MICHELE RIBEIRO DA SILVA

O Achatina fulica e sua utilização zooterápica através de

dietas acrescidas de própolis

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências.

Departamento: Nutrição e Produção Animal

Área de Concentração: Nutrição Animal

Orientador: Profa. Dra. Maria de Fátima Martins

Pirassununga

2009

Autorizo a reproduç ã o parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de Sã o Paulo)

T.2219 Silva, Michele Ribeiro da FMVZ O Achatina fulica e sua utilizaç ã o zooterápica atravé s de dietas

acrescidas de própolis / Michele Ribeiro da Silva. --2009. 64 f. : il. Dissertaç ã o (Mestrado) - Universidade de Sã o Paulo. Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Nutriç ã o e Produç ã o Animal, Pirassununga, 2009.

Programa de Pós-Graduaç ã o: Nutriç ã o e Produç ã o Animal. Área de concentraç ã o: Nutriç ã o e Produç ã o Animal. Orientador: Profa. Dra. Maria de Fátima Martins. 1. Escargots. 2. Achatina fulica. 3. Muco. 4. Própolis. 5. Cicatrizaç ã o.

I. Título.

BIOÉTICA

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: SILVA, Michele Ribeiro

Título: O Achatina fulica e sua utilização zooterápica através de dietas acrescidas de própolis

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências.

Data: ___/___/___

Banca Examinadora

Prof. Dr. ___________________________ Instituição: _____________________

Assinatura: _________________________ Julgamento: ____________________

Prof. Dr. ___________________________ Instituição: _____________________

Assinatura: _________________________ Julgamento: ____________________

Prof. Dr. ___________________________ Instituição: _____________________

Assinatura: _________________________ Julgamento: ____________________

"A compaixão para com os animais é das mais

nobres virtudes da natureza humana"

Charles Darwin

Dedico este trabalho ao meu amor, mmeeuuss ppaaiiss e meus

avós, em especial ao meu avô

José Liberali Sobrinho (in memorian).

AGRADECIMENTOS

• À Deus por ter me dado proteção e forças para prosseguir e principalmente por

ter me concedido a graça de ter os pais maravilhosos que tenho;

• A todos os animais participantes desta pesquisa;

• Aos meus pais por todo apoio, incentivo, paciência e tentativas de compreensão;

• À professora e orientadora Dra. Maria de Fátima Martins pelas oportunidades, e

principalmente por todo amadurecimento proporcionado ;

• Ao Diego, por todo companheirismo, dedicação, auxílio e principalmente por todo

carinho e apoio recebido;

• A Juliana, por cada momento compartilhado, e acima de tudo pela amizade

verdadeira;

• Ao Vanerson e família por todo carinho, apoio e incentivo;

• À Profa. Dra. Mamie Misuzaki Iyomasa da Faculdade de Odontologia da USP de

Ribeirão Preto pela colaboração e orientações;

• À Yamba Carla Lara Pereira pelo precioso auxílio durante as análises;

• À Dimitrius Leonardo Pitol pela grata contribuição;

• Ao Prof. Auro Nomizo da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade

de São Paulo pelo auxílio com os testes de citotoxicidade;

• Aos colegas de pós graduação, em especial Eugênio pela importante participação

em minha vida, durante esses anos;

• Aos professores e funcionários do Departamento de Nutrição e Produção Animal

da FMVZ/USP;

RESUMO

SILVA, M. R. O Achatina fulica e sua utilização zooterápica através de dietas acrescidas de própolis. [The Achatina fulica, and utilization use of propolis]. 2009. 64 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2009. Os escargots da espécie Achatina fulica são caracóis africanos comestíveis e para essa finalidade foram introduzidos no Brasil em 1988 para substituir o escargot europeu Helix sp. Contudo, o hábito alimentar conservador da população brasileira ocasionou prejuízos aos criadores de escargots no Brasil, desencadeando uma soltura irresponsável e anti-ética desses moluscos no meio ambiente, o que proporcionou uma associação direta dos caracóis à impactos ambientais, sendo objeto de estudos e pesquisas correlatas. Todavia, estudos anteriores descreveram efeitos benéficos, antimicrobianos e cicatrizantes do muco extraído de caracóis Achatina sp, e ainda a potencialização destes efeitos a partir do acréscimo de plantas medicinais à dieta base consumida pelos escargots, constatando a capacidade de retenção em seu organismo das propriedades dos alimentos por eles ingeridos. As atividades antimicrobiana e cicatrizante também são conhecidas na utilização da própolis produzida por abelhas da espécie Apis mellifera. Partindo dessas premissas, neste estudo, foi adicionada própolis à ração base dos escargots, objetivando avaliar o efeito cicatrizante desses zooterápicos e suas aplicações. Os resultados obtidos demonstraram que a utilização de muco nas lesões cirurgicamente induzidas em camundongos acelerou o processo de cicatrização, comparativamente ao grupo controle que recebeu apenas tratamento com soro fisiológico. As análises parasitológica e citotóxica realizadas demonstraram que o muco é apto para a utilização proposta. A dieta acrescida de própolis interferiu nas características do muco. Foi possível observar, a partir das avaliações histológicas e macroscópicas uma discreta vantagem no processo de cicatrização para o grupo tratado com muco extraído de escargots que receberam ração base acrescida de própolis em sua dieta. Estes resultados demonstram a potencialidade desta pesquisa em resultar em um biofármaco com propriedades cicatrizantes à base de muco de escargots e ainda uma possível patente deste muco, através do indicativo de sua importância terapêutica para o reparo tecidual de lesões veterinárias e humanas. Palavras-chave: Escargots. Achatina fulica. Muco. Própolis. Cicatrização.

ABSTRACT SILVA, M. R. The Achatina fulica, and its´s Zootherapics utilization through the use of a propolis diet. [O Achatina fulica e sua utilização zooterápica através de dietas acrescidas de própolis] 2009. 64 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2009.

The snail species Achatina fulica, is an edible African giant land snail species that was introduced into Brazil in 1988 as a substitute for the european escargot Helix sp. However, the conservative eating habits of the brazilian population have caused losses to breeders of escargot in Brazil due to the irresponsible, unethical release of the species into the environment. This species is known for it’s invasive nature and most of the literature focuses on the species disruption to the environment. Thus, the first objective of the study and related research focuses on these environmental impacts. Others studies have described beneficial attributes, antimicrobial and healing properties, of the mucous extracted from the small Achatina species. They have also described the potential benefits of feeding the snails a base diet enriched with medicinal plants to prove the capacity of the organisms to retain the aforementioned properties after ingestion. Lastly, our research will also examine the addition of propolis, to the base ration diet of snails. Propolis is a resinous material, obtained from local plant sources, used as a sealant in bee hives. For the purpose of these studies, the focus will be propolis specifically associated with the bees of the species Apis mellifera. The antimicrobial and healing properties of propolis have been well recognized and described. The objective of this work is thus, to evaluate the healing effects of this zootherapics, and it’s application in veterinary medicine as a biopharmaceutical. The results showed that the use of mucous in the lesions surgically induced in mice accelerated the healing process, compared to a control group that received treatment only with saline. Parasitological and cytotoxic analysis performed demonstrated that the mucous is suitable for the proposed use. The diet added with propolis influenced the parameters of mucous. It was observed from the macroscopic and histological findings a slight advantage in the healing process for the group treated with mucus extracted from snails fed diets basis with propolis in their diet. This results achieved were encouraging, showing the potenciality of this research results in a medication with scaring properties based on snail mucus and further a possible patent of this mucus, through its expressive therapeutics importance to veterinary and human lesions tissue repair. Key words: Snails. Achatina fulica. Mucous. Propolis. Helling.

12 1. INTRODUÇÃO

Os caracóis terrestres são animais invertebrados, pertencentes ao Filo

Mollusca, da Classe dos Gastrópodes e mais especificamente da Ordem dos

Pulmonados. Caracóis terrestres comestíveis são denominados “escargots” e os

mais comumente utilizados pertencem às Famílias Achatinidae (África) e Helicidae

(Europa).

Os escargots da espécie Achatina fulica foram introduzidos no Brasil em

1988, (SOUZA, et al., 2007) para criação e comercialização com finalidade

comestível, visando substituir os escargots europeus Helix sp. nas mais diversas

iguarias. Contudo, no Brasil a criação de escargots, denominada “helicicultura”, não

obteve êxito, devido aos hábitos alimentares conservadores da população brasileira

e ainda em decorrência do alto custo de mercado da carne de escargots e de seus

subprodutos. ( Martins, 2009) A conseqüência dos prejuízos obtidos pelos criadores

através da helicicultura, principalmente devido ao molusco africano foi a soltura

irresponsável e anti-ética desses animais no meio ambiente, praticamente em todas

as regiões brasileiras, com maior expressividade na região Sudeste.

A família Achatinidae, de origem centro africana, ocorre em regiões de

florestas tropicais úmidas e apresenta ampla distribuição tanto na África como na

Ásia, sendo extremamente adequada à regiões tropicais, principalmente em

temperaturas superiores a 23ºC. (MARTINS et al., 2002; PACHECO, 1998). São

herbívoros generalistas, altamente prolíferos, encontrando no meio ambiente do

Brasil condições ideais para reprodução e sobrevivência, inclusive competindo com

espécies nativas por alimento e espaço, quase não possuindo predadores naturais.

13 (Vasconcellos e Pile, 2001)

A associação desses fatores possibilitou uma ampla dispersão do Achatina

fulica. De acordo com SOUZA, et al. (2007), há dessa espécie em 23 estados

brasileiros, perpassando diferentes ecossistemas. Esta ocorrência foi fator

desencadeante de estudos e pesquisas correlatas, porém ainda há muito a ser

pesquisado e trabalhado sobre a Família Achatinidae, desde seu controle ambiental,

até à respeito de seus efeitos zooterápicos, e ainda sobre as propriedades

terapêuticas do muco desses escargots, que para finalidade de pesquisas científicas

são reproduzidos em laboratório, mantidos exclusivamente para fins didáticos e de

pesquisa.

Segundo a instrução normativa do IBAMA, Instituto Brasileiro do Meio

Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis, de número 73, de 18 de Agosto de

2005, encontra-se proibida, em todo território brasileiro, a criação e comercialização

de moluscos terrestres da espécie Achatina fulica, porém a mesma autoriza órgãos

competentes federais, estaduais e municipais, bem como organizações não

governamentais capacitadas na área, pesquisar e implementar medidas de controle

destes moluscos nos ambientes urbanos, rurais e naturais.

A secreção ou muco liberado pelos escargots protege o corpo do animal

contra desidratação e sua viscosidade auxilia na locomoção, captura de alimentos,

reprodução e proporciona resistência a infecções por microorganismos, devido à

presença de um fator antimicrobiano (IGUCHI, et al., 1982). Este fator antimicrobiano

pode auxiliar nos processos de reparação de feridas, pois a infecção constitui a

causa mais importante de retardo da cicatrização. (COTRAN, et al., 2000).

Autores como Martins, et al. (1996; 2003); Sírio (2005) verificaram a

capacidade antimicrobiana e cicatrizante do muco extraído de escargots Achatina

14 sp. utilizado em lesões induzidas cirurgicamente em camundongos e coelhos. Um

estudo realizado por Iyomasa et. al (2002) constatou histologicamente uma

diferença na maturação do epitélio, em favor da aplicação da secreção mucosa de

caracóis sobre a área lesada quando comparada a um grupo controle.

Pesquisas anteriores realizadas pelo Heliciário Experimental Profa. Dra. Lor

Cury da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São

Paulo demonstraram que os escargots possuem a capacidade de absorver

propriedades dos alimentos que ingerem e eliminá-las através de seus ovos e muco.

Sírio, et al. (2005) e Lorenzi et al. (2006) fizeram uso de dietas acrescidas de plantas

medicinais com finalidades cicatrizantes, apresentando resultados potencializadores

e que nos motivaram a avaliar o efeito do muco acrescido de própolis no processo

de cicatrização. Pois, assim como o muco de escargots, a própolis também pode ser

considerada um zooterápico, sendo uma resina de coloração e consistência variada,

coletada por abelhas da espécie Apis mellifera de diversas partes das plantas, como

brotos, botões florais e exsudatos resinosos (PARK, et al., 1998), possuindo

atividade antimicrobiana, propriedades anti-inflamatória, cicatrizantes, anestésicas e

anti-carcinogênicas, o que possibilita sua aplicação nas indústrias farmacêuticas e

alimentícias.

Em trabalhos fazendo uso tópico a base de própolis, Berreta (2003 e 2007)

desenvolveu um gel com potencial de aplicação dermatológica, particularmente no

tratamento de queimaduras. Pesquisadores como SUTTA et al. (1974),

DAMYANLIEV et al. já relatavam o efeito epitelizante da própolis, considerando-a

adequada para o tratamento de feridas e infecções microbianas. RAHAL, et al.

(2003) revelaram histologicamente a indução de uma melhor cicatrização pela

redução da resposta inflamatória e uma reepitelização mais rápida após tratamentos

15 com própolis. Face aos resultados apresentados, não foram encontrados trabalhos

em literaturas nacional e internacional fazendo uso de própolis na dieta do molusco

Achatina fulica com a finalidade de implementar o processo de cicatrização.

Partindo dessas premissas, esta pesquisa teve como objetivo adicionar

extrato de própolis na composição da dieta base oferecida para escargots da

espécie Achatina fulica e avaliar um possível efeito sinérgico desses dois

zooterápicos (muco + própolis), nas atividades antimicrobianas e cicatrizantes

através de lesões cirurgicamente induzidas em camundongos “hairless”, Mus

musculus, Linhagem HRS/J.

O enfoque farmacológico associado às propriedades cicatrizantes do

muco destes moluscos amplia o campo de atuação da Zooterapia, pois se traduz na

capacidade de exploração da diversidade biológica dos escargots Achatina fulica

que foram descartados de forma desordenada no meio ambiente e que em

condições de controle em laboratório, podem vir a contribuir para o desenvolvimento

de um biofármaco com capacidade cicatrizante.

16 2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Zooterapia/Zooterápicos

Zooterapia é uma palavra de origem grega, onde zoo significa animal e

therapia trás a idéia de tratamento. Etimologicamente este termo relaciona-se a

terapia através dos animais, incluindo aqui seus produtos ou subprodutos. Sendo

assim, são considerados zooterápicos todos os produtos oriundos de animais com

finalidade terapêutica, como é o caso da própolis obtida de abelhas e do muco

extraído de caracóis.

Compartilhando o pensamento de Costa Neto (1999), Zooterapia refere-se,

stricto sensu, ao registro do uso de remédios elaborados a partir de partes do corpo

de animais, de produtos de seu metabolismo, como secreções corporais e

excrementos, ou de materiais por eles constituídos.

Segundo Costa Neto (2005), a utilização medicinal através de animais é um

fenômeno transcultural historicamente antigo e geograficamente disseminado.

Agentes antimicrobianos seguros tem sido buscados no ambiente natural,

pois há uma preocupação com o crescente uso de antibióticos que podem induzir

resistências bacterianas. (OGAWAA, 1999).

17

2.2. Caracóis terrestres (escargots) da espécie Achatina fulica

Os caracóis da espécie Achatina fulica são moluscos africanos, introduzidos

no Brasil na década de 80 com finalidade comestível visando a substituição do

escargot europeu Helix sp. (SOUZA, 2006) Sendo comparativamente, a criação de

Achatina fulica comercialmente mais lucrativa e menos onerosa, uma vez que estes

moluscos possuem maior tamanho e rusticidade que os Helix aspersa e Helix

pomatia.

A carne do escargot Achatina fulica é constituída de 32% de proteína e

apenas 0,5% de gordura, além de possuir cálcio, ferro, zinco e um pH alcalino, o que

segundo Iguchi, Aikawa e Matsumoto (1982), pode ser adequado ao tratamento de

úlceras, caracterizando propriedades terapêuticas a sua carne.

Segundo Iguchi, et al. (1982), os invertebrados não possuem organismos

imunoespecíficos como os encontrados nos vertebrados. Esses invertebrados,

possuem fatores de defesa que impedem a entrada de materiais estranhos. Para tal,

o muco do molusco possui fatores antibacterianos que exibem atividades contra

organismos gram-positivos e gram-negativos.

Os moluscos produzem de 60 a 400 µg de muco seco/hora/grama de peso

corporal, que produz 24J/MG de peso. O muco expressa informações sobre o estado

sexual dos animais e direção para locomoção (SKINGSLEY; WHITE; WESTON,

2000). A habilidade de secretar muco através da epiderme consiste numa

propriedade particular dos caracóis. O muco é produzido em algumas regiões do

corpo e é freqüentemente misturado a materiais advindos de glândulas juntamente

com o exsudato geral das células epiteliais. Considera-se, primeiramente, que a

superfície ciliada é caracteristicamente coberta pelo muco que atua como um veículo

para o movimento das partículas através do epitélio, e está relacionado com a

18 função de locomoção propriamente dita do molusco. Sugere-se também que, a alta

viscosidade do muco é produzida pelas glândulas suprapodais enquanto que a baixa

viscosidade viria do enchimento das cavidades inferiores dos “pés”, causadas pela

oscilação dos músculos (SIMKISS; WILBUR, 1977).

O muco consiste em 90 a 99,7% de seu peso em água. O principal

constituinte do muco gastrópoda é um complexo de proteínas e polissacarídeos.

Esse complexo é usualmente classificado numa ampla categoria de

mucopolissacarídeos e glicoproteínas (LINCOLN et al., 2004).

O fator antibacteriano dos caracóis demonstrou grande atividade inibitória de

crescimento para bactérias , ainda que a estrutura da parede celular seja diferente.

Isso sugere que cada célula bacteriana é atacada por um fator antibacteriano que

pode não estar localizado na parede celular, mas em algum outro local. (KUBOTA,

et al., 1985).

2.3. Utilização do muco de caracóis terrestres como zooterápico

A utilização do muco, uma secreção glicoproteica produzida através de glândulas

localizadas em toda superfície corpórea dos escargots, e o conhecimento de suas

aplicações terapêuticas e cosméticas remontam aos primórdios da humanidade. Em

países europeus, por exemplo, são produzidos xaropes expectorantes e diversos

cosméticos produzidos com o muco dos caracóis, baseados em receituário milenar.

(CHERNOVIZ, 1890). E, de acordo com Bonnemain (2004) o muco de caracóis é

utilizado na medicina em diferentes formulações desde a antiguidade, e que

19 Hipócrates fazia emprego desta substância para tratar dor em queimaduras,

abcessos e demais feridas.

Uma outra espécie citada por sua utilização zooterápica é o caracol Aruá,

Pomacea sp., que quando aplicados como emplastro, auxiliam na cicatrização de

feridas. (Nomura, 1996)

De acordo com Obara et al., (1992) existem nos moluscos dois tipos de

grupos de reação de defesa: uma celular e outra mediada por fatores de defesa

humoral. A primeira envolve a fagocitose de partículas estranhas e o

encapsulamento de materiais estranhos; a segunda envolve lisozimas, como

proteínas, lectinas, fatores antibacterianos ou antivirais e opsonização.

Iguchi, et al. (1982) descreveram a atividade antibacteriana observada em

frações do muco obtido a partir da superfície corpórea do caracol africano Achatina

fulica. Estas frações exibiram atividade antibacteriana, tanto para as bactérias Gram

positivas quanto para bactérias Gram negativas.

Kubota, et al. (1985) descreveram a presença de uma proteína ou um

polipeptídeo, sendo mais provavelmente a mucina, com poder antimicrobiano para

bactérias gram-positivas (Bacilos subtilis e Staphylococus aureus) e gram-negativas

(Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa), que ocorre no muco dos escargots e

inibe os crescimentos bacterianos quando em presença desta.

Ehara, et al. (2002) purificaram a glicoproteína antibacteriana a partir do muco

do Achatina fulica e a denominaram de “Achacin”. De acordo com Fuchino, et al.

(1991) a ação do “Achacin” assemelha-se àquela de antibióticos pertencentes ao

grupo dos beta-lactâmicos, que inibem a síntese de peptideoglicano na superfície

celular, assim como ocorre na utilização das Penicilinas. Estudos morfológicos

20 revelaram que Achacin “ataca” as membranas citoplasmáticas destas bactérias.

(OGAWAA, 1999)

GONZALES, et. al. (2004) em um estudo realizado sobre os efeitos da

aplicação de um creme industrializado a partir do muco extraído de caracóis da

espécie Helix sp., em pacientes com cicatrizes de queimaduras e enxertos de pele

nas regiões de cabeça, pescoço e mãos, tratados na Unidade de Terapia

Ocupacional do Centro de Reabilitação e Auxílio a Crianças Queimadas,

“Coaniquem Corporation”, descreveram que o creme atuou favorecendo a

despigmentação destas cicatrizes, e na melhora referente a textura da pele com

queimaduras. Estes mesmos autores verificaram a presença de alantoína,

colágeno, elastina, ácido glicólico e de um fator antibacteriano natural eficaz contra

bactérias comumente encontradas em infecções da pele humana (Staphyloccocos

aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli).

2.4. Utilização da própolis como um zooterápico

O nome própolis é derivado do grego pro, em defesa de, e polis a cidade, o

que significa em defesa da cidade ou neste caso, em defesa da colméia. As abelhas

utilizam esta substância para protegê-las contra outros insetos e microorganismos.

(DEBUYSER, E., 1983)

A própolis vem se destacando, nas últimas décadas, por suas propriedades

terapêuticas e biológicas relatadas em vários trabalhos científicos. Estudos

21 atribuem à própolis a melhora no tratamento de queimaduras, cicatrização e

ulcerações (MUJALLI, 1999).

Registros mais antigos citados por Zimmerman (1961) falam sobre

manuscritos egípcios que datam de 3000 - 2500 antes de Cristo, e neles são

mencionados curativos à base de mel e outros produtos oriundos de animais.

Hausen (1987) e Goetz (1990) descreveram os benefícios da sua utilização

em dermatologia na cicatrização de ferimentos, regeneração de tecidos, tratamento

de queimaduras, neurodermites, eczemas, dermatite de contato, úlceras externas,

psoríase, lepra, herpes, pruridos e dermatófitos.

Uma observação importante sobre a utilização da própolis, é que, assim,

como outros produtos oriundos das abelhas (mel, cera e geléia real), sua

composição varia de acordo com a flora, condições sazonais de uma determinada

área, o tempo de coleta e contaminantes. (MARCUCCI, 1996)

GREGORI, et al., (2002) avaliaram satisfatoriamente a utilização de um creme

a base de própolis em tratamentos de pacientes que apresentavam queimaduras de

primeiro e segundo graus,

GEBARA et. al., (2002) estudaram a atividade antimicrobiana do extrato de

própolis em diferentes doenças periodontais, OZTURK, et al., (1999) demonstraram

o efeito cicatrizante do extrato aquoso de própolis a 1% em córnea lesada de ratos.

2.5. Cicatrização

Segundo Gillitzer & Goebeler (2007) a cicatrização é um processo interativo que

envolve mediadores solúveis, componentes da matriz extracelular, e células como

queratinócitos, fibroblastos, células endoteliais e nervosas, e ainda infiltrado de

22 diferentes subtipos de leucócitos, que participam diferentemente na classificação de

cada uma das três fases da cicatrização: inflamatória, proliferativa e remodelação.

Martins (1997) destaca que a migração de neutrófilos ao local da lesão inicia-

se minutos após a injúria como uma primeira linha de defesa para a eliminação de

corpos estranhos e bactérias, além de produzir citocinas importantes para ativar os

fibroblastos e queratinócitos. (Hubner, et al., 1996).

De acordo com Yukami et al. (2007), a cicatrização da pele se inicia

imediatamente após uma injúria e consiste em três fases gerais: inflamatória, que

consiste em agregar e recrutar células inflamatórias; proliferativa, que envolve

migração e proliferação de queratinócitos, fibroblastos e células endoteliais,

formação do tecido de granulação; e remodelação, com migração de células

inflamatórias, inicialmente, neutrófilos no local da lesão, sendo estes a primeira linha

de defesa, realizam limpeza de partículas e bactérias. Os neutrófilos são o primeiro

sinal para ativação dos fibroblastos e queratinócitos. Macrófagos são responsáveis

por debridamento através da fagocitose de microorganismos e fragmentos da matriz

extracelular, ainda são importantes mediadores do fatores de crescimento como por

exemplo o fator básico de crescimento de fibroblasto (bFGF).

A cicatrização tecidual pode sofrer diversas influencias como por exemplo,

produtos secretados de células inflamatórias como o fator de crescimento endotelial

vascular (VEGF) e fator de crescimento de fibroblastos, induzindo a angiogênese.

Angiogênese é um processo de crescimento de novas células sanguíneas, é

o elemento chave da fase proliferativa da cicatrização. Muitos estudos sugerem que

a neovascularização é importante para a cicatrização, como suplemento de oxigênio

e de nutrientes para o crescimento das células mediadoras de reparo. Resultados

demonstraram que os níveis de VEGF influenciam na textura da cicatriz resultante

23 do processo de cicatrização, são responsáveis pela estimulação direta das células

endoteliais e fibroblastos. (Wilgus, 2008)

VEGF inicia a formação vascular, e consequentemente, remodelamento,

maturação e estabilização. VEGF atua na remodelação pela proliferação de

queratinócitos. (Wilgus, 2008)

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais

3.1.1. Escargots

Para a realização desta pesquisa foram utilizados em sua totalidade um

número de 12 escargots adultos da espécie Achatina fulica, com aproximadamente 8

meses de idade e peso médio de 100 gramas provenientes do Heliciário

Experimental Profa. Dra. Lor Cury da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

da Universidade de São Paulo. Destes, 6 animais receberam ração base e 6

receberam ração base acrescida de própolis.

3.1.1.1. Nutrição

A ração bbaassee oferecida aos escargots participantes desta pesquisa é a

mesma utilizada e desenvolvida no Heliciário Experimental Profa. Dra. Lor Cury da

24 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo,

sendo esta composta por 10% de farelo de soja, 56% de fubá de milho, 13% de

farelo de trigo, 1% de suplemento mineral e 20% de carbonato de cálcio.

(FLAUZINO, et al.,1997; MARTINS, et al., 1998 e PACHECO, et al., 1999)

Para o preparo da ração com pprróóppoolliiss, foi acrescida à ração base dos

escargots, 10% de extrato bruto seco de própolis (Fig. 01), sendo observado boa

aceitação na palatabilidade e consumo dos animais. Este extrato passou por

processo de secagem em estufa por 7 dias, com temperatura média de 45ºC. Após,

foi previamente triturado e levado junto com a ração base pronta ao misturador por

20 minutos, na proporção de 10 gramas de própolis para cada 100 gramas de ração

base.

Figura 01: Extrato Bruto de Própolis, posteriormente processado e acrescido na ração base dos escargots da espécie Achatina fulica.

Tabela 01. Nutrição dos escargots, onde grupo 1 recebeu ração base e grupo 2 recebeu ração base acrescida de própolis em sua dieta. Pirassununga, 2009.

Grupo 1 – Muco Puro Ração Base

Grupo 2 – Muco + Própolis Ração Base + Própolis

25

Figura 02: Comparação entre as duas dietas oferecidas (ração base e ração base + própolis).

3.1.1.2. Manejo dos Escargots em experimentação

Os escargots foram mantidos em caixas plásticas, com medidas de 75x40x30

cm, padronizadas pelo Heliciário Experimental e foram separados em número de 3

animais (n=3) por cada caixa, de acordo com o manejo alimentar, ou seja, duas

caixas para os escargots alimentados apenas com a ração base e duas caixas para

os alimentados com a ração base acrescida de própolis. (Figs. 03 e 04) Água e

ração foram fornecidas ad libitum diariamente, em comedouros e bebedouros

específicos, também padronizados.

Figuras 03 e 04: Manejo dos escargots, recebendo ração base e ração base acrescida de própolis, respectivamente.

26

3.1.1.3. Extração de muco dos Escargots

Para a extração de muco, os animais passaram por jejum alimentar,

recebendo apenas água pelo período de um (1) dia, com a finalidade de se evitar

uma possível contaminação do muco a ser extraído.

A coleta do muco foi realizada através de estimulação manual (fricção

contínua) das glândulas podais dos escargots. (Fig. 05) Esta metodologia utilizada

por Martins, et al. (1996) e Caetano, et al. (1998), não acarreta em sacrifício dos

animais, nem prejudica seu bem estar, como ocorreria em técnicas de eletro-

estimulação, utilizadas por autores como IGUCHI, et al. (1992).

Figura 05: Técnica de estimulação manual para a extração de muco de escargots da espécie Achatina fulica.

3.1.1.4. Avaliação citotóxica do muco de escargots Achatina fulica.

Esta análise foi realizada na Faculdade de Ciências Farmacêuticas da

Universidade de São Paulo, em Ribeirão Preto, com o auxílio e orientação do Prof.

Dr. Auro Nomizo. Os mucos extraídos dos escargots que ingeriram ração base e dos

escargots que ingeriram ração base acrescida de própolis foram submetidos em

diferentes diluições ao bioensaio de citotoxicidade em células esplênicas extraídas

27 de camundongos.

Primeiramente, as amostras de mucos foram solubilizadas em DMSO/meio

RPMI, (1:100, 1:10, 1:100), sendo este diluente utilizado como controle negativo.

Para avaliar a atividade citotóxica foi utilizado o método colorimétrico de

citotoxicidade pelo 3-(4,5-dimetil tiazol 2-il) 2,5-difenil brometo de tetrazólio (MTT). A

avaliação da atividade citotóxica foi determinada por espectrofotometria.

3.1.1.5. Análise parasitológica do muco de escargots Achatina fulica

Autores como Alicata (1965) e Moreira (1973) descreveram que o escargot

Achatina fulica pode ser considerado na Ásia e Ilhas do Pacífico, um importante

hospedeiro intermediário do Angiostrongylus cantonensis, e que humanos podem

sofrer infecção acidental após a ingestão de L3 eliminadas através do muco destes

moluscos. Para verificação da possível presença de larvas no muco dos escargots

Achatina fulica utilizados nesta pesquisa, foram realizadas análises parasitológicas

destes mucos, com esta finalidade, adaptou-se a metodologia descrita por

Vasconcellos (2001). Folhas de papel celofane foram introduzidas nas caixas

plásticas onde estavam os escargots, forrando as mesmas por um período de vinte e

quatro horas. Após, as folhas de papel celofane foram levadas ao microscópio óptico

para observação da possível presença de larvas liberadas através do muco destes

moluscos. O muco também foi coletado através da estimulação das glândulas

podais dos escargots e levado em placas diretamente ao microscópio para

visualização e análise.

28

3.1.2. Camundongos

Foram utilizados 09 animais (n=9) machos do tipo camundongo “hairless”,

Mus musculus, Linhagem HRS/J, com peso corporal variando entre 30 e 35 gramas,

com idade aproximada de 40 dias, provenientes do Biotério da Faculdade de

Odontologia de Ribeirão Preto, FORP/USP. Estes camundongos possuem um gene

recessivo autossômico situado no cromossomo 14 e são produzidos em laboratórios,

resultantes do acasalamento entre machos Hr e fêmeas (Hr+). A opção por estes

camundongos deu-se devido aos mesmos possuírem ausência de pelo como

característica fenotípica, sem apresentar deficiências imunológicas severas, o que

facilitou as avaliações macroscópicas, assim como os procedimentos que se fizeram

necessários nesta pesquisa.

Estes animais permaneceram acondicionados individualmente em caixas

específicas para roedores, porém, nesta pesquisa envolvemos ténicas inovadoras,

segundo Sgay (2007), um animal com mais opções comportamentais terá mais

chances de lidar com eventos estressantes, como a condição experimental, todas

com enriquecimento ambiental, visando melhoria das condições de experimentação,

bem estar psicológico dos animais cativos de experimentação, modificando seu

comportamento e mantendo-os distraídos.

Água potável e ração específica balanceada foram fornecidas ad libitum.

29

Figura 06: Demonstração de “toca” proporcionada pelo enriquecimento ambiental.

Figuras 07 e 08: Enriquecimento ambiental proporcionado aos camundongos, na tentativa de torná-los em melhor bem estar. .

3.2. Ensaio biológico

3.2.1. Indução de lesão epitelial realizada com “punch”

As lesões foram cirurgicamente induzidas, ou seja, em condições ideais de

assepsia, sedação e analgesia. O protocolo anestésico utilizado está de acordo com

o estabelecido pelos comitês de bioética, onde foi realizado a associação de agentes

30 anestésicos injetáveis, por via intramuscular, nas seguintes dosagens: Xilasina 10

mg/Kg e Cetamina 75 mg/Kg de peso corporal.

Após a anestesia dos camundongos e preparo da região com realização de

assepsia e anti-sepsia, foi induzida uma lesão circular padronizada de 5 mm. de

diâmetro no dorso de cada animal, com auxílio de “punch” para biópsia, tesoura e

pinça. (Fig. 09)

Figura 09: Demonstração da lesão circular induzida cirurgicamente no dorso dos camundongos “hairless” com auxílio de punch com diâmetro de 5 mm.

31

3.2.2. Grupos Experimentais

Os camundongos foram divididos em 3 diferentes grupos, de acordo com o

tratamento que receberam:

1. Grupo Controle

O grupo controle recebeu apenas aplicação de soro fisiológico;

2. Grupo Muco Puro

Recebeu tratamento com muco extraído de escargots Achatina fulica

que receberam ração base em sua dieta;

3. Grupo Muco + Própolis

Recebeu tratamento com muco extraído de escargots Achatina fulica

que receberam dieta base acrescida de própolis.

Todos os grupos receberam tratamento diário com auxílio de conta-gotas (Fig.

10), até o 5º dia após cirurgia.

Figura 10: Aplicação de muco após a cirurgia com auxílio de conta-gotas.

32

3.2.3. Avaliação Fenotípica da lesão

Análise Macroscópica:

Os camundongos foram avaliados individualmente e pesados a cada dois

dias. As observações macroscópicas referentes ao reparo cicatricial foram

comparadas entre os grupos experimentais, mensuradas com auxílio de paquímetro

digital - MARBERG e através de registros fotográficos.

3.2.4. Perfusão dos animais

Após o período de tratamento (05 dias), os animais foram novamente

anestesiados com Xilasina 10 mg/ Kg e Cetamina 80 mg/ Kg de peso corporal, e

tiveram o diafragma rompido para perfusão com formol a 10%, em tampão fosfato,

por via intracardíaca utilizando o equipamentos de infusão SAMTRONIC.

3.2.5. Preparo histológico das amostras

Os tecidos de pele foram imersos em solução de formalina a 10% por 24

horas, e em seguida submetidos ao processo de desidratação em álcool 70, 80, 90,

95, absoluto (1,2,3). Uma vez desidratadas, as peças foram diafanizadas em xilol e

incluídas em parafina sob forma de blocos. Os blocos foram montados em

micrótomo e obtidos cortes de seis micra de espessura, de modo que a amostra

fosse seccionada longitudinalmente no sentido mésio-distal. A lâmina recebeu

33 coloração de hematoxilina e eosina (HE) para análise histopatológica (TANOMARU

et al, 2003)

3.2.6. Análise qualitativa ao microscópio de luz

Análise Histológica:

As biópsias foram realizadas após o 5º dia de tratamento nos três diferentes

grupos.

Foram avaliados os diferentes graus de reparo tecidual entre os três grupos.

A análise qualitativa das lâminas permite avaliar o grau de inflamação e

cicatrização, permitindo compará-los entre os diferentes grupos. Foi utilizado um

microscópio de luz Leica MZ125 acoplado a uma câmera digital. As imagens foram

analisadas através de objetivas, com aumento de 20 e 40x.

3.2.7. Análise quantitativa

Os cortes histológicos foram analisados em microscópio óptico, e as tomadas

fotográficas feitas em fotomicroscópio Leica MZ125, no aumento de 100 vezes,

partindo-se da periferia da lesão até o centro da mesma. Foram realizadas de 10 a

12 imagens de cada animal para a contagem de fibroblastos, neutrófilos e capilares

e, assim comparar os processos inflamatórios e cicatricial, entre os três grupos.

A quantificação foi realizada pelo Método de Contagem Diferencial de Pontos,

com auxílio do programa Image-J® (Versão 1,32 para Windows), de domínio público

(http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html), do Instituto Nacional de Saúde (NIH),

Bethesda, EUA. Foi utilizado o sistema-teste de 300 pontos sobre as imagens

34 capturadas para determinação da porcentagem relativa de fibroblastos, neutrófilos e

capilares. Esta relação foi determinada entre os pontos de intersecção encontrados

sobre as respectivas áreas.

Figura 11: Imagem do programa Image-J®, em utilização para contagem de fibroblastos ( seta branca), neutrófilos (seta verde) e capilares (seta azul).

Figura 12: Imagem do programa Image-J®, em utilização para contagem de fibras colágenas.

35

4. RESULTADOS

4.1. Dieta base + própolis ofertada aos escargots Achatina fulica

Inicialmente houve uma preocupação inicial a respeito de uma possível

rejeição dos escargots à nova dieta, devido ao odor e gosto acentuados da própolis.

Porém, foi verificada aceitação dessa nova dieta composta de ração base acrescida

de própolis, havendo uma pequena perda de peso, cerca de 4 a 6 gramas por

animal na primeira semana. Após a segunda semana, os animais começaram a

ganhar peso e não apresentaram mudanças em seu comportamento normal, o que

denotou uma adaptação a dieta testada.

Nesta mesma fase, foram extraídas pequenas porções de muco dos dois

grupos de escargots à fim de verificar fenotipicamente uma possível diferença entre

o muco dos escargots alimentados apenas com ração base em comparação ao

muco dos escargots alimentados com ração base acrescida de própolis.

Foi possível observar uma grande diferença quanto a consistência,

viscosidade, odor e principalmente na coloração dos mucos extraídos dos escargots

com diferentes dietas, constatou-se que, a dieta acrescida de própolis interferiu nas

características da secreção (mucoglicoproteíca) natural dos escargots. (Fig. 13)

36

Figura 13: Muco de escargot da espécie Achatina fulica alimentado com ração base acrescida de própolis e muco de escargot Achatina fulica alimentado apenas com ração base, respectivamente.

4.2. Análise citotóxica do muco de escargot Achatina fulica

Foram avaliados o muco extraído de escargots Achatina fulica que receberam

ração base em sua dieta e o muco extraído de escargots Achatina fulica que

receberam ração base adicionada de própolis.

Nenhuma das concentrações analisadas “in natura”, tanto do muco puro

quanto do muco+própolis, apresentou toxidade, o que permitiu e confirmou a

potencialidade de uso do muco acrescido de própolis com finalidades terapêuticas.

4.3. Análise parasitológica do muco de escargot Achatina fulica

Em nenhum dos mucos analisados foi observada eliminação ou presença de

larvas. Os moluscos avaliados não encontraram-se infectados por Angiostrongylus

cantonensis.

37

4.4. Resultados Macroscópicos aos 5 dias de experimento

Os camundongos não apresentaram alteração comportamental.

Não houve óbitos no período de avaliação.

Os grupos experimentais tratados com muco apresentaram o diâmetro da

lesão menor ao 5º dia de tratamento comparativamente ao grupo controle, tratado

apenas com soro fisiológico. (Tab. 02)

Os aspectos macroscópicos foram praticamente semelhantes entre os grupos

tratados com os mucos, com discreta vantagem para o grupo tratado com muco

extraído de escargots que receberam ração base acrescida de própolis em sua

dieta. Comparativamente ao grupo controle, as bordas das lesões encontraram-se

mais regulares nos grupos tratados com muco, e novamente com discreta vantagem

para o grupo tratado com muco extraído de escargots que receberam ração base

acrescida de própolis em sua dieta. Não foram observados edemas, nem sinais de

infecção em nenhuma das lesões induzidas, durante todo o período de avaliação.

Tabela 02: Diâmetro da lesão, em milímetros (mm), nos diferentes grupos experimentais ao 5º dia de tratamento. Peso dos camundongos, em gramas (g), no dia da cirurgia (dia 0); ao segundo dia de tratamento (dia 2) e ao 5º dia de tratamento (dia 5). Pirassununga, 2009. Grupos Experimentais Diâmetro da Lesão Dia 0 Dia 2 Dia 5

Muco + Própolis

(Ração Base + Própolis)

11..99mmmm 35 g 37g 38g

Muco Puro

(Ração Base)

22..1188 mmmm 38g 33g 37g

Soro Fisiológico

(Grupo Controle)

33..6644 mmmm

36g 28g 35g

38

4.5. Resultados Histológicos aos 5 dias de experimento

4.5.1. Grupo Experimental Controle - Soro Fisiológico

4.5.1.1. Epitélio

O corte histológico observado, caracterizou-se por ser espesso contendo as

camadas basal, espinhosa, granulosa e a córnea em diferenciação (Fig. 14). A

porção central da lesão ainda sem o epitélio contem muitos neutrófilos e hemáceas

em contato com a camada profunda da crosta, haja visto que o epitélio regenera-se

da borda da lesão para o centro, sob a crosta.

A descrição das células acima é bem característica das fases iniciais do

processo de cicatrização, pois neutrófilos são as primeiras células inflamatórias a

aparecerem e na ausência de infecção diminuem rapidamente do local da lesão.

Figura 14: Fotomicrografia do grupo controle, lesões tratadas com soro fisiológico. Nota-se o epitélio neoformado espesso (seta curva) apresentando a camada córnea em diferenciação, apoiado sobre o tecido conjuntivo (*) neoformado. Coloração H.E. Aumento de 20x.

39

4.5.1.2. Tecido Conjuntivo

O tecido conjuntivo da borda da lesão e sob o epitélio neoformado revelou a

presença de fibroblastos em desenvolvimento, neutrófilos isolados, linfócitos e

numerosos capilares em desenvolvimento com e sem hemáceas (Fig. 15).

Na região central da lesão numerosas células adiposas entremeadas por

neutrófilos e alguns fibroblastos caracterizaram o tecido conjuntivo.

Figura 15: Fotomicrografia do grupo controle com soro fisiológico. O tecido conjuntivo em processo de cicatrização mostrando os capilares (seta) e as células adiposas entre as células variadas. Coloração H.E. Aumento de 40x.

4.5.1.3. Fibras Colágenas

Notou-se por meio da técnica de coloração “Sirius Red” (Fig. 16) que a

periferia da lesão revelou a presença de fibras colágenas agrupadas em feixes além

de fibrilas delgadas.

Na porção central da lesão, foram evidenciadas delgadas fibras colágenas na

camada subjacente ao epitélio, o que vai ao encontro do relatado por Mackay, Miller

(2003) que constataram que os níveis de colágenos aumentaram continuamente por

40 aproximadamente três semanas e essa quantidade determinará a resistência e

tensão da lesão.

4.5.2. Grupo Experimental – Muco com Própolis

4.5.2.1. Epitélio

Na periferia da lesão o epitélio apresentou-se bem diferenciado revelando as

camadas basal, espinhosa, granulosa e espessa camada córnea. Esse epitélio

recoberto pela crosta apresentou muitas hemáceas nos espaços intercelulares (Fig.

17). A porção central da lesão não mostrou ainda o epitélio, mas apresentou a crosta

protegendo a área contendo grande quantidade de hemáceas entremeadas por

numerosos neutrófilos.

Figura 17: Fotomicrografia do grupo tratado com muco+própolis na borda da lesão. Nota-se o epitélio bem diferenciado (seta curva) apresentando a camada córnea espessa, apoiado sobre o tecido de granulação (*) com numerosas células mononucleares e capilares. Coloração H.E. Aumento de 20x.

41

4.5.2.2. Tecido Conjuntivo

Sob o epitélio neoformado, o tecido conjuntivo da periferia da lesão

apresentou-se bastante celular com fibroblastos em desenvolvimento, escassos

neutrófilos, alguns linfócitos, numerosos capilares e vasos sanguíneos de tamanhos

variados preenchidos por hemáceas, (Fig. 18) diferentemente do tratamento com

soro fisiológico que representava nosso controle. As características descritas,

sugeriram que o muco possui a capacidade de acelerar o processo de cicatrização,

pois é observado um início de angiogênese. Isso ocorre porque todos os estágios

da cicatrização são interligados, e havendo alteração em algum destes estágios,

consequentemente a capacidade de reparo se alterará, acelerando ou retardando o

processo de cicatrização, e somado a isso a ausência de contaminação microbiana.

Figura 18: Fotomicrografia da borda da lesão do grupo tratado com muco+própolis. O tecido conjuntivo revela numerosos capilares (seta) e vasos sanguíneos bem desenvolvidos (seta grossa) entre as células mononucleares e os fibroblastos em desenvolvimento. Coloração H.E. Aumento de 40x.

42

4.5.2.3. Fibras Colágenas

A coloração por “Sirius Red” revelou na periferia da lesão que os feixes de

fibras estavam bem constituídas, corando-se fortemente. Esta característica esta

associada ao alto número de fibroblastos observados, pois uma das principais

funções destes é a síntese de colágeno, sendo a cicatriz determinada pela

velocidade, quantidade e qualidade da deposição das fibras colágenas. Na porção

central a camada profunda revela feixes de fibras colágenas semelhantes as da

região periférica da lesão. Nota-se uma delgada camada superficial com poucos

feixes de fibras formadas e organizadas (Fig. 19).

4.5.3. Grupo Experimental – Muco Puro

4.5.3.1. Epitélio

A figura muco puro 20x (Fig. 20) mostra que o epitélio da margem da lesão

apresentou-se bem diferenciado distinguindo-se as camadas basal, espinhosa,

granulosa e córnea.

A porção central revelou uma crosta com a porção profunda rica em

neutrófilos ainda com a morfologia preservada e o epitélio ainda ausente.

43

Figura 20: Fotomicrografia da borda da lesão do grupo tratado com muco puro. O epitélio estratificado mostra as camadas bem diferenciadas (seta curva) distinguindo-se a camada córnea bem definida, apoiado sobre o tecido de granulação (*) com numerosas células mononucleares e capilares e as células adiposas (seta). Coloração H.E. Aumento de 20x.

4.5.3.2. Tecido Conjuntivo

O tecido conjuntivo na margem da lesão caracterizou-se por ser bastante

celular com a presença de fibroblastos em desenvolvimento neutrófilos e alguns

linfócitos. Notou-se ainda, muitos capilares e vasos sanguíneos com diâmetros

variados (Fig. 21).

44

Figura 21: Fotomicrografia da borda da lesão do grupo tratado com muco puro. O tecido conjuntivo na porção profunda apresenta-se mais celular (*) enquanto na porção superficial menos celular (seta curva). Nota-se numerosos capilares com hemáceas (seta) e sem hemáceas (seta grossa) entre as células mononucleares e os fibroblastos em desenvolvimento. Coloração H.E. Aumento de 40x.

No centro da lesão, sob a crosta, notou-se um tecido conjuntivo celular e

avascular sobre a camada de células adiposas e em alguns locais a presença de um

material amorfo entremeado por neutrófilos com a morfologia preservada e alguns

núcleos em degeneração.

4.5.3.3. Fibras Colágenas

A coloração por “Sirius Red” revelou na periferia da lesão que os feixes de

fibras bem constituídas corando-se fortemente. Na porção central a camada

profunda revela feixes de fibras colágenas semelhantes as da região periférica da

lesão. Nota-se uma delgada camada superficial com poucos feixes de fibras

formadas e organizadas. (Figura 22)

45

Fig. 16 Fotomicrografia do grupo controle com soro fisiológico. A coloração específica revela fibrilas colágenas delgadas (seta) e escassos feixes de fibras colágenas (seta grossa). Coloração de Picro-sirius, Aumento de 40x.

Fig. 19 Fotomicrografia da borda da lesão do grupo tratado com muco+própolis. A coloração específica revela feixes de fibras colágenas (seta grossa) bem constituídos entre as fibrilas colágenas delgadas (seta). Coloração de Picro-sirius, Aumento de 40x

46

Fig. 22 Fotomicrografia da borda da lesão do grupo tratado com muco puro. A coloração específica revela na porção profunda feixes de fibras colágenas com indícios de agrupamento (seta grossa) e na porção superficial as fibrilas colágenas delgadas (seta). Coloração de Picro-sirius, 40x.

47

4.5.3.4 Enriquecimento Ambiental

As tocas colocadas como enriquecimento ambiental, foram utilizadas pelos

camundongos na maior parte do tempo, utilizando-as para brincar, (Figs. 23 e 24)

rodar, utilizar como ponto de “fuga”, expressar seu comportamento normal, como por

exemplo o ato de “higienizar-se”, e principalmente para dormir.

Não buscou-se avaliar se o enriquecimento ambiental poderia interferir na

cicatrização, e este foi colocado para todos os animais, indistintamente, pensando

somente em dar melhores condições de bem estar aos animais de experimentação.

As pedras higiênicas, utilizadas para forrar as caixas foram importantes para

preservar o ambiente livre umidade, diminuindo os odores normalmente liberados.

As serragens, sobre as pedras higiênicas, além de proporcionar maior conforto,

inclusive térmico, tendo em vista que o experimento foi realizado durante o inverno,

também possibilitou sua utilização como abrigo e “esconderijo”.

Segundo Newberry (1995) o enriquecimento ambiental ou comportamental é

tido como um método efetivo de melhoraria do bem-estar psicológico.

Figuras 23 e 24: Camundongos explorando o enriquecimento ambiental.

48 5. DISCUSSÃO

5.1 Análise do desempenho das rações nos escargots em experimentação

Os animais não mostraram rejeição ao novo alimento ofertado, porém, não se

pode afirmar se houve preferência alimentar por uma ou outra ração, no entanto, a

perda média de peso (aproximadamente 4 a 6 gramas por animal na primeira

semana) não pode ser considerada significativa, pois não houve alteração no

comportamento ingestivo dos animais em experimentação, não ocorreu mortalidade

dos mesmos, o que repercutiu em bem estar adequado durante todo o período

experimental.

A alteração da consistência, viscosidade, odor e coloração dos mucos pode

ser considerada um indicativo da absorção de nutrientes através da dieta e expressa

no muco, como já descrito em literatura.

5.2 Extração do muco

Neste trabalho preconizou-se a ética e o bem estar animal. Sendo assim,

para a extração de muco foi realizada a estimulação manual das glândulas podais

dos escargots, como realizada nos demais experimentos desenvolvidos no Heliciário

Experimental Profa. Dra. Lor Cury.

Esta metodologia se difere das utilizadas por outros pesquisadores como

Iguchi, et al. (1982), Kubota, et al. (1985) e Otsuka-Fuchino, et al. (1992) que fazem

uso de estímulos elétricos de 5 a 10 volts na superfície podal do animal para a

retirada do muco, o que causa estresse e até mesmo a sua morte, não preservando

o bem estar dos mesmos, assim como o uso do método de “afogamento” realizado

por Craze e Barr (2002) no preparo dos animais para dissecação, onde os caracóis

49 terrestres permaneciam em um recipiente com água durante todo o período noturno.

A quantidade de muco extraída através da estimulação manual, nesta pesquisa, foi

aproximadamente 1ml/por animal, podendo esta ser considerada baixa quando

comparada a outras metodologias de extração como a eletroestimulação podal,

porém que colocam o animal em sofrimento experimental.

Os métodos invasivos que podem levar animais a sofrimento foram abolidos

desta metodologia experimental nessa dissertação de mestrado, priorizando sempre

o bem estar animal.

5.3 Análise citotóxica do muco de escargot Achatina fulica

Muito se questiona a respeito da toxidade dos materiais biológicos oriundos

de animais, sendo imprescindível o desenvolvimento de tais testes in vitro, antes de

sua utilização in vivo, esse procedimento vem de encontro a ética e respeito a todos

os animais de experimentação.

Nenhuma das concentrações analisadas in natura, tanto do muco puro quanto

do muco+própolis, apresentou toxidade. Estes resultados estão em consonância

com a fisiologia do muco de caracóis terrestres, que consiste em 90 a 99,7% de seu

peso em água (Lincoln, et al., 2004) e é isento de crescimento bacteriano ou fúngico.

Fisher (1948) já sugeriu que o muco é ativamente anti séptico e inócuo e para

avaliar como substâncias antimicrobianas podem auxiliar no tratamento de feridas

de origem diversas, Martins, et al. (1996) realizaram experimentos em ratos fazendo

uso dessa secreção mucosa em diferentes concentrações.

Corossi e Chabu (2007) constataram que o muco de escargots possuem uma

substância denominada Acharan que possui ação anti angiogênica em tumores,

50 sendo responsáveis pela supressão tumoral e que exerce esta ação inibitória não

devido a ttooxxiicciiddaaddee cceelluullaarr, mas pela ação inibitória nos fatores de crescimento ou

ou por interferir nos mecanismos intracelulares ao se ligarem as proteínas das

membranas.

5.4 Análise parasitológica do muco de escargot Achatina fulica

Além dos escargots que fizeram parte da pesquisa com ração base e ração

base acrescida de própolis em sua dieta com finalidades cicatrizantes, foram

analisados mais 15 escargots provenientes do Heliciário Experimental Profa. Dra.

Lor Cury e 15 escargots asselvajados coletados na região de Pirassununga. Não foi

encontrada a presença de larvas nos mucos analisados.

Uma pesquisa divulgada através da Fundação Oswaldo Cruz e realizada por

NEUHAUSS, et al. (2006) relataram que, após a infecção experimental de

Angiostrongylus costaricensis e Angiostrongylus cantonensis e relatório

parasitológico de 6 lotes de Achatina fulica asselvajados da região de Florianópolis,

Santa Catarina, estes moluscos não apresentam um risco significativo para a

transmissão destes parasitas e que a carga parasitária e taxa de recuperação dos

inócuos foram extremamente baixas. Carvalho, et al., (2003) anteriormente, já havia

relatado que em seus estudos a maioria dos animais também não se infectaram.

Estudos realizados por Vasconcellos e Pile (2001), onde um total de 402

exemplares vivos de Achatina fulica foram coletados no município de Resende,

Estado do Rio de Janeiro e transportados em recipientes plásticos para o

Departamento de Biologia do Instituto Oswaldo Cruz (IOC), após análise

51 constataram que em nenhum dos moluscos testados foi observada eliminação ou

presença de larvas de Angiostrongylus cantonensis.

Apesar destes dados, os escargots Achatina fulica ainda são vistos como

vetores destes parasitas. SOUZA, et al. (2006) destaca que este aspecto pode estar

influenciado pelo conhecimento obtido sobre a helmintíase causada por

Schistosoma mansoni, onde há a participação de moluscos gastrópodes do gênero

Biomphalaria nos processos desta infecção aos seres humanos.

Um fator que deve ser ressaltado e também descrito por Paiva (2004), é que

as conchas de escargots Achatina fulica mortos, deixadas expostas ao meio

ambiente podem servir como reservatório para água da chuva e consequentemente

para proliferação de mosquitos do gênero Aedes, vetores de dengue no Brasil.

5.5 Enriquecimento Ambiental

Não foi avaliado se o enriquecimento ambiental pode interferir na cicatrização,

sendo colocado de igual forma (pedra higiênica, serragem e tocas) para todos os

animais, indistintamente. Buscou-se melhores condições para os animais de

experimentação. De acordo com Uez (2005), o enriquecimento ambiental reduz o

estresse pós-cirúrgico, relatando que o nível de corticosterona foi significativamente

menor na primeira semana de pós operatório nos animais submetidos a

enriquecimento ambiental. A autora também descreveu que os camundongos com

enriquecimento ambiental em suas caixas apresentaram níveis de corticosterona

similares a de animais que não haviam sofrido lesão cirúrgica.

52

O enriquecimento ambiental em nosso trabalho, não interferiu nos resultados,

porém foi gratificante proporcionar uma melhor qualidade de vida para estes animais

criados em laboratório.

5.6 Cicatrização da lesão induzida em camundongos

5.6.1 Avaliação macroscópica

No decorrer do experimento, observou-se que nos camundongos submetidos

a feridas provocadas com auxílio de punch, o tratamento com mucos de escargots

Achatina fulica extraídos de animais que receberam ração base e ração base +

própolis, proporcionaram uma redução maior da área da lesão induzida

comparativamente ao grupo controle, tratado com soro fisiológico.

No 3º dia após a indução das lesões, os aspectos macroscópicos eram

semelhantes entre os grupos tratados com os mucos, com discreta vantagem para o

grupo tratado com muco extraído de escargots que receberam ração base acrescida

de própolis em sua dieta.

A redução do diâmetro da lesão foi avaliada através de medidas obtidas com

paquímetro digital ao 5º dia de tratamento, a média das áreas lesionadas para o

grupo tratado com muco extraído de escargots que receberam ração base foi de

22..1188 mmmm.; para o grupo tratado com muco extraído de escargots que receberam

ração base acrescida de própolis em sua dieta foi de 11..9944 mmmm..; e para o grupo

controle, tratado com soro fisiológico foi de 33..6644 mmmm..

53

Os resultados obtidos evidenciam portanto, que o muco de escargots pode

ser usado como agente protetor de células da superfícies expostas ao ambiente

externo. (DAVIES & KHINS, 1998)

Como já relatado anteriormente em pesquisas realizadas por Lorenzi, et.al.

(2006); Sírio, et al. (2005); Caetano, et al. (2005) há muitos indícios demonstrando

que o muco de escargots contem propriedades relacionadas ao processo de

cicatrização o que confirma a possibilidade de utilizá-lo como agente zooterápico.

Estudos realizados nas últimas décadas atribuíram a própolis diversas

propriedades biológicas, entre elas: antimicrobianas, anti-inflamatórias,

cicatrizantes, anestésicas e anti-carcinogênicas, descrevendo após sua utilização

uma melhoria em queimaduras, cicatrização e ulcerações. (PARK, et al., 1998 ;

MUJALLI, 1999; HAVSTEEN, 2002; BERRETA, 2007).

Em função de todas estas características relacionadas a própolis, esta

substância, como parâmetro potencializador da cicatrização através de sua

utilização em dieta oferecidas aos escargots, em nossa hipótese foi confirmada,

embora de maneira ainda prematura, sendo necessário outras repetições.

No que diz respeito a redução da área de lesão cirurgicamente induzida, as

médias mensuradas ao 5º dia de tratamento representam um resultado sinalizador

quanto aos benefícios zooterápicos propostos por esta associação (muco + própolis)

no processo de cicatrização.

5.6.2 Avaliação histológica

Nas ultimas décadas houve um interesse crescente por terapias naturais e

neste campo destaca-se a Zooterapia que faz uso de produtos oriundos dos

54 animais. Tendo por base esta proposição, o muco de escargots destaca-se por suas

propriedades cicatrizantes e antimicrobianas.

A utilização do muco de escargots como um zooterápico tanto em medicina

veterinária quanto humana ainda é uma perspectiva, porém, aliado a esta linha de

pesquisa denominada Zooterapia, a própolis é bem mais estudada e sua

composição química melhor elucidada comparativamente ao muco. Apesar de

ambos possuírem propriedades farmacológicas, a própolis é amplamente descrita

como medicamento em cicatrização de ferimentos, regeneração de tecidos,

eczemas, dermatite de contato, úlceras externas, psoríase, herpes, dermatófitos

(Marcucci, 1996) e queimaduras. (Berreta, 2007).

É conhecido que o reparo de feridas na pele é um processo complexo que

inclui uma reação inflamatória aguda, regeneração das células do parênquima,

migração e proliferação de queratinócitos, fibroblastos e células endoteliais, síntese

de matriz extracelular, e longo período de remodelação (Singer e Clark, 1999 ; Chen

e Kirsner, 2007).

Nos três grupos analisados a reepitelização ainda encontrava-se incompleta

ao 5º dia de tratamento após a lesão induzida. Como Hattori, et al. (2009) obtiveram

a reepitelização completa aos 10 dias em uma lesão de pele com 8mm de diâmetro

em camundongos, o processo de reparo observado em nosso estudo está dentro da

normalidade. No entanto, o epitélio neoformado da periferia da lesão revelou as

camadas bem diferenciadas nos grupos tratados com os dois tipos de muco (dieta

base e dieta base + própolis). No grupo controle, a camada córnea apresentou-se

menos diferenciada.

Estudos revelam que a quimiocina IL-8 estimula a migração e proliferação dos

queratinócitos (Michel et al., 1992 e Gyulai, 1994). Além disso, Brown et al. (1992) e

55 Deodato, et al. (2002) relataram que os queratinócitos produzem o fator de

crescimento das células do endotélio vascular (VGEF), durante o reparo de lesões, o

qual atua de modo parácrino estimulando tanto a angiogênese (Detmar, et al., 1995)

quanto o reparo através dos queratinócitos (Egozi, et al., 2003).

A análise das células do tecido conjuntivo revelou que o número de neutrófilos

já havia reduzido consideravelmente no quinto dia após a lesão, entretanto este

número apresentou-se significativamente menor nos grupos tratados, quando

comparado ao grupo controle.

Observou-se ainda, que o tecido de granulação estava mais denso no grupo

tratado.

A migração de neutrófilos ao local da lesão inicia-se minutos após a injúria

(Martins, 1997) como uma primeira linha de defesa para a eliminação de corpos

estranhos e bactérias, além de produzir citocinas importantes para ativar os

fibroblastos e queratinócitos. (Hubner, et al., 1996).

Esses neutrófilos recém chegados liberam leucotrienos que apresentam

propriedades quimiotáxicas para todos os leucócitos (Gillitzer e Goebeler, 2001).

Após dois dias, com o fechamento da lesão e epitelização diminui muito o número

de neutrófilos junto a crosta. Monócitos e macrófagos representam a população mais

freqüente de células sanguíneas. (Engelhardt, et al., 1998).

Nossos dados estão de acordo com estas características, principalmente na

região periférica da lesão, no entanto, a região central, ainda sem epitélio revelou

uma freqüência maior de neutrófilos.

Com relação aos fibroblastos, foi observado um maior número nos grupos

tratados em relação ao controle.

56

Está bem estabelecido que os macrófagos são essenciais para o processo de

reparo normal, pois exibem a função imunológica como células apresentadoras de

antígeno, fagocitam e são importantes fontes de fatores de crescimento (Dipietro,

1995), além de produzir quimiocinas como a proteina-1 quimiotáxica de monócito

(MCP-1). (Engelhardt, et al., 1998). Essa quimiocina atrai também os mastócitos que

produzem interleucina-4 (IL-4), a qual estimula a proliferação de fibroblastos

(Trautmann et al., 1998). Desta forma, é possível que os componentes presentes no

muco de alguma forma participam estimulando a proliferação de fibroblastos, uma

vez que o grupo tratado revelou consideravelmente um maior número de

fibroblastos.

Houve também um desenvolvimento maior de fibras colágenas nesses grupos

comparativamente ao grupo controle. Os dados referentes as fibras colágenas foram

revelados por meio de uma técnica de coloração específica, denominada “Sirius

Red”.

A presença marcante de capilares e vasos sanguíneos de calibre variados,

nos grupos tratados, revelados em nossos estudos, sugere a participação do muco

de escargot puro ou com adição de própolis na angiogênese.

Tornossen, et al., (2000) revelaram que durante o reparo da ferida,

brotamentos capilares invadem o coágulo rico em fibrinas e fibronectina e em

poucos dias organiza uma rede microvascular no tecido de granulação. Lindenblatt,

et al. (2008) descreveram que em caso de enxerto de pele a microcirculação está

quase totalmente restaurada ao 5º dia. As características da microvascularização

aumentada quando comparada com a do grupo controle revela a efetividade do

muco puro ou com própolis sobre a angiogenêse, aspecto que favorece a

57 distribuição de oxigênio e nutrientes para as células em rápida proliferação no local

da lesão.

O endotélio dos capilares participam do complexo evento de reparo de lesões,

mediando e regulando o recrutamento dos leucócitos do compartimento intraluminal

para os tecidos e, formando novos vasos durante o reparo da lesão. (Gillitzer &

Goebeler, 2001). O processo da angiogênese está intimamente relacionado à

formação do tecido de granulação, o qual depende da ação relativa dos múltiplos

fatores produzidos por uma variedade de células. Dentre esses fatores encontra-se

o fator de crescimento das células do endotélio vascular (VEGF) produzido pelos

macrófagos e queratinócitos (Dvorak, et al., 1995) e fibroblastos. (Nissen, et al.,

1998) Gillitzer & Goebeler (2002) identificaram forte expressão da quimiocina IL-8

do primeiro ao quarto dia de lesão e a correlacionou com o número aumentado de

vasos neste período.

Estudos têm revelado que o VEGF é um potente estimulador de mitose para

as células do endotélio vascular. (Leug, et al.,1989). O VEGF liga aos receptores

VEGFR-1 e VEGFR-2 regulando a proliferação, migração e distribuição de células

endoteliais requeridas para o brotamento de novos vasos.

Foi possível observar uma diferença na maturação das células cicatriciais nas

lesões dos camundongos tratados com o muco extraído de escargots que

receberam ração acrescida de própolis, porém não se pode afirmar que houve uma

diferença significativa quando comparado ao grupo tratado com muco extraído de

escargots que receberam apenas ração base em sua dieta.

Muito ainda se questiona a respeito da manutenção das atividades biológicas

do muco de escargots, seja quanto a eficácia de suas propriedades anti

inflamatórias, regeneração tissular. A relação do muco de escargots ou alguns dos

58 seus constituintes, bem como as reações de defesa envolvendo fagocitose de

partículas estranhas (Ottaviani, 1983) e encapsulamento de material estranho (Tripp,

1970), fatores de defesa humoral envolvendo lizoenzimas (Cheng, 1975 e Miller, et

al., 1982) e opsonificação. ( Obara, et al., 1992)

Esses fatores de defesa humoral apresentam importante papel na proteção

de infecções microbianas, em especial no primeiro estágio da infecção, isto se deve

a presença da Achacin que é uma glicoproteina de alto peso molecular e composta

de subunidades que parecem estar relacionadas ao “ataque” da membrana

citoplasmática da célula. (Otsuka – Fuchino, et al., 1992).

Os resultados obtidos no presente estudo, podem vir a contribuir para melhor

entendimento do efeito do muco de escargots e consequentemente proporcionar sua

utilização efetiva, segura e de baixo custo em aplicações clínicas do processo de

cicatrização de animais e humanos. A utilização do muco de escargots ou sua

associação a produtos naturais como a própolis, confrei, barbatimão, papaína, entre

outros que promovem e contribuem no processo de cicatrização e todos seus

envolvimentos, é ainda restrito e carente de pesquisas “in vitro” e “in vivo”, mas para

nós representa um início, principalmente para nosso grupo de pesquisa do Heliciário

Experimental Profa. Dra. Lor Cury associado à Faculdade de Odontologia da

Universidade de Sâo Paulo, na pessoa da Dra. Mamie, que contribuiu com toda a

avaliação histológica dos trabalhos desenvolvidos até o presente momento.

Em função dos modestos resultados obtidos, investigações científicas

disponíveis, e de ter a adição de própolis como um sinalizador, este trabalho abre

caminho para outras possibilidades, com um número maior de repetições e adição

de própolis em diferentes concentrações.

59 5. CONCLUSÕES

Com base na metodologia utilizada e nos resultados obtidos conclui-se que:

O muco extraído de escargots Achatina fulica com diferentes dietas

apresentaram diferenciações fenotípicas quanto a consistência, viscosidade, odor e

coloração, demonstrando que as propriedades dos alimentos por eles ingeridos são

eliminados através desta secreção mucoglicoproteica.

Os mucos “in natura” de ambos os tratamentos não apresentaram toxidade,

estando aptos para a utilização proposta.

A utilização de ambos os mucos possibilitou acelerar o processo de

cicatrização.

A cicatrização tecidual foi praticamente semelhante entre os grupos tratados

com os mucos, com discreta vantagem para o grupo tratado com muco extraído de

escargots que receberam ração base acrescida de própolis em sua dieta.

60

7. REFERÊNCIAS ADIKWU M.U. Mucins and their potentials (editorial). Trop. J.Pharm. Res. 5: 581-582. 2006 ADIKWU MU, Aneke KO, Builders PF. Biophysical Properties of Mucin and its Use as a Mucoadhesive Agent in Drug Delivery: current Developments and future concepts. Nigerian J. Pharm. Res. 4: 60-60., 2005 ALICATA JE Biology and distribution of the rat lungworm, Angiostrongylus cantonensis, and its relationship to eosinophilic meningoencephalitis and other neurological disorders of man and animals. Adv Parasitol 3:223-248. 1965 ANCELIN M, CHOLLET-MARTIN S, HERVE MA. Vascular endothelial growth factor VEGF189 induces human neutrophil chemotaxis in extravascular tissue via an autocrine amplification mechanism. Lab invest 2004; 84: 502-512. BARLEON B, SOZZANI S, ZHOU D. Migration of human monocytes in response to vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1. Blood 1996; 87:3336-3343.

BARNES, R. S. K.; CALOW, P.; OLIVE, P. J. W. Os invertebrados. São Paulo: Atheneu Editora, 1995, 526 p.

BERRETA, A. A. Pesquisa pré-clínica e clínica de um gel termorreversível contendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF) para a redução do tempo de cicatrização de lesões em pacientes queimados”. Ribeirão Preto, 2007 (Doutorado em Faculdade de Ciências Farmacêuticas) BERRETTA, A. A. Desenvolvimento e avaliação de uma forma farmacêutica de liberação sustentada contendo extrato padronizado de própolis para o tratamento de queimaduras. 2003. 78 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto.

BONNET, J.C.; AUPINEL, P.; VRILLON, J. L. L'escargot Helix aspersa - biologie-élevage. Paris: INRA. 1990, 124 p.

BROWN LF, YEO KT, BERSE B, SENGER DR, DVORAK HF, VAN DE WATER L: Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) by epidermal keratinocytes during wound healing. J. Exp. Med. 1992, 176:1375-1379.

CAETANO, F. A. M. “Estudo comparativo do aparelho reprodutor do molusco Achatina fulica criado em cativeiro e asselvajado”. 2005. 61 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2005.

CAMPION, M. The structure and function of the cutaneous glands in Helix aspersa. The Quarterly Journal on Microscopical Science, v. 102, Parte 2,

COBBINAH, J. R. Snail farming in West Africa. Wageningen - Netherlands. 1993, 49 p.

COSTA NETO, E. M. Animal-based medicines:biological prospection and sustainable use of zootherapeutic resources. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 77 (11): 33-43, 2005

COSTA NETO, E. M. Barata é um santo remédio: Introdução à zooterapia popular no estado da Bahia. UEFS, Feira Santana, Brasil, 103 pp., 1999.

COSTA NETO, E. M. Os moluscos na zooterapia: medicina tradicional e importância clínico-

61

farmacológica. Revista Biotemas, 19, 2006.

COSTA NETO, E. M. Zootherapy-based medicinal traditions in Brazil. Honey Bee, 11 (2): 2-4, 18.

CRAZE, P. G.; BARR, A. G. The use of eletrical-componente freezing spray as a method of kiling and preparing snails. Journal of Molluscan Studies, v. 68, p. 192–192, 2002.

DEODATO B, ARSIC N, ZENTILIN L. GALEANO M, SANTORO D, TORRE V, ALTAVILLA D., VALDEMBRI D, BUSSOLINO F, SQUADRITO F, GIACCA M: Recombinant AAV vector enconding human VEGF 165enhances wound healing. Gene Ther 2002, 9:777-785 DETMAR M, YEO KT, NAGY JA, VAN DE WATER,L., BROWN LF, BERSE B, ELICKER BM, LEDBETTER S, DVORAK HF: Keratinocyte-derived vascular permeability factor (vascular endothelial grown factor) is a potent mitogen for dermal microvascular endothelial cells. J Invest Dermatol 105:44-50. 1995

DEYRUP-OLSEN, I.; LUCHTEL, D. L. Secretion of mucous granules and other membrane-bound structures: a look beyond exocytosis. International Review of Cytology, v. 183, p. 95-141,1998. .

DEYRUP-OLSEN, I.; LUCHTEL, D. L. Secretion of mucous granules and other membrane-bound structures: a look beyond exocytosis. International Review of Cytology, v. 183, p. 95-141,1998.

DVORAK, H. F., BROWN, I., F., DETMAR, M., DVORAK, A. M. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and angiogenesis. Am. J. Pathol. 146, 1029-1039. 1995 EGOZI EL, FERREIRA AM, BURNZ AL, GAMELI RL, DIPIETRO LA: Mast cells modulate the inflammatory but not the proliferative response in healing wounds. Wound Repair Regen 11:46-54. 2003.

EHARA, T.; KITAJIMA, S.; KANZAWA, N.; TAMIYA, T.; TSUCHIYA, T. Antimicrobial action of achacin is mediated by L-amino acid oxidase activity. FEBS Letters. v. 531, n. 3, p. 509-512, 2002.

ELMSIE, L. J. Strain differences in Helix pomatia L. (Gastropoda: Pulmonata): diapause, digging, growth rate and shell fill. Journal Molluscan Studies, v. 67, p. 121-124, 2001.

GEBARA, E.C.E; LIMA, L.A; MAYER, M.P.A Própolis antimicrobial activity against periodontophatic bactéria. Brazilian Journal of Microbiology., São Paulo, v. 33, n. 4, 2002. GILLITZER, R. & GOEBELER, M. Chemokines in cutaneous wound healin . Journal of Leukocyte biology, volume 69, April, 2001

GLINSKI, Z.; JAROSZ, J. Molluscan immune defenses. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis (Warsz), v. 45, n. 2-3, p. 149-55, 1997.

GONZALES, MARIELA A; EGANA, MA.PILAR, MUÑOZ, NATALIA. Creme de Caracol como tratamento auxiliar de cicatrizes em queimaduras e enxertos. Revista Chilena de Terapia Ocupacional.N 4 de Novembro de 2004. GREGORY, SR; PICCOLO, N.; PICCOLO, MT PICCOLO, M.S. HEGGERS, J.P. Comparison of própolis skin cream to silver sulfadizine: a naturopathic alternative to antibiotics in treatment of minor burns. The Journal of Alternative and Complementary Medicine., New York, v. 8, n.1, p.77-83, 2002. GYULAI, R. HUNYANDI, J., KENDERESSY-SZABO, A., KEMENY, L., DOBOZY, A. (1994) Chemotaxis of freshly separated and cultured human keratinocytes. Clin. Exp. Dermatol. 19, 309-311.

HELICICULTURA. Material didático do curso de Helicicultura, FMVZ/USP, Pirassununga, 2004.

62

HUBNER, G., BRAUCHLE, M., SMOLA, H., MADLENER, M.,FASSLER, R., WERNER, S. (1996) Differential regulation of pro-inflammatory cytokines during wound healing in normal and glucocorticoid-treated mice. Cytokine 8,548-556.

IBAMA. Breve histórico do caramujo-gigante africano no Brasil. Disponível em: < A referência de hiperlink não é válida./sp > Acesso em agosto, 2007.

IGUCHI, S. M. M.; AIKAWA, T.; MATSUMOTO, J. J. Antibacterial activity of snail mucus mucin. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 72A, n. 3, p. 571-574, 1982.

IYOMASA, M.; MARTINS, M. F.; PACHECO, P.; MIZUSAKI, C. I.†,; FIGUEIREDO, L. D.; SÍRIO, O. J.; CAETANO, F. A. M. Evaluation of the Achatina fulica snail glycoproteic mucus in surgical injury of rabbits. Brazilian Journal of Morphological Sciences, v.18, n. 2, p. 149, 2002.

JEONG, J.; TOIDA, T.; MUNETA, Y.; KISIICHI, I.; IMANARI, T.; LINHARDT, R. J.; CHOI, H. S.; WU, S. J.; KIM, Y. S. Localization e characterization of acharan sulfate in the body of the giant African snail Achatina fulica. Comparative and Biochemistry and Physiology Part B, v. 130, p. 513-519, 2001.

KOBAYASHI, A.; YAMAMOTO, I.; AOYAMA, T. Tribology of a snail (terrestrial gastropod). Tribology Series, v. 41, p. 429-436, 2002.

KUBOTA, Y.; WATANABE, Y.; OTSUKA, H.; TAMIYA, T.; TSUCHIYA T.; MATSUMOTO J. J. Purification and caracterization of an antibacterial factor from snail mucus. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 82C, n. 2, p. 345-348, 1985.

KYRIAKIDES,T. R. Mice that lack matrix metalloproteinase-9 display delayed wound healing associated with delayed reepithelization and disordered collagen fibrillogenesis. Matrix Biology, 28, 2009

LINCOLN, B. J.; SIMPSON, T. R. E.; KEDDIE, J. L. Water vapour sorption by the pedal mucus trail of a land snail. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 33, p. 251–258, 2004.

LORENZI, A. T. Estudo colorimétrico e espectroscópico do muco de caracóis Achatina sp alimentados com rações acrescidas de plantas medicinais. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Usp, Pirassununga, 2006.

MARTIN, P. (1997) Wound healing-aiming for perfect skin regeneration. Science 276, 75-81.

MARTINS, M. F. "A baba que cura". Revista Super Interessante, ano 14, n. 6, p. 75, 2000.

MARTINS, M. F., PACHECO, P., SÍRIO, O. J., TACCHI, V. C. B. Ação bactericida do muco podal do escargot Achatina fulica. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 30, 2003, Manaus, 2003.

MARTINS, M. F.; CAETANO, F. M. A.;SÍRIO, O. J.; IYOMASA, M. M.; MIZUSAKI, C. I.; PACHECO, P. "Avaliação da eficiência da secreção mucoglicoprotêica do escargot Achatina fulica em feridas provocadas em coelhos". In: Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária, Gramado/RS, 2002.

MARTINS, M. F.; PACHECO, P. "Escargot sem preconceito". Revista Pesquisa. FAPESP, v. 51, p. 32-34, 2000.

MARTINS, M. F.; PACHECO, P.; MIZUSAKI, C. I. †; IYOMASA, M. M.; SILVESTRINI JR, P. I.;

63

FUZETO, A. P. "Avaliação fenotípica e histológica de feridas cirúrgicas de coelhos tratados com secreção mucoglicoprotêica de escargot Achatina fulica". Arquivo do Instituto Biológico, n. 67, p. 1-145, 2000.

MICHEL, G., KEMENY, L., PETER, R. U., BEETZ, A., RIED, C., ARENBERGER, P., RUZICKA, T. (1992) Interleukin-8 receptor-mediated chemotaxis of normal human epidermal cells. FEBS Lett. 305, 241-243.

MITRA, D.; SARKAR, M.; ALLEN, A. K. Purification and characterization of an agglutinin from mucus of snail Achatina fulica. Biochimie, v. 70, n. 12, p. 1821-1829, 1988.

MORRISON, F. B. Alimentos e alimentação dos animais. São Paulo: Edições Melhoramentos, 1955. 921 p.

NOMURA, H. Os moluscos no folclore. Departamento Estadual de Imprensa, Natal, Brasil, 78 pp. 2000

OBARA, K.; OTSUKA-FUCHINO, H.; SATTAYASAI, N., NONOMURA, Y.; TSUCHIYA, T.; TAMIYA, T. Molecular cloning of the antibacterial protein of the giant African snail, Achatina fulica Férussac. European Journal Biochemistry, v. 209, p. 1-6, 1992.

OTSUKA-FUCHINO, H.; WATANABE, Y.; HIRAKAWA, C.; MATSUMOTO, J. J.; TSUCHIYA, T. Bactericidal action of a glycoprotein from the body surface mucus of giant African snail. Comparative Biochemistry and Physiology Part C, v. 101, n. 3, p. 607-613, 1992.

OZTURK, F; DURAN, N.; TAMER, C.; CETIN, M.; SILICI, S. Effect of propolis in the treatment of experimental Staphylococcus aureus Keratitis in rabbits. Ophthalmic Research, v. 37, p. 328-334, 2005.

PACHECO, P.; MARTINS, M. F. Desempenho ponderal do escargot Achatina sp frente a diferentes formulações de ração. Anais Congresso Brasileiro Medicina Veterinária Goiânia, v. 8, p. 184, 1996.

PACHECO, P.; MARTINS, M. F. O Escargot. Higiene Alimentar, v. 12, n. 55, p. 19-20, 1998.

PAIVA, C. L. Achatina fulica: praga agrícola e ameaça à saúde pública no Brasil. Disponível em http://www.geocities.com/lagopaiva/foto.htm [2004]. Acesso em 12 de fevereiro de 2006.

PARK, et al. Estudo da preparação dos extratos de própolis e suas aplicações. Cienc. Tecnol. Aliment. V.18 n.3 Campinas, 1998.

PARK, S. G. Growth Factors, Cytokines, Cell Cycle Molecules The Novel Cytokine p43 stimulates dermal fibroblast proliferation and wound repair. American Journal of Pathology, vol 166. No 2, February 2005 PÉREZ-TAMAYO, R. Introducción a la Patologia. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana,. 670 p. 1987

PONS, F.; KOENIG, M.; MICHELOT, R.; MAYER, M.; FROSSARD, N. The bronchorelaxant effect of helicidine, a Helix Pomatia extract, involves prosaglandin E2 release. Pharmaceutical Biology, v. 36, n. 1, p. 13-19. 1998.

64

RUPPERT, E. E.; FOX, R. S.; BARNES, R. D. Zoologia dos invertebrados. Uma abordagem funcional-evolutiva. 7ª ed. São Paulo: Roca, 2005. p. 323-481.

SGAI, M. G. Avaliação da influencia das técnicas de enriquecimento ambiental nos parâmetros endócrinos e comportamentais de Callitrix penicillata (sagüi-de-tufos-pretos) mantidos em estabilidade social e isolados. Tese de Mestrado, 2007.

SIMKISS, K.; WILBUR, K. M. The molluscan epiderms and its secretions. Symp.Zool.Soc.Lond, n. 39, p.35-75, 1977.

SINGER, A.J., CLARK, R.A.F Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med. 341, 738-746 1999

SÍRIO, O. J.; FIGUEIREDO, L. D.; IYOMASA, M. M.; PRADO, I. M. R.; RECHIA, C. G. V.; PACHECO, P.; MARTINS, M. F. "Investigation of partial composition of Achatina fulica snail mucus and its effects on surgical injuries in rabbits". In: CONGRESS OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, 4., 2003, Ribeirão Preto/SP.

SÍRIO, O. J.” Verificação da potencialização do efeito cicatrizante do muco de caracóis do gênero Achatina promovida por dieta à base de confrei”. 2005. 87 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2005.

SOUZA, et al., Conhecimento sobre o molusco gigante africano Achatina fulica entre estudantes de uma escola pública na Região Metropolitana do Recife. Revista Biotemas, 20, 2007.

TRAUTMAMM, A., KROHNE, G., BROCKER, E. B., KLEIN, C. E. Human mast cells augment fibroblast proliferation by heterotypic cell-cell contact and action of IL-4. J. Immunol. 160, 5053-5057. 1998 UEZ, F. Cicatrização de feridas cutâneas e níveis severos de corticosterona em ratos Wistar submetidos ao Enriquecimento Ambiental. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. 2005 WERNER S. GROSE R: Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiol Rev 83:835-870. 2003 WILGUS, T. R egulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation 88, 579-590, 2008. YUKAMI, T. Endothelial selections regulate skin wound healing in cooperation with l-selection and icam-1. Journal of Leukocyte Biology, volume 82, September, 2007. ZIMMERMAN, L.M., Veith I. Great ideas in the History. Baltimore, Wilkins & Wilkins Co., 1961.