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MÉTODOS DE ESTUDO: CÉLULAS E TECIDOS

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Etapas na preparação de amostras de tecidos para

estudo histológico

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FixaçãoFinalidades:

�Evitar a autólise;� Impedir a atividade e proliferação de bactérias;

�Endurecer as células ⇒⇒⇒⇒ resistir as próximas etapas;

� ↑↑↑↑ afinidade das estruturas celulares pelos corantes usados na M.O. e ↑↑↑↑contrastes na M.E.

� “Preservar” a morfologia e composição dos tecidos.

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FixaçãoAgentes Fixadores:

�Físicos:�Frio (Congelação); �Calor

�Químicos�Formaldeído (+comum);�Aldeído glutárico�Tetróxido de ósmio�Misturas fixadoras (Bouin,etc)

Microscopiaeletrônica

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Inclusão�Incluídos (protegidos) em parafina ou resina plástica ⇒⇒⇒⇒M.O.

�Incluídos em resinas do tipo epóxi (Araldite, Epon) ⇒⇒⇒⇒ M.E.

OBS.: Envolvem e penetram nas células.

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InclusãoOBS.: Antes da inclusão a amostra sofre: �Desidratação([ ] ↑↑↑↑ etanol = 70%→→→→Absoluto)�Diafanização(clareamento = benzol, xilol ou toluol)

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Microtomia�Micrótomo

�Microscopia óptica: cortes de 1 a 6 µµµµm, geralmente;

�Microscopia eletrônica: cortes de 0,02 a 0,1 µµµµm, geralmente;

�Micrótomo de congelação(obtenção rápida de cortes, histoquímica, etc).

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Coloração�A maioria dos tecidos é incolor;

�Facilita a visualização dos componentes teciduais;

�Propicia contraste entre os componentes celulares;

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Corantes básicos�O grupamento químico responsável pela cor (cromóforo) = catiônico

�Combinam-se com grupamentos ácidos (aniônicos) das moléculas celulares. Ex.: DNA, RNA (Basófilas = afinidade por corantes básicos)

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Corantes básicos�Azul de toluidina�Azul de metileno�Hematoxilina

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Corantes ácidos�Cromóforo = aniônico�Combinam-se com grupamentos básicos (catiônicos) das moléculas celulares. Ex.: Componentes básicos das proteínas citoplasmáticas (acidófilas = afinidade por corantes ácidos).

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Corantes ácidos�Orange G�Fucsina ácida�Eosina

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HEMATOXILINA & EOSINA (H&E)

�Coloração dupla + utilizada na rotina histológica;

�Hematoxilina: cora em azul os núcleos celulares e estruturas de natureza ácida (basófilas);

�Eosina: cora em diversas tonalidades de vermelho o citoplasma e o colágeno do material extracelular (acidófilas).

MICROSCÓPIOS

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Microscópio óptico�Parte mecânica

�Suporte para a parte óptica�Parte óptica

�Condensador �Objetiva�Ocular

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Microscópio óptico

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Microscópio ópticoAmpliação total da imagem =

Aumento da objetiva x

Aumento da ocular

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Microscópio óptico�Poder de resolução (sistema óptico) = capacidade de separar detalhes

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Microscópio óptico�Limite de resolução = menor distância que deve existir entre 2 pontos para que eles apareçam, individualizados. Ex.: 2 partículas separadas por 0,3 µµµµm aparecem individualizadas em um sistema óptico com limite resolutivo de 0,2 µµµµm, porém aparecem como partícula única quando o limite resolutivo é de 0,5 µµµµm

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Microscópio ópticoLimite de resolução (LR)LR = K x λλλλ

ANK = constante de valor 0,61;AN = abertura numérica (AN= n x sen αααα; n=índice de refração; αααα= semi-

ângulo da abertura)

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Microscópio óptico“ O que determina a riqueza de detalhes da imagem formada por um sistema óptico é o seu limite de resolução, e não o seu poder de aumentar o tamanho dos objetos”.

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Microscópio de Contraste de fase

�Transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade;

≠≠≠≠ de fase ⇒⇒⇒⇒ ≠≠≠≠ de intensidade luminosa = perceptível

Traduzida

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Microscópio de Contraste de fase

�Utilizado no estudo de células e tecidos vivos;

�Estruturas celulares�Escuras = fase positiva�Claras = fase negativa

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Microscópio Confocal�A iluminação é feita por um delgado feixe de raios laser, que varre ponto por ponto um determinado plano da célula = “corte óptico”;

�A imagem é formada exclusivamente pelas estruturas que estão no plano de varredura ⇒⇒⇒⇒ imagem muito nítida.

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Microscópio de fluorescência

�Utiliza fonte de luz ultravioleta;

Luz UV ⇒⇒⇒⇒ espécime ⇒⇒⇒⇒ Luz visível�Estruturas marcadas com corantes fluorescentes�Ex.:Alaranjado de acridina (DNA ⇒⇒⇒⇒ verde-amarelado; RNA ⇒⇒⇒⇒vermelho-alaranjado)

RaduanCitoesqueleto (cultura de fibroblastos)RITC-phalloidin – M. fluorescência

Citoesqueleto (cultura de fibroblastos)M. eletrônica

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Microscópio eletrônico�Apresenta alta resolução;�Riqueza de detalhes;�Utiliza feixes de elétrons;�Cortes ultra-finos (20 a 100 nm)

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Microscópio eletrônicoTransmissãoAquecimento do cátodo (filamento de tungstênio) no vácuo = elétronsacelerados por uma ≠≠≠≠ de potencial de 60 a 100 kV ⇒⇒⇒⇒ placa perfurada ⇒⇒⇒⇒ feixes de elétrons ⇒⇒⇒⇒ lentes eletromagnéticas (condensadora) ⇒⇒⇒⇒objeto ⇒⇒⇒⇒ lentes (≈≈≈≈objetiva) ⇒⇒⇒⇒lente (projetora) ⇒⇒⇒⇒ tela fluorescente ou filme fotográfico

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Microscópio eletrônico de transmissão

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Microscópio eletrônicoVarreduraBobina de varredura ⇒⇒⇒⇒ feixe de elétrons incide ponto por ponto do objeto

RaduanMicroscópio eletrônico de varredura

HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA

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HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA

Métodos utilizados para a localização intracelular das diversas substâncias que compõem as células e tecidos.

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HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA

Reações químicas específicas, ou interação macromolecular de alta afinidade ⇒⇒⇒⇒ compostos insolúveis, corados, ou elétron-densos ⇒⇒⇒⇒ localização de substâncias específicas (M.O. ou M. E.)

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HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA

�Lipídios�Corantes + solúveis nos lipídios do que no líquido que o corante está dissolvido;

�Sudan IV ⇒ vermelho

�Sudan negro ⇒ preto

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HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA

�Ácido desoxirribonucléico (DNA)�Reação de FeulgenHidrólise do DNA (ácido clorídrico) ⇒⇒⇒⇒ DNA com radicais aldeído livres + reativo de Schiff⇒⇒⇒⇒ composto insolúvel e vermelho

*Intensidade da cor proporcional ao teor de DNA

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HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA

�Ácido ribonucléico (RNA)�↑↑↑↑Afinidade por corantes básicos (azul de toluidina ou azul de metileno);

�Ribonuclease�Utiliza-se 2 preparações

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HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA

�Polissacarídeos�Glicogênio

�P.A.S. (Periodic Acid-Schiff)�Amilase

�Utiliza-se 2 preparações

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IMUNOCITOQUÍMICA�Direta

�Anticorpo marcado (peroxidase, ferritina, etc)

�Indireta�Antianticorpo marcado (peroxidase, ferritina, etc)