MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO

UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS - UAECIA

ESCOLA AGRÍCOLA DE JUNDIAÍ - EAJ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS

MARCADORES BARCODE EM Spondias DO NORDESTE: O CASO ESPECÍFICO

DE S. bahiensis

FRANCISCA JANEKELY BURITI

Macaíba/RN

Setembro de 2020

ii

FRANCISCA JANEKELY BURITI

MARCADORES BARCODE EM Spondias DO NORDESTE: O CASO ESPECÍFICO

DE S. bahiensis

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Florestais da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, como parte das

exigências para obtenção do título de Mestre em

Ciências Florestais (Área de Concentração em Ciências

Florestais - Linha de Pesquisa: Biodiversidade,

Conservação e Uso dos Recursos Genéticos Florestais.

Orientador:

Prof. Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio

Macaíba/RN

Setembro de 2020

Buriti, Francisca Janekely. Marcadores barcode em Spondias do Nordeste: o caso específicode S. bahiensis / Francisca Janekely Buriti. - 2020. 52f.: il.

Dissertação (Mestrado) Universidade Federal do Rio Grande doNorte, Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias,Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais, Macaíba, RN,2020. Orientador: Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio.

1. Marcadores Moleculares - Dissertação. 2. DNA -Dissertação. 3. Filogenia Molecular - Dissertação. I. Lúcio,Paulo Sérgio Marinho. II. Título.

RN/UF/BSPRH CDU 575

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRNSistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Rodolfo Helinski - Escola Agrícola de Jundiaí -EAJ

Elaborado por Valéria Maria Lima da Silva - CRB-15/451

iii

MARCADORES BARCODE EM Spondias DO NORDESTE: O CASO ESPECÍFICO DE S.

Bahiensis

FRANCISCA JANEKELY BURITI

Dissertação julgada para obtenção do título de Mestre em Ciências Florestais (Área de

Concentração em Ciências Florestais - Linha de Pesquisa: GENOMAS DE ÁRVORES:

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE GENES, GENÔMICA COMPARATIVA,

IDENTIFICAÇAO DE POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO E INTERAÇOES

PLANTAS E MICROORGANISMOS e aprovada pela banca examinadora em 28 de agosto

de 2020.

Banca Examinadora

________________________________________________

Prof. Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio

UAECIA/UFRN

Presidente

________________________________________________

Prof. Dr. Aulus Estevão Anjos de Deus Barbosa

UFU

Examinador Externo à Instituição

________________________________________________

Prof. Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha

DBG/UFRN

Examinador externo ao programa

Macaíba/RN

Setembro de 2020

iv

À Deus, minha fonte de sustentação.

DEDICO

v

AGRADECIMENTOS

__________________________________________________________________________

Agradeço

Primeiramente agradeço a Deus por ter me dado força, coragem, e por não ter me

deixado fraquejar nas diversas vezes que pensei em desistir.

Ao meu orientador Paulo Marinho por ter acreditado em mim desde o início, por ter

sido amigo, pai/orientador, e por ter sido compreensivo nos momentos difíceis em que

enfrentei durante esse período, agradeço de coração.

Aos meus pais pelos ensinamentos de honestidade e caráter que me fizeram ser hoje o

que sou. Aos meus irmãos Janielson e Janiele, pelo apoio e preocupações que tiveram comigo

desde sempre.

À minha ex-professora, amiga e mãe espiritual, Eliene Zuza, pelas orações, pelos

conselhos, pelos incentivos, e por ter me ajudado financeiramente em um momento difícil,

sou muito grata por tê-la em minha vida.

Ao meu primo Eudes por ter embarcado comigo nesse mestrado, mesmo sem

condições, passando por diversas necessidades (até de água), perdas dolorosas, foi um dos

pilares de apoio e sustentação para que eu não desistisse e hoje eu conseguisse esse título,

você faz parte dele.

Aos meus amigos que fiz durante o mestrado: a Vanessa Pulcheria por todo apoio, a

Patrícia Balduíno e o Bruno Guirra por toda amizade e companheirismo. Vocês fazem parte

dessa conquista.

À senhora Geralda, ao seu Catôta e Netinha por ter me acolhido em Natal, e por todo

apoio, vocês são os avós e tia que gostaria de ter.

Ao PPGCFL, ao laboratório de genética molecular do Centro de biociências,

consequentemente a UFRN, por ter me proporcionado elementos para a realização da

pesquisa.

Agradeço, enfim, a todos aqueles que de uma forma ou outra contribuíram para

obtenção deste título.

vii

RESUMO GERAL

__________________________________________________________________________

MARCADORES BARCODE EM Spondias DO NORDESTE: O CASO ESPECÍFICO

DE S. Bahiensis

Spondias bahiensis é uma das cinco espécies do gênero Spondias presentes no Brasil,

principalmente ocorrendo no Nordeste brasileiro. A planta foi durante muitos anos

identificada como Spondias sp em função da dúvida que havia em relação à possibilidade de

se tratar de um híbrido entre Spondias tuberosa e Spondias monbim. S. bahiensis foi então

assim denominada com base em estudos de biologia molecular envolvendo marcadores

barcode que confirmaram tratar-se de uma nova espécie. O objetivo desse estudo é abordar a

variabilidade intraespecífica na espécie S. bahiensis com relação à características

morfológicas do fruto e do sabor da fruta e dirimir dúvidas quanto à classificação da espécie

que por ventura possam existir. Como também, pretende-se averiguar se a variabilidade

genética na espécie pode ser acessada com os marcadores barcode disponíveis. A metodologia

utilizada consistiu em realizar coletas de material vegetal (folhas jovens) das cinco espécies

de Spondias, inclusive de S. bahiensis, em diferentes localidades dos estados do Rio Grande

do Norte de e da Paraíba, e a realização de amplificações de PCR com marcadores barcode

universais rbcL, matK, trnG-trnS, trnH-psbA, rpoB, e rpoC. A variabilidade intraespecífica

de S. bahiensis foi estudada a partir de plantas do plantio experimental da EMPARN -

Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte no município de Ipanguaçu, Rio

Grande do Norte. Os resultados obtidos permitiram a amplificação e sequenciamento das

regiões barcode pelos diferentes marcadores utilizados e a realização de árvores filogenéticas

que confirmam, nesta análise, a posição taxonômica de S. bahiensis em comparação com as

demais espécies do gênero.

.

Palavras-chave: marcadores moleculares, DNA, filogenia molecular

viii

GENERAL ABSTRACT

__________________________________________________________________________

MARCADORES BARCODE EM Spondias DO NORDESTE: O CASO ESPECÍFICO

DE S. Bahiensis

Spondias bahiensis P. Carvalho, Van den Berg & M. Machado is one of the five species

of Spondias genus present in Brazil, mainly occurring in the Northeast of Brazil. The plant

was identified for many years as Spondias sp due to the doubts about the possibility of being a

hybrid between Spondias tuberosa and Spondias mombin. S. bahiensis was identified based

on molecular biology studies involving barcode markers that confirmed the plant as a new

species. The objective of this study is to address the intraspecific variability of S.

bahiensis species in relation to the morphological characteristics of the fruit and the fruit

flavor and to resolve doubts related to the classification of the specie that could remain exist.

We intend to investigate if the genetic variability in the species can be accessed with the

available barcode markers. Methodology used consisted in collecting plant material (young

leaves) from five species of Spondias, including S. bahiensis, at different locations in the

states of Rio Grande do Norte and Paraíba, and carrying out PCR amplifications with

universal barcodes markers rbcL, matK, trnG-trnS, trnH-psbA, rpoB, and rpoC. The

intraspecific variabilaidae of S. bahiensis was studied from experimental plantings of

EMPARN - Agricultural Research Company of Rio Grande do Norte in the municipality of

Ipanguaçu, Rio Grande do Norte. The results obtained allowed the amplification and

sequencing of the barcode regions by the different markers used and the realization of

phylogenetic trees that confirm, in this analysis, the taxonomic position of S. bahiensis in

comparison with the other species of the genus.

Keywords: molecular markers, DNA, molecular phylogeny.

ix

SUMÁRIO

__________________________________________________________________________

Página

1. INTRODUÇÃO GERAL ..................................................................................................... 1

2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................ 3

2.1. O gênero Spondias .......................................................................................................... 3

2.2. Importância Econômica das Spondias ....................................................................... ...10

2.2.1 Spondias na Agroindústria ..................................................................................... 10

2.2.2 Propriedade farmacológica das Spondias............................................................... 11

2.3. Marcadores Barcodes em plantas ................................................................................. 12

3. MATERIL E METÓDOS ................................................................................................. 16

3.1 Material Vegetal ............................................................................................................. 16

3.2 Extração de DNA ........................................................................................................... 17

3.3 Condições de amplificação e análise em gel de agarose ............................................... 18

4. RESULTADOS E DISCUSÕES ........................................................................................ 20

4.1 Viabilidade do uso de marcadores barcode universal em Spondia ................................ 20

4.2 Abordagem em Spondias bahiensis ............................................................................... 25

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 26

ANEXO 1. Alinhamento de sequência entre fragmento de sequência gerada por primers

psbA-trnH em Spondias sp do Rio Grande do Norte e genoma plastidial de S.tuberosa 34

ANEXO 2. Alinhamento de sequência entre fragmento de sequência gerada por primers

psbA-trnH em Spondias sp do Rio Grande do Norte e genoma plastidial de S. bahiensis

.................................................................................................................................................. 35

ANEXO 3. Alinhamento de sequência entre fragmento de sequência gerada por primers

psbA-trnH em Spondias sp do Rio Grande do Norte em comparação com a mesma

região em de S.tuberosa...........................................................................................................36

ANEXO 4. Sequências geradas para Spondias sp. com primers psbA-trnH....................36

x

LISTA DE FIGURAS

__________________________________________________________________________

Figura 1. S. monbim. (cajá verdadeiro), folhas, frutos e endocarpo .........................................5

Figura 2. S. purpurea (ciriguela), fruto e endocarpo .................................................................6

Figura 3. S. tuberosa, fruto (umbu, imbu) .................................................................................7

Figura 4. S. cytherea, (cajá manga), árvore, folhas e frutos ......................................................8

Figura 5. S. bahiensis, (umbucajá), fruto e endocarpo ..............................................................9

Figura 6. Localidades de coletas dos espécimes de Spondias utilizadas para extrações de

DNA genômico. ................................................................................................................ ........17

Figura 7. Amplificações de PCR obtidas com os primers rbcL (1-5), trnG-trnS (6-10), psbA-

trnH (11-15), rpoB (16-20), rpoC1 (21-25) e matK (26-30) analisadas em gel de agarose

1,5%. M. marcador 50bp DNA Ladder. Plantas A (S.mombim), J (Spondias sp), M

(S.purpurea), P (S.tuberosa) e R (S.cytherea) da esquerda para a direita, para cada conjunto de

primers. Modificado a partir de Moura (2012) ........................................................................20

Figura 8. Dendrograma UPGMA de distância genética de Nei para um conjunto de nove

árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia. ................................................................................ 22

Figura 9. Árvore filogenética gerada com pacote MEGA a partir de sequências obtidas com 4

Spondias (nome acrescido de PSB) e com sequências de bancos de dados públicos (genbank)

...................................................................................................................................................24

xi

LISTA DE TABELAS

__________________________________________________________________________

Tabela 1. Identificação das amostras de folhas de Spondias coletatas e coordenadas

geográficas no momento da coleta ...........................................................................................16

Tabela 2. Condições de PCR para amplificações de marcadores barcode em plantas de

Spondias mombim, Spondias tuberosa, Spondias purpurea, Spondias bahiensis e Spondias

cytherea..................................................................................................................................... 18

Tabela 3. Sequência de nucleotídeos de sete iniciadores de ISSR...........................................19

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

__________________________________________________________________________

CTAB - Brometo de cetiltrietilamônio

DNA - Ácido desoxirribonucleico

mtDNA - DNA mitocondrial

PCR - Reação em Cadeia da Polimerase

EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético

CBOL - Consortium for the Barcode of Life

BOLD - Barcode of Life Database

COI - Citocromo Oxidase Subunidade I

UPGMA - Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Mean

AFLP - Amplification Fragment Length Polymorphism

1

1. INTRODUÇÃO GERAL

__________________________________________________________________________

Os códigos de barras, ou os atuais QR codes são tecnologias utilizadas

comercialmente para a identificação com rapidez e praticidade de produtos. O código de barra

universal é uma representação gráfica que emprega 10 algarismos alternados com 11 posições

para gerar 100 bilhões de identificadores únicos. No mercado essa ferramenta possibilita o

controle e estocagem de produtos em todo o mundo, reduzindo também o erro.

Já no meio biológico, diversos procedimentos são realizados para identificação de

espécies, com base em características morfológicas, comportamentais, fisiológicas ou

moleculares, entre outros. Em sua maioria são classificados de acordo com a atividade

taxonômica existente em determinado grupo de organismos. Dessa forma, Linné no século

XVIII, classificou a taxonomia de seres vivos dividindo-a por reinos, filos, classes, ordens,

gêneros, famílias e espécies (AGANETTE, et al., 2010).

Para a identificação de espécies biológicas, no ano de 2003, o código de barras de

DNA, ou como é mais conhecido, o DNA barcode, foi proposto como um método de

identificação taxonômica a partir da sequência de um fragmento do gene mitocondrial

citocromo oxidase I (COI) (HERBET et al., 2003). A finalidade desta iniciativa era de

identificar a nível de espécie todos os indivíduos por meio não de um código de barras, mas

de uma sequência de DNA universal para todas as espécies existentes (TIZARD et al., 2019).

E isto se mostrou muito eficaz (BROWN et al., 1979; MOORE 1995; MINDELL et al. 1997).

O princípio da técnica de DNA barcode é encontrar uma sequência de DNA que possa ser

amplificada por PCR em uma única reação com uso de um par de primers universal e que seja

suficientemente variável a ponto de se constituir num marcador molecular universal (CHEN

et al., 2019). Isto permitiria a identificação de espécies morfologicamente iguais, mas

geneticamente diferentes, como também espécies invasoras (COSTION et al., 2011) entre

muitas outras aplicações. O objetivo final seria a manutenção de bancos de dados em

plataformas digitais que permitissem a consulta de sequências submetidas e identificar com

rapidez e eficácia a taxonomia de um determinado espécime.

O gene COI proposto por Hebert et al. (2003) se mostrou muito eficaz na identificação

de animais. Em plantas, no entanto, este gene mitocondrial não apresenta a mesma taxa de

mutação observada em animais o que dificulta a identificação de espécies já que diferentes

espécies podem ter a mesma sequência alvo. Neste sentido, muitos esforços foram feitos para

2

se chegar ao marcador molecular ideal para plantas por diversos grupos de pesquisa

(PENNISI, 2007; LEDFORD, 2008; KRESS & ERICKSON, 2007; FAZEKAS et al., 2008;

LAHAYE et al., 2008; ERICKSON et al., 2008; HOLLINGSWORTH et al., 2009)

Em 2009 os resultados dos esforços vieram com a publicação do barcode universal

consenso para plantas (CBOL Plant Working Group, 2009). No caso, trata-se não somente de

um par de primers, mas da associação de duas regiões codantes do gene plastidial matK e

outra do gene rbcl. Este trabalho, embora tenha sido um marco pela importância da revista em

que foi publicado e pelo próprio esforço do CBOL em realizá-lo em vários laboratórios do

mundo, não se constituiu, necessariamente, numa referência de aceitação automática pela

comunidade científica tendo sido então propostos vários marcadores para plantas ao longo dos

últimos anos (KREES, 2017).

O interesse desta dissertação foi então de testar os principais barcodes de plantas em

cinco espécies do gênero Spondias, Spondias bahiensis P. Carvalho, Van Den Berg & M.

Machado (umbu-cajá ou cajarana, antiga Spondia spp.) Spondias tuberosa Arruda (umbu),

Spondias purpurea L. (ciriguela ), Spondias mombin L. (cajá ) e Spondias cytherea Sonn

(cajá-manga), presentes no Nordeste do Brasil, mais precisamente nos estados do Rio Grande

do Norte e Paraíba, onde foram coletadas as amostras de material vegetal.

Especificamente, no caso de S. bahiensis, procurou-se acessar a variabilidade da planta

com os marcadores trnH-psbA uma vez que permanecem dúvidas quanto a identificação desta

cajarana, antes considerada um híbrido, Spondias sp. (MITCHELL & DALY, 1998) até a sua

identificação por Machado et al (2015).

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

__________________________________________________________________________

2.1. O gênero Spondias

Sendo um dos primeiros gêneros a ser descrito por Linnaeus em 1737, o

gênero Spondias (BRITO et al., 2018), possui 18 espécies dentre elas: S. acida, S.

admirabilis, S. chinensis, S. dulcis, S. mombin, S. dubia, S. graveolens, S. lutea, S.

pseudomyrobalanus, S. novoguineensis, S. pinnata, S. purpurea, S. mexicana, S.

tuberosa Arruda, S. venulosa. (SAMEH et al., 2018) com 19 táxons, dos quais dez

ocorrem em regiões da América Central (NOBRE et al., 2018).

Pertencente à família Anacardiaceae que envolve de 60 a 75 gêneros e

aproximadamente 600 espécies, cuja 20 estão distribuídas mundialmente, estando sete delas

em regiões neotropicais, dos quais dentre eles 4 possuem relevâncias econômica e por suas

propriedades farmacêuticas: S. dulcis, S. purpurea. S. tuberosa, S. monbim (SILVA et al.,

2014).

Nativas de regiões da América Central, as espécies S. monbim, S. purpurea, S.

tuberosa, S. venulosa , e um suposto híbrido entre S. mombin e S. tuberosa, tem maior

ocorrência no Brasil, em específico, nas regiões Norte e Nordeste (SILVA et al., 2015),

possuem destaque econômico, as espécies S. mombin L, mais conhecida como cajá, cajá-

mirin, a S. purpurea, mais conhecida na região Nordeste de ciriguela, a S. tuberosa

popularmente conhecida de imbu ou umbu e S. cytherea, conhecida como cajá-manga (SILVA

et al., 2014).

As Spondias possuem métodos de propagações divergentes. As S. cytherea e mombin

possuem seus métodos de propagação simples, por meio de estacas, onde são plantadas

continuamente no campo, tardando o surgimento de raízes (SILVA et al., 2014). A S. tuberosa,

além de ser, é propagada pelo método da estaquia, no entanto também pode ser feita pela

semeadura da semente, como também por muda enxertada (FONSECA, 2015). Para a espécie

S. purpurea o principal método de propagação pelo método vegetativo se dá por meio

exclusivamente de estacas talão.

A espécie S. mombin é uma árvore frutífera que pode atingir até 25 metros de altura,

com folhas ímpares, com 11 divisões de 9 a 11 centímetros (OSUNTOKUN, 2017), na

extremidade dos ramos possui flores pequenas de coloração branca. Floresce a partir do final

de agosto junto com o surgimento da nova folhagem, até dezembro. Regenera

espontaneamente tanto a partir de sementes como de estacas e raízes. Seus frutos (Figura 1),

4

do tipo drupa elipsóide e endocarpo súbero-lenhoso, com 3 a 4 centímetros de comprimento,

formato oval, oblongo, de epicarpo fino e liso, possuem cor amarelo-alaranjado, polpa fina de

sabor ácida (LORENÇO et al., 2018). O período de maturação dos seus frutos ocorre entre os

meses de outubro a janeiro, a colheita é feita em plantios espontâneas, possuindo importante

valor comercial, pois podem ser consumidos e processados para comercialização na forma in

natura (SILVA et al., 2014).

Figura 1. S. monbim. (cajá verdadeiro), folhas, frutos (a) e endocarpo (B). Fonte:

GIACON, 2017; SANTOS e COSTA, 2010.

Nos Estados da região Norte e Nordeste do Brasil, seu fruto possui uma diversidade de

nomes populares, os mais conhecidos são: cajá, cajá verdadeiro, cajá-mirim e cajá-manga.

Além disso, segundo Brito et al. (2018), os frutos da S. mombin, dispõem de alto valor no

agronegócio naquelas regiões decorrentes do sabor específico e aroma exótico, sendo

popularmente consumidos in natura, e na forma de polpa processada para sucos ou sorvetes.

O desenvolvimento dos frutos é ocasionado pela acelerada divisão e alongamento, com um

acréscimo irreversível do peso, diâmetro, e comprimento, dos quais são influídos por fatores

genéticos e ambientais, como temperatura, radiação UVA/UVB e precipitação (SILVA et al.,

2018).

De acordo com Tijani et al. (2019), o centro da origem da espécie S. monbim é o

continente americano onde é amplamente distribuída nos países trópicos, em áreas costeiras,

A

B

B

5

como maior frequência na Nigéria e Brasil. No Brasil tem maior ocorrência nas florestas

Amazônicas e Atlânticas, possuindo assim, uma grande variabilidade genética, identificando a

presença de açúcares redutores, alcalóides, glicosídeos cardíacos, flavonoides, taninos,

saponinas, esteróides, e terpenóides (TIJANI et al., 2019)

Avaliados os parâmetros físico-químicos por Brito et al. (2018), detectaram que a S.

mombin possui a capacidade antiulcerogênica, intermediada por atividade antioxidante,

provocando a produção de muco gástrico, agindo como um antissecretor, anti-Helicobacter do

ácido gástrico no estômago. Além disso, a pesquisa constatou que a fruta inclui compostos

fenólicos na sua composição, possibilitando a ação da atividade antioxidante, trazendo poder

de reduzir inflamações (BRITO et al., 2018). Lourenço et al. (2018) também analisaram a

planta e relataram que, as folhas, polpa e epicarpo são ricos em beta-criptoxantina que é um

pigmento natural com funções antioxidantes, como também a luteína, flavonoides e

compostos fenólicos. Ainda segundo Tiburski et al. (2011), a polpa do cajá manga contém

taninos e níveis de vitamina C.

A espécie possui diversos benefícios terapêuticos. Segundo estudos feitos por Sampaio

et al. (2018), afirmam que o extrato hidroetanólico derivado das folhas da S. mombin é

eficiente no combate a sintomas decorrentes da ansiedade e depressão como: insônia, insônia,

taquicardia, palidez, aumento da respiração, tensão muscular, tremor, tontura e distúrbios

como doenças intestinais, agindo como ansiolíticos e antidepressivos. Além disso, Nwidu et

al. (2018) realizaram estudos na Nigéria, onde avaliaram o efeito hepatoprotetores e

antioxidantes dos extratos metanólicos de folhas e caules para o tratamento de doenças

hepáticas, do qual obtiveram resultados significativos.

S. purpurea é uma espécie nativa das florestas tropicais secas do México e da América

Central (TEJACAL et al., 2017). Na época da colonização europeia foram amplamente

cultivadas desde o México até as regiões setentrionais da América do Sul (MILLER &

SCHAAL, 2005). É caracterizada por raramente ultrapassar 7m de altura e possuir ramos que

se desenvolvem rente ao solo.

Seus frutos (Figura 2), no formato oval, são lisos, de cor verde quando imaturo,

amarelo alaranjado e vermelho quando maduro, com 5,5 centímetros de comprimento,

pesando entre 12 a 28 gramas (SILVA et al., 2018) com endocarpo espesso e fibroso (MUÑIZ

et al., 2018) podendo ser consumido in natura. Amadurece nos meses de inverno e floresce

em meados do verão.

De acordo com Muñiz et al. (2018), o fruto da S purpurea propicia uma elevada

densidade calórica, vitamina C, ácidos fenólicos (ácido gálico, ácido clorogênico), taninos,

6

flavonóides, e minerais que agem como antioxidantes naturais, protegendo o organismo de

doenças degenerativas crônicas, como o diabetes mellitus. Identificou-se também lipídios em

extratos de folhas, do qual contém na sua composição β- cariofileno, δ- caadineno, torreyol e

T-muurolol, carotenóides luteína entre outros compostos (SILVA et al., 2018). Além disso,

emestudos realizados Arshadi et al. (2015), com a semente da espécie, verificou-se que, a o

extrato feito com a semente auxiliou no tratamento de águas sintéticas e naturais, fazendo a

retirada de monopartículas de ferro. Na polpa da fruta in natura identificou-se a presença de

aldeídos, hidrocarbonetos terpênicos, cetonas, ésteres, álcoois (SILVA et al., 2018).

Figura 2. S. purpurea (ciriguela), fruto (A) e endocarpo (B). Fonte: LIMA, 2009;

SANTOS & COSTA, 2010.

A S. tuberosa pode atingir de 4 a 7 metros de altura, com folhas de 2 a 4 centímetros

de comprimento e diâmetros de 10 a 15 metros (BATISTA et al., 2015). De acordo com

Santos e Castro, (2010), em tupi-guarani é denominada de "ymbu", que significava "árvore

que dá de beber, apresenta sistema radicular responsável pela absorção de água, sais minerais

e pela fixação de vegetais, por meio de raízes longas difundidas horizontalmente, próximas à

superfície do solo, com espessuras de 20 cm de diâmetro e profundidades entre 10 e 30

centímetros. Seus frutos (Figura 3) do tipo drupa em formato esféricos e ovais possuem em

média 4 centímetros de diâmetro, com coloração amarelo esverdeada (SILVA et al., 2018),

com período de maturação entre os meses de janeiro e fevereiro e colheita de abril a dezembro

(NASCIMENTO et al., 2016). De coloração branca, as flores dispostas em ramos de 10 a 15

centímetros são actinomorfas e hermafroditas contendo 7 a 8 centímetros de diâmetro,

perianto apresentando 4 a 5 sépalas e pétalas (SANTOS e CASTRO, 2010). Floresce quase

A B

7

sempre um pouco antes das primeiras chuvas quando ainda sem folhas, ou no início das

chuvas quando já enfolhada.

Xerófita e endêmica do semiárido brasileiro por não haver ocorrência da espécie em

outras regiões do planeta (SANTOS e CASTRO, 2010) é considerada resistente, podendo

viver mais de cem anos sob estresse hídrico. Popularmente é conhecida como “árvore sagrada

da seca”, por fornecer águas que são armazenadas no interior de suas raízes, como também

pelo fruto que gera renda e suprimento animal (NASCIMENTO et al., 2016).

Figura 3. S. tuberosa, fruto (umbu, imbu) (A) e endocarpo (B). Fonte: GIDSICKI,

2014; SANTOS e COSTA, 2010.

Embora a S. tuberosa seja considerada endêmica do Brasil, ela não é encontrada em

todo o país, sua ocorrência tem maior predominância na vegetação Caatinga, nos Estados do

Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas e a Chapada Diamantina na

Bahia (INSA, 2015) onde é indicada como cultura promissora por possuir capacidade

agrossocioeconômica (MEDEITOS et al., 2015), e agroflorestal sendo usada para recuperação

e reflorestamento de áreas degradadas. Inúmeros atributos são dados à espécie, ressaltando

sua importância na função sociocultural, ambiental e medicinal (SANTOS, 2008).

Por isso, vários estudos foram realizados devidos às propriedades existentes na S.

tuberosa. Avaliações físico-química afirmam que a espécie estudada apresenta alto teor de

compostos fenólicos, exercendo assim, a atividade antioxidante no organismo (SILVA et al.,

2018), como também possui vitamina C, carotenoides, antocianinas e flavonoides (Silva et al.,

A B

8

2014), atividade antifungicida (CORDEIRO et al., 2018), antidiabéticos (BARBOSA et al.,

2018), e antiinflamatória (SIQUEIRA et al., 2016).

A exploração de seus frutos é baseada no extrativismo através de pequenos e médios

produtores rurais, que comercializam in natura, para a confecção de polpas, doces, geleias. Os

frutos ganharam destaque no setor alimentício, como também no comercial devido ao

excêntrico sabor agridoce (SILVA et al., 2018).

A S. cytherea (Figura 4), também conhecida como maçã dourada ou porco-ameixa, é

nativa da Polinésia Francesa, introduzida na Jamaica em 1782 sendo cultivada principalmente

na região do Caribe, Ásia, América Central, América do Sul e, em menor medida, na África

(FOURNET, 2002). Introduzida no Brasil em 1985 e cultivada principalmente na região

Nordeste do país, onde a espécie passou a ser mais conhecida pelo nome popular cajá-manga

(LAGO-VANZELA et al., 2011). É uma árvore de médio porte, medindo de 15 a 25 metros de

altura (FOURNET, 2002). O fruto do tipo drupa (Figura 4), elipsoidal, ovoide, de cor amarelo

brilhante, contém em seu interior um endocarpo com espinhos longos e encurvados que

penetram na polpa, possuindo 9 centímetros de diâmetros e pesando, aproximadamente, 100

gramas (UMSZA-GUEZ, 2011). Com casca fibrosa e tenra, possui sabor agridoce e ácido, e

aroma agradável. Estima-se que 60% da massa dos frutos é constituído de polpa, sendo muito

utilizado na preparação de sucos, sorvetes, vinhos e licores, sendo importante para economia

(ALMEIDA et al., 2011).

Figura 4. S. cytherea, (cajá manga), árvore, folhas (A), frutos e endocarpo (B). Fonte:

PARMACH, 2018.

A

B

9

O período de colheita do fruto é curto (UMSZA-GUEZ, 2011), por isso é considerado

um fruto climatérico, com períodos de maturação divididos em cinco ciclos diferentes

consonantes com as características físico-químicas (AROUCHA et al., 2012; SANCHES,

2017). Assim sendo, os frutos da espécie apresentam em sua composição teores de pectina,

cinzas, lipídios, carboidratos totais e baixo teor de umidade, permitindo ser usada pela

medicina no tratamento de doenças.

Suas propriedades terapêuticas têm despertado o interesse de vários estudiosos.

Segundo Yolande et al. (2018), a casca da S. cytherea é usada no Peru no preparo de soluções

antissépticas para pele e mucosas. Já suas raízes são utilizadas para o tratamento de febres,

dores de cabeças, enxaquecas e diarreia. As folhas por sua vez, são usadas no método de

infusão para o combate da gonorreia, cistite e uretrite, com também no tratamento de

infecções oculares. Por conseguinte, o extrato metanólico confirmou a presença de atividades

antimicrobianas, atividades antioxidante, citotóxica e trombolítica (YOLANDE et al., 2018).

Recentes estudos realizados por Machado et al. (2015), tem trazido à comunidade

científica a descoberta de uma nova espécie pertencente ao gênero Spondias, denominando-a

de S. bahiensis, conhecida popularmente como umbucajá e cajarana. A S. bahiensis foi uma

espécie considerada por muito tempo híbrida da S.monbim e S. tuberosa. Ela é uma árvore

considerada de baixo porte por possuir altura de 6 a 8 metros, facilitando a coleta dos frutos.

Seus frutos (Figura 5), que possuem coloração verde-amarelado quando maduro

(CARVALHO et al., 2008), são do tipo drupa de formatos piriformes a oval (ARAÚJO et al.,

2018), possuem tamanhos de 2,5 a 3,5 centímetros, uma polpa grossa, com sabores menos

ácida, no entanto, semelhantes ao da S. tuberosa (MACHADO et al., 2015).

A

10

Figura 5. S. bahiensis, (umbucajá), fruto (A) e endocarpo (B). Fonte: MACHADO, et

al. 2015.

Possui flores com pétalas de 2 a 3 milímetros de comprimento (ARAÚJO et al., 2018),

e floração entre os meses de novembro e dezembro, período em que ocorrem as primeiras

chuvas, acontecendo consequentemente o surgimento dos frutos, dos quais entram em estado

de maturação entre os meses de fevereiro a março (MACHADO et al., 2015).

Araújo et al. (2018) consideram a S. bahiensis endêmica do Brasil, ocorrendo nos

estados de Alagoas, Pernambuco, Bahia e Sergipe, onde predomina a vegetação da Caatinga e

clima semiárido, podendo também, ocorrer em biomas como a Mata Atlântica. A espécie

possui grande valor econômico, nas regiões onde a presença gera renda para pequenos e

médios agricultores que cultivam e colhem seus frutos dela (OLIVEIRA et al., 2015).

Bem antes de ser considerada uma nova espécie, vários estudos foram realizados sobre

as características físico-química para garantir uma boa qualidade dos produtos derivados da S.

bahiensis. Com isso, foram disseminando estudos sobre suas características como os de

Franco et al. (2000), que identificaram mais de vinte compostos voláteis, já Silva, et al.,

(2015), que identificaram em seus estudos a presença de flavonoides, pectina, carotenoides,

entre outros; Dutra et al. (2017), por sua vez avaliaram a atividade antioxidante, e Soares et

al. (2017) avaliaram a qualidade microbiológica. Dessa forma, é possível destacar a

importância para sociedade, e sabendo dos inúmeros benefícios, faz-se necessário manter a

espécie em conservação.

De acordo com Araújo et al. (2018), o principal meio de propagação da S. bahiensis, é

por estacas, parte vegetativa da espécie, de 35 centímetros de comprimento e 1,5 centímetros

de diâmetro. No entanto, os autores ainda afirmam que é possível realizar a propagação por

meio de sementes, possibilitando realizar a seleção das melhores plantas, futurando alta

qualidade e produção da mesma.

2.2. Importância Econômica das Spondias

2.2.1 Spondias na Agroindústria

Muito presente e de fácil propagação nas regiões norte e nordeste do Brasil, os

espécimes pertencentes ao gênero Spondias, são considerados árvores frutíferas, produzindo

frutos de sabores pouco ácidos e com bastante valores nutricionais. Já no ano de 1997 a

11

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa, publicava um artigo científico

mostrando a importância econômica dos frutos da S. tuberosa para a geração de renda de

pequenos agricultores. Hoje, todas os espécimes pertentes ao gênero possuem valores

econômicos para médios e pequenos produtores, que comercializam os frutos em feira livres

de hortaliças e frutas como também para a indústria (BRASIL, 2005). No entanto, é de

conhecimento que sua maior produção corresponde ao setor da agroindústria. Os frutos são

utilizados para a produção e comercialização de sucos, geleias, doces, picolés, podendo do

mesmo modo ser consumido in natura (VIANA et al., 2015).

De acordo com os dados coletados do censo agropecuário do Sistema IBGE de

Recuperação Automática – SIDRA (2018), no ano de 2017 o Brasil produziu na extração

vegetal 1.938 toneladas da Spondia sp. (cajarana) e 5.905 toneladas da S. tuberosa (umbu).

Ainda segundo o SIDRA (2018), a quantidade produzida na extração vegetal deu destaque a

região nordeste, elencando como a maior produtora, totalizando em 1.231 toneladas da

Spondias sp. e 5.723 toneladas da S. tuberosa, ficando em segundo lugar a região nordeste

com 629 toneladas da Spondias. sp. Assim sendo, os estados com maior produção são: 1º)

Bahia com 641 toneladas da Spondias. sp. e 5.272 para a S. tuberosa, 2º) Rio Grande do norte

com 80 toneladas da Spondias. sp. e 203 toneladas para S. tuberosa, 3º) Paraíba com 67

toneladas da Spondias sp. e 168 toneladas da S. tuberosa. Todos esses números resultaram em

valores aproximados aos dois milhões e meio de reais para a economia brasileira.

O controle de qualidade dos seus frutos foram destaque em diversos trabalhos, entre

eles estão: características físico-química e microbiológica (GUIMARÃES et al., 2020 e

RIBEIRO et al., 2017) composição nutricional (OLIVEIRA et al., 2018), pH, sólidos

solúveis, acidez titulável, ácido ascórbico e umidade (MOURA NETO et al., 2015),

temperatura (OLIVEIRA et al., 2014; KOHATSU et al., 2011), resultado de sua valorização

econômica.

Além do que já foi citado, segundo as afirmações de Mattietto (2005), os frutos da S.

monbim tem apresentado ser aromatizante, sendo identificado trinta e três (33) compostos.

Com isso, a espécie se destaca ainda mais no mercado e ganha também espaço no setor de

cosméticos e perfumarias, confirmando o seu valor econômico.

2.2.2 Propriedades farmacológicas das Spondias

Já utilizada há muitos anos pela medicina popular para o tratamento de diferentes

doenças, as espécies do gênero Spondias têm despertado o interesse da indústria farmacêutica

12

quanto a suas propriedades e benefícios. Para os espécimes presente neste trabalho, foram

publicados diversos artigos científicos divulgando os resultados das investigações realizadas

em suas pesquisas.

Diante disso, o estudo de Sampaio et al., (2018), nos mostra que o extrato

hidroetanólico das folhas de S. mombin foram utilizados como ansiolítico e antidepressivo

para a espécie aquática peixe-zebra. No trabalho de Brito et al., (2018), foi avaliada a

atividade antiulcerosa através do extrato etánolico das folhas. Ainda sobre a S. mombin, o

estudo publicado PAKOUSSI et al., (2018) nos mostra que extratos das folhas são

responsáveis pelo aumento das contrações no músculo liso uterino facilitando o parto. Além

disso, foi percebido a presença do ácido gálico e ácido elágico, responsáveis pela propriedade

antioxidante, nos extratos para a espécie S. monbin. Além das propriedades terapêuticas, de

acordo com o estudo de Eze et al., (2014), o extrato da folha possui atividade larvicida,

combatendo a disseminação dos mosquitos da dengue, malária, por possuir produtos bioativos

na sua composição.

Estudos realizados por Barbosa et al., (2018) tiveram como objetivo avaliar os efeitos

do extrato hidroetanólico da casca do caule da espécie S. tuberosa nos valores glicêmicos de

ratos diabéticos, no entanto, também foram observados outros efeitos sendo satisfatório para a

pesquisa. A Inserção do extrato, não só reduziu a glicose, como também o volume urinário, o

consumo de alimentos e água, resultando na diminuição do ganho de massa corpórea. Além

disso, os estudos publicados por Santos et al., 2019 e Cordeiro et al., 2018 que utilizaram

extratos de hidroalcóolicos da folha e raízes da S. tuberosa foram satisfatórios, comprovando

que possuíam atividades antioxidantes e antifúngica. A espécie ainda possui atividade anti-

inflamatória, que foi investigada pelo estudo publicado por Siqueira et al., 2016.

A S. purpurea, possui estudos sobre sua atividade anti-inflamatória, como podemos

ver no artigo publicado no Jornal of Food Science no ano de 2017 por VILLA-HERNÁNDEZ

e colaboradores. Esse estudo objetivou analisar a atividade in vitro e in vivo, obtendo ao

término da pesquisa resultados satisfatórios para os testes realizados. Assim como o estudo

anteriormente apresentado, Almeida et al., (2017), realizou uma pesquisa sobre a atividade

anti-inflamatória, buscando também investigar a atividade antiulcerosa do extrato das folhas.

Os ensaios apresentaram resultados eficientes quanto a atividade anti-inflamatória e

antiulcerosa, aumentando os níveis de glutationa reduzida, consequentemente também reduziu

o fator de necrose tumoral (ALMEIDA et al., 2017). Além disso, segundo o a pesquisa

publicada por Arshadi et al., (2015), resíduos da semente possuem a capacidade de adsorção

para remover íons de fosfatos de águas residuais e naturais.

13

Yolande et al., (2018), propôs em seu estudo avaliar a atividade anticâncer através do

extrato da fruta da S. cytherea. Os resultados encontrados mostraram que os ensaios

realizados in vivo reduziram o aparecimento de tumores causados pelo melanoma, afirmando

que os frutos da S. cytherea pode ser uma alternativa futura para a fabricação medicamentos.

2.3. Marcadores Barcodes em plantas

Sistemas de identificação moleculares pretendem realizar a discriminação de todas as

espécies vivas do planeta através da utilização de um pequeno segmento padronizado de

DNA. Esta abordagem representa uma estratégia promissora para o diagnóstico da

biodiversidade. Em termos reais, essas sequências podem ser vistas como um “código de

barras” que estão contidos em todas as células. O código de barra universal dos produtos,

utilizado para identificar produtos do mercado varejista empregam 10 algarismos alternados

com 11 posições para gerar 100 bilhões de identificadores únicos. Códigos de barras

genômicos têm apenas quatro nucleotídeos alternados em cada posição, mas a sequência de

locais disponíveis para a inspeção é maior. Nas células o DNA mitocondrial (mtDNA) se

organiza em nucleóides incluindo DNA e inúmeras proteínas, em estruturas organizadas,

possibilitando armazenamento, transmissão de informação genética (KOLESNIKOV, 2016).

O DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido aplicado em estudos filogenéticos de animais,

porque sua evolução é muito mais rápida do que o DNA nuclear, resultando na acumulação de

diferenças entre espécies estreitamente relacionadas (OEY et al., 2019; BURNARD e SHAO,

2019). Se uma pequena região do mtDNA que diferencia espécies fosse encontrada e aceita

como um padrão, formando uma biblioteca de sequências ligadas aos espécimes de referência,

ele seria então um identificador de uma sequência para as espécies, um ''DNA barcode''. E

então foi proposto que o sistema de código de barras do DNA para o reino animal poderia se

basear na diversidade de uma parte da sequência do gene da subunidade I do citocromo

oxidase (COI ou Cox I), um gene mitocondrial. A sequência de código de barras primário é

formada pelo segmento de 648 nucleotídeos da extremidade 5’ do gene mitocondrial

Citocromo c Oxidase I (COI).

Para Hebert et al., (2003), essa região possui uma série de características consideradas

vantajosas para o seu uso como: (1) por ser uma região curta pode ser obtida facilmente para

um grande número de táxons com um único par de primers; (2) é uma sequência facilmente

alinhada; (3) é informativa para distinguir espécies próximas, pois possui variabilidade

semelhante a outros genes codificadores de proteínas. A evolução deste gene é

14

suficientemente rápida para permitir a discriminação não só de espécies estreitamente aliadas,

mas também de grupos filogeográficos dentro de uma única espécie (COX e HEBERT, 2001;

WARES e CUNNINGHAM, 2001).

DNA barcode, é visto como uma ferramenta útil para taxonomistas e um sistema de

custo-benefício com que os não-especialistas podem atribuir espécies não identificadas para

conhecer novas espécies. Sua função essencial consiste na habilidade em identificar

corretamente um indivíduo dentro de uma espécie, ou de identificar a amostra como

pertencente a uma nova espécie, ainda não descrita, levando em consideração que até hoje

foram classificadas somente 1,7 milhões dos 10-50 milhões de espécies que se estima existir

no planeta.

Em maio de 2004 foi lançado o “Consortium for the Barcode of Life” – CBOL –

(www.barcodeoflife.org) com o objetivo de ajudar no desenvolvimento de um sistema capaz

de identificar todas as espécies do planeta baseado na utilização de um pequeno fragmento

padronizado de DNA. O CBOL agora inclui mais de 120 organizações de 45 nações;

promovendo o desenvolvimento de alianças internacionais de pesquisas necessários para que,

ao longo dos próximos 20 anos, seja construída uma biblioteca de código de barras de toda

vida eucariótica (RATNASINGHAM e HEBERT, 2007). Diversos consórcios foram criados

para auxiliar no estabelecimento do CBOL. Por exemplo, “The Lepidoptera Barcode of Life”

(www.lepbarcoding.org) que é um banco de dados de sequências de COI que auxilia na

caracterização das espécies de borboletas e mariposas; “All Birds Barcoding Initiative”

(www.barcodingbirds.org) que surgiu em 2005, visa reunir dados de aproximadamente 10.000

espécies conhecidas de pássaros de todo o mundo; “The Fish Barcode of Life Initiative (Fish-

Bol)” (www.fishbol.org) é uma biblioteca eletrônica de referência que contêm sequências de

COI de peixes, tanto de água doce quanto marinhos. O “Barcode of Life Data System” –

BOLD – (www.boldsystems.org) é uma base de dados on-line que auxilia na coleta, análise,

gestão e utilização de DNA barcodes (RATNASINGHAM e HEBERT, 2007).

Três princípios importantes do DNA barcode são: (i) padronização, (ii) minimalismo, e

(iii) escalabilidade. O padrão animal de DNA barcode, o COI, se encaixa bem nesses critérios

(HEBERT, 2003). No entanto, a aplicação do DNA barcoding em plantas, apesar de

aparentemente simples, tem sido mais complexa do que o esperado. A baixa taxa de

substituição de nucleotídeos no genoma mitocondrial das plantas impede o uso do COI como

um DNA barcode universal (FAZEKAS et al., 2008), pois eles evoluem mais lentamente em

plantas do que em animais. Então, na busca de um barcode para plantas era necessário

procurar externamente ao genoma mitocondrial, sendo aceito que múltiplos marcadores

15

seriam necessários para fazer a discriminação das espécies (HOLLINGSWORTH et al.,

2011). Alguns números de regiões de genes foram sugeridos como candidatos para possíveis

barcodes, mas nenhum deles foi totalmente aceito pela comunidade científica de taxonomistas

(LEDFORD, 2008; FAZEKAS et al., 2008; LAHAYE et al., 2008; ERICKSON et al., 2008;

HOLLINGSWORTH et al., 2009). Vários fatores devem ser considerados na hora de

selecionar um DNA barcode para plantas: otimização da reação de PCR, amplo poder de

diversidade taxonômica, diferenciação de espécies e fácil análise em bioinformática (KRESS

e ERICKSON, 2007).

A partir de investigações iniciais de regiões plastidiais (CHASE et al., 2007; FORD et

al., 2009), 7 genes de barcode em plantas surgiram como candidatos principais (PENNISI,

2007; LEDFORD, 2008). Quatro são porções que codificam genes (matK, rbcL, rpoB, e

rpoC1), e três são espaçadores correspondentes a genes não codificantes (atpF-atpH,

trnHpsbA, e psbK-psbI).

As regiões não codificantes, especialmente trnh-psba, têm um forte potencial como

DNA barcodes, mas sofrem com problemas técnicos de produzir sequências de baixa

qualidades devido à presença de longas repetições de nucleotídeos. Tais repetições podem

fazer com que as sequências sejam mal interpretadas. E o progresso com uma região de

barcode de dois locis seria mais barato e mais rápido do que com uma região de três-locis,

especialmente se a terceira região é não-codificante e requer edição de sequência manual. O

grupo concluiu que o sucesso na resolução de problemas com primers de matk é mais

provável do que a solução de problemas da qualidade de sequência para trnh-psba e

recomendou-se rbcl e matk como um barcode de dois locis (CBOL Plant Working Group,

2009).

16

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material vegetal

O material vegetal utilizado neste trabalho consistiu em amostras de folhas jovens das

espécies Spondias mombim, Spondias tuberosa, Spondias purpurea, Spondias bahiensis e

Spondias cytherea coletadas nos Estados do Rio Grande do Norte e da Paraíba A tabela 1

mostra as espécies coletadas e as coordenadas geográficas no momento da coleta de folhas.

Para cada tipo de Spondias foram coletadas 4 amostras de folhas e identificadas de A a Z

respectivamente.

Tabela 1. Identificação das amostras de folhas de Spondias coletadas e coordenadas

geográficas no momento da coleta. Modificado a partir de Moura (2012).

Amostra Planetas coletas Latitude Longitude

A S. mombin 5° 46'43.32"S 35°12'23.31"O

B S. mombin 5°56'21.10"S 35°15'50.10"O

C S. mombin 5°56'21.10"S 35°15'50.10"O

D S. mombin 5°37'43.04"S 35°36'13.08"O

E S. bahiensis 5°38'52.05"S 35°27'11.75"O

F S. bahiensis 5°15'32.08"S 36°51'39.08"O

G S. bahiensis 5°37'43.04"S 35°36'13.08"O

H S. bahiensis 5°12'37.78"S 37°02'00.50"O

I S. purpurea 5°38'51.23"S 35°17'26.32"O

J S. purpurea 5°38'50.39"S 35°17'26.32"O

K S. purpurea 6°22'47.33"S 35°08'42.13"0

L S. purpurea 6°05'47.33"S 35°12'31.10"O

M S. tuberosa 7°12'10.01"S 37°15'34.83"O

N S. tuberosa 7°12'10.01"S 37°15'34.83"O

O S. tuberosa 6°41'45.63"S 36°39'38.74"O

P S. tuberosa 6°54'58.42"S 37°26'55.73"O

Q S. cytherea 5°38'50.69"S 35°17'25.92"O

R S. cytherea 5°38'51.00"S 35°17''26.65"O

S S. cytherea 5°26'48.06"S 36°50'52.01"O

T S. cytherea 5°26'48.06"S 36°50'52.01"O

U S. bahiensis 5º32’44.0’’S 36º52’23.5’’W

V S. bahiensis 5º32’43.8’’S 36º52’24.8’’W

W S. bahiensis 5º32’43.5’’S 36º52’26.3’’W

Y S. bahiensis 5º32’43.4’’S 36º52’24.7’’W

17

X S. bahiensis 5º32’43.4’’S 36º52’23.3’’W

Z S. bahiensis 5º32’42.9’’S 36º52’26.2’’W

As coletas dos espécimes de S. Bahiensis (no mapa como Spondias sp) foram feitas na

Estação Experimental da Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte –

EMPARN, localizada no povoado de base física, as margens da RN 118, em Ipanguaçu, além

de uma amostra em Parelhas e outra no município de Ceará Mirim conforme mostra a figura

6. S. tuberosa foi coletada em Lajes no Rio Grande do Norte e em Maturéia no Estado da

Paraíba e S. purpúrea, S cytherea e S. mombin em Natal.

Figura 6. Localidades de coletas dos espécimes de Spondias utilizadas para extrações

de DNA genômico.

3.2 Extração de DNA

No laboratório de Genética Molecular de Plantas e Biointerações da UFRN foi

extraído DNA com o uso da técnica de Romano & Brasileiro (1999), sendo adaptado na sua

utilização. O protocolo de extração consistiu em submeter o material vegetal a 300 μl de

tampão de extração contendo CTAB Merck [CTAB, NaCl 5M, Tris-HCl 1M, EDTA Merck

500mM, β-mercaptoetanol] e triturar a amostra com pistilo. Após a trituração, mais 200 μl de

tampão CTAB foi adicionado. Seguiu-se a uma incubação em banho-maria a 67°C por 30

18

minutos. Em seguida, o tubo de extração foi adicionado de 500 μl de clorofórmio: álcool

isoamílico (24:1) para extração. Procedeu-se a uma centrifugação a 10.000 g em centrifuga

HERMLE Z326K por 10 minutos e a fase aquosa foi removida para um novo tubo. Em

seguida, adicionou-se 300 μl de isopropanol (Vetec) 60% gelado, para precipitação do DNA,

seguido de uma centrifugação por 20 minutos. Em seguida, removeu-se o isopropanol, e o

DNA foi lavado com 300 μl de etanol (Merck) 70% gelado, centrifugado por 3 minutos e o

precipitado obtido foi posto para secar a temperatura ambiente por 30 minutos. O DNA foi

então ressuspendido em 50 μl de água destilada autoclavada e estocado a -20°C.

3.3 Condições de Amplificação e análise em gel de agarose

Os primers para barcode em plantas utilizados foram rbcL, matK, trnG-trnS, trnH-

psbA, rpoB, e rpoC1, para amplificar os espécimes de S. mombin, S. tuberosa, S. purpurea, S.

bahiensis, S. cytherea. As PCRs foram realizadas em termociclador Techne, com protocolo

padrão adaptados para cada marcador. As reações de base para as amplificações feitas

seguiram o seguinte padrão: tampão 2,0 μl [1X final]; MgCl2 1,0 μl [2,5 mM final]; dNTPs

0,8 μl [0,4mM final]; primers forward e reverse 2,0 μl [20 mM final]; Taq polimerase 0,2 μl

[1U final]; DNA 1,0 μl e H2O 14,8 μl, em volume final de 25 μl. As condições de

amplificação, bem como as sequências dos primers podem ser visualizadas nas tabelas 2 e 3.

Para analisar os produtos de PCR obtidos após as amplificações foram aplicados 5,0 μl

de produto de PCR + 1,0 μl de tampão de corrida. As amostras foram submetidas à

eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio e o gel visualizado sob

transiluminador de luz UV.

Tabela 2. Sequências de primers utilizados para amplificações de marcadores barcode

em plantas de Spondias mombim, Spondias tuberosa, Spondias purpurea, Spondias bahiensis

e Spondias cytherea.

Primer Sequência 5’ - 3’

rbcLa_f ATGTCACCACAAACAGAGACTAA

rbcLa_r CTTCTGCTACAAATAAGAAATCG

matK 2,1f CCTATCCATCTGGAAATCTTAG

matK 5r GTTCTAGCACAAGAAAGTCG

trnS GCCGCTTTAGTCCACTCAGC

trnG GAACGAATCACACTTTTACC

trnH-psbA f GTTATGCATGAACGTAATGCTC

trnH-psbA r CGCGCATGGTGGATTCACAATCC

rpoB 2f ATGCAACGTCAAGCAGTTCC

19

Tabela 3. Condições de PCR para amplificações de marcadores barcode em plantas de

Spondias mombim, Spondias tuberosa, Spondias purpurea, Spondias bahiensis e Spondias

cytherea.

rpoB 4r GATCCCAGCATCACAATTCC

rpoC1 3f TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC

rpoC1 1r GTGGATACACTTCTTGATATTGG

Primer Desnaturação

inicial

Ciclagem Extensão

Final

rbcL 95°C por 3 min 40X [1’ a 94°C; 30’’ a 45°C; 2’ a 72°C] 10’ a 72°C

matK 95°C por 3 min 1 40X [30” a 94°C; 45’’ a 49°C; 1’ a 72°C] 10’ a 72°C

matK 95°C por 3 min 2 40X [30” a 94°C; 1’ a 47°C; 1’ a 72°C] 10’ a 72°C

matK 95°C por 3 min 3 40X [30” a 94°C; 1’ a 51°C; 1’ a 72°C] 10’ a 72°C

matK 95°C por 3 min 4 40X [30” a 94°C; 1’ a 53°C; 1’ a 72°C] 10’ a 72°C

trnG-

trnS.

94°C por 5 min 30X [1’ a 94°C; 45” a 58°C; 1’ a 72°C] 5’ a 72°C

trnH-

psbA.

95°C por 4 min 35X [30” a 94°C; 1’ a 55°C; 1’ a 72°C] 10’ a 72°C

rpoB. 94°C por 1 min 35X [30” a 94°C; 40’’ a 50°C; 40” a 72°C] 10’ a 72°C

rpoC1. 94°C por 1 min 35X [30” a 94°C; 40’’ a 53°C; 40” a 72°C] 10’ a 72°C

20

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Viabilidade do uso de marcadores barcode universais em Spondias

O objetivo principal deste trabalho foi de contribuir na utilização de marcadores

moleculares barcode num gênero específico em plantas, no caso, no gênero Spondias. Isto

porque, apesar de esforços importantes terem sido feitos nesta área, permanece sem consenso

com relação à qual seria o marcador ideal para espécie de plantas (KRESS, 2017). Neste

sentido, utilizou-se uma estratégia de trabalho que consistiu em testar os principais primers

utilizados em plantas (rbcL, matK, trnG-trnS, trnH-psbA, rpoB, e rpoC1) tendo como foco o

gênero em questão. Isto porque neste grupo de plantas há poucos dados moleculares bem

como dúvidas quanto a identificação de espécies que poderiam mais bem elucidadas.

O primeiro resultado a ser considerado diz respeito, especificamente, à amplificação

por PCR do DNA genômico das plantas coletadas. Neste sentido, leva-se em conta a

eficiência dos marcadores barcode quanto à obtenção de bandas únicas e do número de cópias

da região a ser da região amplificada e a intensidade da banda, para que seja possível o seu

sequenciamento. Os resultados obtidos para este parâmetro estão na figura 7 em que se mostra

um gel de eletroforese de DNA com os resultados das amplificações de PCR para os primers

utilizados.

Figura 7. Amplificações de PCR obtidas com os primers rbcL (1-5), trnG-trnS (6-10),

psbA-trnH (11-15), rpoB (16-20), rpoC1 (21-25) e matK (26-30) analisadas em gel de agarose

1,5%. M. marcador 50bp DNA Ladder. Plantas A (S.mombim), J (Spondias sp), M

(S.purpurea), P (S.tuberosa) e R (S.cytherea) da esquerda para a direita, para cada conjunto de

primers. Modificado a partir de Moura (2012).

As amplificações de PCR realizadas com os 6 marcadores moleculares empregados

foram exitosas uma vez que todas elas proporcionaram a obtenção de bandas de tamanho

21

esperado para os primers adicionados às reações. No entanto, observam-se diferenças quanto

a intensidade das bandas obtidas. Os primers rbcL e trnG-trnS apresentaram um padrão de

amplificação mais discreto do que aquele obtido para os marcadores psbA-trnH, rpoB e

rpoC1 com os quais foram obtidas as melhores amplificações do experimento. Já para o gene

matK o padrão de bandas obtido foi o mais heterogêneo entre as plantas bem como na

intensidade das bandas. Com este marcador, especificamente, somente foram obtidas

amplificações com a realização de ajustes nas condições de PCR através da alteração dos

programas de ciclagem conforme tabela 3 já apresentada neste trabalho.

A eficiência dos primers utilizados já foi testada por diversos autores que relatam

resultados muito semelhantes aos aqui obtidos para os marcadores rbcL e trnG-trnS ou rpoB e

rpoC1 (PARVEEN et al, 2017). Para o marcador psbA-trnH, que constitui um dos mais

eficientes barcodes em plantas atualmente (KANG et al, 2017), nossos resultados também se

reproduzem. O gene matK, indicado em 2009 juntamente com o rbcL como os marcadores

universais em plantas (KREES, 2017), se mostrou de difícil amplificação. Ele é, sem dúvida,

segundo a literatura, um bom barcode para a identificação de indivíduos, mas apresenta

recorrente dificuldade de amplificação o que o se observou aqui, bem como em outros

trabalhos (SINGH et al, 2012).

As amplificações de PCR realizadas permitiram o sequenciamento (sequências no

anexo 1) de fragmentos para 5 dos marcadores utilizados com exceção das amplificações

feitas com o gene matK, que gerou bandas múltiplas e de diferentes tamanhos. As sequências

obtidas permitiram a construção de árvores filogenéticas para o grupo em estudo. A figura 8

mostra estas árvores obtidas com as sequências geradas pelos primers rpoC1, rbcL e psbA-

trnH respectivamente. Nas três situações, observa-se que as plantas de Spondias, neste

trabalho, se agrupam em um “cluster” específico confirmando e validando o sequenciamento

obtido. No entanto, há alterações quanto a filogenia dentro do grupo entre as 5 espécies

estudadas em função dos primers utilizados. Por outro lado, a situação da Spondias sp., a

cajarana, que potencialmente poderia ser um híbrido entre S. mombin e S. tuberosa é

interessante. Isto porque, nas três árvores obtidas, ela parece estar, de um ponto de vista da

filogenia, mais próxima à S. tuberosa que, em princípio, poderia ser seu parental.

22

Figura 8. Árvores filogenéticas geradas a partir de sequências de espécimes de

Spondias (S.mombin, Spondias sp, S.purpurea, S.tuberosa, S.cytherea.) coletadas (A, rpoC1;

B, rbcL; C, psbA-trnH) e com demais sequências obtidas em bancos de dados públicos

(genbank).

23

4.2 Abordagem barcode em Spondias bahiensis

A outra abordagem alvo deste trabalho foi a de acessar, através do uso de marcadores

barcode, a possível variabilidade no caso das Spondias sp., a cajarana. Até 2015, quando da

publicação de Machado et al (2015), esta planta, ainda não identificada a nível de espécie, era

considerada um híbrido comumente denominado de umbu-cajá por apresentar características

taxonômicas possivelmente presentes nos seus potênciais genomas parentais, Spondias

tuberosa e Spondias mombin. A planta, que apresenta caraterísticas de uma provável

domesticação no Nordeste brasileiro, uma vez que está sempre presente em agrupamentos

humanos segundos os mesmos autores, foi estudada por este grupo a partir de coletas

realizadas nos estados da Bahia e de Pernambuco. Neste estudo, que envolveu tanto a

abordagem molecular quanto a taxonomia clássica, se chegou a conclusão de que cajarana

seria uma nova espécie e não um híbrido. Isto com base em diferentes parâmetros

taxonômicos e pela análise molecular de reconstituição filogenética realizada. A planta então

recebeu o nome de Spondias bahiensis. Estes resultados foram contestados mais recentemente

por Nobre et al (2018) que utilizaram uma abordagem de sequenciamento de alta performance

dos de fragmentos dos genomas de S. tuberosa, S. bahiensis e de S. mombin. Neste estudo,

que envolveu a identificação de polimorfismos de uma única base (SPNs em inglês) nas três

plantas chegou-se à conclusão que S. bahiensis teria uma origem hibrida com parentais

feminino S. tuberosa e masculino S. dulcis divergindo de Machado (2015) que supõem

possíveis genomas parentais como sendo os de S. tuberosa e S. venulosa.

As cajaranas dos estados da Paraíba e do Rio Grande do Norte não foram analisadas

no trabalho de Machado et al (2015) e constituem, como citado acima, um dos objetivos desta

dissertação. Neste sentido, e aproveitando-se de que na caraterização da Spondias bahiensis

foram geradas sequências para os marcadores barcode psbA-trnH tal como no presente

trabalho, procurou-se aqui estudar a situação das cajaranas presentes nesta região numa

abordagem comparativa. As coletas realizadas permitiram as amplificações da mesma região

com os barcodes psbA-trnH. A sequência aqui obtida é 99.67% idêntica àquele presente no

genoma plastidial de S. tuberosa diferindo apenas em 2 nucleotídeos (957/599 nucleotídeos).

Isso demonstra fortemente a presença, na cajarana, de um possível genitor feminino, a S.

tuberosa, na existência de eventual híbrido dado também observado por Nobre et al (2018),

autores que afirmam o caráter híbrido em S. bahiensis. Quando a mesma sequência aqui

obtida é comparada àquela de S. bahiensis, presente no seu genoma plastidial, a cajarana

apresenta 97.69% de identidade (592/606 nucleotídeos). Isto explica a proximidade e o

24

agrupamento da Spondias sp. com a S. tuberosa também observado aqui neste trabalho com o

uso dos marcadores rpoC1 e rbcL. Por esta razão, a árvore filogenética apresentada na figura

9 mostra a Spondias sp e o genoma plastidial da Spondias tuberosa tendo o mesmo ancestral

comum. Da mesma maneira, a sequência de Spondias tuberosa que obtivemos e que se

ramifica na mesma posição dá suporte a afirmação de que no genoma da cajarana há

provavelmente o caráter híbrido discutido. Na mesma árvore, Spondias bahiensis e Spondias

venulosa apresentam um mesmo ancestral comum confirmando a suposição de Machado et al

(2015) para quem S. venulosa seria um potencial parental de S. bahiensis. S. purpurea e S.

cytherea estão na árvore para compor a filogenia e são mais distantes evolutivamente de

Spondias sp. É interessante observar que S. mombin e S. cytherea dividem um mesmo ponto

de ramificação. A suposição recorrente de que a cajarana que se distribui pelo Rio Grande do

Norte seria um híbrido de S. mombin e S. tuberosa resta a ser investigada com mais

ferramentas moleculares.

Figura 9. Árvore filogenética gerada com pacote MEGA a partir de sequências

obtidas com 4 espécies de Spondias (nome acrescido de PSB) e com sequências de bancos de

dados públicos (genbank).

25

5. CONCLUSÕES

As abordagens aqui desenvolvidas que visavam testar seis tipos de marcadores de

DNA barcode em plantas de Spondias bem como aportar informações adicionais à questão da

classificação da cajarana, Spondias bahiensis, foram exitosas sob diferentes aspectos.

Com relação a capacidade de utilização dos primers barcode rbcL, trnG-trnS, psbA-

trnH, rpoB, rpoC1 e matK conclui-se que todos, com exceção do gene matk, são capazes de

gerar boas amplificações de PCR, sequenciáveis, e passíveis de serem utilizadas na obtenção

de arvoes filogenéticas. Neste estudo, observou-se para três destes marcadores, rpoC, psbA-

trnH e rbcl que o grupo de Spondias se enraíza nas árvores num grupo monofilético

caraterístico. O gene matK mostrou-se de difícil amplificação em todos as plantas testadas,

requerendo ajustes nos programas de PCR e não se constitui num bom marcador para

Spondias.

A abordagem visando acessar a possível variabilidade observada na cajarana presente

nos estados da Rio Grande do Norte e Paraíba em comparação àquela da Spondias bahiensis

permitiu se chegar a conclusão, com o uso do marcador psbA-trnH, a partir das plantas

coletadas neste estudo, que não se pode afirmar que a cajarana (Spondias sp.) seja a mesma

que a Spondias bahiensis. Neste estudo conclui-se, no entanto, que a comparação de

sequência realizada entre o genoma plastidial de S. tuberosa e a sequência obtida neste

trabalho com os primers psbA-trn é idêntica reforçando a hipótese já citada na literatura que

S. tuberosa é o potencial genitor feminino de Spondias sp e de S. bahiensis.

26

LITERATURA CITADA

AGANETE, E. et al. Elementos constitutivos do conceito de taxonomia. Informação &

Sociedade: Estudos. v.20, n.3, p. 77-93, João Pessoa, set./dez. 2010.

ALMEIDA, C. L. F et al. Spondias purpurea L. (Anacardiaceae): antioxidant and antiulcer

activities of the leaf hexane extract. : Antioxidant and Antiulcer Activities of the Leaf Hexane

Extract. Oxidative Medicine And Cellular Longevity, [s.l.], v. 2017, p. 1-14, 2017. Hindawi

Limited. http://dx.doi.org/10.1155/2017/6593073.

ALMEIDA. E. I. B. et al. Maturação fisiológica de frutos de cajazeiras do Brejo paraibano.

Tecnologia & Ciência Agropecuária, v.5, n.2, p.5-10, João Pessoa, jun. 2011.

ARAÚJO, R. R. et al. Spondias bahiensis Umbu cajá. In: CORADIN, L.; CAMILLO, J.;

PAREYN, F. G. C. Espécies nativas da flora brasileira de valor econômico atual ou

potencial: plantas para o futuro: região Nordeste. Brasília: Embrapa Agroindústria

Tropical, 2018. p. 279-286.

AROUCHA, E. et al. Qualidade pós colheita da cajarana em diferentes estádios de maturação

durante armazenamento refrigerado. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v. 34,

n. 2, p. 391-399, jun 2012.

ARSHADI, M. et al. Preparation of iron nanoparticles-loaded Spondias purpurea seed waste

as an excellent adsorbent for removal of phosphate from synthetic and natural waters.

Journal Of Colloid And Interface Science, [s.l.], v. 452, p.69-77, ago. 2015. Elsevier BV.

http://dx.doi.org/10.1016/j.jcis.2015.04.019.

BARBOSA, H. M. et al. Spondias tuberosa inner bark extract exert antidiabetic effects in

streptozotocin-induced diabetic rats. Journal Of Ethnopharmacology, [s.l.], v. 227, p.248-

257, dez. 2018. Elsevier BV. http://dx.doi.org/10.1016/j.jep.2018.08.038.

BATISTA, F. R. C. O. et al. Umbuzeiro e o semiárido brasileiro. Campina Grande: INSA,

2015. p. 72.: il. ISBN: 978-85-64265-26-4 1.

BRITO, S. A et al. Antiulcer Activity and Potential Mechanism of Action of the Leaves of

Spondias mombin L. Oxidative Medicine And Cellular Longevity, [s.l.], v. 2018, p. 1-20,

2018. Hindawi Limited. http://dx.doi.org/10.1155/2018/1731459.

BRITO, S. A. et al. Evaluation of gastroprotective and ulcer healing activities of yellow

mombin juice from Spondias mombin L. Plos One, [s.l.], v. 13, n. 11, p.1-16, 5 nov. 2018.

Public Library of Science (PLoS). http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0201 561.

27

BURNARD, D; SHAO, R. Mitochondrial genome analysis reveals intraspecific variation

within Australian hard tick species. Ticks Tick-Borne Diseases. v.10, p.677-681, 2019.

Elsevier. http//:dx.doi.org/10.1016/j.ttbdis.2019.02.013.

CARVALHO, P. C. L. et al. Características morfológicas, físicas e químicas de frutos de

populações de umbu-cajazeira no Estado da Bahia. Revista Brasileira de Fruticultura, [s.l.],

v. 30, n. 1, p.140-147, mar. 2008. FapUNIFESP (SciELO). http://dx.doi.org/10. 1590/s 0100-

29452008000100026.

CAVALCANTE, N. B et al. Importância Econômica do Extrativismo do Fruto do Imbuzeiro

(Spondia tuberosa Arr. Cam) para os pequenos agricultores do Semiárido brasileiro. 1997.

Disponível em: https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/165170/1/6923.pdf.

Acesso em: 23 mai. 2020.

CBOL PLANT WORKING et al. A DNA barcode for land plants. Proceedings Of The

National Academy Of Sciences, [s.l.], v. 106, n. 31, p.12794-12797, 30 jul. 2009.

Proceedings of the National Academy of Sciences. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0905

845106.

CHEN, J. et al. Identification of species and materia medica within Saussurea subg.

Amphilaena based on DNA barcodes. Peerj, [s.l.], v. 7, p.6357-6362, 1 fev. 2019. PeerJ.

http://dx.doi.org/10.7717/peerj.6357.

CORDEIRO, B. M. P. C. et al. Hexane extract from Spondias tuberosa (Anacardiaceae)

leaves has antioxidant activity and is an anti-Candida agent by causing mitochondrial and

lysosomal damages. Bmc Complementary And Alternative Medicine, [s.l.], v. 18, n. 1, p.1-

12, 19 out. 2018. Springer Nature. http://dx.doi.org/10.1186/s12906-018-2350-2.

COSTION, C. et al. Plant DNA Barcodes Can Accurately Estimate Species Richness in

Poorly Known Floras. Plos One, [s.l.], v. 6, n. 11, p.26841-26856, 11 nov. 2011. Public

Library of Science (PLoS). http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0026841.

COX, A. J.; HEBERT, P. D. N. Colonization, extinction and phylogeographic patterning in a

freshwater crustacean. Mol. Ecol., n.10, 371–386, 2001.

DUTRA, R. L. T. et al. Bioaccessibility and antioxidant activity of phenolic compounds in

frozen pulps of Brazilian exotic fruits exposed to simulated gastrointestinal conditions. Food

Research International, [s.l.], v. 100, p.650-657, out. 2017. Elsevier BV.

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2017.07.047.

EZE E. A, DANGA S. P, OKOYE F. B. Larvicidal activity of the leaf extracts of Spondias

mombin Linn. (Anacardiaceae) from various solvents against malarial, dengue and filarial

vector mosquitoes (Diptera: Culicidae). J Vector Borne Dis. 2014; 51(4):300‐306.

28

FAZEKAS, A. J.; BURGESS, K. S.; KESANAKURTI, P. R.; GRAHAM, S. W.;

NEWMASTER, S. G. et al. Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome

discriminate plant species equally well. PLoS ONE, 3: e2802, 2008.

FONSECA, N. Propagação e plantio do umbuzeiro (Spondias tuberosa Arr. Cam) para a

agricultura familiar do Semiárido Baiano. Embrapa Mandioca e Fruticultura, p. 23, ed. 21,

Bahia, 2015.

FOURNET, J. Anacardiaceae. P.1047-1054. In: Gondwana Editions (ed.), Flore illustrèe des

phanèrogames de Guadeloupe et de Martinique, Tome 1, Nouvelle èdition revue et

augmentèe, France, 2002.

FRANCO, M. R. B.; SHIBAMOTO, Takayushi. Volatile Composition of Some Brazilian

Fruits: Umbu-caja (Spondias citherea), Camu-camu (Myrciaria dubia), Araça-boi (Eugenia

stipitata), and Cupuaçu (Theobroma grandiflorum). Journal Of Agricultural And Food

Chemistry, [s.l.], v. 48, n. 4, p.1263-1265, abr. 2000. American Chemical Society (ACS).

http://dx.doi.org/10.1021/jf9900074.

GIACON, G. Spondia monbim. 2017. Fotografia.

GIDSIKI, D. Spondia tuberosa. 2014. Fotografia.

GUIMARÃES, A. R. D; LEÃO, K. V; MAPELI, A. M; SCHNEIDER, L. C. Caracterização

física e química de frutos da cajarana (Spondias dulcis Parkinson). Brazilian Journal Of

Development, [s.l.], v. 6, n. 2, p. 6693-6701, 2020. Brazilian Journal of Development.

http://dx.doi.org/10.34117/bjdv6n2-100.

HEBERT, P. D. N. et al. Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings Of

The Royal Society Of London. Series B: Biological Sciences, [s.l.], v. 270, n. 1512, p.313-

321, 7 fev. 2003. The Royal Society.

HOLLINGSWORTH, M. L. et al. Selecting barcoding loci for plants: Evaluation of seven

candidate loci with species-level sampling in three divergent groups of land plants. Mol Ecol

Res, 9:439–457, 2009.

HOLLINGSWORTH, P. M. Refining the DNA barcode for land plants. Proc Natl Acad Sci,

19451, 2011.

IBGE- INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA ESTATÍSTICA. SIDRA – Banco de

tabelas estatísticas. 2017. Disponível em: < https://sidra.ibge.gov.br>. Acesso em: 15 abr

2019.

29

KANG, Y; DENG, Z.; ZANG, R,: LONG, W. DNA barcoding analysis and phylogenetic

relationships of tree species in tropical cloud forests. Sci Rep. 2017; 7: 12564.

KOHATSU, D. S; ZUCARELI, V; BRAMBILLA, W. P; EVANGELISTA, R. M. Qualidade

de frutos de cajá-manga armazenados sob diferentes temperaturas. Revista Brasileira de

Fruticultura, [s.l.], v. 33, n. 1, p. 344-349, out. 2011. FapUNIFESP (SciELO).

http://dx.doi.org/10.1590/s0100-29452011000500043.

KOLESNIKOV, A. A. The Mitochondrial Genome. The Nucleoid. Biochemistry, v. 81, n.

10, p.1057-1065, out.2016.

KRESS, J.K. Plant DNA barcodes: applications today and in the future. Journal of

Siystematics and Evolution. 55: (4) 291-307. 2017.

KRESS, W. J.; ERICKSON, D. L. A two-locus global DNA barcode for land plants: The

coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region. PLoS ONE, 2:e508,

2007

LAGO-VANZELA, E. S. et al. Chemical and sensory characteristics of pulp and peel 'cajá-

manga' (Spondias cytherea Sonn.) jelly. Ciência e Tecnologia de Alimentos, [s.l.], v. 31, n.

2, p.398-405, jun. 2011. FapUNIFESP (SciELO).

LEDFORD, H. Botanical identities: DNA barcoding for plants comes a step closer. Nature,

451:616, 2008.

LIMA, A. K. C. Propagação de cajarana (Spondias sp.) e cirigüela (Spondias purpurea) por

meio de estacas verdes enfolhadas, nas condições climáticas de Mossoró-RN [propagation of

cajarana (Spondias sp.) And spanish-plum (Spondias purpurea) by leafed soft cuttings in

Mossoró, Rio Grande do Norte, Brazil]. Caating, 15(1/2):33-38, dez. 2002.

LIMA, I. C. Spondia purpurea. 2009. Fotografia.

LOERA-SÁNCHEZ,M; STUDER, B; KÖLLIKER, R. DNA barcode trnH-psbA is a

promising candidate for efficient identification of forage legumes and grasses. BMC Res

Notes. 2020; 13: 35. Published online 2020 Jan 17. doi: 10.1186/s13104-020-4897-5

LOURENÇO, M. A. M. et al. Spondias mombin supplementation attenuated cardiac

remodelling process induced by tobacco smoke. Journal Of Cellular And Molecular

Medicine, [s.l.], v. 22, n. 8, p.3996-4004, 29 maio 2018. Wiley. http://dx.doi.org/

10.1111/jcmm.13683.

MACHADO M, CARVALHO P; VAN DEN BERG, C. Domestica- tion, hybridization,

speciation, and the origins of an economically important tree crop of Spondias

(Anacardiaceae) from the Brazilian Caatinga dry forest. Neodiversity n.8, p.8–49, Jun 2015.

30

MATTIETTO, R.A. M. Estudo tecnológico de um néctar misto de cajá (Spondias Lutea L.) e

umbu (Spondias Tuberosa, Arruda Câmara). Tese, Campinas, SP: [s.n.], 2005.

MEDEIROS, E. V. et al. População microbiana, disponibilidade de nutrientes e crescimento

de umbuzeiro em substratos contendo resíduos orgânicos. Revista Caatinga, [s.l.], v. 28, n. 3,

p.47-53, set. 2015. FapUNIFESP (SciELO). http://dx.doi.org/10.1590/1983-

21252015v28n305rc

MITCHELL, J. D.; DALY, D. C. Revisão das espécies neotropicais de Spondias

(Anacardiaceae). In: CONGRESSO NACIONAL DE BOTÂNICA, 46, São Paulo, 1995.

Anais... São Paulo: USP, 1995. p.207.

MOURA NETO, L. G et al. PHYSICOCHEMICAL AND SENSORY EVALUATION OF

YELLOW MOMBIN (Spondias mombin L.) ATOMIZED POWDER. Revista Caatinga,

[s.l.], v. 28, n. 4, p. 244-252, dez. 2015. FapUNIFESP (SciELO).

http://dx.doi.org/10.1590/1983-21252015v28n427rc.

MOURA, M.P. Utilização de marcadores barcode em Spondias do Brasil. Monografia de

Bacharelado em Ciencias Biológicas. 42p, 2012.

MUÑIZ, A. et al., Antioxidant Activity and In Vitro Antiglycation of the Fruit of Spondias

purpurea. Evid Based Complement Alternat Med. v. 2018, p. 1-7, Ago 2018. Hindawi

Limited. http://dx.doi.org/10.1155/2018/5613704.

NASCIMENTO, T. V. C.et al. Productive performance and parasitological control of kids

supplemented with umbu fruits (Spondias tuberosa Arruda). Revista Brasileira de Saúde e

Produção Animal, [s.l.], v. 17, n. 3, p.520-528, set. 2016. FapUNIFESP (SciELO).

http://dx.doi.org/10.1590/s1519-99402016000300017.

NOBRE, L. L. Melo et al. Phylogenomic and single nucleotide polymorphism analyses

revealed the hybrid origin of Spondias bahiensis (family Anacardiaceae): de novo genome

sequencing and comparative genomics. Genetics And Molecular Biology, [s.l.], v. 41, n. 4,

p.878-883, 29 nov. 2018. FapUNIFESP (SciELO). http://dx.doi.org/10. 1590/1678-4685-

gmb-2017-0256.

NWIDU, L. L. et al. Hepatoprotective and antioxidant activities of Spondias mombin leaf and

stem extracts against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity. Journal Of Taibah

University Medical Sciences, [s.l.], v. 13, n. 3, p.262-271, jun. 2018. Elsevier BV.

https://doi.org/10.1016/j.jtumed.2018.03.006.

OEY, H. et al. Whole-genome sequence of the bovine blood fluke Schistosoma bovis supports

interspecific hybridization with S. haematobium. Plos Pathogens, [s.l.], v. 15, n. 1, p.1-17, 23

jan. 2019. Public Library of Science (PLoS). http://dx.doi.org/10.1371/ journal.ppat.1007513.

31

OLIVEIRA, E. N. A. Caracterização físico-química, microbiológica e sensorial de geleias de

umbu-cajá elaboradas com e sem a adição de sacarose. Revista Instituto Adolfo Lutz, v. 74, p.

111-121, mai. 2015.

OLIVEIRA, E. N. A; SANTOS, D. C; ROCHA, A. P. T; GOMES, J. P; FEITOSA, R. M;

FEITOSA, B. F. Composição nutricional de geleias de umbu-cajá durante estocagem em

temperatura ambiente. Brazilian Journal Of Food Technology, [s.l.], v. 21, n. 2018033, p. 1-8,

16 ago. 2018. FapUNIFESP (SciELO). http://dx.doi.org/10.1590/1981-6723.3318.

OLIVEIRA, G. S.; COSTA, J. M. C; AFONSO, M. R. A. Caracterização e comportamento

higroscópico do pó da polpa de cajá liofilizada. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e

Ambiental, [s.l.], v. 18, n. 10, p. 1059-1064, out. 2014. FapUNIFESP (SciELO).

http://dx.doi.org/10.1590/1807-1929/agriambi.v18n10p1059-1064.

OSUNTOKUN, O.T. et al. Assessment of Nephrotoxicity, Anti-Inflammatory and

Antioxidant Properties of Epigallocatechin, Epicatechin and Stigmasterol Phytosterol

(Synergy) Derived from Ethyl Acetate Stem Bark Extract of Spondias Mombin on Wistar

Rats Using Molecular Method of Analysis. Journal of Molecular Microbiology. v. 1, n. 1:103,

p 1-11, jun. 2017.

PAKOUSSI, T; MOUZOU, A. P; METOWOGO, K; AKLIKOKOU, K; GBEASSOR, M.

How do Spondias mombin L (Anacardiaceae) leaves extract increase uterine smooth muscle

contractions to facilitate childbirth in parturient women? African Health Sciences, [s.l.], v. 18,

n. 2, p. 235-243, 22 jun. 2018. African Journals Online (AJOL).

http://dx.doi.org/10.4314/ahs.v18i2.6.

PARMACH. Spondia Cytherea. Fotografia. Disponível em <http://www.fruitipedia.com/

2018/ 12/am barella_spondias-cytherea/> Acesso em: 10 mai. 2018.

PARVEEN, I; SINGH, H.K,; MALIK, S; RAGHUVANSHI, S; BABBAR, S.B. Evaluating

five different loci (rbcL, rpoB, rpoC1, matK, and ITS) for DNA barcoding of Indian orchids.

Genome. 2017 Aug;60(8):665-671. doi: 10.1139/gen-2016-0215. Epub 2017 May 17.

PENNISI, E. Taxonomy. Wanted: A barcode for plants. Science, 318:190–191, 2007.

RATNASINGHAM, S.; HEBERT, P. D. N. BOLD: The Barcode of Life Data System

(http://barcodinglife.org). Molecular Ecology. n.7: 355–364. 2007.

RIBEIRO, L. O.; PONTES, S. M; RIBEIRO, A. P. O; PACHECO, S; FREITAS, S. P;

MATTA, V. M. Avaliação do armazenamento a frio sobre os compostos bioativos e as

características físico-químicas e microbiológicas do suco de umbu pasteurizado. Brazilian

Journal Of Food Technology, [s.l.], v. 20, n. 2015095, p. 1-8, 2017. FapUNIFESP (SciELO).

http://dx.doi.org/10.1590/1981-6723.9515.

32

ROMANO, E.; BRASILEIRO, A. C. M. Extração de DNA de plantas. Biotecnologia,v. 9, p.

40-43, 1999.

SAMEH, S. et al. Genus Spondias: A Phytochemical and Pharmacological Review. Evidence-

based Complementary And Alternative Medicine, [s.l.], v. 2018, p.1-13, 2018. Hindawi

Limited. https://doi.org/10.1155/2018/5382904.

SAMPAIO, T. I. S. et al. Leaves of Spondias mombin L. a traditional anxiolytic and

antidepressant: Pharmacological evaluation on zebrafish (Danio rerio). Journal Of

Ethnopharmacology, [s.l.], v. 224, p.563-578, out. 2018. Elsevier BV.

http://dx.doi.org/10.1016/j.jep.2018.05.037.

SANCHES, A. G. et al. Retardation of maturity in cajarana (Spondias cytherea) treated with

1-MCP. Nativa, [s.l.], v. 5, n. 4, p.244-249, 2017. Nativa. http://dx.doi.org/10.5935/2318-

7670.v05n04a03.

SANTOS, A. T. Let al. UPLC-MS-ESI-QTOF Analysis and Antifungal Activity of the

Spondias tuberosa Arruda Leaf and Root Hydroalcoholic Extracts. Antibiotics, [s.l.], v. 8, n.

4, p. 240, 28 nov. 2019. MDPI AG. http://dx.doi.org/10.3390/antibiotics8040240.

SANTOS, B. L; CASTRO, M. S. Boas práticas de manejo para o extrativismo sustentável do

umbu. Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, f.64. Brasília: 2010. ISBN 978-85-

87697-64-6.

SANTOS, C. A. F.; OLIVEIRA, V. R. Inter-Relações genéticas entre espécies do gênero

Spondias com base em marcadores AFLP. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal-SP,

v.30, n.3, p.731-735, 2008.

SANTOS, F. X; COSTA, J. T. A. Produção de mudas das Spondias cajazeiras, cajaraneira,

ciriguela, umbu-cajazeira e umbuzeiro, f.72 EMBRAPA AGROINDÚSTRIA TROPICAL.

Fortaleza: 2010. ISSN 2179-8184.

SANTOS, M. B. Caracterização e qualidade de frutos de umbu-cajá (Spondias tuberosa X S.

mombin) PROVENIENTES DO RECÔNCAVO SUL DA BAHIA. Revista Brasileira de

Fruticultura, v. 32, n. 4, p. 1089-1097, dez. 2010.

SILVA, A. S. et al. Use of umbu (Spondias tuberosa arr. Camara) pulp for preparation of diet

cereal bar. Revista Brasileira de Fruticultura, [s.l.], v. 40, n. 2, p.1-11, 26 abr. 2018.

FapUNIFESP (SciELO). http://dx.doi.org/10.1590/0100-29452018540.

SILVA, C. A. et al. Divergência genética entre acessos de cajazinho (Spondias mombin L.) no

norte do Espírito Santo. Revista Ceres, [s.l.], v. 61, n. 3, p.362-369, jun. 2014. FapUNIFESP

(SciELO).

33

SILVA, G. A. et al. Gênero Spondias: aspectos botânicos, composição química e potencial

farmacológico. Biofarm. v. 10, n. 1. p. 27-41, 2014.

SILVA, J. N. et al. DNA barcoding and phylogeny in neotropical species of the genus

Spondias. Biochemical Systematics And Ecology, [s.l.], v. 61, p.240-243, ago. 2015. Elsevier

BV. http://dx.doi.org/10.1016/j.bse.2015.06.005.

SILVA, R. S. et al. Caracterização físico-química de frutos dos genótipos de umbu-cajazeiras

oriundos da microrregião de Iguatu, CE. Revista Brasileira de Tecnologia Agroindustrial,

[s.l.], v. 9, n. 1, p.1647-1659, 30 jul. 2015. Universidade Tecnologica Federal do Parana

(UTFPR). http://dx.doi.org/10.3895/rbta.v9n1.1699.

SILVA, T. L. L. et al. Physicochemical characterization and behavior of biocompounds of

caja-manga fruit (Spondias mombin L.). Food Science And Technology, [s.l.], v. 38, n. 3,

p.399-406, 11 jun. 2018. FapUNIFESP (SciELO).

SINGH, K.H,: PARVEEEN, I,: RAGHUVANSHI, S.; BABBAR, S. The loci recommended

as universal barcodes for plants on the basis of floristic studies may not work with congeneric

species as exemplified by DNA barcoding of Dendrobium species. BMC Res Notes. 2012; 5:

42.

SIQUEIRA, E. M. S et al. Leaves of Spondias tuberosa (Anacardiaceae): profiles of phenolic

compounds by HPLC-DAD and LC-MS / MS and anti-inflammatory activity in vivo.

Biomedical Chromatograpy, [s.l.], v. 30, n. 10, p. 1655 – 1656, abril 2016. Wiley.

https://doi.org/10.1002/bmc.3738.

SIQUEIRA, E. M. S et al. Spondias tuberosa (Anacardiaceae) leaves: profiling phenolic

compounds by hplc-dad and lc-ms/ms andin vivoanti-inflammatory activity: profiling

phenolic compounds by HPLC-DAD and LC-MS/MS andin vivoanti-inflammatory activity.

Biomedical Chromatography, [s.l.], v. 30, n. 10, p. 1656-1665, 27 maio 2016. Wiley.

http://dx.doi.org/10.1002/bmc.3738.

SOARES, K. M. P. Qualidade microbiológica e físico-química de polpas de umbu-cajá e cajá

comercializadas em Mossoró, RN. Higiene Alimentar, v.31, n. 272/273, p. 42-46, set/out

2017.

TEJACAL, I. A. et al. Antioxidant Capacity In Vitro and In Vivo of Various Ecotypes of

Mexican Plum (Spondias purpurea L.). Journal of food science, v. 82, p. 2576-2582, n 11, out

2017. Wiley Online Library. https://doi.org/10.1111/1750-3841.13862.

TIJANI, J. O. et al. One-step green synthesis of WO3 nanoparticles using Spondias mombin

aqueous extract: effect of solution pH and calcination temperature. Applied Physics A, [s.l.],

v. 125, n. 3, p.128-142, 5 fev. 2019. Springer Nature. http://dx.doi.org/10.1007/s00339-019-

2450-y.

34

TIZARD, J. et al. DNA barcoding a unique avifauna: an important tool for evolution,

systematics and conservation. Bmc Evolutionary Biology, [s.l.], v. 19, n. 1, p.1-16, 11 fev.

2019. Springer Nature. http://dx.doi.org/10.1186/s12862-019-1346-y.

UMSZA-GUEZ, M. A. et al. Effect of pectinolitic enzymes on the physical properties of caja-

manga (Spondias cytherea Sonn.) pulp. Ciência Tecnologia de Alimento. Campinas, 31(2):

517-526, abr.-jun. 2011

VIANA, E. S. et al. Desenvolvimento de geleia de umbu-cajá convencional e dietética.

Revista Brasileira de Fruticultura, [s.l.], v. 37, n. 3, p.708-717, set. 2015. FapUNIFESP

(SciELO). http://dx.doi.org/10.1590/0100-2945-018/14.

VILLA-HERNÁNDEZ, J. M; MENDOZA-CARDOSO, G; MENDOZA-ESPINOZA, J. A;

VELA-HINOJOSA, C; LEÓN-SÁNCHEZ, F. D; RIVERA-CABRERA, F; ALIA-TEJACAL,

I; PÉREZ-FLORES, L. J. Antioxidant Capacity In Vitro and In Vivo of Various Ecotypes of

Mexican Plum (Spondias purpurea L.). Journal Of Food Science, [s.l.], v. 82, n. 11, p. 2576-

2582, 9 out. 2017. Wiley. http://dx.doi.org/10.1111/1750-3841.13862.

YOLANDE, F. N. et al. Cytotoxic Effect of Spondias cytherea Fruit Extract in Murine

Melanoma Model In Vivo and In Vitro. Journal Of Environmental Pathology, Toxicology

And Oncology, [s.l.], v. 37, n. 3, p.231-240, 2018. Begell House.

http://dx.doi.org/10.1615/jenvironpatholtoxicoloncol.2018026697.

35

ANEXO 1 – Alinhamento de sequência entre fragmento de sequência gerada por

primers psbA-trnH em Spondias sp do Rio Grande do Norte e genoma plastidial de

S.tuberosa.

-

__________________________________________________________________________

36

ANEXO 2 – Alinhamento de sequência entre fragmento de sequência gerada por

primers psbA-trnH em Spondias sp do Rio Grande do Norte e genoma plastidial de S.

bahiensis

37

ANEXO 3 – Alinhamento de sequência entre fragmento de sequência gerada por

primers psbA-trnH em Spondias sp do Rio Grande do Norte em comparação com a

mesma região em de S.tuberosa

ANEXO 4 – Sequências geradas para Spondias sp. com primers psbA-trnH-

__________________________________________________________________________

>Spondias sp_trn-PSB

GCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGATCCACTTGGCTACATCCGCCCC

TNCCCTATTTCAAAAATTATACAAAAAACAAAGATTCCAATTTCTGATCATTATTTTT

TATCATTATTCTTTCCTTTCTCTTTTTTTCTTTTATATTAAAAAAACTGTAAAATAATA

ATTATTAAATTGGAATTAAAATAATTTATTAGATTTTTCTCTTTTTTTTATCTAATAGAA

TATAGATTCTATTTTCTATATTCTTCTATATATATTTGATTAATATTCTATCGATTCTAAT

ATATATTAGAATATTTTTCTCTATTATTAAATAGATAGAAATTAATTATTTCTATTTATA

CAAATGAAATCTATATTAATTAATTCTAATTAAATTATTAGTACATAAGTAAAACACG

AAATCAAATGCATAAAAATACTTGTGTTTTGGTAAAAAGTAAACAAAAAAATGTAT

GGAAATAAAAAAATACTAAAGAAAAACTACTAAATAACGGAGCAATACCAATTTAT

TGCAAGAGGGTCGGTATTACTCCGTTATTTTAAAAACTCGTATACACAAAGACCGA

AATCTTATCCATTTGTGGATGGA

>Spondias cytherea trn_PSB

38

TTCACAATCCACTGCCTTGATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCACTATTTC

AAAAATTATACAAAAAACAAAGATTGCAATTTCTGATCATTATTTTTTATCATTATTC

TTTCCTTTCTCTTTTTTTTCTTTTATATTAAATTAACTGTAAAATAATAATTATTAAATT

GGAAATTGGAATTCAAATAATTTGTTAGATTTTTTGTTAGATTTTTATCTTTTTTTATC

TAATAGAATATAGATTCTATTCTCTTATCTAAGAAAATAGAGATTCTATTTTCTATATT

CTTCTATATATATTAGATATATTAGATTAATATTTTATCGATTCTAATATATATTAGAATA

TTTTTCTCTATTATTAAATAGATAGAAATTCATTTTTTCAATTTATACAAACGAAATCT

ATATTAATTAATTCTAATTAAATTATTAGTACATAAGTAAAACACTAAATCAAATGCAT

AAAAATACTTGTGTTTTGGTAAAAAGTAAACAAAAAAATGTATGGAAATAAAAAA

ATACTAAAAAAAAACTACTAAATAACGGAGCAATACCAATTTATTGCAAATTTATTG

CAAGAGGGTCGGTATTACTCCGTTATTTTAAAAACTCGTATACACAAAGACCGAAA

TCTTATCCATTTGTGGATGGAGCT

>Spondias purpúrea trn_PSB

ATTATACAAAAAACAAAGATTCCAATTTCCAAAATTGGAATTCAAATAATTT

GTTAGATTTTTTGTTAGATTTTTATCTTTTTTTTTTATCTAATAGAATATAGATTCTATT

TTCTATATTCTTCTATATATATATTAGATTAATATTCTATCGATTCTAATATATATTAGAAT

ATTTTTCTCTATTATTAAATAGATAGAAATTAATTATTTCTATTTATACAAATGAAATCT

ATATTAATTAATTCTAATAAAATTATTAGTACATAAGTAAAACACTAAATCAAATGCA

TCAAAATACTTGTGTTTTGGTAAAAAGTAAACAAAAAAATGTATGGAAATAAAAAA

ATACTAAAGAAAAACTACTAAATAACGGAGCAATACCAATTTATTGCAAATTTATTG

CAAGAGGGTTGGTATTACTCCGTTATTTTAAAAACTCGTATACACAAAGACCGAAA

TCTTATCCATTTGTGGATGGAGCTTCAA

>Spondias tuberosa trn_PSB

GATTCACAATCCACTGCCAAGATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTCCACTAT

TTCAAAAATTATACAAAAAACAAAGATTCCAATTTCTGATCATTATTTTTTATCATTA

TTCTTTCCTTTCTCTTTTTTTCTTTTATATTAAAAAAACTGTAAAATAATAATTATTAA

ATTGGAATTAAAATAATTTATTAGATTTTTCTCTTTTTTTTATCTAATAGAATATAGATT

CTATTTTCTATATTCTTCTATATATATTTGATTAATATTCTATCGATTCTAATATATATTAG

AATATTTTTCTCTATTATTAAATAGATAGAAATTAATTATTTCTATTTATACAAATGAAA

TCTATATTAATTAATTCTAATTAAATTATTAGTACATAAGTAAAACACGAAATCAAAT

GCATAAAAATACTTGTGTTTTGGTAAAAAGTAAACAAAAAAATGTATGGAAATAAA

AAAATACTAAAGAAAAACTACTAAATAACGGAGCAATACCAATTTATTGCAAGAGG

GTCGGTATTACTCCGTTATTTTAAAAACTCGTATACACAAAGACCGAAATCTTATCC

ATTTGTGGATGGA