MÓDULO I

Electroforese

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Electroforese: uma técnica electrizante

Laboratório Virtual de Biotecnologia

Introdução

A electroforese é uma das técnicas

básicas da Biologia molecular e é uma

das mais utilizadas pelos cientistas no

seu trabalho diário. Esta técnica

permite a separação de moléculas de

diferentes tamanhos. Antes do seu

aparecimento, a separação de

fragmentos de DNA, por exemplo, era

feita recorrendo a um método

laborioso: a ultracentrifugação por

velocidade de sedimentação. Neste

método, as amostras de DNA eram

sujeitas a uma centrifugação de alta

velocidade envoltas num gradiente de

sal ou açúcar que separava os

fragmentos por tamanho.

Em 1970, Daniel Nathans utilizou

a electroforese em gel de

poliacrilamida como uma técnica

simples e rápida para separar

fragmentos de DNA. A partir daí esta

técnica disseminou-se de tal modo

que, actualmente, ela é utilizada em

virtualmente todos os laboratórios de

biologia molecular.

O que é a electroforese?

Electroforese significa literalmente

“transportar através de electricidade”.

Tem por base o princípio que

determina que a carga global de uma

cadeia de DNA é negativa. Portanto,

moléculas de DNA que se encontrem

em suspensão numa solução

electrolítica (isto é, que possua iões

livres) podem ser separadas através

da aplicação de uma dada voltagem.

No final do processo, as cadeias de

DNA estarão próximas do ânodo

(eléctrodo positivo), que atrai

moléculas de carga negativa. No

entanto, o objectivo desta técnica é

separar os fragmentos de várias

moléculas por tamanho. A solução é

“peneirar” esses fragmentos utilizando

para esse efeito crivos moleculares.

As moléculas são “empurradas”

através desse crivo pela corrente

eléctrica, e, de acordo com o tamanho

dos poros do crivo, passam ou são

retidas. O crivo utilizado é o gel de

agarose ou de poliacrilamida. Ao

solidificar, este gel forma uma rede

através da qual passam as moléculas

de DNA.

Para que se possa utilizar esta

técnica, é necessário montar todo o

material necessário:

Primeiro, é necessário preparar o gel

de agarose (mais utilizado do que o

gel de poliacrilamida). Para isso,

dissolve-se agarose (uma forma muito

pura de agar, substância obtida a

partir de algas marinhas) com a

solução-tampão que necessariamente

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irá cobrir o gel na montagem final do

material. Normalmente, na

electroforese de DNA, utiliza-se a

solução-tampão Tris-Acetato de EDTA

(TAE). Aquece-se a mistura para

facilitar a dissolução e deita-se

cuidadosamente a mistura na tina de

electroforese, recipiente que dará

forma ao gel e onde irá ocorrer a

electroforese. Antes que o gel

solidifique, coloca-se no local

adequado o pente que fará os poços

onde se colocarão as amostras. Após

ter solidificado, obtém-se o gel que

servirá de suporte à electroforese e

de crivo para as moléculas que irão

migrar. De seguida, preenche-se a

tina de electroforese com solução-

-tampão até o gel ficar totalmente

coberto por esta. Esta solução é

importante por duas razões:

possibilita a passagem da corrente

eléctrica e mantém as moléculas e o

pH da solução estáveis. Só depois de

tudo estar coberto pela solução-

-tampão é que se retira o pente,

ficando os poços onde se vão colocar

as amostras devidamente delimitados

no gel (Fig.1).

Quanto às amostras que serão

carregadas no gel, é importante

realçar que elas são previamente

misturadas com o tampão de amostra

(Loading dye), que tem como principal

função aumentar a densidade da

amostra e, assim, impedir que esta

comece a flutuar no tampão antes que

a voltagem seja aplicada ao sistema.

Além disso, o tampão de amostra

possui um corante, o que possibilita a

visualização do progresso da

electroforese (uma vez que o DNA não

é visível a olho nu). Normalmente

utiliza-se como tampão de amostra

uma mistura de azul de bromofenol

Figura 1 – Montagem do material necessário para realizar a electroforese.

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(Corante), xileno-cianol e glicose ou

glicerol (para aumentar a densidade),

dissolvidos na solução-tampão.

Quando todo o material está

preparado e todas as amostras são

carregadas nos devidos poços, inicia-

-se a electroforese: liga-se a fonte de

energia, o que faz com que seja

fornecida corrente a cada um dos

eléctrodos presentes de ambos os

lados da tina de electroforese,

criando-se um campo eléctrico ao

longo do gel. Os fragmentos de DNA

iniciam a sua migração, abandonando

os poços e movendo-se através do gel

de agarose. O DNA, carregado

negativamente, migra através dos

poros do gel em direcção ao eléctrodo

carregado positivamente (ânodo).

O movimento visível das moléculas do

corante (que também migram em

direcção ao ânodo) permite controlar

a migração relativa das moléculas de

DNA, que, nesta fase, não se

conseguem visualizar.

Após a electroforese, é necessário

corar o DNA para podermos visualizar

os resultados. Para isso, mergulha-se

o gel numa solução diluída de

brometo de etídio. O brometo de

etídio difunde-se através do gel

concentrando-se nas regiões onde

estão os fragmentos de DNA. Uma vez

que o brometo de etídio é uma

molécula planar, intercala-se nas

moléculas de DNA, corando-as

(Fig.2).

O gel corado é posteriormente

exposto a luz ultravioleta (UV). O

complexo DNA-brometo de etídio,

quando observado sob a luz UV,

torna-se fluorescente indicando a sua

posição no gel. É importante perceber

que uma banda de DNA observada no

gel de agarose não corresponde a

uma única molécula de DNA mas sim

a vários milhões de moléculas

idênticas, todas do mesmo tamanho.

Figura 2 – Moléculas de brometo de etídio

intercaladas na dupla hélice do DNA.

Aplicações da técnica de

electroforese

A electroforese é aplicada em

diversas áreas, sempre que é

necessário proceder à separação de

fragmentos de DNA ou de outras

moléculas. Dada a sua simplicidade e

facilidade de uso, esta técnica

substituiu outras técnicas de

separação. É utilizada para visualizar

fragmentos provenientes da digestão

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de enzimas de restrição ou para

visualizar produtos da reacção de

PCR. A análise dos padrões de bandas

obtidos no gel de agarose é muito

importante no diagnóstico de várias

doenças genéticas, por exemplo.

Questões de análise

No Laboratório Virtual de

Biotecnologia encontrará dois vídeos

que ilustram e explicam algumas

etapas da electroforese (canal 4 e 5

da LVBtv).

1 – Descreva o que ocorre durante

uma electroforese.

2 – Enumere as principais vantagens

desta técnica relativamente a outras

utilizadas anteriormente para separar

moléculas de DNA.

3 – Faça uma lista do material

necessário para realizar uma

experiência utilizando esta técnica.

4 – Indique duas aplicações desta

técnica.

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Desenho experimental:

Registos/Observações:

ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA

Durante a electroforese

as moléculas de DNA

migram todas à mesma

velocidade? Princípios:

Conceitos:

Teoria: Conclusões:

Pista 1 Pista 2

Tamanho da molécula de DNA

Pista 1

Pista 2

300 pb 900 pb

1700 pb

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Desenho experimental:

Registos/Observações:

ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA

A concentração em

agarose do gel

influencia a migração

das moléculas de

DNA?

Princípios:

Conceitos:

Teoria: Conclusões:

Pista 1 Pista 2

Tamanho da molécula de DNA

Pista 1

Pista 2

300 pb 900 pb

1700 pb

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Desenho experimental:

Registos/Observações:

ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA

A migração de um

fragmento de DNA

influencia a migração

de outro?

Princípios:

Conceitos:

Teoria: Conclusões:

Pista 1 Pista 2

Tamanho da molécula de DNA

Pista 1

Pista 2

300 pb 900 pb

1700 pb