Artigo

de análise como, por exemplo, distribuição não uniforme das micotoxinas nos lotes contaminados, níveis de conta-minação serem extremamente baixos, extratos usualmen-te acompanhados de interferentes necessitando de uma fase de limpeza e a natureza variada das amostras, as quais requerem diferentes procedimentos na extração (4).

A necessidade de decisões rápidas leva aos novos méto-dos de triagem, por exemplo, imunoensaios, MIPs (Molecu-larly Imprinted Polymers), biossensores e a espectroscopia no infravermelho. Na análise de multitoxinas a espectrome-tria de massas está sendo muito promissora (5).

Os principais métodos de extração de aflatoxinas pre-sentes em alimentos e rações à base de milho encontram-se descritos na Tabela 1.

A extração de aflatoxinas de amostras requer o uso de solventes ou mistura de água e solventes relativamente polares (metanol, acetona, etilacetato) (5). As matrizes problemáticas são, em particular, materiais secos, tais

As aflatoxinas, metabólitos altamente tóxicos de Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nomius, podem contaminar alimentos e rações à base de milho no campo ou no armazenamento. Devido ao potencial risco à saúde humana, os níveis de aflatoxinas são monitorados em mui-tos países. Com a finalidade de fornecer informações a respeito dos métodos empregados na determinação de aflatoxinas em alimentos e rações à base de milho, foi realizada uma revisão da metodologia analítica relatada na literatura científica.

Palavras-chave: aflatoxinas, métodos analíticos, milho

MÉTODOS ANALÍTICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINAS EM MILHO E SEUS DERIVADOS: UMA REVISÃO

Aflatoxins are mycotoxins produced by Aspergillus flavus, A. parasiticus and A. nomius and occur in corn used for food and in corn-based animal feeds. They have been to the potential risk to the health human. The aflatoxins levels are monitored in many countries. The pre-sent paper reviews the analytical methodology currently described in the cientific literature for determination of aflatoxins in corn-based foods and feeds.

Keywords: aflatoxins, analytical methods, corn

As aflatoxinas podem ser produzidas por três espécies de Aspergillus, A. flavus, A. parasiticus e A. nomius, que con-taminam grãos e seus produtos. O A. flavus produz apenas aflatoxinas do grupo B, enquanto as outras duas espécies produzem aflatoxinas dos grupos B e G (1). As aflatoxi-nas são conhecidas por serem compostos mutagênicos, carcinogênicos e teratogênicos. A exposição por ingestão de aflatoxinas pode levar ao desenvolvimento de sérias condições clínicas que variam consideravelmente depen-dendo da espécie animal, dose, estado nutricional, idade e gênero (2,3). Após a ingestão, a aflatoxina B1 é biotrans-formada por enzimas dando origem a um produto reativo, o 8-9-epóxido, que pode se ligar tanto ao DNA quanto à albumina sérica formando adutos de aflatoxina-N7-guanina e aflatoxina-N7-lisina, respectivamente. As ligações cova-lentes dos adutos no DNA são consideradas um passo crítico na hepatocarcinogênese das aflatoxinas (3).

Uma vez que a presença do fungo não implica neces-sariamente na presença de toxinas, as determinações ana-líticas são necessárias para fiscalização, monitoramento e pesquisa. Existem vários fatores que dificultam este tipo

Kassia Ayumi Segawa do Amaral eMiguel Machinski Junior*

Universidade Estadual de MaringáDepartamento de Análises Clínicas, Laboratório de Toxicologia

*Autor para correspondência:Av. Colombo, 5790CEP: 87020-900. Maringá. PRFone: (44) 3261-4565Fax: (44) 3261-4489E-mail: mmjunior@uem.br

Resumo

Summary

Introdução

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Extração

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como pós ou aqueles com um alto conteúdo de consti-tuintes hidrossolúveis. Nestes casos, o uso de extratores aquosos como o metanol ou acetona é menos crítico que o uso daqueles contendo acetonitrila (17).

O extrato resultante da etapa anterior contém várias impurezas, como lipídios e pigmentos. Os procedimentos de limpeza do extrato envolvem partição líquido-líquido, colunas de extração em fase sólida (sílica gel, C18, silicato de magnésio) (11, 15) e colunas de imunoafinidade (3, 5, 12). O uso de agentes clarificantes como sulfato de cobre ou sulfato de amônio associado a terra diatomácea foi relatado por Soares e Rodrigues-Amaya (13).

Detecção/Quantificação

A determinação de aflatoxinas tem sido realizada por várias técnicas, como: cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e imunoensaios (ELISA, BIOSSENSORES, SIIA).

Cromatografia em camada delgada

É a técnica de referência para a maioria dos labora-tórios brasileiros porque não necessita de equipamentos onerosos e é confiável (13). A CCD permite separação eficaz dos compostos, o que torna este método muito útil na caracterização das aflatoxinas. Na CCD, o Rf das micotoxinas varia conforme a mistura de solventes da fase móvel (18), sendo muito utilizado o sistema-solven-

te tolueno-acetato de etila-clorofórmio-ácido fórmico – 70:50:50:20 (19). A quantificação das aflatoxinas pode ser realizada utilizando técnica visual sob luz UV ou a den-sitometria (20).

Cromatografia líquida de alta eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência de fase nor-mal e fase reversa tem sido usada com detecção por ab-sorção ultravioleta (UV), fluorescência, espectrometria de massas e amperométrica. O sistema de detecção por fluorescência é, cerca de 30-40 vezes mais sensível que o sistema de detecção por UV para aflatoxinas. A sensibili-dade pode ser aumentada através da conversão de aflato-xinas em derivados por derivação pré-coluna com ácido trifluoroacético ou derivação pós-coluna com iodeto ou brometo (3, 21).

Imunoensaios

Existem atualmente no comércio vários tipos de testes (kits comerciais) baseados em métodos imunoquímicos tanto para a detecção qualitativa (triagem) como para a determinação quantitativa de micotoxinas.

ELISA (ensaio imunoenzimático)

A técnica de ELISA pode ser competitiva direta ou in-direta, e consiste em dois passos: 1) a reação entre o anticorpo e a aflatoxina, e 2) a detecção da reação usando a hidrólise enzimática do substrato pelo complexo afla-toxina-enzima. A técnica de ELISA pode ser usada como procedimento de triagem na determinação de aflatoxinas, devido a sua sensibilidade, especificidade, rapidez e faci-lidade de manuseio (6, 22, 23). A principal desvantagem desta metodologia é a alta incidência de resultados falso-positivos, grande variabilidade nos resultados (30-300%), baixa reprodutibilidade e possibilidade de resultado falso-negativo (24).

Biossensores

Um biossensor fluorométrico de imunoafinidade tem sido desenvolvido para detectar e quantificar aflatoxinas. O aparelho opera nos princípios de imunoafinidade e fluores-cência para um ensaio quantitativo (25). Os imunosensores geralmente se referem a um sistema que acopla um material imunoativo a um transdutor para produzir um sinal elétrico proporcional à quantidade do analito presente (8).

Imunoensaio de injeção sequencial (SIIA – Sequential injection immunoassay)

Ensaio imunoenzimático colorimétrico de injeção se-quencial utiliza a célula de jato de fluxo com fase sólida de

Tabela 1. Levantamento dos solventes para extração de aflatoxinas em milho e derivados

Detecção/Quantificação

Solventes extratores Proporção Referência

Metanol:água 70:30 (6, 7)

Metanol:água 6.5:3.5 (7)

Metanol:água→hexano 80:20→5 (8)

Acetonitrila: água 9:1 (9)

Celite:água:clorofórmio 25g:10ml:250ml (10)

Acetonitrila:água 9:1 (11)

Metanol:água 8:2 (12)

Metanol:KCl 9:1 (13)

Clorofórmio:água 30:1 (14)

Acetonitrila:água 9:1 (3)

Clorofórmio:água 30:1 (15)

Clorofórmio:água (3, 16)

Metanol:água (3, 16)

Acetonitrila:água (3, 16)

Limpeza

Artigo

Conclusões

Confirmação

polimetilmetacrilato adsorvidas com AFB1-albumina sérica bovina. É uma técnica de imunoensaio competitivo indi-reto com duplo anticorpo tão sensível quanto o ELISA na detecção de AFB1. A desvantagem é que o método de SIIA realiza os ensaios individualmente e seqüencialmente, e no caso de muitas amostras, a análise é demorada (8).

A confirmação pode ser efetuada segundo Przybylski (26) por derivação química com ácido trifluoroacético (TFA) com formação dos derivados hemiacetais caracte-rísticos das aflatoxinas B1 e G1 (27) e analisadas por CCD. A espectrometria de massas acoplada ao cromatógrafo gasoso ou líquido de alta eficiência é um procedimento de confirmação altamente específico na análise de aflatoxi-nas, mas requer equipamentos de alto custo.

Um método de análise para aflatoxinas em milho e deriva-dos deve ser simples, rápido, robusto, exato, preciso e sele-tivo para permitir determinações simultâneas. Além disso, os baixos níveis de tolerância em alimentos e rações requerem métodos sensíveis. De acordo com as recomendações evi-denciadas pelos diversos autores, pode-se concluir que os métodos analíticos para a determinação de aflatoxinas em mi-lho e derivados têm sido amplamente desenvolvidos, mas são necessários alguns melhoramentos para se tornarem exatos, baratos e rápidos. Dentre os métodos mais acessíveis aos laboratórios, os imunoensaios apresentam como vantagem a baixa utilização de solventes orgânicos; a CCD é a técnica mais utilizada nos países em desenvolvimento, devido o seu baixo custo e eficiência, enquanto a CLAE é a mais emprega-da nos países desenvolvidos.

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Referências

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