Érica Guilhen Mario

Metabolismo do tecido adiposo epididimal

de camundongos com deleção genética do

receptor MAS.

Tese de mestrado apresentado ao programa de

Pós-graduação em Ciências Biológica – Fisiologia e

Farmacologia do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Minas Gerais como

requisito parcial à obtenção do título de mestre.

Orientadora: Profa. Dra. Leida Maria Botion.

Belo Horizonte Instituto de Ciências Biológicas da UFMG

2007

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Aos meus pais Gilberto e Clélia, meu irmão Everton e ao

querido Alexandre.

ii

Agradecimentos

A Deus, muito obrigada pela dádiva da vida e por estar sempre presente em cada

passo da minha trajetória.

Aos meus pais, Gilberto e Clélia, que tantos sacrifícios dedicaram à minha formação

pessoal e profissional, que muitas vezes renunciaram aos seus sonhos para que eu

pudesse realizar os meus.

Ao meu irmão, Éverton e familiares que são a base de tudo que tenho e sou.

Com grande alegria agradeço à minha família mineira Aline, Adriano, Maria de Paula e

Otávio, que muitas vezes foram à base da minha solidificação em Minas Gerais.

Agradeço ao Alexandre o grande apoio, paciência e amor que foram importantes

durante essa jornada.

A Profª Drª Leida Maria Botion pela sua orientação e profissionalismo, imprescindíveis

na minha formação científica.

Aos colegas do laboratório de metabolismo celular: Adriana, Ana Carolina, Gilbert,

Natália, Jonas.

Agradeço de coração as minhas grandes amigas: Adaliene, Laura e Zélia que tanto

contribuiriam com este trabalho, mas que acima de tudo tornaram-se amigas de

coração.

Ao Prof. Dr. Robson Augusto S Santos por ter me socorrido na hora crucial e ter

confiado no meu trabalho.

iii

Ao Serginho pela ajuda importantíssima na realização do PCR.

Ao Prof. Dr. Cândido Coimbra por disponibilizar a dosagem de AGL sérico.

A Ilma pelo carinho com os animais.

A grande família da pós-graduação do departamento de fisiologia, em especial aos

novos amigos conquistados: Adelaide, Daniel, Éder, Gonzaga, Marcelo, Nívia, Priscila.

A todos vocês meu muito obrigado!!!!

iv

RESUMO

Estudos recentes têm demonstrado que animais com ausência do receptor

MAS, receptor acoplado a proteína G que medeia várias ações da angiotensina-(1-7),

apresentam um quadro de dislipidemia, com aumento plasmático de colesterol total,

HDL (lipoproteína de alta densidade) e triacilgliceróis e menor sensibilidade á ação da

insulina. Esse trabalho teve como finalidade estudar o metabolismo do tecido adiposo

em animais knock-out para receptor MAS. Observamos que animais knock-out (KO)

para o receptor Mas apresentam maior concentração plasmática de ácidos graxos livres

em relação aos animais wild-type (WT). Tanto a atividade lipolítica basal quanto a

estimulada pelo isoproterenol foram semelhante entre os grupos. A insulina reduziu em

41% a atividade lipolítica de adipócitos estimulados pelo isoproterenol no grupo wild

type, enquanto que nenhum efeito da ação da insulina foi observado no grupo KO. A

massa da enzima HSL foi semelhante entre grupos. A atividade da enzima LPL

encontra-se aumentada 2,4 vezes no tecido adiposo dos animais KO em relação ao

tecido adiposo do grupo WT. A atividade lipogênica basal e estimulada pela insulina

encontra-se semelhante entre os grupos, entretanto a expressão do PPARγ está

reduzida em 66% nos animais com deleção genética do receptor MAS. A captação de

glicose em condição basal foi semelhante entre os grupos. No que se refere à captação

de glicose estimulada pela insulina, observou-se um aumento do transporte de glicose

nos dois grupos de animais, todavia, os adipócitos dos animais KO apresentaram uma

redução de 39% da captação de glicose estimulada pela insulina em relação aos

adipócitos dos animais WT. Nossos dados sugerem que a falta da ação da ANG-(1-7)

via receptor MAS parece alterar a resposta dos adipócitos à ação da insulina, levando a

uma resistência insulínica.

v

ABSTRACT

Recent studies have demonstrated that animals with absence of receptor MAS, receptor

G protein-coupled receptor that acts in several actions of angiotensin-(1-7), show a

dylslipemia, with an increasing of total plasmatic cholesterol, HDL ( high density

lipoprotein), triacyglicerol and less sensibility to the insulin actions. The aim of this study

was to investigate the metabolism of adipose tissue in animals knock-out to the receptor

MAS (KO). We observed that animals KO showed a greater concentration of plasmatic

fatty acids in comparison the wild-type animals (WT). The lipolitic activity as basal as

stimulated by isoproterenol was the same in both groups. The insulin decreased in 41%

the lipolitic activities of adipocytes stimulated by isoproterenol in a wild-type group, while

no effect of the insulin action was observed in a KO group. The amount of HSL enzyme

was the same in both groups. The LPL enzyme activity is increased 2.4 times on

adipose tissue of KO animals compared to adipose tissue of WT group. The lipogenic

activity as basal as stimulated by the insulin was the same in both group, however, the

expression of PPARγ is reduced in 66% in animals with absence of MAS receptor. The

glucose uptake in the basal condition was the same in both groups. Regarding to the

glucose uptake stimulated bu insulin, it was observed an increasing of glucose

transportation in both groups, however, the adipocytes of KO animals showed a

decreasing of 39% of glucose uptake stimulated by insulin, compared to adipocytes of

WT animals. Our data suggested that the lack of angiotensina-(1-7) action through MAS

receptor seemed to alter the response of adipocytes of insulin action, leading an insulin

resistance.

vi

Lista de abreviaturas

AC: adenilato ciclase

ACC: acetil-CoA carboxilase

ACS: acil-CoA sintetase

AGL: ácidos graxos livre

AGT: angiotensinogênio

Amp: aminopeptidase

Ang II: angiotensina II

Ang-(1-7): angiotensina-(1-7)

AT1: receptor tipo 1 de angiotensina II

AT2: receptor tipo 2 de angiotensina II

AQP 7: aquaporina 7

βAR: receptor β-adrenérgico

cAMP: adenosina monofosfato cíclico

DNA: ácido desoxiribonucleico

DNAc: DNA complementar

ECA: enzima conversora de angiotensina ECA 2: enzima conversora de angiotensina 2

FATP: proteína transportadora de ácidos graxos

FDE 3B: fosofodiesterase 3B

GLUT 4: transportador de glicose 4

HDL: lipoproteína de alta densidade

HSL: lípase hormônio sensível

IR: receptor de insulina

IRS 1: substrato do receptor de insulina 1

JAK 2: proteína janus kinase

vii

KO: deleção genética de determinad gene (knock-out)

LPL: lípase lipoprotéica

NEP: endopeptidase neutra

PEP: prolil-endopeptidase

PGI 2: prostaglandina 2

PI3K: fosfatidil inositol 3 kinase

PKA: proteína kinase A

PPARγ: receptor ativado pelo proliferador de peroxissomos gamma

RNA: ácido ribonucleíco

RNAm: RNA mensageiro

SNS: sistema nervoso simpático

SRA: sistema renina-angiotensina

TAE: tecido adiposo epidimal

TAG: triacilgliceróis

VLDL: lipoproteína de muita baixa densidade

WT: selvagem/controle (wild type)

viii

Lista de figuras

1 Principais vias metabólicas do tecido adiposo

3

2 Diagrama simplificado da cascata de formação e de degradação

dos principais angiotensinérgicos biologicamente ativos

8

3 Atividade lipolítica de adipócitos isolados da tecido adiposo epidimal

em condições basal e estimulada por isoproterenol

25

4a Autoradiograma representativo de western blot para proteínas HSL

e β-actina

26

4b Análise semi-quantitativa do conteúdo protéico da enzima HSL. 26

5 Atividade da enzima LPL no tecido adiposo epididimal

27

6 Atividade lipogênica in vitro do tecido adiposo epidimal em condição

basal ou estimulada por insulina

28

7a Expressão do RNAm para PPARγ no tecido adiposo epididimal 29

7b Expressão do RNAm para ACC no tecido adiposo epididimal 29

8 Captação de glicose por adipócitos isolados do tecido adiposo

epididimal 30

ix

Sumário

Resumo v

Abstract vi

Lista de figuras vii

Lista de abreviaturas viii

1.0 Introdução 1

1.1 Tecido adiposo 2

1.2 Metabolismo do tecido adiposo 2

1.3 Tecido adiposo e seu dinamismo 6

1.4 Sistema renina-angiotensina 7

1.5 Sistema renina-angiotensina no tecido adiposo 10

2.0 Objetivo 14

2.1 Objetivos específicos 14

3.0 Materiais e métodos 15

3.1 Animais 15

3.2 Metodologias 15

3.2.1 Isolamentos dos adipócitos 15

3.2.2 Lipólise 16

3.2.3 Captação de glicose 16

3.2.4 Lipogênese in vitro 17

3.2.5 Medida da atividade lípase lipoprotéica 18

3.2.6 Análise semi-quantitativa da enzima HSL no tecido adiposo por

Western blot 19

3.2.7 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR RT) 20

3.2.7.1 Extração RNA total 20

3.2.7.2 Eliminação de moléculas de DNA genômico das amostras 21

3.2.7.3 Quantificação do RNA total 21

x

xi

3.2.7.4 Transcrição reversa 21

3.2.7.5 PCR semi-quantitativo 22

3.2.8 Dosagens bioquímicas 23

3.2.9 Análise dos dados 23

4.0 Resultados 24

4.1 Biometria e dosagens séricas 24

4.2 Atividade lipolítica e western blot para HSL no tecido adiposo 25

4.3 Atividade da enzima LPL em tecido adiposo 27

4.4 Lipogênese in vitro do tecido adiposo 28

4.5 Expressão gênica por real time PCR 29

4.6 Captação de glicose por adipócitos 30

5.0 Discussão 31

6.0 Referências bibliográficas 38

1.0 INTRODUÇÃO

Evidências crescentes sugerem que a distribuição de tecido adiposo é fator

crítico na relação entre obesidade e doenças cardiovasculares, uma vez que o

acúmulo de gordura na região abdominal está associado com o aumento do risco de

desenvolvimento de doença cardiovascular e morbidades correlatas (FOLSOM et al,

1993; BJÖRNTORP et al, 1984). Foi verificado que as células adiposas de origem

abdominal possuem maior atividade lipolítica e resistência ao efeito antilipolítico da

insulina, quando comparada com adipócitos provenientes de outros depósitos

(KISSEBAH et al, 1989a; BOLINDER et al, 1983).

Grassi et al (1995) demonstraram que um aumento expressivo no peso corporal

está associado com maior ativação simpática. Esta possibilidade de ativação do

sistema nervoso simpático (SNS) é indicada pela forte associação entre aumento da

pressão arterial e freqüência cardíaca em pessoas com excesso de peso. O aumento

da atividade do SNS poderia não apenas ser responsável pela elevação da pressão

arterial e da freqüência cardíaca, mas também pelo aumento na mobilização de

ácidos graxos livres (AGL) provenientes do tecido adiposo. A elevação de AGL é um

importante achado na obesidade abdominal (KISSEBAH, 1989b), exercendo efeitos

periféricos no desenvolvimento da resistência insulínica pela inibição da captação de

glicose pelo músculo esquelético (RANDLE et al, 1963). Também foi observado que o

aumento na concentração plasmática de ácidos graxos livres determina um aumento

na resposta vasoconstritora a agonistas α1-adrenérgicos, tanto no que se refere à

pressão sanguínea quanto à distensibilidade venosa (AILHAUD et al, 2000; KIHARA

et al, 1998).

1

1.1 TECIDO ADIPOSO

Para garantir a sobrevivência em condições de escassez de nutrientes no meio

ambiente, os mamíferos desenvolveram a capacidade de estocar, pricipalmente como

lipídios, o excesso das calorias ingeridas, de modo a suprir a demanda energética

durante períodos de escassez alimentar. Além de poderem ser armazenados em

grandes quantidades por não precisarem de água como solvente, outra vantagem de

se estocar energia como lipídios é que a oxidação destes compostos fornece o dobro

de energia por unidade de massa, se comparados aos carboidratos e proteínas.

O tecido adiposo é o principal reservatório energético do organismo. Os

adipócitos são as únicas células especializadas no armazenamento de lipídeos na

forma de triacilglicerol (TAG) em seu citoplasma, sem que isto seja nocivo à sua

integridade funcional. O tecido adiposo tem papel crítico no balanço energético, pois

possui toda a maquinaria necessária para sintetizar ácidos graxos (lipogênese) e

estocá-los na forma de TAG em períodos onde a oferta de energia é abundante, e

para mobilizá-los (lipólise) quando há déficit calórico. A regulação desses processos

ocorre por meio de sinais nutricionais, neurais e humorais (AHIMA e FLIER, 2000).

1.2 METABOLISMO DO TECIDO ADIPOSO.

O conteúdo de gordura corporal é dependente do balanço entre a deposição de

gordura e sua mobilização. O processo de deposição de lipídios no tecido adiposo

depende da disponibilidade de ácidos graxos para esterificação a triacilgliceróis (TAG)

e posterior armazenamento na gotícula de gordura intracitoplasmática. A

disponibilidade de ácidos graxos, por sua vez, depende da síntese in situ (lipogênese)

e da captação dos ácidos graxos contidos nos triacilgliceróis presentes nas

lipoproteínas circulantes por ação da enzima lípase lipoprotéica (figura 1).

2

Acil-Coa

Glicose

Glicerol

Quilomicrons VLDL

AGL

Figura 1 Principais vias metabólicas do tecido adiposo. VLDL: lipoproteína de muita

baixa densidade; LPL: lipase lipoprotéica; CD36: transportador de AGL; ACS: acil-CoA

sintetase; IR: receptor de insulina; FDE 3B: fosdiesterase 3B; βAR: receptor β adrenérgico;

AC: adenilato ciclase; cAMP: adenosina monofosfato cíclico; PKA: proteína quinase A.

(Adaptado de SETHI, 2007)

O receptor nuclear ativado pelos proliferadores de peroxissomos gama (PPARγ)

pertence a grande família dos receptores nucleares, está fortemente expresso no

tecido adiposo. O PPARγ promove diferenciação dos adipócitos resultando em

aumento no número de células pequenas mais sensíveis a ação da insulina (OKUNO

et al,1998), em adipócitos maduros tem papel importante na homeostase da glicose e

lipídios através de efeitos coordenados sobre a transcrição gênica (SPIELGEMAN,

Glicose

Acetil-Coa AGL

Glicerol 3P

Lipogênese

TAG

FDE 3B

Glicerol

Lipólise AGL

AGL

3

1998; WALCZAK, 2002). Os receptores nucleares regulam a transcrição de genes

alvo, através da heterodimerização com o receptor retinóico X, esse complexo se liga

em sítios específicos do DNA, chamados elementos responsivos, uma vez ativados

esse complexo pode estimular ou inibir a expressão de genes alvo (GEARING et al,

1993). O PPARγ está envolvido na deposição de gordura nos adipócitos por regular

genes responsáveis pelo armazenamento de gordura como LPL, Acil-CoA sintetase,

ácido graxo translocase (CD 36), proteína transportadora de ácidos graxos (FATP)

(KERSTEN, 2002) e na proteína diretamente envolvida na captação de glicose como

o transportador de glicose dependente de insulina, GLUT 4 ( WU et al, 1998) . O

PPARγ regula positivamente a expressão da adiponectina (IWAKI et al, 2003), uma

adipocina secretada exclusivamente pelo tecido adiposo o qual está envolvida no

aumento da sensibilidade às ações da insulina (FASSHAUER et al, 2004).

A lipoproteína lipase é sintetizada nas células parenquimais dos tecidos adiposo,

muscular esquelético e cardíaco, e exportada para o sítio de ação nos capilares, onde

se liga às cadeias de proteoglicanas na superfície luminal do endotélio vascular

(KARPE et al, 1998). A enzima promove a hidrólise de TAG plasmáticos contidos em

lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL) provenientes da secreção hepática ou

dos quilomicra oriundos da dieta, produzindo AGL e glicerol (KARPE et al, 1998;

LADU et al, 1991). Os ácidos graxos atravessam a membrana plasmática através de

translocases de ácidos graxos (ABMURAD et al,1993), e uma vez no interior dos

adipócitos estes são esterificados com glicerol-3-fosfato e estocados como

triacilglicerol (FRAYN, 2002). A insulina é o principal hormônio envolvido na regulação

da deposição de gordura. Este hormônio, além de aumentar a expressão da LPL no

tecido adiposo (FRAYN, 2002), também aumenta a captação de glicose nas células

adiposas por aumento da translocação dos transportadores de glicose (GLUT4) para

a membrana celular além de ativar enzimas lipogênicas e glicolíticas (KERSTEN,

2001). Estudos de BOTION, 2001 demonstraram que a atividade de LPL

encontraram-se diminuída no tecido adiposo após jejum de 24h em ratos Wistar

enquanto que no estado absortivo a atividade da enzima esta aumentada em 36%,

4

demonstrando que a regulação da atividade da LPL também esta relacionada com o

estado nutricional do animal.

A mobilização lipídica (figura 1) refere-se às ações que resultam em hidrólise dos

TAG armazenados e na liberação dos ácidos graxos não esterificados (AGL) e do

glicerol, sendo a lipase hormônio sensível (HSL) a principal enzima de regulação

dessa via. Os produtos lipolíticos podem ser utilizados em outros tecidos como fonte

de energia durante o jejum ou em condições de grande demanda energética, como no

exercício físico. A ativação da lipólise ocorre através da ativação de receptores β-

adrenérgicos, que culmina em hidrólise dos triacilgliceróis enquanto que a ativação de

receptores α-adrenérgicos tem ação antilipolítica (LaFONTAN e BERLAN,1993). Em

humanos a adrenalina e noradrenalina (agonistas adrenérgicos) estimulam a lipólise

(maior razão entre receptores β/α) no tecido adiposo visceral, entretanto no tecido

adiposo subcutâneo a adrenalina inibe a lipólise (menor razão entre receptores β/ α)

(RICHELSEN et al, 1991).

O mecanismo lipolítico mais conhecido ocorre através de aumento da

concentração intracelular de AMPc. Neste mecanismo, os receptores são acoplados a

proteínas G estimulatória (GS), que quando ativada estimula a subunidade α (Gαs) a

qual ativa a adenilato ciclase que cataliza a síntese de AMPc a partir de ATP. O

resultado do aumento intracelular de AMPc leva a ativação de uma proteína kinase

dependente de cAMP (PKA) que por sua vez fosforila a HSL em resíduos de serina

tornando-a ativa (EGAN et al, 1992). A PKA também fosforila as perilipinas, proteínas

que envolvem a gota lipídica impedindo a hidrólise dos TAG. Uma vez fosforiladas, as

perilipinas se deslocam da superfície da gotícula de óleo, se dispersam no citosol e

abrem espaço para o acesso da LHS ao seu substrato (GREENBERG, 1990). A

insulina é um potente inibidor da lipólise do tecido adiposo devido a sua ação na

ativação da fosfodiesterase 3B. Uma vez ativa, essa enzima degrada o AMPc

diminuindo sua concentração intracelular e consequentemente impede a fosforilação

da HSL (DEGERMAN et al, 1997).

5

1.3 TECIDO ADIPOSO E SUA DINÂMICA

O tecido adiposo além da sua capacidade de armazenar e liberar energia

apresenta função mais abrangente. Por constituírem depósitos localizados em

diversas regiões do organismo envolvendo ou mesmo se infiltrando em órgãos e

estruturas internas, o tecido adiposo branco oferece proteção mecânica, permite

adequado deslizamento entre vísceras e feixes musculares, sem comprometer a

integridade e funcionalidade dos mesmos. Além disso, pela distribuição mais

abrangente, incluindo derme e tecido subcutâneo, e por ser um importante isolante

térmico, tem papel importante na manutenção da temperatura corporal. Estudos mais

recentes demonstram que o tecido adiposo é capaz de secretar substâncias com

efeitos biológicos importantes. Com a descoberta de uma ampla gama de proteínas

secretadas pelo tecido adiposo e denominadas adipocinas, um novo conceito sobre a

função biológica deste tecido vem surgindo, consolidando a idéia de este tecido não

ser apenas um armazenador e fornecedor de energia, mas sim, um órgão dinâmico

envolvido em uma variedade de processos metabólicos e fisiológicos.

As adipocinas agem como sinais endócrinos para regular a homeostase

energética, incluindo a autoregulação do crescimento e desenvolvimento do adipócito,

assim como a homeostasia do corpo todo. As adipocinas identificadas até o

momento, são altamente variadas e compreende proteínas relacionadas ao sistema

imune, como as citocinas clássicas - o fator de necrose tumoral-α (TNF- α) e

interleucina-6 (IL-6), fatores de crescimento (fator transformador do crescimento β –

TGF-β). Outras adipocinas estão envolvidas na angiogênese (fator de crescimento

endotelial vascular – VEGF), homeostase glicêmica (adiponectina, leptina),

homeostase vascular (inibidor do ativador de plasminogênio 1 – PAI-1) e na regulação

da pressão sangüínea (angiotensinogênio) (FRUHBECK et al, 2001)

6

1.4 SISTEMA RENINA ANGIOTENSINA Estudos recentes apontam o sistema renina-angiotensina (SRA) não apenas

como um controlador da pressão arterial e homeostasia cardiovascular, mas também

como um complexo sistema hormonal envolvido em diversas funções fisiológicas.

Os principais componentes do SRA são o angitensinogênio (globulina secretada

pelo fígado), a renina (enzima liberada pelo aparelho justaglomerular renal), a enzima

conversora de angiotensina (ECA) e a angiotensina II (ang II). Na visão clássica, o

sistema renina-angiotensina age endocrinamente, sendo que a renina cliva o

angiotensinogênio (AGT) em angiotensina I (um decapeptídeo inativo) a qual é

clivada em ang-II pela ECA (figura 2). Esta enzima está presente na superfície

vascular e tem como sua principal localização anatomorfofuncional o leito vascular

pulmonar (PEACH, 1977).

As ações da Ang II resultam da sua ligação aos receptores específicos AT1 e

AT2, usualmente mediando efeitos opostos (ERNSBERGER e KOLETSKY, 2006). O

receptor AT1 é expresso por todos os sistemas orgânicos que têm papel central no

controle da homeostasia da pressão sanguínea, incluindo sistema circulatório,

sistema nervoso e rins (SHANMUGAN e SANDBERG, 1996).

A ativação do receptor AT1 no sistema circulatório leva a uma potente

vasoconstricção (TIMMERMANS et al, 1993). Na zona glomerulosa da glândula

adrenal a ativação do AT1 promove liberação de aldosterona (AGUILERA, 1992) que

age no néfron promovendo a reabsorção de sódio (MASILAMANI et al, 1999). Os

receptores AT1 no cérebro estão ligados a regulação do apetite de sal, sede e no

controle da liberação de vasopressina (DAVISSON et al, 2000; MORRIS et al, 2002).

Nos rins a ativação do AT1 leva a vasoconstricção renal e aumento na reabsorção

tubular de sódio (ICHIKAWA e BRENNER, 1980; PETI-PETERDI et al, 2002).

7

Angiotensinogênio

Angiotensina I

Angiotensina-(1-9) Angiotensina II

Angiotensina-(1-7)

Angiotensina III

Angiotensina IV

Angiotensina-(1-5) Angiotensina-(1-4)

renina

ECA 2

ECA 2 NEP, PEP

ECA

ECA

ECA

ECA 2

NEP

Amp

Amp

Figura 2. Diagrama simplificado da cascata de formação e de degradação das

principais angiotensinas. Amp aminopeptidase; ECA enzima conversaora de angitensina;

ECA 2 enzima conversora de angiotensina 2; NEP endopeptidase neutra; PEP prolil-

endopeptidase. (adaptado de TIKELLIS, 2006)

8

Fisiologicamente, parece que o receptor AT2 age como um modulador de

programas biológicos complexos como desenvolvimento embrionário, diferenciação

celular, apoptose, regulação da função renal e pressão sangüínea (CAREY et al,

2000; UNGER, 1999). Um dos maiores efeitos da ativação do AT2 é ter ação de

proteção contra a estimulação acentuada do AT1, por exemplo, a regressão da

fibrose cardíaca e remodelação vascular evocado pelo AT2 se opõe aos efeitos

fibróticos da Ang II mediados pelo AT1 (WU et al, 2001; WU et al, 2002). Tem sido

relatado que os efeitos vasodilatadores da Ang II via AT2 se opõe ao efeito

vasoconstrictor da Ang II via AT1 (CAREY et al, 2000), a ativação do AT2 parece ter

efeito natriurético opondo-se ao efeito antinatriurético da ativação do AT1 (SIRAGY e

CAREY, 1999). Além disso, estudos de Munzenmaier e Greene (1996) demonstraram

que Ang II induz angiogênese através do AT1 e este efeito é tamponado pela ativação

do AT2.

Na última década muitos estudos têm contribuído para a mudança da visão

clássica do SRA, onde há apenas um único produto final ativo. De acordo com estes

estudos a Ang I, uma vez formada, pode ser processada gerando diversos produtos

biologicamente ativos (SANTOS et al, 2000). O processamento da Ang I ou Ang II por

endopeptidases forma o heptapeptídeo Ang-(1-7) (YAMAMOTO et al, 1992; TAN et al,

1993), sendo esse peptídeo um metabólito com ação biológica (FERRARIO e IYER,

1998).

Estudos de Santos (2003) identificaram que a Ang-(1-7) é um agonista

endógeno do receptor Mas acoplado à proteína G. O receptor Mas parece agir como

antagonista funcional do receptor AT1 e que a sinalização via receptor AT1 pode ser

regulada de maneira tecido-específico pelos níveis de expressão do Mas (KOSTENIS

et al, 2005). A Ang-(1-7) é capaz de ativar a óxido nítrico sintetase e assim

apresentam um efeito vasodilatador através da liberação de óxido nítrico (HEITSCH

et al, 2001) além de potencializar o efeito hipotensivo da bradicinina (ABBAS et

al,1997; PAULA et al, 1995). A infusão renal de Ang-(1-7) produz diurese e natriurese

9

em rins isolados (DELLIPIZZI et al, 1994) e intactos de ratos Wistar (HANDA et al,

1996) e em contraste a potente ação da Ang II, a Ang-(1-7) aumenta a taxa de

filtração glomerular (HANDA et al, 1996). No sistema nervoso central a Ang-(1-7)

modula a liberação de vasopressina (SCHIAVONE et al, 1988; SANTOS et al, 1996),

aldosterona, sem inibir o barorreflexo (CAMPAGNOLE-SANTOS et al, 1992). Estudos

de Roks (1999) demonstraram que a Ang-(1-7) é um antagonista das respostas

vasculares da Ang II em artérias humanas e um inibidor da ECA no plasma humano,

tecido caríaco e tecido vascular. Esses resultados ratificam o efeito antihipertensivo

da Ang-(1-7).

1.5 SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA NO METABOLISMO O SRA tem papel importante no controle metabólico uma vez que seus

componentes podem ser encontrados em muitos tecidos entre eles tecido adiposo e

pâncreas.

O pâncreas endócrino apresenta imunoreatividade para os receptores AT1 e

AT2, embora a distribuição dentro das ilhotas pancreáticas sejam diferentes,

enquanto que o receptor AT1 é encontrado em células que estão no centro das

ilhotas e são co-localizadas com as células β, o receptor AT2 é expresso nas células

que produzem somatostatina, que estão localizadas na periferia das ilhotas de

Langerhans (TIKELLIS et al, 2006). A regulação da perfusão das ilhotas é importante

na disponibilidade de glicose e subsequentemente regulando a secreção de insulina

bem como outros hormônios pancreáticos (JANSSON, 1994). Estudos de Carlsson

(1998) verificaram que animais expostos agudamente a Ang II têm uma menor

perfusão das ilhotas e apresentam uma menor liberação de insulina em resposta a

glicose.

A Ang II também tem papel importante na regulação da glicose plasmática uma

vez que este peptídeo é capaz de promover hiperglicemia de maneira dose-

10

dependente (MACHADO et al, 1995). O efeito hiperglicêmico da Ang II é mediado via

receptor AT1 (MACHADO et al, 1998) pode ser atribuído a uma ação direta na

produção hepática de glicose, pois estudos de Coimbra et al (1999) demonstraram

que a infusão de Ang II resulta na ativação rápida da gliconeogênese hepática

contribuindo para o aumento da glicose plasmática.

O acúmulo de gordura na região abdominal é o maior fator de risco no

desenvolvimento de doenças crônicas, tais como diabetes mellitus tipo 2 e doenças

cardiovasculares (SHARMA, 2006). Existem evidências que os componentes do

sistema renina-angiotensina estão aumentados na circulação de pessoas obesas

(UMEMURA et al, 1997) e que a perda de peso leva a uma redução da atividade

sistêmica do SRA (ENGELI et al, 2005). Estes dados indicam que a obesidade é

responsável pelo aumento da atividade sistêmica do SRA e sugere que componentes

do sistema renina-angiotensina que são expressos no tecido adiposo podem também

ser secretados para a circulação e exercer efeitos endócrinos (GOOSSENS et al,

2007).

Apesar de o fígado ser considerado o principal produtor de AGT (LYNCH e

PEACH, 1991), outros estudos mostram que adipócitos maduros expressam todos os

componentes do sistema renina-angiotensina, incluindo AGT, renina, ECA, Ang II,

receptores AT1 e AT2 (ENGELI et al, 2000; CAMPBELL e HABENER, 1987; CASSIS

et al, 1988). As linhagens clonais de preadipócitos 3T3-L1 e 3T3-F442A sintetizam e

secretam angiotensinogênio e esta produção encontra-se aumentada durante a

diferenciação de preadipócitos para adipócitos (SAYE et al, 1989; SAYE et al, 1990).

Estudos de Massiera (2001) realizados em camundongos transgênicos, que

superexpressam AGT, apresentam aumento de duas vezes na massa adiposa, de

22% no AGT plasmático e de 16% na pressão sistólica quando comparado ao

camundongo wild-tipe.

11

Aumento da expressão de angiotensinogênio na obesidade tem sido relatado em

alguns estudos. Adipócitos de ratos Zucker obesos (fa/fa) mostram um aumento no

conteúdo e secreção de angiotensinogênio durante o desenvolvimento da obesidade

(HAINAULT, 2002) A expressão de angiotensinogênio é maior no tecido adiposo

visceral humano quando comparado ao tecido adiposo subcutâneo (DUSSERRE et

al, 2000; GIACCHETTI et al, 2002). Strazzullo e Galletti (2004) sugerem que o tecido

adiposo, particularmente o tecido adiposo visceral, seja o responsável pelo aumento

de AGT circulante em indivíduos obesos. E esse aumento de angiotensinogênio

plasmático associado a maior atividade da renina e ECA plasmática tem grande

contribuição para a elevação da pressão arterial em indivíduos obesos

(STRAZZULLO e GALLETTI, 2004). A expressão específica pelos adipócitos, em

camundongos transgênicos, do gene AGT foi acompanhado por hipertrofia e

hiperplasia destas células (MASSIERA et al, 2001) sugerindo que a Ang II é um fator

trófico para os adipócitos.

Já está bem estabelecido que a angiotensina II (Ang II) age como fator de

crescimento em uma variedade de tecidos e células (SIL e SEM, 1997; MEFFERT et

al, 1996), e alguns estudos têm demonstrado a importância da Ang II no crescimento

e na diferenciação dos adipócitos (DARIMONT et al, 1994a). Na diferenciação de

preadipócitos, a prostaglandina I2 (PGI2) é uma potente e específica efetora da

diferenciação adipogênica (NEGREL et al, 1989). A secreção de PGI2 é induzida

quando adipócitos Ob 1771 são expostos à Ang II tanto in vitro (DARIMONT et al,

1994a; AXELROD et al, 1985) quanto in vivo no fluido intersticial de tecido adiposo de

ratos (DARIMONT et al, 1994b), O efeito adipogênico da PGI2 induzido pela Ang II foi

suprimido pela inibição da síntese da prostaglandina (DARIMONT et al, 1994a). Foi

verificado que a Ang II reduz o acúmulo de lipídios induzido pela insulina em

preadipócitos humanos (SCHLING and LÖFFLER, 2001) e aumenta a proliferação de

preadipócitos pela aceleração da fase G1 do ciclo celular (CRANDALL et al, 1999).

Estudos de JANKE (2002) demonstraram que a Ang II inibiu a diferenciação

adipogênica em cultura primária de preadipócitos humanos, e o bloqueio do receptor

12

AT1 aumentou marcadamente o acúmulo de lipídios e a diferenciação dessas células.

Resultados controversos na ação da Ang II na diferenciação e proliferação dos

adipócitos podem ser devido a diferenças de espécies e/ou diferenças entre as

linhagens celulares.

Poucos estudos têm relacionado o papel da Ang-(1-7) como contraregulador das

ações da Ang II no metabolismo do tecido adiposo. Estudos de Santos e

colaboradores (2007) demonstraram que camundongos knock-out para o receptor

Mas apresentam um aumento do tecido adiposo epididimal e retroperitoneal, menor

sensibilidade à insulina além de um quadro de dislipidemia, com aumento plasmático

de colesterol total, HDL (lipoproteína de alta densidade) e triacilgliceróis. Esses dados

sugerem que o eixo Ang-(1-7)/Mas possui um papel importante no controle do

metabolismo do tecido adiposo.

13

2.0 OBJETIVO

Tendo em vista a importância do sistema renina-angiotensina no metabolismo e

os poucos estudos disponíveis sobre a participação do eixo Ang-(1-7)/MAS neste

processo, o objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da deleção genética do

receptor Mas sobre o metabolismo do tecido adiposo.

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Avaliar no tecido adiposo a captação de glicose, atividade da enzima lipase

lipoprotéica, atividade lipogênica, e expressão genética do PPARγ e Acetil CoA

carboxilase .

- Quantificar as concentrações plasmáticas de triacilgliceróis, ácidos graxos e

glicerol.

- Avaliar a lipomobilização em adipócitos isolados, medir a massa da proteína

lipase hormônio sensível.

.

14

3.0 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Animais

Foram utilizados camundongos wild type FVB/N (WT) e camundongos FVB/N

knock-out para o receptor Mas (KO) (Walther et al, 1998), cujas matrizes foram

produzidas no Max-Delbrück-center for Molecular Medicine (Berlin-Buch, Germany).

Os animais tinham aproximadamente entre 8 e 10 semanas de idade. Os animais

foram mantidos em gaiolas coletivas (4 animais por gaiola) em ambiente com

controle de luz (12 horas de luz, das 7:00 às 19:00 h) e temperatura (25±2°C) com

livre acesso à água e ração.

Na noite anterior aos experimentos os animais foram mantidos em jejum de

12h, sendo que os experimentos foram realizados na parte da manhã. Os

camundongos sofreram eutanásia por exangüinação pela aorta abdominal após

anestesia intraperitoneal com quetamina/xilasina (70 e 5 mg/kg, respectivamente).

Após a eutanásia o tecido adiposo epididimal foi removido e utilizado imediatamente

ou congelado em nitrogênio líquido e conservado em freezer -80 °C até o momento

do uso. O sangue foi coletado em microtubos para obtenção de soro e armazenado

à -20°C para dosagens posteriores.

3.2. Metodologias 3.2.1 Isolamento dos adipócitos Após o sacrifício dos animais o tecido adiposo epididimal foi removido, picado

e incubado com colagenase por 45 minutos a 37°C, sob agitação contínua,

conforme descrito por Rodbell (1964). Ao término do período de incubação, as

células foram filtradas através de tela de nylon, lavadas três vezes com tampão

HEPES (pH 7,4) contendo 1% de albumina bovina livre de ácidos graxos. Os

15

adipócitos isolados foram ressuspensos em volume de 20 mL de tampão/grama de

tecido.

3.2.2 Lipólise Após o isolamentos as células adiposas foram incubadas por 1h em condições

basal (sem estímulo) ou estimulada com 0,1 mM isoproterenol (agonista β-

adrenérgico). O efeito antilipolítico da insulina foi determinado na presença de 25

ng/mL desse hormônio. A liberação de glicerol para o meio de incubação foi

utilizada como índice lipolítico. Ao término do período de incubação, uma alíquota

do infranadante foi removida, aquecida a 700 C para inativação de qualquer enzima

liberada pelas células e o teor de glicerol medido por kit enzimático KATAL (Belo

Horizonte, MG).

3.2.3 Captação de glicose Após isolamento, as células adiposas foram lavadas com tampão HEPES e

incubadas por 45 min em tubos contendo ou não insulina (50 ng/mL). Um tubo

contendo floretina foi adicionado ao teste, pois essa substância inibe a captação da

2-deoxi-[3H]glicose e permite a quantificação aproximada de background. A

captação da 2-deoxi-[3H]glicose foi utilizada para determinar a sensibilidade

insulínica sobre o processo de transporte de glicose (Botion, 1999). Para isso foi

adicionado aos tubos 50 µL de 2-deoxi-[3H] glicose (0,2 µCi) e as células incubadas

por mais 3 min. A 2-deoxi-[3H]glicose é transportada para dentro da célula através

dos mesmos transportadores da glicose (Hom, 1984; Kraegen, 1985), entretanto, a

sua metabolização não é completa. O transporte da glicose foi interrompido por

transferência de 300 µL da mistura de reação que foram adicionados a um

microtubo contendo 70-80 µL de óleo de silicone (d= 0,98). Os tubos foram

centrifugados imediatamente, por 60 segundos, e as células foram separadas do

meio de incubação pela camada oleosa. O tubo foi então cortado na fase

16

intermediária do óleo de silicone, e a parte do tubo contendo a camada de células

foi transferida para um frasco de cintilação contendo líquido de cintilação

(Biodegradable counting scintillant, Amersham, USA) para a contagem da

radioatividade captada pelos adipócitos. O cálculo do índice de captação de glicose

in vitro foi feito considerando-se a radioatividade da 2-deoxi-[3H]glicose nas células

e a concentração desse composto no meio de incubação.

3.2.4 Lipogênese in vitro

A atividade lipogênica do tecido adiposo foi quantificada utilizando a água

tritiada como marcador radioisótopo. A água tritiada é o marcador radioisótopo de

preferência para o estudo da atividade lipogênica. O trítio é incorporado durante o

processo de síntese de ácidos graxos em ligações estáveis C-H por meio da troca

do 3H com nucleotídeos de pirimidina reduzidos (NADPH), formados na via das

pentoses ou pela enzima málica.

Fragmentos de tecido adiposo epididimal (100 mg) foram incubados por 2

horas em tampão contendo água tritiada 3H2O. Ao término do período de incubação,

os tecidos foram homogeneizados em uma mistura de clorofórmio-metanol 2:1,

segundo o método de Folch e colaboradores (1957). Alíquotas da fase inferior

clorofórmica foram utilizadas para a medida da radioatividade incorporada em

lipídios totais através de espectroscopia de cintilação líquida (Beckman LS 7600).

A velocidade de síntese de ácidos graxos in vitro no tecido adiposo epididimal

foi calculada segundo as premissas de Windmuller e Spaeth, 1966. A formula é a

seguinte:

μmol de AG/2h = dpm de 3H incorporados em AG no TA x 109 x 1

dpm de 3H /átomo-g de H no meio x 13,3 x t2-t1

17

3.2.5 Medida da atividade da lípase lipoprotéica A lipase lipoprotéica (LPL) é uma glicoproteína, cujas características funcionais

mais importantes são: possuir um pH ótimo de ação alcalino (8,0 – 8,5), ser inibida

por NaCl 1M e requerer um cofator específico para manifestar sua atividade, a

apolipoproteína C-II. O ensaio da atividade enzimática da LPL baseia-se no método

de Nilsson-Ehle e Schotz (1976) e fundamenta-se na reação:

TAG (glicerol tri-3H- oleato) glicerol + 3H- oleato L PL

Os ácidos graxos liberados (3H- oleato) foram separados pela utilização de um

sistema de partição líquido-líquido e uma alíquota dos AGL situados na fase

superior polar, é removida para a determinação da radioatividade correspondente. O

índice de hidrólise é diretamente proporcional à atividade da enzima.

Para a medida da atividade da LPL, fragmentos do tecido adiposo epididimal

foram homogeneizados em tampão Tris-HCL (pH 8,3) contendo detergentes,

centrifugados a 2500 rpm por 15 minutos e a camada intermediária, abaixo da

camada gordurosa, foi utilizada para a medida da atividade enzimática.

A emulsão-substrato foi preparada com trioleína fria e [9,10-3H]trioleato e

estabilizada com lecitina. Os lipídios foram sonicados com glicerol a 4 0C durante 5

min. Esta emulsão é estável por cerca 2 meses no escuro.

No dia do experimento foi preparada a mistura de reação, contendo 2 partes de

tampão LPL (Tris 0,2M, pH 8,3; contendo 6 % de albumina bovina livre de ácidos

graxos e cloreto de sódio 0,15M), 2 partes de emulsão-substrato e 1 parte de soro

de rato em jejum por 24 horas como fonte de Apo-CII. A mistura de reação foi

agitada em vortex e 100 μL adicionados em todos os tubos. A reação iniciou-se pela

adição de 10 μL do homogenado que foi então incubado sob agitação por 45

18

minutos a 37oC. Ao final do período de incubação adicionou-se inicialmente 3,25 mL

da mistura de extração clorofórmio-heptana-metanol, 1,25:1,1:1,41 (BELFRAGE &

VAUGHAN, 1969) e em seguida 1,05 ml de tampão carbonato-borato 0,1M pH 10,5,

sob agitação em vortex. Os tubos de ensaio foram centrifugados à temperatura

ambiente por 10 minutos e uma alíquota de 1,0 mL da fase aquosa superior foi

colocada em 4 ml de coquetel de cintilação (tolueno-triton-PPO-POPOP) e a

radioatividade quantificada por espectroscopia de cintilação líquida (Beckman LS

7600).

3.2.6 Análise semi-quantitativa da enzima lípase hormônio sensível no

tecido adiposo por Western Blot Fragmentos de tecido adiposo foram homogeneizados em tampão de lise

contendo inibidores de proteases e posteriormente centrifugados (2500 rpm, 20 min,

4°C) para remoção do infranadante. As proteínas contidas no infranadante foram

quantificadas através do método de Bradford (1976).

A eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS) foi

realizada de acordo com método de Laemmli (1970). As amostras (30 µg de

proteína) foram aquecidas a 95°C por 5 min antes de serem aplicadas em gel de

poliacrilamida 8%. Na lateral do gel foi aplicado um padrão de peso molecular (20-

200 kDa), sendo que a HSL tem um peso molecular de, aproximadamente, 84 kDa.

A eletroforese foi realizada numa cuba de acrílico, contendo tampão de corrida

(Tris-HCl 25mM, SDS 0,1%), sob a voltagem de 100 Volts, por 2h. As proteínas

foram transferidas eletroforeticamente para as membranas de nitrocelulose sob

voltagem de 100 volts, por 1,5 h. Em seguida as membranas foram bloqueadas para

as ligações inespecíficas com tampão contendo leite desnatado a 5% em TBS-T 1x

e 0.05% TWEEN por 1 hora. Após, as membranas foram incubadas com anticorpo

primário para a enzima HSL durante a noite. As membranas foram lavadas

novamente e incubadas com anticorpo secundário por 1 hora. Posteriormente foi

19

realizada a revelação por quimiluminescência utilizando ECL plus (Amersham).

Após a identificação das bandas referentes à proteína HSL, foi feito, na mesma

membrana, a identificação das bandas referentes a β-actina, que foi utilizada como

controle endógeno. Para isso, foi feito o “stripping” da membrana que consiste na

retirada dos anticorpos da superfície da mesma e a incubação por 1h com anticorpo

primário para a proteína β-actina. As membranas foram então lavadas com TBS-T

1x e incubadas com anticorpo secundário (anti-mice) por 1h e após, lavadas

novamente. Posteriormente, foi realizada a revelação quimioluminescente utilizando

ECL plus (Amersham).

As bandas imuno-reativas foram quantificadas por densitrometria no programa

Image J quant, da National Institute of Health, USA. Os resultados foram expressos

a partir da relação HSL/β-actina em unidades de densidade relativas.

3.2.7 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR RT) 3.2.7.1 Extração do RNA total A extração do RNA total foi realizada utilizando o método “guanidino-

isotiocianato-fenol-clorafórmio” Os fragmentos de tecido adiposo foram

homogeneizados em tubos plásticos contendo o reagente TRIzol ® (0,1 g de

tecido/1,0 mL do reagente TRIzol ®; Invitrogen laboratories, USA). Os recipientes de

plástico contendo o homogenato foram incubados a temperatura ambiente por 10

minutos, em seguida adicionou-se 0,2 mL de clorofórmio. Os tubos foram

vigorosamente agitados e deixados em repouso por 5 minutos a 4 °C, sendo, em

seguida, centrifugados a 12.000 rpm durante 15 minutos. A fase aquosa foi

transferida para microtubos, com subseqüente adição de 0,5 mL de isopropanol. A

mistura foi levemente agitada e mantida em repouso a 4°C por 10 minutos. Nova

precipitação foi realizada a 12.000rpm/10min/ 4°C. O sobrenadante foi descartado e

20

o pellet resultante foi ressuspendido em 1 mL de etanol gelado 70 % (solução

manufaturada em água tratada com dietil-pirocarbonato – DEPC), agitando-se

novamente. O sobrenadante foi vertido e os tubos com as amostras foram mantidos

a temperatura ambiente até a secagem das mesmas. O RNA foi novamente

ressuspendido em 0,05 mL de água DEPC.

3.2.7.2 Eliminação de moléculas de DNA genômico de amostra de RNA total.

Para eliminação de uma possível contaminação com DNA genômico nas

amostras de RNA total, utilizou-se a enzima desoxiribonuclease I (GibcoBRL®). O

tratamento foi feito de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante.

3.2.7.3 Quantificação do RNA total

As amostras de RNA total foram diluídas 50X e a concentração de RNA total

foram determinadas pela leitura da densidade óptica em comprimento de onda de

260nm (HITACHI ® UV 160 A). A concentração do nucleotídeo foi expressa em

µg/mL dada através da equação:

[ RNA total ] = Absorbância x 40 x Fator de diluição

3.2.7.4 Transcrição reversa

O RNA total foi utilizado para a síntese de DNA complementar (DNAc).

Resumidamente, a 1 µg de RNA total foram adicionados: 0,2 µg de

hexadeodinucleotídeos e tampão para RT (Tris-HCl 45mM pH 8,5; MgCl2 50mM;

DTT 15mM; dNTPs 1,8 mM e 150 UI de transcriptase reversa – reagente

provenientes da empresa Promega® Corporation, USA). O DNAc foi sintetizado em

21

termociclizador durante um período de 60 minutos de incubação a 37°C. A reação

foi interrompida pelo aquecimento a 90 °C por 5 minutos. O DNAc foi armazenado à

– 20°C.

3.2.7.5 PCR Semi – Quantitativo As reações de PCR quantitativo foram feitas utilizando primers (tabela 1)

específicos para o DNAc dos genes de interesse. A análise dos pares de base foi

executada através do programa BLASTN e sintetizada pela Invitrogen® . Os primers

do gne utilizado para controle endógeno foram de HPRT.

O DNAc obtido da etapa de RT (2 µl ) foi utilizado como fita molde para a

amplificação por PCR. As reações de PCR tiveram volume final de 20 µl e foram

feitas em duplicatas, utilizando 19 µl do Master mix de SYBR Green (Apllied

Biosystem), e 2 µl de cada primer (senso e anti-senso) na concentração de 1 nm/µl

e 2 µl de DNAc. O aparelho para reação foi o ABI Prism 7000 (Apllied Biosystem,

USA), sendo realizados 40 ciclos em temperatura de anelameto de 60 °C

Tabela 1. Primers para o DNAc dos genes de interesse

Primers Seqüência

ACC for CGG CTT GCA CCT AGT AAA AC

ACC rev AAT CCA CTC GAA GAC CAC TG

PPARγ for AGA TCA TCT ACA CCA TGC TGG CCT

PPARγ rev AGG AAC TCC CTG GTC ATG AAT CCT

HPRT for GTT GGA TAC AGG CCA GAC TTT GTT

HPRT rev GAT TCA ACT TGC GCT CAT CTT AGG C

22

A análise da expressão dos genes foi semi-quantitativa (método delta delta CT)

segundo modelo matemático desenvolvido por Ptaffl, 2001. O valor de CT (threshold

cycle) representa o momento da reação de PCR em que a florescência de

determinada amostra é detectada acima do ruído de fundo (background). O resultado

foi expresso em unidades arbitrárias. O modelo matemático utilizado para obtenção

das unidades arbitrárias para essa análise foi:

1- Subtração do valor de CT dos genes estudados pelo CT do HPRT (ΔCT);

2 - média do ΔCT das amostras;

3 - ΔCT de cada amostra – a média do ΔCT (ΔΔCT);

4 - elevação negativa do ΔΔCT na base 2 = 2- ΔΔCT .

3.2.8 DOSAGENS BIOQUÍMICAS A concentração de ácidos graxos plasmáticos foi quantificada por método

enzimático utilizando kit comercial da WAKO (Pure Chemical Industries, Japan). O

glicerol e o triacilglicerol plasmático foram quantificados através do kit enzimático

KATAL (Belo Horizonte, MG).

3.2.9 ANÁLISE DOS DADOS Para análise dos dados foi utilizado o teste estatístico ANOVA one way

seguida de Newman-Keuls. Para comparação entre dois grupos foi utilizado teste “t

de Student”. O nível de significância adotado foi de p<0,05. Os cálculos e análises

estatísticas foram realizados utilizando-se o programa Graph Pad Prism 4.0 (San

Diego, CA, USA)

23

4.0 RESULTADOS

4.1 Biometria e Dosagens séricas Os resultados apresentados na tabela 2 mostram que os animais com deleção

do receptor MAS produziu um ligeiro aumento do peso corporal e do tecido adiposo

epidimal (TAE) quando comparado ao grupo controle WT. Os dados também mostram

um aumento 39 % e de 66% nas concentrações séricas de ácidos graxos e de

triacilglicerol, respectivamente. Não foram observadas diferenças nas concentrações

séricas de glicerol.

Tabela 2. Pesos corporal e do tecido adiposo epididimal e parâmetros

plasmáticos de camundongos com deleção do receptor MAS.

WT KO

Peso corporal (g) 24±0,40 (23) 25±0,47 (23)

TAE (g/ 100g de PC) 1,39±0,09 (23) 1,89±0,08 (23) *

AGL (mmol/L) 1,12±0,05 (5) 1,56±0,15 (5)*

Glicerol (mmol/L) 0,34±0,03 (5) 0,31±0,03 (5)

TAG (mmol/L) 1,05±0,15 (4) 1,75±0,14 (4)*

Os valores apresentam a média ± erro padrão. O número de animais utilizados

encontra-se entre parênteses. *p<0,05 vs WT.

24

4.2 Atividade lipolítica e western blot para HSL do tecido adiposo epididimal

A figura 3 mostra a atividade lipolítica do tecido adiposo epidimal, e conforme

pode ser observado, a lipólise basal foi semelhante entre os dois grupos de animais

(0,61±0,09 mM WTb vs 0,58±0,07 mM KOb). No que se refere à lipólise estimulada

com isoproterenol (agonista β-adrenérgico não específico), o efeito desse agonista foi

semelhante nos dois grupos (2,10 ±0,14 mM WTiso vs 1,77±0,10 mM KOiso).

A insulina reduziu em 41% a atividade lipolítica de adipócitos estimulados pelo

isoproterenol no grupo wild type (2,10 ±0,14 mM WTiso vs 1,23±0,17 mM WT

iso+ins), enquanto que nenhum efeito antilopolítico da insulina foi observado no grupo

KO (1,77±0,10 mM KOiso vs 1,70±0,10 mM KOins).

WTb WTiso WTins KOb KOiso KOins0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 **

**

Glic

erol

(mM

)

Figura 3 Atividade lipolítica de adipócitos isolados do tecido adiposo epidimal em

condições basal (b) e estimulada por 0,1 μM isoproterenol (iso), e efeito antilipolítico

de 25 ng/mL de insulina (ins). As barras representam à média ± erro padrão, n = 6,

*p<0,05 vs respectivo basal; **p<0,05 vs WTiso.

25

A massa da enzima HSL foi semelhante nos grupos (0,98±0,05 unidade de

densidade relativa WT vs 1,09±0,04 unidade de densidade relativa KO), conforme

pode ser observado na figura 4.

A

WILD-TYPE KNOCK-OUT

HSL

β-actina

B

WT KO

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

HSL

/ β-a

ctin

a (u

nida

des

de d

ensi

dade

rel

ativ

a)

Figura 4 (A) Autoradiograma representativo de western blot para proteínas HSL e β-actina.

(B) Análise semi-quantitativa do conteúdo protéico da enzima HSL. Os resultados foram

expressos, a partir da relação HSL/β-actina, em unidades de densidde relativa. As barras

representam à média ± erro padrão, n = 3-4

26

4.3 Atividade da enzima lipase lipoprotéica em tecido adiposo A lipase lipoprotéica no tecido adiposo é responsável pela hidrólise de

triacilgliceróis presente nas lipoproteínas circulantes, e os ácidos graxos resultantes

dessa hidrólise são captados e armazenados nesse tecido. Os dados obtidos em

nosso experimento (figura 5) mostraram que a atividade dessa enzima encontra-se

aumentada 2,4 vezes no tecido adiposo dos animais KO em relação ao tecido

adiposo do grupo WT (0,07±0,01 mU WT vs 0,17±0,02 mU KO, p<0,05).

WT KO0.0

0.1

0.2 *

mU

Figura 5 Atividade da enzima LPL (mU) no tecido adiposo epidimal. As barras representam à

média ± erro padrão, n = 4-5.*p<0,05.

27

4.4 Lipogênese in vitro do tecido adiposo epidimal A atividade lipogênica refere-se à síntese de novo de ácidos graxos, para

posterior armazenamento como TAG dentro do adipócito. A figura 6 monstra que a

lipogênese basal (9,64±1,00 µmolAG/g TAE/2h WTb vs 12,25±2,08 µmolAG/g TAE/2h

KOb) foi igual entre os grupos. A insulina aumentou a atividade lipogênica tanto no

grupo WT quanto no KO, entretanto esse aumento não foi diferente (20,19±2,08 µmol

AG/g TAE/2h WTins vs 22,5±2,02 µmol AG/g TAE/2h KOins).

μ mol

AG /g

TAE

/2h

WT b WT ins KO b KO ins0

5

10

15

20

25 * *

Figura 6 Atividade lipogênica in vitro do tecido adiposo epidimal em condições basal (b) ou

estimulada por 100 ng/mL de insulina (ins). As barras representam à média ± erro padrão, n =

7. *p<0,001.

28

4.5 Expressão gênica por Real Time PCR. Foi avaliado a expressão do RNAm para o receptor nuclear ativado pelos

proliferadores de peroxissomos gama (PPARγ), que esta diretamente envolvido no

processo de deposição lipídica. Também foi avaliado a expressão RNAm para as

enzimas: Acetil-CoA carboxilase (ACC), enzima envolvida na formação de ácidos

graxos.

A figura 7A demonstra que a expressão do PPARγ no tecido adiposo está

reduzida em 66% nos animais KO em relação aos animais WT (1,80±0,08 UA WT vs

0,60±0,03 UA KO, p<0,05). A expressão para a enzima ACC (1,00± 0,17 UA WT vs

0,87±0,14 UA KO) não foi diferente entre os dois grupos como mostra a figura 7B.

WT KO 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

*

A

Uni

dade

s ar

bitr

ária

s

WT KO0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 B

Uni

dade

s ar

bitr

ária

s

Figura 7 Expressão do RNAm para PPARγ (A) e ACC (B) no tecido adiposo epidimal. As

barras representam à média ± erro padrão, n = 3, *p<0,05.

29

4.6. Captação de glicose por adipócitos do tecido adiposo epidimal.

Conforme demonstrado na figura 8, a captação de glicose no estado basal (sem

estímulo) foi igual nos dois grupos de animais (0,26±0,02 mmol/3min WTb vs

0,20±0,03 mmol/3min KOb). No que se refere à captação estimulada pela insulina,

observou-se um aumento do transporte de glicose nos dois grupos de animais.

Entretanto, os adipócitos dos animais KO apresentaram uma captação de glicose

estimulada pela insulina 39% menor em relação aos adipócitos dos animais WT

(0,46±0,06 mmol/3min KOin vs 0,75±0,07 mmol/3min WTin, p<0,05).

WTb WTin KOb KOin0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9 **

***

capt

ação

de

2-de

oxig

licos

e(m

mol

/3m

im)

Figura 8 Captação de glicose por adipócitos isolados do tecido adiposo epididimal As barras

representam à média ± erro padrão, n=5. b basal: in insulina (50ng/mL). ** p <0,05 in vs b, *

p< 0,05 vs WTin.

30

5.0 DISCUSSÃO Estudos recentes sugerem que o aumento da massa adiposa visceral está

intimamente relacionado com a hipertensão e diabetes, e enfatizam que os fatores

derivados dos adipócitos podem contribuir para o desenvolvimento dessas doenças

(CASSIS, 2000). Tem sido relatado na literatura que o sistema renina-angiotensina

está presente no tecido adiposo e parece ter um papel importante no

desenvolvimento da hipertensão e resistência insulínica associada à obesidade.

Em nosso estudo foi demonstrado que os animais knock-out para o receptor

MAS apresentam um pequeno aumento de peso corporal e de massa adiposa

epididimal, os quais não podem ser atribuídos ao aumento da ingestão alimentar, uma

vez que os estudos de Santos e colaboradores (2007) mostraram que esses animais

apresentam ingestão alimentar semelhante à do grupo controle (wild type), sugerindo,

portanto,que o aumento da massa do tecido adiposo deve-se, provavelmente, a um

desequilíbrio metabólico.Os estudos de CASSIS (1998) demonstram que a infusão

crônica de Ang II em ratos Sprague-Dawley promove perda de peso e redução na

massa de tecido adiposo branco. Por outro lado, estudos realizados em ratos e em

humanos têm relacionado à perda de peso com a administração de inibidores da

enzima conversora de angiotensina (McGRATH et al, 1990; CAMPBELL et al, 1995).

Estudos de ENGELI et al, (2005) demonstram, em humanos, que a perda de peso foi

acompanhada pela diminuição da atividade do SRA, sugerindo que o aumento do

tecido adiposo é responsável pelo aumento da atividade sistêmica do sistema renina-

angiotensina.

O presente estudo demonstrou que animais com deleção genética para o

receptor MAS (KO) apresentam um aumento na concentração sérica de ácidos

graxos livres (AGLs), embora a concentração de glicerol tenha sido semelhante nos

dois grupos. O aumento de AGLs pode levar a um distúrbio no metabolismo de

31

glicose e insulina no fígado, músculo e tecido adiposo podendo contribuir para a

resistência à insulina (SALEH et al, 1999). A elevação na concentração plasmática

de AGLs é principalmente decorrente : 1) de uma atividade lipolítica aumentada; 2)

menor re-esterificação dos AGLS em TAG; 3) redução da utilização periférica e/ou

oxidação.

Apesar da atividade lipolítica in vitro basal e estimulada pelo isoproterenol ser

semelhantes nos dois grupos, o efeito antilipolítico da insulina foi menor no grupo KO,

o que poderia contribuir para o aumento da concentração sérica de AG nestes

animais. Os estudos de Santos e cols (2007), mostram que os animais com deleção

genética para o receptor MAS possuem menor sensibilidade insulínica quando

comparados aos controles, o que está de acordo com os resultados apresentados no

presente estudo. EGAN e colaboradores (1996) relataram que o estado de resistência

à insulina na obesidade é tipicamente caracterizado pelo reduzido efeito antilipolítico

da insulina, particularmente em pessoas com obesidade visceral (LARGE & ARNER,

1998).

Estudos de English and Cassis (1999) mostram que a Ang II estimula a liberação

de noradrenalina dos terminais neuronais simpáticos, esse efeito poderia estar

exacerbado nos animais KO, pois não há atividade contrarreguladora da ANG- (1-7),

e com isso aumentar a taxa lipolítica nesses animais. Estudos recentes têm

demonstrado que a Ang II tem ação no metabolismo do tecido adiposo. Boschmann e

colaboradores (2001) demonstraram que a perfusão do tecido adiposo branco com

Ang II mais isoproterenol potencializava a lipólise. Estudos de Ferreira (2004)

demonstrou que a infusão de Ang II promove um aumento de AGL plasmático e que o

bloqueador β-adrenérgico propanolol bloqueou a mobilização de AG promovido pela

Ang II. Entretanto estudos de TOWSEND (2001) mostram que infusão de

angiotensina II e que tratamento com enalapril (inibidor da enzima conversora de

angiotensina) não altera a taxa lipolítica basal em humanos.

32

No que se refere ao conteúdo da proteína HSL, não foram observadas

diferenças entre os grupos. Diante disso, nos parece razoável supor que a redução da

sensibilidade insulínica dos adipócitos poderia estar comprometendo a fosforilação da

enzima. Este comprometimento acarreta em uma menor translocação da enzima para

a gota lipídica levando a uma inibição da hidrólise dos TAG armazenados nos

adipócitos.

A lipase lipoprotéica (LPL) tem papel fundamental no clearance plasmático de

lipídios, uma vez que age como passo limitante na hidrólise de TAG presentes nos

quilomicra e VLDL circulante. A atividade da LPL está cronicamente aumentada no

tecido adiposo de humanos obesos (ECKEL, 1989) e de modelos de obesidade

animal, como ratos Zucker (LOPEZ-SORIANO et al, 1991), enquanto que a LPL no

músculo está inalterada ou diminuída em resposta a moduladores como a insulina

(HARTMAN, 1981; YOST et al, 1995). Alterações na atividade tecido-específico da

LPL pode constituir adaptações metabólicas canalizando lipídios para

armazenamento em detrimento da oxidação.

No presente estudo verificamos que a atividade da LPL está aumentada no

grupo que apresenta ausência do receptor Mas, disponibilizando AGLs para ser

captados pelo tecido adiposo. Os animais knock-out para o receptor MAS apresentam

disfunções metabólicas semelhantes aos animais Zucker obesos estudados por

Boivin and Deshaies (2000), que apresentam uma maior atividade da LPL no tecido

adiposo branco durante o jejum, além de aumento na concentração triacilglicerol,

AGLs e insulina, pois estudos de Santos e colaboradores (2007) demonstraram que

os animais com deficiência para o receptor MAS apresentam maior nível plasmático

de insulina.

O maior fornecimento de AGLs, via LPL, favorece uma captação aumentada

pelo tecido adiposo, facilitando assim o armazenamento de TAG. Entretanto em

nosso estudo observamos que apesar de uma maior atividade da LPL com

33

subseqüente disponibilidade da AGLs, tanto a lipogênese basal quanto a estimulada

pela insulina foram semelhante entre os grupos. A expressão da acetil-CoA

carboxilase, enzima responsável pela formação de malonil-CoA, primeiro composto

da formação da cadeia de ácidos graxos, também não apresenta diferença entre os

grupos.

O desenvolvimento celular associado com o crescimento do tecido adiposo

envolve hipertrofia celular (aumento no tamanho celular) e/ou hiperplasia. Hipertrofia

é resultado do excesso de acúmulo de TAG nos adipócitos resultante de um balanço

energético positivo (a energia ingerida é maior que o dispêndio energético). A

hiperplasia, também chamada de adipogênese, é resultado do recrutamento de novos

adipócitos a partir de precursores celulares existentes no tecido adiposo. O maior

processo envolvido na adipogênese é a proliferação de uma população de células

tronco e sua diferenciação em adipócitos maduros. Apesar dos animais knock-out

apresentarem um aumento na massa do tecido adiposo epididimal, esse fato não se

deve ao maior acúmulo de TAG nos adipócitos já que a lipogênese foi semelhante

nos dois grupos, e nos estudos de SANTOS e colaboradores (2007) não foi

evidenciada hipertrofia nos adipócitos dos animais knock-out para o receptor MAS.

Entretanto, podemos sugerir que pode haver uma falha na captação dos AGLs para o

interior dos adipócitos ou falta de glicerol para a re-esterificação dos AGLs em

triacilglicerol.

A entrada de ácidos graxos para o interior da célula adiposa é dependente de

translocases de ácidos graxos (CD36), que são encontradas em abundância nos

tecidos periféricos responsáveis pela metabolização de ácidos graxos livres, como

tecido adiposo, músculo esquelético e músculo cardíaco (ABMURAD et al, 1993).

Yang (2007) demonstrou que a expressão de CD36 aumenta durante a diferenciação

de adipócitos e que a insulina aumenta de maneira dose-dependente a expressão do

RNAm de CD36 o que consequentemente leva a um aumento na captação de AGLs

pelos tecidos insulino-dependentes. A maior atividade enzimática da LPL com

34

aumento na disponibilidade de AGLSs, sem alteração na lipogênese nos leva a

sugerir que pode haver uma deficiência na captação desses ácidos graxos pelo

adipócitos talvez por uma menor ação da insulina na expressão de CD36 nos

adipócitos dos animais knock-out.

Conforme já referido na INTRODUÇÃO, o receptor nuclear gama ativado pelos

proliferadores de peroxissomos (PPARγ) pertence à grande família dos receptores

nucleares, e é expresso predominantemente no tecido adiposo. No presente estudo

os animais com ausência do receptor MAS apresentaram uma redução na expressão

do RNAm para o PPARγ do tecido adiposo epididimal, o que pode estar relacionado a

uma menor expressão da CD36 e com isso uma menor captação de AGLs pelos

adipócitos contribuindo para o aumento de ácidos graxos plasmáticos. Estudos de

BARROSO et al (1999) relataram que pacientes com mutação no gene do PPARγ

padecem de severa resistência insulínica sugerindo que expressão do PPARγ pode

estar diminuída no estado de resistência à insulina. A menor expressão do PPARγ

contribui para a menor expressão de adiponectina encontrado nos animais knock-out

(SANTOS et al, 2007) levando a uma menor sensibilidade à insulina nos adipócitos.

Todos os componentes do sistema renina-angiotensina são expressos no tecido

adiposo e estão implicados na formação de novas células adiposas por mecanismos

parácrinos/autócrinos (DARIMONT et al, 1994a). Estudos de SAFANOVA (1997)

demonstram que tratamento de preadipócitos com ácidos graxos induz a expressão

de angiotensinogênio durante a diferenciação e essa indução é dependente da

continua presença de ácidos graxos. Em nosso estudo foi demonstrado que houve

um aumento na massa do tecido adiposo que pode ser decorrente de uma maior

diferenciação celular. O aumento da disponibilidade de AGL, através do efeito

antilipolítico da insulina e da maior atividade da LPL, nos animais KO, pode levar a

um aumento na expressão de angiotensinogênio e consequentemente um aumento

na síntese de angiotensina II que em pré adipócitos estimula a expressão e atividade

35

de marcadores da formação de adipócitos (glicerol 3 fosfato dehidrogenase e ácido

graxo sintetase) (SAINT-MARC et al, 2001).

O passo limitante na captação e metabolismo de glicose mediado pela insulina é

o transporte de glicose para o interior das células-alvo. Esse transporte no músculo e

tecido adiposo é mediado por transportadores específicos de glicose, a isoforma

GLUT-4. Em nosso estudo a captação de glicose nos adipócitos foi semelhante entre

os grupos KO e WT na condição basal, mas a captação de glicose máxima em

resposta á insulina foi menor no grupo KO. Dados de Santos e colaboradores (2007)

verificaram que quantidade de GLUT 4 esta menor nos animais com deleção genética

no receptor MAS o que certifica a menor captação de glicose pelos adipócitos nesses

animais.

Tem sido relatado que ANG II está envolvida no desenvolvimento de hipertensão

e resistência insulínica, sugerindo haver um crosstalk entre a sinalização de insulina e

angiotensina II. Estudos de VELLOSO e colaboradores (1996) demonstraram que a

angiotensina II (Ang II) diminui a fosforilação do substrato do receptor de insulina 1

(IRS-1) e diminui sua ancoragem com fosfatidil inositol 3 (PI-3) kinase em músculo

liso vascular. A Ang II aumenta a fosforilação de resíduos de serina do receptor de

insulina, IRS-1, PI-3 kinase (FOLLI et al, 1997), juntos, estes resultados demonstram

que a Ang II diminui a sinalização do receptor de insulina, se isso for verdadeiro para

células adiposas podemos explicar a menor ação da insulina observada em nossos

resultados. Por outro lado, estudos de GIANI et al (2007) verificaram que a

angiotensina-(1-7) estimula a fosforilação da JAK 2 e IRS-1 em coração de ratos e

esse efeito foi bloqueado na presença de losartan (antagonista do receptor AT1). Em

contraste à ANG II, a ANG-(1-7) estimula a fosforilação da Akt cardíaca e esta

estimulação foi diminuída na presença do antagonista do receptor MAS, A-779. Se

esses dados também forem verdadeiros para a célula adiposa podemos concluir que

a ANG-(1-7) pode ser um modulador positivo da à ação da insulina e que o balanço

36

entre a ANG II e ANG-(1-7) pode ser relevante no desenvolvimento da resistência

insulínica.

Considerando o papel oposto da angiotensina-(1-7) dentro do sistema renina-

angiotensina, a ausência do eixo Ang-(1-7)/MAS parece ter papel importante no

metabolismo do tecido adiposo, uma vez que o tecido adiposo desses animais

apresentam uma menor sensibilidade a ações da insulina. Essa menor ação da

insulina pode ser devido a uma exacerbação da ação da Ang II pela falta da

contrarregulação da angiotensina-(1-7), via receptor MAS, no tecido adiposo

epididimal.

37

6.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABBAS A, GORELIK G, CARBINI LA, SCICLI AG. 1997 Angiotensin-(1-7) induces bradykinin-mediated hypotensive responses in anesthetized rats. Hipertension 30:217-21. ABUMRAD NA, EL-MAGHRABI MR, AMRI, EZ, LOPEZ E, GRIMALDI PA. 1993 Cloning of a rat adipocyte membrane protein implicated or transport of long-chain fatty acids that is induced during preadipocyte differentiation. Homology with human CD36. J. Biol. Chem. 268: 17665-17668. AGUILERA G. 1992 role of angiotensina II stimulates sutypes an the regulation of aldosterone secretion in the adrenal glomerulosa zone in the rat. Mol Cell Endocrinol. 106:52-60. AILHUAD G, FUKAMIZU A, MASSIERA F, NEGREL R, SAINT-MARC P, TEBOUL M. 2000 Angiotensinogen, angiotensin II and adipose tissue development. Int J Obes Relat Metab Disord. 24 Suppl 4:S33-5 AXELROD L, MINNICH AK, RYAN CA. 1985 Stimulation of prostacyclin production in isolated rat adipocytes by ang II, vasopressin and bradykinin: evidence for 2 separate mechanisms of proataglandin synthesis. Endocrinology 116:2548-2553. BARROSO I, GURNELL M, CROWLEY VE, et al. 1999 Dominant negative mutations in human PPARgamma associated with severe insulin resistance, diabetes mellitus and hypertension. Nature 402:880-883. BELFRAGE P, VAUGHAN M. Simple liquid-liquid partition system for isolation of labeled oleic acid from mixtures with glycerides. J Lipid Res. 1969;10:341-344. BJÖRNTORP P. 1984 Hazards in subgroups in human obesity. Eur J Invest 14:239-241. BOIVIN A, DESHAIES Y. 2000 Contribution of hyperinsulinemia to modulation of lipoprotein lipase activity in the obese Zucker rat. Metabolism 49(1) 134-140. BOLINDER J, KAGER L, ÖSTMAN J, ARNER P. 1983 Differences at the receptor and postreceptor levels between human omental and subcutaneous adipose tissue in the action of insulin on lipolysis. Diabetes 32: 117-123. BOSCHMANN M, RINGEL J, KLAUS S, SHARMA AM. 2001 Metabolic and hemodynamic response of adipose tissue to angiotensin II. Obes. Res. 9:486-491.

38

BOTION, LM. 2001 The influence of fasting/ refeeding on the lipoprotein lipase activity of adipose tissue and muscle. Braz J Med Biol Res 34 (11): 1411-1414. BOTION, L.M., GREEN, A.1999 Long-term regulation of lipolysis and hormone sensitive lipase by insulin and glucose. Diabetes 48: 1691-1697. BRADFORD, M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-254. CAMPBELL DJ, HABENER J. 1987 Cellular localization of angiotensinogen gene expression in brown adipose tissue and mesentery: quantification of messenger ribonucleic acid abundance using hybridization in situ Endocrinology 121:1616-1626. CAMPBELL DJ, DUNCAN AM, KLAIDS A, HARRAP SB.1995 Converting enzyme inhibition and its withdrawal in spontaneously hypertensive rats. J Cardiovasc Pharmacol 26:426-436 CAMPAGNOLE-SANTOS MJ, HERINGER SB, BATISTA EN, KHOSLA MC, SANTOS RAS. 1992 Differential baroreceptor reflex modulation by centrally infused angiotensin peptides. Am J Physiol 263:R89-94. CAREY RM, WANG ZQ, SIRAGY HM. 2000 Role of the angiotensin II type 2 receptor in the regulation of blood pressure and renal function. Hypertension 35: 155-63. CARLSSON PO. 1998 Angiotensin II and the endocrine pancreas: Effects on islet blood flow and insulin secretion in rats. Diabetologia 41:127-133. CASSIS LA, SAYE JA, PEACH MJ. 1988 Location and regulation of rat angiotensinogen messenger RNA. Hypertension 11:591-596. CASSIS LA, MARCHALL DE, FETTINGER MJ, et al. 1998 Mechanism contributing to angiotensin II regulation of body weight. Am J Physiol 274: E867-876. CASSIS LA. 2000 Fat cell metabolism; insulin, fatty acids and rennin. Current Hypertens Rep 2: 132-138. COIMBRA CC, GAROFALO MAR, FOSCOLO DRC, XAVIER AR, MIGLIORINI RH. 1999 Gluconeogenese activation after intravenosus angiotensin II in freely moving rats. Peptides 20: 823-827. CRANDALL DL, ARMELLINO DC, BUSLER DE, McHENDRY-RINDLEB, KRAL JG. 1999 Ang II receptors in human preadipocytes: role in cell cycle regulation. Endocrinology 140:154-158.

39

DARIMONT C, VASSAUX G, AILHAUD G, NEGREL R. 1994a Differentiation of preadipose cells: paracrine role of prostacyclin upon stimulation of adipose cells by angiotensin-II. Endocrinology 135:2030-2036. DARIMONT C, VASSAUX G, GAILLARD D, AILHAUD G, NEGREL R. 1994b In situ microdialysis of proatagladins in adipose tissue: stimulation prostacyclin release by angiotensina II. Int J Obes Relat Metab Disord. 18:783-788. DAVISSON RL, OLIVERIO MI, COFFMAN TM et al 2000 Divergent function of angiotensin II receptor isoformas in the brain. J Clin Invest. 106:103-106 DEGERMAN E, BELFRAGE P, MANGANIELLO VC. 1997 Structure, localization and regulation of cGMP-inhibited phosphodiesterase (PDE3). J Biol Chem 272:6823-6826. DELLIPIZZI A, HILCHEY SD, BELL-QUILLEY CP. 1994 Natriuretic actions of angiotensin-(1-7). Br J Pharmacol 111:1-3. DUSSERRE F, MOULIN P, VIDAL H. 2000 Differences in mRNA expression of the adipose tissues. Biochem Biophys Acta 1500:88-96. ECKEL RH. . 1989 Lipoprotein lipase. A multifunctional enzyme relevant to common metabolic diseases. New Engl. J. Med 320:1060-1068 EGAN JJ, GREENBERG AS, GHANG MK, WEK MC, MOOS JR, LONDOS C. 1992 Mechanism of hormone-stimuled lipoysis in adipocytes: Traslocation of hormone sensitive lipase to the lipid storage droplet. Proc Natl Acad Sci USA 89: 8537-8541. EGAN BM, HENNES MMI, STEPNIAKOWSKI KT, O’SHAUGHNESSY IM, KISSEBAH AH, GOODFRIEND TL. 1996 Obesity hypertension is related more to insulin’s fatty acid than glucose action. Hypertension 27: 723-728. ENGELI S, NEGREL R, SHARMA AM. 2000 Physiology and pathophysiology of the adipose tissue renin-angiotensin-system. Hypertension 35:1270-1277. ENGELI S, BOHNKE J, GORZELNIAK K, JANKE J, SCHLING P, BADER M, LUFT FC, SHARMA AM. 2005 Weight loss and renin-angiotensin-aldosterone system. Hypertension 45:356-362 ENGLISH V, CASSIS L. 1999 Facilitation of sympathetic neurotransmission contributes to angiotensina regulation of body weight. J Neural Transm 106:631-644.

40

ERNSBERGER P, KOLESTSKY RJ. 2006 Metabolic effects of antihypertensive agents: role of sympathoadrenal and rennin-angiotensin systems. N-S Arch Pharmacol 373:245- 258. FERRARIO CM, IYER SN. 1998 Angiotensin-(1-7): a bioactive fragment of the renin-angiotensin system. Regulatory Peptides 78(1-3):13-18. FERREIRA ML. 2004 Efeito da angiotensina II na lipogênese e lipólise, in vivo, em ratos aclimatados ao frio (5 0C) e a temperatura ambiente (25 0C). Tese de doutorado, departamento de fisiologia e biofísica, UFMG. FASSHAUER M, PASCHKE R, STUMVOLL M. 2004. Adiponectin, obesity, and cardiovascular disease. Biochimie 86: 779-784. FOLCH, J., LEES, M., STANLEY, G.A. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 1957; 226: 497-509. FOLLI F, KAHN CR, HANSEN H, BOUCHIE JL, FEENER EP. 1997 Angiotensin II inhibits insulin signaling in aortic smooth muscle cells at multiple levels. A potential role of serine phosphorylation in insulin/angiotensin II crosstalk. J Clin Invest 100: 2158-69. FOLSOM AR, KAYE SA, SELLERS TA, HONG CP, CERHAN JR, POTTER JD, PRINEAS RJ. 1993 Body fat distribution and 5-year risk of death in older women. JAMA 269: 483-487. FRAYN KN. 2002 Adipose tissue as a buffer for daily lipid flux. Diabetologia 45: 1201-1210. FRUHBECK G, COMEZ-AMBROSI J, MURUZABAL FJ, BURREL MA. 2001 The adipocyte: a model for integration of endocrine and metabolic signaling in energy metabolism regulation. Am J Physiol Endocrinol Metab 280:E827-47. GEARING KL, GOTTLICHER M, TEBOUL M, WIDMARK E, GUSTAFASSON JA. 1993 Interaction of the peroxissome-proliferator-activated receptor and retinoid X receptor. Proc Natl Acad Sci USA 90:1440-1444. GIACCHETTI G, FALOIA E, MARINIELLO B, et al.2002 Overexpression of the renin-angiotensin system in human visceral adipose tissue in normal and overweight subjects. Am J Hypertens 15:381-388. GIANI JF, GIRONACCI MM, MUNOZ MC, PENA C, TURYN D, DOMINICI FP. 2007 Angiotensin-(1-7) stimulates the phosphorylation of JAK 2, IRS-1 and Akt in rat heart in vivo: role of the AT1 and MAS receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol 293(2): H1154-63.

41

GRASSI G, SERAVELLE G, CATTANEO GM, BOLLA GB, LANFRANCHIA, COLOMBO M. 1995 Sympatic activation in obese normotensive subjects. Hypertension 25: 560-3. GREENBERG AS. 1990 Perilipin, a major hormonally regulated adipocyte-specifc phosphoprotein associated with the periphery of lipid storage droplets. J. Biol. Chem. 266: 18769-18775. GOOSSENS GH, JOCKEN JWE, BLAAK EE, SCHIFFERS PM, SARIS WHM, van BAAK MA. 2007 Endocrine role of the renin-angiotensin system in human adipose tissue and muscle: Effect of β-adrenergic stimulation. Hypertension 49:542-547. HAINAULT I, NEBOUT G, TURBAN S et al. 2002 Adipose tissue-specific increase in angiotensinogen expression and secretion in the obese (fa/fa) Zucker rat. Am J Physiol Endocrinol Metab.282:E59-E66. HANDA RK, FERRARIO CM, STRANDHOY JW. 1996 Renal actions of Angiotensin-(1-7): in vivo and in vitro studies. Am J Physiol 270:F141-F147. HARTMAN AD. 1981 Lipoprotein lipase activities in adipose tissue and muscle in the obese Zucker rat. Am J Physiol 241:E108-E115. HEITSCH H, BROVKOVYCH S, MALINSKI T, WIEMER G. 2001 Angiotensin-(1-7)-stimulated nitric oxide and superoxide release from endothelial cells. Hypertension 37:72-76. HOM FG, GOODNER CJ. 1984 Insulin-dose response characteristic among individual muscle and adipose tissue measured in rat in vivo using 2-deoxy-glucose.Diabetes 33:153-159. ICHIKAWA I, BRENNER BM. 1980 Importance of efferent arteriolar vascular tone in regulation of proximal tubule fluid reabsorption an glomerulo tubular balance in rats. J Clin Invest 65: 1992-1201. IWAKI M, MATSUDA M, MAEDA N, FUNAHASHI T, MATSUZAWA Y, MAKISHIMA M, SHIMOMURA I. 2003 induction of adiponectin, a fat-derived antidiabetic and antiatherogenic factor, by receptor nuclear. Diabetes 52: 1655-1663. JANKE J, ENGELI S, GORZELNIAK K, LUFT FC, SHARMA AM. 2002 Mature adipocytes inhibit in vitro differentiation of human preadipocytes via angiotensin type 1 receptors. Diabetes 51:1699-1707. JANSSON L. 1994 The regulation of pancreatic islet blood flow . Diab Metab Rev 10: 407-416.

42

KRAEGEN EW, JAMES DE, JENKINS AB, CHISOLM DJ. 1985 Dose-respose curves for in vivo sensitivity in individuals tissues in rats. Am J Physiol 248:353-362. KARPE F, OLIVERCRONA T, OLIVERCRONA G, SAMRA JS, SUMMERS L.K.M., HUMPHREYS SM, FRAYN KN. 1998 Lipoprotein lipase transport in plasma: role of muscle and adipose tissue in regulation of plasma lipoprotein lipase concentration. J Lipid Res 39:2387-2393.

KERSTEN S. 2001 Mechanisms of nutritional and hormonal regulation of lipogenesis. EMBO Reports 21 (41): 282-286. KERSTEN S. 2002 Peroxissome proliferator activated receptor and obesity. European Journal of Pharmacology 440:223-234. KIHARA M, UMEMURA S, SUMIDA Y, YOKOYAMA N, YABANA M, NYUI N, TAMURA K, MURAKAMI K, FUKAMIZU A, ISHII M 1998 Genetic deficiency of angiotensinogen produces an impaired urine concentrating ability in mice. Kidney Int 53: 548-555 KISSEBACH AH, FREEDMAN DS, PERIS AN. 1989a Helt risks of obesity. Med Clin North Am 73:111-138. KISSEBACH AH, PERIS AN. 1989b Biology of regional body distribution relationship to non-insulin-dependent diabetes mellitus. Diabet Metab Rev 5:83-109. KOSTEINS E, MILLIGAN G, CHRISTOPOULOS A, SANCHEZ-FERRER CF, HERINGER-WALTHER S, SEXTON PM, GEMBARDT F, KELLETT E, MARTINI L, VANDERHEYDEN P, SCHULTHEISS HP, WALTHER T. 2005 Gprotein-coupled receptor Mas is a physiological antagonist of the angiotensina II type 1 receptor. Circulation 111:1806-1813. LADU MJ, HAPSAS H, PALMER WK. 1991 Regulation of lipoprotein lipase in adipose tissue and muscle tissue during fasting. Am J of Physiology 260: 953-959. LAEMMLI UK. 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685. LAFONTAN M, BERLAN M. 1993 Fat cell and the control of white and brown fat cell function. J Lipid Res 34: 1057-1091. LARGE V, ARNER P. 1998 Regulation of lipolysis in human. Pathophysiological modulation in obesity, diabetes and hyperlipidaemia. Diabetes Metab 24:409-418.

43

LOPEZ-SORIANO FJ, CARBO N, ARGILES JM. 1991 Lipid metabolism inthe obese Zucker rat: Disposal of na oral [14C]triolein load and lipoprotein lípase activity. Biochem J 274:651-656. LYNCH KR, PEACH MJ. 1991 Molecular biology of angiotensinogen Hypertension 17: 263-269S MACHADO LJC, MIHESSEN-NETO I, MARUBAYASHI U, REIS AM, COIMBRA CC. 1995 Hyperglicemic action of angiotensin II in freely moving rats. Peptides 16:479-483. MACHADO LJC, MARUBAYASHI U, REIS AM, COIMBRA CC. 1998 The hyperglicemia induced by angiotensin II in rats is mediated by AT1 receptors. Bras J Med Res 31:1349-1352. MASILAMANI S, KIM GH, MITCHELL C et al. 1999 Aldosterone-mediated regulation of ENaC alpha, beta and gamma subunit proteins in rat kidney. JJ Clin Invest 104: R19-R23. MASSIÉRA F, BLOCH-FAURE M, CEILER D, MURAKAMI K, FUKAMIZU A, GASC JM, QUIGNARD-BOULANGÉ A, NEGREL R, AILHAUD G, SEYDOUX J, MENETON P, TEBOUL M. 2001 Adipose angiotensinogen is involved in adipose tissue grwth and blood pressure regulation. FASEB 15:2727-2729 MEFFERT S, STOLL M, STECKELINGS UM, BOTTARI SP, UNGER T. 1996 The angiotensina II AT2 receptor inhibits proliferation and promotes differentiation in PC12W cells. Mol Cell Endocrinol 122:59-67. McGRATH BP, MATTHEWS PG, LOUIS W et al. 1990 Double-blind study of dilevalol and captopril, both in combination with hydrochlorothiazide, in patients with moderate to severe hypertension. J Cardiovasc Pharmacol 16:831-838. MORRIS MJ, WILSON WL, STRBUCK EM et al . 2002 Forebrain circumventricular organs mediate salt appetite induced by intravenous angiotensina II in rats. Brain Res 949: 42-50. MUZENMAIER DH, GREENE AS. 1996 Opposing action of angiotensi II on microvascular growth and arterial blood pressure. Hypertension 27:760-5. NEGRELR, GAILLARD D, AILHAUD G. 1989 Prostacyclin as a potent effector of adipose cell differentiation. Biochem J 257:399-405. NILSSON-EHLE P.E; SCHOTZ M.C. A stable radioactive substrate emulsion for assay of lipoprotein lipase. J. Lipid Res 1976; 17: 536-41.

44

OKUNO A, TAMEMOTO H, TOBE K, et al. 1998 Troglitazone increases the number of small adipocytes without the change of white adiose mass in obese Zucker rats. J Clin Invest 101:1354-1361. PAULA RD, LIMA CV, KLOSLA MC, SANTOS RAS. 1995 Angiotensin-(1-7) potentiates the hypotensive effect of bradykinin in conscious rats. Hypertension 26:1154-9. PEACH M.1977.Renin–angiotensin system: biochemistry and mechanism involved. of action. Physiol Rev. 57:313–70. PETI –PETERDI J, WARNOCK DG, BELL PD 2002 Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical colleting duct via AT(1) receptors. J Am Soc Nephrol 13:1131-1135. PTAFFL MW. 2001 A new mathematical model for relative quantification im real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29(9):e45. RANDLE P, GARLANDP, HALES N, NEWSHOLEME E. 1963 The glucose fatty acid: its role insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet I: 785. RICHELSEN B, PEDERSEN SB, MOLLER-PEDERSEN T, BAK JF. 1991 Regional differences in triglyceride breakdown in human tissue: effects of catecholamines, insulin and prostaglandin E2. Metabolism 40: 990-996. RODBELL, M.1964 Metabolism of isolated fat cells. I. Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis. J. Biol. Chem 239: 375-380. ROKS AJM, van GEEL PP, PINTO YM, BUIKEMA H, HENNING RH, ZEEUW D, van GLIST WH. 1999 Angiotensin-(1-7) is a modulator of the human renin-angiotensin system. Hypertension 34:296-301. SAFANOVA I, AUBERT J, NEGREL R, AIHAUD G. 1997 Regualtion by fatty acids of angiotensinogen gene expression in preadipose cells. Biochem J 322:235-239. SAINT-MARC P, KOZAK LP, AILHAUD G, et al 2001 Angiotensin IIas a trofic factor of white adipose tissue: stimulation of cell formation. Endocrinology 142:487-492. SALEH J, SNIDERMAN AD, CIANFLONE K. 1999 Regulation of plasma fatty acid metabolism. Clin Chim Acta 286: 163-180. SANTOS RAS, SILVA ACS, MAGALDI AJ, KHOSLA MC, CESAR KR, PASSAGLIO KT, et al. 1996 Evidence for physiological role of angiotensin-(1-7) in the control of hydroelectrolyte balance. Hypertension 27:875-84.

45

SANTOS RAS, CAMPAGNOLE-SANTOS MJ, ANDRADE SP.2000 Angiotensin-(1-7): an update. Regul Pept 28:91(1-3): 45-62. SANTOS RA, SIMÕES E SILVA AC, MARIO C, SILVA DM, MACHADO RO, DE BUHR I, HERINGER-WLTHER S, PINHEIRO SV, LOPES MT, BADER M, MENDES EP, LEMOS VS, CAMPAGNOLE-SANTOS MJ, SCHULTHEISS HP, SPETH R, WALTHER T. 2003 Angiotensin-(1-7) is na endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci USA 100(14):8258-8263. SANTOS SHS, FERNANDES LR, MARIO EG, ALVAREZ-LEITE JI, FERREIRA AVM, PÔRTO LCJ, BOTION LM, BADER M, ALENINA N, SANTOS RAS. MAS deficiency in FVB/N mice produces marked changes in lipid and glycemic metabolism. Diabetes 57:340-347. SAYE JA, CASSIS LA, STURGILL TW, LYNCH KR and PEACH MJ. 1989 Angiotensinogen gene expression in 3T3-L1 cells. Am J Physiol 256:C448-C451 SAYE JA, LYNCH KR and PEACH MJ. 1990 Changes in angiotensinogen messenger RNA in differentiating 3T3-F442 adipocytes. Hypertension 15:867-871. SCHIAVONE MT, SANTOS RAS, BROSNIHAN KB, KHOSLA MC, FERRARIO CM. 1988 Release of vasopressin from the rat hypothalamo- neurohypophysial system by angiotensin-(1-7) heptapeptide. Proc Natl Acad Sci USA 85:4095-8. SCHLING P, MALLOW H, TRINDL A, LÖFFLER G. 1999 Evidence for a local renin angiotnsin system in priamry cultured human adipocytes. Inter J Obes Relat Metab Disord 23:336-341. SETHI JK, VIDAL-PUIG AJ. 2007 Thematic reviews series: adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. J Lipid Res 48(6):1253-62. SHANMUGAM S, SANDBERG K. 1996 Ontogeny of angiotensin II receptors. Cell Biol Int 20: 169-176. SHARMA AM. 2006 The obese patient with diabetes mellitus: from research targets to treatment options. Am J Med 119: S17-S23. SIL P, SEN S. 1997 Ang II and myocyte growth. Hypertension 30:209-216. SIRAGY HM, CAREY RM. 1999 Protective role of angiotensin AT2 receptor in a renal wrap hypertension model. Hypertension 169: 997-1006. SPIEGELMAN BM. 1998 PPARγ: adipogênico regulator and thiazolidionedione receptor. Diabetes 47:507-514.

46

STRAZZULLO P and GALLETTI F. 2004 Impact of the renin-angiotensin system om lipid and carbohydrate metabolism. Curr Opin Nephrol Hypertens 13:325-332. TAN F, MORRIS PW, SKIDGEL RA, ERDOS EG. 1993 Sequencing and cloning of human prolycarboxipeptidase (angiotensinase C): similarity to both serine caboxypeptidase and prolyendopeptidase families. J Biol Chem 268: 16631-8. TIKELLIS C, COOPER ME, THOMAS MC. 2006 Role of the rennin-angiotensin in the endocrine pancreas: implications for the development of diabetes. Inter J Biochem Cell Biol 38: 737-751. TIMMERMANS PB, WONG PC, CHIU AT et al. 1993 Angiotensin II receptors and angiotensina II receptor antagonists. Pharmacol Rev 45: 205-251. TOWNSEND RR. 2001 The effects of angiotensina-II on lipolysis in human. Metabolism 50(4): 468-472. UMEMURA S, NYUI N, TAMURA K, YAMAGUCHI S, NAKAMARU M, ISHIGAMI T, YABANA M, KIHARA M, INOUE S, ISHII M. 1997 Plasma angiotensinogen concentrations in obese patients. Am J Hypertens 10:629-633. UNGER T. 1999 The angiotensin type II receptor: variations on an enigmatic theme. J Hypertens 17:1775-86. VELLOSO LA, FOLLI F, SUN XJ, WHITE MF, SAAD MJ, KAHN CR. 1996 Cross-talk between the insulin and angiotensin signaling systems. Proc Natl Acad Sci USA 93:12490-5. WALCZAK R and TONTONOZ P. 2002 PPARadigms and PPARadoxes. Expanding roles for PPARγ in the control of lipid metabolism. J Lipid Res 43:177-186. WALTHER T, BALSCHUN D, VOIGT JP, FINK H, ZUSCHRATTER W, BIRCHMEIER C, GANTEN D, BADER M. 1998 Sustained long term potentiation and anxiety in mice lacking the Mas protooncogene. J Biol Chem 273:11867-11873. WU L, IWAI M, NAKAGAMI H, CHEN R, SUZUKI J, AKISHITA M et al. 2002 Effect of angiotensin II type 1 receptor blockade on cardiac remodeling in angiotensin II type 2 receptor null mice. Arterioscler Thrmb Vasc Biol 22:49-54. WU L, IWAI M, NAKAGAMI H, LI Z, CHEN R, SUZUKI J, et al. 2001 Roles of angiotensin II type 2 receptor stimulation associated with selective angiotensina II type 1 receptor blockade with valsartan in the improvement of inflammation-induced vascular injury. Circulation 104:2716-21.

47

48

WU Z, XIE Y, MORRISON RF, BUCHER NL, FARMER SR. 1998 PPARgamma induces the insulin-dependent glucose transporter GLUT4 in the absence of C/EBPalpha during the conversion of 3T3 fibroblast into adipocytes. J Clin Invest 101:22-32. YAMAMOTO K, CHAPPELL K, BROSNIHAN KB, FERRARIO CM 1992 In vivio metabolism of angiotensina I by neutral endopeptidase (EC3.4.24.11) in spontaneously hypertensive rats. Hypetension 19:1201-11. YANG Y, CHEN M, LOUX TJ, HARMON CM. 2007 Regulation of FAT/CD36 mRNA gene expression by long chain fatty acids in the differentiated 3T3-L1 cells. Pediatr Surg Int 23(7):675-83. YOST TJ, FROYD KK, JENSEN DR et al. 1995 Change in skeletal muscle lipoprotein lipase activity in response to insulin/glucose in non-insulin-dependent diabetes mellitus. Metabolism 44:786-790.

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