01:04:01 C 1

G:01:04:01 G:01:04:04 2 G:01:05N A 1

G:01:04:01 A 2 E F 1

G:01:04:04 G:01:05N 2 G:01:01:01:01/02 G:01:01:05 1

49

Figura 4.3.3.3 . Frequências alélicas dos variantes de HLA-G encontrados no estudo com valor

superior a 3%. A classe “Novos” abrange todos os seis novos alelos identificados. A classe “Outros”

se refere à soma da frequência dos alelos G:01:01:02:02, G:01:01:05, G:01:01:06, G:01:03:01:02,

G:01:04:05 e G:01:06 (Com freqüência individual abaixo de 3%).

Para as análises de correlação dos alelos do HLA-G com a susceptibilidade à

infecção e à persistência do HPV, foram utilizados os alelos HLA G:01:01:01,

G:01:01:02, G:01:03, G:01:04 e G:01:05N, descritos como os mais frequentes

mundialmente e encontrados nesse estudo com frequência acima de 4%. As

análises de regressão logística indicaram que os principais fatores de ajuste a serem

considerados foram a idade e pertencer ou não ao grupo previamente definido de

mulheres com alto risco de exposição ao vírus.

A Tabela 4.3 representa a relação entre a presença/ausência dos alelos e a

infecção pelos respectivos grupos de HPV definidos previamente (vide seção

“Análises estatísticas” em Material e Métodos), destacando-se o efeito protetor

exercido por dois diferentes alelos. O estudo mostrou que o alelo G:01:03 pôde ser

associado à proteção contra a infecção por espécies de HPV do grupo B (alto risco

oncogênico) e o alelo G:01:01:02 pôde ser associado à proteção contra a infecção

por espécies do grupo C (baixo risco oncogênico).

50

Tabela 4.3 . Resultados obtidos através de análises de regressão logística ajustada por idade mostrando a correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a infecção por diferentes tipos de HPV durante o período de estudo.

Grupo A Grupo B Grupo C

Alelo Negativo

(%)

Positivo

(%) P

OR

(IC 95%)

Negativo

(%)

Positivo

(%) P

OR

(IC 95%)

Negativo

(%)

Positivo

(%) P

OR

(IC 95%)

G:01:01:01

Ausente 88,7 11,3 0,761 22,6 77,4 0,564 87,1 12,9 2,039

Presente 90,6 9,4 0,776

0,237-2,438 34,4 65,6 0,170

0,255-1,243 76,6 23,4 0,167

0,792-5,249

G:01:01:02

Ausente 87,6 12,4 0,435 29,2 70,8 1,087 76,4 23,6 0,187

Presente 94,6 5,4 0,342

0,09-2,097 27 73 1,000

0,457-2,583 94,6 5,4 0,021

0,041-0,847

G:01:03

Ausente 90,4 9,6 1,637 25,4 74,6 0,246 81,6 18,4 0,833

Presente 83,3 16,7 0,358

0,307-8,737 58,3 41,7 0,038

0,071-0,851 83,3 16,7 1,000

0,166-4,174

G:01:04

Ausente 91 9 1,496 30,3 69,7 1,389 82 18 1,041

Presente 86,5 13,5 0,523

0,451-4,966 24,3 75,7 0,665

0,575-3,356 81,1 18,9 1,000

0,387-2,803

G:01:05N

Ausente 90,2 9,8 1,485 28,6 71,4 1,012 83,9 16,1 2,872

Presente 85,7 14,3 0,638

0,292-7,566 28,6 71,4 1,000

0,295-3,469 64,3 35,7 0,133

0,860-9,588

Grupo A: espécies de HPV 1, 8, 10 e 13; Grupo B: espécies de HPV 5, 6, 7, 9, 11; Grupo C: espécies de HPV 2, 3, 4 e 15. As associações significativas estão destacadas em vermelho. A presença do alelo se refere à soma de indivíduos homozigotos e heterozigotos (quando aplicável). A positividade para a infecção em um determinado grupo representa a presença de ao menos um tipo de HPV pertencente a alguma das espécies abrangidas no respectivo grupo.

51

A fim de melhor investigar as associações encontradas relacionando os alelos

com a infecção pelo HPV, fizemos novas análises considerando o genótipo de HLA-

G das amostras. Além disso, essa nova análise foi dividida em duas etapas: uma

onde foi feito apenas o ajuste da idade e outra ajustada para a idade e o alto risco

de exposição ao vírus. Dessa forma, foi analisada a ausência do alelo versus casos

de pacientes homozigotos com o alelo versus casos de pacientes heterozigotos com

o alelo. Cabe destacar que o alelo G:01:03 foi encontrado na nossa casuística

apenas na forma heterozigota, o que impossibilitou sua subdivisão. Nessa nova

análise não tivemos nenhuma significância estatística, entretanto encontramos uma

tendência de associação do genótipo homozigoto G:01:05N com o aumento do risco

de infecção por espécies de HPV do grupo C (Tabela 4.4).

52

Tabela 4.4. Resultados obtidos através de análises de regressão logística ajustada por idade e por alto risco de exposição ao vírus HPV evidenciando a

correlação entre os genótipos de HLA-G encontrados e a infecção durante o período de estudo.

Grupo A Grupo B Grupo C

Alelo

p OR* p ARE OR ARE p OR p ARE OR ARE p OR p ARE OR ARE

G:01:01:01

Heterozigoto 0,294 0,465 (0,111-1,946)

0,302 0,472 (0,113-1,968)

0,155 0,541 (0,232-1,261)

0,149 0,535 (0,229-1,252)

0,191 1,964 (0,715-5,398)

0,193 1,957 (0,713-5,375)

Homozigoto 0,408 1,881 (0,421-8,396)

0,435 1,819 (0,404-8,183)

0,468 0,638 (0,189-2,149)

0,436 0,615 (0,181-2,088)

0,236 2,267 (0,585-8,788)

0,249 2,226 (0,571-8,680)

G:01:01:02

Heterozigoto 0,290 0,321 (0,039-2,631)

0,301 0,329 (0,040-2,706)

0,683 0,817 (0,311-2,148)

0,701 0,828 (0,314-2,179)

0,118 0,295 (0,064-1,362)

0,121 0,298 (0,064-1,377)

Homozigoto 0,731 0,684 (0,078-5,996)

0,722 0,673 (0,076-5,931)

0,333 2,193 (0,448-10,745)

0,335 2,186 (0,445-10,726)

0,999 0 0,999 0

G:01:04

Heterozigoto 0,977 1,021 (0,250-4,166)

0,937 1,059 (0,254-4,419)

0,386 1,530 (0,585-4,000)

0,328 1,622 (0,615-4,280)

0,898 1,071 (0,376-3,055)

0,836 1,120 (0,385-3,261)

Homozigoto 0,097 4,820 (0,753-30,853)

0,124 4,491 (0,662-30,472)

0,901 0,894 (0,154-5,201)

0,806 0,799 (0,134-4,778)

0,918 0,890 (0,097-8,176)

0,862 0,818 (0,086-7,832)

G:01:05N

Heterozigoto 0,949 0,931 (0,106-8,165)

0,938 0,917 (0,103-8,127)

0,471 0,612 (0,161-2,328)

0,470 0,611 (0,160-2,328)

0,297 2,164 (0,507-9,233)

0,298 2,166 (0,506-9,276)

Homozigoto 0,306 3,464 (0,321-37,316)

0,270 3,861 (0,349-42,645)

0,999 - 0,999 - 0,103 5,443 (0,711-1,657)

0,094 5,761 (0,742-44,695)

Grupo A: espécies de HPV 1, 8, 10 e 13; Grupo B: espécies de HPV 5, 6, 7, 9, 11; Grupo C: espécies de HPV 2, 3, 4 e 15. ARE- refere-se a um grupo apenas com mulheres sob Alto Risco de Exposição ao Vírus HPV * A OR é definida em relação às pacientes negativas para o alelo em questão, definida como = 1.

53

Como não foi encontrada associação entre a família G:01:01:01 e a infecção pelo

HPV em nenhum dos três grupos, a análise foi repetida considerando-se apenas o alelo

G:01:01:01:01/02 (presente em 25% da casuística), que codifica para a mesma proteína

que o alelo G:01:01:01:03/04/05, já que os últimos dígitos separados pelas barras

representam apenas alterações nucleotídicas presentes em uma região de íntron não

incluída no nosso estudo, o que prejudica a definição do alelo com oito dígitos. A

análise mostrou a associação do alelo G:01:01:01:01/02 com a proteção contra a

infecção por espécies do grupo C (p= 0,033; OR 2,729 (IC 95% 1,082-6,887)).

Em vista do fato de que o HPV 16 foi o mais frequentemente encontrado em

nossa casuística (n = 44, 35%), analisamos também a associação de alelos de HLA-G

com a infecção por este tipo viral. Entretanto, os resultados não apontaram nenhuma

associação estatisticamente significativa (Anexo V).

Foram também realizadas análises de associação dos alelos de HLA-G com os

casos de eliminação e persistência da infecção pelo HPV durante o tempo de

acompanhamento do estudo, mas nenhuma correlação estatisticamente significativa

pode ser encontrada. As análises foram repetidas restringindo-se a série ao grupo de

mulheres com alto risco de exposição ao vírus, como definido anteriormente. Isto

permitiu observar que o alelo G:01:04 está aparentemente associado a um aumento do

risco de persistência do vírus (p= 0,091; OR 2,299 (IC 95% 0,877-6,028)) (Anexo 2).

Ainda em relação à persistência, não foi encontrada nenhuma associação entre

qualquer alelo e a infecção persistente pelo HPV 16 (Anexo V).

As análises da correlação dos alelos aos casos de múltipla infecção foram

realizadas considerando-se toda a casuística e posteriormente apenas as mulheres

pertencentes ao grupo com alto risco de exposição, entretanto nenhuma associação foi

encontrada.

Quanto às alterações citológicas detectadas por colposcopia, foram realizadas

análises de correlação entre os alelos do HLA-G e a ocorrência de lesões que

apontaram um efeito protetor contra a ocorrência de lesões em pacientes com o alelo

G:01:01:02, e uma tendência de aumento de ocorrência de lesões em pacientes

portando os alelos G:01:04 e G:01:05N (Tabela 4.5).

54

Tabela 4.5: Correlação entre os alelos de HLA-G e a presença de alterações citológicas (LSIL e/ou HSIL)

Alelos Lesão

citológica (%) OR p OR (ARE) p ARE

Ausente 34 G:01:01:01

Presente 34

1,001 (0,477-2,102)

0,997 1,009

(0,480-2,122) 0,981

Ausente 43 G:01:01:02

Presente 13

0,212 (0,075-0,597)

0,003 0,210

(0,074-0,593) 0,003

Ausente 35 G:01:03

Presente 25

0,573 (0,144-2,279)

0,429 0,558

(0,140-2,227) 0,408

Ausente 29 G:01:04

Presente 46

2,027 (0,915-4,493)

0,082 2,009

(0,903-4,469) 0,087

Ausente 31 G:01:05N

Presente 57

2,903 (0,935-9,012)

0,065 2,882

(0,928-8,955) 0,067

Em vermelho está destacado o efeito protetor do alelo G:01:01:02 contra a ocorrência de lesões,

associações estas significativas. ARE- refere-se a um grupo apenas com mulheres sob Alto Risco de

Exposição ao HPV

Em uma análise da persistência das lesões, observou-se a associação do alelo

G:01:04 (p=0,036, Anexo 8.4.1) com a persistência da lesão em pacientes com citologia

alterada, significância essa que se manteve tanto na análise de regressão ajustada por

idade, quanto na análise ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus.

Para as análises estatísticas também foram considerados parâmetros clínicos

como a contagem da carga viral do HIV e a contagem de células CD4 por mm3, na qual

podemos destacar apenas uma tendência de associação do alelo G:01:01:02 à valores

indetectáveis de carga viral (p=0,059; OR 2,269 (IC 95% 0,969-5,313)) e uma

associação do alelo G:01:05N a contagem de células abaixo de 350 por mm3 (p= 0,024;

OR 0,249 (IC 95% 0,74-0,835). A tabela completa está disponível no Anexo V.

55

5. DISCUSSÃO

É sabido que o HPV evoluiu a fim de escapar da detecção pelo sistema imune

através de diversos mecanismos de forma a estabelecer a infecção e manter a

persistência viral. Inúmeros são os imunomoduladores capazes de atuar nesse

processo. Nesse contexto, a importância do HLA-G na regulação negativa da resposta

do sistema imune tem sido alvo de diversos estudos atuais (revisado por CAROSELLA

et al., 2008b).

Os resultados obtidos através da genotipagem dos éxons 2 a 4 do HLA-G

permitiram a aplicação de análises estatísticas para descrever e caracterizar uma

amostra populacional de 126 gestantes HIV+ acompanhadas no Rio de Janeiro. Foi

possível traçar um perfil da variabilidade genética do HLA-G e comparar esses dados

com as poucas informações disponíveis na literatura obtidas em estudos similares com

outras amostras populacionais de Montreal e Quebec, ambos no Canadá (FERGUSON

et al., 2011; FERGUSON et al., 2012; METCALFE et al., 2013).

A elevada variedade de alelos observada é condizente com o alto nível de

diversidade genética intrapopulacional associado às amostras brasileiras. O Brasil é

relatado como uma das populações mais heterogêneas do mundo como resultado de

cinco séculos de cruzamentos entre diferentes etnias oriundas de três continentes: os

colonizadores europeus (representados principalmente pelos portugueses), os colonos

ameríndios e os escravos africanos (PARRA et al., 2003). Dessa forma, o país

apresenta a maior variabilidade já detectada de alelos do HLA-G. Em estudos

anteriores com populações brasileiras, 43% dos alelos descritos haviam sido

identificados (CASTELLI et al., 2007, CASTELLI et al., 2008). Nosso estudo encontrou

uma taxa de detecção similar, tendo identificado 22 de 50 alelos (44%) alelos descritos.

Embora a região codificante apresente menor diversidade nucleotídica do que as

regiões promotora (5’URR) e 3’UTR, com uma média de uma variação a cada 62

nucleotídeos, é responsável pela maior diversidade haplotípica do gene (CASTELLI et

al., 2011). Dessa maneira, nosso estudo se propôs a analisar exclusivamente essa

região.

Por definição, um polimorfismo deve estar presente em uma população em uma

56

frequência maior que 1%. Com isso, alguns polimorfismos do HLA-G podem não ser

validados, já que estão presentes em apenas um ou poucos indivíduos em cada estudo.

Entre os 13 polimorfismos descritos para o éxon 2, 12 para o éxon 3 e 8 para o éxon 4,

aparentemente apenas quatro desses (um no éxon 2, 2 no éxon 3 e um no éxon 4)

estão presentes com uma frequência maior do que 1% na população mundial (revisto

por DONADI et al., 2011). Cabe aqui destacar que a maioria dos sítios polimórficos

nessa região representam substituições sinônimas e que apenas uma substituição não-

sinônima em cada um dos éxons 2, 3 e 4 possui frequência mundial maior que 1%

(revisto por DONADI et al., 2011).

Esse é o primeiro estudo investigando a associação dos alelos do HLA-G com a

susceptibilidade à infecção e à persistência do HPV na população brasileira. Em

relação a estudos brasileiros com o HLA-G e a infecção pelo HPV, o primeiro estudo

publicado na literatura foi realizado por Simões e colaboradores com mulheres em

acompanhamento na cidade de Ribeirão Preto, que buscou correlacionar os alelos do

HLA-G com as lesões citológicas provocadas pelo HPV (SIMOES et al., 2009). Esse

estudo utilizou a técnica de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) para

caracterizar os éxons 2 e 3 definindo os alelos apenas em nível de família, enquanto o

nosso estudo analisou a região dos éxons 2-4 com as técnicas de sequenciamento e

clonagem, o que nos permitiu definir os alelos além do nível de família e portanto uma

associação mais clara entre os alelos e a infecção. Um outro estudo realizado na

população brasileira foi feito com base na definição dos polimorfismos presentes na

região 3’UTR, impossibilitando a comparação com os dados obtidos a partir da região

codificante, o caso aqui presente (SILVA et al., 2013).

Nosso estudo encontrou alelos que codificam as quatro diferentes proteínas do

HLA-G comumente observadas na população mundial. Eles estão distribuídos nas

famílias G:01:01. G:01:03, G:01:04 e G:01:06 e podem influenciar na função do HLA-G

por modificarem o sítio de ligação aos aminoácidos.

O alelo mais predominante em nosso estudo foi o G:01:01:01:01/02 encontrado

em 26% da população. Por sua vez, o alelo G:01:01:01:03/04/05 foi encontrado em

11% das mulheres, totalizando uma frequência de 37% para a família G:01:01:01, taxa

essa similar à encontrada em indivíduos da cidade de São Paulo (CASTELLI et al.,

57

2007). Os alelos da família G:01:01:01 são os mais encontrados em todo o mundo, com

frequência variando de 10% no Norte da Índia, a 33% no Japão, 52% na Polônia, 56%

na Dinamarca e 83% em Gana (ISHITANI et al., 1999; ABBAS et al., 2004; HVIID et al.,

2006; SIPAK-SZMIGIEL et al., 2009). Outro alelo bastante frequente no estudo foi o

alelo G:01:01:02:01, presente em 17.46% das mulheres, taxa comparável a frequência

de 15.5% encontrada na cidade de São Paulo (CASTELLI et al., 2011, CASTELLI et al.,

2008).

Sabe-se que o alelo G:01:05N, presente em 7% das mulheres da nossa

casuística, é encontrado com frequência em algumas populações e está ausente em

outras, estando superrepresentado no norte da Índia (15.4%) e no povo Shona

localizado no Zimbábue e Moçambique (11.1%) quando comparado à Dinamarca (1%)

e a outros estudos feitos no Brasil (0.97%-4.17%) (MATTE et al., 2002; ABBAS et al.,

2004; HVIID et al., 2006; CASTELLI et al., 2007, CASTELLI et al., 2009).

Dos alelos descritos recentemente na população brasileira por Castelli e

colaboradores, foi possível encontrar em nossa casuística oito indivíduos portando o

alelo G:01:01:03:03, descrito em 2012 e encontrado em dois indivíduos da cidade de

Ribeirão Preto, São Paulo (CASTELLI et al., 2012).

Os alelos G:01:01:03, G:01:01:05 e G:01:01:08 estão associados na literatura ao

aumento do risco de infecção por espécies de HPV incluídas no grupo A, entretanto, tal

associação não foi encontrada no nosso estudo. Tal fato pode ser explicado pela baixa

frequência do alelo G:01:01:05 e pela ausência do alelo G:01:01:08 em nossa

casuística. Já o alelo G:01:01:03 estava presente apenas em mulheres infectadas por

espécies de HPV grupo B. Além desses, os alelos G:01:01:01, G:01:01:02 e G:01:04:01

também não puderam ser associados às características descritas anteriormente na

literatura, respectivamente aumento do risco de infecção por espécies dos grupos A e

C, aumento do risco de infecção pelo HPV-16 e proteção contra a infecção por espécies

de HPV do grupo C (FERGUSON et al., 2012, FERGUSON et al., 2011; METCALFE et

al., 2013).

A análise das pacientes incluídas no nosso estudo permitiu encontrar

associações protetoras contra a infecção pelo HPV em dois alelos: o alelo G:01:03 se

58

mostrou protetor contra a infecção por espécies do grupo B e o alelo G:01:01:02

ofereceu proteção contra a infecção por espécies do grupo C. Quando as análises

foram divididas em pacientes homozigotos e heterozigotos foi encontrada apenas uma

tendência de associação entre a forma homozigota do alelo G:01:05N e o risco de

infecção por espécies do grupo C (p=0.094; OR 5,761 (IC 95% 0,742-44,695).

Ainda que não tenha sido encontrada associação entre a família G:01:01:01 e a

infecção por espécies de HPV incluídas no grupo C, foi evidenciada uma associação

com o alelo G:01:01:01:01/02 (p=0.04413). Deve-se esclarecer que esse alelo possui a

mesma sequência que o alelo G:01:01:01:03/04/05 que também compõe o conjunto

G:01:01:01, exceto por uma única substituição nucleotídica no íntron 3. Dessa forma,

acreditamos que o menor número de indivíduos com o alelo G:01:01:01:03/04/05

quando comparado aos indivíduos com o alelo G:01:01:01:01/02, e alta taxa de

heterozigotos nesse último grupo tenham influenciado na falta de significância

estatística quando a família foi analisada.

Com relação à persistência, assim como no estudo de Metcalfe e colaboradores,

nenhuma associação dos alelos com a manutenção de ao menos um tipo viral durante

o tempo de acompanhamento do estudo foi significante nem mesmo dos alelos

G:01:01:02 (descritos na literatura como associados à persistência do HPV-16) e

G:01:03 (associado a persistência das espécies do grupo C) (FERGUSON et al., 2012,

FERGUSON et al., 2011; METCALFE et al., 2013). Esse fato também pode estar

correlacionado ao baixo número de pacientes persistentes com esses alelos. A

tendência de associação entre o alelo G:01:04 e o aumento do risco da persistência

viral ainda precisa ser melhor investigada, de forma a validar a correlação evitando-se a

influência do baixo número de amostras (p=0,091; OR 2,299 (IC 95% 0,877-6,028)).

As análises de associação entre as alterações citológicas detectadas por

colposcopia e os alelos do HLA-G, permitiram evidenciar um efeito protetor contra a

ocorrência de lesões em pacientes portando o alelo G:01:01:02 e uma tendência de

aumento da ocorrência de lesões em pacientes com os alelos G:01:04 e G:01:05N. O

trabalho realizado por Simões e colaboradores encontrou uma correlação entre o alelo

G:01:03 e a proteção contra a ocorrência de lesões associadas ao HPV (SIMOES et al.,

2009). Tal associação não pode ser confirmada pelo nosso estudo uma vez que 25%

59

das mulheres com o alelo apresentavam lesão citológica versus 35% das mulheres em

o alelo. Em contrapartida, nosso estudo encontrou significância ao correlacionar o alelo

G:01:01:02 às lesões ocasionadas pelo HPV, diferente do estudo de Metcalfe, que

encontrou associação dos alelos G:01:01:02, G:01:04:01 e G:01:06 com as lesões mas

não alcançou significância estatística (METCALFE et al., 2013). De maneira

interessante, foi evidenciada a associação do alelo G:01:04 à persistência da lesão

durante o tempo de acompanhamento do estudo em pacientes com citologia alterada,

fato esse não demonstrado por nenhum estudo anterior. Cabe destacar que as

casuísticas usadas nos estudos citados não incluíram pacientes HIV positivos.

Entre os seis alelos novos encontrados nesse estudo, apenas um foi encontrado

em quatro pacientes. Os demais foram encontrados apenas em uma única paciente,

representando assim alelos raros. O novo alelo mais frequente nessa casuística

apresenta uma transversão G → C na posição +1249 de acordo com o banco de dados

IMGT/HLA. Esse novo alelo é provavelmente derivado do alelo G:01:01:02:01, bastante

frequente em nossa população (18%).

Já o alelo novo encontrado no paciente 28 apresenta uma transição na posição

249 de G → A, uma tranversão C → G na posição 901 e uma transição C → T na

posição 503 localizada no éxon 3, originando assim uma nova proteína e

caracterizando um novo alelo a partir do G:01:01:02:01.

A clonagem também indicou a presença de dois alelos novos na paciente 54,

sendo um dos alelos novos oriundo através de uma transição C → T na posição 278

localizada no íntron 2, gerando assim um alelo novo oriundo provavelmente a partir de

uma troca sinônima do alelo G:01:05N, tendo inclusive a deleção característica desse

alelo. O outro alelo desse paciente é provavelmente derivado do alelo G:01:12 tendo

apenas uma transversão A → T na posição 76, acarretando assim a geração de uma

nova proteína por ocorrer no éxon 2.

Além desses, o paciente 91 apresentou um alelo novo formado a partir de uma

transição C → T na posição 89 do éxon 2 gerando um novo alelo a partir do G:01:11.

Por fim, o paciente 98 apresentou uma transição G → A na posição 707 do éxon 2,

originando um novo alelo a partir do já descrito G:01:01:01:03/04/05.

60

Todos os alelos novos encontrados serão submetidos ao Comitê Internacional de

Nomenclatura (WHO Nomenclature Committee) para que sejam validados e tenham

então um nome oficialmente atribuído a eles.

As informações relativas à carga viral do HIV e a contagem de células CD4 por

mm3 presentes nos questionários das gestantes foram obtidas apenas na entrada

dessas mulheres no estudo (início do segundo trimestre da gestação) e no momento do

parto, totalizando ao menos seis meses de diferença entre as duas coletas. Dessa

forma, consideramos a presença de carga viral indetectável e contagem acima de 350

cells/mm3 quando essas mulheres apresentavam essa característica em ao menos um

momento do estudo. Ao correlacionarmos os alelos encontrados a esses parâmetros,

pudemos observar uma tendência de associação do alelo G:01:01:02 à valores

indetectáveis de carga viral e uma associação do alelo G:01:05N a contagem de células

abaixo de 350 por mm3. Cabe ressaltar que essas pacientes estavam em

acompanhamento médico durante o estudo e que o protocolo de tratamento a que

estavam submetidas visa a redução da carga viral e o reestabelecimento da contagem

de CD4 a fim de melhorar o sistema imune da mãe e para evitar a transmissão do vírus

ao neonato, o que poderia ser um fator de confusão nas análises. Dessa forma, mais

estudos precisam ser feitos de forma a validar essa associação.

Ainda quanto ao status soropositivo da infecção pelo HIV dessas pacientes, é

interessante observar que ocorre uma maior expressão de moléculas de HLA-G

solúveis nessas pacientes. Essa expressão é ainda maior em pacientes que fazem uso

do HAART- em particular naqueles que utilizam a classe dos inibidores análogos

nucleosídicos (NRTI) (RIVERO et al., 2007). Dessa maneira, a expressão aumentada

do HLA-G nessa população poderia favorecer o escape imune do vírus HPV, evitando

assim sua eliminação e favorecendo sua persistência no indivíduo.

Dentre os poucos trabalhos da literatura correlacionando os alelos do HLA-G à

infecção pelo HIV por transmissão sexual, destaca-se o trabalho de Matte e

colaboradores que encontrou uma associação entre o alelo G:01:01:08 e o aumento do

risco de infecção pelo HIV em mulheres adultas do Zimbábue, e uma maior frequência

do alelo G:01:05N em controles do que em mulheres infectadas pelo HIV (MATTE et al.,

2004). Posteriormente, a associação do alelo G:01:05N à diminuição do risco de

61

infecção pelo HIV foi corroborada por Lajoie e colaboradores em uma coorte de

mulheres também zimbabuanas (LAJOIE et al., 2006). Contrastando com esses

estudos, Segat e colaboradores encontraram uma associação do alelo G:01:05N ao

aumento do risco de infecção pelo HIV em italianas caucasianas adultas (SEGAT et al.,

2010, SEGAT e CROVELLA, 2012). Nosso estudo não encontrou o alelo G:01:01:08 e

observou uma elevada frequência do alelo G:01:05N, o que também pode estar

associado a uma maior risco de infecção pelo HIV em mulheres portando esse alelo. A

falta de trabalhos brasileiros correlacionando a infecção pelo HIV ao HLA-G impede

uma observação mais clara dessa correlação e destaca a necessidade de maiores

estudos a fim de verificar a validade dessa associação.

Resultados contrastantes sobre os níveis de expressão das formas solúveis do

HLA-G em pacientes HIV positivos e controles têm sido publicados (LOZANO et al.,

2002; DERRIEN et al., 2004; LAJOIE et al., 2009, LAJOIE et al., 2010). Uma hipótese

levantada por Aghafar e colaboradores afirma que variantes genéticas do HLA-G que

afetam a ligação aos receptores das células NK podem comprometer a inibição dessas

células, protegendo os carreadores dessas variantes da infecção pelo HIV (AGHAFAR

et al., 2012).

A busca contínua por melhores marcadores de prognóstico e o potencial

relativamente inexplorado de imunoterapias efetivas para o tratamento da infecção pelo

HPV e HIV impulsionam a busca para o melhor entendimento das interações entre o

vírus e o sistema imune que levam à regressão ou permitem a persistência da infecção

viral. Atualmente, o HLA-G tem sido alvo de inúmeros estudos que tem por objetivo

bloquear sua liberação em tumores com altos níveis de expressão, tornando-o uma

atrativa estratégia terapêutica contra diversos tipos de câncer, como mama, endométrio

e ovário (SINGER et al., 2003; DAVIDSON et al., 2005; BIJEN et al., 2010; DE KRUIJF

et al., 2010; HE et al., 2010; AGAUGUE et al., 2011; ZHENG et al., 2011).

Dessa forma, estudos com o lócus HLA-G se tornam cada vez mais necessários,

a fim de validar seu potencial uso como estratégia terapêutica contra o câncer,

infecções virais e doenças inflamatórias. Além disso, são necessários novos estudos

que possam validar o seu potencial como biomarcador, uma vez que poderia identificar

mulheres com alto risco de infecção pelo HPV e persistência viral, permitindo assim um

62

acompanhamento diferenciado dessas pacientes que inclua um rastreamento mais

frequente para o câncer cervical ou até mesmo uma prioridade no acesso à vacina

profilática do HPV.

63

6. CONCLUSÕES

A diversidade de alelos observada na população de mulheres HIV-positivas em

acompanhamento no Programa de Assistência Integral à Gestante HIV-positiva do

Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira da UFRJ, Rio de Janeiro, é

condizente com a alta diversidade genética associada à população brasileira. Nesse

estudo encontramos 44% dos alelos já descritos na literatura. As frequências dos alelos

encontrados em nossa casuística corroboram com os dados brasileiros disponíveis na

literatura.

As análises correlacionando os alelos do HLA-G à infecção pelo HPV

evidenciaram uma associação entre o alelo G:01:03 e a proteção contra a infecção por

espécies do grupo B e do alelo G:01:01:02 a proteção contra a infecção por espécies

do grupo C. Em nosso estudo, não foi evidenciada nenhuma correlação dos alelos

encontrados aos casos de múltipla infecção, persistência e eliminação viral.

Os dados relativos à citologia oncótica permitiram observar um efeito protetor

contra a ocorrência de lesões em pacientes portando o alelo G:01:01:02. Além disso,

pudemos evidenciar pela primeira vez a associação do alelo G:01:04 à persistência da

lesão em pacientes com citologia alterada. Quanto aos parâmetros clínicos, foi possível

correlacionar o alelo G:01:05N à contagem de celulas CD4 maior ou igual a 350

cels/mm3.

Em conjunto, esses dados contribuem para uma melhor compreensão sobre o

impacto dos alelos do HLA-G em mulheres co-infectadas pelos vírus HIV e HPV de

forma a esclarecer o papel desses alelos na susceptibilidade à infecção e persistência

do vírus HPV. Dessa forma, o estudo contribui para o desenvolvimento e

implementação de intervenções que possam ser efetivas para a população mais

susceptível, prevenindo assim a persistência da infecção e consequentemente a

progressão para o câncer cervical, tão frequente em nossa população. Entretanto, a

conscientização a fim de prevenir a disseminação do HPV e um sistema que garanta o

diagnóstico rápido e adequado da infecção devem ser prioridades da saúde pública,

garantindo assim o acesso e aprimorando os programas de prevenção e tratamento

disponíveis para todas as mulheres de nosso país.

64

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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79

8. ANEXOS

8.1. Aprovação do projeto no Comitê de Ética em Pe squisa do Instituto

Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva

80

8.2. Aprovação do projeto no Comitê de Ética em Pe squisa do Instituto de

Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira

81

8.3. Questionário aplicado as pacientes

Nome: Prontuário n°:

Endereço:

Bairro: Município: Estado:

Telefone: Outro contato:

Data de Nascimento: / / Idade atual:

Estado civil: ( ) Solteira ( ) Casada ( ) Viúva ( ) Divorciada ( ) União Consensual

Escolaridade: ( ) Analfabeta ( ) 1° Grau ( ) 2° Grau ( ) 3° Grau

Usuária de drogas injetáveis: ( ) Sim ( ) Não

( ) Sim

( ) Até 10 cigarros/dia

( ) 10 a 20

Tabagismo atual:

( ) Mais de 20

( ) Não

Menarca aos _____ anos

Primeira relação sexual aos ____ anos

N° de parceiros sexuais: ( ) 1 até 3 ( ) 4 ou mais ( ) Profissionais do sexo

Gesta - Para - Aborto -

DST prévia: ( ) Ausente ( ) Presente

( ) Condom pregresso ( ) Condom atual

( ) Anticoncepcional atual ( ) Anticoncepcional pregresso

( ) Diu atual ( ) Diu pregresso Método contraceptivo:

( ) Outro método -___________________

82

8.4. Tabelas estatísticas

Tabela 8.4.1: Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a persistência da infecção pelo vírus HPV durante o período de estudo, obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade e ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus (ARE). Destacado em negrito está a tendência de significância observada na análise.

Persistência Persistência ARE Alelo

OR (IC 95%) P OR (IC 95%) P

G:01:01:01 0,751

(0,308-1,831) 0,529

0,704

(0,285-1,739) 0,447

G:01:01:02 0,485

(0,165-1,429) 0,190

0,486

(0,164-1,444) 0,194

G:01:03 0,966

(0,191-4,872) 0,967

1,077

(0,211-5,494) 0,929

G:01:04 2,041

(0,799-5,216) 0,136

2,299

(0,877-6,028) 0,091

G:01:05N 1,863

(0,521-1,155) 0,338

1,967

(0,547-7,075) 0,300

Tabela 8.4.2. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a infecção pelo vírus HPV durante o período de estudo, valores de OR obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade e ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus.

Eliminação viral Eliminação viral ARE Alelo

OR (IC 95%) P OR (IC 95%) P

G:01:01:01 0,971

(0,461-2,046) 0,939

0,984

(0,466-2,078) 0,966

G:01:01:02 1,296

(0,578-2,906) 0,529

1,290

(0,575-2,895) 0,537

G:01:03 1,592

(0,464-5,467) 0,46

1,552

(0,449-5,358) 0,487

G:01:04 0,807

(0,351-1,858) 0,615

0,788

(0,340-1,822) 0,577

G:01:05N 0,789

(0,232-2,688) 0,705

0,779

(0,228-2,659) 0,690

83

Tabela 8.4.3. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a ocorrência de casos de múltipla infecção pelo vírus HPV durante o período de estudo, os valores de OR foram obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade e ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus (ARE).

Tabela 8.4.4. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e os casos de melhora identificados por colposcopia durante o período de estudo, valores de OR obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade.

Múltipla Infecção

Alelo OR

(IC 95%) P

OR ARE

(IC 95%) P ARE

G:01:01:01 0,789

(0,293-2,128) 0,640

0,790

(0,291-2,144) 0,643

G:01:01:02 0,927

(0,302-2,848) 0,895

0,914

(0,297-2,813) 0,876

G:01:03 0,394

(0,046-3,350) 0,394

0,374

(0,044-3,172) 0,367

G:01:04 1,055

(0,363-3,063) 0,922

1,026

(0,353-2,979) 0,963

G:01:05N 2,524

(0,694-9,178) 0,160

2,496

(0,685-9,091) 0,165

Melhora citológica Alelo

OR (IC 95%) P

G:01:01:01 1,065

(0,332-3,415) 0,915

G:01:01:02 0,193

(0,024-1,559) 0,123

G:01:03 3,018

(0,678-13,434) 0,147

G:01:04 0,639

(0,163-2,506) 0,521

G:01:05N 1,478

(0,289-7,553) 0,639

84

Tabela 8.4.5 . Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e pacientes com contagem de cels TCD4>= 350 cels/mm3 durante o período de estudo. Valores de OR obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade. Destacado em negrito está a tendência de significância observada na análise.

Tabela 8.4.6. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e pacientes com carga viral do HIV

indetectável durante o período de estudo. Valores de OR obtidos através da análise de regressão

logística ajustada por idade. Destacado em negrito está a tendência de significância observada na

análise.

CD4>=350 cels/mm3 Alelo

OR (IC 95%) P

G:01:01:01 1,177

(0,486-2,851) 0,717

G:01:01:02 1,311

(0,489-3,515) 0,590

G:01:03 2,446

(0,293-20,415) 0,409

G:01:04 1,361

(0,488-3,799) 0,556

G:01:05N 0,249 (0,74-0,835) 0,024

CV Indetectável Alelo

OR (IC 95%) P

G:01:01:01 0,547

(0,262-1,141) 0,108

G:01:01:02 2,269

(0,969-5,313) 0,059

G:01:03 1,180

(0,329-4,229) 0,800

G:01:04 1,205

(0,540-2,690) 0,649

G:01:05N 0,581

(0,189-1,784) 0,343

85

Tabela 8.4.7. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e infecção pelo HPV-16. Valores de OR foram obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade.

Tabela 8.4.8. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e infecção persistente pelo HPV-16 durante o período do estudo. Os valores de OR foram obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade e ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus.

Infecção HPV-16 Alelo OR (IC 95%) P

G:01:01:01 1,311

(0,624-2,752) 0,475

G:01:01:02 0,677

(0,293-1,561) 0,360

G:01:03 0,371

(0,076-1,797) 0,218

G:01:04 1,058

(0,470-2,380) 0,893

G:01:05N 1,505

(0,484-4,680) 0,480

Persistência HPV-16 Alelo

OR (IC 95%) P OR (IC 95%) ARE P ARE

G:01:01:01 0,485

(0,114-2,060) 0,327

0,478

(0,110-2,087) 0,327

G:01:01:02 0,634

(0,110-3,649) 0,610

0,634

(0,108-3,731) 0,615

G:01:03

- -

- -

G:01:04 1,955

(0,438-8,733) 0,380

1,990

(0,428-9,257) 0,380

G:01:05N 0,721

(0,071-7,273) 0,781

0,714

(0,070-7,249) 0,776

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