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MÉTODOS DE ESTUDO: CÉLULAS E TECIDOS

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Etapas na preparação de amostras de tecidos para

estudo histológico

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FixaçãoFinalidades:

Evitar a autólise; Impedir a atividade e proliferação de

bactérias;Endurecer as células resistir as

próximas etapas; afinidade das estruturas celulares

pelos corantes usados na M.O. e contrastes na M.E.

“Preservar” a morfologia e composição dos tecidos.

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FixaçãoAgentes Fixadores:

Físicos:Frio (Congelação); Calor

QuímicosFormaldeído (+comum);Aldeído glutáricoTetróxido de ósmioMisturas fixadoras (Bouin,etc)

Microscopiaeletrônica

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Desidratação[ ] etanol = 70%Absoluto Consiste na remoção da água dos tecidos, pois as substâncias

utilizadas para inclusão em parafina não se combinam homogeneamente com a água.

DiafanizaçãoClareamento = benzol, xilol ou toluol Visa remover completamente o álcool do interior dos

tecidos, preparando-os para as etapas subsequentes. pois a parafina não se mistura homogeneamente com o álcool.

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Impregnação

Os fragmentos de tecidos serão imersos e mantidos em parafina líquida (60ºC).

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InclusãoIncluídos (protegidos) em parafina ou resina plástica M.O.

Incluídos em resinas do tipo epóxi (Araldite, Epon) M.E.

OBS.: Envolvem e penetram nas células.

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Inclusão

Orientação dos fragmentosÉ um processo importante

na confecção dos cortes e análise dos tecidos.

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http://www.icb.usp.br/mol/

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http://www.icb.usp.br/mol/

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MicrotomiaMicrótomoMicroscopia óptica: cortes de 1 a 6 m, geralmente;

Microscopia eletrônica: cortes de 0,02 a 0,1 m, geralmente;

Micrótomo de congelação(obtenção rápida de cortes, histoquímica, etc).

https://www.leicabiosystems.com/histology-equipment

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ColoraçãoA maioria dos tecidos é incolor;Facilita a visualização dos componentes teciduais;Propicia contraste entre os componentes celulares;

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Corantes básicosO grupamento químico responsável pela cor (cromóforo) = catiônico

Combinam-se com grupamentos ácidos (aniônicos) das moléculas celulares. Ex.: DNA, RNA (Basófilas = afinidade por corantes básicos)

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Corantes básicos

Azul de toluidina

Azul de metileno

Hematoxilina

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Corantes ácidosCromóforo = aniônicoCombinam-se com grupamentos básicos (catiônicos) das moléculas celulares. Ex.: Componentes básicos das proteínas citoplasmáticas (acidófilas = afinidade por corantes ácidos).

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Corantes ácidos

Orange G

Fucsina ácida

Eosina

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HEMATOXILINA & EOSINA (H&E)

Coloração dupla + utilizada na rotina histológica;

Hematoxilina: cora em azul os núcleos celulares e estruturas de natureza ácida (basófilas);

Eosina: cora em diversas tonalidades de vermelho o citoplasma e o colágeno do material extracelular (acidófilas).

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MICROSCÓPIOS

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Microscópio óptico

Parte mecânicaSuporte para a parte óptica

Parte ópticaCondensador

Objetiva

Ocular

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Microscópio óptico

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Microscópio óptico

Ampliação total da imagem =

Aumento da objetiva

x

Aumento da ocular

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Microscópio óptico

Poder de resolução (sistema óptico) = capacidade de separar detalhes

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Microscópio óptico

Limite de resolução = menor distância que deve existir entre 2 pontos para que eles apareçam, individualizados. Ex.: 2 partículas separadas por 0,3 m aparecem individualizadas em um sistema óptico com limite resolutivo de 0,2 m, porém aparecem como partícula única quando o limite resolutivo é de 0,5 m

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Microscópio ópticoLimite de resolução (LR)LR = K x

ANK = constante de valor 0,61;AN = abertura numérica (AN= n x sen ; n=índice de refração; = semi-

ângulo da abertura)

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Microscópio óptico“ O que determina a riqueza de detalhes da imagem formada por um sistema óptico é o seu limite de resolução, e não o seu poder de aumentar o tamanho dos objetos”.

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Microscópio de Contraste de fase

Transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade;

de fase de intensidade luminosa = perceptível

Traduzida

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Microscópio de Contraste de fase

Utilizado no estudo de células e tecidos vivos;

Estruturas celularesEscuras = fase positiva

Claras = fase negativa

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Microscópio Confocal

A iluminação é feita por um delgado feixe de raios laser, que varre ponto por ponto um determinado plano da célula = “corte óptico”;

A imagem é formada exclusivamente pelas estruturas que estão no plano de varredura imagem muito nítida.

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Microscópio de fluorescência

Utiliza fonte de luz ultravioleta;

Luz UV espécime Luz visível

Estruturas marcadas com corantes fluorescentesEx.:Alaranjado de acridina (DNA verde-amarelado; RNA vermelho-alaranjado)

RaduanCitoesqueleto (cultura de fibroblastos)RITC-phalloidin – M. fluorescência

Citoesqueleto (cultura de fibroblastos)M. eletrônica

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Microscópio eletrônico

Apresenta alta resolução;

Riqueza de detalhes;

Utiliza feixes de elétrons;

Cortes ultra-finos (20 a 100 nm)

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Microscópio eletrônico

TransmissãoAquecimento do cátodo (filamento de tungstênio) no vácuo = elétronsacelerados por uma de potencial de 60 a 100 kV placa perfurada feixes de elétrons lentes eletromagnéticas (condensadora) objeto lentes (objetiva) lente (projetora) tela fluorescente ou filme fotográfico

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Microscópio eletrônico de transmissão

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Microscópio eletrônico

Varredura

Bobina de varredura feixe de elétrons incide ponto por ponto do objeto

RaduanMicroscópio eletrônico de varredura