Manejo Zootécnico – Biotério Laboratório Análise Neuro Comportamental (LANEC) PUC-Rio. Alex...

Manejo Zootécnico – BiotérioLaboratório Análise Neuro

Comportamental (LANEC) PUC-Rio.

Alex Sandro Moraes Silva

Rio, 10/07/2008

Laboratório de Análise Neuro Comportamental (LANEC)

Laboratório de Análise Neuro Comportamental (LANEC)

• O animal que é utilizado no laboratório é o Rato Wistar;• Possui um biotério de criação e experimentação;• São utilizados diversos modelos para estudo do

comportamento (labirinto em cruz, campo aberto, caixas de condicionamento);

• São realizadas pequenas neuro cirurgias; • Manipulações farmacológicas do sistema nervoso;• Seleções genéticas comportamentais;• Fenotipagem de linhagens de ratos;• Trabalha-se principalmente com Ansiedade e Pânico;

O Campo Aberto

• Importante modelo experimental utilizado para delinear comportamentos defensivos e atividade locomotora de roedores é o campo aberto;

• O Teste de Campo aberto é um modelo animal que possibilita registrar o medo através da atividade exploratória do animal. Consiste de uma grande câmara vazia, onde o indivíduo é colocado.

• Uma vez dentro do campo, a atividade do animal é registrada.

O Campo Aberto

• Além disso, pode-se contar também o número de bolos fecais produzidas pelos animais durante o teste.

• Uma baixa atividade motora e alta contagem de bolas fecais freqüentemente indica uma reação de medo do animal. Ratos com medo procuram não se aventurar para longe das paredes da câmara, além de evitarem em ficarem sobre as patas traseiras ou se limpar.

• Os ratos apresentam tal comportamento de medo quando introduzidos num campo aberto desconhecido. Este comportamento irá diminuir à medida que o animal se familiarize com a caixa.

Labirinto em Cruz Elevado • Um dos modelos animais de

ansiedade animal mais eficiente e mais usado;

• Consiste de estrutura de quatro braços, elevados 50 cm do chão. Dois braços possuem paredes, sendo chamados de “braços fechados”. Os outros dois braços não possuem as paredes, sendo chamados de “braços abertos”.

• O comportamento do rato no labirinto é passível de medição através da observação direta e pode ser quantificado através de programas de computador especiais. Tais programas determinam o tempo em que o rato permanece em cada braço, além da freqüência com que o animal entra nos braços abertos e fechados.

Labirinto em Cruz Elevado

• O labirinto permite também avaliar a atividade motora do animal.

• Observou-se que drogas ansiolíticas, incluindo os benzodiazepínicos, barbitúricos e etanol, aumentam o número de entradas e permanência nos braços abertos, enquanto que agentes ansiogênicos produzem um efeito oposto.

Caixa de Condicionamento

• Um dos principais modelos utilizados para se estudar o comportamento animal;

• Tal modelo consiste numa câmara à prova de som, que possui mecanismos responsáveis para fornecer punições ou recompensas.

Caixa de Condicionamento

Cirurgias Esteriotáxicas

• São realizadas cirurgias esteriotáxicas em pequenos roedores (ratos); com o intuito de instalar cânulas guias, que servirão de acesso para micro-injeções intracerebrais de substâncias químicas para modulações farmacológicas do comportamento ou para se realizar ablações (lesões) cerebrais e verificar a relação entre ausência de estrutura e o comportamento.

Cirurgias Esteriotáxicas

Atlas

• Um atlas ajuda na identificação das coordenadas para cirurgias esteriotáxicas.

Histologia

• Além de observação comportamental, todo procedimento é confirmado através de cortes histológicos que vão mostrar se a região do cérebro foi realmente manipulada (cirúrgica ou farmacologicamente).

Biotério

• Aspectos Estruturais;

• Bem estar e Reprodução animal;

• Enriquecimento ambiental;

O Rato.

Origem:• O rato de laboratório, Rattus

novergicus, usado na maioria dos biotérios e infectórios, deriva de colônias desses animais, originários dos EUA. Embora seja originário de regiões da Ásia central, acompanhou o homem em seu avanço pelos continentes, sendo encontrado, hoje em dia, em praticamente todas as latitudes.

Taxonomia

• Classe: Mammalia

• Ordem: Rodentia

• Família: Muridae

• Gênero: Rattus

• Espécie: Rattus novergicus

Rattus rattus

Gestação

• O período de gestação se estende de 19 a 22 dias. Após o 10º dia, já se pode observar o aumento de volume do abdômen. O parto duro, em média, de 1 a 2 horas (sempre à noite). A média de filhotes/ parto é de 8, para o rato Wistar, mas podemos encontrar ninhadas com até 16 filhotes. Este número sempre é menor para animais Inbred.

Dados Biológicos • O rato nasce desprovido de pêlos, com exceção

das vibrissas (responsáveis pelo tato), e com o corpo avermelhado; com os olhos fechados. O pavilhão auricular também fechado e aderido à cabeça e pesando de 4g a 6g. Após parto, a fêmea amamenta a ninhada. Esse fenômeno pode ser observado através da mancha branca no abdômen dos animais, que nada mais é do que leite no estômago. Tal fato é importante, já que os filhotes mais fracos não mamam e, portanto, em caso de seleção ao nascimento, este, além da robustez do animal, é um fator de descarte.

Dados Biológicos • A pele dos animais vai clareando ou escurecendo, de

acordo com a coloração da linhagem, e os pêlos começam a despontar por volta do 3º ao 4º dia de vida. Com 7 dias o corpo está totalmente recoberto de pêlos, as tetas são visíveis nas fêmeas e as orelhas já começam a se afastar da cabeça e a se abrirem. Por volta do 10º dia os animais abrem os olhos. Aos 16 dias já começam a se alimentar independentemente e dos 18 aos 24 já estão aptos ao desmame. Nessa idade, são sexados, geralmente pesados e separados. O peso ao desmame varia de 35g a 45g e a sexagem é feita baseada na distância ano-genital, que no macho é bem maior do que na fêmea, além da visualização da bolsa escrotal.

Dados Biológicos

• A puberdade se dá aos 30 dias e a maturidade sexual, dos 50 aos 60 dias. Em geral, o acasalamento ocorre nesse período, quando os machos já pesam de 200g a 250g e as fêmeas, de 150g a 180g. Os animais permanecem em reprodução até os 9 meses de idade. Os machos podem pesar de 500g a 600g e as fêmeas de 300g a 400g.

Biotério PUC-Rio: Reprodução

Reprodução• Ciclo Estral: tem a duração de 4-5 dias e se divide em:

• Proestro: tem duração de 12 horas. Podemos observar uma pequena tumefação na vulva e a mucosa vaginal se apresenta ressecada.

• Estro: tem a duração de 12 horas e a tumefação da vulva chega ao máximo.

• Metaestro I: tem a duração de 15 horas e. além da tumefação da vulva começar a diminuir, podemos observar uma massa caseosa na vagina;

• Metaestro II: tem duração de 6 horas e a vulva volta ao normal. A mucosa vaginal se apresenta úmida.

• Diestro: tem a duração de 57 horas e a vulva continua normal. A mucosa

vaginal se apresenta úmida.

ReproduçãoO Proestro começa com a fase folicular do ovário, que

culmina na ovulação, no estro (= Cio). O metaestro e o diestro se caracterizam pela fase luteínica do ovário.

• Fase Folicular ou Proliferativa = Aumento de estrogênio.

• Fase Lútea (secretora) ou Progestacional = Aumento da Progesterona.

• As alterações desta fase têm a finalidade de produzir um endométrio secretor, contendo grande quantidade de nutrientes, proporcionando condições para a implantação do óvulo fertilizado.

Dosagens hormonais (Estrogênio e Progesterona) em roedores

• Vantagens:

• Sistema automático.

• Realiza grande quantidade de testes.

• Precisão.

Dosagens hormonais (Estrogênio e Progesterona) em roedores

• Desvantagens:• Aparelhos devem ser

calibrados para aspirar menor quantidade de soro.

• Uso de radioatividade no caso de radioimunoensaio.

• Os animais (roedores de laboratório), são sacrificados para os testes, pois a dosagens necessitam de sangue total.

• Alto custo financeiro.

Citologia Hormonal

Correlação morfológica das células do trato reprodutor feminino com o

ciclo estral (estrogênio e progesterona)

Citologia Hormonal (aspectos citológicos)

• As Células do trato genital são divididas em:

• Superficiais (A)• Intermediárias (B)• Profundas (C)

Citologia no Proestro/ Estro (Cio) = Ovulação

• Ação estrogênica:• Proliferativa;• Células superficiais;• Diferenciação;• (característica núcleo

picnótico);• Células eosinofílicas.

Citologia no Metaestro/Diestro

• Ação Progesterônica:• Características de

células intermediárias;• Depósito

citoplasmático de glicogênio;

• Pregueamento;• Grupadas e dobradas.

Aspectos Estruturais (Biotério)Atual

• O Biotério do Laboratório de Análise Neuro Comportamental PUC-Rio atualmente destina-se a criação, manutenção e experimentação com Ratos Wistar.

• Considerado “Convencional” não possuindo barreiras sanitárias rígidas.

• Possuindo em seu plantel ratos outbred e está desenvolvendo uma linhagem Inbred (consangüínea).

Biotério PUC-Rio

• As condições ambientais são desenvolvidas visando proporcionar conforto aos pequenos roedores.

• Estes ratos são utilizados para estudos etológicos/comportamentais, neurocirurgias e modulações farmacológicas do sistema nervoso.

Biotério PUC-Rio

• Estrutura física: Paredes chão e teto;

• Exaustão e Insuflação;

• Ciclo de Luz/ claro e escuro e intensidade luminosa;

• Temperatura ºC;

• Umidade%;

• Depósito para ração, maravalha e materiais (armário);

• Ruído;

• Estantes, Gaiolas e bebedouros.

Biotério PUC-Rio

• Paredes em azulejo;• Chão de piso frio;• Teto plástico (PVC);• Revestimento em lã de

vidro (Isolante térmico e acústico).

• Ideal: tudo em alvenaria e epóxi.

Biotério PUC-Rio

• O sistema de exaustão está posicionado na parte de cima da sala, com o objetivo de retirar o ar saturado e a amônia do ambiente;

• A insuflação está posicionada em baixo; com o objetivo de renovar o ar ambiente;

• Ideal: Exaustão em baixo 60cm acima do chão e a insuflação em cima.

Biotério PUC-Rio: Exaustão

Biotério PUC-Rio: Insuflação

• A insuflação é importante para renovar o ar da sala de animais e o ar que entra passa por um filtro, esta insuflação deve ser colocada na parte de cima do Biotério.

Biotério PUC-Rio: Ciclo de Luz

• Um Timer controla o ciclo de luz da sala, 12 horas claro e 12 horas escuro;

• Importante para a reprodução e bem estar animal.

• Este mecanismo sempre está funcionando, inclusive finais de semana e feriados.

Biotério PUC-Rio: Intensidade de luz

• A intensidade da luz é ideal para roedores, sendo fraca para as pessoas, porém, o rato sendo um animal albino e fotofóbico, o melhor é uma luz branca e de baixa intensidade.

Biotério PUC-Rio:Temperatura ºC

• A temperatura fica em torno de 21ºC;

• O sistema de refrigeração é composto por ar condicionado split, 2 aparelhos;

• Acima do teto foi colocado um isolante térmico “manta”, ajudando manter a temperatura ideal para os roedores.

Biotério PUC-Rio:Umidade %

• A umidade é controlada por um desumidificador ARSEC, que retira a água do ambiente;

• A umidade na sala de animais fica em torno de 55%.

Biotério PUC-Rio: Depósito de materiais (ração, maravalha e materiais)

Biotério PUC-Rio:Ruído

• No Biotério a entrada de pessoal é restrita;

• O aparelho de Ar condicionado e o sistema de exaustão fazem um ruído constante;

• O ruído constante é menos prejudicial ao animal, minimizando o estresse;

• O enriquecimento ambiental (música ambiente) pode ser interessante para diminuir a variação de ruídos de final de semana para a segunda-feira, tendo então um nível constante em decibés de barulho no Biotério.

Biotério PUC-Rio:Estantes, gaiolas e Bebedouros

• As estantes são higienizadas semanalmente,

• A água é trocada 3 x por semana e os frascos higienizados;

• A cama dos animais (maravalha) é trocada e as caixas lavadas de acordo com o número de animais, idade e sexo; numa freqüência de uma a duas vezes por semana.

Classificação dos animais de

laboratório

quanto ao status genético

Animais não consangüíneos ou Outbred.

• São animais que apresentam na constituição genética uma alta heterozigose (99%), o que faz com que seja mantida numa mesma colônia uma grande diversidade genética (vários alelos), possibilitando a reprodução de populações naturais.

Animais consangüíneos ou Inbred.

• Um animal consangüíneo é o produto de 20 gerações consecutivas de acasalamentos entre irmãos, ou pais e filhos. Utilizando esse tipo de acasalamento, conseguimos obter um índice de homozigose de 99%, o que torna tais animais os mais idênticos possíveis que se pode obter.


• Para cada 50 mil ou mais genes que um roedor possui, 99% apresentam o mesmo alelo em dose dupla. Isso significa que cada linhagem consangüínea apresenta um conjunto único de características que as diferencia entre si.


• Esse conjunto de características que constitui cada linhagem é composto de genes que sofrem menor ou maior grau de influências ambientais. Por isso a manutenção desses animais deve ser feita de maneira rigorosa, de modo que as variações, através das gerações sejam mínimas.

Acasalamento consangüíneo

(formação de linhagens). • O sistema de acasalamento de irmãos da mesma

ninhada é o mais fácil para a manutenção das características da linhagem consangüínea. Entretanto, animais com características individuais podem ser selecionados para acasalamento, a fim de fixarmos essas características na linhagem, ou quando estamos desenvolvendo uma nova linhagem.

Linhagens de Animais – Seleção Bidirecional • Existe uma grande variabilidade fisiológica e comportamental entre

indivíduos de uma mesma espécie. Isto está ligado à capacidade que cada indivíduo possui para enfrentar situações desafiadoras ou estressantes.

• Na tentativa de se elucidar as influências genéticas que contribuem para a ocorrência de determinado comportamento ou resposta fisiológica, utiliza-se um procedimento de formação de linhagens obtidas através de sucessivos cruzamentos de animais de uma dada população que apresentem altos ou baixos valores extremos do traço desejado.

• Quando uma seleção genética ocorre baseando-se nos extremos do fenótipo desejado, no caso de uma pesquisa comportamental, designa-se uma seleção bi-direcional. Neste sentido as duas linhagens divergentes irão progressivamente mostrar diferenças maiores através das gerações no que diz respeito ao traço desejado, e nos genes que definem tal traço.

Linhagens de Animais – Seleção Bidirecional

• De fato, a seleção de animais com base no desempenho em um determinado teste, resultam em linhagens com consistentes padrões comportamentais através das gerações.

• O processo de seleção tem a capacidade de influenciar o padrão de uma série de respostas fisiológicas subjacentes ao traço selecionado.

Linhagens Selecionadas com base na resposta de congelamento

• A resposta de congelamento é uma importante medida de ansiedade encontrada em roedores;

• Para eliciar tal resposta, utiliza-se o condicionamento aversivo. Sabe-se que este tipo de aprendizagem é hereditário em camundongos. Além disso, é importante observar que o condicionamento aversivo também possui caráter hereditário em humanos.

• Indivíduos com diagnóstico de ansiedade generalizada demonstram maior aquisição e menor extinção do condicionamento aversivo.

• Desta forma, estudos genéticos objetivam a elucidação dos genes envolvidos nos transtornos de ansiedade.

Importância

• Animais geneticamente predispostos a demonstrar alta quantidade de comportamentos defensivos, relacionados a transtornos psiquiátricos humanos, oferecem uma oportunidade única para o teste de compostos farmacológicos potencialmente eficazes contra tais transtornos;

• Estes animais também são importantes ferramentas experimentais para se desvendar as bases neurobiológicas, comportamentais e genéticas de uma série de enfermidades psiquiátricas, que vão desde a ansiedade à depressão.

• Objetivo futuro: Ratos com Alta taxa de Congelamento serão usados como modelo animal para transtorno de ansiedade generalizada. (TAG).

Manejo reprodutivo

• Feromônios: Os roedores são sensíveis a feromônios, os machos liberam substâncias que induzem o estro das fêmeas, para um melhor manejo reprodutivo, os machos serão colocados nas gaiolas 48hs antes que as fêmeas, para que liberem seus feromônios através da urina, isto também irá ajudar na sincronização dos cios, visto que, as fêmeas antes da reprodução ficam juntas em gaiolas após a sexagem, de certa forma, induzindo um anestro temporário.

Manejo reprodutivo • Confirmação da reprodução: os cruzamentos serão organizados na

parte da tarde, para que a monta ocorra a noite, na manha seguinte, observa-se o tampão vaginal ou através da observação de espermatozóides da cavidade vaginal da fêmea, que será coletado através de swab e confecção de lâminas para observar a luz do microscópio óptico os espermatozóides. Obs: isto será muito importante para se saber se as fêmeas de linhagens consangüíneas não estão sendo cobertas pelos machos ou se estão sendo cobertas, mas não nascem filhotes devido à consangüinidade (absorção de embriões, genes deletérios, homozigose ou algum problema genético).

• Idade para reprodução: diminuir a idade dos ratos para reprodução de 3 para 2 meses.

Problemas com reprodução de Linhagens

• Ratos Inbred, são mais sensíveis as variações ambientais (Temperatura, ruído, e etc.),

• Ratos Inbred podem ser mais estressados e possuem maior dificuldade para realizar a monta nas fêmeas e estas mais agressivas para aceitar a monta;


• Senilidade Reprodutiva: os animais nunca devem passar de 9 meses para acasalar, pois ocorre diminuição da produção de espermatozóides nos machos e deficiência hormonal nas fêmeas (anestro);

• Superpopulação: as fêmeas quando se encontram em superpopulação suspendem o ciclo estral (anestro) não ocorrendo a ovulação, e pode abortar casa esteja prenha.


• O estresse pode levar ao aborto espontâneo, principalmente nos primeiros dias de gestação;

• Problemas relativos a endogamia: aborto espontâneo, animais portadores de genes letais;

• Maior susceptibilidade a variações do meio, pela menor diversidade gênica.

Biotério PUC-Rio (Manejo Zootécnico) Linhagens de ratos: Carioca com Baixo Congelamento (CBC), Cariocas com Alto Congelamento (CAC) e Controle –

Geração S=1

RATOS (FÊMEAS) R.ALTA (CBC) R.BAIXA (CAC) TOTAL

ACASALADAS 6 5 11

GRÁVIDAS 6 5 11

MED.FECUNDAÇÃO 100% 100% 100%

NÚMERO DE FILHOTES 45 43 88

FILHOTES POR FÊMEA GRÁVIDA 7,5 8,6 8

FILHOTES. POR FÊMEA ACASALADA (IP) 7,5 8,6 8

Biotério PUC-Rio (Manejo Zootécnico) Linhagens de ratos: Carioca com Baixo Congelamento (CBC), Cariocas com Alto Congelamento (CAC) e Controle

– Geração S=2


ACASALADAS 11 11 22

GRÁVIDAS 11 10 21



FILHOTES POR FÊMEA GRÁVIDA 10,5 10,4 10,4

FILHOTES. POR FÊMEA ACASALADA (IP) 10,5 9,5 9,5


– Geração S=3


ACASALADAS 10 10 20

GRÁVIDAS 8 8 16



MED.FILHOTES POR FÊMEA GRÁVIDA 9,9 9 9,4

MED.FIL. POR FÊMEA ACASALADA (IP) 7,9 7,2 7,5


– Geração S=4


ACASALADAS 14 14 28

GRÁVIDAS 12 14 26



MED.FILHOTES POR FÊMEA GRÁVIDA 10,9 7,3 8,96

MED.FIL. POR FÊMEA ACASALADA (IP) 9,35 7,3 8,3


– Geração S=5

RATOS (FÊMEAS) R.ALTA (CBC) R.BAIXA (CAC) CONTROLE TOTAL

ACASALADAS 16 16 16 48

GRÁVIDAS 10 10 11 31

MED.FECUNDAÇÃO 63% 63% 69% 65%

NÚMERO DE FILHOTES 42 51 60 153

MED.FILHOTES POR FÊMEA GRÁVIDA 4,2 5,1 5,45 4,9

MED.FIL. POR FÊMEA ACASALADA (IP) 2,62 3,18 3,75 3,2


– Geração S=6

RATOS (FÊMEAS) R.ALTA (CBC) R.BAIXA (CAC) COTROLE TOTAL

ACASALADAS 15 15 10 40

GRÁVIDAS 9 7 9 25

MED.FECUNDAÇÃO 60% 47% 90% 63%

NÚMERO DE FILHOTES 79 68 85 232

MED.FILHOTES POR FÊMEA GRÁVIDA 8,77 9,71 9,4 9,3

MED.FIL. POR FÊMEA ACASALADA (IP) 5,3 4,5 8,5 5,8

Biotério PUC-Rio (Controle Zootécnico): Reprodução/

Fecundação%

FECUNDAÇÃO % R.ALTA (CBC) R.BAIXA (CAC) CONTROLE TOTAL

S=1 100 100 N/A 100

S=2 100 91 N/A 95

S=3 80 80 N/A 80

S=4 86 100 N/A 93

S=5 63 63 69 65

S=6 60 47 90 63

Biotério PUC-Rio (Controle Zootécnico): Reprodução/ Fecundação%

Fecundação

0

20

40

60

80

100

120

S=1 S=2 S=3 S=4 S=5 S=6

R.ALTA (CBC) R.BAIXA (CAC) CONTROLE

TOTAL Seqüência4 Seqüência5

Biotério PUC-Rio (Controle Zootécnico): Reprodução/ Fecundação%

100 100

80 86

63 60

10091

80

100

6347

0 0 0 0

69

90100 9580

93

65 63

10

20

40

60

80

100

120

R.ALTA (CBC) R.BAIXA (CAC) CONTROLE TOTAL Seqüência4

R.ALTA (CBC) 100 100 80 86 63 60

R.BAIXA (CAC) 100 91 80 100 63 47

CONTROLE 0 0 0 0 69 90

TOTAL 100 95 80 93 65 63

Seqüência4 1

S=1 S=2 S=3 S=4 S=5 S=6

Biotério PUC-Rio (Controle Zootécnico): Reprodução/ Número de filhotes por fêmea grávida (FFG)

FFG R.ALTA (CBC) R.BAIXA (CAC) CONTROLE TOTAL

S=1 7,5 8,6 N/A 8

S=2 10,5 10,4 N/A 10,4

S=3 9,9 9 N/A 9,4

S=4 10,9 7,3 N/A 9

S=5 4,2 5,1 5,45 4,9

S=6 8,77 9,71 9,4 9,3


FFG

0

2

4

6

8

10

12

S=1 S=2 S=3 S=4 S=5 S=6

R.ALTA (CBC) R.BAIXA (CAC) CONTROLE TOTAL


7,5

10,5 9,9 10,9

4,2

8,778,610,4

97,3

5,1

9,71

0 0 0 0

5,45

9,4

810,4 9,4 9

4,9

9,3

110

5

10

15



R.ALTA (CBC) 7,5 10,5 9,9 10,9 4,2 8,77

R.BAIXA (CAC) 8,6 10,4 9 7,3 5,1 9,71

CONTROLE 0 0 0 0 5,45 9,4

TOTAL 8 10,4 9,4 9 4,9 9,3

Seqüência5 1

S=1 S=2 S=3 S=4 S=5 S=6

Biotério PUC-Rio (Controle Zootécnico): Reprodução/ Número de filhotes por fêmea acasalada

(Índice de Produção-IP)

IP R.ALTA (CBC) R.BAIXA (CAC) CONTROLE TOTAL

S=1 7,5 8,6 N/A 8

S=2 10,5 9,5 N/A 9,5

S=3 7,9 7,2 N/A 7,5

S=4 9,35 7,3 N/A 8,3

S=5 2,62 3,18 3,75 3,2

S=6 5,3 4,5 8,5 5,8



IP

0

2

4

6

8

10

12

S=1 S=2 S=3 S=4 S=5 S=6





7,5

10,5

7,99,35

2,62

5,3

8,69,5

7,2 7,3

3,184,5

0 0 0 0

3,75

8,5

89,5

7,58,3

3,2

5,8

110

2

4

6

8

10

12

R.ALTA (CBC) R.BAIXA (CAC) CONTROLE TOTAL Seqüência4 Seqüência5

R.ALTA (CBC) 7,5 10,5 7,9 9,35 2,62 5,3

R.BAIXA (CAC) 8,6 9,5 7,2 7,3 3,18 4,5

CONTROLE 0 0 0 0 3,75 8,5

TOTAL 8 9,5 7,5 8,3 3,2 5,8

Seqüência4 1

Seqüência5 1

S=1 S=2 S=3 S=4 S=5 S=6

Obrigado!

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