Métodos de Detecção de Mutações dos genes

B-RAF e C-KIT em Melanomas

Dra Isabela Werneck da Cunha, MD phD Divisão de Patologia Molecular

Departamento de Anatomia Patológica iwcunha@hcancer.org.br

DNA

RNA

Proteínas

Funções celulares

Detecção das mutações • Detecção de proteínas alteradas, supressas ou super-

expressas – Imunoistoquímica

• Aumento ou diminuição do mRNA – RT-PCR

• Análise do DNA

– PCR – Real time PCR – Sequenciamentos – Hibridização in situ (se alterações no numero de cópias ou translocações

de genes inteiros)

O DNA – principais características

• Dupla-Fita

• Anti-Paralelas

• Complementares A T

C G

Códon Códon Códon Códon Códon

aminoácidos

4 nucleotídeos= 64 combinações diferentes de 3 em 3 (Temos 20 aminoácidos) Redundância: Vários códons codificam o mesmo aminoácido

• Mutações em Melanoma

– BRAF – NRAS – KIT

• Vias similares • Mutualmente

exclusivas • Diferentes tipos de

Melanoma

Lazar AJ & Murphy GF, Robbins and Cotran´s Pathologic Basis of Disease

Melanoma

•Diferentes vias moleculares

•Diferentes tratamentos

Subtipos de Melanoma

Mike Davies, MDACC CSD, Chronic sun-damaged

– GENE BRAF

– Gene da família das Kinases da via MAP kinase/ERKs

– Participa dos processos de divisão celular e diferenciação.

– A mutação leve a produção de uma proteína com atividade 10x maior que a selvagem, favorecendo proliferação celular, invasão, angiogênese e metástase.

Mutação do BRAF vista em 66% dos melanomas (Davies et al.2002)

– 97% das mutações envolvem o codon 600 (GTG>GAG)

(Valina>Ac.Glutâmico) (V600E)

– Associação com resposta (78%) a tratamento de melanoma

metastático com inibidores de BRAF (vemurafenib) (Eggermount et al 2011).

(JaKob J et al, Cancer 2012)

GENE BRAF

Targeted therapy for metastatic melanoma

Garnett MJ et al. Cancer Cell 2004;6:313–319; Wan PT et al. Cell 2004;116:855–887.

Zelboraf mode of action BRAF V600E

MEK

ERK

Arrested cell proliferation and survival

x Zelboraf

RAS-GTP

Growth factors

MAPK, Mitogen-activated protein kinase

BRAF

Normal cell proliferation and survival

MEK P

ERK P

Oncogenic BRAF signaling

BRAF V600E

Excessive cell proliferation and survival

MEK

ERK

P

P

– Gene da família das Proteínas Tirosino-Kinases

– Participa dos processos de divisão celular e diferenciação.

– A mutação leve a produção de uma proteína constantemente ativa,

favorecendo proliferação celular, invasão, angiogênese e metástase.

–

Cytogenetic Location: 4q11-q12 Molecular Location on chromosome 4: base pairs 55,524,094 to 55,606,880

GENE KIT

GENE KIT

GENE KIT

•Seleção dos casos •Extração do DNA •PCR de amplificação dos genes envolvidos •Real Time, sequenciamento, pirosequenciamento, análise de fragmentos, next sequencing generation, etc.....

•Análise dos dados

Pesquisa de Mutações

Mistura de células tumorais e estromais: Necessidade de microdissecção.

Heterogeneidade intratumoral. DNA mutado misturado com DNA selvagem: Desafio para detectar baixas taxas de mutação.

Fixação tecidual pode levar a dano do DNA. Tecido necrótico pode não ter DNA amplificado.

Tipo de fixação e outras impurezas como melanina podem interferir na amplificação do DNA

% tumoral % cópias mutantes

% DNA amplificado

Tipo de fixação

A grande maioria dos melanomas para testes moleculares estão emblocados em parafina

Adaptado

• PARA 1 litro • 100 ML DE FORMALDEIDO A 37% • 4,0 gramas de Fosfato de Sódio Monobásico NA H2 P04

H20 • 12,26 gramas de Fosfato de Sódio Bibasico Na2H PO4.7 H20 • 900 ml de Água destilada

• Acertar o PH = 7.2 a 7.4 com Hidróxido de Sódio NaOH=5 normal

Fixação do Material (formol tamponado a 10%)

FORMOL TAMPONADO A 10%

Formol tamponado 10%

Confirmação Diagnóstica (checagem do material enviado)

Seleção da amostra

• Microdissecção a laser

• Microdissecção manual /scrape

Tumor content study Correct detection of V600E mutations in specimens with at least

15% tumor content and/or mutation level >5%

Specimen Tumor content* % mutation Test result 1 5%/5% 3% Mutation not detected 4 10%/10% 4% Mutation not detected 5 10%/10% 14% Mutation not detected 8 15%/15% 3% Mutation detected 12 20%/20% 28% Mutation detected 14 20%/20% 2% Mutation detected 17 30%/25% 20% Mutation detected 22 35%/35% 7% Mutation detected

26 40%/35% 7% Mutation detected

31 40%/45% 36% Mutation detected

cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011.

*Tumor content for first and last of 12 adjacent 5µm sections from each specimen

Impacto da quantidade relativa de estroma na sensibilidade de detecção de mutação do gene

KRAS (Macedo MP 2012)

• Lâminas histológicas submetidos a análise de imagens para estimar a proporção de tumor em relação ao estroma

48% de células neoplásicas

Impacto da quantidade relativa de estroma na sensibilidade de detecção de mutação do gene KRAS

Extração do DNA

Inúmeros métodos Inúmeros kits

• Espectofotômetro • Mede quantidade e

qualidade do DNA obtido • Usar o DNA para realizar a

PCR.

PCR

• Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase)

• Amplificação do DNA (criação de múltiplas cópias)

• Consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.

• Pode ser usada para amplificar todo o gene ou somente parte de um gene

595 596 597 598 599 600 601 602 603 ........

Área de interesse

DNA

PCR

Codon 600

Sequenciamento Gênico

• Determinar a ordem das bases nitrogenadas A G C T da molécula de DNA

• Métodos: • Sanger – conceito de sequenciamento por ``Chain termination´´

• Pirosequenciamento: sequenciamento por síntese • Next sequencing generation • Análise de fragmentos, etc • RT-PCR

Um Pouco de História.....

"for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids“

Nobel Prize in Chemistry - 1980

Frederick Sanger 1918-

Walter Gilbert 1932-

c.1780 G>A, pD594N

Pirossequenciamento

PPi ATP

Emissão de luz

Tempo

•Se baseia no conceito de liberação de pirofosfato após incorporação de cada nucleotídeo- conceito do sequenciamento por síntese •Mais sensível que Sanger •Quantitativo

cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011.

cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test Based on TaqMan® PCR

Probe and primer binding Polymerization Fluorescence TaqMan® probe

Fluorophore

Quencher Amplifica

tion Cleavage products

Forward PCR primer

Competitive landscape cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test – comparison to

other methods

Feature cobas® BRAF test1

therascreen BRAF RGQ2 kit

Direct sequencing

Next generation sequencing PCR-based LDT

% tumor required

≥50% Undefined Undefined Undefined Undefined

DNA input required

125 ng/25 μl requires PCR titration Undefined Undefined Undefined

Sensitivity ≤5% FFPET 1–5% in cell line ~20% ~1%–5% Undefined

Storage conditions

2 to 8°C -18°C to -25°C Variable Variable Variable

Control/result interpretation

Automated Manual Manual Manual Manual

Workflow <8 hours ~16 hours ~3 days ~5 days ~16 hours

IVD platform CE-IVD, FDA approved RUO RUO RUO RUO

1cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011; 2therascreen BRAF RGQ PCR Kit CE-IVD Handbook, Qiagen Manchester Ltd, UK, 2011.

LDT=Laboratory-developed test

• Imuno-histoquímica – VE1 – Anticorpo monoclonal anti-BRAF

V600E • Representa a sequência de aa da

mutação V600E • aa 596-606: GLATEKSRWSG

– Negativo em: • Gene tipo-selvagem • Outras mutações do BRAF

Assessment of BRAF V600E mutation status by immunohistochemistry with a mutation-specific

monoclonal antibody

David Capper • Matthias Preusser • Antje Habel • Felix Sahm • Ulrike Ackermann • Genevieve Schindler • Stefan Pusch • Gunhild

Mechtersheimer • Hanswalter Zentgraf • Andreas von Deimling

Acta Neuropathology (2011) 122:11–19

Immunohistochemical testing of BRAF V600E status in 1,120 tumor tissue samples of patients with brain metastases David Capper • Anna Sophie Berghoff • Manuel Magerle • Aysegu¨ l Ilhan • Adelheid Wo¨hrer • Monika Hackl • Josef Pichler • Stefan Pusch • Jochen Meyer • Antje Habel • Peter Petzelbauer • Peter Birner • Andreas von Deimling • Matthias Preusser Acta Neuropathology (2012) 123: 223 – 233

Em resumo

• Condições pré analíticas – Tamanho/Tipo da amostra – DNA degradado (descalcificação) – Fixação inadequada

• Métodos (sensibilidade X especificidade)

Taxa de resultados inconclusivos: 2 a 3 % (dados americanos)