MAPA METABÓLICO DA INTOXICAÇÃO POR CHUMBO...Souza, Iara Dantas de. Mapa metabólico da...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

INSTITUTO METRÓPOLE DIGITAL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOINFORMÁTICA

IARA DANTAS DE SOUZA

MAPA METABÓLICO DA INTOXICAÇÃO POR CHUMBO

NATAL RN

2017

IARA DANTAS DE SOUZA

MAPA METABÓLICO DA INTOXICAÇÃO POR CHUMBO

Defesa de Mestrado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Bioinformática da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte.

Área de concentração: Bioinformática

Linha de Pesquisa: Biologia de Sistemas

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Juliani Siqueira

Dalmolin

NATAL-RN

2017

Souza, Iara Dantas de. Mapa metabólico da intoxicação por chumbo / Iara Dantas deSouza. - Natal, 2017. 83 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grandedo Norte. Instituto Metrópole Digital. Programa de Pós-Graduaçãoem Bioinformática. Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin.

1. Chumbo - Dissertação. 2. Intoxicação por chumbo -Dissertação. 3. Envenenamento por chumbo - Dissertação. 4.Metais pesados - Dissertação. 5. Biologia de sistemas -Dissertação. 6. Toxicologia de sistemas - Dissertação. I.Dalmolin, Rodrigo Juliani Siqueira. II. Universidade Federal doRio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 546.815

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRNSistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB

Dedico este trabalho à minha mãe, Ana Maria, que

em vida sempre me incentivou a seguir meus

sonhos.

AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha família, em especial minha tia Izaneide Cortez, pelo apoio

incondicional durante minha vida acadêmica aqui em Natal.

Agradeço especialmente ao meu orientador, Rodrigo Dalmolin, que foi

extraordinário comigo durante este tempo de mestrado e é minha grande referência

acadêmica. Espero continuar trabalhando para fazer jus à confiança depositada em

mim.

As minhas amigas de infância: Carol, Joyce, Emmily, Ellyda, Edwiges, Thalita,

Izadora e Ylana pelo companheirismo que atravessa os anos.

Aos amigos que a Biomedicina me proporcionou: Hannaly, Jéssyca, Kamila,

Felipe, Brenda Alves e Brenda Cardoso, por acreditarem em mim e me incentivarem

a tentar o mestrado.

Aos amigos do BioME, os quais são muitos para citar, que tornaram estes dois

anos de formação muito mais divertidos. Obrigado pelo companheirismo nesta jornada

acadêmica, pelas viagens, pelos forrós das antigas, pelos “piqueniques” na casa de

Ricardo/Lucas, pelos karaokês, pelas edições divertidíssimas da disciplina BioME

Beach Party, pelas inúmeras conversas depressivas do almoço, pelas conversas

restauradoras na piscina, pela ajuda mútua durante as disciplinas (e fora delas

também), e pela confiança em mim que levou alguns a apostar a própria mão caso

não passe na seleção de doutorado. Vocês são perigosamente inspiradores.

RESUMO

Desde a antiguidade, o chumbo (Pb) vem sendo utilizado pela humanidade em virtude

das suas propriedades físico-químicas, como maleabilidade, ductilidade, resistência à

corrosão, baixo ponto de fusão e baixa condutividade elétrica. Entretanto, além de sua

importância econômica, o chumbo possui uma importância quanto à saúde humana,

uma vez que causa intoxicação. Muitos efeitos da intoxicação pelo chumbo já foram

relatados na literatura, sendo responsável pela toxicidade nos sistemas

cardiovascular, imunológico, ósseo, reprodutivo, hematopoiético, renal,

gastrointestinal e, principalmente, no sistema nervoso. Embora haja evidências sobre

como o chumbo afeta a homeostase em nível celular, a descrição das vias metabólicas

afetadas na intoxicação por chumbo não está estabelecida. Para esclarecer os efeitos

da intoxicação, o objetivo deste estudo é propor vias metabólicas das interações do

chumbo com os componentes celulares, através da curadoria das informações

presentes na literatura e em repositórios públicos. Após a busca na literatura,

encontramos um total de 23 proteínas, incluindo o tripeptídeo glutationa, as quais são

capazes de interagir com o chumbo e estão relacionadas com a base celular da

intoxicação. Estas informações, em conjunto com outras provenientes de repositórios

especializados, permitiram a integração do conhecimento em uma via metabólica da

intoxicação por chumbo. Por meio dela, observou-se que o chumbo atua de maneira

sistêmica no organismo, em especial, interferindo na função normal de proteínas as

quais se ligam a metais essenciais, como zinco e cálcio.

Palavras-chave: Chumbo, intoxicação por chumbo, envenenamento por chumbo,

metais pesados, biologia de sistemas, toxicologia de sistemas.

ABSTRACT

Since ancient times, lead (Pb) has been used by mankind because of its

physicochemical properties, such as malleability, ductility, corrosion resistance, low

melting point and low electrical conductivity. However, in addition to its economic

importance, lead is an important human health issue since it causes intoxication. Many

effects of lead intoxication have been reported in the literature, affecting the organism

as a whole and causing symptoms in cardiovascular, immune, skeletal, reproductive,

hematological, renal, gastrointestinal and nervous systems. Although there is evidence

on how lead affects cellular homeostasis, the description of the metabolic pathways

affected in lead poisoning is not fully established. To elucidate the effects of lead

poisoning, the aim of this study is to propose pathways of lead interactions with cell

components, through manual curation of information present in literature and public

repositories. After a search in literature, it was found a total of twenty-three proteins,

including glutathione, which can directly interact with lead and are related to the cellular

basis of intoxication. This knowledge taken together with the information present in

pathways repositories allowed the integration of the current information in a map of

lead poisoning. It was observed that lead acts in a systemic way, specially interfering

with the normal function of metalloproteins which rely on essential metals to the

organism, such as calcium and zinc.

Keywords: Lead, lead intoxication, lead poisoning, heavy metals, systems biology,

systems toxicology.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Relação entre uso de compostos de chumbo na gasolina e a concentração

média do chumbo no sangue de crianças do período de 1976 a 1980 nos EUA.

Adaptado de Jarup, 2003 .......................................................................................... 15

Figura 2. Níveis de chumbo no sangue considerados seguros pelo CDC do período

de 1960-2014. Adaptado de Burns & Gerstenberger, 2014. ..................................... 16

LISTA DE ABREVIATURAS

ALA Ácido aminolevulínico

ALAD Enzima ácido aminolevulínico desidratase

BLL Concentração de chumbo no sangue (do inglês, blood lead levels)

CDC Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos (do

inglês, U.S. Centers for Disease Control and Prevention)

COBRAC Companhia Brasileira de Chumbo

DMT1 Proteína transportadora de metais divalentes-1

GO Gene ontology

KEGG Enciclopédia de genes e genomas de Kyoto (do inglês, Kyoto

Encyclopedia of Genes and Genomes)

Pb Chumbo (Símbolo)

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11

1.1 Aspectos gerais do chumbo ................................................................................ 11

1.2 Ocorrência do chumbo no ambiente ................................................................... 11

1.3 Importância econômica ....................................................................................... 12

1.4 Aspectos epidemiológicos da intoxicação ........................................................... 13

1.5 Toxicocinética ...................................................................................................... 18

1.6 Sintomatologia da intoxicação por chumbo ......................................................... 19

1.7 Biomarcadores da intoxicação ............................................................................ 21

1.8 Justificativa do estudo ......................................................................................... 22

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 23

2.1 Geral.................................................................................................................... 23

2.2 Específicos .......................................................................................................... 23

CAPÍTULO I .............................................................................................................. 24

3 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 70

3.1 Biologia de sistemas e repositórios públicos de informação ............................... 70

3.2 Metais pesados e sua relação com o metabolismo celular ................................. 71

3.3 Grupos de risco acerca da intoxicação por chumbo ............................................ 72

3.4 Bases moleculares da intoxicação por chumbo .................................................. 73

4 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 76

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 77

11

1 INTRODUÇÃO

1.1 Aspectos gerais do chumbo

O chumbo é um dos metais pesados mais utilizados pela humanidade. O

chumbo é classificado como metal pesado em virtude do seu elevado número atômico,

massa molecular e densidade. Possui como símbolo Pb, número atômico 82, massa

atômica relativa 207,2 e densidade de 11.34 g/cm3, sendo o elemento estável de maior

número atômico. É encontrado na natureza sob uma mistura de quatro isótopos

diferentes, sendo aquele com maior massa atômica (208Pb) o mais comum. Os

isótopos do chumbo são provenientes do decaimento dos elementos urânio, actínio e

tório. O principal minério de extração do chumbo na natureza é a galena, o qual

contém chumbo na forma sulfatada, além de uma pequena proporção de prata. Na

sua forma pura, apresenta-se com coloração cinza-azulada brilhante. Apresenta

valência de +2 ou +4 que permite a formação de compostos inorgânicos de chumbo,

como o fluoreto de chumbo e o cloreto de chumbo, além de compostos orgânicos,

como o chumbo tetrametílico e o chumbo tetraetílico. Além disso, o chumbo apresenta

a capacidade de fazer ligações com outros átomos de chumbo, formando cadeias

(IARC, 2006).

Há relatos da utilização do chumbo nas sociedades da antiguidade, como

Egito, Grécia e Roma. A vasta utilização pela sociedade se deve às suas propriedades

físico-químicas. O chumbo é um metal com alta maleabilidade e ductibilidade, baixo

ponto de fusão e resistência à corrosão. Essas características possibilitaram seu uso

na confecção de utensílios domésticos, ferramentas, adornos e canos que levavam

água dos aquedutos para as cidades antigas. Por isso, o termo “Pb” é proveniente do

latim “plumbum” que significa “tubo”. Ainda, desde esta época já se relatavam

condições patológicas que se assemelhavam às da intoxicação pelo chumbo

(HERNBERG, 2000; HONG, S. et al., 1994).

1.2 Ocorrência do chumbo no ambiente

O chumbo ocorre de forma ubíqua no ambiente e sua distribuição se deve

aos processos naturais e às atividades antropogênicas. O intemperismo, a erosão e

as atividades vulcânicas são responsáveis pela liberação e dispersão do chumbo

12

presente na forma mineral para o ambiente (IARC, 2006). Estes processos naturais

de distribuição do chumbo correspondem a apenas uma pequena parcela do chumbo

liberado anualmente na crosta terrestre. A exploração mineral realizada pelo homem

passou a ter um peso maior para a dispersão do chumbo a partir do século XVIII, com

a Revolução Industrial (HERNBERG, 2000). Atualmente, estima-se que a

concentração de chumbo no ambiente é mil vezes maior do que aquela encontrada

em regiões não expostas à atividade exploratória, mostrando, desta maneira, a

importância da exploração humana como fonte de contaminação (PATTERSON, C. et

al., 1991). O chumbo pode ser acumulado no solo, na água e no ar e o intercâmbio

entre estes repositórios ocorre por forças físicas e naturais. Considerando as

atividades antropogênicas, o aumento da concentração do chumbo na atmosfera foi

resultado da exaustão de motores que utilizavam combustíveis com aditivos contendo

compostos de chumbo (MORE et al., 2017). Esta prática passou a ser abolida a partir

da década de 1970, nos Estados Unidos, sendo posteriormente também banida em

outros países. A mineração e fundição também influenciam no aumento dos níveis de

chumbo no ar, especialmente nas proximidades onde estas atividades ocorrem. Além

disso, processo de decaimento do radônio constitui uma fonte alternativa de liberação

de partículas de chumbo na atmosfera (IARC, 2006; TONG; SCHIRNDING, VON;

PRAPAMONTOL, 2000).

A contaminação do solo ocorre principalmente pela deposição do chumbo

atmosférico e pela liberação de resíduos provenientes de áreas de mineração. A

contaminação dos lençóis freáticos e das coleções externas de água é resultado do

desgaste natural dos minérios de chumbo e, em maiores proporções, da atividade

industrial. Os sistemas de encanamento, por exemplo, que usam tubulações com

soldas de chumbo, representam um risco adicional para a contaminação da água

(ATSDR, 2007; IARC, 2006).

1.3 Importância econômica

A produção do chumbo segue as vias primária e secundária. A produção

primária corresponde à extração do chumbo por meio da atividade mineradora; a

produção secundária, por sua vez, está relacionada às atividades de reciclagem dos

produtos que contém chumbo (IARC, 2006). Em virtude da versatilidade das suas

características físico-químicas, o chumbo é amplamente utilizado pela indústria.

13

Grande parte da sua versatilidade pode estar relacionada à formação de ligas

metálicas com outros metais, como o antimônio, cobre, cálcio e prata. As ligas são

usadas na fabricação de soldagens, lâminas e materiais de construção (KING et al.,

2005). O chumbo produz compostos resistentes à oxidação, sendo usado também na

produção de baterias, tintas e tubulações. Possui resistência à radiação ionizante e à

vibração mecânica, sendo usado na proteção contra raios-X e no isolamento acústico.

Em razão da sua elevada densidade e baixo custo, é usado na fabricação de munições

(JOHNSON, C. K.; KELLY; RIDEOUT, 2013). Alguns compostos de chumbo

apresentam coloração vermelha ou amarelada, sendo usados na fabricação de

ornamentos de vidro e cerâmica (IARC, 2006).

A maior parte dos materiais produzidos a partir do chumbo podem ser

reutilizados. A fabricação de baterias automotivas pode ser considerada atualmente a

principal aplicação econômica do chumbo, sendo também o produto com maior índice

de reciclagem deste metal (IARC, 2006; MEYER, P. A.; BROWN, M. J.; FALK, 2008).

1.4 Aspectos epidemiológicos da intoxicação

A intoxicação pelo chumbo é uma das doenças relacionadas à toxicologia

ambiental de maior importância para a saúde humana. Desde a antiguidade são

reportados casos de intoxicação pelo chumbo: a colica Pictorum era uma condição

bem conhecida da sociedade romana. Era caracterizada pela presença de fortes

cólicas abdominais seguidas de paralisia e outras disfunções do sistema nervoso

central, sendo estas manifestações patognomônicas da intoxicação crônica por

chumbo (EISINGER, 1982). Sabe-se que o chumbo é uma potente neurotoxina capaz

de causar danos irreversíveis, especialmente em crianças expostas a níveis crônicos

(SANDERS et al., 2009). Apesar de haver na história relatos do conhecimento dos

efeitos nocivos do chumbo, as medidas de prevenção não eram prioridade. Desde que

o chumbo começou a ser explorado até a Revolução Industrial, a população exposta

perecia sem o conhecimento da causa da sua enfermidade ou como poderiam tratá-

la.

A partir da segunda metade do século XX, a intoxicação pelo chumbo

tornou-se mais evidente, ganhando os holofotes da mídia e dos governos

(HERNBERG, 2000). Nos Estados Unidos, país que liderou muitas das discussões

sobre o assunto, houve inicialmente controvérsias por partes dos grupos de estudo

14

sobre a real influência do chumbo na saúde humana (NEEDLEMAN, 2000).

Entretanto, após alguns anos, o efeito tóxico do chumbo foi amplamente reconhecido

e medidas começaram a ser tomadas para o controle da exposição. Nesta época,

estas discussões incidiam sobre a adição de compostos de chumbo como

antidetonantes nos combustíveis, fato este que aumentou consideravelmente a

dispersão de partículas de chumbo pela atmosfera. Esta nova forma de exposição é

apontada como uma das principais causas relacionadas ao aumento dos níveis de

chumbo no sangue da população, especialmente urbana (MAHAFFEY, 1998;

RICHMOND-BRYANT et al., 2013, 2014). Em 1973, o governo estado-unidense

resolveu eliminar gradualmente o uso de compostos de chumbo nos combustíveis,

cuja eliminação completa só foi conseguida anos mais tarde, em 1988 (NIEBOER et

al., 2013). O primeiro incentivo à eliminação do chumbo é apontado como um dos

principais marcos no controle da exposição e iniciou uma era de políticas públicas em

outros países visando a prevenção e o combate à intoxicação pelo chumbo (Figura 1)

(PIRKLE et al., 1994; THOMAS, 1995). Neste período, outros marcos importantes

foram a eliminação da adição de compostos de chumbo em tintas e do uso de

soldagens de chumbo em latas usadas no armazenamento de alimentos (NIEBOER

et al., 2013).

15

Figura 1. Relação entre uso de compostos de chumbo na gasolina e a concentração média do

chumbo no sangue de crianças do período de 1976 a 1980 nos EUA. Adaptado de Jarup, 2003

Os estudos epidemiológicos auxiliam na caracterização de populações

susceptíveis à intoxicação e no planejamento de estratégias de ação para a prevenção

da intoxicação. As investigações têm como principais amostras populacionais os

trabalhadores que atuam na exploração e na indústria do chumbo, além da população

de forma geral. Podemos classificar a intoxicação pelo chumbo como aguda ou

crônica. A intoxicação aguda é definida como uma exposição à grandes quantidades

de chumbo em um curto espaço de tempo, ocasionando sintomas mais graves que

podem resultar em risco de vida se não houver um manejo rápido e adequado. A

intoxicação crônica, por sua vez, muitas vezes está relacionada à exposição

ocupacional e é resultado da exposição a quantidades baixas ou moderadas de

chumbo por um longo período de tempo. Os indivíduos cronicamente intoxicados

desenvolvem os sintomas gradualmente, tornando-se, com o passar do tempo, tão

graves quanto os da intoxicação aguda (FLORA; GUPTA, D.; TIWARI, 2012; ROSIN,

2009).

16

Não há nenhuma função conhecida no organismo para a qual o chumbo

seja necessário. Assim, qualquer nível de exposição ao chumbo pode ser considerado

prejudicial. Apesar disso, em função da ampla dispersão dos compostos de chumbo

no ar, solo e água, é aceito que virtualmente todas as populações estão expostas e

apresentem concentrações variáveis do chumbo no sangue (BURNS;

GERSTENBERGER, 2014). Em 1991, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças

dos EUA (U.S. Centers for Disease Control and Prevention - CDC) estabeleceu a

concentração de 10 µg/dL como limiar preocupante para o chumbo no sangue, após

o amplo monitoramento da população infantil (CDC, 1991). Este valor de referência

passou a ser usado em todo o mundo como forma de avaliação de populações

susceptíveis. Entretanto, alguns grupos continuaram mostrando os efeitos nocivos do

chumbo em níveis menores que o limiar até então estabelecido, especialmente

relacionando baixos níveis de chumbo com o detrimento irrecuperável do

desenvolvimento cognitivo em crianças. Observou-se ainda que níveis de chumbo no

sangue menores que o limiar de 10 µg/dL estavam relacionados a disfunções

comportamentais, imunológicas, cardiovasculares e endócrinas. Assim, em 2012, o

CDC aboliu o termo “limiar de preocupação” e adotou como nível máximo para

desencadeamento de ações de combate à intoxicação o valor de 5 µg/dL de sangue

(Figura 2) (ACCLPP, 2012).

Figura 2. Níveis de chumbo no sangue considerados seguros pelo CDC do período de 1960-2014.

Adaptado de Burns & Gerstenberger, 2014.

17

Para fins de acompanhamento epidemiológico, a concentração de chumbo

no sangue total é a métrica mais usada para avaliar a exposição (SAKAI, 2000). As

medidas de controle tomadas ao longo dos últimos cinquenta anos, sobretudo com

relação à diminuição da emissão de compostos de chumbo no ar, foram responsáveis

pela diminuição dos níveis de chumbo no sangue em muitos países (RICHMOND-

BRYANT et al., 2014). Apesar desta diminuição, a intoxicação pelo chumbo segue

sendo um problema atual, especialmente nos países em desenvolvimento, os quais,

em geral, não possuem políticas públicas fortes de vigilância, prevenção e combate à

intoxicação.

A exposição da população em geral, aquela que não está submetida à

exposição ocupacional, varia em função da localização e da situação socioeconômica.

Nos EUA, houve uma diminuição de 87% na concentração de chumbo no sangue do

período de 1976 a 2000, chegando a uma média de 1.8 µg/dL em homens e mulheres.

A Austrália também seguiu esta tendência de diminuição. Na Ásia, a maior parte dos

países apresentaram níveis de chumbo menores que 10 µg/dL, com algumas áreas

urbanizadas apresentando níveis elevados. Na América Latina, a maior parte dos

países apresentam níveis de chumbo menores que 10 µg/dL. No continente africano,

por sua vez, a maioria dos países apresentam níveis de chumbo maiores que 10 µg/dL

(IARC, 2006).

No Brasil, poucos relatos epidemiológicos foram feitos nos últimos 50 anos

para acompanhar a situação da população quanto à exposição ao chumbo. Assim

como ocorreu em outros países, na década de 1980, houve uma preocupação por

parte do governo brasileiro em diminuir a presença de compostos de chumbo na

gasolina. Esta iniciativa fez parte da política econômica brasileira voltada para a

promoção de combustíveis de origem vegetal, como o etanol. A adição progressiva

do etanol à gasolina eliminou a necessidade de adição de compostos de chumbo nos

combustíveis usados nos veículos de passeio. Atualmente, os dados de estudos em

algumas localidades do país mostram que em populações não expostas pelas

atividades ocupacionais, a concentração de chumbo no sangue é baixa. Entretanto,

alguns casos pontuais foram observados, resultados de acidentes ambientais

(ALMEIDA LOPES et al., 2017; KIRA, 2014; PAOLIELLO; CAPITANI, 2005)

18

1.5 Toxicocinética

O chumbo pode ser absorvido por meio do trato gastrointestinal, pelo trato

respiratório e pela pele. A via de absorção pode depender do tipo de composto, se

orgânico ou inorgânico, e pelo tamanho da partícula. Ainda, alguns fatores podem

alterar a susceptibilidade à intoxicação, como idade, estado nutricional e

características genéticas (BARBOSA JR. et al., 2005).

Dependendo do tamanho da partícula, os compostos inorgânicos podem

ser absorvidos pela via respiratória e pela via gastrointestinal, sendo a primeira mais

eficiente. Ao chegar aos alvéolos, as partículas de chumbo são fagocitadas pelos

macrófagos alveolares e o chumbo é liberado na corrente sanguínea (NEAL;

GUILARTE, 2013). Considerando que atualmente a emissão de compostos de

chumbo no ar em função da queima de combustíveis é um evento raro, esta forma de

exposição é mais comum em populações localizadas próximas aos parques industriais

(IARC, 2006). No intestino, o chumbo é absorvido principalmente por transporte

facilitado. A proteína transportadora de metais divalentes-1 (DMT1) é uma proteína

expressa na superfície dos enterócitos e está envolvida no transporte de íons de ferro,

cogitando-se a relação desta proteína com a absorção de chumbo (NEAL; GUILARTE,

2013). Há um aumento da presença desta proteína na superfície intestinal em casos

de deficiência de ferro, o que pode acarretar um aumento na capacidade de absorção

ao chumbo (MEYER, P. A.; BROWN, M. J.; FALK, 2008). Em virtude da maior

hidrofobicidade, os compostos orgânicos de chumbo são melhor absorvidos pela pele.

Esta forma de exposição também se tornou rara com a eliminação dos compostos

alquilados nos combustíveis (ATSDR, 2007).

Uma vez absorvido, a maior parte dos íons de chumbo liga-se aos

eritrócitos, associando-se às proteínas intracelulares e às membranas. Há um

equilíbrio entre o chumbo eritrocítico e o chumbo plasmático, de modo que este

corresponde à fração biodisponível aos tecidos (SAKAI, 2000). O chumbo pode

permanecer por cerca de 40 dias no sangue e, através da corrente sanguínea, alcança

diversos órgãos, como cérebro, fígado, músculos, rins e pulmões, e os tecidos ósseos,

incluindo dentes (FOWLER, 1998). Apesar da grande seletividade, as barreiras

endoteliais, como a barreira hematoencefálica e a barreira placentária, são

permeáveis à passagem dos íons de chumbo, embora o mecanismo subjacente a este

transporte não tenha sido completamente desvendado (GUNDACKER;

19

HENGSTSCHLÄGER, 2012). Uma vez nestes tecidos, o chumbo deposita-se e

apresenta uma meia vida variável. O principal local de armazenamento do chumbo no

organismo são os ossos e dentes, correspondendo a 94% da carga total em adultos

e 73% em crianças (BARBOSA JR. et al., 2005). Os íons de chumbo substituem os

íons de cálcio presentes nos cristais de hidroxiapatita necessários à deposição óssea,

permanecendo armazenados neste tecido por décadas. Além disso, o processo de

reabsorção óssea contribui para a liberação para o sangue do chumbo armazenado,

sendo influenciado por fatores hormonais causados pela menopausa, lactação e pelo

crescimento (RABINOWITZ, 1991). Assim, a concentração de chumbo no sangue

reflete não somente o nível de exposição externa ao metal, mas também a

reexposição endógena, contribuindo para a cronificação da intoxicação. O chumbo

pode ser excretado por meio das fezes e da urina, podendo estar presente nas unhas,

suor, pelos e cabelos (ATSDR, 2007).

1.6 Sintomatologia da intoxicação por chumbo

A intoxicação por chumbo provoca uma vasta gama de sintomas, cuja

gravidade dependerá do tempo e nível de exposição, além do diagnóstico precoce e

adoção de medidas de tratamento e prevenção.

Um dos sintomas mais evidentes da intoxicação pelo chumbo é a anemia,

resultado do bloqueio da via de biossíntese do heme pelo chumbo e da retirada

precoce dos eritrócitos da circulação pelo sistema monocítico-macrofágico presente

nos órgãos hematopoiéticos. O bloqueio da via de biossíntese do heme ocasiona o

acúmulo de metabólitos, como o ácido aminolevulínico (ALA) e a zincoprotoporfirina,

os quais são usados como marcadores da intoxicação. A degradação precoce dos

eritrócitos está diretamente relacionada à meia-vida do chumbo na corrente

sanguínea, estando envolvida com comprometimento das membranas celulares em

virtude do processo oxidativo desencadeado pelo chumbo. Na intoxicação aguda,

prevalece a anemia hemolítica, definida como um excesso de destruição dos

eritrócitos; na intoxicação crônica, contudo, há uma franca anemia, caracterizada tanto

pelo excesso de destruição quanto pela diminuição da síntese de hemoglobina

(FLORA; GUPTA, D.; TIWARI, 2012; KIM, H.-C. et al., 2015).

O dano renal é uma das principais consequências da intoxicação. A

exposição sustentada a altos níveis de chumbo no sangue (70–80 μg/dl) já foi

20

associada à insuficiência renal crônica, através de estudos epidemiológicos e modelos

animais. Nos dias atuais, tal concentração de chumbo no sangue é rara,

especialmente nos países desenvolvidos; todavia, deve ser levada em consideração

em populações residentes próximas a áreas de contaminação. Contudo, como

mostrado por Ekong et al, o chumbo, mesmo em concentrações mínimas no sangue,

atua com outros fatores de risco bem estabelecidos para promover a doença renal

crônica (EKONG; JAAR; WEAVER, 2006).

Alguns estudos mostram a relação da exposição ao chumbo com a

ocorrência de doenças cardiovasculares. Sabe-se que a exposição crônica ao chumbo

aumenta a frequência de hipertensão arterial, bem como acidentes cerebrovasculares

e doença vascular periférica (ALMEIDA LOPES et al., 2017; KIM et al., 2015). O

mecanismo por trás deste processo ainda não foi desvendado, mas há evidências do

papel do estresse oxidativo na ocorrência deste processo (SIRIVARASAI et al., 2015).

Os efeitos do chumbo nos ossos afetam o desenvolvimento, formação e

reabsorção ósseas. Mostrou-se que o chumbo é capaz de ser depositado no

esqueleto fetal e provocar aberrações ósseas, especialmente o esqueleto axial. O

chumbo deposita-se na região trabecular, a qual mantém a liberação de chumbo no

sangue, e na região cortical, onde o chumbo permanece armazenado e ficando pouco

disponível para trocas com o plasma. A reabsorção óssea é responsável por 40-70%

do chumbo no sangue, constituindo uma fonte de exposição endógena (SMITH;

OSTERLOH; FLEGAL, A. R., 1996).

As consequências mais graves da intoxicação pelo chumbo estão

relacionadas ao funcionamento do sistema nervoso. A encefalopatia é observada na

intoxicação aguda e crônica e manifesta-se como apatia, irritabilidade, falta de

atenção, dor de cabeça, tremor muscular, perda de memória e alucinações, e nos

casos mais graves, ocorre delírio, falta de coordenação, convulsões, paralisia, coma

e ataxia (FLORA; GUPTA, D.; TIWARI, 2012). Os efeitos no sistema nervoso periférico

são mais pronunciados em adultos que em crianças, enquanto que os efeitos centrais

são mais importantes na infância. Fetos e crianças tem maior susceptibilidade aos

efeitos centrais em função da maior capacidade de absorção do sistema nervoso em

desenvolvimento (NEEDLEMAN, 2004). Em baixas concentrações, o chumbo pode

prejudicar o desenvolvimento cognitivo, com diminuição do QI, alterações

comportamentais e habilidade de concentração (BELLINGER; NEEDLEMAN, 2003).

21

1.7 Biomarcadores da intoxicação

Na toxicologia, biomarcadores são medidas biológicas usadas no

diagnóstico ou na avaliação de risco de potenciais agentes tóxicos. Os biomarcadores

de exposição ao chumbo podem ser classificados como biomarcadores de exposição

e biomarcadores de efeito. Ambos representam mecanismos de interação do chumbo

com o organismo (SAKAI, 2000).

Os biomarcadores de exposição reportam o contato, recente ou não, com

o chumbo. O mais utilizado é a concentração de chumbo no sangue total, já que a

maior parte do chumbo na corrente sanguínea está associado aos eritrócitos, ficando

disponível por cerca de 40 dias (BARBOSA JR. et al., 2005). A concentração do

chumbo plasmático reflete o equilíbrio entre sangue e outros compartimentos do

organismo, mas possui uma meia-vida muito curta, de cerca de uma hora (SAKAI,

2000). O chumbo urinário, de forma menos frequente, também pode ser usado como

medida de exposição. As concentrações de chumbo plasmático e urinário, entretanto,

relacionam-se diretamente com o chumbo no sangue e tendem a aumentar

exponencialmente conforme o aumento deste (BERGDAHL et al., 1997). Deve-se

lembrar que a concentração de chumbo no sangue é resultado da combinação de

exposições ambientais ao chumbo bem como da exposição endógena às reservas

presentes nos ossos e dentes (SAKAI, 2000).

Os marcadores de efeito são biomoléculas cujo metabolismo é interferido

pela ação toxicodinâmica do agente tóxico. Em geral, correspondem a metabólitos os

quais são acumulados após a interferência do chumbo. Dentre eles, temos o ácido

aminolevulínico (ALA), substrato usado pela enzima ácido aminolevulínico

desidratase (ALAD) na segunda reação da via de biossíntese do heme, a qual é

fortemente inibida pelo chumbo. A exposição ao chumbo interfere na via de

biossíntese do heme e acarreta o aumento de ALA em vários tecidos, resultando em

aumento da concentração de ALA no sangue, plasma e urina; embora o aumento no

plasma e no sangue seja melhores indicadores do efeito do chumbo sobre a medula

óssea. Ainda, a atividade da enzima ALAD eritrocitária também pode ser usada como

marcador de efeito, uma vez que sua atividade é especificamente inibida por baixos

níveis de chumbo no sangue (AJIOKA; PHILLIPS; KUSHNER, 2006; MEYER, U. A.;

SCHUURMANS; LINDBERG, 1998). A zincoprotoporfirina é produzida como resultado

da inibição da transferência dos íons de ferro pelo chumbo para a protoporfirina, na

22

última etapa da via de biossíntese do heme. O acúmulo de zincoprotoporfirina nos

eritrócitos também mostra-se um bom marcador do efeito do chumbo sobre a medula

óssea (MARTIN, C. J.; WERNTZ; DUCATMAN, 2004). Por fim, o coproporfirinogênio

III é outro metabólito da via de biossíntese do heme, sendo excretado anormalmente

na urina de trabalhadores expostos pelo menos duas semanas depois do início dos

sintomas da intoxicação (SAKAI, 2000).

1.8 Justificativa do estudo

A preocupação sobre a influência do chumbo na saúde humana que surgiu

nas últimas décadas estimulou inúmeros estudos os quais visaram a identificação dos

alvos moleculares para este metal no organismo. Muitos destes trabalhos

conseguiram identificar proteínas as quais apresentavam alterações de suas funções

quando submetidas à ação do chumbo, resultando em modificação da homeostase

celular e relacionando-se aos sintomas observados na intoxicação (GARZA; VEGA;

SOTO, 2006).

A identificação de componentes celulares envolvidos na fisiopatologia de

doenças seguiu uma linha reducionista desde o surgimento da biologia molecular.

Nesta premissa, cada componente celular é estudado separadamente do sistema o

qual faz parte na busca do entendimento da contribuição deste para o processo. Com

o desenvolvimento de novas tecnologias, tornou-se possível o estudo do metabolismo

celular de forma coordenada, contribuindo para a expansão da biologia de sistemas

(BARABASI; OLTVAI, 2004).

A biologia de sistemas permitiu a observação da funcionalidade dos

componentes celulares integradamente. Apesar de haver repositórios especializados

na montagem e representação dos processos celulares, estes não possuem vias

celulares que demonstrem de maneira coordenada, a interação do chumbo com os

diversos componentes celulares e como esta interação pode explicar os sintomas da

intoxicação.

23

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Este trabalho tem como objetivo principal propor vias que possam explicar

os mecanismos celulares subjacentes à intoxicação por chumbo.

2.2 Específicos

• Analisar os dados presentes na literatura e buscar proteínas de interação com

o chumbo por meio de mineração de texto;

• Fazer uma busca utilizando o banco de dados KEGG Pathway sobre as vias

metabólicas as quais as proteínas de interação com o chumbo participam;

• Reunir as informações presentes na literatura com aquelas adquiridas do banco

de dados citado e integrar este conhecimento em vias da intoxicação por

chumbo;

• Elucidar a base molecular pela qual o chumbo é capaz de interferir nos

sistemas do organismo e provocar os sintomas observados na intoxicação;

24

CAPÍTULO I

Artigo: Lead poisoning metabolic map

Escrito por: Iara Dantas de Souza, Abraão Silveira de Andrade, Rodrigo Juliani

Siqueira Dalmolin

Manuscrito submetido ao periódico Critical Reviews in Toxicology

For Peer Review O

nly

Lead poisoning metabolic map

Journal: Critical Reviews in Toxicology

Manuscript ID Draft

Manuscript Type: Review

Date Submitted by the Author: n/a

Complete List of Authors: de Souza, Iara; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Bioinformatics Multidisciplinary Environment de Andrade, Abraão; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Bioinformatics Multidisciplinary Environment Dalmolin, Rodrigo; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Bioinformatics Multidisciplinary Environment; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Biochemistry

Keywords: heavy metals, lead intoxication, environmental toxicity, systems toxicology, environmental health, systemic effect of lead poisoning

URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected]

Critical Reviews in Toxicology

For Peer Review O

nly

Lead poisoning metabolic map

Iara Dantas de Souzaa, Abraão Silveira de Andradea, Rodrigo Juliani Siqueira

Dalmolina,b*

aBioinformatics Multidisciplinary Environment, Federal University of Rio Grande do Norte,

Natal, Brazil; bDepartment of Biochemistry, Federal University of Rio Grande do Norte,

Natal, Brazil.

BioME – Bioinformatics Multidisciplinary Environment.

Address: Rua Odilon Gomes de Lima, 1722, Natal – RN. Brazil. Zip code 59078-400.

Phone number: +55 84 33422216

*Corresponding author

Iara Dantas de Souza. e-mail: [email protected]

Abraão Silveira de Andrade. e-mail: [email protected]

*Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin. e-mail: [email protected]

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Abstract

Lead is an important heavy metal used worldwide in several applications, especially in

industry. People exposed to lead can develop a wide range of symptoms associated

with lead poisoning. Many effects of lead poisoning were reported in the literature,

showing a compromising of whole body health, with symptoms related to cardiovascu-

lar, immune, bone, reproductive, hematological, renal, gastrointestinal, and nervous

system. However, the molecular lead targets as well as the pathways affected by lead

poisoning are not completely described. The aim of this study was to construct a map

of metabolic pathways impaired in lead poisoning by evaluating which biomolecules

are directly affected by lead. Through manual literature curation, we identified proteins

which physically interact with lead and subsequently determined the metabolic path-

ways those proteins are involved with. At total, we identified 23 proteins involved with

heme synthesis, calcium metabolism, neurotransmission, among other biological sys-

tems, which helps to understand the wide range of lead poisoning symptoms.

Keywords: heavy metals; lead intoxication; environmental toxicity; systems toxicolo-

gy; environmental health; systemic effect of lead poisoning;.

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Table of contents

Introduction4

Methods6

Inclusion Criteria6

Exclusion Criteria6

Results7

Lead poisoning symptoms7

Systemic effects of lead poisoning8

Proteins related to hematological system8

Proteins related to oxidative stress10

Proteins related to calcium metabolism10

Proteins of nuclear function11

Proteins involved with lead bioavailability11

Proteins related to nervous system metabolism13

NMDA Receptors14

Acetylcholine Receptors15

Synaptotagmin16

Voltage-Gated Calcium Channels17

Discussion and perspectives17

Acknowledgments20

Declaration of interest20

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References20

Introduction

Lead is one of the most important heavy metals due to its impact on the economy and human

health. It has been used since ancient times for several purposes, such as household utensil

manufacturing, plumbing systems, and even in food (Hernberg 2000). After the Industrial

Revolution, lead has been used in paint manufacturing, maritime industry, automotive battery

manufacturing, metal soldering, nuclear industry, and fuel. Despite the decrease of lead use in

past years, lead containing compounds are still essential for industries and relevant for the

economy in several countries. The Centers for Disease Control and Prevention from the US

(CDC) establishes blood lead levels (BLL) at 5 µg/dL as reference for health surveillance

(ACCLP 2012). However, studies using animal models to assess the effects of lead poisoning

have shown that BLL lower than the established by CDC are capable of impairing some bio-

logical systems, especially the nervous system (C.M. Bouton et al. 2001; Gillis et al. 2012).

The consequences of lead exposure remain a significant public health problem especially in

developing countries.

Lead compounds are absorbed mainly through respiratory and gastrointestinal tract

(Figure 1), being the former more efficient when compared to the latter (Hodgkins et al.

1991). It can also be absorbed through skin, particularly when forming hydrophobic organic

compounds such as tetraethyl lead. Once in the bloodstream, 99% of lead is associated with

erythrocytes (Schütz et al. 1996). Lead can also interact with plasma and cellular proteins,

mainly thiol and sulfhydryl containing proteins (Al-Modhefer et al. 1991). Bones and teeth

can store lead, retaining it for decades. Lead compounds might be released back to the blood-

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stream through processes as bone remodeling. Additionally, lead can accumulate in soft tis-

sues, especially liver, kidney, and brain. Adults have greater lead storage capacity than chil-

dren, causing the latter to have greater lead available in the blood (Liu et al. 2013). Lead

might crosses the blood-brain barrier through active transport by protein channels that carry

ions to the brain tissues (Simons & Pocock 1987). Lead has a special affinity for blood-brain

barrier and the choroid plexus endothelial cells. Therefore, those structures can protect central

nervous system against the deleterious effects of lead poisoning (Strużyńska et al. 1997). On

the other hand, there is no consensus in the literature whether lead has a preferential deposi-

tion area in the brain (Neal & Guilarte 2013). There are no lead detoxification systems de-

scribed and its half-life in the blood is approximately 40 days. It is excreted mainly in urine

and feces, and additionally in hair, skin, sweat, milk, and nails (Barbosa Jr et al. 2006). [Fig-

ure 1 near here]

The symptoms associated to lead intoxication might vary depending on whether the

exposure is acute or chronic. The primary effects of lead in the body are related to neurologi-

cal, hematological, cardiovascular, immune, bone, reproductive, and renal dysfunctions (Flo-

ra et al. 2012). The broad spectrum of symptoms indicates that lead can impair several sys-

tems by interacting with many cellular components and/or affect signaling cascades. The

complexity and heterogeneity of the lead intoxication symptoms reflect the systemic impair-

ment of cellular functions. Many studies on lead poisoning report the effects of lead on pro-

teins and show the influence of this metal on the metabolic functions by affecting lead-

interacting proteins. The aim of this work is to organize and combine the lead influence on

metabolism, in a broad and coordinated way, to describe the lead poisoning metabolic map

focusing on systemic, neuronal, and cellular levels.

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Methods

Proteins that directly interact with lead were identified by systematical literature curation.

Briefly, PubMed Database search was performed using the following terms: “Lead intoxica-

tion”, “Lead poisoning”, “Lead binding proteins”, and “Lead(II) and Pb(II)”. Also, the fol-

lowing filters have been established: article types (“classical articles”, “reviews”, “case re-

ports”, and “datasets”) and language (“English”). In total, 83 articles that report the effects of

lead poisoning in the human body, focusing on systemic effects, have been selected. From

those 83 articles, 34 studies showing proteins that directly interact with lead have been se-

lected, resulting in a list of 23 proteins (including the tripeptide glutathione). The Gene Sym-

bol of each selected protein was checked using HUGO Gene Nomenclature Committee

(Yates et al. 2017). The pathways associated with each retrieved protein was obtained using

KEGG Pathways Database (Supplemental Table S1) (Kanehisa et al. 2016). Disease-related

pathways have been excluded.

Inclusion Criteria

The proteins included in the metabolic map were chosen based on whether they can directly

interact with lead. Structural studies showing the molecular interaction between the lead ions

and proteins were considered the gold standard for our purposes. Additionally, previous stud-

ies regarding the interference of lead on the enzyme and membrane channel activity were

considered.

Exclusion Criteria

Proteins reported in the literature having their expression altered by lead without any infor-

mation supporting the inclusion criteria cited above were excluded.

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Results

Lead poisoning symptoms

Acute and chronic exposure to lead produces a set of systemic symptoms. The clinical fea-

tures observed in lead poisoning are non-specific and may be confused by porphyrias and in-

toxication by other metals. The most prominent symptoms are related to central nervous sys-

tem, such as dullness, irritability, and poor attention. The aggression of blood-brain barrier

results in encephalopathy with cerebral edema and hemorrhages (Strużyńska et al. 1997; Flo-

ra et al. 2012). Animal studies showed that prenatal exposure is particularly relevant consid-

ering the ineffectiveness of the blood-brain barrier in protecting the nervous system against

lead during development (Toews et al. 1978). In severe cases, the intoxication outcomes in-

clude convulsions, paralysis, and coma (Flora et al. 2012).

Chronic kidney disease occurs with chronic BLL of 70–80 mg/dl (Khalil-Manesh et

al. 1992; Said & Hernandez 2015). The high and stead lead levels cause the lead nephropa-

thy, defined by chronic tubulointerstitial nephritis. High chronic levels of exposure are rare,

particularly in developed countries. Despite the worldwide lead exposure reduction, there is

still evidence to support renal damage at chronic low lead levels (Ekong et al. 2006). Bones

are the main lead reservoir in the human body and the skeletal lead level reflects long term

exposure (Álvarez-Lloret et al. 2017). Animal studies showed developing effects of prenatal

lead exposure, resulting in impairment of axial skeleton (Ferm & Carpenter 1967; Jacquet et

al. 1977). Lead intoxication also comprises the development of bones and teeth through life

(Lee et al. 2016; Beier et al. 2016). Resolving lead intoxication symptoms requires continued

treatment in order to eliminate the skeletal lead content to avoid endogenous exposure

(Wedeen 1992). Lead can also accumulate at bone marrow affecting the maturation process

of blood components, while strongly inhibits the heme synthesis (Ajioka et al. 2006).

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Systemic effects of lead poisoning

Lead effects on cellular metabolism may be due to its interaction with susceptible proteins,

especially those with prosthetic groups composed of calcium and zinc (Gorkhali et al. 2016).

Those ions act in the cell by regulating the electrochemical gradient between intra- and extra-

cellular environments, controlling transmission of secondary signals, and/or altering gene ex-

pression (Baranowska-Bosiacka et al. 2012). Lead interacts with ion-binding sites, interfering

with normal protein activity affecting the cellular processes they participate in.

We identified 23 proteins (including the tripeptide glutathione) described to physical-

ly interact with lead (Table 1). Among them, 5 proteins are able to bind lead acting as chela-

tors (e.g. metallothioneins), 15 have its functions inhibited by lead, and 3 are described to be

stimulated by lead. Lead binding proteins act in several pathways such as signal transduction,

proliferation, cell survival, secretion, and regulation of gene expression (Figure

2)(Verstraeten et al. 2008; Gonick 2011). In the following sessions, we will discuss interac-

tion aspects of lead and lead-interacting proteins, and the cellular basis of symptoms pro-

voked by lead toxicity. [Table 1 near here]

Proteins related to hematological system

The interaction of lead with hematological cells induces changes in cell homeostasis and

culminates in anemia (Suwalsky et al. 2003). Proteins affected by lead play essential func-

tions in blood stream metabolism, controlling biomolecules synthesis and metabolites pro-

cessing. The inhibition of the enzymes related to hematological pathways results in substrate

accumulation, decreasing the concentration of final pathway metabolites.

The δ-aminolevulic acid dehydratase (ALAD) is one of the main targets of lead (Jaffe

et al. 2001). This cytoplasmic enzyme catalyzes the asymmetric condensation of two mole-

cules of δ-aminolevulic acid to form one molecule of porphobilinogen, in a rate-limiting step

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of heme biosynthesis (Ajioka et al. 2006). Replacement of zinc in the enzyme metal binding

site strongly inhibit ALAD activity (Figure 2), making the enzyme a good biomarker of lead

exposure (Talia Sanders et al. 2009). The inhibition of ALAD promotes the increase of δ-

aminolevulic acid concentration in blood, plasma, and urine (Barbosa Jr et al. 2006). The two

ALAD most common alleles, ALAD-1 and ALAD-2, have different distributions among eth-

nic groups and they were related to distinct susceptibilities to lead poisoning (Wetmur et al.

1991). Lead also stimulates the accumulation of other metabolites derived from heme biosyn-

thesis, such as zinc protoporphyrin. Collectively, the metabolites mentioned are used as bi-

omarkers of lead exposure (Sakai 2000).

Pyrimidine 5'-nucleotidase 1 is an erythrocyte enzyme involved in pyrimidine nucleo-

tide metabolism, catalyzing the hydrolysis of cytidine monophosphate (CMP) or 7-

methylguanosine monophosphate nucleotides (Valentine et al. 1976). Lead inhibits Pyrimi-

dine 5'-nucleotidase 1 by a yet unclear mechanism (Figure 2). The enzyme inhibition causes

the accumulation of pyrimidine nucleotides, which affects RNA catabolism (Paglia et al.

1975). The accumulation of RNA molecules stimulates its aggregation and it appears as a

basophilic stippling in erythrocytes. The presence of those histological features in peripheral

blood is another indication of lead poisoning. On the other hand, basophilic stipplings are

present in the pyrimidine 5'-nucleotidase 1congenital deficiency, which makes it difficult to

use basophilic stipplings as a specific biomarker for lead poisoning (Chiarelli et al. 2006).

The inhibition of pyrimidine 5'-nucleotidase 1 and ALAD disturb blood cells physiol-

ogy (Suwalsky et al. 2003). In consequence, intoxicated individuals present anemia as a com-

bination of decreasing in heme biosynthesis and impairment of hemoglobin synthesis (Sakai

2000). The accumulation of metabolites and the lipid oxidation result in early removal and

destruction of erythrocytes from blood stream on spleen, liver, and/or bone marrow

(Adonaylo & Oteiza 1999; Jang et al. 2011). [Figure 2 near here]

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Proteins related to oxidative stress

Lead intoxication is well-known to disrupt redox balance by inducing oxidative stress (Flora

et al. 2012). The oxidative stress in lead poisoning is a result of at least two mechanisms: the

increase of reactive oxygen species (ROS) production and the depletion of antioxidant mole-

cules reserves. The inhibition of ALAD synthesis accumulates ALA substrate, which gener-

ates hydroxyl radical (Jan et al. 2015). Additionally, lead can directly interact with membrane

lipids, leading to lipid peroxidation (Flora et al. 2012). Lead also impairs glutathione recy-

cling systems by affecting glutathione peroxidase (Gpx) and glutathione reductase (Grx),

which become inactive and therefore no longer capable of recycling glutathione (Figure 2)

(Flora et al. 2012). As a consequence of the disrupted redox state, chronic lead-induced oxi-

dative stress causes extensive DNA damage (Danadevi et al. 2003). Moreover, lead is able of

interfering with nucleotide excision repair (NER) through the inhibition of Ape endonuclease.

This often introduces critical DNA mutations and it consequently prompts apoptosis (Jan et

al. 2015).

Proteins related to calcium metabolism

Pb2+ can replace other divalent metals, such as Zn2+ (Ordemann & Austin 2016) and Ca2+

(Gorkhali et al. 2016). This binding often implies in protein function loss or hyperactivation.

This property is crucial for several clinical manifestations of lead poisoning. For example, it

enables lead to cross blood-brain barrier tight junctions through ion channels by substituting

Ca2+ (T. Sanders et al. 2009). Also, calcium replacement can impair calmodulin-mediated

pathways. Calmodulin is a ubiquitous calcium-binding protein, which affects and stimulates

many intracellular functions such as inflammation, metabolism, apoptosis, muscle contrac-

tion, intracellular movement, nerve growth, and immune response (Hudmon & Schulman

2002; Xia & Storm 2005). Lead has a higher affinity for calmodulin binding sites (Figure 2)

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and it is able to bind it in lower concentrations when compared to calcium (Fullmers et al.

1985; Richardt et al. 1986). Consequently, lead-bound calmodulin undergoes conformational

changes and may cause inappropriate activation of several proteins, many belonging to the

protein kinase C (PKC) family and N-methyl-D-aspartate glutamate receptor subtype

(Gorkhali et al. 2016). These protein complexes are deeply involved in learning and cognitive

functions and they are also thought to interact significantly with each other to mediate cogni-

tive functions (Marchetti 2003).

Proteins of nuclear function

Lead often forms large granular aggregates called inclusion bodies when inside the cell (Gon-

ick 2011). Lead ions that do not associate in inclusion bodies are left free in the cytosol and

eventually reach the nucleus, affecting nuclear enzymes (Figure 2). Lead has been described

to have a strong affinity for apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) (McNeill et al.

2004). APE1 is one of the main proteins involved in DNA repair and its activity is greatly

inhibited when the enzyme is bound to lead, making DNA nucleotide repair systems progres-

sively inefficient (McNeill et al. 2004). Lead also binds to human protamine P2 (HP2), a pro-

tein that acts as a histone in sperm cells (Quintanilla-Vega et al. 2000). HP2 condenses DNA

protecting it during spermatogenesis. Lead binds to the zinc site on HP2, leading to a con-

formational change that results in chromatin instability and that may affect fertility and off-

spring development (Quintanilla-Vega et al. 2000).

Proteins involved with lead bioavailability

Several proteins can protect against heavy metals by acting as chelators. The expression of

those proteins is stimulated after the ions enter the cell, preventing heavy metal toxic effects.

Some chelators may have other physiological functions which could be comprised by the in-

teraction with the heavy metal (Gonick 2011). One of the first studies to understand proteins

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associated to lead intoxication was conducted by Raghavan and Gonick in the 1970's, which

used human erythrocytes to identify a protein capable of sequestering lead available in the

cell (Raghavan & Gonick 1977).

Metallothionein corresponds to a family of small molecular weight proteins rich in

cysteine residues (Ruttkay-Nedecky et al. 2013), involved with metal detoxification and reac-

tive oxygen species scavenging (Vallee 1995; Kang 2006; Carpenè et al. 2007). Oxidative

stress stimulates its expression, serving as a free radical acceptor. Due to its ability to bind

metal ions inside the cell, metallothionein is an important biomarker for heavy metal poison-

ing (Ademuyiwa et al. 2010). Metallothionein is also expressed in placenta, being present in

syncytiotrophoblast and the villous interstitial layer (Gundacker et al. 2012). The presence of

metallothionein in placenta can prevent the passage of lead into the fetal circulation and, pre-

sumably, protect the fetus against lead (Adonaylo & Oteiza 1999; Gundacker et al. 2012).

Lead intoxication induces the formation of inclusion bodies in kidney and brain. Such

structures are formed by aggregates of lead and proteins, especially metallothionein. Inclu-

sion bodies formation is initiated in the cytoplasm and then the complex is transported to the

nucleus (Figure 3) (Qu et al. 2002; Waalkes et al. 2004; Zuo, Qu, Ryan N. Cooper, et al.

2009). There is no concrete evidence about how these inclusion bodies can impair cellular

homeostasis. They could play a protective role against lead intoxication by sequestering the

ions, preventing lead from accessing cell structures sensitive to their toxic effects. Knockout

mice for the two major isoforms of metallothionein (MT-I/II) have not shown inclusion bod-

ies in their renal cells (Zuo, Qu, Ryan N. Cooper, et al. 2009), and are more susceptible to the

occurrence of carcinogenic events (Zuo, Qu, Ryan N Cooper, et al. 2009). Besides metal-

lothionein, other proteins have been suggested to be lead-binding proteins, such as α2µ-

microglobulin, diazepam binding inhibitor, and thymosin β4 (Fowler 1998). [Figure 3 near

here]

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Studies have shown that glial cells can accumulate higher lead levels than the extra-

cellular medium (Tiffany-Castiglioni et al. 1989), implying a possible protective function in

nerve tissues. Following these assumptions, Qian and collaborators have conducted a study

using rat glial cells to verify which proteins were involved in resistance to lead intoxication

(Qian et al. 2000). They have observed that lead was able to bind to 78 kDa glucose-regulated

protein (GRP78), also known as heat shock 70 kDa protein, an endoplasmic reticulum protein

(Figure 2) responsible for the correct folding of newly synthesized proteins and the mainte-

nance of intracellular calcium levels (Qian et al. 2000). In addition to providing a binding site

for lead, its expression was stimulated in a time-dependent manner and remained elevated

until the last day of cell exposure, suggesting that increased protein synthesis may be a de-

fense mechanism against the toxic effects of lead. However, it is unknown if this mechanism

of cell resilience may compromise other important functions performed by GRP78.

Interactions involving the proteins mentioned above and lead need to be better under-

stood, and it is still necessary to comprehend the protein content of inclusion bodies since

studies made so far are not conclusive about the structure’s protein identity.

Proteins related to nervous system metabolism

The most known effects of lead on human physiology are related to its ability to cause chron-

ic and acute damage to the nervous system. In the 1990’s, research groups began to discuss

safe BLL for the population. It was noted that BLL below the level of concern designated by

CDC could also result into complications and irreversible damages (Gilbert & Weiss 2006;

Betts 2012). Studies have shown that the developmental period of the nervous system is more

susceptible to chronic imbalances in neural pathways essential for cognition, resulting in

nervous system development deficiency mostly in spatial learning pathways and memory

consolidation processes (Toscano & Guilarte 2005; Guilarte et al. 2012). Chronic exposure to

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lead during childhood may result in deleterious consequences that persist into adult life. Early

and chronic exposure to lead is associated with several cognitive disorders in children (Nigg

2008; Baranowska-Bosiacka et al. 2012). Chronic lead exposure during adulthood may be

associated with increased susceptibility to neurodegenerative diseases, probably due to the

interaction of lead with enzymes and transcription factors associated with Parkinson, Alz-

heimer, and Schizophrenia (Ordemann & Austin 2016).

NMDA Receptors

Glutamatergic neurons mediate the larger proportion of excitatory neural pathways with an

essential role in the memory process through a cellular mechanism called Long Term Poten-

tiation (LTP) (Nihei et al. 2000; Nihei & Guilarte 2001). The most abundant NMDA receptor

subtypes in nervous system are NR1/NR2A and NR1/NR2B, being present in synaptic densi-

ty and glial cells, respectively (Monyer et al. 1994; Luo et al. 1996; Toscano & Guilarte

2005). The extracellular part of the receptor has binding sites for glutamate and glycine, and a

metal-binding site occupied by zinc. This ion binding site regulates the affinity of glycine to

the receptor. The channel allows the transit of Na+, K+, and Ca+2, and its structural features

make it more selective to Ca+2 (Garza et al. 2006). [Figure 4 near here]

Lead is a potent NMDA receptor antagonist (Figure 4) (Ujihara & Albuquerque 1992;

Omelchenko et al. 1997). The inhibition caused by lead possibly occurs through the substitu-

tion of zinc at the regulatory site, causing the receptor to have a lower glycine affinity. The

inhibition of glycine binding to the receptor inhibits its activation interfering with intracellu-

lar calcium-dependent processes (Hashemzadeh-Gargari & Guilarte 1999). Lead blocks the

calcium influx to cytoplasm due to the higher affinity of lead ions with the channel glutamate

residues (Garza et al. 2006). Studies have concluded that lead selectively affects NMDA re-

ceptor-mediated LTP in the hippocampus, but does not cause injury to LTP mediated by oth-

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er non-NMDA pathways, showing the selectivity of lead in this particular receptor (Gutowski

et al. 1998). This is probably the mechanism by which chronic exposure to lead, especially in

periods of the nervous system development, triggers cognitive deficits in memory and learn-

ing.

Lead intoxication is reported to change the ontogeny pattern of NMDA receptor sub-

units during the nervous system development in addition to the direct NMDA receptors inhi-

bition. NR1/NR2B receptors are present in major proportions during the primary stages of

nervous system development. Over time, there is a change in the composition of those recep-

tors, which in the adult brain are composed mainly of NR2A subunits. This shift in subunit

predominance reflects the need for neural pathway consolidation through synaptic plasticity

(Sun et al. 2017). Receptors containing the NR2B subunits have slower deactivation kinetics

and have the optimum performance for the early stages of development. Then, after increas-

ing the stimuli, the NR2A receptors are more efficient since their deactivation kinetics is fast-

er (Toscano & Guilarte 2005). NR2A receptors are required for the acquisition of more effi-

cient neuronal responses end its increased expression remains through life in the mature

brain. It has been observed that lead may decrease the expression of NR2A subunits and in-

crease the expression of NR2B subunits during the early stages of brain development (Gui-

larte & McGlothan 1998). The perturbation of the ontogeny of NMDA receptors, through the

change in the composition of their subunits, can alter the normal development and maturation

of the nervous system, especially in the hippocampal areas (Guilarte & McGlothan 1998; Ni-

hei & Guilarte 1999).

Acetylcholine Receptors

Acetylcholine is one of the main neurotransmitters involved in neuromodulation, a process

related to attention, memory, learning, and synaptic plasticity (Teles-Grilo Ruivo & Mellor

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2013). Lead acts by decreasing the frequency of opening ionic channels associated with cho-

linergic receptors (Figure 4) (Nagata et al. 1997). Lead is associated with a reduction in mus-

carinic receptor amount during the perinatal period and a decreased choline acetyltransferase

activity. All those mechanisms might work together, impairing cholinergic transmission.

While the results described here do not clearly explain the molecular basis of lead interfer-

ence on those pathways, they give us evidence about the mechanisms involved with the influ-

ence of lead intoxication in learning and memory consolidation.

Synaptotagmin

Synaptotagmin is a protein present in the synaptic vesicles and functions as a cellular regula-

tor of vesicle fusion to the presynaptic membrane (Zimmerberg et al. 2006). Neurotransmitter

release occurs rapidly after calcium influx through the opening of the ion channels. Synapto-

tagmin has two C2 domains that interact with calcium (C2a and C2b), both homologous to

those found in PKC. As intracellular calcium concentrations increase, synaptotagmin initiates

the union of the vesicle with the membrane through the interactions with other proteins

(Südhof 2013). This process occurs after signal evocation, membrane depolarization, and

opening of the calcium channels. However, lead has been described to stimulate the sponta-

neous neurotransmitter release in several neuronal pathways. The exact mechanism behind

this phenomenon is unknown, but lead in picomolar concentrations are able to activate PKC

(Markovac & Gary W Goldstein 1988; Morales et al. 2011). Once activated, PKC stimulates

other cellular pathways, culminating in the release of the neurotransmitters present in the

synaptic vesicles. Lead interacts with Synaptotagmin C2 domain but prevents its bind to syn-

taxin, a protein required for the presynaptic membrane fusion (Figure 4). Thus, the spontane-

ous release of neurotransmitters induced by lead does not appear to occur directly through the

interaction between lead and synaptotagmin (C.M.L.S. Bouton et al. 2001).

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Voltage-Gated Calcium Channels

Voltage-gated calcium channels are ion channels which allow calcium flux from the extracel-

lular to the intracellular medium. They are present in several cell types and their activation

induces calcium-dependent pathways, regulation of gene expression, hormonal secretion,

neurotransmitter release, muscle contraction, and onset of synaptic transmission. Calcium

channels convert the electrical signal from the membrane into cellular response mediated by

other proteins. Thus, the cellular effects of calcium channels activation will depend on the

cell type, the channel subtype, and the current type generated (Catterall 2011; Simms &

Zamponi 2014).

Many of the processes discussed so far are intrinsically involved with calcium metab-

olism. In neurons, calcium channel activation and the consequent increase of intracellular

calcium stimulate calcium-dependent proteins such as PKC and CaM, which will activate

gene transcription (Zimmerberg et al. 2006). It was experimentally observed that lead inhibits

calcium channel activation (Figure 4), interfering with the nerve impulse (Büsselberg et al.

1993). The effect of lead on each channel subtypes was evaluated by Ujihara and collabora-

tors and it was observed that lead could block all types of calcium channels at the highest

concentrations tested (10µM), but there is a selective blockade of type-P channels at low lev-

els equivalent to those observed in chronic intoxication (Ujihara et al. 1995). The inhibition

of calcium channels caused by lead chronic exposure may contribute to neurotoxicity due to

the wide distribution of those channels in nervous system.

Discussion and perspectives

The broad spectrum of lead poisoning symptoms indicates that lead can impair several sys-

tems by interacting with many cellular components. The toxic effect of lead relies on suscep-

tible proteins, especially those with prosthetic groups composed of calcium and zinc. Lead

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interacts with the protein ion-binding sites, interfering with normal protein activity and, con-

sequently, affecting the cellular processes they participate. Ions act at various cellular levels,

regulating the electrochemical gradient between intra and extracellular environments, control-

ling transmission of secondary signals within the cell, and/or altering gene expression (Bar-

anowska-Bosiacka et al. 2012; Gorkhali et al. 2016).

Calcium is one most essential ions to the cell due to regulating a wide variety of pro-

cesses. It is found in higher concentrations in the extracellular medium so that the electro-

chemical gradient of calcium between the extracellular matrix and the cytoplasm reaches the

order of 104 (Gorkhali et al. 2016). Calcium influx is performed by protein channels that al-

low the ions transit through the hydrophobic membrane. The opening of those channels and

the maintenance of the intracellular calcium buffering system regulates ionic balance between

intra and extracellular environments. Calcium is an important secondary messenger given its

capacity to interact with many proteins. Modulation of calcium binding proteins within the

neuronal cell is essential for neuronal excitability, synaptic transmission, and neuronal plas-

ticity (Nikoletopoulou & Tavernarakis 2012). The C2 domain present in PKC and synapto-

tagmin as well as the EF domain present in calmodulin are examples of calcium binding do-

mains (Nalefski & Falke 1996; Lewit-Bentley & Réty 2000). Specifically, PKC family have a

key role in regulating signal transduction, gene expression, membrane channels, and synaptic

plasticity, commonly associated with the arising and progress of diseases (Sun et al. 1999;

Geraldes & King 2010). Lead has a higher affinity for C2 PKC domain by replacing calcium

ions of its binding site in presence of phosphatidylserine containing membranes. The interac-

tion of PKC and membrane lipids is crucial for its kinase activity. Lead was reported to be as

effective as calcium to prompt membrane association (Morales et al. 2011). Also, when com-

pared to calcium, lower concentrations of lead can trigger PKC activation (Markovac & Gary

W. Goldstein 1988; Markovac & Gary W Goldstein 1988; Hwang et al. 2002). Given the

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wide set of cellular responses invoked by PKC activation, its interaction with lead clearly

contributes to the basis of lead toxicity.

Like calcium, zinc is an essential ion and participates in several cellular mechanisms.

Among many functions, it is required for the structural constitution zinc fingers protein fami-

ly. These structurally diverse proteins are widely distributed in eukaryotic genomes, corre-

sponding to 3% of human genome. Zinc fingers are related to several functions such as DNA

recognition, RNA packaging, transcriptional activation, apoptosis, protein packaging, and

lipid binding (Malgieri et al. 2015). Some zinc fingers have been reported to interact with

lead. Their functions are heterogeneous, relating to erythropoiesis regulation and immune re-

sponse regulation (Gao et al. 2007). The interaction of zinc finger (e. g. GATA-1, TFIIIA,

and EGR-1) with lead comprising their DNA binding properties (Reddy & Zawia 2000;

Crumpton et al 2001; Huang et al 2004; Ghering et al 2005). Zinc fingers also participate in

nervous system development and their interaction with lead have been associated with neuro-

degenerative diseases (Ordemann & Austin 2016).

Some studies have associated lead exposure with cancer development risk. It is well

reported the effect of oxidative stress in the emergency of genetic instability and the initial

cancer events. As discussed above, lead can induce free radicals production through damage

in cell membranes and inhibition of glutathione detoxification system, besides inhibition of

Apu/Apy-endonuclease 1, related to protection against DNA damage caused by reactive oxy-

gen species. Those factors could increase cancer susceptibility (Wang & Shi 2001; Chen &

Shi 2002; Harris & Shi 2003; Leonard et al. 2004).

The study of cellular pathophysiology of lead intoxication may help to elucidate the

mechanisms that result in the symptoms observed in lead poisoning. We found that lead can

interact with several cellular components, comprising its normal function. Lead acts in a sys-

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temic way interacting with a heterogeneous set of proteins, such as enzymes, transcription

factors, neuronal receptors, xenobiotic responsive, and oxidative stress-detox system proteins.

Acknowledgments

We acknowledge KEGG and PUBMED databases for providing public access to their data. This work

was supported by CAPES, CNPQ and PROPESQ.

Declaration of interest

The authors report no conflicts of interest. The author’s affiliation is as shown on the cover page. The

authors have sole responsibility for the writing and content of the paper.

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Tables

Table 1. Lead interacting proteins.

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Figure captions

Figure 1. The toxicokinetics of lead poisoning. Lead enters in the organism mainly through

gastrointestinal and respiratory tracts but skin could absorb organic lead compounds in rarer

cases. Lead reaches the blood stream and associates to erythrocytes. Lead associated with

cells remains in equilibrium with plasmatic lead. Plasmatic lead corresponds to a tiny propor-

tion of lead pool, yet is important because it is available to other tissues. After achieving hard

tissues such as bone and teeth, lead can remain stored for decades. Soft tissues, such as kid-

ney, liver, lungs, and brain can also store lead. After damaging blood-brain barrier, lead can

accumulate in the brain and to impair brain development. Lead is excreted in feces and urine.

Figure 2. Cellular effects of lead poisoning. Lead can affect redox detoxification by inhibition

of glutathione system, enhancing reactive oxygen species. Lead can also inhibit some im-

portant enzymes involved in heme synthesis leading to hematological symptoms. Lead inter-

feres with calcium metabolism, through activation of protein kinase C and calmodulin, and

by inhibition of adenylate cyclase and voltage-gated calcium channels, which are key pro-

teins related to signal transduction and activation of second messengers. Lead can interact

with nuclear proteins, such as transcription factors and DNA repair enzymes. Finally, lead

can be chelated by cytosolic proteins and endoplasmic reticulum proteins.

Figure 3. Hypothetical mechanism of inclusion bodies formation.

Figure 4. Effects of lead on the nervous system. Most of the studies about lead poisoning fo-

cus on explaining the mechanisms underlying the clinical manifestations and the develop-

mental consequences of lead exposure. Evidence so far shows that lead interferes with glu-

tamatergic pathways, one of the main excitatory pathways of the nervous system. It has a

great importance on memory consolidation due to the ionotropic receptors, mostly NMDA

receptors, which mediate the synaptic plasticity by stimulation of Long-Term Potentiation

and Long-Term Depression on hippocampus. Lead also might inhibit the current on nicotinic

receptors, an ionotropic cholinergic receptor. Additionally, lead can interrupt the currents

mediated by voltage-gated calcium channels. Lead binds to synaptotagmin, but apparently, it

is not related to neurotransmitter release. It is not well described how lead can access neuron

cytoplasm, but it is possible that lead crosses the hydrophobic membrane through ion chan-

nels such as the ionotropic receptors mentioned above. Within the cell, lead can mimic essen-

tial ions and trigger secondary pathways that regulate important neuronal processes.

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Interaction Protein Reference

Diazepam binding inhibitor Fowler, 1998

Thymosin beta 4 Fowler, 1998

Synaptotagmin 1 Bouton et al. 2001

Heat shock protein family A (Hsp70) member 5 Qian et al. 2000

Metallothionein

Qu et al. 2002

Zuo et al. 2009

Waalkes et al. 2004

General transcription factor IIIA Huang et al. 2004

Early growth response 1 Reddy & Zawia 2000

GATA binding protein 1 Ghering et al. 2005

Apurinic/apyrimidinic endodeoxyribonuclease 1 McNeill et al. 2004

NMDA receptor

Omelchenko et al. 1997

Ujihara & Albuquerque 1992

Hashemzadeh-Gargari & Guilarte 1999

Voltage-gated calcium channels Ujihara et al. 1995

Nicotinic acetylcholine receptor Nagata et al. 1997

Adenylate cyclase Nathanson & Bloom 1975

Protamine 2 Quintanilla-Vega et al. 2000

Aminolevulinate dehydratase Jaffe et al. 2001

Glutamine synthetase Flora et al. 2012

Glutathione reductase Flora et al. 2012

Glutathione peroxidase Flora et al. 2012

Glutathionea Flora et al. 2012

Pyrimidine 5'-nucleotidase 1 Paglia et al. 1975

Sp1 transcription factor Crumpton et al. 2001

CalmodulinFullmers et al. 1985

Richardt et al. 1986

Protein kinase C

(Markovac & Gary W. Goldstein 1988)

(Markovac & Gary W Goldstein 1988)

(Morales et al. 2011)

(Hwang et al. 2002)

Binding

Inhibition

Stimulation

ª Glutathione is a tripeptide inhibited by lead.

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Figure 1. The toxicokinetics of lead poisoning. Lead enters in the organism mainly through gastrointestinal and respiratory tracts but skin could absorb organic lead compounds in rarer cases. Lead reaches the blood stream and associates to erythrocytes. Lead associated with cells remains in equilibrium with plasmatic lead. Plasmatic lead corresponds to a tiny proportion of lead pool, yet is important because it is available to other

tissues. After achieving hard tissues such as bone and teeth, lead can remain stored for decades. Soft tissues, such as kidney, liver, lungs, and brain can also store lead. After damaging blood-brain barrier, lead

can accumulate in the brain and to impair brain development. Lead is excreted in feces and urine.

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Figure 2. Cellular effects of lead poisoning. Lead can affect redox detoxification by inhibition of glutathione system, enhancing reactive oxygen species. Lead can also inhibit some important enzymes involved in heme synthesis leading to hematological symptoms. Lead interferes with calcium metabolism, through activation

of protein kinase C and calmodulin, and by inhibition of adenylate cyclase and voltage-gated calcium channels, which are key proteins related to signal transduction and activation of second messengers. Lead can interact with nuclear proteins, such as transcription factors and DNA repair enzymes. Finally, lead can

be chelated by cytosolic proteins and endoplasmic reticulum proteins.

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Figure 3. Hypothetical mechanism of inclusion bodies formation.

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Figure 4. Effects of lead on the nervous system. Most of the studies about lead poisoning focus on explaining the mechanisms underlying the clinical manifestations and the developmental consequences of lead exposure. Evidence so far shows that lead interferes with glutamatergic pathways, one of the main

excitatory pathways of the nervous system. It has a great importance on memory consolidation due to the ionotropic receptors, mostly NMDA receptors, which mediate the synaptic plasticity by stimulation of Long-Term Potentiation and Long-Term Depression on hippocampus. Lead also might inhibit the current on

nicotinic receptors, an ionotropic cholinergic receptor. Additionally, lead can interrupt the currents mediated by voltage-gated calcium channels. Lead binds to synaptotagmin, but apparently, it is not related to

neurotransmitter release. It is not well described how lead can access neuron cytoplasm, but it is possible that lead crosses the hydrophobic membrane through ion channels such as the ionotropic receptors mentioned above. Within the cell, lead can mimic essential ions and trigger secondary pathways that

regulate important neuronal processes.

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Planilha1

Protein Pathway ID Pathway Name

hsa04261 Adrenergic signaling in cardiomyocytes

hsa04925 Aldosterone synthesis and secretion

hsa04371 Apelin signaling pathway

hsa04976 Bile secretion

hsa04020 Calcium signaling pathway

hsa04024 cAMP signaling pathway

hsa04022 cGMP-PKG signaling pathway

hsa04062 Chemokine signaling pathway

hsa04725 Cholinergic synapse

hsa04713 Circadian entrainment

hsa04728 Dopaminergic synapse

hsa04961 Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption

hsa01522 Endocrine resistance

hsa04915 Estrogen signaling pathway

hsa04727 GABAergic synapse

hsa04540 Gap junction

hsa04971 Gastric acid secretion

hsa04922 Glucagon signaling pathway

hsa04724 Glutamatergic synapse

hsa04912 GnRH signaling pathway

hsa04750 Inflammatory mediator regulation of TRP channels

hsa04911 Insulin secretion

hsa04211 Longevity regulating pathway

hsa04720 Long-term potentiation

hsa04916 Melanogenesis

hsa04740 Olfactory transduction

hsa04114 Oocyte meiosis

hsa04913 Ovarian steroidogenesis

hsa04921 Oxytocin signaling pathway

hsa04972 Pancreatic secretion

hsa04072 Phospholipase D signaling pathway

hsa04611 Platelet activation

hsa04914 Progesterone-mediated oocyte maturation

hsa00230 Purine metabolism

hsa04015 Rap1 signaling pathway

hsa04923 Regulation of lipolysis in adipocytes

hsa04924 Renin secretion

hsa04723 Retrograde endocannabinoid signaling

hsa04970 Salivary secretion

hsa04726 Serotonergic synapse

hsa04742 Taste transduction

hsa04918 Thyroid hormone synthesis

hsa04270 Vascular smooth muscle contraction

hsa04962 Vasopressin-regulated water reabsorption

Aminolevulinate

Dehydratasehsa00860 Porphyrin and chlorophyll metabolism

Apurinic/apyrimidinic

Endodeoxyribonuclease 1hsa03410 Base excision repair





hsa04973 Carbohydrate digestion and absorption

hsa04260 Cardiac muscle contraction

Supplemental table S1. Kegg Pathways of lead interacting proteins

Adenylate Cyclasea

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Planilha1hsa04022 cGMP-PKG signaling pathway








hsa04730 Long-term depression


hsa04010 MAPK signaling pathway





hsa04721 Synaptic vesicle cycle

hsa04742 Taste transduction

hsa04530 Tight junction




hsa04371 Apelin signaling pathway



hsa04022 cGMP-PKG signaling pathway





hsa04922 Glucagon signaling pathway



hsa04910 Insulin signaling pathway



hsa04722 Neurotrophin signaling pathway

hsa04740 Olfactory transduction

hsa04114 Oocyte meiosis


hsa04070 Phosphatidylinositol signaling system

hsa04744 Phototransduction


hsa04014 Ras signaling pathway





hsa05204 Chemical carcinogenesis


hsa04080 Neuroactive ligand-receptor interaction

Thymosin Beta 4 hsa04810 Regulation of actin cytoskeleton

Diazepam Binding

Inhibitorhsa03320 PPAR signaling pathway

Early Growth Response 1 hsa04371 Apelin signaling pathway



Voltage-Gated

Calcium Channelsb

Calmodulinc

Nicotinic Acetylcholine

Receptorsd

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For Peer Review O

nly

Planilha1hsa04713 Circadian entrainment




hsa04080 Neuroactive ligand-receptor interaction



hsa05322 Systemic lupus erythematosus

hsa00480 Glutathione metabolism


hsa03060 Protein export

hsa04141 Protein processing in endoplasmic reticulum

hsa04612 Antigen processing and presentation


Metallothioneinf hsa04978 Mineral absorption

hsa00230 Purine metabolism

hsa00240 Pyrimidine metabolism

hsa00760 Nicotinate and nicotinamide metabolism


hsa04960 Aldosterone-regulated sodium reabsorption


hsa04360 Axon guidance

hsa04662 B cell receptor signaling pathway


hsa04973 Carbohydrate digestion and absorption

hsa04062 Chemokine signaling pathway




hsa01521 EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance

hsa04961 Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption

hsa04012 ErbB signaling pathway

hsa04664 Fc epsilon RI signaling pathway

hsa04666 Fc gamma R-mediated phagocytosis

hsa04510 Focal adhesion


hsa04540 Gap junction




hsa04066 HIF-1 signaling pathway


hsa04931 Insulin resistance


hsa04670 Leukocyte transendothelial migration

hsa04730 Long-term depression


hsa04010 MAPK signaling pathway


hsa04150 mTOR signaling pathway

hsa04650 Natural killer cell mediated cytotoxicity

hsa04064 NF-kappa B signaling pathway


hsa04972 Pancreatic secretion

hsa04070 Phosphatidylinositol signaling system

hsa04072 Phospholipase D signaling pathway

NMDA Receptorse

Gluthatione Reductase

Heat Shock 70kD Protein 5

(Glucose-Regulated Protein, 78kD)

5'-Nucleotidase

Protein Kinase C

(Conventional)g

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For Peer Review O

nly

Planilha1hsa04151 PI3K-Akt signaling pathway






hsa04071 Sphingolipid signaling pathway

hsa04919 Thyroid hormone signaling pathway



hsa04370 VEGF signaling pathway

hsa04310 Wnt signaling pathway

hsa01522 Endocrine resistance

hsa04350 TGF-beta signaling pathway


Synaptotagmin 1 hsa04721 Synaptic vesicle cicle

e The pathways are from GRIN1, GRIN2A, GRIN2B, GRIN2C, GRIN2D, GRIN3A, GRIN3B genes of NMDA receptors.f The pathways are from MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1HL1, MT1M, MT1X, MT2A, MT3 and MT4 genes of metallothionein.

gThe pathways are from PRKCA, PRKCB and PRKCG genes of the conventional isoform of protein kinase C, which has the C2 domain. This domain has a calcium

binding site that can be replaced by lead ions.

SP1 Transcription Factor

ª The pathways are from ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 and ADCY10 genes of adenylate cyclase.

bThe pathways are from CACNA2D1, CACNA2D2, CACNA2D3, CACNA2D4, CACNB1, CACNB2, CACNB3, CACNB4, CACNG1, CACNG2, CACNG3,

CACNG4, CACNG5, CACNG6, CACNG7, CACNG8, CACNA1A, CACNA1B, CACNA1C, CACNA1D, CACNA1E, CACNA1F, CACNA1G, CACNA1H,

CACNA1I and CACNA1S genes of voltage-gated calcium channels. c The pathways are from CALM1, CALM2 and CALM3 genes of calmodulin.

dThe pathways are from CHRNA1, CHRNA2, CHRNA3, CHRNA4, CHRNA5, CHRNA6, CHRNA7, CHRNA9, CHRNA10, CHRNB1, CHRNB2, CHRNB3,

CHRNB4, CHRND, CHRNE and CHRNG genes of nicotinic acetylcholine receptors.

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70

3 DISCUSSÃO

3.1 Biologia de sistemas e repositórios públicos de informação

A biologia molecular clássica dominou a pesquisa biológica por cerca de

um século, focando na identificação do funcionamento de componentes celulares

individuais. Esta abordagem reducionista permitiu o estudo de muitos protagonistas

da manutenção da homeostase celular e foi importante para o avanço do

conhecimento da maquinaria celular. Apesar de relevante, o esclarecimento sobre o

intrincado mecanismo da vida requer o entendimento sobre como estes atores atuam

em conjunto, de modo que as características moleculares são resultado de interações

complexas entre os constituintes celulares, como DNA, RNA, proteínas e pequenas

moléculas. Ganhando destaque principalmente com o surgimento das novas

tecnologias de sequenciamento de DNA, a biologia de sistemas é um campo recente

da biologia, o qual emprega integração de dados, métodos matemáticos e

computacionais para entender de forma holística o funcionamento de sistemas

biológicos complexos (BARABASI; OLTVAI, 2004; WALHOUT; VIDAL; DEKKER,

2013).

Os dados provenientes de estudos moleculares em conjunto com aqueles

provenientes de novas tecnologias permitiram a obtenção de volumes de dados

massivos, os quais demandam vastos recursos humanos e computacionais para a

análise completa da informação biológica ali contida. Com o objetivo de organizar a

informação proveniente destas análises, bancos de dados especializados foram

criados e passaram a ter importância central na biologia molecular, funcionando como

repositórios do conhecimento. Alguns bancos possuem a finalidade de abrigar

informações biológicas acerca do funcionamento de processos metabólicos e como

os agentes destes processos relacionam-se. Dentre estes bancos, podemos citar o

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Gene Ontology (GO) e o

Reactome (ASHBURNER et al., 2000; CROFT et al., 2011; KANEHISA et al., 2016)

Apesar de descreverem inúmeros mecanismos celulares, há uma lacuna

de conhecimento sobre como os metais pesados interagem com o metabolismo

celular. Especificamente, estes repositórios não possuem informações organizadas

de forma sistemática sobre como o chumbo interage como metabolismo celular e

sobre como esta interação pode estar ligada aos sintomas decorrentes da intoxicação.

71

3.2 Metais pesados e sua relação com o metabolismo celular

O termo “metal pesado” é amplamente difundido, mas não há um consenso

quanto à sua definição. A definição mais utilizada, entretanto, remete à densidade: o

critério de classificação possui um intervalo de 3 a 7,5 g/cm3, acima do qual um

elemento pode ser considerado um metal pesado (DUFFUS, 2002). Outra definição

importante leva em consideração o efeito do metal sobre a saúde humana. Assim,

desde que o elemento químico seja conhecido por causar intoxicação, qualquer metal

pode ser classificado como metal pesado, independente da sua massa atômica ou

densidade (SINGH et al., 2011). Dentre os metais pesados mais importantes, temos

o chumbo, cádmio, arsênio e o mercúrio.

Os metais pesados foram utilizados durante a humanidade por milênios e

continuam sendo importantes para as atividades econômicas. O crescimento da

produção de metais pesados ocorreu de forma abrupta a partir da Revolução

Industrial, com concomitante aumento da contaminação ambiental. Apesar dos efeitos

adversos da exposição aos metais pesados ser conhecido há bastante tempo, a

exposição e os casos de intoxicação permanecem como problemas de saúde pública

em muitos países, especialmente os países em desenvolvimento (JARUP, 2003).

Nos últimos anos, em virtude da crescente conscientização acerca dos

danos causados pela intoxicação por metais pesados, a dispersão de compostos no

ambiente vem diminuindo. A emissão ocorre por uma ampla gama de processos, os

quais perpassam pelas atividades exploratórias e industriais. Os metais são dispersos

pelo do ar, água e solo, através de processos naturais e, de forma mais importante,

da atividade humana. A dispersão antropogênica aumentou significativamente a

exposição das populações aos metais pesados. Entretanto, a presença dos efeitos

tóxicos de um determinado elemento depende do contato entre o mesmo e as vias de

absorção (aérea, cutânea, intestinal). Isto é, para a exposição ocorrer, determinado

metal deve estar presente em um mesmo espaço e em um mesmo período de tempo

da presença humana (JARUP, 2003).

Alguns metais possuem importância bioquímica e fisiológica para a

homeostase dos organismos. São chamados de elementos traço ou micronutrientes,

os quais atuam na constituição e atividade de moléculas biológicas (KATHARIYA et

al., 2014). O zinco, por exemplo, é um micronutriente e importante cofator de enzimas

de diversos organismos, inclusive do homem. Contudo, existe um limiar de

72

concentração de zinco no organismo acima do qual efeitos tóxicos são observados

(FOSMIRE, 1990).

Há alguns metais os quais não são usados pelo metabolismo humano e a

sua presença no organismo pode resultar em intoxicação. Metais pesados causam

toxicidade celular principalmente através da substituição de metais essenciais dos

seus respectivos sítios nativos de ligação em metaloproteínas. Outro mecanismo de

toxicidade remete ao dano oxidativo causado aos componentes celulares, como

membranas, proteínas e ácidos nucleicos. A interação do metal pesado com o

metabolismo resulta nos sintomas da intoxicação, os quais podem ajudar a determinar

qual o agente tóxico em questão (JAN et al., 2015).

3.3 Grupos de risco acerca da intoxicação por chumbo

Um dos aspectos da gravidade da intoxicação pelo chumbo remete ao

grupo epidemiológico o qual ele atinge. O grupo de maior risco são as crianças,

especialmente aquelas na idade de 1-5 anos. Na década de 1990 e início dos anos

2000, pesquisas mostraram que o chumbo produz efeitos tóxicos até quando em

concentrações no sangue até então consideradas aceitáveis (<10 µg/dL). A principal

preocupação concerne ao detrimento do desenvolvimento completo do sistema

nervoso, sobretudo quanto às capacidades cognitivas de crianças, cujo dano pela

intoxicação mostra-se irreversível. Estudos com coortes de crianças em idade escolar

mostraram a relação entre níveis de chumbo no sangue menores que o limiar

estabelecido e a diminuição do QI (BELLINGER; NEEDLEMAN, 2003; CANFIELD et

al., 2003; JUSKO et al., 2007). Ainda, baixos níveis de chumbo no sangue foram

relacionados ao comprometimento de outras características do desenvolvimento

intelectual das crianças, como o detrimento da capacidade de leitura e escrita e

comportamentos associados ao déficit de atenção e hiperatividade (CHANDRAMOULI

et al., 2009; HONG et al., 2014; NIGG et al., 2010). Modelos animais também

mostraram a relação entre os baixos níveis de chumbo com o comprometimento de

funções cognitivas (LEASURE et al., 2008; RICE, D. C., 2006).

No Brasil, a maior parte dos levantamentos epidemiológicos descreve a

situação de exposição de algumas áreas restritas nas regiões sudeste e sul,

mostrando que em áreas onde não há relação direta com a atividade mineradora, os

níveis de chumbo no sangue da população são baixos (ALMEIDA LOPES et al., 2017;

73

KIRA, 2014; PAOLIELO et al., 1997). Entretanto, os casos de intoxicação por chumbo

no Brasil parecem estar ligados a regiões com atividade mineradora recente. Por

exemplo, em regiões próximas a uma mineradora localizada no vale do rio Ribeira, na

divisa entre os estados de São Paulo e Paraná, registrou-se altos níveis de chumbo

no sangue de crianças que residiam nesta região (PAOLIELLO, 2002; PAOLIELLO et

al., 2002). Além disso, um dos casos de intoxicação ambiental por chumbo mais

impactantes do país foi observado no município de Santo Amaro da Purificação, no

estado da Bahia. Os dejetos provenientes da atividade mineradora realizada pela

Companhia Brasileira de Chumbo (COBRAC) contaminaram os arredores do

município, causando casos graves de intoxicação na população residente, sendo

considerado um dos acidentes ambientais mais importantes da história do país

(SOUZA GUERRA, DE et al., 2015).

Apesar de estudos mostrarem que uma parcela da população brasileira não

possui níveis altos de chumbo no sangue, falta a implementação de ações de

vigilância, a exemplo de outros países, para comprovar se os resultados encontrados

caracterizam a situação de exposição de toda a população. Deve-se considerar ainda

que o nível de exposição aceitável para o chumbo é um parâmetro estabelecido por

agências estrangeiras, cujos manuais de recomendações são usados por muitos

outros países. No entanto, a determinação destas diretrizes baseia-se em

levantamentos epidemiológicos realizados em populações com características

socioeconômicas distintas daquelas encontradas no Brasil.

Ao contrário da exposição ocupacional, existem fontes de contaminação

que são mais sutis e podem ser igualmente importantes para a intoxicação pelo

chumbo, como a presença de chumbo em alimentos de origens animal e vegetal

(PAOLIELLO; CAPITANI, 2005). Outra via de exposição importante ocorre com a

contaminação da água. No estado do Rio Grande do Norte, há relatos do excesso de

metais pesados, em especial o chumbo, em coleções de água doce localizadas no

semiárido potiguar, pondo em risco de contaminação a população que utiliza este bem

para suas atividades (DANTAS et al., 2017).

3.4 Bases moleculares da intoxicação por chumbo

O chumbo é um metal pesado o qual não possui nenhuma função biológica

conhecida no organismo humano. Ainda, o organismo humano não possui sistemas

74

específicos de defesa contra a intoxicação pelo chumbo. Todavia, seres vivos

conseguiram adaptar-se a microambientes ricos em metais pesados, como o chumbo,

através de mecanismos de resistência. Algumas bactérias e leveduras possuem

sistemas bioquímicos especializados em inibir os efeitos tóxicos do chumbo, através

da precipitação do metal na forma de sais insolúveis no meio extracelular, adsorção

dos metais em polissacarídeos de parede celular, presença de transportadores de

membrana que realizam a remoção do metal do interior da célula e quelação dos íons

de chumbo que alcançam o espaço intracelular por proteínas. Tais características são

economicamente importantes uma vez que podem ser usadas no processo de

biorremediação de ambientes contaminados por chumbo (JAROSŁAWIECKA;

PIOTROWSKA-SEGET, 2014; NAIK; DUBEY, 2013).

A base molecular dos sintomas associados à intoxicação pelo chumbo

pode ser explicada pelo estímulo ao estresse oxidativo, ligação aos grupos tiol de

enzimas e, sobretudo, pela substituição dos íons cálcio e zinco em metaloproteínas.

A neurotoxicidade provocada pelo chumbo tem grande relação com as proteínas

ligadoras de cálcio, podendo atuar de três maneiras: através da ligação aos sítios de

cálcio, alterando a conformação da proteína e inibindo sua atividade; através da

ocupação de sítios de ligação ao cálcio e mimetização da atividade deste íon, ativando

a proteína e perturbando as vias a jusante; e através da ligação a outros sítios da

proteína não relacionados ao cálcio, podendo diminuir a afinidade a este íon e interferir

na atividade da proteína (GORKHALI et al., 2016).

A investigação da inibição do receptor glutamatérgico NMDA e a

perturbação da plasticidade sináptica envolvidos na consolidação da memória são

mecanismos propostos para explicar a neurotoxicidade provocada pelo chumbo no

desenvolvimento do sistema nervoso em crianças. O chumbo é capaz de alterar o

padrão de expressão das subunidades do receptor NMDA, a composição destas

subunidades e a sua localização sináptica, resultando na alteração das cascatas de

sinalização de cálcio no neurônio. Além da perturbação das vias glutamatérgicas,

outras vias e proteínas com papel fundamental no processo do desenvolvimento

cognitivo do sistema nervoso podem ser alvo do efeito tóxico do chumbo, como as

vias colinérgicas, os canais de cálcio voltagem-dependentes, a sinaptotagmina e

proteína quinase C (NEAL; GUILARTE, 2010; NEAL; GUILARTE, 2013).

75

Além disso, outro mecanismo relacionado à toxicidade celular causada pelo

chumbo remete a sua interação com as proteínas chamadas “dedos de zinco” (zinc

fingers), as quais são proteínas com um domínio particular composto pelos

aminoácidos histidina e cisteína conhecidos por serem sítios de ligação ao zinco. Elas

compreendem uma família de proteínas presente em muitos seres vivos e que, em

alguns casos, atuam como fatores de transcrição. Evidências mostram que o chumbo

é capaz de substituir o zinco no sítio de ligação de algumas destas proteínas,

interferindo na afinidade de ligação com o DNA e afetando a expressão gênica

(ORDEMANN; AUSTIN, 2016).

Além de interferir diretamente na estrutura e função de proteínas,

evidências suportam o efeito genotóxico do chumbo (JOHNSON, F. M., 1998). Um

dos mecanismos prováveis para a genotoxicidade remete à indução ao estresse

oxidativo, a partir da produção de espécies reativas de oxigênio e da depleção das

reservas antioxidantes. O estímulo ao estresse oxidativo pode estar relacionado ao

aumento dos níveis do ALA, resultado da inibição da via de biossíntese do heme,

tendo-se observado o aumento de eventos de quebra de dupla fita do DNA por este

metabólito (ONUKI et al., 1994). Ainda, leva-se em consideração a inibição da enzima

Ape-1 pelo chumbo, a qual possui a função de promover o reparo no DNA causado

por danos provenientes do estresse oxidativo. Estes fatores podem estar relacionados

com os mecanismos moleculares os quais apontam o chumbo como provável agente

carcinogênico em humanos (BORGHINI; GIANICOLO; ANDREASSI, 2015).

Em suma, à semelhança de outros metais pesados, a toxicidade causada

pela contaminação por chumbo se mostra proveniente da interação deste metal com

diversos componentes celulares, em especial as metaloproteínas. Deste modo, a

perturbação da homeostase iônica, sobretudo dos íons cálcio e zinco, parece ser o

fator preponderante para o surgimento dos amplos efeitos sistêmicos observados na

intoxicação por chumbo.

76

4 CONCLUSÃO

A busca na literatura revelou que o chumbo tem a capacidade de interagir

com diversas proteínas celulares, muitas delas com papéis centrais na manutenção

do metabolismo celular, as quais regulam a entrada de íons na célula, atuam como

mensageiros intermediários, protegem os demais componentes celulares dos danos

causados pelo estresse oxidativo, participam da transmissão do impulso nervoso e

participam da produção de metabólitos essenciais para a homeostase do organismo.

A vasta interferência do chumbo com os componentes celulares pode ser ilustrada

pelas diversas vias as quais as proteínas de interação fazem parte, fato este que pode

estar relacionado aos muitos sintomas associados à intoxicação. Tendo isto em vista,

reuniu-se as informações presentes na literatura e aquelas presentes nos repositórios

especializados para a construção das vias que representam a interação do chumbo

com os componentes celulares. Por fim, conclui-se que o chumbo atua em diversos

componentes celulares produzindo sintomas sistêmicos, de modo que a base

molecular da intoxicação está relacionada à substituição de íons essenciais, como o

cálcio e o zinco, em metaloproteínas.

77

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MAPA METABÓLICO DA INTOXICAÇÃO POR CHUMBO...Souza, Iara Dantas de. Mapa metabólico da...

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