Lorena - S.P. - Brasil . 2004sistemas.eel.usp.br/bibliotecas/antigas/2004/BIT04004OCR.pdfEm...

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

Pós-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

ESTUDO DA OBTENÇÃO DE XILITOL EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA

COM CÉLULAS IMOBILIZADAS EM GEL DE ALGINATO DE CÁLCIO

Este exemplar corresponde à

versão final da Tese de Doutorado

aprovada pela banca examinadora

Dr. Silvio Silvério da Silva

Presidente da Banca Examinadora

Lorena - S.P. - Brasil

. 2004

A os- meccs- p~ Walt-er 8' Eligabeth{

A mú1Jia- noiY~ Lar~·

A o- mec« irmão; Luca4-:

AGRADECIMENTOS

Este trabalho é resultado de uma jornada que se iniciou em 1994, quando tive a

oportunidade de me envolver em atividades laboratoriais extraclasse no 1 º ano de graduação

em Farmácia. Ao longo destes anos, encontrei muitas pessoas que me ajudaram a chegar até

este ponto, pelo que agradeço a Deus. Em hipótese alguma, poderia deixar de citar os nomes

da Prof'. Miriam A P. Vilela (UFJF), do Prof Silvio S. Silva (Faenquil) e do Prof Ranil

Wickramasinghe (CSU), que confiaram em mim e me deram a oportunidade de trabalhar em

seus laboratórios. Igualmente, também não poderia deixar de citar os nomes do Prof Ismael

M. Mancilha (Faenquil), do Prof Michele Vitolo (USP), do Prof Attilio Converti (UNIGE),

do Prof Arnaldo M. R. Prata (Debiq), do Prof João B. A Silva (Faenquil), do Prof Marco A

M. Furtado (UFJF), da Prof'. Maria G. A Felipe (Faenquil), da Prof'. Inês C. Roberto

(Faenquil), do Dr. James D. McMillan (NREL) e do Dr. Binbing Han (CSU), que

participaram ativamente dos meus trabalhos de pesquisa, oferecendo sugestões e

complementando a formação adquirida com os professores em sala de aula. A estes, também

agradeço de coração.

À UFJF, à CAPES e à F APESP, agradeço pelas bolsas de iniciação científica,

mestrado e doutorado, respectivamente.

Aos amigos de curso e de laboratório, agradeço pela convivência, pelo estímulo e pela

ajuda nos inúmeros momentos dificeis. Em especial, gostaria de lembrar o nome de André

Luís de Almeida (in memoriam).

BIOGRAFIA

Walter de Carvalho, filho de Walter José de Carvalho e de Elizabeth Aparecida Lima

Carvalho, nasceu em Ribeirão Vermelho, Minas Gerais, no dia 23 de setembro de 1973.

Em fevereiro de 1994, ingressou no curso de Farmácia pela Faculdade de Farmácia e

Bioquímica da Universidade Federal de Juiz de Fora (Juiz de Fora, M.G.), onde obteve o

título de Farmacêutico em dezembro de 1997.

Em fevereiro de 1998, ingressou no curso de Mestrado em Biotecnologia Industrial

pela Faculdade de Engenharia Química de Lorena (Lorena, S.P.), onde obteve o título de

Mestre em Biotecnologia Industrial em abril de 2000.

Em dezembro de 2000, ingressou no curso de Doutorado em Biotecnologia Industrial

pela Faculdade de Engenharia Química de Lorena (Lorena, S.P.).

\

RESUMO

Estudo da obtenção de xilitol em hidrolisado de bagaço de cana com células imobilizadas em gel de alginato de cálcio. Walter de Carvalho. Tese de Doutorado. Programa de Pós- Graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia. Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Silvio Silvério da Silva (FAENQUIL, C.P. 116, 12.600-970, Lorena, S.P., Brasil). Banca Examinadora: Dr. Alfredo Eduardo Maiorano, Dr. Ismael Maciel de Mancilha, Dr. José Geraldo da Cruz Pradella, Dr. Maria das Graças de Almeida Felipe. Dezembro de 2004.

O presente trabalho buscou definir condições adequadas para a obtenção de xilitol em

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana utilizando a levedura Candida guilliermondii

FTI 20037 imobilizada em alginato de cálcio. Inicialmente, a produção de xilitol foi avaliada

em três sistemas fermentativos diferentes: frascos Erlenmeyer - 125 mL (EF), reator de

mistura - 2.4 L (STR) e reator de mistura tipo cesta - 2.4 L (BSTR). Enquanto os sistemas EF

e STR resultaram em produções equivalentes de xilitol, a fermentação no sistema BSTR foi

prejudicada por limitações na transferência de massa. Em etapa seguinte, as metodologias de

planejamento de experimentos e de superficie de resposta foram utilizadas para determinar

condições adequadas de fermentação no sistema STR. Modelos empíricos foram ajustados aos

dados experimentais, considerando a produtividade e o rendimento em xilitol como variáveis

dependentes. A partir destes modelos, condições adequadas para a produção de xilitol no

sistema STR foram definidas, a saber: fator de concentração do hidrolisado (5.0), vazão de ar

(1.30 L/min), agitação (300 rpm), concentração inicial de células (1.4 g/L), pH inicial do meio

de fermentação (6.0). Utilizando estas condições, obteve-se uma produção de xilitol igual a

4 7. 5 g/L após 120 h de fermentação, resultando em produtividade e rendimento iguais a

0.40 g/L h e 0.81 g/g, respectivamente. As células imobilizadas puderam ser reutilizadas

durante cinco bateladas repetidas de fermentação sem prejuízos na produção de xilitol. Em

valores médios ( coeficientes de variação inferiores a 1 O % ), foram obtidos 51.6 g/L de xilitol

em cada uma das bateladas repetidas de fermentação, com produtividade e rendimento iguais

a 0.43 g/L h e 0.71 g/g, respectivamente. Por outro lado, foi observada uma redução de

31.6 % no volume médio das esferas de alginato de cálcio ao final do 5º ciclo de fermentação.

A suplementação do hidrolisado de bagaço de cana com sulfato de amônio e extrato de farelo

de arroz maximizou a produção de xilitol pela levedura. Esta suplementação se mostrou

benéfica ao longo de todas as bateladas repetidas.

ABSTRACT

Study of xylitol obtainment from sugarcane bagasse hydrolysate by Ca-alginate entrapped cells. Walter de Carvalho. Doctorate Thesis. Post-Graduation Program in Industrial Biotechnology. Department of Biotechnology. Chemical Engineering College of Lorena. Supervisor: Dr. Sílvio Silvério da Silva (FAENQUIL, C.P. 116, 12.600-970, Lorena, S.P., Brazil). Examining Board: Dr. Alfredo Eduardo Maiorano, Dr. Ismael Maciel de Mancilha, Dr. José Geraldo da Cruz Pradella, Dr. Maria das Graças de Almeida Felipe. December, 2004.

This study aimed to define adequate conditions for xylitol obtainment frorn sugarcane bagasse

hemicellulosic hydrolysate using the yeast Candida guilliermondii FTI 20037 entrapped in

Ca-alginate beads. Initially, the xylitol production was evaluated in three different

fermentation systems: 125-mL Erlenmeyer flasks (EF), 2.4-L stirred tank reactor (STR) and

2.4-L basket-type stirred tank reactor (BSTR). While the EF and the STR systems resulted in

similar xylitol productions, the fermentation in the BSTR system was affected by rnass-

transfer limitations. ln a further step, the experimental design and the response surface

methodologies were used in arder to determine adequate conditions for cultivating the

entrapped cells in the STR system. Empírica! models were fitted to the experimental data,

considering the xylitol productivity and yield as dependent variables. From these models,

adequate conditions for xylitol production in the STR system were defined: hydrolysate

concentration factor (5.0), air flowrate (1.30 L/min), agitation speed (300 rpm), initial cell

concentration (1.4 g/L), initial pH ofthe fermentation medium (6.0). Using these conditions, a

xylitol production of 47.5 g/L was obtained after 120 h of fermentation, resulting in

productivity and yield of 0.40 g/L h and 0.81 g/g, respectively. The immobilized cells were

reused during tive successive batch fermentations, without lasses in the xylitol production. ln

average ( variation coefficients lower than 1 O % ), a xylitol production of 51. 6 g/L was

obtained in each one of the successive batch fermentations, with productivity and yield of

0.43 g/L h and 0.71 g/g, respectively. On the other hand, a reduction of 31.6 % in the average

volume of the Ca-alginate beads was observed at the end of the fifth fermentation cycle. The

supplementation of the hydrolysate with amrnonium sulfate and rice bran extract maximized

the xylitol production by the yeast. This supplementation was shown to be beneficial along all

the successive batch fermentations.

- ,-

I

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO --------------------------------------------------------------------------1

2 O BJ ETIV OS ----------------------------------------------------------------------------- 3

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA --------------------------------------------------------4

3.1 Biomassa Lignocelulósica ------------------------------------------- 4

3. 1. 1 Bagaço de Cana-de-Açúcar-------------------------------------------------------- 6

3.2 Xilitol, Propriedades e Aplicações----------------------------- 7

3 .2.1 Produção de Xilitol em Escala Industrial ---------------------------------------- 9

3.3 Produção de Xilitol por Via Biotecnológica --------------------------10

3.3.1 Principais Fatores que Interferem na Bioconversão de Xilose em Xilitol---14

3 .3 .1.1 Concentração Inicial de Xilose----------------------------------------------14

3 .3 .1.2 Taxa de Transferência de Oxigênio-----------------------------------------15

3. 3. 1. 3 Inibidores do Metabolismo Celular-----------------------------------------17

3. 3. 1. 4 Modo de Condução da Fermentação ---------------------------------------22

3.4 Imobilização de Células em Gel de Alginato de Cálcio------------------24

3.5 Cultivo de Células Imobilizadas---------------------------------------29

4 MATERIAIS E MÉTODOS -------------------------------------------------------- 34

4.1 Obtenção, concentração e tratamento do hidrolisado hemicelulósico do

bagaço de cana de açúcar------------------------------------------------------34

4.2 Microrganismo e obtenção das células ------------------------------------------34

_,./

"'"\

II

4.3 1 mo bil izaçã o d as célula s------------------------------------------------------------35

4.4 Meio e condições de fermentação----------------------------------------36

4.4.1 Avaliação da Performance das Células Imobilizadas na Produção de Xilitol

em Diferentes Sistemas Fermentativos -----------------------------------------------------------3 7

4.4.2 Identificação dos Principais Fatores que Influenciam a Produção de Xilitol

em Reator de Mistura ---------------- ---------------------------------------------------------------3 9

4.4.3 Elaboração de Modelos Empíricos para Predição da Produção de Xilitol em

Reator de Mistura -----------------------------------------------------------------------------------41

4.4.4 Avaliação da Estabilidade Operacional do Sistema de Produção de Xilitol

em Reator de Mistura -------------------------------------------------------------------------------4 2

4.4.4.1 Avaliação das Necessidades Nutricionais da Levedura para a Produção

de Xilitol na Modalidade de Bateladas Repetidas de Fermentação-------------------------43

4.5 Métodos Analíticos -------------------------------------------------------------44

4. 5. 1 Determinação das Concentrações Celulares ----------------:-------------------44

4.5.2 Determinação da Estabilidade das Esferas de Alginato de Cálcio -----------45

4.5.3 Determinação do Teor de Açúcares, Xilitol, Ácido Acético, Furfural e

Hidróxi-m eti l-furfural-------------------------------------------------------------------------------46

4.5.4 Determinação do teor de produtos de decomposição da lignina--------------47

4. 5. 5 Determinação dos Parâmetros Fermentativos ---------------------------------4 7

5 RESUL TACOS E DISCUSSÃO--------------------------------------------------- 50

5.1 Caracterização Parcial dos Hidrolisados Obtidos ·------------------50

5.2 Avaliação da Performance das Células Imobilizadas na Produção de

Xilitol em Diferentes Sistemas Fermentativos --------------------------------------54

III

5.2.1 Comparação dos Resultados com Dados da Literatura------------------------59

5.3 Identificação dos Principais Fatores que Influenciam a Produção de

Xilitol em Reator de Mistura -------------------------------------------------------------------60


5.4 Elaboração de Modelos Empíricos para Predição da Produção de Xilitol

em Reator de Mistura------------------------- ------------ 73

5 .4. 1 Definição das Condições de Cultivo para a Produção de Xilitol em Reator de

Iviistura ---------------------------------------------------------------------------------------80

5.5 Avaliação da Estabilidade Operacional do Sistema de Produção de Xilitol

em Reator de Mistura-------------- -----------84


5.5.2 Avaliação das Necessidades Nutricionais da Levedura para a Produção de

Xilitol no Sistema de Bateladas Repetidas de Fermentação------------------------------------88

6 CONCLUSÕES ----------------------------------------------------------------------- 93

7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS------------------------------ 95

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS--------------------------------------------- 96

IV

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: Valores reais das variáveis independentes utilizados nos ensaios, de acordo com

um planejamento fatorial fracionado do tipo 2/-1 .......................•......................•......... 40

TABELA 2: Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado do tipo 2/·1 utilizado

para a identificação dos principais efeitos / interações que influenciam a produção de

xilitol 40

TABELA 3: Matriz experimental utilizada para compor o planejamento fatorial fracionado

do tipo 2/-1 em face centrada 42

TABELA 4: Planejamento experimental utilizado para a avaliação das necessidades

nutricionais da levedura para a produção de xilitol no sistema de bateladas repetidas de

fermentação 43

TABELA 5: Caracterização parcial do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana obtido

após hidrólise ácida 50

TABELA 6: Caracterização parcial dos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana

submetidos à concentração por fatores iguais a três (H3), quatro (Ri) e cinco (Hs) 51


submetidos à concentração por fatores iguais a três (H3), quatro (Ha) e cinco (H«),

detoxificação e autoclavagem 52


submetidos a concentração por fatores iguais a três (H3), quatro (Ri) e cinco (Hc) 53

TABELA 9: Caracterização parcial do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

submetido à concentração por fator igual a cinco 54

TABELA 10: Performance dos sistemas fermentativos empregados na bioconversão de xilose

em xilitol 57

TABELA 11: Dados reportados na literatura sobre o uso de células imobilizadas em esferas

V

de alginato de cálcio para a produção de xilitol em meios sintéticos e hidrolisados

hemicelulósicos · 59

TABELA 12: Parâmetros fermentativos determinados após 72 h de fermentação 61

TABELA 13: Análise de variância dos efeitos principais e de interações entre 2 fatores sobre

a produtividade (Qp) 62


o rendimento (Yp;s) 63

TABEL.\ 15: Parâmetros fermentativos determinados nos tempos de 72 e 120 h de

fermentação. Condições de cultivo: fator de concentração do hidrolisado (5.0), vazão de

ar (1.30 L/min), agitação (300 rpm), concentração inicial de células (1.4 g/L), pH inicial

do meio (6.0) 71

TABELA 16: Dados reportados na literatura sobre a produção de xilitol em hidrolisados

hemicelulósicos de bagaço de cana com a levedura Candida guiltiermondii FTI 20037 72

TABELA 17: Parâmetros fermentativos determinados após 72 h de fermentação 73

TABELA 18: Valores dos coeficientes de regressão mantidos no modelo proposto para a

predição da produtividade em xilitol 75

TABELA 19: Análise de variância do modelo quadrático e da falta de ajuste dos dados

experimentais a este modelo 76


predição do rendimento em xilitol 78


experimentais a este modelo 79

TABELA 22: Parâmetros fermentativos determinados nos tempos de 72 e 120 h de

fermentação. Condições de cultivo: fator de concentração do hidrolisado (5.0), vazão de

ar (1.30 L/min), agitação (300 rpm), concentração inicial de células (1.4 g/L), pH inicial

VI

do meio (6.0) 82

TABELA 23: Parâmetros fermentativos determinados ao final de cada uma das 5 bateladas

repetidas de fermentação 85

TABELA 24: Dados reportados na literatura sobre o uso da levedura Candida guilliermondii

FTI 2003 7 para a produção de xilitol em hidrolisado de bagaço de cana na modalidade de

bateladas repetidas de fermentação 88

TABELA 25: Parâmetros fermentativos determinados nas bateladas repetidas de fermentação

···································································································································· 89

VII

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Exemplos de produtos que contêm xilitol. -------------------------------------------- 8

FIGURA 2: Principais vias metabólicas usadas na fermentação de xilose por leveduras

(HAHN-HAGERDAL et al.. 1994). -----------------------------------------------------------12

FIGURA 3: Produtos formados durante a hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos

(PALMQVTST e HAHN-HAGERDAL 2000b ). ----------------------------------------------18

FIGURA 4: Métodos de imobilização de enzimas e células (BÁLES, 1994). -----------------25

FIGURA 5: Modelo para a formação da malha de alginato de cálcio envolvendo: a)

dimerização inicial, e b) subseqüente agregação dos dímeros pré-formados induzida por

íons cálcio (GEMEINER et al., 1994 ). --------------------------------------------------------29

FIGURA 6: Ilustração do equipamento utilizado para a imobilização das células de Candida

guilliermondii em esferas de gel de alginato de cálcio. --------------------------------------36

FIGURA 7: Representação esquemática do reator de mistura utilizado para a bioconversão de

xi lose em xi I ito 1. -------------- --------------------------------------------------------------------3 8

FIGURA 8: Representação esquemática do reator tipo cesta utilizado para a bioconversão de

xi lose em xi l ito l. ----------------------------------------------------------------------------------3 8

FIGURA 9: Bioconversão de xilose em xilitol em frascos Erlenmeyer. Concentração de

células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio, X1 <•), e no reator, Xn, (O);

concentração de células livres no meio de fermentação, XM <•), e no reator, XRM (O);

concentração celular total no reator, XR (.6.). ------------------------------------------------55

FIGURA 1 O: Bioconversão de xilose em xilitol em reator de mistura. Concentração de

células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio, X1 <•), e no reator, XR! (O);

concentração de células livres no meio de fermentação, XM (e), e no reator, J(m.1 (O);

concentração celular total no reator, XR ( .6. ). -------------------------------------------------56

FIGURA 11: Bioconversão de xilose em xilitol em reator tipo cesta. Concentração de células

VIII

imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio, X,(•), e no reator, XRJ (O); concentração

de células livres no meio de fermentação, .X:11 (e), e no reator, XRA-1 (O); concentração

celular total no reator, XR ( .6. ). ------------------------------------------------------------------58

FIGURA 12: Valores preditos para a produtividade (a) e rendimento (b), em função do fator

de concentração do hidrolisado e da concentração inicial de células. ----------------------65


de concentração do hidrolisado e do pH inicial do meio de fermentação. -----------------66

FIGURA 14: Valores preditos para a produtividade (a) e rendimento (b), em função do pH

inicial do meio de fermentação e da velocidade de agitação. -------------------------------68

FIGURA 15: Valores preditos para rendimento, em função da vazão de ar e da velocidade de

agitação. -------------------------------------------------------------------------------------------69

FIGURA 16: Plote dos resíduos em função dos valores preditos pelo modelo quadrático

proposto para a predição da produtividade. --------------------------------------------------- 76 : -. -

FIGURA 17: Superfície de resposta descrita pela equação 25, que relaciona a produtividade

com o fator de concentração do hidrolisado e com o pH inicial do meio de fermentação.

------------------------------------------------------------------------------------------------------77


proposto para a predição do rendimento. ------------------------------------------------------ 79

FIGURA 19: Superficie de resposta descrita pela equação 27, que relaciona o rendimento


------------------------------------------------------------------------------------------------------80 FIGURA 20: Superposição das curvas de nível que relacionam a produtividade e o

rendimento em xilitol com o fator de concentração do hidrolisado e com o pH inicial do

meio de fermentação. ----------------------------------------------------------------------------81

FIGURA 21: Perfis do consumo de glicose (v'), xilose (•), arabinose (e) e ácido acético

IX

(0), da produção de xilitol (Ã), e do crescimento de células livres no reator, X1t11 (0).83

FIGURA 22: Valores de concentração final (Pr-) obtidos durante a produção de xilitol, em

frascos Erlenmeyer, no sistema de bateladas repetidas de fermentação: Ensaio A C•);

Ensaio B (e); Ensaio C (A); Ensaio D (D); Ensaio E (O); Ensaio F (.6).---------------90

FIGURA 23: Valores de produtividade (Qp) obtidos durante a produção de xilitol, em frascos

Erlenmeyer, no sistema de bateladas repetidas de fermentação: Ensaio A C•); Ensaio B

(e); Ensaio C (A); Ensaio D (D); Ensaio E (O); Ensaio F (.6). --------------------------91

FIGURA 24: Valores de rendimento (YP/S) obtidos durante a produção de xilitol, em frascos

Erlenmeyer, no sistema de bateladas repetidas de fermentação: Ensaio A (•): Ensaio B

(e); Ensaio C (A); Ensaio D (D); Ensaio E (O); Ensaio F (.6). --------------------------92

LISTA DE SÍMBOLOS

A: Fator de concentração do hidrolisado

B: Vazão de ar

BSTR: Reator de mistura tipo cesta

C: Agitação

D: Concentração inicial de células

E: pH inicial do meio de fermentação

E%: Eficiência da conversão de xilose em xilitol

EF: Frascos Erlenmeyer

1%: Percentual de células imobilizadas no reator

PF: Concentração final de xilitol

Qp: Produtividade em xilitol

qp: Produtividade específica em xilitol

Qs: Taxa do consumo de xilose

qs: Taxa específica do consumo de xilose

R%: Percentual de redução no volume médio das esferas de alginato de cálcio

S0: Concentração inicial de xilose

S%: Percentual do consumo de xilose

STR: Reator de mistura

V: Volume médio das esferas de alginato de cálcio

X1: Concentração de células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio

XM: Concentração de células livres no meio de fermentação

XR: Concentração celular total no reator

XRo: Concentração inicial de células no reator

Xru: Concentração de células imobilizadas no reator

X

XI

XRJ\1: Concentração de células livres no reator

Y p1s: Fator de rendimento da conversão de xilose em xilitol

YX!c: Fator de rendimento da conversão de glicose e xilose em células

l INTRODUÇÃO

O xilitol é um álcool pentahidroxilado que apresenta poder adoçante equivalente ao da

sacarose. Além de prevenir a formação de cáries, exerce também um efeito sobre as lesões já

existentes ocasionando remineralização do esmalte dos dentes e regeneração das cáries já

formadas. Além disso, pode ser utilizado por diabéticos, por pessoas obesas e por pacientes

que apresentam desordens no metabolismo de gorduras.

Este poliol é produzido em escala industrial por meio da redução de xilose obtida de

materiais lignocelulósicos. Após extensivas etapas de purificação, a xilose é reduzida a xilitol

na presença de um catalisador inorgânico sob condições elevadas de temperatura e pressão.

Este processo confere ao produto final um preço elevado.

Desde a descoberta da habilidade de certas leveduras em produzir xilitol, a

possibilidade de produção deste composto por via biotecnológica tem despertado interesse

para aplicação em escala comercial. Idealmente, a redução da xilose seria realizada - ---·-

diretamente no hidrolisado (sem purificação prévia da xilose) sob condições amenas de

temperatura e pressão, reduzindo-se os custos de produção.

O principal obstáculo na utilização de hidrolisados hemicelulósicos para a produção

biotecnológica de xilitol refere-se à presença de substâncias tóxicas aos microrganismos,

originadas durante a etapa de hidrólise. Os valores de concentração final, rendimento e

produtividade em xilitol obtidos em meios constituídos por hidrolisados são inferiores aos

valores obtidos em meios sintéticos, elaborados com xilose comercial. A condução da

fermentação na modalidade de bateladas repetidas é um procedimento que contribui para

superar estes efeitos tóxicos, uma vez que promove adaptação das células.

Em um estudo prévio (CARVALHO, 2000), desenvolvido nos laboratórios do Grupo

de Microbiologia Aplicada e Bioprocessos (GMBio) do Departamento de Biotecnologia

(Debiq) da Faculdade de Engenharia Química de Lorena (Faenquil), foram determinadas

2

condições adequadas para a imobilização da levedura Candida guilliermondii FTI 2003 7 em

gel de alginato de cálcio. Naquele estudo, foi constatado o efeito benéfico da condução da

fermentação na modalidade de bateladas repetidas para a produção de xilitol em hidrolisado

hemicelulósico de bagaço de cana. O presente trabalho visou dar continuidade ao estudo

inicial com células imobilizadas em gel de alginato de cálcio, procurando definir condições

adequadas de cultivo para maximizar a produção de xilitol. Após a definição destas

condições, a estabilidade operacional do sistema foi avaliada durante uma seqüência de

bateladas repetidas de fermentação.

3

2 OBJETIVOS

./ Avaliar a performance das células imobilizadas na produção de xilitol em frascos

Erlenmeyer, reator de mistura e reator tipo cesta;

,/ Identificar os principais fatores que influenciam a produção de xilitol, em reator de

mistura, utilizando a metodologia de planejamento experimental;

./ Elaborar modelos empíricos para a predição da produção de xilitol, em reator de mistura,

utilizando a metodologia de superficie de resposta;

,/ Avaliar a estabilidade operacional da produção de xilitol, em reator de mistura, na

modalidade de bateladas repetidas de fermentação.

4

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA

A biomassa vegetal constitui uma fonte potencial de carbono e energia que pode ser

empregada em bioprocessos para a produção de diversos produtos de valor agregado, uma vez

que é abundante, renovável e de baixo custo (TSAO, 1986). O mercado para os produtos

derivados da biomassa vegetal inclui combustíveis e insumos químicos em geral. Dentre

estes, encontram-se alimentos, fármacos e enzimas (LOUWRIER, 1998; WINKELHAUSEN

e KUZMANOV A, 1998).

Os materiais lignocelulósicos representam a fração mais expressiva da biomassa

vegetal (LUTZEN et al., 1983). Estes materiais são compostos principalmente por uma

mistura de carbohidratos polimerizados ( celulose e hemicelulose) e lignina. A composição

exata não é bem definida, e varia de espécie para espécie com relação aos constituintes e às

proporções entre eles (KUHAD e SINGH, 1993).

A celulose, principal componente da parede celular da fibra vegetal, é um

homopolissacarídeo linear formado por unidades de D-glicose unidas entre si através de

ligações glicosídicas do tipo f3 (1-+4), com grau de polimerização de até 25.000 unidades. As

fibrilas de celulose envolvem as células vegetais em arranjos paralelos regulares e são

geralmente mantidas juntas por uma matriz de outro material polimérico, a hemicelulose

(FENGEL e WEGENER, 1989).

A hemicelulose, fração que chega a representar até 40 % do material da parede celular

da fibra vegetal e age como substância de reserva e sustentação, é um heteropolímero formado

por pentoses (xilose e arabinose) e por hexoses (glicose, manose e galactose} e seus

correspondentes ácidos urônicos. Esta fração é geralmente acetilada e sua composição varia

amplamente, dependendo da espécie considerada. O grau de polimerização deste

heteropolímero é geralmente inferior a 200 unidades (FENGEL e WEGENER, 1989).

5

A lignina, fração responsável pela rigidez e baixa reatividade destes materiais, é

encontrada na parede celular de todas as plantas vasculares. Esta macromolécula de elevado

peso molecular possui estrutura polifenólica complexa, sendo formada através da

polimerização desidrogenativa de três precursores primários: trans-p-cumaril, trans-coniferil e

trans-sinapil. Junto com hemicelulose e pectina, a lignina preenche os espaços entre as fibrilas

de celulose, atuando assim como um material de ligação entre componentes da parede celular

(FENGEL e WEGENER, 1989).

Os constituintes dos materiais lignocelulósicos encontrados em menores proporções

incluem extrativos e não-extrativos. Os extrativos consistem de graxas, gomas, amidos,

alcalóides, resinas, óleos essenciais e outros constituintes citoplasmáticos. Os não-extrativos

incluem compostos como sílica, carbonatos e oxalatos, sendo freqüentemente responsáveis

por características como cor, sabor, resistência ao apodrecimento e propriedades abrasivas

(KUHAD e SINGH, 1993).

A utilização dos diferentes componentes, passíveis de serem obtidos a partir dos

materiais lignocelulósicos, requer a separação seletiva de cada uma das frações. Isto implica

na ruptura do complexo lignina - hemicelulose - celulose e na remoção de cada fração por

técnicas de pré-tratamento, hidrólise e deslignificação (FENGEL e WEGENER, 1989). A

separação simultânea de cada um dos principais constituintes (lignina, celulose· e

hemicelulose) em sua forma polimérica, usando procedimentos de separação convencionais

como cristalização, precipitação ou extração, não é factível. No mínimo um dos polímeros

acima citados deve ser degradado tendo em vista as diferenças entre suas propriedades

químicas (PARAJÓ et ai., 1998c).

Dentre os diferentes métodos empregados para a recuperação dos açúcares presentes

na fração hemicelulósica dos materiais lignocelulósicos, a hidrólise com ácidos diluídos tem

se mostrado eficiente para a obtenção de hidrolisados fermentescíveis, sendo os ácidos

6

sulfürico e clorídrico os mais comumente empregados para este fim (P ARAJÓ et al., 1998c ).

Esta técnica, também conhecida como pré-hidrólise, apresenta vantagens como minimização

da formação de produtos de degradação e aumento da susceptibilidade da celulose à hidrólise

subseqüente (MAGEE e KOSARIC, 1985).

Uma limitação crítica na utilização de hidrolisados hemicelulósicos em processos de

bioconversão é a presença de inibidores do metabolismo microbiano. Estes inibidores tornam

os hidrolisados substancialmente mais dificeis de serem utilizados por microrganismos em

relação à correspondente mistura de açúcares puros. São, em sua maioria, produtos de

degradação formados durante a fase de hidrólise. O conhecimento dos inibidores e de como

minimizar seus efeitos no metabolismo microbiano é de extrema importância para se alcançar

um processo de fermentação eficiente (WINKELHAUSEN e KUZMANOV A, 1998).

3.1.1 BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

O Brasil é um dos maiores produtores de cana-de-açúcar do mundo. De acordo com

dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, foram processadas cerca de

360 milhões de toneladas deste material para a produção de açúcar e álcool na safra

2003/2004. Tendo em vista que cada tonelada de cana-de-açúcar processada gera de 180 a

280 Kg de bagaço (SANTANA e SOUZA, 1984), pode-se estimar que, somente na safra

2003/2004, o Brasil produziu entre 65 e 100 milhões de toneladas de bagaço de cana. Embora

o bagaço gerado durante a produção de açúcar e álcool seja utilizado em grande parte pela

própria indústria sucro-alcooleira como fonte energética, existe ainda um excedente deste

material, em torno de 1 O %, que gera problemas de estocagem e poluição ambiental. ,,

O bagaço é o subproduto obtido após a moagem da cana-de-açúcar para a extração do

suco, sendo composto basicamente de água, fibras e pequenas quantidades de sólidos

solúveis. Em média, as fibras do bagaço de cana são constituídas por 50 % de celulose, 25 %

de hemicelulose e 25 % de lignina (P ANDEY et a!. 2000), sendo que a xilose pode perfazer

7

até 80 % dos carbohidratos presentes na fração hemicelulósica (KUHAD e SINGH, 1993).

Diversos processos têm sido idealizados para utilização racional do excedente de

bagaço gerado pela indústria sucro-alcooleira. Como exemplo, cita-se a geração de energia, a

produção de polpa e papel e a produção de insumos por via fermentativa (P ANDEY et ai.,

2000; PROCKNOR, 2000). Neste contexto, uma das linhas de pesquisa em desenvolvimento

nos laboratórios do GMBio/Debiq/Faenquil visa o aproveitamento da xilose presente na

fração hemicelulósica do bagaço de cana para a produção de xilitol, um adoçante com várias

aplicações. Espera-se, desta forma, agregar valor a um material de baixo custo, que gera

problemas de estocagem e poluição ambiental.

3.2 XILITOL, PROPRIEDADES E APLICAÇÕES

O xilitol é um álcool pentahidroxilado de fórmula molecular C5H120s. Apresenta

poder adoçante equivalente ao da sacarose (BAR, 1986) e é um produto intermediário do

metabolismo de carbohidratos no homem e em animais (MANZ et ai., 1973). A produção

endógena diária é em média de 5 a 15 gramas em uma pessoa adulta normal (EMODI, 1978).

Este poliol ocorre naturalmente em certas frutas e vegetais, entretanto a extração a

partir destas fontes é economicamente inviável devido às pequenas concentrações (EMODI,

1978).

As suas diversas propriedades despertam interesse comercial por parte de indústrias

alimentícias e farmacêuticas. Prova disso é o número crescente de produtos contendo xilitol

que vêm sendo lançados no mercado. A FIGURA 1 ilustra alguns produtos comercializados

nos mercados europeu e norte-americano. No Brasil, apesar de incipiente, algumas indústrias

já têm utilizado o xilitol na formulação de alguns produtos, podendo-se citar como exemplos

o creme dental Sorriso Ação Total e a bala Smints.

FIGURA 1: Exemplos de produtos que contêm xilitol.

8

O xilitol não é fermentado pelos microrganismos da flora bucal (PEPPER. e

OLINGER, 1988). À luz das evidências científicas disponíveis, é considerado o melhor de

todos os adoçantes alternativos em refação à prevenção de cáries (WINKELHAUSEN e

KUZMANOVA, 1998). Segundo SCHE1N1N et ai. (1975), o xilitol além de prevenir a

formação de cáries, exerce também um efeito sobre as 1esões já existentes ocasionando uma

remineralização do esmalte dos dentes e das cáries já formadas. De acordo com W ÃLER et

al. (1992), este é um efeito único do xilitol entre os demais polióís como sorbitol e manitol.

Pode ser utilizado em substituição à sacarose por pacíentes diabéticos e obesos, uma

vez que seu metabolismo independe de insulina e contribuí pouco para a formação de tecidos

gordurosos (MAKINEN, 1976; YLIKAHRI, 1979). É também indicado para pacientes

portadores de deficiência da enzima glícose-6P-desidrogenase (W ANG e van EYS, 1981) e,

nos últimos anos, alguns estudos têm evidenciado a eficácía do uso de xilitol na prevenção de

otites (UHARI et ai., 1998).

O xilitol não participa de reações de escurecimento do tipo "Maillard", devido à

ausência de grupos aldeídicos e cetônicos na sua mo1écu1a, o que o torna apropriado para a

9

utilização em alimentos processados em temperaturas elevadas (MANZ et al., 1973) e

apresenta elevado calor de dissolução negativo, que confere sensação agradável de frescor,

tornando-o apropriado ao revestimento de gomas de mascar (BÀR, 1986).

Ressalta-se ainda que, pelo fato deste adoçante apresentar poder de edulcoração

relativa igual à sacarose, a sua utilização pela indústria alimentícia na confecção de alimentos

dietéticos em substituição ao açúcar é vantajosa quando comparada aos demais adoçantes.

Como a substituição ocorre na proporção de 1: 1, o balanço de massa dos produtos não é

afetado, proporcionando manutenção das propriedades organolépticas do produto final

(EMODI, 1978).

Este adoçante é classificado como "Generally Recognised as Safe" pelo "Food and

Drug Administratton ". No Brasil, é aprovado como produto dietético pela Divisão Nacional

de Vigilância Sanitária de Medicamentos do Ministério da Saúde (AGUIAR et ai., 1999).

3.2.1 PRODUÇÃO DE XILITOL EM ESCALA INDUSTRIAL

O xilitol é produzido em escala industrial através da redução de xilose pura sob

elevadas condições de temperatura e pressão, utilizando-se como catalisador o níquel de

Raney (MELAJA e HAMALAINEN, 1977).

Nesta via de produção, a solução de xilose, obtida por meio da hidrólise ácida de

materiais lignocelulósicos ricos em xilanas, passa por extensivas operações de troca iônica e

fracionamento cromatográfico de forma a se obter uma solução com elevado grau de pureza.

A etapa de hidrogenação ocorre em reatores descontínuos a pressões elevadas (50 atm) e

temperaturas entre 80 e 140 ºC, na presença de níquel de Raney. Após a remoção do

catalisador por filtração e troca iônica, a solução contendo xilitol é concentrada, sofre

fracionamento cromatográfico através de resinas catiônicas e é cristalizada para a obtenção de

xilitol puro (MELAJA e HAMALAfNEN, 1977; MIKKOLA et al., 2000).

A necessidade dos extensivos passos de fracionamento da solução de xilose ( visando a

10

eliminação de impurezas que podem interferir na catálise), a necessidade dos extensivos

passos de purificação da solução de xilitol (visando a eliminação de resíduos tóxicos do

catalisador e subprodutos gerados durante a redução da xilose) e a necessidade do uso de

elevadas temperatura e pressão durante a catálise química conferem ao processo um custo

relativamente elevado (OJAMO et al., 1988).

3.3 PRODUÇÃO DE XILITOL POR VIA BIOTECNOLÓGICA

Apesar da grande gama de aplicações, o uso do xilitol como adoçante é ainda limitado.

O custo de produção comparativamente alto ( cerca de 1 O vezes o custo de produção da

sacarose ou do sorbitol) parece ser o fator responsável, encorajando o desenvolvimento de

tecnologias capazes de diminuir os custos de produção (P ARAJÓ et al., 1998a). Neste

contexto, a produção por via biotecnológica está se tomando mais atrativa nos últimos anos

porque se espera redução significativa dos custos de produção (WINKELHAUSEN e

KUZMANOV A, 1998).

Os primeiros trabalhos significativos referentes à produção microbiológica de xilitol

relatam a busca por microrganismos adequados para emprego neste bioprocesso (GONG et

ai., 1981; BARBOSA et ai., 1988 ). Entretanto, o interesse científico real iniciou-se nos

últimos anos, quando o xilitol, devido às suas propriedades únicas como adoçante alternativo,

começou a ser amplamente utilizado (WINKELHAUSEN e KUZMANOV A, 1998).

A obtenção de xilitol por via biotecnológica é possível graças à capacidade de alguns

microrganismos de sintetizarem a enzima xilose redutase, a qual catalisa a redução de xilose a

xilitol (JEFFRIES, 1983). Em geral, entre os microrganismos, as leveduras são consideradas

as melhores produtoras de xilitol, especialmente aquelas que pertencem ao gênero Candida

(WINKELHAUSEN e KUZMANOV A, 1998). A eficiência e a produtividade dependem do

microrganismo, do meio de fermentação e das condições de cultivo (BARBOSA et ai., 1990;

TAYLOR et al., 1990).

1 l

O primeiro passo do metabolismo da xilose é o transporte deste açúcar através da

membrana celular. Uma vez dentro da célula, a xilose é reduzida a xilitol pela enzima xilose

redutase (EC l. l .1.21) com a participação das coenzimas NADPH ou NADH. A seguir, o

xilitol é secretado para fora da célula ou oxidado a xilulose pela enzima xilitol desidrogenase

(EC 1.1.1.9), com participação de NAD' (SLININGER et al., 1987). A xilulose é fosforilada

a xilulose 5-fosfato, a qual pode ser convertida em piruvato através do complexo enzimático

transcetolase-transaldolase, que faz a conexão entre via das fosfopentoses e via EMP (WEBB

e LEE, 1992; NOLLEAU et al., 1993). O esquema demonstrado pela FIGURA 2 representa

as principais vias metabólicas envolvidas na fermentação de xilose por leveduras.

Dependendo do microrganismo, a enzima xilose redutase difere na especificidade

pelas coenzimas NADPH e NADH. Em estudos realizados com as leveduras Candida

shehatae e Pichia stipitis. a xilose redutase mostrou ser dependente tanto de NADPH quanto

de NADH (BRUINEMBERG et ai., 1984 ). Para leveduras com baixos níveis de atividade de

xilose redutase dependente de NADH, como Candida guilliermondii (NOLLEAU et al.,

1993; SILVA et al., 1996c), condições de anaerobiose levam a um desbalanço no potencial

redox das células e determinam a paralisação do metabolismo da xilose. Em condições

aeróbias, a oxidação de xilitol em xilulose é o passo limitante da velocidade do metabolismo

da xilose, exercendo a atividade da enzima xilitol desidrogenase papel relevante no acúmulo

de xilitol. Por outro lado, sob condições limitadas de oxigênio, a taxa de transporte através da

membrana pode limitar a velocidade de utilização de xilose pela levedura (A.LEXANDER et

ai., 1988; KILIAN e van UDEN, 1988; LIGTHELM et ai., 1988a; SPENCER-MARTINS,

1994; PARAJÓ et ai., 1998a).

Segundo Jeffiies ( 1982), citado por GONG et ai. (1983 ), o metabolismo de xilose

ocorre em um ciclo fechado, o que garante a regeneração do NADPH necessário para a

redução de xilose em xilitol, já que o x.ilitol produzido é eventualmente catabolizado,

12

produzindo glicose ô-fosfato, a qual é metabolizada pela via das fosfopentoses regenerando

este cofator e mantendo o ciclo.

Xilose Glicose

Membrana Citoplasmática

. . . Glicose

NADPH ::!.-- NADH t: ATP NADPH NADP+ ADP

NADP+ ·~ NAD+ \.. ) Xilitol /.,.,,---.-:~--- Glícose-6P

é NAD+ 6-Fosfo;uconatç, I -: Cr02 t'./NADP+ _/ NADH

~ NADPH Frutose-6P Xilulose :::---1 / Ribulose 5P . .. --··· ·· ...- J: ::: ~-- / \ ·- Frutose-1,6PP

Xilulose-SP Ribose-SP _ . ...- I\ ~··· ~''---. Sedoheptulose-7P . ...- Gliceralde1do-3P Dihidrcccacetona-P "--~,;~ ADP -+- N.ID> V- NADH

Eri ~4P .. -··F···rut·· / 6P ATP~~NADH t-+NAD+

Í trose- .-· · ose- __ ..-- Piruvato Glicerol_3P

__ ... ·· .. · NAD+ ~ 1-- ADP ~-~- .·· C02

_ .. ····~ NADH '7 · ',, . -~ATP · +" C02 ~ .

Frutose-6P Gliceraldeido-Sf .../ Acetil-CoA Acetaldeido Glicerol

. (/ "'"'/C:: ---~ \ Acetato NADH NJ.D+ Etanol

!>!,

FADH -.

DE ~ SISTEMA DE TRANSPORTE \ KREBS

GTP .-\_ NAD+

GDP+Pi_,)'-"-...~ 'NADH

Y..ilose

FADH FAD \

NADH NAD+ t

DE ELÉTRONS

\ ADP+Pi ATP

FIGURA 2: Principais vias metabólicas usadas na fermentação de xilose por leveduras

(HAHN-HAGERDAL et ai., 1994).

De acordo com BARBOSA et ai. ( 1988), durante o metabolismo de xilose em

13

leveduras ocorre a oxidação completa de 1 mol de glicose ô-fosfato a C02 pela via das

fosfopentoses, gerando 12 moles de NADPH a partir de NADP'. Estes autores propõem um

rendimento teórico de O, 9 mal de xilitol para cada mo! de D-xilose utilizado, levando em

consideração a seguinte equação geral da bíoconversão:

60 C'_sH1005: 12 ADP -- 12 Pi · 12 H20 · 3 <h --f5.:/ C5H1205: 12 ATP ' 30 C(h (1)

Entretanto, de acordo com SLlNINGER et ai. ( 1987), o metabolismo de xilose em

leveduras gera vários produtos, como dióxido de carbono, etanol, ácido acético e

polissacarídeos. Os fatores de rendimento em produto são dependentes da regulação do fluxo

de carbono através das rotas metabólicas disponíveis Segundo WINKELHAUSEN e

KUZMANOV A ( 1998), a conversão de xilose em xilitol não pode ser separada da conversão

de xilose nos produtos acima mencionados. O processo de formação de xilitol não pode ser

interrompido após o primeiro passo, quando a xilose é convertida em xilitol. O crescimento

celular depende de alguns produtos metabólicos, sendo também necessário que os cofatores

sejam regenerados através de diferentes passos na via metabólica. Desta forma, para a

obtenção de bons rendimentos em xilitol, a quantidade de xilose que é convertida em xilitol e

a quantidade de xilitol que é disponibilizada para o metabolismo devem ser bem balanceadas.

De acordo com MEYRIAL et ai. (1991), a levedura Candida guilliermondii apresenta

alto potencial para ser empregada na produção de xilitol a partir de materiais ricos em xilose.

Recentemente, o gene que codifica a síntese da enzima xilose redutase nesta levedura foi

isolado, clonado e expressado em Pichia pastoris, uma levedura metilotrófica adequada para

emprego em processos fermentativos a nível industrial (HANDUMRONGKUL et ai., 1998).

Uma linhagem desta espécie, Candida guilliermondii FTI 20037, previamente selecionada

nos laboratórios do GMBio/Debiq/Faenquil por BARBOSA et ai. ( 1988), se mostrou um

biocatalisador promissor para ser empregado na conversão de xilose em xilitol tanto em meio

sintético, quanto em hidrolisados de materiais lignocelulósicos (SILVA et ai., 1996a; FELIPE

14

et al., 1996a; ROBERTO et al., 1996; SILVA et al., 1997).

3.3.l PRINCIPAIS FATORES QUE INTERFEREM NA BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM

XILITOL

A bioconversão de xilose em xilitol é influenciada por diversas condições de cultivo,

como nutrição, temperatura, pl-I, concentração de inóculo, concentração de substrato e aeração

(WINKELHAUSEN e KUZMANOY A, 1998). Além do modo de condução da fermentação,

os principais fatores que interferem na bioconversão de xilose em xilitol em meios

constituídos por hidrolisados de materiais lignocelulósicos são: concentração inicial de xilose,

taxa de transferência de oxigênio e presença de inibidores do metabolismo celular.

3.3.1. 1 Concentração Inicial de Xilose

A concentração inicial de xilose no meio de fermentação exerce grande influência na

produção de xilitol. De uma maneira geral, pode-se dizer que a elevação da concentração

inicial de xilose promove o seu rápido consumo e intensifica a produção de xilitol, resultando

em maiores eficiência e produtividade (SILVA e AFSCHAR, 1994; PARAJÓ et al., 1998b ).

Entretanto, o aumento excessivo da concentração de xilose acarreta um decréscimo nas taxas

de crescimento do microrganismo, com conseqüente queda nas taxas de produção de xilitol

(NOLLEAU et al., 1993; SILVA e AFSCHAR, 1994; PARAJÓ et al., 1998b). Dependendo

da espécie de levedura e das condições operacionais, a inibição por excesso de substrato

ocorre geralmente entre 150 e 200 g/L de xilose (P ARAJÓ et ai., 1998b ).

As interferências negativas na produção de xilitol, determinadas pelas maiores

concentrações de xilose. podem ser explicadas em função da pressão osmótica elevada e da

repressão de enzimas que participam do metabolismo deste açúcar (NIGAM e SINGH, 1995),

e podem ser reduzidas ou mesmo eliminadas alterando-se a condução do processo para

descontínuo alimentado (OJAMO et ai., 1988).

IS

Um ponto critico que deve ser observado quando os meios de fermentação são

elaborados com hidrolisados lignocelulósicos é o fato de existirem também efeitos adicionais

relativos à concentração do substrato. Se concentração a vácuo é utilizada para elevar o teor

de xilose por evaporação, ocorre também um aumento simultâneo na concentração de outros

compostos não-voláteis, alguns deles causando inibição do metabolismo microbiano com

conseqüente efeito negativo na produção de xilitol (P ARAJÓ et al., I 998b ). Nestes casos,

deve-se ter em mente que o efeito combinado das concentrações de xilose e inibidores irá

determinar o fator de concentração do hidrolisado adequado para a produção de xilitol

(PARAJÓ et al., 1998c).

Empregando hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz para a produção de xilitol

com a levedura Candida guilliermondii FTI 20037, SILVA e ROBERTO (2001)

determinaram uma máxima concentração inicial de xilose da ordem de 80 g/L, de forma a se

evitar problemas de inibição com conseqüente queda nas taxas de bioconversão.

3.3.1.2 Taxa de Transferência de Oxigênio

Dentre os fatores que regulam a bioconversão de xilose em xilitol, a taxa de

transferência de oxigênio ao meio é o mais importante, uma vez que a variação acima ou

abaixo de um valor ótimo leva a uma diminuição significativa do rendimento e/ou da

produtividade (JEFFRIES, 1983; SKOOG e HÀHN-HAGERDAL, 1988; LIGHTELM et al.,

1988b; SILVA et al., 1996b; SILVA et ai., 1997).

De acordo com DELGENES et ai. (1989), o fator de rendimento em xilitol depende

fortemente da velocidade de transferência de oxigênio, estando esta influência relacionada

com a regeneração de coenzimas e com a produção de A TP durante a fosforilação oxidativa

(JEFFRIES, 1983; NOLLEAU et ai., 1993 ). Em condições aeróbias ocorre maior produção de

massa celular, enquanto que em condições limitadas de oxigênio uma grande parte da xilose é

convertida em xilitol (LIGHTELM et ai., 1988b; GROOTJEN et al., 1991). Um rigoroso

16

controle da disponibilidade de oxigênio é fundamental para se obter elevada eficiência

fermentativa, evitando-se o desvio do metabolismo para a formação de células. Por outro

lado, a falta deste nutriente proporciona um desbalanço tio potencial redox das células

ocasionando a paralisação do crescimento celular, da assimilação de xilose e.

conseqüentemente, da formação de xilitol (SCHNEIDER, 1989; NOLLEAU et al., 1995:

V ANDESKA et al., 1995).

O suprimento limitado de oxigênio favorece a produção de xilitol devido ao

desbalanço entre as concentrações de NAD" e NADH (BRUINENBERG et al., 1984) A

taxas específicas de fornecimento de oxigênio decrescentes, o sistema de transporte de

elétrons não é capaz de reoxidar todo o NADH2 produzido. Como conseqüência, o nível de

NADH2 intracelular aumenta, reduzindo a velocidade de reação da enzima xilitol

desidrogenase e determinando acúmulo de xilitol no meio de cultivo (RIZZI et al., 1989a:

1989b).

RIBEIRO ( 1997) estudou a influência da vazão de ar e da agitação sobre a

bioconversão de xilose em xilitol em hidrolisado de bagaço de cana, cultivando a levedura

Candida guilliermondii FTI 20037 em reator de mistura. Neste estudo, que visou definir as

condições operacionais para se obter a máxima produtividade em xilitol, foi empregado um

planejamento fatorial do tipo 22 e, posteriormente, a metodologia da superficie de resposta.

Foi possível elaborar um modelo empírico que descreveu satisfatoriamente o comportamento

do sistema na região de ótimo. A máxima produtividade volumétrica (0,84 g/Lh) foi obtida

utilizando-se uma agitação de 357 rpm e uma vazão de ar de 0,62 vvm, correspondendo a um

K1,a inicial de 21, 6 h º 1. Nestas condições, foi obtida uma concentração de xilitol igual a 4 L 7

g/L e um fator de conversão de xilose em xilitol igual a 0,71 g/g após 48 h de fermentação.

NAKANO et ai. (2000) demonstraram a importância de se manter um ambiente de

microaerobiose durante a produção de xilitol. Utilizando um programa computacional para

17

controlar em tempo real a vazão de ar fornecida ao sistema, em função dos valores de

oxigênio dissolvido e de dióxido de carbono produzido, estes autores conseguiram obter

elevada eficiência na bioconversão de xilose em xilitol, minimizando a produção de massa

celular. Após cinco bateladas sucessivas de fermentação ( o volume de meio retirado no

decorrer de cada batelada para monitorar o consumo de açúcares e a produção de xilitol foi

compensado pela adição de xilose na forma de soluções superconcentradas ao final de cada

uma das bateladas), foi obtida uma concentração de xilitol igual a 3 56 g/L, com um fator de

conversão de O, 75 g/g.

3.3.J.3 Inibidores do Metabolismo Celular

A utilização da hidrólise ácida para a obtenção de hidrolisados hemicelulósicos, apesar

de sua rapidez e simplicidade, apresenta a desvantagem de levar à formação de produtos

secundários (P ALMQVIST e HÃHN-HAGERDAL, 2000b ). Estes produtos secundários são

em sua maioria substâncias inibitórias do metabolismo microbiano (FERRARI et al., 1992;

KUHAD e SINGH, 1993 ), as quais constituem o principal problema relativo ao uso destes

materiais como meio de fermentação (FELIPE et al., 1997b ). Estes inibidores podem limitar o

consumo do substrato, prejudicar o crescimento celular e a formação de produtos, e até

mesmo interromper o processo fermentativo (PARAJÓ et al., 1998c).

De acordo com PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL (2000b), os inibidores podem

ser divididos em três grandes grupos de acordo com a sua origem: ácidos fracos, derivados do

furano e compostos fenólicos.

A FIGURA 3 ilustra os principais produtos formados durante a hidrólise ácida de

materiais lignocelulósicos. Conforme pode ser observado, quando a hemicelulose é

despolimerizada, xilose, manose, ácido acético, galactose e glicose são liberadas. Em

condições de elevadas temperatura e pressão, a xilose é posteriormente degradada em furfural.

De maneira similar, hidróxi-metil-furfural é formado a partir da degradação de glicose. Estes

18

derivados do furano podem reagir entre si e formar compostos poliméricos. Ácido fórmico

pode ser formado tanto a partir de furfural quanto a partir de hidróxi-metil-furfural. Por outro

lado, ácido levulínico só é formado a partir da degradação de hidróxi-rnetil-furfural. Os

compostos fenólicos são formados devido à degradação da lignina.

Materiais Lignocelulósicos

------------------~----------------- r ' Hemicelulose Celulose Lignina

1 \ t....----i-i...----i.-------,i, _ ... ,~ ~/

Glicose .......

1

' -, ..... _ --

Ácido Acético Xilose Manose Galactose

... \ 1

Compostos Fenólicos .J:..

\ \

' ... ... ' ' \

1 ~ ( 1

I

Furfural Hidróxi-metil-furfural

L :J .. ,,. ......

Ácido :r:~c~- -- - - - - - - - --- --- ... ~

Ácido Levulínico FIGURA 3: Produtos formados durante a hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos

(P ALMQVJST e HAHN-HAGERDAL 2000b ).

Para um dado material lignocelulósico, o tipo e a quantidade de inibidores formados

são função da temperatura, do tempo e da concentração e tipo de ácido utilizados na hidrólise

(PARAJÓ et ai., 1998c). Por exemplo, MARTIN et ai. (2002), empregando diferentes agentes

impregnantes para a obtenção de hidrolisados de bagaço de cana por meio de explosão a

vapor, verificaram que, embora a concentração total de compostos fenólicos tenha

permanecido mais ou menos constante nos diferentes hidrolisados obtidos, as proporções

entre os diferentes compostos variaram significativamente dependendo das condições

empregadas. Utilizando técnicas de HPLC e GC-MS, foram identificados e quantificados

treze compostos fenólicos oriundos da degradação da lignina durante a fase de hidrólise.

O efeito inibitório dos ácidos fracos é dependente do grau de dissociação, que por sua

19

vez é função do pH do meio de fermentação (PARAJÓ et al., 1998c; WINKELHAUSEN e

KUZMANOV A, 1998). Estes ácidos apresentam valores de pKa relativamente elevados. Por

exemplo, os valores de pKa para os ácidos acético, fórmico e levulínico são 4,75 (25ºC), 3,75

(20ºC) e 4,66 (25ºC), respectivamente (P ALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000b ). Em

valores de pH inferiores aos respectivos pKas, estes compostos encontram-se principalmente

nas formas não dissociadas. Nestas formas, os ácidos não dissociados são lipossolúveis e

podem difundir-se através da membrana citoplasmática. No citoplasma, ocorre a dissociação

destes ácidos, determinando decréscimos no pH intracelular para valores inferiores aos limites

fisiológicos (LOHMEIER-VOGEL et ai., 1998). Os mecanismos pelos quais estes ácidos

afetam a homeostase intracelular ainda não são bem compreendidos. O acúmulo intracelular

de ânions (RUSSEL, 1992) e o desacoplamento da produção de A TP pela ATPase da

membrana citoplasmática (LOHMEIER-VOGEL et ai., 1998) têm sido sugeridos.

Dentre os ácidos fracos, o ácido acético tem sido o inibidor mais estudado. Dados

relacionados ao efeito deste ácido na bioconversão de xilose em xilitol sugerem que o efeito

inibitório deste composto depende também da composição e origem do meio de fermentação

(FELIPE et ai., 1997a), bem como da taxa de aeração. Em condições de maior aeração, o

ácido acético é consumido mais rapidamente (PAR.;\JÓ et ai., 1997).

Especificamente com relação aos efeitos inibitórios dos ácidos fracos, vale ressaltar

que o pH inicial do meio de fermentação é uma variável crucial a ser observada durante os

processos de bioconversão de materiais lignocelulósicos. O crescimento celular em meios

preparados a partir destes hidrolisados é fortemente dependente do pH inicial, uma vez que a

concentração de ácidos fracos não dissociados é extremamente sensível a pequenas variações

de pH em torno de 5,0 (PALMQVIST et ai., 1998).

O modo preciso de ação do furfural e do hidróxi-metil-furfural sobre a atividade

microbiana ainda não é completamente entendido, sendo a de-energização celular um dos

20

possíveis mecarusmos envolvidos na ação inibitória (LOHMEIER-VOGEL et ai., 1998).

Entretanto, para a levedura Sacharomyces cerevisiae, foi demonstrada a capacidade deste

microrganismo em reduzir estes compostos até os respectivos álcoois (furfurílico e hidróxi-

metil-furfurílico) em condições anaeróbias (PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000b).

Devido à natureza hidrofóbica, os compostos fenólicos oriundos da degradação da

lignina acarretam em perda da integridade das membranas biológicas, afetando a sua

habilidade em servir como barreiras seletivas e matrizes enzimáticas (HEIPIEPER et al.,

1994). De acordo com PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL (2000b), o mecanismo de

inibição destes compostos ainda não está bem elucidado, principalmente devido à falta de

análises qualitativas e quantitativas acuradas.

A máxima concentração de cada inibidor permitida no meio de fermentação, de modo

a não interferir no processo fermentativo, não pode ser estabelecida de forma geral, uma vez

que é dependente de fatores como espécie e grau de adaptação do microrganismo utilizado,

modo de condução da fermentação e presença simultânea de outros inibidores (P ARAJÓ et

ai., l 998c). Entretanto, de acordo com DELGENES et ai. (1996), o grau de inibição depende

fortemente da natureza e concentração de cada um dos inibidores presentes no meio.

Face aos problemas que ocasionam, os compostos que inibem o metabolismo

microbiano devem ser removidos do meio ou terem suas concentrações reduzidas para que os

hidrolisados possam ser utilizados em processos de bioconversão, uma vez que a interferência

na atividade microbiológica leva a uma diminuição nas taxas e rendimentos de conversão dos

açúcares presentes.

Diversos métodos químicos, fisicos e biológicos têm sido empregados para a

detoxificação de hidrolisados lignocelulósicos. Entre estes, citam-se: alteração do pH por

meio da adição de ácidos e bases (RANATUNGA et ai., 2000), evaporação sob condições

reduzidas de pressão (PALMQVIST et ai., 2000a), adição de sulfito (CONVERTI et ai., '

21

1999), extração com solventes orgânicos (CRUZ et ai., 1999), tratamento com carvão ativo

(ALVES et al., 1998), tratamento com resinas trocadoras de íons (DOMÍNGUEZ et ai., 1996)

e oxidação enzimática (JONSSON et ai., 1998). Ressalta-se que estes métodos são, em sua

maioria, específicos para a remoção de um determinado grupo de substâncias. Desta forma,

para que uma detoxificação eficiente seja alcançada, muitas vezes é necessário combinar mais

de um tratamento durante a fase de preparo do meio de fermentação. Uma observação

importante, feita por P ALMQVIST e HAHN-HAGERDAL (2000a), reporta à necessidade de

se utilizar um procedimento de detoxificação que remova os inibidores de maneira seletiva,

sem afetar a composição dos açúcares fermentescíveis, barata e fácil de ser integrada ao

processo considerado.

ALVES et ai. (1998) definiram uma metodologia para o tratamento do hidrolisado de

bagaço de cana que consiste na alteração do pH com óxido de cálcio e ácido fosfórico seguida

da adição de carvão ativo. Posteriormente, um estudo da influência exercida por estes

tratamentos sobre o hidrolisado de bagaço de cana comprovou a capacidade de remoção de

alguns compostos inibidores (CARVALHO, 2000). Enquanto o tratamento com carvão ativo

reduziu a concentração dos compostos fenólicos derivados da lignina e dos compostos

derivados do furano, a quantificação dos inibidores avaliados não mostrou resultados

concretos na tentativa de se atribuir efeitos específicos ao tratamento por meio da alteração do

pH com óxido de cálcio e ácido fosfórico. Nenhum dos dois tratamentos influenciou a

concentração de ácido acético no hidrolisado.

De acordo com RANATUNGA et ai. (2000), pelo menos teoricamente, a alteração de

pH com ácidos e bases pode remover compostos inibitórios por precipitação e/ou por

conversão para formas não tóxicas. Além disso, estes autores postulam também a

possibilidade de complementação do hidrolisado, durante a adição de ácidos e bases, com

alguma substância que melhore a capacidade de fermentação dos microrganismos.

22

Estratégias biotecnológicas, como emprego de altas concentrações celulares iniciais e

adaptação dos microrganismos aos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados, também

têm sido utilizadas com sucesso para superar os efeitos inibitórios dos hidrolisados

lignocelulósicos sobre a atividade fermentativa dos microrganismos utilizados (FELIPE et ai.,

l 996a,b; P ARAJÓ et ai., 1996). Enquanto o uso de altas concentrações celulares no início das

fermentações limita a morte celular causada pela assimilação ou degradação dos inibidores

(PARAJÓ et ai., 1998c), a adaptação das células propicia um aumento na resistência das

mesmas pela exposição a concentrações gradativamente crescentes destes inibidores (FELIPE

et ai., l 996b ). Ressalta-se que estas técnicas não excluem os tratamentos que visam reduzir a

concentração dos compostos inibidores no meio de fermentação. Ao contrário, os métodos de

detoxificação e as estratégias biotecnológicas podem ser utilizados em conjunto de modo a

promover uma melhor conversão dos açúcares presentes no hidrolisado.

3.3.1.4 Modo de Condução da Fermentação

O modo de conduzir a fermentação exerce grande influência sobre os parâmetros

fermentativos da bioconversão de xilose em xilitol.

A condução da fermentação na modalidade de batelada alimentada tem sido sugerida

por alguns autores como forma de aumentar o fator de conversão de xilose em xilitol através

da suplementação constante de glicose (Y AHASHI et ai., 1996; OH e KIM, 1998) e de

amenizar as interferências negativas determinadas pela alta concentração de xilose sobre o

metabolismo celular (OJAMO et ai., 1988). Por outro lado, o emprego desta técnica tem sido

sugerido também para amenizar a toxicidade de hidrolisados lignocelulósicos. A adição do

meio de fermentação através do uso de baixas vazões permite que as concentrações de

inibidores que podem ser bioconvertidos no reator ( como é o caso do furfural e hidróxi-metil-

furfural em relação à Sacharomyces cerevisiae) permaneçam baixas, minimizando o efeito

inibitório (P ALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000a).

23

O sistema contínuo tem sido recomendado para o estudo da fisiologia celular, uma vez

que permite a obtenção de respostas mais acuradas (WINKELHAUSEN et ai., 1996).

Entretanto, quando analisado como um sistema a ser empregado para a produção de xilitol em

nível industrial, deve-se observar que o percentual de consumo da xilose presente nestes

hidrolisados decresce à medida que se aumenta a vazão específica de alimentação,

principalmente devido às baixas taxas de consumo desta pentose em condições de limitação

de oxigênio. Desta forma, para o consumo integral da xilose. presente no meio, faz-se

necessário o emprego de elevados tempos de residência, dificeis de serem executados na

prática (WINKELHAUSEN e KUZrv1ANOV A, 1998). Uma alternativa que tem sido sugerida

para minimizar esta limitação é o emprego de sistemas com alta densidade celular, obtidos

através de imobilização ou reciclo de células por meio de filtração, centrifugação ou

deposição (PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000a; CHOI et ai., 2000).

A modalidade de processo mais investigada para a produção de xilitol tem sido a

batelada convencional. Este modo de condução é caracterizado por elevadas concentrações

iniciais de substrato, elevadas concentrações de produto no final da fermentação e

produtividades relativamente baixas, devido aos tempos mortos entre as bateladas

(WINKELHAUSEN e KUZMANOV A, 1998). Entretanto, de acordo com PARAJÓ et ai.

( l 998b ), esta modalidade de processo oferece versatilidade e facilidade de condução.

O inóculo necessário para a condução de um processo em batelada pode ser preparado

em um fermentador separadamente para cada batelada ou, mais economicamente, as células

podem ser reutilizadas após o término de cada fermentação. Deve-se observar que a

reutilização de células pode ser benéfica em processos que visam a utilização de açúcares

presentes em hidrolisados hemicelulósicos, uma vez que este procedimento pode levar à

adaptação das células aos compostos inibidores. Um ponto importante a ser observado é a

viabilidade celular, que deve permanecer alta ao final das bateladas (P ALMQVIST e HAHN-

_,)

24

HAGERDAL, 2000a).

A avaliação do efeito da adaptação de células de Candída guilliermondii na produção

de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana foi realizada por SENE et

ai. (1998). Estes autores verificaram que o emprego desta técnica resultou em melhor fator de

rendimento e melhor produtividade. Além disso, quando as células adaptadas foram

recicladas, as taxas e rendimentos de bioconversão apresentaram pequenas variações ao longo

de cinco bateladas repetidas de fermentação, com coeficientes de variação inferiores a l O %.

Um estudo prévio, desenvolvido nos laboratórios do GMBio/Debiq/Faenquil

(CARVALHO, 2000), teve por objetivo determinar condições adequadas de imobilização da

levedura Candida guilliermondii FTI 2003 7 em esferas de alginato de cálcio para a produção

de xilitol em hidrolisado hernicelulósico de bagaço de cana. Naquele estudo, as condições de

imobilização definidas ( concentração de alginato de sódio igual a 2 %, concentração de

cloreto de cálcio igual a O, 1 M em íons Ca2+ e tempo de cura igual a 24 h) permitiram a

- reutilização das células imobilizadas durante cinco bateladas sucessivas, sem prejuízos na

produção de xilitol. Ao contrário, a reutilização das células proporcionou aumentos na

produção, na produtividade e na eficiência de bioconversão após a primeira batelada da série

de repetições. O diâmetro das esferas de alginato de cálcio, monitorado periodicamente para

se estimar a estabilidade das esferas frente às condições operacionais utilizadas, manteve-se

inalterado ao longo das fermentações. Os valores de concentração final (28, 4 g/L ),

produtividade (0,59 g/Lh) e eficiência de bioconversão (61,5 %) obtidos com a utilização de

células imobilizadas (CARVALHO et ai., 2002b) foram comparáveis àqueles obtidos com a

utilização de células livres em suspensão, em condições de cultivo semelhantes (SENE et ai.,

1998).

3.4 IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS EM GEL DE ALGINATO DE CÁLCIO

Existem diversos métodos para a imobilização de biocatalisadores. Estes métodos

25

podem ser divididos em quatro grandes grupos, conforme ilustrado na FIGURA 4. Da mesma

forma, também existem diversos materiais que podem ser utilizados como suportes de

imobilização através destes métodos. Apesar disso, não existe um método e um suporte

universais, adequados para qualquer processo (BÁLES, 1994).

BIOCATALISADORES IMOBILIZADOS

1 Auto

1

Ligação a i agregação superflcies

1

Artificial Adsorção Ligação

Natural natural. quimica

Aprisionamento em Contenção matrizes porosas por barreiras

1 1 1

Suportes Aprisionamento Barreiras Gel pré-formados em fase pré-formadas

1

1

Micro Enwlsõesde encapsulação duas fases

FIGURA 4: Métodos de imobilização de enzimas e células (BÁLES, 1994).

O método de aprisionamento em alginato de cálcio é a técnica de imobilização mais

extensivamente utilizada para a imobilização de células viáveis (RAMAKRISHNA e

PRAKASHAM, 1999). Como a formação do gel ocorre rapidamente na presença de íons

cálcio sem alterações drásticas de temperatura, pH e pressão osmótica, a atividade e a

viabilidade dos . . rrucrorgamsmos imobilizados é conservada (CORCORAN, 1985;

BRODELIUS e MOSBACH, 1987; BRODELIUS e VANDAMME, 1987). Vantagens como

baixo custo (CORCORAN, 1985), grande disponibilidade no mercado (GUISELEY, 1989),

26

versatilidade da técnica (BRODELIUS e V ANDAMME, 1987) e possibilidade de ampliação

de escala (CHAMPAGNE et al., 2000) têm sido citadas na literatura. Além disso, as

substâncias utilizadas para a imobilização (alginato e cloreto de cálcio) são aceitas como

aditivos na produção de alimentos (CHAMPAGNE et al., 2000).

De acordo com FREEMAN e LILL Y ( 1998), entre os vários tipos de técnicas e

suportes utilizados para a imobilização de células, a maior parte dos trabalhos que relatam

estabilidades operacionais superiores a 100 horas referem-se à utilização da técnica de

imobilização por aprisionamento em gel de alginato de cálcio.

A produção de etanol pela indústria Kyowa Hakko Kogyo Co., localizada em Tóquio

(BRODELIUS e V ANDAMME, 1987), e a produção de cerveja pela indústria Hwa Kuang

Co., localizada em Shanghai (LINKO e LINKO, 1984), são exemplos de aplicações

industriais que fizeram uso do alginato de cálcio como matriz para a imobilização de células.

Atualmente, este material tem sido avaliado como suporte para a imobilização de células

animais (ORIVE et al., 2003) e vegetais (GILLET et ai., 2000), algas (JIMÉNEZ-PÉREZ et

ai., 2004), enzimas (PRASHANTH e MULIMANI, 2005), bactérias (TRELLES et ai., 2004),

leveduras (NAJAFPOUR et ai., 2004) e fungos (ELLAIAH et ai., 2004).

Entre as desvantagens do uso deste polímero como suporte de imobilização, são

citadas: instabilidade química na presença de agentes quelantes do íon cálcio ( como fosfato,

lactato, citrato e EDTA), tendência das esferas em sofrer dilatação na presença de cátions

monovalentes e limitações impostas à transferência de massa de substratos e produtos

(BRODELIUS e V ANDAMME, 1987; BRODELIUS e MOSBACH, 1987; FREEMAN e

LILL Y, 1998).

A instabilidade na presença de quelantes de cálcio e a tendência em sofrer dilatação na

presença de cátions monovalentes podem ser superadas pela escolha do alginato utilizado

(MARTINSEN et ai., 1989), pela adição de íons cálcio no meio· de fermentação

27

(BRODELIUS e V ANDAMME, 1987), por tratamentos adicionais como lavagem das esferas

em solução de agentes estabilizantes (BRODELIUS e MOSBACH, 1987) ou pela manutenção

das esferas recém-produzidas em solução de cloreto de cálcio previamente à utilização

(OGBONNA et ai., 1989).

Por outro lado, as limitações impostas à transferência de massa de substratos e

produtos podem ser minimizadas através da seleção adequada das condições de imobilização

(BRODELIUS e V ANDAMME, 1987). Além disso, estratégias como adição de carreadores

de oxigênio ( como hemoglobina e perfluorquímicos) ao meio de fermentação, geração de

oxigênio "in situ" na matriz ( como coimobilização de microrganismos fotossintéticos ou

adição de H202 ao meio de fermentação com posterior decomposição em H20 + 02 pela

enzima catalase do microrganismo imobilizado) e oxigenação eficiente do meio de

fermentação ( como aumento da agitação e da vazão de ar ou utilização de 02 puro) têm sido

também utilizadas para minimizar os problemas relativos à transferência de oxigênio até as

células imobilizadas (OGBONNA et ai., 1991). Para uma melhor transferência de massa de

substratos (principalmente oxigênio) e produtos, entretanto, o método mais eficiente consiste

na redução do diâmetro das esferas (OGBONNA et ai., 1991).

O alginato é um polissacarídeo presente em todas as "algas marrons", embora poucas

espécies sejam comercialmente importantes. A espécie Macrocystis pyrifera constitui a

principal fonte (GUISELEY, 1989). Algumas bactérias, principalmente aquelas derivadas do

gênero Pseudomonas, também são capazes de produzir quantidades abundantes deste

polímero como exopolissacarídeo (REHM e V ALLA, 1997).

Quimicamente, os alginatos consistem de polímeros lineares dos ácidos D-manurônico

e L-gulurônico unidos entre si através de ligações glicosídicas do tipo í3(1-+t) e a(l---,,4),

respectivamente. Estes polímeros encontram-se arranjados em três tipos de grupamentos

diferentes: MMI\tfMMM (Blocos M), GGGGGG (Blocos G) e MGMGMG (Blocos MG)

28

(GEMEINER et ai., 1994). A forma como esses blocos se encontram e a proporção de cada

um deles depende da fonte, da época da colheita e da parte da alga a partir da qual o alginato é

extraído (GUISELEY, 1989).

As propriedades mecânicas dos géis de alginato de cálcio são fortemente influenciadas

pela distribuição dos ácidos manurônico e gulurônico no polímero, assim como pelo peso

molecular e pelo grau de polidispersibilidade (BRODELIUS e V ANDAMME, 1987;

MARTINSEN et ai., 1989). Os géis formados a partir de alginatos ricos em ácido gulurônico

são mais quebradiços, enquanto aqueles formados a partir de alginatos ricos em ácido

manurônico são mais maleáveis (GUISELEY, 1989). Os géis quimicamente mais estáveis são

aqueles obtidos a partir da utilização de polímeros com alta relação de blocos G

(BRODELIUS e V ANDAMME, 1987).

A formação do gel ocorre quando cátions como Ca +2 são introduzidos em soluções do

sal de sódio (alginato de sódio). A troca dos íons Na+1 pelos íons Ca+2 leva à formação de gel

consistente, quebradiço e geralmente túrbido, cujas características reológicas dependem do

tipo de alginato e do modo de introdução dos íons divalentes (GEJ\1EINER et ai., 1994). De

acordo com Clark e Ross-Murphy (1987), citados por GEMEINER et ai. (1994), os íons

cálcio se ligam preferencialmente aos blocos G. Este processo é altamente cooperativo se o

número de resíduos de guluronato excede 20 unidades. Não existem evidências da existência

de especificidade ou cooperação em relação à ligação dos íons Ca+2 aos blocos M ou MG. Os

íons Ca +2 ligados cooperativamente durante a gelificação são dispostos dentro das cavidades

eletronegativas dos resíduos de poliguluronato, como ovos dentro de uma caixa apropriada. A

associação se inicia entre duas cadeias somente, lado a lado. Maiores agregados somente

ocorrem sob condições forçadas de elevada concentração de íons Ca+2 (GEMEINER et ai.,

1994). Este modelo de formação da malha de alginato de cálcio é ilustrado na FIGURA 5.

Tendo em vista que as propriedades de gelificação do alginato, vitais para a sua

29

utilização como suporte de imobilização, variam de acordo com a composição monomérica,

com o arranjo seqüencial e com o comprimento dos blocos G, a seleção cuidadosa do material

de partida é essencial para a obtenção de bons resultados (MARTINSEN et ai., 1989).

FIGURA 5: Modelo para a formação da malha de alginato de cálcio envolvendo: a)

dimerização inicial, e b) subseqüente agregação dos dímeros pré-formados induzida por íons

cálcio (GEMEINER et ai., 1994).

3.5 CUL TJVO DE CÉLULAS }MOBILIZADAS

A questão mais importante relativa ao uso de células imobilizadas em bioprocessos

consiste na resistência à transferência de massa entre a fase líquida, na qual se encontram os

nutrientes, e a fase sólida, na qual se encontram as células imobilizadas. A área superficial

reduzida destes agregados celulares e a presença do suporte de imobilização compreendem

barreiras adicionais à transferência de massa de substratos e produtos, podendo determinar

redução nas taxas de reação e criar um microambiente diferente daquele verificado na fase

líquida (KAREL et ai., 1985).

A transferência de massa entre o meio líquido e os biocatalisadores imobilizados é

30

dividida em duas fases: a) transferência de massa externa, que envolve a transferência de

nutrientes do meio de fermentação através de um filme líquido estagnado até a superficie do

suporte de imobilização, e b) transferência de massa interna, que descreve a transferência de

substratos e produtos no interior do suporte de imobilização e através da membrana celular

das células imobilizadas (PILKINGTON et al., 1998). A concentração de metabólitos em

íntimo contato com as células imobilizadas pode ser alterada devido a limitações de

transferência de massa externa e/ou interna. Isto pode levar a alterações no metabolismo e,

conseqüentemente, na qualidade e eficiência do processo fermentativo.

Além das resistências à transferência de massa externa e interna, o "rnicroambiente"

no qual as células imobilizadas se encontram é determinado por efeitos de partição entre a

fase líquida e a matriz sólida de imobilização. O coeficiente de transferência de massa no

filme líquido (KL), a difusividade efetiva do soluto na matriz de imobilização (DE) e o

coeficiente de partição do soluto (Kp }, respectivamente, são os parâmetros utilizados na

quantificação destes fenômenos para a determinação dos fatores de efetividade globais, que

permitem determinar se o sistema é limitado ou não pela transferência de massa

(PILKINGTON et ai., 1998).

As limitações à transferência de massa interna são de particular importância em

sistemas nos quais as células são imobilizadas por meio da técnica de aprisionamento em

matrizes porosas, como alginato de cálcio. A taxa de transferência de uma determinada

substância nestas matrizes (assumindo que a transferência ocorre somente por difusão e

considerando a matriz de imobilização esférica e homogênea) é proporcional ao gradiente de

concentração da espécie difundente, conforme a equação:

.! = -DôC lôr (2)

Onde J é a taxa de transferência da substância por unidade de área, C é a concentração

da substância na matriz de imobilização, r é o raio da esfera e D é o coeficiente de difusão da

31

substância na matriz de imobilização (PILKlNGTON et ai., 1998).

A transferência de massa interna pode ser otimizada pelo ajuste da textura e

porosidade da matriz de imobilização e pela redução do diâmetro das esferas de imobilização,

sendo esta última opção uma alternativa eficiente. Deve-se ter em mente, entretanto, que as

esferas devem ser pequenas o suficiente para evitar limitações à transferência de massa e

grandes o suficiente para permitir fácil recuperação do meio fermentado (OGBONNA et ai.,

1991).

Com relação à transferência de massa externa, o fluxo de um substrato qualquer até a

superficie do suporte de imobilização depende do coeficiente de transferência de massa no

filme líquido e da concentração deste substrato na fase líquida, sendo expresso por meio da

equação:

J=KL(CML-- Css) (3)

Onde J é a taxa de transferência do substrato, KL é o coeficiente de transferência de

massa, CML é a concentração de substrato na fase líquida e Css é a concentração de substrato

na superficie do suporte de imobilização. A diferença de concentração (CML - Css) é a força

motriz para a transferência de massa (PILKlNGTON et ai., 1998).

O coeficiente de partição do soluto (Kp), definido através da equação:

(4)

Onde Cs é a concentração de substrato na matriz de imobilização e CML é a

concentração de substrato na fase líquida, vai estabelecer a proporção entre estas duas

concentrações do mesmo substrato em condições de equilíbrio (PILKINGTON et ai., 1998).

Fatores como tipo, tamanho e condições de operação do bioreator utilizado irão

influenciar a transferência de massa externa em sistemas com células imobilizadas, afetando o

coeficiente de transferência de massa no filme líquido (KL). A otimização da mistura entre a

fase líquida e a fase sólida maximiza o contato superficial entre estas fases, minimizando a

32

espessura do filme líquido estagnante que envolve o suporte de imobilização, maximizando o

valor de KL e, conseqüentemente, minimizando as limitações impostas à transferência de

massa (PILKINGTON et ai., 1998). Entretanto, se o estresse causado à matriz de

imobilização é muito intenso, o suporte de imobilização pode se romper. Desta forma, o

estresse imposto à matriz de imobilização deve ser ajustado de forma a permitir a manutenção

da integridade fisica aliada a uma adequada mistura entre as fases (FUKUDA, 1994;

PILKINGTON et ai., 1998).

Os reatores para trabalhos com células imobilizadas podem ser divididos em três

categorias, de . acordo com o padrão de fluxo: reatores de - mistura, reatores de leito

empacotado e reatores de leito fluidizado. Estes reatores podem também ser modificados para

melhorar as caracteristicas de transferência de massa e a capacidade de controle das condições

de cultivo ou para minimizar o estresse imposto ao suporte de imobilização (FUKUDA,

1994).

Entre os fatores que devem ser levados em consideração quando da escolha de um

determinado tipo ou configuração de reator para trabalhos com células imobilizadas são

citados na literatura: requerimentos de transferência de massa (principalmente suprimento de

oxigênio e remoção de gases), método de imobilização empregado e características da matriz

de imobilização utilizada, natureza do substrato e requerimentos para o cultivo do

microrganismo utilizado (KAREL et ai., 1985; FUKUDA, 1994; BARON et ai., 1996;

PILKINGTON et ai., 1998).

Como vantagens da utilização do reator de mistura (STR), podem ser citadas a

flexibilidade de operação, a possibilidade de se ajustar a intensidade de mistura, a facilidade

de controle de pH e temperatura, a possibilidade de manutenção de uma concentração

homogênea de substrato em todo o reator e a adequação para trabalhos em meios viscosos.

Embora vários tipos de agitadores possam ser utilizados, a principal desvantagem refere-se à

33

tensão de cisalhamento imposta a matrizes sensíveis (FUKUDA, 1994; BARON et ai., 1996).

Neste contexto, uma configuração alternativa denominada reator tipo cesta (BSTR), que

consiste na adaptação de uma cesta no interior da cuba e permite que o contato direto das

esferas de imobilização com as turbinas seja evitado, foi proposta e utilizada com sucesso na

produção de etanol (GAMARRA, 1988; TA V ARES, 1998) e ácido lático (ABEL Y AN e

ABELYAN, 1996).

Diversos trabalhos têm descrito o uso de reatores de mistura no cultivo de células

imobilizadas por meio da técnica de aprisionamento em polímeros naturais, apesar das

elevadas tensões de cisalhamento caracteristicas destes reatores. Entre os polímeros testados,

encontram-se a pectina (KESAVA e PANDA, 1996), a carragena (JAIN et ai., 1985; NUNEZ

et ai., 1991; NORTON et ai., 1994; LAMBOLEY et ai., 1997) e o alginato (KROUWEL et

ai., 1983; QURESHI e MANDERSON, 1991; VIVES et ai., 1993; OY AAS et ai., 1996;

BUZZINI e ROSSI, 1998; HERNÁNDEZ et ai., 2001 ).

Na maior parte dos trabalhos em que o alginato de cálcio foi o suporte utilizado, os

autores relataram boa estabilidade das esferas nas condições experimentais avaliadas, com

agitação das turbinas variando entre 200 e 300 rpm. Por exemplo, KROUWEL et ai. ( 1983 ),

utilizando meio sintético para a produção de isopropanol-butanol-etanol em modo contínuo de

fermentação, relatam como uma das conclusões mais importantes do trabalho a possibilidade

de reutilização dos pellets por períodos prolongados. QURESHJ e MANDERSON ( 1991 ),

utilizando hidrolisado de Pinus sp. para a produção de etanol, também em modo contínuo de

fermentação, classificam o sistema de "opção atrativa para a fermentação de açúcares obtidos

por meio de hidrólise ácida". Deve-se observar, entretanto, que a determinação de uma

agitação adequada, de forma a se prevenir o rompimento das esferas de imobilização, é um

fator muito importante para a obtenção de resultados satisfatórios (VIVES et ai., 1993).

34

4 MATERIAIS E MÉTODOS

j

4.1 OBTENÇÃO, CONCENTRAÇÃO E TRATAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO

DO BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR

O hidrolisado hemicelulósico foi obtido por hidrólise ácida do bagaço de cana de

açúcar proveniente da Usina Santa Helena (Rio das Pedras - SP) em reator de aço inox com

capacidade de 250 litros. O bagaço foi hidrolisado utilizando-se lhS04 98 % de pureza como

catalisador em uma razão de 100 mg H2SOJg de bagaço {peso-seco) durante 20 minutos à

temperatura de 121 ºC, utilizando-se uma proporção de 1 : 1 O entre bagaço e volume da

solução de H2S04. Após resfriamento e homogeneização, a fração líquida foi separada da

fração sólida por centrifugação e estocada em câmara fria a uma temperatura de l O ºC.

Para a realização dos ensaios fermentativos com diferentes concentrações iniciais de

xilose, o hidrolisado obtido foi concentrado sob pressão reduzida a uma temperatura de 70 ºC

(aproximadamente) em diferentes lotes, de acordo com a demanda, utilizando-se fatores de

concentração iguais a três, quatro ou cinco vezes.

Os hidrolisados concentrados foram tratados por meio da elevação do pH até 7.0 pela

adição de óxido de cálcio, redução do pH até 5. 5 pela adição de ácido fosfórico comercial e

adição de carvão ativo 2.5 % com posterior agitação em incubadora com movimento rotatório

a 200 rpm e 30 ºC por 1 h (ALVES et ai., 1998). Após cada etapa deste tratamento, os

hidrolisados foram filtrados em papel de filtro quantitativo para a remoção dos precipitados

formados. Após o tratamento, os hidrolisados foram autoclavados a 0.5 atm por 15 min.

4.2 MICRORGANISMO E OBTENÇÃO DAS CÉLULAS

Para a realização dos ensaios fermentativos, foi utilizada a levedura Candida

guilliermondii FTI 20037, descrita por BARBOSA et ai. (1988). As células foram mantidas

em agar malte a 4 ºC, sendo repicadas a cada 7 dias.

35

Para a obtenção das células utilizadas na etapa de imobilização, foi transferida uma

alçada de células provenientes da cultura-estoque para frascos Erlenmeyer de 125 mL

contendo 50 mL de meio sintético composto de: xilose (30.0 g/L}, sulfato de amônio

(3.0 g/L), cloreto de cálcio (O. l g/L) e extrato de farelo de arroz (1 O% v/v). As células foram

cultivadas em incubadora com movimento rotatório a 200 rpm e 30 ºC por 24 h. Após o

cultivo, as células foram coletadas por centrifugação a 2000 g por 20 min, lavadas, coletadas

novamente por centrifugação e re-suspensas em água destilada esterilizada.

O extrato de farelo de arroz foi preparado em água destilada, utilizando-se uma

concentração de 200 g/L. Esta suspensão foi autoclavada a 0.5 atm por 15 min. Após

resfriamento, o sobrenadante foi separado por centrifugação a 2000 g por 20 min e utilizado

nos ensaios. A solução-estoque de xilose foi preparada na concentração de 250 g/L e

autoclavada a 0.5 atm por I 5 min. A solução-estoque de sulfato de arnônio foi preparada na . ·;;:,.,·.-···---··-- ·········

concentração de 250 g/L e autoclavada a I. O atm por 20 min. A solução-estoque de cloreto de

cálcio foi preparada na concentração de 50 g/L e autoclavada a 1.0 atm por 20 min. Estes

nutrientes foram misturados com água destilada, esterilizada a 1.0 atm por 20 mm, em

proporções adequadas para o preparo do meio utilizado para a obtenção das células.

4~3 IMOBILIZAÇÃO DAS ,CÉLULAS

As células foram imobilizadas pelo método de aprisionamento em esferas de gel de

alginato de cálcio. A suspensão celular, obtida conforme descrito no item anterior, foi

adicionada a uma solução de alginato de sódio (Satialgine S JJOO - Degussa Texturant

Systems, França) previamente autoclavada a 0.5 atm por 15 min, de modo a se obter

suspensões homogêneas com concentrações celulares (em peso-seco) iguais a 2.0, 4.0 ou

6.0 g/L (de acordo com o experimento em questão) e concentração de alginato de sódio igual

a 20.0 g/L. Esferas de gel foram produzidas pelo gotejamento destas suspensões em uma

solução de cloreto de cálcio 0.1 M, previamente preparada em água deionizada e esterilizada a

36

1.0 atm por 20 min, mantida sob agitação. Para o gotejamento das suspensões celulares na

solução de cloreto de cálcio, foram utilizadas duas bombas peristálticas e duas agulhas 19 G

(1 Yz polegada), conforme ilustrado na FIGURA 6. As esferas formadas, contendo as células

imobilizadas, foram mantidas na solução de cloreto de cálcio a uma temperatura de 1 O ºC por j,

um periodo de 24 h. Após este periodo, as esferas foram lavadas com água destilada /

esterilizada e utilizadas nos ensaios fermentativos (CARVALHO, 2000). O diâmetro médio

das esferas no início dos ensaios foi de 2.75 mm (crn.1 = 0.05 mm).

FIGURA 6: Ilustração do equipamento utilizado para a imobilização das células de Candida

guilliermondü em esferas de gel de alginato de cálcio.

4.4 MEIO E CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO

O meio de fermentação foi preparado pela adição de sulfato de amônio, cloreto de

cálcio e extrato de farelo de arroz ao hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar

(após concentração, tratamento e autoclavagem) em proporções adequadas para a obtenção de

concentrações destes nutrientes idênticas às utilizadas· durante a etapa de obtenção das células

(item 4.2).

No início das fermentações e em intervalos regulares de 48 h, adicionou-se

benzilpenicilina potássica (Benzecilin 1.000.000 UI, Teuto Brasileiro Ltda.) ao meio de

fermentação em uma concentração igual a 1. 000. 000 UI para o controle de possíveis

• 37

contaminantes. De acordo com as especificações contidas na bula deste medicamento, as

penicilinas são rapidamente inativadas na presença de soluções de carbohidratos em pH

alcalino.

Os ensaios fermentativos foram divididos em 4 etapas: 1) Avaliação da performance

das células imobilizadas na produção de xilitol em diferentes sistemas fermentativos; 2)

Identificação dos principais fatores que influenciam a produção de xilitol em reator de

mistura; 3) Elaboração de modelos empíricos para a predição da produção de xilitol em reator

de mistura; 4) Avaliação da estabilidade operacional do sistema de produção de xilitol em

reator de mistura.

4.4.1 A V ALlAÇÃO DA PERFORMANCE DAS CÉLULAS IMOBILIZADAS NA PRODUÇÃO DE

XILITOL EM DIFERENTES SISTEMAS FERMENTATIVOS

Nesta etapa, três sistemas fermentativos foram utilizados para realizar a bioconversão

de xilcse em xilitol: frascos Erlenmeyer, reator de mistura e reator tipo cesta.

Excepcionalmente nestes experimentos, foi utilizado um hidrolisado proveniente de um lote

diferente. Este hidrolisado apresentou em sua composição (g/L): glicose (4.5), xílose (59.4),

arabinose (5.2), ácido acético (4.0), furfural (0.06) e hidróxi-metil-furfural (0.14).

Os frascos Erlenmeyer (125 mL), contendo 7.4 g de esferas com células imobilizadas

e 40 mL de meio de fermentação, foram mantidos em agitador rotatório a uma temperatura de

30 ºC e a uma agitação de 200 rpm por um período de 48 h.

O reator de mistura (2.4 L) (FIGURA 7), contendo 200 g de esferas com células

imobilizadas e 1.3 L de meio, foi operado a uma agitação de 500 rpm por um período de 60 h,

utilizando-se vazão de ar igual a 1. 7 L/min e temperatura igual a 30 ºC.

O reator tipo cesta (2.4 L) (FIGURA 8), contendo 200 g de esferas com células

imobilizadas e 1.3 L de meio, foi operado a uma agitação de 1300 rpm por um período de

72 h, utilizando-se vazão de ar igual a O.OI L/min e temperatura igual a 30 ºC.

: Erirada : deAr ... - .

~

~

o 4:l:mm

Sensores -----'~ Exaustão de

Gases

38

FIGURA 7: Representação esquemática do reator de mistura utilizado para a bioconversão de

xilose em xilitol.

o 00

•100

~·-·---·-·--···---·-·-···--,·······-··· ] Entrada+ _ i

de Ar

1-=l L::_J

Amostragem

O 4:lmm

-+ meio

Bomloe Peristálica

FIGURA 8: Representação esquemática do reator tipo cesta utilizado para a bioconversão de

xilose em xilitol.

39

Conforme ilustrado na FIGURA 8, o reator tipo cesta consistiu na adaptação de um

leito empacotado com células imobilizadas no centro da cuba do reator de mistura. Uma

bomba peristáltica foi utilizada para recircular o meio de fermentação através do leito

empacotado utilizando-se um fluxo de 350 mL/min.

4.4.2 IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCIPAIS FATORES QUE INFLUENCIAM A PRODUÇÃO DE

XILITOL EM REATOR DE MISTURA

Nesta etapa, foram realizados 19 ensaios de fermentação, de acordo com a

metodologia de planejamento experimental (BOX et al., 1978), para a identificação dos

principais fatores/interações que influenciam a produção de xilitol no reator de mistura

ilustrado na FIGURA 7. Os efeitos das variáveis/ator de concentração do hidrolisado, vazão

de ar, agitação, concentração inicial de células e pH inicial do meio de fermentação

(variáveis independentes) sobre a produtividade e o rendimento da bioconversão de xilose em

xilitol (variáveis dependentes) foram avaliados através da realização de 16 ensaios de

fermentação, de acordo com um planejamento fatorial fracionado do tipo 2/-1. Três ensaios

nos níveis centrais das variáveis independentes foram adicionalmente realizados, de forma a

verificar a existência de curvatura significativa na região de estudo.

A TABELA 1 ilustra os valores reais das variáveis independentes avaliados nos

ensaios. Para a realização das análises estatísticas, estes valores foram codificados em níveis

(inferior, central e superior) de acordo com a equação:

(5)

Onde Vc é o valor codificado da variável independente, VR é o valor real da variável

independente, V0 é o valor real da variável independente no nível central e L1VR é a diferença

entre o valor real máximo e o valor real mínimo da variável independente (BOX et ai., 1978).

40

TABELA 1: Valores reais das variáveis independentes utilizados nos ensaios, de acordo com

um planejamento fatorial fracionado do tipo 2/-1

Variáveis Independentes Unidades Códigos Níveis

o +

Fator de cone. do hldrolisado A 3.0 4.0 5.0 Vazão de ar L/min B 1.30 1.95 2.60 Agitação rpm e 300 400 500 Cone. inicial de células g/L D 0.6 ± 0.1 l.O ± 0.1 l.4 ± 0.1 pH inicial do meio E 4.0 5.0 6.0

A TABELA 2 ilustra a matriz experimental do planejamento fatorial fracionado 2/-1,

com os níveis codificados das variáveis independentes testados em cada ensaio.

TABELA 2: Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado do tipo 2/-1 utilizado

para a identificação dos principais efeitos I interações que influenciam a produção de xilitol

Ensaio A B e D E=+ABCD

OI + 02 +

03 +

04 + + +

05 +

06 + + +

07 + + +

08 + + +

09 +

10 + + +

11 + + +

12 + + +

13 + + +

14 + + +

15 -t- + +

16 + + + + +

17 o o o o o 18 o o o o o 19 o o o o o

41

As influências das variáveis independentes sobre as variáveis resposta (dependentes)

foram avaliadas de acordo com conceitos 'de estatística descritiva e multivariada, utilizando-se

os softwares Statgraphics plus 6.0 e Design Expert 5.0. A significância destas influências e da

existência de curvatura na região estudada foi avaliada por meio de análise de variância,

considerando-se como influências estatisticamente significativas aquelas que apresentaram

níveis de significância inferiores a 20 % (p < 0.20).

Considerando o padrão de superposição de efeitos do planejamento adotado, os efeitos

de interação de 3ª e 4ª ordem foram considerados desprezíveis para a realização das análises

estatísticas.

4.4.3 ELABORAÇÃO DE MODELOS EMPÍRICOS PARA PREDIÇÃO DA PRODUÇÃO DE


Nesta etapa, o planejamento fatorial inicial foi composto em um planejamento de face

centrada, de acordo com a metodologia de superficie de resposta (BOX et ai., í 978), com a

finalidade de permitir a elaboração de modelos empíricos para predição das variáveis

dependentes produtividade e rendimento da bioconversão de xilose em xilitol. No total, foram

realizados 12 ensaios adicionais de fermentação dentro da região de estudo inicial conforme

ilustrado na TABELA 3, sendo 2 destes ensaios conduzidos nos níveis centrais das variáveis

independentes de forma a permitir a neutralização de possíveis efeitos causados pela

utilização de hidrolisados concentrados provenientes de lotes diferentes.

Os modelos empíricos foram elaborados através de ajuste aos dados experimentais

pelo método dos mínimos quadrados com o software Design Expert 5.0, de acordo com a

seguinte equação:

n n n-1 n

Yi=bo+í:.biXi+'J:.biiX:+'J:. í:.bijXiXj i=I i=I i=I j=i+I

(6)

42

Onde Y; representa a variável dependente, b0, b., b; e bu representam os coeficientes

de regressão, e X e~· representam as variáveis independentes.

TABELA 3: Matriz experimental utilizada para compor o planejamento fatorial fracionado

do tipo 2v5-' em face centrada

Ensaio A B e D E=+ABCD

20 o o o o 21 + o o o o 22 o o o o 23 o + o o o 24 o o o o 25 o o + o o 26 o o o o 27 o o o + o 28 o o o o 29 o o o o +

30 o o o o o 31 o o o o o

A significância dos coeficientes de regressão do modelo foi avaliada considerando-se

como coeficientes estatisticamente significativos aqueles que apresentaram níveis de

significância inferiores a 20 % (p < 0.20). A validação dos modelos obtidos foi feita levando-

se em consideração a significância estatística, a capacidade de predição, a falta de ajuste e a

análise gráfica dos resíduos. As superficies de resposta descritas por estes modelos foram

plotadas com o software Statistica 5.0.

4.4.4 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE OPERACIONAL DO SISTEMA DE PRODUÇÃO DE


Nesta etapa, a estabilidade operacional da produção de xilitol em reator de mistura foi

avaliada conduzindo-se a fermentação na modalidade de bateladas repetidas. Ao final de cada

batelada, as células imobilizadas foram reutilizadas como inóculo para a batelada seguinte.

43

Ao todo, foram realizadas 5 bateladas sucessivas de fermentação com duração de 120 h cada.

As fermentações foram conduzidas no reator de mistura (FIGURA 7), utilizando-se fator de

concentração do hidrolisado igual a 5.0, vazão de ar 1.30 L/min, agitação de 300 rpm,

concentração inicial de células de 1.4 g/L e pH inicial do meio de fermentação igual a 6.0.

4.4.4.1 Avaliação das Necessidades Nutricionais da Levedura para a Produção de

Xilitol na Modalidade de Bateladas Repetidas de Fermentação

Nesta etapa, a bioconversão de xilose em xilitol foi realizada em frascos Erlenmeyer

na modalidade de bateladas repetidas de fermentação, conforme ilustrado na TABELA 4.

TABELA 4: Planejamento experimental utilizado para avaliar as necessidades nutricionais da

levedura visando a produção de xilitol no modo de bateladas repetidas de fermentação

Ensaio Batelada Nutrientes Adicionados

A r SA,FA

2· SA,FA .. ·. -

3• SA,FA

B 1" SA, FA

SA,FA

e SA.FA

D FA

FA

FA

E r SA

AS

AS

2·

F

3"

SA: Sulfato de amônio; FA: Extrato de Farelo de Arroz;»: Sem adição de nutrientes

Os frascos Erlenmeyer ( 125 mL ), contendo 7. O g de esferas com células imobilizadas

44

e 43 mL de meio de fermentação, foram mantidos em agitador rotatório a uma temperatura de

30 ºC e a uma agitação de 200 rpm por um período de 96 h. Ao final de cada batelada, as

células imobilizadas foram reutilizadas como inóculo para a batelada seguinte. Utilizou-se

fator de concentração do hidrolisado, concentração inicial de células (na 1ª batelada) e pH

inicial do meio de fermentação iguais a 5.0, 1.4 e 6.0, respectivamente, para a realização

destes experimentos. Nos ensaios sem nutrientes, adicionou-se água esterilizada ao

hidrolisado - nas mesmas proporções dos nutrientes omitidos - de forma a manter a

concentração inicial de xilose constante.

4.5 MÉTODOS ANALÍTICOS

Todas as fermentações foram acompanhadas por meio do controle analítico de

amostras retiradas periodicamente. As observações foram feitas com relação ao consumo de

açúcares (glicose, xilose e arabinose) e ácido acético, produção de xilitol, crescimento celular,

e variação de pH. Os resultados destas determinações analíticas encontram-se descritos nos

Anexos 1 a 6.

4.5.1 DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES CELULARES

Os precipitados formados durante a elaboração dos meios de fermentação, pela adição

dos nutrientes aos hidrolisados, foram removidos por meio de centrifugação a 2000 g por

20 min antes do início das fermentações.

As concentrações celulares foram determinadas por turbidimetria em

espectrofotômetro no comprimento de onda de 600 nm e correlacionadas com o peso seco de

células (g/L) através de curvas de calibração correspondentes. A fase líquida das amostras

retiradas durante as fermentações foi centrifugada a 2000 g por 20 min e as células foram re-

suspensas em água para a determinação das concentrações de células livres. Uma massa

conhecida (precisão de 0.01 g) de esferas de alginato de cálcio retiradas durante as

45

fermentações e previamente secas com papel absorvente foi dissolvida em citrato de potássio

2.0 % sob agitação em vórtex. A suspensão resultante foi centrifugada a 2000 g por 20 mine

as células foram re-suspensas em água para a determinação das concentrações de células

imobilizadas. A densidade das esferas de alginato de cálcio, considerada constante durante as

fermentações, foi de 1. O g/mL.

O crescimento celular foi considerado como concentração de células livres no meio de

cultivo (XM) e de células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio (X1), ou como

concentração celular total no reator (XR), conforme proposto por TA V ARES (1998). Para o

cálculo da concentração celular total no reator (XR), empregou-se o seguinte balanço material:

(7)

Onde VR é o volume do reator (L ), XR é a concentração celular total presente no reator

(g/L), Vi é o volume de esferas de gel (L), X1 é a concentração celular nas esferas de gel (g/L),

VM é o volume de meio de cultivo (L) e XM é a concentração celular no meio de cultivo (g/L).

A concentração de células livres no meio de fermentação (XM) e a concentração de

células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio (X1) foram relacionadas ao volume de

trabalho do reator (VR) utilizando-se as seguintes equações:

XRA1 = {XM VMIVR]

XRJ = [(X1 Vi)IVR}

(8)

(9)

Onde XRM é a concentração de células livres no reator (g/L) e XRI é a concentração de

células imobilizadas no reator (g/L). Assim, a soma das concentrações celulares no meio e

imobilizada, expressas em volume de reator, forneceu a concentração celular total em relação

ao volume de reator (XR), conforme a equação:

(10)

4.5.2 DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS ESFERAS DE ALGINATO DE CÁLCIO

A solubilização das esferas foi acompanhada com a finalidade de se estimar a

46

estabilidade da matriz de imobilização frente às condições operacionais empregadas. Foi feita

uma amostragem de 30 esferas, coletadas aleatoriamente no início e no final das

fermentações, para a determinação do diâmetro médio utilizando-se paquímetro com precisão

de 0.05 mm. Os valores de volume médio foram então calculados, considerando uma

geometria esférica constante durante as fermentações, de acordo com a seguinte equação:

V= [4/3 J[ (Dl2/J (11)

Onde V é o volume médio das esferas de alginato de cálcio (mnr') e D é o diâmetro

médio das esferas de alginato de cálcio (mm).

A solubilização das esferas de alginato de cálcio foi finalmente expressa como

percentagem de redução de volume, de acordo com a seguinte equação:

(12)

Onde R% é o percentual de redução do volume das esferas de alginato de cálcio

durante as fermentações (% ), Vo é o volume médio das esferas no início da fermentação

(mm') e VF é o volume médio das esferas no final da fermentação (mm').

4.5.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE AÇÚCARES, XJLITOL, ÁCIDO ACÉTICO, FURFURAL

E HIDRÓXI-METIL-FURFURAL

A determinação destas substâncias foi realizada por cromatografia líquida de alta

eficiência. Para a análise do teor de açúcares, xilitol e ácido acético, foi utilizada uma coluna

BIO-RAD AMINEX HPX-87H (300 x 7,8 mm) e detector de índice de refração mantidos a

45 ºC, fase móvel H2S04 0,01 N, e fluxo de 0,6 mL/min. Após diluição apropriada, as

amostras foram filtradas em filtro Sep Pak Cl8 e 20 µL foram injetados no cromatógrafo.

Para a análise do teor de furfural e hidróxi-metil-furfural (HMF), foi utilizada uma coluna RP

18 (200 x 4,6 mm) mantida a 25 ºC e detector de ultravioleta em 276 nm, fase móvel

acetonítrila/água 1 :8 adicionada de 1 % de ácido acético, e fluxo de 0,8 mL/min. Após diluição

47

apropriada, as amostras foram filtradas em membrana Minisart e 20 µL foram injetados no

cromatógrafo.

4.5.4 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PRODUTOS DE DECOMPOSIÇÃO DA LIGNINA

O teor dos produtos de decomposição da lignina foi analisado através da quantificação

da lignina Klason solúvel em meio ácido, conforme proposto por ROCHA (2000).

Uma alíquota do hidrolisado foi alcalinizada até pH 12 pela adição de NaOH 6 M e

diluída com água destilada de forma a se obter uma leitura inferior a 1 unidade de

absorbância. A absorbância desta solução foi determinada num comprimento de onda de

280 nm utilizando-se água destilada como referência. A concentração de lignina foi calculada

por meio das equações seguintes, levando-se em consideração a normalização das

concentrações em função do fator de diluição utilizado.

CJJc = [4, 187 x 10·2 (AJJmso-ÀPD2Bo) - 3,279 x 10-4] (13)

(14)

Onde Cuc é a concentração de lignina Klason solúvel em meio ácido (g/L), Auc280 é a

absorbância da solução em 280 nm, CF e Cm.1F são as concentrações (g/L) de furfural e

hidróxi-metil-furfural determinadas por HPLC, e f:f· e &HMF são os coeficientes de extinção

(L/g cm) do furfural (146.85) e do hidróx.i-metil-furfural (114.00), determinados por

espectrofotometria em 280 nm.

4.5.5 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FERMENTATIVOS

O percentual de células imobilizadas no reator (! %) foi determinado por meio da

equação:

1% = XRIIXR (15)

Onde 1% é o percentual de células imobilizadas no reator, XRI é a concentração de

células imobilizadas no reator (g/L) e XR é a concentração celular total no reator (g/L).

48

O percentual do consumo de xilose (S%) foi determinado por meio da seguinte

equação:

(16)

Onde S% é o percentual do consumo de xilose, So é a concentração inicial de xilose

(g/L) e SFé a concentração final de xilose (g/L).

O fator de rendimento da conversão de xilose em xilitol ( Yr,·s) foi determinado por

meio da seguinte equação:

Yl'/s = Pr/(So - SF) (17)

Onde Yp;s é o fator de rendimento da conversão de xilose em xilitol (g/g), Pr é a

concentração final de xilitol (g/L ), So é a concentração inicial de xilose (g/L) e Sr é a

concentração final de xilose (g/L).

A eficiência da bioconversão de xilose em xilitol (E%) foi determinada por meio da

seguinte equação:

E%= Yp;s/0.917 (18)

Onde E% é a eficiência da conversão de xilose em xilitol e Yp;s é o rendimento da

conversão de xilose em xilitol (g/g). Considerou-se, como valor teórico máximo de Yp;s, o

rendimento de 0.917 g/g proposto por BARBOSA et ai. (1988).

O fator de rendimento da conversão de glicose e xilose em células (Yxd foi

determinado por meio da seguinte equação:

Y X1C = (XRF - XRo)l(So - SF + Go) (19)

Onde Yx1c é o fator de rendimento da conversão de glicose e xilose em células (g/g),

XRF é a concentração celular total no reator (g!L ), XRo é a concentração celular total no reator

no início das fermentações (g/L ), So é a concentração inicial de xilose (g/L ), SF é a

concentração final de xilose (g/L) e Go é a concentração inicial de glicose (g/L).

A produtividade em xilitol (Qp) foi determinada por meio da seguinte equação:

49

Qp = Pp/t (20)

Onde Qp é a produtividade em xilitol (g/L h), PF é a concentração final de xilitol (g/L)

e t é o tempo decorrido durante a fermentação (h).

A produtividade específica em xilitol (qp) foi determinada por meto da seguinte

equação:

qr = Q/XR (21)

Onde qp é a produtividade específica em xilitol (g/g h), Qp é a produtividade em xilitol

(g/L h) e XR é a concentração celular total no reator (g/L).

A taxa do consumo de xilose (Qs) foi determinada por meio da seguinte equação:

Qs = (SF - So)/t (22)

Onde Qs é a taxa do consumo de xilose (g/ L h), SF é a concentração final de xilose

(g/L), S0 é a concentração inicial de xilose (g/L) e t é o tempo decorrido durante a

fermentação (h).

A taxa específica do consumo de xilose (qs) foi determinada por meio da seguinte

equação:

qs = Qs!XR (23)

Onde qs é a taxa específica do consumo de xilose (g/g h), Qs é a taxa do consumo de

xilose (g/L h) e XR é a concentração celular total no reator (g/L).

50

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DOS HIDROLISADOS OBTIDOS

O bagaço de cana, após secagem ao sol e determinação do teor de umidade, foi

submetido à hidrólise ácida. O hidrolisado obtido, cuja composição média é apresentada na

TABELA 5, apresentou um pH igual a 1.3.

TABELA 5: Caracterização parcial do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana obtido

após hidrólise ácida

Componente Concentração (g/L)

Glicose

Xilose

Arabinose

Ácido Acético

Furfura/

HMF

Lignina K/ason

1.4

22.2

1.8

2.6

0.15

0.03

2.6

Uma parte deste hidrolisado, suficiente para a realização dos ensaios do planejamento

inicial (item 4.4.2), foi concentrada utilizando-se fatores de concentração iguais a três, quatro

ou cinco vezes. Os hidrolisados obtidos apresentaram valores médios de pH iguais a 0.8, 0.6 e

0.5, respectivamente. A TABELA 6 ilustra a composição média destes hidrolisados.

Conforme pode ser observado nas TABELAS 5 e 6, os teores dos açúcares presentes

no hidrolisado original (hidrolisado não concentrado) aumentaram de maneira proporcional

aos fatores de concentração utilizados. Comportamento semelhante foi evidenciado com

relação ao teor de HMF, um dos inibidores normalmente encontrados em hidrolisados

lignocelulósicos. Com relação aos teores dos demais inibidores quantificados, verificou-se um

comportamento diferenciado dependendo do composto em questão. Enquanto a concentração

de furfural foi drasticamente reduzida, independentemente do fator de concentração, o teor de

ácido acético foi aumentado de maneira não proporcional ao fator de concentração quando o

51

hidrolísado foi concentrado três vezes. O aumento do fator de concentração para quatro e

cinco vezes não acarretou em maiores aumentos na concentração deste inibidor. Verificou-se

um aumento no teor dos produtos de decomposição da lignina de maneira proporcional ao

fator de concentração quando o hidrolisado foi concentrado três vezes. Diferentemente do

comportamento observado para o ácido acético, o aumento do fator de concentração para

quatro e cinco vezes levou a aumentos progressivos no teor dos produtos de decomposição da

lignina.


submetidos à concentração por fatores iguais a três (H3), quatro (H4) e cinco (H5)

Componente Concentração {g/L)

H3 84 Hs

Glicose 4.7 6.1 7.3 Xilose 64.6 85.5 105.8

Arabinose 6.4 8.6 10.4

Ácido Acético 4.1 4.3 .. 4.4 - - Furfural 0.02 0.02 0.03

HMF 0.1 l 0.14 0.17 Lignina Klason 7.3 9.0 IO.O

Durante a realização dos ensaios do planejamento inicial (item 4.4.2), foram retiradas

amostras dos hidrolisados antes da elaboração do meio de fermentação, após os

procedimentos de detoxificação e autoclavagem. A composição média destes hidrolísados é

apresentada na TABELA 7.

Conforme pode ser observado na TABELA 7, o tratamento empregado na

detoxificação do hidrolisado foi capaz de reduzir fortemente as concentrações dos inibidores

em todos os hidrolisados. Especificamente, o furfural e o HMF foram praticamente

eliminados dos hídrolisados, independentemente do fator de concentração. Apesar da

considerável redução nos teores dos produtos de decomposição da lignina em todos os

hidrolisados, resíduos destes compostos permaneceram em concentrações progressivamente

52

crescentes nos hidrolisados concentrados três, quatro e cmco vezes, respectivamente. Não

foram verificadas reduções nos teores de ácido acético após o tratamento, independentemente

do fator de concentração.


submetidos à concentração por fatores iguais a três (H3), quatro (Ha) e cinco (H5),

detoxificação e autoclavagem


HJ H4 Hs

Glicose 4.3 5.8 6.5

Xüose 60.1 77.8 92.1

Arabinose 5.9 8.3 9.2

Ácido Acético 3.9 4.4 3.9

Furfural 0.00 0.00 0.01

HMF 0.00 O.OI O.OI

Lignina Klason 0.8 1.5 1.8

Um outro aspecto importante observado durante o tratamento destes hidrolisados foi a

tendência de perda dos açúcares presentes provocada pelo método de detoxificação.

Enquanto, no hidrolisado concentrado três vezes, não foram detectadas diferenças

estatisticamente significativas (p < O.OS) entre os teores dos açúcares antes e após o

procedimento de detoxificação, verificou-se redução no teor de xilose (9.0 %) do hidrolisado

concentrado quatro vezes e nos teores de glicose (11.0 %), xilose (13.0 %) e arabinose

(11.5 %) do hidrolisado concentrado cinco vezes após os procedimentos de detoxificação e

autocla vagem.

Para a realização dos ensaios de composição do planejamento inicial (item 4.4.3), uma

nova parte do hidrolisado original foi concentrada utilizando-se os mesmos fatores de

concentração da etapa anterior. A composição média dos hidrolisados concentrados é

apresentada na TABELA 8.

A comparação das composições médias entre os hidrolisados utilizados nos ensaios do

53

planejamento inicial (TABELA 6) e os hidrolisados utilizados nos ensaios de composição do

planejamento inicial (TABELA 8) mostrou diferenças significativas (p < 0.05) com relação

aos teores de arabinose, furfural e produtos de decomposição da lignina, embora a

composição do hidrolisado original (TABELA 5) tenha permanecido inalterada com relação a

todos os compostos quantificados. Verificou-se que os teores médios de arabinose, furfural e

produtos de decomposição da lignina foram maiores nos hidrolisados utilizados nos ensaios

de composição do planejamento inicial (TABELA 8). Com relação aos demais compostos

quantificados e aos valores de pH, não foram observadas diferenças estatisticamente

significativas.


submetidos a concentração por fatores iguais a três (H3), quatro Il-ía) e cinco (Hj)


83 li4 Hs

Glicose 4.6 6.3 8.1

Xllose 62.7 84.8 106.4

Arabinose 8.1 12.0 13.5

Ácido Acético 4.1 3.9 4.0

Furfural 0.07 0.04 0.06

HMF 0.10 0.15 0.16

Lignina Klason 10.7 11.7 15.2

Acredita-se que as diferenças descritas no parágrafo anterior ( com relação aos teores

de arabinose, furfural e produtos de decomposição da lignina) possam estar relacionadas ao

tempo e à temperatura utilizados para a concentração do hidrolisado. Sabe-se que muitos dos

compostos presentes em hidrolisados hemicelulósicos são bastante reativos (FENGEL e

WEGENER, 1989), alguns deles podendo reagir entre si e formar outros compostos

dependendo da temperatura e do tempo de residência (P ALMQVIST e HAHN-HAGERDAL,

2000b). No presente estudo, utilizou-se um concentrador aquecido por vapor proveniente de

uma autoclave e, tanto a temperatura quanto o tempo de concentração não puderam ser

54

controlados precisamente.

Com a finalidade de neutralizar efeitos causados pela utilização de hidrolisados

concentrados provenientes de lotes diferentes, com conseqüente interferência na análise

estatística dos dados obtidos, dois ensaios (ensaios 30 e 31 - TABELA 3) foram

adicionalmente realizados nos níveis centrais das variáveis independentes durante a

composição do planejamento inicial, de forma a permitir uma distinção entre os efeitos reais

causados pelas variáveis em estudo e aqueles devidos ao uso de hidrolisados com

características distintas.

Para a avaliação da estabilidade operacional da produção de xilitol em reator de

mistura (item 4.4.4), uma nova parte do hidrolisado original foi concentrada utilizando-se um

fator de concentração igual a cinco vezes. A composição média do hidrolisado obtido, que

apresentou um valor médio de pH igual a 0.4, é apresentada na TABELA 9.

TABELA 9: Caracterização parcial do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

submetido à concentração por fator igual a cinco


Lignina Klason

8.5

106.3

11.3

4.7

0.02

0.15

14.0

Glicose

Xilose

Arabinose

Ácido Acético

Furfural

HMF

5.2 AVALIAÇÃO DA PERFORMANCE DAS CÉLULAS IMOBILIZADAS NA PRODUÇÃO DE

XILITOL EM DIFERENTES SISTEMAS FERMENTATIVOS

Nesta etapa, a bioconversão de xilose em xilitol pelas células imobilizadas nas esferas

de alginato de cálcio foi realizada utilizando-se três sistemas fermentativos diferentes: frascos

Erlenmeyer (EF), reator de mistura (STR) e reator tipo cesta (BSTR).

55

Conforme pode ser observado nas FIGURAS 9 - 11, verificou-se um crescimento

expressivo de célul_as livres no meio de fermentação em todos os três sistemas fermentativos,

caracterizando-os como mistos, sendo compostos por células imobilizadas e células livres. O

crescimento de células livres no meio de fermentação durante a produção de xilitol com

células imobilizadas em esferas de alginato de cálcio foi também observado em meio sintético

(Y AHASHI et al., 1996) e, previamente, em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

(CARVALHO et ai., 2002c).

30-,-----------===---.-10 .-------· ::i' E!

6 x."' -----!::,. Q)

:E ------o 4 ><."'

8 25

20

- '><.'ii.

5 ==:::::=:::::::=======e 2 J ~e- -- º o o

o 12 24 36 Tempo (h)

48

FIGURA 9: Bioconversão de xilose em xilitol em frascos Erlenmeyer. Concentração de

células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio, X1 (•), e no reator, XRI (O);

concentração de células livres no meio de fermentação, XM (e), e no reator, XR!vt (O);

concentração celular total no reator, XR (.6).

De acordo com QUIRÓS et ai. ( 1995), a perda de células das esferas de alginato de

cálcio para o meio de fermentação ocorre naturalmente devido ao aparecimento de poros

semelhantes a crateras na superfície das esferas, determinado pelo crescimento das células

imobilizadas. Entretanto, conforme pode ser observado na TABELA 1 O, o menor percentual

de células imobilizadas no reator (1%) observado ao final da fermentação conduzida no

sistema STR sugere que a abrasão das esferas, resultante do contato direto com as turbinas de

agitação, contribuiu para o aumento na perda de células para o meio de fermentação.

A TABELA 1 O apresenta os resultados obtidos nos diferentes sistemas fermentativos

56

avaliados. Conforme pode ser observado, os sistemas EF e STR apresentaram resultados

semelhantes com relação à concentração, rendimento e produtividade ao final das

fermentações. Entretanto, as taxas específicas de consumo de xilose e produção de xilitol, que

alcançaram valores iguais a 0.152 g/g h e 0.082 g/g h, respectivamente, no sistema EF,

diminuíram para valores iguais a 0.082 g/g h e 0.047 g/g h, respectivamente, quando o

sistema STR foi empregado.

40

35

30

25

~ 20 .9 ),( 15

10

5

o o

. .....-----.-• !:, -----.6-- 8 6 ::i s

6 x."' D o-D G>

:!;

4 x."'

o 12 24 36

Tempo (h) 48 60

FIGURA 1 O: Bioconversão de xilose em xilitol em reator de mistura. Concentração de

células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio, X1 (•), e no reator, XRJ (O); ;

concentração de células livres no meio de fermentação, XM (e), e no reator, XRJ..f (O);

concentração celular total no reator, XR (.6).

De acordo com SPENCER-MARTINS (1994), a mudança para condições anaeróbias

pode alterar o mecanismo de transporte de xilose através da membrana plasmática de

leveduras, levando a uma menor taxa de entrada desta pentase para o interior das células.

Desta forma, tendo em vista os dados comentados no parágrafo anterior, acredita-se que uma

melhor transferência de oxigênio no sistema STR possa ter favorecido a formação de maiores

colônias de células imobilizadas na superficie das esferas de imobilização, limitando a

transferência de oxigênio para as células confinadas mais internamente. Em conseqüência, a

existência de possíveis zonas anaeróbias no interior das esferas de imobilização teria levado a

um decréscimo na taxa de transporte de xilose através da membrana plasmática das células

57

confinadas nestas zonas, explicando as reduções nas taxas específicas de consumo de xilose e

de produção de xilitol.

TABELA 10: Performance dos sistemas fermentativos empregados na bioconversão de xilose

em xilitol

Sistema Fermentativo EF" STR6 BSTR6

PF(g/L) 21.0 23.5 15.0

Qp (g/L h) 0.44 0.39 0.21

qp (glg h) 0.082 0.047 0.043

Yp1s (glg) 0.54 0.58 0.46

Qs(g/L h) 0.82 0.68 0.45

qs (glg b) 0.152 0.082 0.092

1% (-) 0.70 0.62 0.69

s% <-> 0.90 0.89 0.71

Yx;c(glg) 0.089 0.149 0.089

ª: So = 43.4 g/L; XRo = 1.6 g/L : So = 45.5 g/L; XRo = 1. 7 gil

Foi observada uma redução de 10.7 % (p < O.OS) no volume médio das esferas de

alginato de cálcio durante a fermentação conduzida no sistema STR. De acordo com BARON

et ai. (1996), a adaptação de uma cesta no centro da cuba do reator de mistura, de forma a

conter um leito empacotado com células imobilizadas, permite a manutenção da integridade

do suporte de imobilização e oferece vantagens sobre a utilização de reatores de leito

empacotado tradicionais. De fato, reatores tipo cesta (BSTR) contendo células imobilizadas

em esferas de alginato de cálcio foram utilizados com sucesso na produção de etanol

(GAMARRA et al., 1986; TAVARES, 1998) e ácido lático (ABELYAN e ABELYAN,

1996). No presente estudo, entretanto, a configuração do reator tipo cesta utilizado não

produziu resultados satisfatórios na produção de xilitol. Conforme pode ser observado na

TABELA 10, uma produção de 15.0 g/L foi observada no sistema BSTR após 72 h de

fermentação, resultando em uma produtividade de apenas 0.21 g/L h. ROCA et ai. (1996), por

exemplo, utilizando um reator de leito empacotado tradicional na produção de xilitol em

58

modo contínuo de fermentação, obtiveram excelentes resultados em termos de rendimento

(1.03 g/g) e produtividade (5.80 g/L h), mesmo levando em consideração o fato de terem

utilizado um meio de fermentação preparado com xilose comercial ao invés de hidrolisado

hemicelulósico.

30~-------------~10

o 12 24 36 48 Tempo (h)

60 72

FIGURA 11: Bioconversão de xilose em xilitol em reator tipo cesta. Concentração de células

imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio, X1 (•), e no reator, XRI (O); concentração de

células livres no meio de fermentação, XM {9), e no reator, )ú<ii1 (O); concentração celular

total no reator, XR (..6.).

A FIGURA 11 apresenta os perfis de crescimento das células imobilizadas e livres

durante a fermentação no sistema BSTR. Diferentemente dos perfis observados nos sistemas

EF (FIGURA 9) e STR (FIGURA 1 O), as esferas de a1ginato de cálcio se tornaram

aparentemente repletas de células apenas após 60 h de fermentação, sugerindo limitações na

transferência de oxigênio e nutrientes até as células imobilizadas. Além disso, foi necessário o

uso de uma agitação demasiadamente elevada para manter as células livres homogeneamente

suspensas no meio de fermentação. Devido à elevada relação entre altura e diâmetro da cuba

do reator e ao fato de que a cesta foi adaptada logo acima da turbina de agitação, uma baixa

eficiência de mistura foi observada na parte superior da cuba, mesmo utilizando-se uma

agitação de 1.300 rpm. Abaixo desta velocidade, verificou-se grande heterogeneidade no

59

padrão de mistura ao longo da cuba e as células livres, presentes no meio de fermentação,

tenderam a aderir nas paredes superiores da cuba e da cesta, interrompendo a bioconversão de

xilose em xilitol.

Além das desvantagens mencionadas no parágrafo anterior, um outro aspecto

importante observado durante a realização da fermentação no sistema BSTR foi a dificuldade

em se manter condições de assepsia durante a transferência das esferas contendo as células

imobilizadas para o reator.

5.2.1 COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS C_OM DADOS DA LITERATURA

A TABELA 11 apresenta dados reportados na literatura sobre o uso de células

imobilizadas em alginato de cálcio para a produção de xilitol em meios sintéticos e

hidrolisados hernicelulósicos.

TABELA 11: Dados reportados na literatura sobre o uso de células imobilizadas em esferas

de alginato de cálcio para a produção de xilitol em meios sintéticos e hidrolisados

hemicelulósicos

Modo de Tipo de Tipo de So PF Qp Yp1s Referência

Operação Meio Reator (g/L) (g/L) (g/L b) (glg)

Leito Roca et al. Contínuo Sintético 50 16.0 5.80 1.03

Empacotado (1996)

Frascos Yahashi et Batelada Sintético 170 86.2 2.16 0.50

Erlenmeyer ai. (1996)

Batelada Frascos 37.6ª 0.31ª 0.37ª Domínguez Sintético 120

94.3b l.97b 0.74b Repetida Erlenmeyer (1998)

Frascos Domínguez Batelada Eucalipto 12 3.4 0.02 0.50

Erlenmeyer et ai. (1999)

Batelada Bagaço de Frascos 23.8ª 0.50ª 0.49ª Carvalho et 50

27.6b 0.58b 0.56b Repetida Cana Erlenmeyer al. (2002b)

ª: Primeira batelada : Quinta batelada

Conforme pode ser observado na TABELA 11, é notável que o uso de meios de

fermentação preparados com xilose comercial (Y AHASHI et al., 1996; DOMÍNGUEZ, 1998)

60

em lugar de hidrolisados hemicelulósicos propiciou a obtenção de valores de concentração

final e produtividade em xilitol pelo menos quatro vezes superiores àqueles obtidos nos

sistemas EF e STR (TABELA 1 O). Estes incrementes na produção de xilitol podem ser

atribuídos às maiores concentrações de xilose presentes no meio ao início das fermentações e

à ausência dos compostos inibidores normalmente encontrados em hidrolisados.

Com relação aos valores de rendimento em xilitol, os valores obtidos nos sistemas EF

e STR (TABELA l O) foram comparáveis àqueles obtidos em meios preparados com xilose

comercial (TABELA 11 ). Exceção a este comportamento foi observada somente durante o

uso de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada, que resultou em

rendimento de 1.03 g/g (ROCA et ai., 1996). Neste contexto, vale ressaltar que a reciclagem

das células imobilizadas em sistemas de bateladas repetidas de fermentação acarretou em

aumentos no rendimento em xilitol tanto em meio preparado com xilose · comercial

(DOMÍNGUEZ, 1998) quanto em meio preparado com hidrolisado de bagaço de cana

(CARVALHO et ai., 2002b ), conforme pode ser verificado na TABELA 11.

5.3 IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCIPAIS FATORES QUE INFLUENCIAM A PRODUÇÃO DE


Nesta etapa, a bioconversão de xilose em xilitol pelas células imobilizadas nas esferas

de alginato de cálcio foi realizada em reator de mistura (STR), variando-se as seguintes

condições de cultivo: fator de concentração do hidrolisado, vazão de ar, agitação,

concentração inicial de células e pH inicial do meio de fermentação.

Os parâmetros fermentativos determinados após 72 h de fermentação empregando-se

as diferentes condições para o cultivo das células (item 4.4.2.) são apresentados na TABELA

12. Conforme pode ser observado, a combinação dos níveis das variáveis independentes

( condições de cultivo) acarretou em mudanças bruscas no comportamento da levedura

Candida guilliermondii. Especificamente com relação à produção de xilitol, os melhores

61

valores de concentração final (PF = 27.9 g/L), produtividade (Qr = 0.39 g/L h) e rendimento

(Yp;s = O. 79 g/g) foram obtidos no ensaio 1 O. Neste ensaio, foram utilizados os níveis

superiores de fator de concentração do hidrolisado (5.0), concentração inicial de células

(1.4 g/L) e pH inicial do meio (6.0) aliados aos níveis inferiores de vazão de ar (1.30 L/min) e

agitação (300 rpm).

TABELA 12: Parâmetros fermentativos determinados após 72 h de fermentação

Pr Q,, Yp1s YX!c XRI XRM XR /% Ensaio

(g/L) (g/L.h) (glg) (glg) (g/L) (g/L) (glL) (-)

01 21.1 0.29 0.60 0.10 1.8 2.9 4.7 0.38

02 3.3 0.05 0.43 0.09 1.2 0.6 1.8 0.67

03 11.3 0.16 0.58 0.18 1.9 2.9 4.8 0.40

04 16.9 0.24 0.68 0.29 2.6 6.2 8.8 0.30

05 17.4 0.24 0.66 0.16 1.8 3.5 5.3 0.34

06 14.1 0.20 0.54 0.33 3.1 8.1 11.2 0.28

07 6.0 0.08 0.32 0.47 4.6 6.2 10.8 0.43

08 7.5 0.10 0.28 0.24 2.4 5.9 8.3 0.29

09 7.1 0.10 0.59 0.12 2.3 0.9 3.2 0.72

10 27.9 0.39 0.79 0.11 3.3 2.6 5.9 0.56

11 15.1 0.21 0.46 0.30 4.0 8.2 12.2 0.33

12 9.5 0.13 0.50 0.14 2.8 2.1 4.9 0.57

13 9.8 0.14 0.37 0.43 4.1 10.1 14.2 0.29

14 9.4 0.13 0.50 0.14 3.1 1.5 4.6 0.67

15 12.9 0.18 0.38 0.28 3.4 8.7 12.1 0.28

16 23.6 0.33 0.44 0.24 3.9 11.7 15.6 0.25

17 22.9 0.32 0.64 0.19 2.4 6.2 8.6 0.28

18 19.5 0.27 0.51 0.18 2.6 6.2 8.8 0.30

19 25.2 0.35 0.57 0.15 2.6 6.0 8.6 0.30

Com relação aos demais parâmetros fermentativos quantificados, observou-se que o

fator de rendimento da conversão de glicose e xilose em células (Yx;tc) variou entre 0.09 e

0.47 g/g, a concentração de células imobilizadas no reator (XRI) variou entre 1.2 e 4.6 g/L, a

concentração de células livres no reator (XRM) variou entre 0.6 e 11. 7 g/L, a concentração

celular total no reator (XR) variou entre 1. 8 e 15. 6 g/L, e o percentual de células imobilizadas

62

no reator (]%) variou entre 25 e 72 %, dependendo das condições de cultivo empregadas.

Utilizando-se a metodologia de planejamento de experimentos, foram quantificados os

efeitos principais e de interações entre 2 fatores que influenciam a produtividade (Qp) e o

rendimento (Jp s) da bioconversão.

A TABELA 13 ilustra os níveis de significância estatística dos efeitos principais e de

interações entre 2 fatores sobre a resposta produtividade (Qp ), enquanto a TABELA 14 ilustra

os níveis de significância estatística dos efeitos principais e de interações entre 2 fatores sobre

a resposta rendimento (Yp;s). Efeitos que apresentaram valor de t calculado inferior a 1.0

foram excluídos previamente à análise de variância.


a produtividade (Qp)

Efeito GL SQ MQ Fc:a1c p

A 01 0.0018 0.0018 0.94 0.3664

e 01 0.0018 0.0018 0.94 0.3664

D 01 0.0039 0.0039'·· 2.02 .. 0.1854

E 01 0.0390 0.0390 20.19 0.0012

AD 01 0.0176 0.0176 9.09 0.0130

AE 01 0.0315 0.0315 16.31 0.0024

CE 01 0.0218 0.0218 11.26 0.0073

Curvatura 01 0.0412 0.0412 21.33 0.0010

Erro total 10 0.0193 0.0019

Total 18 0.1779

GL: graus de liberdade; SQ: soma quadrática; MQ: média quadrática; A: fator de concentração do hidrolisado; C: agitação; D: concentração inicial de células; E: pH inicial do meio de fermentação R2: 0.89

Conforme pode ser observado na TABELA 13, a concentração inicial de células

(p < 0.20) e o pH inicial do meio de fermentação (p < O.OI) influenciaram significativamente

a produtividade em xilitol no sistema em estudo. Além disso, a interação entre o fator de

concentração do hidrolisado e a concentração inicial de células (p < 0.05), a interação entre o

fator de concentração do hidrolisado e o pH inicial do meio de fermentação (p < 0.01) e a

63

interação entre a agitação e o pH inicial do meio de fermentação (p < O.OI) se mostraram

providas de significância estatística, influenciando a produtividade em xilitol.

Conforme pode ser observado na TABELA 14, a vazão de ar (p < O.OI), a agitação

(p < O.OI) e o pH inicial do meio de fermentação (p < 0.20) influenciaram significativamente

o rendimento em xilitol no sistema em estudo. Além disso, a interação entre o fator de

concentração do hidrolisado e a concentração inicial de células (p < O. O l ), a interação entre o

fator de concentração do hidrolisado e o pH inicial do meio de fermentação (p < 0.01), a

interação entre a vazão de ar e a agitação (p < 0.05) e a interação entre a agitação e o pH

inicial do meio de fermentação (p < 0.05) se mostraram providas de significância estatística,

influenciando o rendimento em xilitol.


o rendimento ( f p;s)

Efeito GL SQ MQ F.,..k p -·-··

- !il;..I~" --

A 01 0.0016 0.0016 0.79 0.4098

B OI 0.0400 0.0400 19.70 0.0022

e 01 0.0756 0.0756 37.25 0.0003

D 01 0.0006 0.0006 0.31 0.5999

E OI 0.0064 0.0064 3.15 0.1137

AD OI 0.0306 0.0306 15.08 0.0046

AE 01 0.0841 0.0841 41.42 0.0002

BC 01 0.0110 0.0110 5.43 0.0481

CE 01 0.0182 0.0182 8.98 0.0172

Curvatura OI 0.0101 0.0101 4.99 0.0559

Erro total 08 0.0162 0.0020

Total 18 0.2946

GL: graus de liberdade; SQ: soma quadrática; MQ: média quadrática; A: fator de concentração do hidrolisado; B: vazão de ar; C: agitação; D: concentração inicial de células; E: pJJ inicial do meio de fermentação R2: 0.95

D'e acordo com a teoria de planejamento de experimentos (BOX et ai., 1978), a

existência de interações significativas entre 2 ou mais fatores cujos efeitos principais não são

significativos não é plausível. Desta forma, com base nos dados apresentados nas TABELAS

64

13 e 14, experimentos adicionais para confirmar ou refutar a significância estatística dos

efeitos principais do fator de concentração do hidrolisado, da agitação e da concentração

inicial de células se mostraram necessários, uma vez que estas variáveis estavam envolvidas

em interações estatisticamente significativas. A existência de curvaturas significativas para as

duas respostas, indicando que possíveis modelos quadráticos seriam mais adequados para se

ajustarem aos dados experimentais, também apontou para a necessidade da realização de

experimentos adicionais.

De uma maneira geral, com base nos dados apresentados nas TABELAS 13 e 14, a

única conclusão tirada a respeito do sistema em estudo com os resultados dos 19 ensaios

iniciais foi que a vazão de ar não influenciou a produtividade. Nem o seu efeito principal nem

nenhuma das interações em que esta variável estava envolvida apresentou um valor de t

calculado superior a 1. O previamente à análise de variância.'

Apesar do planejamento fracionado empregado no presente estudo apresentar

resolução V e, portanto, dos efeitos de interação entre 2 fatores estarem confundidos com

efeitos de interação entre 3 fatores, a interpretação dos resultados em termos de interações

entre 2 fatores ( assumindo-se que as interações entre 3 fatores poderiam ser desprezadas) para

as duas respostas (produtividade e rendimento) se mostrou coerente com a literatura. Mais que

isso, estas interações evidenciaram claramente a influência determinada pelos compostos

inibidores, gerados durante a fase de hidrólise ácida, sobre a atividade fermentativa dos

microrganismos. Apesar de detoxificados, os hidrolisados apresentaram ainda alguns

compostos inibidores em suas composições, conforme apresentado na TABELA 7. A

interpretação das interações entre 2 fatores sugeriram a possibilidade de minimização das

influências negativas determinadas por estes inibidores residuais sobre a atividade

fermentativa dos microrganismos através do ajuste das condições de cultivo.

A FIGURA 12 apresenta os valores preditos para produtividade (a) e rendimento (b),

65

em função do fator de concentração do hidrolisado e da concentração inicial de células.

Conforme pode ser observado, a maior produtividade (0.24 g/L.h) e o maior rendimento (0.56

g/g) são obtidos quando se utiliza os níveis superiores de concentração inicial de células

(1.4 g/L) e fator de concentração do hidrolisado (5.0).

~ ~

B ~ !:!!

~ ~ ~ ~ " = 1.4 .. 1.4 = :.; :-.; o u o

"O u -;;; "O

ºõ ~ :s .s .5 o o "" o- "" .. E! ~ o-

B ~ J:, .. s 0.6 J:, 0.6 e o u e o o e o o

J.O 5.0 u 3.0 5.0

fator de concentração do hidrolisado Fator de concentração do hidrolísado

(a) (b)


de concentração do hidrolisado e da concentração inicial de células.

Ao se trabalhar com hidrolisado concentrado três vezes, a elevação da concentração

celular inicial de 0.6 g/L para 1.4 g/L acarreta em decréscimos na produtividade e no

rendimento. Por outro lado, ao se trabalhar com hidrolisado concentrado cinco vezes, a

mesma elevação na concentração celular inicial favorece a bioconversão de xilose em xilitol,

aumentando em 60 % a produtividade e em 17 % o rendimento.

De acordo com os dados apresentados na FIGURA 12, o aumento na concentração

inicial de células é um procedimento que contribui para aliviar os efeitos negativos

determinados pela maior concentração de compostos inibidores presentes no hidrolisado mais

concentrado. De fato, melhoras na produtividade e no rendimento em xilitol devido à

utilização de inóculos mais concentrados foram também observadas quando se cultivou a

levedura Candida guilliermondii em hidrolisados de eucalipto (FELIPE et al., 1996a), bagaço

de cana (FELIPE et al., l 997b) e palha de arroz (SILVA e ROBERTO, 1999). De acordo com

P ARAJÓ et ai. (1998c ), o aumento da concentração inícial do inóculo favorece a produção de

66

xilitol em hidrolisados hemicelulósicos limitando a morte celular causada pela assimilação

dos inibidores presentes (P ARAJÓ et al., l 998c).


em função do fator de concentração do hidrolisado e do pH inicial do meio de fermentação.

Conforme pode ser observado, a maior produtividade (0.29 g!L.h) e o maior rendimento

(0.61 g/g) são obtidos quando se utiliza os niveis superiores de pH inicial do meio (6.0) e

fator de concentração do hidrolisado (5.0).

e o "' .. o- <> ..

~ j 0.291 ..

~ ~ e ê " 6.0 " 6.0 E Ê ~ ~ " e

"O "O o o

'ü ·.; E E o o

"" "O .. ~ ~

:; ~ ~

"ü 4.0 1

o 4.0 :s :ê - :r: ~ e.. 3.0 5.0 3.0 5.0

Fator de concentração do hidrolisado Fator de concentração do hidroliaado

(a) (b)


de concentração do hidrolisado e do pH inicial do meio de fermentação.

Ao se trabalhar com hidrolisado concentrado três vezes, a elevação do pH inicial do

meio de 4.0 para 6.0 praticamente não influencia a produtividade além de acarretar em

redução no rendimento. Por outro lado, a mesma elevação de pH em um meio preparado com

hidrolisado concentrado cinco vezes determina um aumento de 190 % na produtividade e de

cerca de 42 % no rendimento.

De acordo com os dados apresentados na FIGURA 13, o aumento do pH inicial do

meio de fermentação também ajuda a aliviar os efeitos negativos determinados pela maior

concentração de inibidores presentes no hidrolisado mais concentrado. Os efeitos

determinados pelo pH inicial do meio de fermentação sobre a atividade fermentativa dos

microrganismos podem ser explicados em função da toxicidade do ácido acético, uma vez que

67

a alteração do pH entre 4.0 e 6.0 não é suficiente para alterar a toxicidade dos derivados da

lignina (Fengel e Wegener, 1989). O efeito inibitório do ácido acético é dependente do grau

de dissociação, sendo que a variação do pH do meio entre 4.0 e 6.0 influencia o percentual de

moléculas presentes na forma não dissociada (P ALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000b ).

As moléculas não dissociadas difundem-se através da membrana citoplasmática,

determinando decréscimos no pH intracelular para valores inferiores aos limites fisiológicos e

alterando a homeostase intracelular (LOHMEIER-VOGEL et ai., 1998). Desta forma, ao

elevar o pH inicial do meio de fermentação, o percentual de moléculas na forma não

dissociada é reduzido, minimizando assim o efeito deste tipo de inibidor no metabolismo

microbiano.

Por outro lado, conforme pode ser observado na TABELA 7, não foram detectadas

diferenças significativas com relação aos teores médios de ácido acético entre os hidrolisados

concentrados três, quatro e cinco vezes, após detoxificação e autoclavagem. Como a elevação

do pH inicial do meio de fermentação de 4.0 para 6.0 no hidrolisado concentrado três vezes

praticamente não influenciou a produtividade, além de ter acarretado em decréscimo no

rendimento, acredita-se que a maior concentração de produtos de decomposição da lignina

presente no hidrolisado concentrado cinco vezes (TABELA 7) tenha potencializado a ação

inibitória do ácido acético, realçando o efeito determinado pela elevação do pH inicial do

meio de fermentação. Desta forma, os dados apresentados na FIGURA 13 confirmam a teoria

de P ARAJÓ et ai. ( 1998c ), segundo a qual o potencial inibitório de um dado composto não

pode ser estabelecido de uma forma geral, uma vez que depende da presença simultânea de

outros inibidores e de suas respectivas concentrações.


em função do pH inicial do meio de fermentação e da agitação. Conforme pode ser observado,

a maior produtividade (0.28 g/L.h) e o maior rendimento (0.63 g/g) são obtidos quando se

68

utiliza o nível inferior de agitação (300 rpm) e o nível superior de pH inicial do meio (6.0).

Enquanto ao se trabalhar com uma agitação de 500 rpm, a elevação do pH inicial do

meio de 4.0 para 6.0 praticamente não influencia a produtividade e o rendimento, a mesma

elevação de pH em uma fermentação conduzida com uma agitação de 300 rpm determina um

aumento de aproximadamente 155 % na produtividade e de aproximadamente 21 % no

rendimento.

o .. e- ~ ê 6.0 .s o

"O o ·.; E o -e -;; ·e:; ~ :s 4.0 ~

o .... "" !! j 6.0

o -e o ·.; E o -e

300 500 300 500

Velocidade de agitação (rpm) Velocidade de agitação (rpm)

(a) (b)

FIGURA 14: Valores preditos para a produtividade (a) e rendimento (b), em função do pH

inicial do meio de fermentação e da velocidade de agitação.

! -. -

De acordo com os dados apresentados na FIGURA 14, o aumento da agitação (e

conseqüentemente da taxa de transferência de oxigênio para o meio de cultivo) praticamente

anula os ganhos em produtividade e rendimento obtidos quando se eleva o pH inicial do meio

em fermentações conduzidas com menores velocidades de agitação. Estando o efeito do pH

inicial do meio relacionado com a toxicidade do ácido acético, conforme discutido

previamente, é também plausível associar o efeito da taxa de transferência de oxigênio para o

meio de cultivo com a toxicidade provocada por este ácido fraco. De fato, P ARAJÓ et ai.

( 1997) verificaram que o ácido acético foi consumido mais rapidamente em condições de

maior aeração, sendo o potencial tóxico deste composto reduzido como conseqüência.

FELIPE et ai. (1997a) também observaram efeito semelhante na atividade fermentativa da

levedura Candida guilliermondii FTI 20037. No presente estudo, também se verificou uma

69

maior velocidade média de consumo do ácido acético nos ensaios nos quais se utilizou uma

maior velocidade de agitação. Entretanto, apesar da utilização de uma maior taxa de

transferência de oxigênio favorecer o consumo de ácido acético, resulta em menores valores

de produtividade e rendimento, conforme pode ser observado na FIGURA 14.

A FIGURA 15 apresenta os valores preditos para rendimento, em função da vazão de

ar e da velocidade de agitação. Conforme pode ser observado, o maior rendimento (0.60 g/g)

é obtido quando se utiliza os níveis inferiores de vazão de ar (1.30 L/min) e de velocidade de

agitação (300 rpm).

.52.60 ~ ~ J:

1.30

300 500

Velocidade de agitação (rpm)

FIGURA 15: Valores preditos para rendimento, em função da vazão de ar e da velocidade de

agitação.

Independentemente da vazão de ar empregada, o aumento da velocidade de agitação

acarreta em decréscimos no rendimento. Enquanto o aumento na agitação de 300 rpm para

500 rpm em fermentação conduzida com vazão de ar igual a 1.30 L/min leva a um decréscimo

de cerca de 13 % no rendimento, o mesmo aumento na agitação quando a fermentação é

conduzida utilizando-se vazão de ar igual a 2.60 L/min provoca redução de aproximadamente

35 % no rendimento.

Com base no exposto, fica claro que as interações que se mostraram providas de

significância estatística, influenciando a produtividade e o rendimento da bioconversão, foram

consideradas plausíveis e coerentes com a literatura. Entretanto, para uma interpretação final

dos dados obtidos, a realização de experimentos adicionais se mostrou necessária não somente

70

para confirmar ou refutar a significância dos efeitos principais de variáveis envolvidas em

interações significativas, mas também para se obter dados suficientes para a elaboração dos

modelos quadráticos sugeridos pela existência de curvaturas significativas.

Para a realização dos experimentos adicionais, o planejamento inicial foi composto em

um planejamento de face centrada com todas as variáveis independentes. Optou-se por este

tipo de planejamento porque a ampliação da região de estudo por meio da composição do

planejamento inicial em um planejamento rotacional (a = ± 2.0) ou ortogonal (a = ± 2.25)

apresentaria problemas devido à necessidade de utilização de valores de pH inicial do meio

iguais ou superiores a 7. O (inativação da penicilina empregada para o controle de

contaminantes) e à necessidade de emprego de fatores de concentração do hidrolisado iguais

ou superiores a 6.0 (perda de xilose durante o tratamento de detoxificação).

5.3.1 COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS COM DADOS DA LITERATURA

Conforme mencionado previamente, os melhores valores de concentração final,

produtividade e rendimento foram obtidos no ensaio 1 O, utilizando-se os níveis superiores de

fator de concentração do hidrolisado, concentração inicial de células e pH inicial do meio

aliados aos níveis inferiores de vazão de ar e agitação.

Todas as análises estatísticas foram realizadas considerando-se o tempo de 72 h de

fermentação como referência, uma vez que alguns ensaios tiveram que ser finalizados neste

tempo por problemas de contaminação. No caso específico do ensaio 10, foi possível conduzir

a fermentação até 120 h. A TABELA 15 apresenta os parâmetros fermentativos determinados

para este ensaio nos tempos de 72 e 120 h.

Conforme pode ser observado na TABELA 15, foi possível prolongar a fermentação

até 120 h, maximizando o consumo de xilose e a concentração de xilitol no caldo fermentado,

sem provocar prejuízos nos valores de rendimento e produtividade. Entretanto, verificou-se

uma redução nas velocidades específicas de consumo de xilose (15.7 %) e de produção de

71

xilitol ( 18.2 % ), sugerindo limitação de algum nutriente ( como oxigênio, por exemplo) ou

algum outro problema de transferência de massa, que pode ter sido determinado pelo aumento

da concentração celular no reator e/ou pela redução do teor de xilose no meio de fermentação.


fermentação. Condições de cultivo: fator de concentração do hidrolisado (5.0), vazão de ar


(6.0)

Parâmetros Fermentativos Tempo de Fermentação (b)

72 120

27.9 47.9

0.39 0.40

0.066 0.054

0.79 0.77

0.86 0.84

0.49 0.52

0.083 0.070

0.48 0.84

3.3 3.3

2.6 4.1

5.9 7.4

0.56 0.45

0.ll 0.09

PF(g{L)

Qp (g/L h)

qp (g/g h)

Yp;s (g/g)

E%(-)

Qs (gfL h)

qs (gfg h)

S%(-)

Xiu (g{L)

XRM (g/L)

XR (g/L)

]% (-)

Yx;c(gfg)

So = 74.3 g!L; XRo = 1.5 gil

A TABELA 16 ilustra alguns resultados obtidos através do cultivo da levedura

Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, utilizando-se

diferentes sistemas de fermentação e modos de operação. Conforme pode ser observado,

embora hidrolisados com concentrações similares de xilose tenham sido utilizados no início

destes experimentos, grandes variações na concentração, produtividade e rendimento em

xilitol foram obtidas ao final das fermentações. A utilização do reator de mistura no modo de

batelada (SILVA et ai., 1997) permitiu a obtenção dos melhores valores de concentração

(41.8 g/L) e produtividade (0.87 g/L h) aliados a um bom rendimento em xilitol (0.67 g/g),

72

com a vantagem adicional de requerer um inóculo consideravelmente pequeno (0.5 g/L). O

maior valor de rendimento em xilitol (O. 79 g/g) foi observado durante o emprego do reator de

mistura em modo semicontínuo (RODRIGUES et al., 1998), enquanto o menor valor de

concentração obtido (18.0 g/L) foi observado quando se utilizou o reator de mistura em modo

contínuo de operação (MARTINEZ et ai., 2003). A reutilização das células imobilizadas em

um sistema de bateladas repetidas de fermentação determinou aumentos de aproximadamente

15 % nos valores de concentração, produtividade e rendimento em xilitol após a primeira

batelada da série de repetições (CARVALHO et al., 2002b). Apesar da melhora na produção

de xilitol observada pela reutilização dos biocatalisadores imobilizados, os valores de

concentração, produtividade e rendimento em xilitol foram ainda inferiores àqueles

observados quando se empregou um sistema de fermentação semelhante (frascos

Erlenmeyer ), porém com células livres em suspensão (FELIPE et al., 1997b ).

TABELA 16: Dados reportados na literatura sobre a produção de xilitol em hidrolisados

hemicelulósicos de bagaço de cana com a levedura Candida guilliermondii FTI 20037

Modo de Tipo de XRo So PF Q,, Yprs Referência

Operação Reator (g/L) (g/L} (g/L) (g/L h) (glg)

Frascos Felipe et ai. Batelada 3.0 54.5 34.4 0.75 0.74

Erlenmeyer (1997b)

Silva et ai. Batelada STR 0.5 62.1 41.8 0.87 0.67

(1997)

Semi l.Ob 62.lb 34.0b 0.65b 0.79b

Rodrigues STR

Contínuo et al. (1998)

Martinez et Contínuo STR 0.5 51.0 18.0 0.68 0.69

al. (2003)

Semi Frascos 1.0ª 23.8ª 0.50ª 0.49ª Carvalho et . 50.0 Continuo Erlenmeyer 3. lc 27.6c 0.58c 0.56c al. (2002b)

': Células imobilizadas;ª: Primeira batelada; 6: Segunda batelada; e_. Quinta batelada

Comparando os dados obtidos com o uso de células imobilizadas nas melhores

condições de cultivo (TABELA 15) com aqueles reportados na literatura para a mesma

levedura (TABELA 16), verifica-se que no sistema com células imobilizadas foi possível

73

obter uma elevada concentração de xilitol no caldo fermentado (47.9 g/L) e um bom

rendimento da conversão de xilose em xilitol (O. 77 g/g), que foi de aproximadamente 85 % do

valor teórico máximo proposto por BARBOSA et ai. (1988). Por outro lado, o valor de

produtividade obtido nestas condições de cultivo (0.40 g/L h) foi ainda inferior àqueles

alcançados com a utilização de células livres em suspensão no meio.

5.4 ELABORAÇÃO DE MODELOS EMPÍRICOS PARA PREDIÇÃO DA PRODUÇÃO DE

XILITOL EM.REATOR DE MISTURA

Nesta etapa. o planejamento fatorial fracionado inicial foi composto em um

planejamento de face centrada. Estes ensaios adicionais permitiram a elaboração de modelos

quadráticos para predição da produtividade e do rendimento da bioconversão em função das

variáveis independentes que influenciam cada uma destas duas respostas.

Os parâmetros fermentativos determinados após 72 h de fermentação empregando-se

as diferentes condições para cultivar as células (item 4.4.3) são apresentados na TABELA 17.

TABELA 17: Parâmetros fermentativos determinados após 72 h de fermentação

Pr Qp YP!s YXtc XRI XRM XR I-,. Ensaio

(g/L) (g/L.b) (glg) (glg) (g/L) (g{L) (g/L) (-)

20 21.2 0.29 0.51 0.19 2.1 7.7 9.8 0.21

21 29.8 0.41 0.66 0.11 2.2 4.4 6.6 0.33

22 24.4 0.34 0.70 0.09 2.1 2.5 4.6 0.46

23 22.0 0.31 0.54 0.24 2.5 9.9 12.3 0.20

24 30.5 0.42 0.69 0.08 2.2 3.0 5.2 0.42

25 23.8 0.33 0.53 0.30 2.5 10.7 13.3 0.19

26 25.8 0.36 0.64 0.12 1.8 4.3 6.1 0.30

27 27.4 0.38 0.62 0.11 2.5 4.6 7.1 0.35

28 14.4 0.20 0.55 0.10 1.9 2.2 4.1 0.46

29 18.0 0.25 0.53 0.37 3.2 9.9 13.l 0.24

30 26.6 0.37 0.70 0.14 2.3 4.5 6.8 0.34

31 32.0 0.44 0.66 0.12 2.2 5.5 7.7 0.29

Conforme pode ser observado na TABELA 17, os melhores valores de concentração

74

final (PF == 32.0 g/L) e produtividade (Qp == 0.44 g/L h) foram obtidos no ensaio 31, enquanto

o melhor valor de rendimento (Yns == 0.70 g/g) foi obtido nos ensaios 22 e 30. Com relação

aos demais parâmetros fermentativos quantificados, observou-se que o fator de rendimento da

conversão de glicose e xilose em células (Yxíc) variou entre 0.08 e 0.37 g/g, a concentração de

células imobilizadas no reator (Xm) variou entre 1.8 e 3.2 g/L, a concentração de células livres

no reator (XRi11) variou entre 2.2 e 10.7 g/L, a concentração celular total no reator (XR) variou

entre 4.1 e 13.3 g/L, e o percentual de células imobilizadas no reator (/%) variou entre 19 e

46 %, dependendo das condições de cultivo empregadas.

Utilizando-se a metodologia da superficie de resposta, uma nova análise de variância

(com os dados de todos os 31 ensaios) foi realizada, obtendo-se os coeficientes de regressão

dos modelos quadráticos que relacionam a produtividade (Qp) e o rendimento (YPls) da

bioconversão com as variáveis independentes que influenciam estas respostas.

Adicionalmente, a significância daqueles efeitos pnncipais não-significativos de variáveis

envolvidas em interações significativas (TABELAS 13 e 14) foi reavaliada.

A TABELA 18 apresenta os valores dos coeficientes de regressão mantidos no modelo

que relaciona Qp com as variáveis que a influenciam, bem como seus respectivos níveis de

significância. Conforme pode ser observado, os efeitos principais do fator de concentração do

hidrolisado e da agitação passaram a apresentar significância estatística (p < 0.20) depois que

os dados dos 12 experimentos adicionais de composição do planejamento foram incluídos na

análise, estando de acordo com o esperado pela teoria (BOX et ai., 1978).

Considerando os coeficientes de regressão apresentados na TABELA 18, o modelo

que relaciona a produtividade em xílitol com as variáveis independentes que a influenciam é

expresso pela seguinte equação:

Qp = 0.34 + 0.016A - 0.014C + 0.015D + 0.047E - 0.13E2 + 0.033AD + 0.044AE - 0.037CE (24)

Onde Qp é o valor de produtividade obtido em função dos valores codificados

75

(equação 5) de fator de concentração do hidrolisado (A), agitação (C), concentração inicial de

células (D) e pH inicial do meio de fermentação (E).


predição da produtividade em xilitol

Fator Coeficiente Erro-padrão lc.ic p

Constante 0.340 0.013

Bloco 1 -0.023

Bloco 2 0.023

A 0.016 0.010 1.63 O.1184

e -0.014 0.010 -1.46 0.1592

D 0.015 0.010 I.52 0.1445

E 0.047 0.010 4.72 0.0001

E! -0.130 0.021 -6.47 0.0001

AD 0.033 0.010 3.16 0.0048

AE 0.044 0.010 4.23 0.0004

CE -0.037 0.010 -3.51 0.0021

A: fator de concentração do hidrolisado; C: agitação; D: concentração inicial de células; E: pH inicial do meio de fermentação

A TABELA 19 ilustra a análise de variância do modelo quadrático ( equação 24) e da

falta de ajuste dos dados experimentais a este modelo, bem como a sua capacidade em

predizer os valores de produtividade. Conforme pode ser observado, o modelo proposto

apresenta elevada significância estatística (p < O. O 1 ), não sendo verificada falta de ajuste

estatisticamente significativa (p > 0.20) no ajuste aos dados experimentais. Além disso,

apresenta uma boa capacidade de predição, conseguindo explicar 84 % da variação total.

Conforme pode ser observado na FIGURA 16, o plote dos resíduos em função dos

valores preditos pelo modelo apresenta uma distribuição aleatória, não sendo identificadas

tendências que poderiam invalidar o modelo proposto.

76


experimentais a este modelo

CV GL Bloco

Modelo 8

Resíduo 21

Falta de ajuste 18

Erro puro 3

Total 30

SQ MQ Fca1c p

0.140 0.140

0.200 0.025 13.91 0.0001

0.037 0.002

0.031 0.002 0.91 0.6236

0.006 0.002

0.370

CV: causa de variação; GL: graus de liberdade; SQ: soma quadrática; MQ: média quadrática R2: 0.84

O.OS- D

o 01><1- e, e e

o D o

"' o a

0.01_ e e "'e o o o ::, D " :E " - - "' "' o: e

-0.02- o D o

o D

-0.00- e D o o 1 1 • 1

0.04 0.13 0.22 0.30 0.311

Valores preditos


proposto para a predição da produtividade.

A equação 24 foi então reduzida, de forma a permitir a elaboração da superfície de

resposta em função do fator de concentração do hidrolisado e do pH inicial do meio de

fermentação. Para esta redução, as variáveis independentes vazão de ar e agitação foram

fixadas nos seus níveis inferiores (-1) e a variável independente concentração inicial de

células foi fixada no seu nível superior ( + 1 ), resultando na seguinte equação:

Qp == 0.369 + 0.049A + 0.084E - 0.13E2 + 0.044A.E (25)

Onde Qp é o valor de produtividade obtido em função dos valores codificados

77

(equação 5) de fator de concentração do hidrolisado (A) e pH inicial do meio de fermentação

(E). A superficie de resposta descrita por esta equação é apresentada na FIGURA 17, onde os

melhores valores de produtividade no sistema em estudo (acima de 0.40 g/L h) são obtidos na

região experimental demarcada em amarelo.

0,50

0,45

0,40

0,35

1.0 ~ o.s 1

.g ,g

º·º -1 -0,S §

-es -·"1 .. 0 ~

o.o -o .es -1.0 ~

- 0,200 ~ 0,250 ~ 0,300 CJ 0,350

- 0.400 CJ above

a.. o 0,30

0,25

0,20

0,15

"'f .. O 075

pH ínicial do meio de Ferrnen-tação

FIGURA 17: Superficie de resposta descrita pela equação 25, que relaciona a produtividade


A TABELA 20 apresenta os valores dos coeficientes de regressão mantidos no modelo

que relaciona Yp;s com as variáveis que o influenciam, bem como seus respectivos níveis de

significância. Conforme pode ser observado, o efeito principal da concentração inicial de

células não apresentou significância estatística (p > 0.20) nem depois que os dados dos 12

experimentos adicionais de composição do planejamento foram incluídos na análise. Desta

forma, estima-se que a elevada significância estatística da interação AD esteja relacionada a

um possível efeito de interação entre 3 fatores (interação BCE), sobreposto à interação AD

devido ao planejamento fracionado empregado (BOX et al., 1978).

Considerando os coeficientes de regressão apresentados na TABELA 20, o modelo

que relaciona o rendimento em xilitol com as variáveis independentes que o influenciam é

expresso pela seguinte equação:

78

Yp1s = 0.60 + 0.019A - 0.056B - 0.072C - 0.004D + 0.014E - 0.073E2 +

0.041AD + 0.075AE - 0.029BC - 0.036CE (26)

Onde Yp;s é o valor de rendimento obtido em função dos valores codificados ( equação

5) de fator de concentração do hidrolisado (A), vazão de ar (B), agitação (C) e pH inicial do

meio de fermentação (E).


predição do rendimento em xilitol

Fator Coeficiente Erro-padrão tcAlc p

Constante 0.600 0.013

Bloco 1 -0.022

Blocol 0.022

A 0.019 0.010 1.94 0.0673

B -0.056 0.010 -5.54 0.0001

e -0.072 0.010 -7.21 0.0001

D -0.004 0.010 -0.44 0.6624

E 0.014 0.010 1.44 0.1658 .. - E2 -0.073 0.021 -3.54 0.0022 -- AD 0.041 0.011 3.88 0.0010

AE 0.075 0.011 7.06 0.0001

BC -0.029 0.011 -2.70 0.0140

CE -0.036 0.011 -3.41 0.0029

A: fator de concentração do hidrolisado; B: vazão de ar; C: agitação; D: concentração inicial de células; E: pH inicial do meio de fermentação

A TABELA 21 ilustra a análise de variância do modelo quadrático ( equação 26) e da

falta de ajuste dos dados experimentais a este modelo, bem como a sua capacidade em

predizer os valores de rendimento. Conforme pode ser observado, o modelo quadrático

proposto apresenta elevada significância estatística (p < O. O 1 ), não sendo verificada falta de

ajuste estatisticameme significativa (p > 0.20) no ajuste aos dados experimentais. Além disso,

apresenta uma boa capacidade de predição, conseguindo explicar 91 % da variação total.

Conforme pode ser observado na FIGURA 18, o plote dos resíduos em função dos

valores preditos pelo modelo apresenta uma distribuição aleatória, não sendo identificadas

tendências que poderiam invalidar o modelo proposto.

79


experimentais a este modelo

CV GL

Bloco

Modelo 10

Resíduo 19

Falta de ajuste 16

Erro puro 3

Total 30

SQ MQ Fca1c p

0.064 0.064

0.330 0.033 18.50 0.0001

0.034 0.002

0.025 0.002 0.51 0.8409

0.009 0.003

0.430

CV: causa de variação; GL: graus de liberdade,· SQ: soma quadrática; MQ: média quadrática If: 0.91

0.08- D

D

CJ D 0.03- o

e"'º o D o .., D o n D ;:,

-0.01 - ~ e 3? .,a

"' e ... e o o o a: D " o

JJ.05 -

D

.0.00- D

t 1 ' ' 1

0.28 0.41 0.53 O.ll6 0.7Q

Valores preditos


proposto para a predição do rendimento.

A equação 26 foi então reduzida, de forma a permitir a elaboração da superficie de

resposta em função do fator de concentração do hidrolisado e do pH inicial do meio de

fermentação. Para esta redução, as variáveis independentes vazão de ar e agitação foram

fixadas nos seus níveis inferiores (-1) e a variável independente concentração inicial de

células foi fixada no seu nível superior ( + 1 ), resultando na seguinte equação:

80

Yp1s = 0.695 + 0.06A + O.OSE - 0.073E2 + 0.075AE (27)

Onde Yp;s é o valor de rendimento obtido em função dos valores codificados ( equação

5) de fator de concentração do hidrolisado (A) e pH inicial do meio de fermentação (E). A

superfície de resposta descrita por esta equação é apresentada na FIGURA 19, onde os

melhores valores de rendimento no sistema em estudo (acima de 0.75 g/g) são obtidos na

região experimental demarcada em amarelo.

0,85

0,80

0,75

U) 0,70 a:: >- 0,65

0,60

0,55

-, .e> C> .. :!:->

, .<~

C>.C> • o.sso mo.ooo ~ 0,650 CJ 0,700 lm 0,750 c:::J above

o.s

-0.o!!'5

-1 .. o -1~0

FIGURA 19: Superfície de resposta descrita pela equação 27, que relaciona o rendimento


5.4.1 DEFINIÇÃO DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO PARA A PRODUÇÃO DE XILITOL EM

REATOR DE MISTURA

As curvas de nível descritas pelas equações que relacionam a produtividade ( equação

25) e o rendimento ( equação 27) em xilitol com o fator de concentração do hidrolisado e com

o pH inicial do meio de fermentação foram sobrepostas, de forma a permitir a definição das

condições de cultivo mais adequadas para a produção de xilitol no sistema em estudo.

Os critérios adotados para a definição das condições de cultivo mais adequadas para a

produção de xilitol foram: As variáveis independentes vazão de ar e agitação foram fixadas

nos seus níveis inferiores (1.30 L/min e 300 rpm, respectivamente); A variável independente

81

concentração inicial de células foi fixada no seu nível supenor (1.4 g/L ); A variável

dependente produtividade em xilitol deveria ser superior a 0.40 g/L h; A variável dependente

rendimento em xilitol deveria ser superior a 0.75 g/g.

A área não sombreada da FIGURA 20 corresponde à região experimental onde os

critérios adotados para a definição das condições de cultivo mais adequadas para a produção

de xilitol no sistema em estudo foram satisfeitos.

Utilizando-se fator de concentração do hidrolisado igual a 5. O, vazão de ar de

1.30 L/min, agitação de 300 rpm, concentração inicial de células de 1.4 g/L e pH inicial do

meio de fermentação igual a 6.0, valores de produtividade e rendimento em xilitol iguais a

0.41 g/L h e 0.81 g/g, respectivamente, foram preditos pelos modelos propostos, no tempo de

72 h de fermentação. Os intervalos de confiança (p < O.OS) das predições compreenderam

valores entre 0.35 g/L h e 0.48 g/L h (produtividade) e entre 0.74 g/g e 0.88 g/g (rendimento).

o •«> o, ffl 0.50 e Q)

ê .!!!

Q) -e o 0.00

ºõi E o

-e

~ .!:::! -0.50 e: I o..

Fator de concentração do hidrolisado

FIGURA 20: Superposição das curvas de nível que relacionam a produtividade e o

rendimento em xilitol com o fator de concentração do hidrolisado e com o pH inicial do meio

de fermentação.

Com a finalidade de comprovar os modelos empíricos propostos e concluir as análises

82

estatísticas dos dados obtidos, foi realizado um ensaio fermentativo utilizando-se as condições

de cultivo descritas no parágrafo anterior. A TABELA 22 apresenta os parâmetros

fermentativos determinados para este ensaio nos tempos de 72 e 120 h. Devido a problemas

de contaminação, evitou-se a abertura do reator para a retirada de amostras das esferas de

alginato de cálcio durante a fermentação. Por este motivo, a concentração de células

imobilizadas foi determinada apenas no início e ao final da batelada.


fermentação. Condições de cultivo: fator de concentração do hidrolisado (5.0), vazão de ar


(6.0)

Parâmetros fermentativos Tempo de Fermentação (b)

72 120 PF(g/L) 25.2 47.5

Qp (glL h) 0.35 0.40

s» (g/g h) 0.062 - . . ·--

YP1s (g/g) 0.83 0.81

E'-'(-) 0.91 0.88

Qs (glL h) 0.42 0.49

qs (g/g h) 0.075

S'-'(-) 0.44 0.86

XRJ (g/L) 2.7

X&v (glL) 2.3 3.8

XR (glL) 6.5

1.,. (-) 0.42

Yx,c (g/g) 0.08

So = 68.8 g/L; XRo = 1.4 g/L

Conforme pode ser observado na TABELA 22, verificou-se uma produção de xilitol

igual a 25.2 g/L após 72 h de fermentação, com valores de produtividade e rendimento iguais

a 0.35 g/L h e 0.83 g/g, respectivamente. Estes dados comprovaram a validade dos modelos

propostos, considerando-se os intervalos de confiança das predições descritos previamente.

De maneira semelhante ao observado no ensaio 1 O (TABELA 15), no qual empregou-

83

se as mesmas condições de cultivo, foi novamente possível prolongar a fermentação até 120 h

de cultivo, maximizando o percentual de consumo de xilose e a concentração de xilitol no

caldo fermentado, sem prejuízos na produtividade e no rendimento da bioconversão. A

FIGURA 21 ilustra os perfis do consumo de glicose, xilose, arabinose e ácido acético, da

produção de xilitol, e do crescimento de células livres no reator, observados durante esta

fermentação.

70

60

:::. ~ 50 (1) Ul o e 40 :e ro iii_ 30 õ :!: ~ 20 oi ~ ·x 10

o o -o-,o-,.~,---,--,-~..---.----.-~.-- ......... -,-~..---11110

144 24 48 72

tempo (h) 96 120

FIGURA 21: Perfis do consumo de glicose (V), xilose <•), arabinose (e) e ácido acético

( <> ), da produção de xilitol (~), e do crescimento de células livres no reator, XRM (O).

Conforme pode ser observado na FIGURA 21, observou-se uma produção de xilitol

igual a 47.5 g/L com um fator de rendimento (Yp;s) de 0.81 g/g após 120 h de fermentação,

resultando em uma produtividade (Qp) de 0.40 g/L h. Estes dados evidenciam a possibilidade

de obtenção de elevados valores de rendimento da bioconversão de xilose em xilitol no

sistema em estudo. De fato, a eficiência de bioconversão obtida nesta fermentação foi de

aproximadamente 90 % do valor máximo teórico proposto por BARBOSA et ai. (1988). Por

outro lado, a produtividade observada após 120 h de fermentação (0.40 g/L h) foi inferior

àquelas obtidas durante o cultivo da levedura Candida guilliermondii em suspensão ( células

não imobilizadas), conforme pode ser observado na TABELA 14.

84

É possível que a presença de glicose no meio tenha contribuído para o aumento no

tempo de fermentação. Conforme pode ser observado na FIGURA 21, a curva de crescimento

das células livres apresentou um padrão de diauxia com uma fase lag aparente entre 12 e 24 h

de fermentação, período no qual observou-se uma redução das taxas de consumo de xilose e

de produção de xilitol. WALTHER et ai. (2001) também observaram um comportamento

semelhante durante a fermentação de meios sintéticos ( elaborados com glicose e xilose)

durante a produção de xilitol com a levedura Candida tropicalis. De acordo com estes

autores, a presença de glicose no meio de fermentação acarretou em consideráveis

decréscimos na produtividade obtida ao final das fermentações.

Por outro lado, tendo em vista que o uso de sistemas com células imobilizadas tem

sido considerado como uma alternativa para se aumentar a produtividade de processos

fermentativos, em razão das elevadas densidades celulares que podem ser utilizadas

(RAMAKRISHNA e PRAKASHAM, 1999), deve-se ressaltar também que o presente

trabalho não explorou o uso de altas densidades celulares para a condução das fermentações.

Conforme pode ser observado na TABELA 1, a máxima concentração celular inicial

empregada neste estudo foi de apenas 1.4 g/L. Conforme pode ser observado na TABELA 18,

a concentração inicial de células foi uma das variáveis que influenciaram significativamente a

produtividade em xilitol, sendo o seu efeito positivo (maior concentração inicial de células,

maior produtividade).

5.5 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE OPERACIONAL DO SISTEMA DE PRODUÇÃO DE


Nesta etapa, a estabilidade operacional do sistema de produção de xilitol em reator de

mistura foi avaliada conduzindo-se a fermentação na modalidade de bateladas repetidas,

reutilizando-se as células imobilizadas ao final de cada batelada como inóculo para a batelada

seguinte. Para o cultivo das células, foram utilizadas as condições previamente definidas.

85

Buscou-se verificar a possibilidade de: 1) minimizar os custos relativos ao preparo de

inóculo, 2) minimizar os tempos mortos entre bateladas, 3) eliminar a necessidade de uso de

equipamentos para a recuperação das células ao final de cada batelada, e 4) adaptar as células

aos compostos inibidores residuais presentes no meio de fermentação.

A TABELA 23 apresenta os parâmetros fermentativos determinados ao final de cada

uma das 5 bateladas repetidas de fermentação. Conforme pode ser observado, não foram

verificadas grandes alterações nos parâmetros avaliados ao longo das 5 bateladas, uma vez

que os valores de coeficiente de variação destes parâmetros foram inferiores a 1 O %. Em

valores médios, foi possível obter 51. 6 g/L de xilitol em cada uma das bateladas, com

produtividade de 0.43 g/L h e rendimento de 0.71 g/g.

TABELA 23: Parâmetros fermentativos determinados ao final de cada uma das 5 bateladas

repetidas de fermentação

Batelada Média DP CV

r 2ª 3ª 4• 5ª (%)

P)(g!L) 46.7 51.3 55.7 53.9 50.3 51.6 3'.5 6.8

Qp(g/Lh) 0.39 0.43 0.46 0.45 0.42 0.43 0.03 7.0

Yp;s (g/g) 0.71 0.72 0.69 0.70 0.71 0.71 O.OI 1.4

Qs (gfL h) 0.55 0.53 0.60 0.57 0.53 0.56 0.03 5.4

S~(-) 0.86 0.86 0.90 0.88 0.82 0.86 0.03 3.5

V(mm3) 10.84 7.42

DP: Desvio-Padrão; CV.- Coeficiente de Variação= (Desvio-Pudrão/Médiaix Iõõ

De acordo com os dados apresentados na TABELA 23, pode-se afirmar que a

produção de xilitol na modalidade de bateladas repetidas permite minimizar os custos

relativos ao preparo de inóculo, uma vez que as células imobilizadas puderam ser reutilizadas

durante as 5 bateladas repetidas de fermentação sem prejuízos evidentes nos parâmetros

avaliados. Além disso, este sistema permite que os tempos mortos entre bateladas sucessivas

de fermentação sejam minimizados e não requer o uso de equipamentos ( como centrífugas,

por exemplo) para a recuperação das células ao final de cada batelada. Sabe-se que a

86

reutilização das células pode ser benéfica em processos que visam a utilização de açúcares

presentes em hidrolisados lignocelulósicos, uma vez que este procedimento pode levar à

adaptação das mesmas aos compostos inibidores (P ALMQVIST e HAHN-HAGERDAL,

2000a). Entretanto, no presente estudo, a reciclagem das células imobilizadas não levou a

melhoras nos parâmetros avaliados.

Observou-se uma redução significativa (p < 0.05) no diâmetro médio das esferas de

alginato de cálcio ao final da 5ª batelada. O diâmetro médio após as 600 h de fermentação foi

de 2.40 mm (crn-1 = 0.10 mm), resultando em um percentual de redução de volume (R%) igual

a 31.6 %. De acordo com SANTOS et ai. (1997), a abrasão observada nas esferas de

imobilização em reatores de mistura é determinada pelo estresse hidrodinâmico, pelo contato

direto com as turbinas de agitação, e pelas colisões das esferas entre si e com as partes

internas do reator. Este conjunto de fatores atuando nas esferas leva à fadiga da matriz de

imobilização, provocando o desenvolvimento e a propagação de fraturas a partir da superficie

das mesmas. Aliado a estes fatores, o crescimento das células na matriz de imobilização

também pode contribuir para desestabilizar a estrutura do gel, modificando a arquitetura da

matriz de alginato de cálcio e levando ao aparecimento de poros semelhantes à "crateras" na

região superficial das esferas (CHEN e HUANG, 1988; QUIRÓS et al., 1995).

Tendo em vista o valor relativamente elevado de R% ao final das bateladas repetidas de

fermentação, estima-se que a utilização de um suporte de imobilização mais resistente às

condições de processo seria uma estratégia mais adequada para a obtenção de xilitol com

células imobilizadas em reator de mistura. Neste contexto, sugere-se a utilização de gel de

álcool polivinílico (PV A-gel) como suporte de imobilização celular. Segundo LOZINSKY e

PLIEV A (1998), o PV A-gel apresenta características reológicas de estrutura não quebradiça

excelentes, permitindo sua utilização na maior parte dos biorreatores e exibindo insignificante

erosão abrasiva em condições de agitação intensa. Por outro lado, a utilização de um reator

87

mais apropriado para o cultivo de células imobilizadas em gel de alginato de cálcio seria uma

outra alternativa a ser seguida. Neste contexto, sugere-se a utilização do reator de leito

fluidizado. De acordo com GROBOILLOT et ai. (1994), este tipo de reator busca aliar as

boas condições de mistura características dos reatores de mistura às baixas tensões de

cisalhamento características dos reatores de leito empacotado. Por último, vale ressaltar os

valores de produtividade (0.65 g/L.h) e de rendimento (0.79 g/g) da bioconversão de xilose

em xilitol obtidos por RODRIGUES et ai. (1998) em cultivo semi-contínuo com células em

suspensão (TABELA 16). Utilizando um sistema de cortes bastante simples, no qual parte do

meio fermentado contendo células em suspensão foi deixado no fermentador e utilizado como

inóculo para a batelada seguinte, os autores também conseguiram se beneficiar de vantagens

como minimização de custos relativos ao preparo de inóculo, minimização de tempos mortos

entre bateladas e exclusão da necessidade do uso de equipamentos acessórios para a

recuperação das células ao final de cada batelada.

5.5. l COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS COM DADOS DA LITERATURA

A TABELA 24 apresenta dados reportados na literatura sobre o uso da levedura

Candida guilliermondii FTI 20037 para a produção de xilitol em hidrolisado de bagaço de

cana na modalidade de bateladas repetidas de fermentação. Conforme pode ser observado,

SENE et ai. (1998), utilizando células em suspensão cultivadas em frascos Erlenmeyer ( os

autores utilizaram uma centrifuga para recuperar as células ao final de cada batelada),

observaram pequenas variações nos parâmetros fermentativos avaliados ao longo de 5

bateladas repetidas. Por outro lado, CARVALHO et ai. (2002b), utilizando células

imobilizadas em alginato de cálcio cultivadas em frascos Erlenmeyer, observaram melhora

nos parâmetros fermentativos avaliados após a primeira batelada da série de repetições. Esta

melhora nos parâmetros fermentativos foi atribuída ao crescimento limitado e à adaptação das

células imobilizadas após a primeira batelada da série de repetições.

88

TABELA 24: Dados reportados na literatura sobre o uso da levedura Candida guilliermondii

FTI 20037 para a produção de xilitol em hidrolisado de bagaço de cana na modalidade de

bateladas repetidas de fermentação

Batelada Média Referência

1ª 2ª 3• 4• 5• PF(g/L) 25.1 23.5 25.7 26.5 28.3 25.8 Sene et ai. (1998)1

Qp (g/L h) 0.52 0.49 0.54 0.55 0.60 0.54

Yp;s (g/g) 0.63 0.58 0.64 0.62 0.62 0.62

PF(g/L) 23.8 28.3 28.6 28.9 27.6 27.4 Carvalho ct ai. (2002b)7"

Qp {g/L b) 0.50 0.59 0.60 0.60 0.58 0.57

Yp1s (glg) 0.48 0.54 0.56 0.56 0.55 0.54

: Células em suspensão; ·: Células imobilizadas em alginato de cálcio

Embora não tenha sido observada melhora nos parâmetros fermentativos durante a

reciclagem das células imobilizadas em reator de mistura (TABELA 23 ), contrariamente ao

observado em frascos Erlenmeyer (TABELA 24), as condições de cultivo previamente

definidas em reator de mistura acarretaram em aumentos consideráveis na concentração e no

rendimento em xilitol obtidos ao final de cada uma das bateladas repetidas de fermentação,

em comparação aos valores obtidos em frascos Erlenmeyer. Em valores médios, estes

aumentos foram da ordem de 90 e 30 %, respectivamente. Por outro lado, a produtividade

obtida em reator de mistura foi cerca de 25 % inferior à produtividade obtida em frascos

Erlenmeyer.

5.5.2 AVALIAÇÃO DAS NECESSIDADES NUTRICIONAIS DA LEVEDURA PARA A

PRODUÇÃO DE XILITOL NA MODALIDADE DE BATELADAS REPETIDAS DE

FERMENTAÇÃO

A suplementação nutricional de hidrolisados hemicelulósicos pode influenciar a

bioconversão de xilose em xilitol, dependendo do microrganismo (P ARAJÓ et ai., 1998c;

WINKELHAUSEN e KUZMANOV A, 1998). Com relação à levedura Candida

guilliermondii FTI 20037, a necessidade de suplementação depende da matéria-prima a partir

89

da qual o hidrolisado é obtido. Enquanto a suplementação do hidrolisado de palha de arroz

com sulfato de amônio e extrato de farelo de arroz se mostrou, além de desnecessária,

prejudicial à bioconversão de xilose em xilitol (SILVA e ROBERTO, 1999), a suplementação

do hidrolisado de cavacos de eucalipto com os mesmos nutrientes se mostrou necessária para

um melhor desempenho da bioconversão (CANNETTIERI et ai., 2001 ).

Com base no exposto, foram programados ensaios utilizando hidrolisados

suplementados ou não com nutrientes, de forma a permitir uma avaliação das necessidades

nutricionais da levedura para a produção de xilitol em hidrolisado de bagaço de cana na

modalidade de bateladas repetidas de fermentação. A TABELA 25 apresenta os parâmetros

fermentativos determinados nas diferentes condições de cultivo (item 4. 4. 4. 1).

Ensaio Batelada Nutrientes

TABELA 25: Parâmetros fermentativos determinados nas bateladas repetidas de fermentação

Yws (g/g) Q,,(g/L h)

A 1" AS,FA

AS,FA

AS,FA

25.9

46.8

48.7

0.27

0.49

0.51

0.45

0.58

0.55

2"

·------------------------------------------------------------------------------------------· B 1" AS. FA 26.7 0.28 0.47

3" AS,FA ·------------------------------------------------------------------------------------------- e 1" AS, FA 27.5 0.29 0.47

14.1

42.0

15.2

12.0

0.15

0.44

0.16

0.13

0.25

0.58

0.22

0.19 -------------------------------------------------------------------------------------------· D 1" FA 16.5 0.17 0.34

3"

FA

FA

25.0

26.5

0.26

0.28

0.50

0.52

2ª

E I" AS 14.2 0.15 0.33

3"

AS

AS

12.4

9.6

0.13

0.10

0.27

0.25

2ª

F I" 12.1 0.13 . 0.30

3• 9.0

8.7

0.09

0.09

0.20

0.18

SA: Sulfato de amônio; FA: Extrato de Farelo de Arroz:»: Sem adição de nutrientes

Conforme pode ser observado na TABELA 25, a levedura Candida guilliermondii FTI

90

20037 produziu, após 96 h de fermentação, 12.1 g/L de xilitol no hidrolisado não

suplementado com nutrientes, resultando em produtividade de 0.13 g/L h e rendimento de

0.30 g/g (Ensaio F). Tanto a suplementação do hidrolisado com sulfato de amônio (Ensaio E)

quanto a suplementação com extrato de farelo de arroz (Ensaio D) promoveram uma melhora

nos valores de concentração final, produtividade e rendimento em xilitol obtidos após 96 h de

fermentação. Entretanto, os melhores resultados foram obtidos quando o hidrolisado foi

suplementado através de adição conjunta dos nutrientes sulfato de amônio e extrato de farelo

de arroz, resultando em valores médios de concentração, produtividade e rendimento iguais a

26.7 g/L, 0.28 g/ Lhe 0.46 g/g, respectivamente, ao final da 1ª batelada da série de repetições

(Ensaios A, B e C).

As FIGURAS 22-24 ilustram o comportamento da levedura com relação à produção

de xilitol em função da suplementação ou não do hidrolisado com nutrientes ao longo das

bateladas repetidas de fermentação.

:::i' -.. -9 a.""20

10

40

30

2

Batelada 3

FIGURA 22: Valores de concentração final (PF) obtidos durante a produção de xilitol, em

frascos Erlenmeyer, no sistema de bateladas repetidas de fermentação: Ensaio A (•); Ensaio

B (e); Ensaio C (À); Ensaio D (O); Ensaio E (O); Ensaio F (.6).

Conforme pode ser observado nas FIGURAS 22-24, os valores de concentração final,

produtividade e rendimento em xilitol foram aumentados consideravelmente na 2ª batelada da

91

série de repetições e permaneceram aparentemente constantes na batelada seguinte quando se

empregou o hidrolisado suplementado com ambos os nutrientes nas 3 bateladas (Ensaio A).

Por outro lado, a suplementação do hidrolisado com ambos os nutrientes apenas na 1 ª das 3

bateladas (Ensaio C), a suplementação do hidrolisado com apenas sulfato de amónio em todas

as 3 bateladas (Ensaio E) e a ausência de suplementação do hidrolisado com nutrientes em

todas as bateladas (Ensaio F) resultaram em decréscimos progressivos nos valores de

concentração final, produtividade e rendimento em xilitol ao longo das bateladas repetidas de

fermentação.

s: ~ 0,3 ~

Q.

O 0,2

0,5

0,4

0,1 .- e '

2

Batelada 3

FIGURA 23: Valores de produtividade (Qp) obtidos durante a produção de xilitol, em frascos

Erlenmeyer, no sistema de bateladas repetidas de fermentação: Ensaio A (•); Ensaio B (e);

Ensaio C (.6.); Ensaio D (D); Ensaio E (O); Ensaio F (.6.).

Contrariamente ao observado quando o hidrolisado de bagaço de cana foi

suplementado apenas com sulfato de amónio em todas as bateladas (Ensaio E), a reutilização

das células imobilizadas promoveu aumentos consideráveis nos valores de concentração final,

produtividade e rendimento em xilitol na 2ª batelada da série de repetições, os quais

permaneceram aparentemente constantes na batelada seguinte, quando o hidrolisado foi

suplementado somente com extrato de farelo de arroz em todas as bateladas da série de

repetições (Ensaio D).

92

A utilização de hidrolisado não suplementado com nutrientes entre 2 bateladas nas

quais utilizou-se hidrolisado suplementado com sulfato de amônio e extrato de farelo de arroz

não afetou a capacidade da levedura Candida guilliermondii FTI 20037 em converter xilose

em xilitol (Ensaio B), mostrando que o cultivo da levedura em hidrolisado não suplementado

com nutrientes, apesar de resultar em piora nos parâmetros avaliados, não altera a capacidade

intrínseca da célula em efetuar a bioconversão.

C) E! 0,3

~ >· 0,2

0,1

0,4

2

Batelada 3

FIGURA 24: Valores de rendimento (YP1s) obtidos durante a produção de xilitol, em frascos

Erlenmeyer, no sistema de bateladas repetidas de fermentação: Ensaio A(•); Ensaio B (e);

Ensaio C (Ã.); Ensaio D (O); Ensaio E (O); Ensaio F (~).

De uma maneira geral, os resultados obtidos nestes ensaios permitem afirmar que,

embora não essencial para a bioconversão de xilose em xilitol pela levedura Candida

guilliermondii FTI 20037, a suplementação do hidrolisado de bagaço de cana com sulfato de

amônio e extrato de farelo de arroz acarreta em melhor desempenho da bioconversão. Durante

as bateladas repetidas de fermentação, os melhores valores de concentração, produtividade e

rendimento em xilitol foram obtidos quando se suplementou o hidrolisado com os dois

nutrientes em todas as 3 bateladas.

93

6 CONCLUSÕES

./ A detoxificação do hidrolisado de bagaço de cana por meio da alteração de pH associada

à adsorção em carvão ativo determinou perda de açúcares, dependendo do fator de

concentração do hidrolisado. Embora tenha se mostrado eficiente para a remoção de furfural,

hidróxi-rnetil-furfural e derivados da lignina, esta estratégia se mostrou ineficaz para a

remoção de ácido acético .

./ Enquanto os sistemas EF e STR resultaram em produções equivalentes de xilitol, com

rendimentos e produtividades semelhantes, a bioconversão de xilose em xilitol no sistema

BSTR foi prejudicada por limitações na transferência de massa .

./ O fator de concentração do hidrolisado, a agitação, a concentração inicial de células e o

pH inicial do meio de fermentação influenciaram significativamente a produtividade em

xilitol no sistema STR .

./ O fator de concentração do hidrolisado, a vazão de ar, a agitação e o pH inicial do meio

de fermentação influenciaram significativamente o rendimento em xilitol no sistema STR .

./ Os modelos empíricos ajustados aos dados experimentais foram capazes de predizer

satisfatoriamente a produção de xilitol no sistema STR. A partir destes modelos, condições

adequadas para a produção de xilitol foram definidas, a saber: fator de concentração do

hidrolisado (5.0), vazão de ar (1.30 L/min), agitação (300 rpm), concentração inicial de

células (1.4 g/L), pH inicial do meio de fermentação (6.0). Utilizando estas condições, obteve-

se uma produção de xilitol igual a 47.5 g/L após 120 h de fermentação, resultando em

produtividade e rendimento iguais a 0.40 g/L h e 0.81 g/g, respectivamente .

./ As células imobilizadas puderam ser reutilizadas durante 5 bateladas repetidas de

fermentação sem prejuízos evidentes nos parâmetros fermentativos. Em valores médios,

foram obtidos 51.6 g/L de xilitol em cada uma das bateladas, com produtividade e rendimento

iguais a 0.43 g/L h e O. 71 g/g, respectivamente. Após as 600 h de fermentação necessárias

94

para a realização das 5 bateladas repetidas, observou-se um percentual de redução no volume

médio das esferas de alginato de cálcio igual a 31.6 % .

./ A suplementação do hidrolisado de bagaço de cana com sulfato de amônio e extrato de

farelo de arroz, embora não essencial para a bioconversão de xilose em xilitol pela levedura

Candida guilliermondii FTI 20037, acarretou em melhor desempenho da bioconversão. Esta

suplementação se mostrou benéfica ao longo de todas as bateladas repetidas de fermentação.

95

7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

./ Buscar definir uma estratégia para a detoxificação de hidrolisados mais concentrados que,

ao mesmo tempo, promova uma boa redução nos teores de todos os compostos inibidores

(furfural, hidróxi-metil-furfural, derivados da lignina e ácido acético) e não determine perda

de açúcares. ,

./ Avaliar o comportamento da produção de xilitol com células em suspensão (não-

imobilizadas) na modalidade de bateladas repetidas de fermentação, reciclando-se as células

por meio de cortes ( deixando uma parte do caldo fermentado no reator ao final de cada

batelada como inóculo para a batelada seguinte ) .

./ Avaliar o comportamento da produção de xilitol com células imobilizadas em alginato

de cálcio utilizando-se elevada densidade celular no início da fermentação .

./ Avaliar o comportamento da produção de xilitol em reator de leito fluidizado, com

células imobilizadas em gel de alginato de cálcio .

./ Avaliar o comportamento da produção de xilitol em reator de mistura, com células

imobilizadas em gel de álcool polivinílico.

96

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABELY AN, V.A.; ABELY AN, L.A. Production of lactic acid by immobilized cells in stirred

reactors. Applied Biochemistry and Microbiology. v. 32, p. 495-9, 1996.

AGUIAR, C. L.; OETTERER, M.; MENEZES, T. J. B. Caracterização e aplicações do xilitol

na indústria alimentícia. Boletim SBCTA. v. 33, p. 184-93, 1999.

ALVES, L.A.; FELIPE, M.G.A.; SILVA, J.B.A.; SILVA, S.S.; PRATA, A.M.R. Pretreatment

of sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate for xylitol production by Candida

guilliermondii. Applied Biochemistry and Biotechnology. v.70-72, p.89-98, 1998.

ALEXANDER, M.A; CHAPMAN, T.W.; JEFFRIES, T.W. Xylose metabolism by Candida

shehatae in continuous culture. Applied Microbiology and Biotechnology. v.28, p.478-86,

1988.

BÁLES, V. Bioprocesses with immobilized biocatalist - Engineering aspects. Applied

Biochemistry and Biotechnology. v.48, p.5-10, 1994.

BAR, A. Xylitol. ln: O'BREEN NABORS L.; GELARDI, R. Altemative Sweeteners. New

York: Basel, 1986, p.185-216.

BARBOSA, M.F.S.; MEDEIROS, M.B.; MANCILHA, I.M.; SCHNEIDER, H.; LEE, H.

Screening of yeasts for production of xylitol from D-xylose and some factors wich affect

xylitol yield in Candida guilliermondii. Joumal of Industrial Microbiology. v.3, p.241-51,

1988.

BARBOSA, M.F.S.; LEE, H; SCH.i"'IBIDER, H; FORSBERG, C.W. Temperature mediated

changes of D-xylose metabolism in the yeast Pachysolen tannophilus. FEMS

Microbiology Letters. v. 72, p. 35-40, 1990.

BARON, G.V.; WILLAERT, R.G.; BACKER, L.U.C. Immobilized cell reactors. ln:

WILLAERT, R.G. Immobilized living cell systems: Modelling and experimental

methods. London: John Willey & Sons, 1996, p. 67-95.

BOX, G.E.P.; HUNTER, W.G.; HUNTER, J.S. Statistics for experimenters: an introduction

to design, data analysis and model building. New York: John Wiley & Sons, 1978. 653p.

BRODELIUS, P.; V ANDAMME, E.J. lmmobilized cell systems. ln: REHM, H.J.; REED, G.

Biotechnology - A Comprehensive Treatise. Weinheim: Verlag Chemie. 1987, v. 7a,

p.405-64.

97

BRODELIUS, P.; MOSBACH, K. lmmobilization techniques for cells and organelles. ln:

MOSBACH, K. Immobilized Enzymes and Cells. London: Academic Press. 1987, v.135,

p.173-387.

BRUINENBERG, P.M.; de BOT, P.H.M.; van DIJKEN, J.P.; SCHEFFERS, W.A. NADH-

linked aldose reductase: the key to anaerobic alcoholic fermentation of xylose by yeasts.

Applied Microbiology and Biotechnology. v.19, p.256-60, 1984.

BUZZINI, P.; ROSSI, J. Semi-continuous and continuous riboflavin production by calcium

alginate immobilized Candida tropicalis in concentrated rectified grape must. World

Joumal ofMicrobiology and Biotechnology. v. 14, p. 377-81, 1998.

CANNETTIERI, E.V.; ALMEIDA e SILVA, J.B.; FELIPE, M.G.A. Application of factorial

design to the study of xylitol production from Eucalyptus hemicellulosic hydrolysate.

Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 94, p. 159-68, 2001.

CARVALHO, W. Estudo da imobilização de Candida guilliermondii FTI 20037 para

obtenção de xilitol em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar. 2000. 108

f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Industrial) - Faculdade de Engenharia

Química de Lorena, Lorena.

CARVALHO, W.; SILVA, S.S.; CONVERTI, A; VITOLO, M.; FELIPE, M.G.A.;

ROBERTO, I.C.; SILVA, M.B.; MANCILHA, I.M. Use of immobilized Candida yeast

cells for xylitol production from sugarcane bagasse hydrolysate: Cell immobilization

conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. v. 98/100, p. 489-96, 2002a.

CARVALHO, W.; SILVA, S.S.; VITOLO, M.; FELIPE, M.G.A., MANCILHA, I.M.

Improvement in xylitol production from sugarcane bagasse hydrolysate achieved by the

use of a repeated-batch immobilized cell system. Zeitschrift für Naturforschung. v. 57c, p.

109-12, 2002b.

CARVALHO, W.; SILVA, S.S.; CONVERTI, A; VITOLO, M. Metabolic behavior of

immobilized Candida guilliermondii cells during batch xylitol production from sugarcane

bagasse acid hydrolyzate. Biotechnology and Bioengineering. v. 79, p. 165-9, 2002c.

CHAMP AGNE, C.P.; BLAHUT A, N.; GAGNON, C. A vortex-bowl disk atomizer system

for the production of alginate beads in a 1500-liter fermentor. Biotechnology and

Bioengineering. v. 68, p. 681-8, 2000.

98

CHEN, K.C.; HUANG, C.T. Effects of the growth of T cutaneum in calcium alginate gel

beads upon bead structure and oxygen transfer characteristics. Enzyme and Microbial

Technology. v. 10, p. 284-92, 1988.

CHOI, J.H.; MOON, K.H.; RYU, Y.W.; SEO, J.H. Production of xylitol in cell recycle

fermentations ofCandida tropicalis. Biotechnology Letters. v. 22, p. 1625-8, 2000.

CONVERTI, A; PEREGO, P.; DOMÍNGUEZ, J.M. Xylitol production from hardwood

hemicellulose hydrolysates by Pachysolen tannophilus, Debaryomyces hansenii and

Candida guilliermondii. Applied Biochemistry and Biotechnology. v. 82, p.141-51, 1999.

CORCORAN, E. The production and use of immobilized living microbial cells. ln:

WISEMAN, A Topics in Enzyme and Fermentation Biotechnology. England: Ellis

Horwood. 1985, v.10, p.12-50.

CRUZ, J.M.; DOMÍNGUEZ, J.M.; DOMÍNGUEZ, H.; PARAJÓ, J.C. Solvent extraction of

hemicellulosic wood hydrolysates: a procedure useful for obtaining both detoxified

fermentation media and polyphenols with antiox.idant activity. Food Chemistry. v. 67, p.

147-53, 1999.

DELGENES, J.P.; MOLETTA, R.; NAVARRO, J.M. Fermentation of D-xylose, D-glucose, ...

L-arabinose mixture by Pychia stipitis: Effect of the oxygen tranfer rate on fermentation

performance. Biotechnology and Bioengineering. v.34, p.398-402, 1989.

DELGENES, J.P.; MOLETT A, R.; NAVARRO, J.M. Effects of lignocellulose degradation

products on ethanol fermentations of glucose and xylose by Saccharomyces cerevisiae,

Zymomonas mobilis, Pichia stipitis and Candida shehatae. Enzyme and Microbial

Technology. v.19, p.220-5, 1996.

DOMÍNGUEZ, J.M.; CHENG, S.G.; TSAO, G.T. Pretreatment of sugar cane bagasse

hemicellulose hydrolysate for xylitol production by yeast. Applied Biochemistry and

Biotechnology. v.57/58, p.49-56, 1996.

DOMÍNGUEZ, J.M. Xylitol production by free and immobilized Debaromyces hansenii.

Biotechnology Letters. v.20, p.53-6, 1998.

DOMÍNGUEZ, J.M.; CRUZ, J.M.; ROCA, E.; DOMÍNGUEZ, H.; PARAJÓ, J.C. Xylitol

production from wood hydrolysates by entrapped Debaryomyces hansenii cells. Applied

Biochemistry and Biotechnology. v, 81, p. 119-130, 1999.

99

ELLAIAH, P.; PRABHAKAR, T.; RAMAKRISHNA, B.; THAER-TALLEB, A.;

ADINARA Y ANA, K. Production of lipase by immobilized cells of Aspergillus niger.

Process Biochemistry. v.39, p.525-528, 2004.

EMODI, A. Xylitol: Its properties and food applications. Food Technology. January, p.28-32,

1978.

FELIPE, M.G.A.; ALVES, L.A.; SILVA, S.S.; ROBERTO, I.C.; MANCILHA, I.M.; SILVA,

J.B.A. Fennentation of Eucaliptus hemicellulosic hydrolysate to xylitol by Candida

guilliermondii. Bioresource Technology. v.56, p.281-3, 1996a.

FELIPE, M.G.A.; VITOLO, M.; MANCILHA, I.M. Xylitol fonnation by Candida

guilliermondit grown in a sugar cane bagasse hemicellulosic hydrolysate: effect of

aeration and inoculum adaptation. Acta Biotechnologica. v.16, p. 73-9, I 996b.

FELIPE, M.G.A.; VITOLO, M.; MANCILHA, I.M.; SILVA, S.S. Fennentation of sugar cane

bagasse hemicellulosic hydrolysates for xylitol production: effect of pH. Biomass and

Bioenergy. v.13, p.11-4, 1997a.

FELIPE, M.G.A.; VITOLO, M.; MANCILHA, I.M.; SILVA, S.S. Environmental parameters

affecting xylitol production from sugar cane bagasse hydrolyzate by Candida

guilliermondii. Joumal of Industrial Microbiology and Biotechnology. v.18, p.251-4,

1997b.

FENGEL, D.; WEGENER, G. Wood Chemistry, Ultrastucture, Reactions. Berlin: Walter de

Gruyter, 1989, 613p.

FERRARI, M.D.; NEIROTTI, E.; ALBORNOZ, C.; SAUCEDO, E. Ethanol production from

eucalyptus wood hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. Biotechnology and

Bioengineering. v.40, p. 753-9, 1992.

FREEMAN, A.; LILL Y, M.D. Effect of processing parameters on the feasibility and

operational stability of immobilized viable microbial cells. Enzyme and Microbial

Technology. v.23. p.335-45, 1998.

FUKUDA, H. Immobilized microorganism bioreactors. ln: ASENJO, J.A.; MERCHUK, J.C.

Bioreactor System Design. New York: Marcel Dekker. 1994, p. 339-75.

GAMARRA, J.A.; CUEVAS, C.M.; LESCANO, G. Production of ethanol by a stirred

catalytic basket reactor with immobilized yeast cells. Joumal of F ermentation

Technology. v. 64, p. 25-8, 1986.

G -N~"' ~!.;,, sç.t..\ '= 1-L~~\ 100 'o e..,

'"(" ..,. J; r;::·N'Q"'ILJ, ll :::;- t ga r-,-\,_, · - -~- ~ t ,~ 01

GAMARRA, J.A.G. Produção de etanol em batelada repetida cot'{Ezeciclo celular &9mpleto

usando um reator catalítico agitado tipo cesta com leveduras ·~o<-6~fiiidif::_i ~S~. 88 f. ,., \.,: p i:: t,~ . :/.'·

Dissertação (Mestrado em Engenharia) - Faculdade de Ciên~ias·-~·Fânnacêuticas,

Universidade de São Paulo, São Paulo.

GEMEINER, P.; REXOVÁ-BENKOV Á, L.; SVEC, F.; NORRLOW, O. Natural and

synthetic carriers suitable for immobilization of viable cells, active organelles, and

molecules. ln: VELIKY, I.A.; McLEAN, RJ.C. Immobilized Biosystems: Theory and

Practical Applications. Glasgow: Chapman & Hall, 1994, v. l, p. 1-128.

GILLET, F.; ROISIN, C.; FLINIAUX, M.A.; JACQUIN-DUBREUIL, A; BARBOTIN, J.N.;

NA V A-SAUCEDO, J.E. Immobilization of Nicotiana tabacum plant cell suspensions

within calcium alginate gel beads for the production of enhanced amounts of scopolin.

Enzyme and Microbial Technology, v.26, p.229-234, 2000.

GONG, C.H.; CHEN, L.F.; TSAO, G.T. Quantitative production ofxylitol from D-xylose by

a high xylitol producer yeast mutant Candida tropicalis HXP2. Biotechnology Letters,

v.3, p.125-30, 1981.

GONG, C.H.; GLAYPOOL, T.A.; McCRAKEN, L.D.; MAUN, C.M.; UENG, P.P.; TSAO,

G. T. Conversion of pentoses by yeasts. Biotechnology and Bioengineering. v.25, p. 85-

102, 1983.

GROBOILLOT, A; BOADI, D.K.; PONCELET, D.; NEUFELD, RJ. Immobilization of

cells for application in the food industry. Criticai Reviews in Biotechnology. v . 14, p. 75-

107, 1994.

GROOTJEN, D.RJ.; van der LANS, R.G.M.; LUYBEN, K.C.A.M. Conversion of glucose

and xylose mixtures by Pichia stipitis under oxygen limited conditions. Enzyme and

Microbial Technology. v.13, p.648-54, 1991.

GIBSELEY, K.B. Chemical and physical properties of alga! polysaccharides used for cell

immobilization. Enzyme and Microbial Technology. v.11, p.706-16, 1989.

HAHN-HAGERDAL, B.; JEPPSSON, H.; SKOOG, K; PRIOR, B.A. Biochemistry and

physiology of xylose fermentation by yeasts. Enzyme and Microbial Technology. v. 16, p.

933-943, 1994.

101

HANDUMRONGKUL, C.; MA, D.P.; SILVA, J.L. Cloning and expression of Candida

guilliermondii xylose reductase gene (xyl 1) in Pichia pastoris. Applied Microbiology and

Biotechnology. v.49, p.399-404, 1998.

HEIPIEPER, H.J.; WEBER, F.J.; SIKKEMA, J.; KEWELO, H.; de BONT, J.A.M.

Mechanism ofresistence of whole cells to toxic organic solvents. TibTech. v. 12, p. 409-

15, 1994.

HERNÁNDEZ, H.; ASANZA, M.L.; ALCARAZ, A.M.; HIDALGO, M.F.; MÁXIMO, M.F.;

BASTIDA, J. Production of optically pure L-alanine in batch and continuous stirred tank

reactors using immobilized Pseudomonas sp. Biotechnology Letters. v. 23, p. 887-91,

2001.

JAIN, V.K.; DIAZ, I.T.; BARATTI, J. Preparation and characterization of immobilized

growing cells of Zymomonas mobi/is for ethanol production. Biotechnology and

Bioengineering. v. 27, p. 273-9, 1985.

JAMUNA, R.; SAI, P.S.T.; VORA, S.; RAMAKRISHNA, S.V. Optirnization of criticai

parameters for immobilization of yeast cells to alginate gel matrix. Joumal of

Fermentation and Bioengineering. v. 73, p. 319-22, 1992.

JEFFRIES, T.W. Utilization of xylose by bacteria, yeasts and fungi. Advances in Biochemical

Engineering. v.27, p.1-32, 1983.

JIMÉNEZ-PÉREZ, M.V.; SÁNCHEZ-CASTILLO, P.;ROMERA, O.; FERt'"\IÁNDEZ-

MORENO, D.; PÉREZ-MARTÍNEZ, C. Growth and nutrient remova! in free and

immobilized planktonic green algae isolated from pig manure. Enzyme and Microbial

Technology. v.34, 392-398, 2004.

JOHANSEN, A.; FLINK, J.M. Influence of alginate properties and gel reinforcement on

fermentation characteristics of immobilized yeast cells. Enzyme and Microbial

Technology. v. 8, p. 737-48, 1986.

JÕNSSON, L.J.; PALMQVIST, E.; NILVEBRANT, N.O., HÀHN-HAGERDAL, B.

Detoxification of wood hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot

fungus Trametes versicolor. Applied Microbiology and Biotechnology. v. 49, p. 691-97,

1998.

KAREL, S.F.; LIBICKI, S.B.; ROBERTSON, C.R. The immobilization of whole cells:

Engineering principies. Chemical Engineering Science. v.40, p.1321-54, 1985.

102

KESAV A, S.S.; PANDA, T. Ethanol production by immobilized whole cells of Zymomonas

mobilis in a continuous flow expanded bed bioreactor and a continuous flow stirred tank

bioreactor. Joumal oflndustrial Microbiology. v. 17, p. 11-4, 1996.

KILIAN, S.G.; van UDEN, N. Transport of xylose and glucose in the xylose fermenting yeast

Pichia stipitis. Applied Microbiology and Biotechnology. v.27, p.545-8, 1988.

KROUWEL, P.G.; GROOT, W.J.; KOSSEN, N.W.F. Continuous IBE fermentation by

immobilized growing Clostridium beijerinckii cells in a stirred-tank reactor.

Biotechnology and Bioengineering. v. 25, p. 281-99, 1983.

KUHAD, R.C.; SINGH, A. Lignocellulose Biotechnology: Current and Future Prospects.

Criticai Reviews in Biotechnology. v.13, p.151-72, 1993.

LAMBOLEY, L.; LACROIX, C.; CHAMPAGNE, C.P.; VUILLEMARD, J.C. Continuous

mixed strain mesophilic lactic starter production in supplemented whey permeate medium

using immobilized cell technology. Biotechnology and Bioengineering. v. 56, p. 502-16,

1997.

LIGHTELM, M.E.; PRIOR, B.A.; du PREEZ, J.C.; BRANDT, V. An investigation of D-(l-

13C) xylose metabolism in Pichia stipitis under a~robic and anaerobic conditions. Applied

Microbiology and Biotechnology. v.28, p.293-6, 1988a.

LIGHTELM, M.E.; PRIOR, B.A.; du PREEZ, J.C. The oxygen requeriments ofyeasts for the

fermentation of D-xylose and D-glucose of ethanol. Applied Microbiology and

Biotechnology. v.28, p.63-8, 1988b.

LINKO, P.; LINKO, Y.Y. Industrial applications of immobilized cells. CRC Criticai Reviews

in Biotechnology. v.1, p.289-337, 1984.

LOHMEIER-VOGEL, E.M.; SOPHER, C.R.; LEE, H. Intracellular acidification as a

mechanism for the inhibition by acid hydrolysis-derived inhibitors of xylose fermentation

by yeasts. Joumal oflndustrial Microbiology and Biotechnology. v.20, p.75-81, 1998.

LOUWRIER, A. Industrial products: the retum to carbohydrate-based industries.

Biotechnology and Applied Biochemistry. v.27, p.1-8, 1998.

LOZINSKY, V.I.; PLIEV A, F.M. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell

immobilization: Overview of recent research and developments. Enzyme and Microbial

Technology. v.23, p.227-242, 1998.

103

LUTZEN, N.W.; NIELSEN, M.H.; OXIBOELI, K.M.; SCHIILEIN, M.; OLESSEN, B.S.

Cellulase and their application in the conversion of lignocellulose to fermentable sugar.

Philosophical Transactions ofthe Royal Society ofLondon. v.300, p.283, 1983.

MAGEE, R.J.; KOSARIC, N. Bioconversion of hemicellulosics. Advances in Biochemical

Engineering and Biotechnology. v.32, p.60-93, 1985.

MAKINEN, K.K. Xylitol: The sugar that prevents tooth decay. The futurist. p.135-9, 1976.

MANZ, U.; VANNINEN, E.; VOIROL, F. Xylitol: Its properties and use as a sugar substitute

in foods. ln: FOOD SYMPOSIUM ON SUGAR AND SUGAR REPLACEMENTS, 1973,

London. Anais ... London, 1973. p.21-38.

MARTÍN, C.; GALBE, M; NILVEBRANT, N.O.; JÔNSSON, L.J. Comparison of the

fermentability of enzymatic hydrolyzates of sugarcane bagasse pretreated by steam

explosion using different impregnating agents. Applied Biochemistry and Biotechnology.

V. 98, p. 699-716, 2002.

MARTINEZ, E.A.; SILVA, S.S.; SILVA, J.B.A.; SOLENZAL, A.LN.; FELIPE, M.G.A. The

influence of pH and dilution rate on continuous production of xylitol from sugarcane

bagasse hemicellulosic hydrolysate by C. guilliermondii. Process Biochemistry. v. 38, p.

1677-83, 2003.

MARTINSEN, A.; SKJAK-BRAEK, G.; SMIDSROD, O. Alginate as irnmobilization

material: Correlation between chemical and physical properties of alginate gel beads.

Biotechnology and Bioengineering. v.33, p.79-89, 1989.

MELAJA, A.J.; HAMALAINEN, L. Process for Making Xylitol. U.S. Patent n.4.008.285, 18

june 1975, 15 feb. 1977.

MEYRIAL, V.; DELGENES, J.P.; MOLETT A, R.; NAVARRO, J.M. Xylitol production

from D-xylose by Candida guilliermondii: Fermentation behaviour. Biotechnology

Letters. v.13, p.281-6, 1991.

MIKKOLA, J.; VAINIO, H.; SALMI, T.; SJÔHOLM, R.; OLLONQVIST, T; VÁYRINEM,

J. Deactivation kinectics of Mo-supported Raney Ni catalyst in the hidrogenation of

xylose to xylitol. Applied catalysis A. v. 196, p. 143-55, 2000.

NAJAFPOUR, G.; YOUNESI, H.; ISMAIL, K.S.K. Ethanol fermentation in an immobilized

cell reactor using Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology. v.92, p.251-260,

2004.

104

NAKANO, K.; KATSU, R.; TADA, K.; MATSUMURA, M. Production of highly

concentrated xylitol under a microaerobic condition maintained by simple fuzzy control.

Journal ofBioscience and Bioengineering. v. 89, p. 372-6, 2000.

NIGAM, P.; SINGH, D. Processes for fermentative production of xylitol. a sugar substitute.

Process Biochemistry. v.30, p.117-24, 1995.

NOLLEAU, V.; PREZIOSI-BELLOY, L.; DELGENES, J.P.; DELGENES, J.M. Xylitol

production from xylose by two yeast strains: Sugar tolerance. Current Microbiology. v.27,

p.191-7, 1993.

NOLLEAU, V.; PREZIOSI-BELLOY, L.; NAVARRO, J.M. The reduction of xylose to

xylitol by Candida guilliermondii and Candida parapsilosis: Incidence of oxygen and pH.

Biotechnology Letters. v.117, p.417-22, 1995.

NORTON, S.; LACROIX, C.; VUILLEMARD, J.C. Kinetic study of continuous whey

permeate fennentation by immobilized Lactobacillus helveticus for Iactic acid production.

Enzyme and Microbial Technology. v. 16, p. 457-66, 1994.

NUNEZ, M.J.; CHAMY, R.; DOMÍNGUEZ, H.; SANROMAN, A; LEMA, J.M. Continuous

fermentation of D-xylose by immobilized Pichia stipitis. Applied Biochemistry and

Biotechnology. v. 28/29, p. 731-9, 1991.

OGBONNA, J.C.; AMANO, Y.; NAKAMURA, K. Elucidation of optimum conditions for

immobilization of viable cells by using calcium alginate. Journal of Fermentation and

Bioengineering. v.67, p.92-6, 1989.

OGBONNA, J.C.; MATSUMURA, M.; KATAOKA, H. Effective oxigenation of

immobilized cells through reduction in bead diameters: a review. Process Biochemistry.

v.26, p.109-21, 1991.

OH, D.K.; KIM, S.Y. Increase of xylitol yield by feeding xylose and glucose in Candida

tropicalis. Applied Microbiology and Biotechnology. v.50, p.419-25, 1998.

OJAMO, H.; YLINEN, L.; LINK O, M. Process for the Preparation of Xylito] from Xylose by

Cultivation Candida guilliermondii. Wo Patent n.88/05467, 08 dec. 1987, 28 july 1988.

ORIVE, G.; HERNÁNDEZ, R.M.; GASCÓN, AR; IGARTUA, M.; PEDRAZ, J.L. Survival

of different cell lines in alginate-agarose microcapsules. European Journal of

Pharmaceutical Sciences. v.18, p.23-30, 2003.

105

OY AAS, J.; STORRO, I.; LEVINE, D.W. Uptake of lactose and continuous lactic acid

fermentation by entrapped non-growing Lactobacillus helveticus in whey permeate.

Applied Microbiology and Biotechnology. v. 46, p. 240-9, 1996.

PALMQVIST, E.; GALBE, M.; HÀHN-HAGERDAL, B. Evaluation of cell recycling in

continuous fermentation of enzymatic hydrolysates of spruce with Saccharomyces

cerevisiae and on line monitoring of glucose and ethanol. Applied Biochemistry and

Biotechnology. v. 50, p. 545-51, 1998.

PALMQVIST, E.; HÀHN-HAGERDAL, B. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates:

inhibition and detoxification. Bioresource Technology. v. 74, p. 17-24, 2000a.

PALMQVIST, E.; HÀHN-HAGERDAL, B. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates:

Inhibitors and mechanisms of inhibition. Bioresource Technology. v. 74, p. 25-33, 2000b.

PANDEY, A.; SOCCOL, C.R.; NIGAM, P.; SOCCOL, V.T. Biotechnological potential of

agro-industrial residues: Sugarcane bagasse. Bioresource Technology. v. 74, p. 69-80,

2000.

PARAJÓ, J.C.; DOMÍNGUEZ, H.; DOMÍNGUEZ, J.M. Production of xylitol from

concentrated wood hydrolysates by Debaromyces hansenii: Effect of the initial cell

concentration. Biotechnology Letters. v.18, p.593-8, 1996.

PARAJÓ, J.C.; DOMÍNGUEZ, H.; DOMÍNGUEZ, J.M. Improved xylitol production with

Debaromyces hansenii Y- 7426 from raw or detoxified wood hydrolysates. Enzyme and

Microbial Technology. v.21, p.18-24, 1997.

PARAJÓ, J.C.; DOMÍNGUEZ, H.; DOMÍNGUEZ, J.M. Biotechnological production of

xylitol: Interest of xylitol and fundamentais of its biosynthesis. Bioresource Technology.

v.65, p.191-201, 1998a.


xylitol: Operation in culture media made with commercial sugars. Bioresource

Technology. v.65, p.203-212, 1998b.


xylitol: Operation in culture media made from lignocellulose hydrolysates. Bioresource

Technology. v.66, p.25-40, 1998c.

PEPPER, T.; OLINGER, P.M. Xylitol in sugar-free confections. Food Technology. v.42,

p.98-106, 1988.

106

PILKINGTON, P.H.; MARGARITIS, A; :MENSOUR N.A. Mass transfer characteristics of

immobilized cells used in ferrnentation processes. Criticai Reviews in Biotechnology. v.

18, p. 237-55, 1998.

PRASHANTH, S.J.; MULIMANI, V.H. Soymilk oligosaccharide hydrolysis by Aspergillus

oryzae o-galactosidase immobilized in Ca-alginate. Process Biochemistry. v.40, p.1199-

1205, 2005.

PROCKNOR, C. Subprodutos: O bagaço. STAB-Açúcar, Álcool e Subprodutos. v. 18, p. 14,

2000.

QUIRÓS, C.; RENDUELES, M.; GARCÍA, L.A.; DÍAZ, M. Diffusion of microorganisms in

calcium alginate beads. Biotechnology Techniques. v. 9, p. 809-14, 1995.

QURESHI, N; MANDERSON, G.J. Ethanol production from sulfuric acid wood hydrolysate

of Pinus radiata using free and immobilized cells of Pichia stipitis. Joumal of Industrial

Microbiology. v. 7, p. 117-22, 1991.

RAMAKRISHNA, S.V.; PRAKASHAM, R.S. Microbial fermentations with immobilized

cells. Current Science. v. 77, p. 87-100, 1999.

RANATUNGA, T.D.; JERVIS, .J.; HELM, R.F.; Me MILLAN, J.D.; WOOLEY, R.J. The

effect of overliming on the toxicity of dilute acid pretreated lignocellulosics: the role of

inorganics, uronic acids and ether-soluble organics. Enzyme and Microbial Technology. v.

27, p. 240-7, 2000.

REHM, B.H.A.; V ALLA, S. Bacterial alginates: biosynthesis and applications Apllied

Microbiology and Biotechnology. v.48, p.281-8, 1997.

RIBEIRO, J.D. Otimização da taxa de tranferência de oxigênio na produção de xilitol por

Candida gui/liermondii FTI 20037. 1997. 73 f Dissertação (Mestrado em Biotecnologia

Industrial)- Faculdade de Engenharia Química de Lorena, Lorena.

RIZZI, M.; HARWART, K.; BUI-THANH, N.A.; DELLWEG, H. A kinetic study of the

NAD+ -xylitol dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis. Joumal of Fermentation and

Bioengineering. v. 67, p.25-30, l 989a.

RIZZI, M.; HARWART, K.; ERLEMANN, P.; BUI-THANH, N.A.; DELLWEG, H.

Purification and properties of the NAD+ -xylitol dehydrogenase from the yeast Pichia

stipitis. Joumal ofFerrnentation and Bioengineering. v.67, p.20-4, 1989b.

107

ROBERTO, I.C.; SATO, S.; MANCILHA, I.M. Effect of inoculum levei on xylitol

production from rice straw hemicellulose hydrolysate by Candida guilliermondii. Journal

oflndustrial Microbiology. v.16, p.348-50, 1996.

ROCA, E.; MEINANDER, N.; HAHN-HAGERDAL, B. Xylitol production by immobilized

recombinant Saccharomyces cerevisiae in a continuous packed-bed bioreactor.

Biotechnology and Bioengineering. v.51, p.317-26, 1996.

ROCHA, G.J.M. Deslignificação de bagaço de cana de açúcar assistida por oxigênio. 2000.

136 f Tese (Doutorado) - Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo,

São Paulo.

RODRIGUES, D.C.G.A.; SILVA, S.S.; PRATA, A.M.R.; FELIPE, M.G.A. Biotechnological

production of xylitol from agroindustrial residues: Evaluation of bioprocesses. Applied

Biochemistry and Biotechnology. v. 70/72, p. 869-75, 1998.

RUSSEL, J.B. Another explanation for the toxicity of fennentation acids at low pH: anion

accumulation versus uncoupling. Joumal of Applied Bacteriology. v. 73, p. 363-70, 1992.

SA.iWANA, J.; SOUZA, S.O. Subprodutos da cana-de-açúcar. Informe Agropecuário. v.10,

p.22-6, 1984.

SANTOS, V.A.P.M.; LEENEN, E.J.T.M.; RIPPOLL, M.M.; SLUIS, C.; VLIET, T.;

TRAMPER, J.; WIJFFELS, R.H. Relevance of rheological properties of gel beads for

their mechanical stability in bioreactors. Biotechnology and Bioengineering, v. 56, p. 517-

29, 1997.

SCHEININ, A; MÀKINEN, K. K.; YLIT ALO, K Turku sugar studies: Final report on the

effect of sucrose, frutose and xylitol diets on the caries incidence in man. Acta

Odontologica Scandinavica. v.33, p. 67-104, 1975.

SCHNEIDER, H. Conversion of pentoses to ethanol by yeasts and fungi. Criticai Reviews in

Biotechnology. v.9, p.1-40, 1989.

SENE, L.; FELIPE, M.G.A.; VITOLO, M.; SILVA, S.S.; MANCILHA, I.M. Adaptation and

reutilization of Candida guilliermondii cells for xylitol production in bagasse hydrolysate.

Joumal ofBasic Microbiology. v.38, p.61-9, 1998.

SILVA, S.S.; AFSCHAR, AS. Microbial production of xylitol from D-xylose using Candida

tropicalis. Bioprocess Engineering. v.11, p.129-34, 1994.

108

SILVA, S.S.; ROBERTO, I.C.; FELIPE, M.G.A.; MANCILHA, I.M. Batch fermentation of

xylose for xylitol production in a stirred tank bioreactor. Process Biochemistry. v.31,

p.549-53, I 996a.

SILVA, S.S.; FELIPE, M.G.A.; ROBERTO, I.C.; VITOLO, M.; MANCILHA, I.M.

Physiological aspects of biotechnological xylitol production frorn hemicellulosic

substrates. Biotecnologia Aplicada. v.13, p.206-12, l 996b

SILVA, S.S.; VITOLO, M.; PESSOA JÚNIOR, A.; FELIPE, M.G.A. Xylose reductase and

xylitol dehydrogenase activities of D-xylose-xylitol-fermenting Candida guilliermondii.

Joumal ofBasicMicrobiology. v.3, p.187-91, 1996c.

SILVA, S.S.; RIBEIRO, J.D.; FELIPE, M.G.A.; VITOLO, M. Maximizing the xylitol

production from sugarcane bagasse hydrolysate by controlling the aeration rate. Applied

Biochemistry and Biotechnology. v.63/64, p.557-63, 1997.

SILVA, C.J.S.M.; ROBERTO, I.C. Statistical screening method for selection of important

variables on xylitol biosynth.esis from rice straw hydrolysate by Candida guilliermondit

FTI 20037. Biotechnology Techniques. v.13, p. 743-7, 1999.

SILVA, C.J.S.M.; ROBERTO, I.C. Optimization of xylitol production by Candida

guilliermondii FTI 20037 using response surface methodology. Process Biochernistry. v.

36, p. 1119-24, 2001.

SKOOG, K.; HÁHN-HAGERDAL, B. Xylose Fermentation. Enzyme and Microbial

Technology. v.10, p.66-80, 1988.

SLININGER P.J.; BOLEN, P.L.; KURTZMAN, C.P. Pachysolen tannophilus: Properties and

process consideration for ethanol production from D-xylose. Enzyme and Microbial

technology. v.9, p.5-15, 1987.

SPENCER-MARTINS, 1. Transport of sugars in yeasts: implications in the fermentation of

lignocellulosic materiais. Bioresource Technology. v. 50, p. 51-7, 1994.

TA V ARES, L.B.B. Fermentação alcoólica de material amíláceo por levedura amilolítica

recombinante em reator com células imobilizadas. 1998. 174 f Tese (Doutorado em

Engenharia) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São

Paulo.

109

TAYLOR, K.B.; BECK, M.J.; HUANG, D.H.; SAKAI, T.T. The fermentation of xylose:

studies by carbon-13 nuclear magnetic ressonance spectroscopy. Joumal of Industrial

Microbiology. v.6, p.29-41, 1990.

TRELLES, J.A.; FERNÁNDEZ-LUCAS, J.; CONDEZO, L.A.; SINISTERRA, J.V.

Nucleoside synthesis by immobilized bacterial whole cells. Joumal of Molecular Catalysis

B. v.30, p.219-227, 2004.

TSAO, G.T. Conversion of cellulosics. ln: ALANI, D.I.; MOO-YOUNG, M. Perspectives in

Biotechnology and Applied Microbiology. London: Elsevier Applied Science Publishers,

1986. p.203-22.

lIBARI, M.; KONTIOKARI, T.; KOSKELA, M.; NIEMELA, M. A novel use of xylitol

sugar in preventing acute otitis media. Pediatrics. v. 102, p. 879-84, 1998.

V ANDESKA, E.; AMARTEY, S.; KUZMANOVA, S.; JEFFRIES, T.W. Effects of

environmental conditions on production of xylitol by Candida boidinii. World Joumal of

Microbiology and Biotechnology. v.11, p.213-8, 1995.

VIVES, C.; CASAS, C.; GÓDIA, F.; SOLÀ, C. Determination of the intrinsic fermentation

kinetics of Saccharomyces cerevisiae cells immobilized in Ca-alginate beads and

observations on their growth. Applied Microbiology and Biotechnology. v. 38, p. 467- 72;

1993.

WÃLER, S.M.; ASSEV, S.; RÔLLA, G. Xylitol 5-P formation by dental plaque after 12

weeks's exposure to a xylitol/sorbitol containning chewing gum. Scandinavian Joumal of

Dental Research. v.100, p.319-21, 1992.

WALTHER, T.; HENSIRISAK, P.; AGBLEVOR, F.A. The influence of aeration and

hemicellulosic sugars on xylitol production by Candida tropica/is. Bioresource

Technology. v. 76, p. 213-20, 2001.

W ANG, Y.M.; van EYS, J. Nutritiona] significance of fructose and sugar alcohols. Annual

Review ofNutrition. v.1, p.437-475, 1981.

WEBB, S.R.; LEE, H. Characterization of xylose reductase from the yeast Pichia stipitis:

evidence for functional thiol and histidyl groups. Journal of General Microbiology. v.138,

p.1857-63, 1992.

110

WINKELHAUSEN, E.; PITTMAN, P.; KUZMANOV A, S.; JEFFRIES, T.W. Xylitol

formation by Candida boidinii in oxygen lirnited chemostat culture. Biotechnology

Letters. v.18, p. 753-8, 1996.

WINKELHAUSEN, E.; KUZMANOV A, S. Microbial conversion of D-xylose to xylitol.

Joumal ofFermentation and Bioengineering. v.86, p.1-14, 1998.

YAHASID, Y.; HATSU, M.; HORITSU, H.; KAWAI, K.; SUZUKl, T.; TAKAMIZAWA,

K. D-glucose feeding for improvement of xylitol productivity from D-xylose usmg

Candida tropicalis immobilized on a non-woven fabric. Biotechnology Letters. v.18,

p.1395-400, 1996.

YLIKAHRI, R. Metabolic and nutritional aspects of xylitol. Advances in Food Research.

v.25, p.159-80, 1979.

~ -· -

Anexo 1 -·- ..

-. -- .. _,..

Tabela Al.l: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii

imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio em.frascos Erlenmeyer

Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A. Acético pH XRJ XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g!L) (g!L) (g!L)

o 3.7 43.4 4.4 2.8 5.0 1.6 1.6

24 27.9 3.6 7.5 1.8 5.0 3.7 1.1 4.8

48 4.3 3.3 21.0 0.5 5.9 3.8 1.6 5.4

Tabela Al.2: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii

imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio em reator de mistura

Tempo Glicose Xilosc Arabinose Xilitol A. Acético pH Xm XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 3.9 45.6 4.1 2.8 4.9 1.7 1.7

24 29.1 3.5 5.6 1.5 5.0 4.9 2.3 7.2

48 12.1 2.4 19.0 0.6 5.5 5.0 2.9 7.9

60 5.2 2.3 23.5 5.6 5.1 3.2 8.3

Tabela Al.3: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii

imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio em reator tipo cesta

Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xm XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 3.7 45.4 4.1 2.7 5.1 1.7 1.7

24 36.2 3.8 3.6 2.4 4.9 2.4 l.O 3.4

48 23.7 3.3 10.3 1.8 5.0 3.1 1.7 4.8

60 16.0 3.0 13.7 1.5 5.0 3.3 1.7 5.0

72 13.1 3.0 15.0 1.2 5.0 3.4 1.6 4.9

Anexo2

Tabela A2.l: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii

imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 01 da matriz do planejamento experimental

Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRJ XRM XR

(h) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 5.0 49.2 5.1 2.8 6.0 0.7 0.7 24 37.3 4.6 3.8 2.5 5.6 1.7 1.7 3.4 48 27.9 4.4 12.2 2.1 5.9 1.7 2.2 3.9 72 13.9 3.8 21. l 1.8 6.1 1.8 2.9 4.7 96 3.8 3.8 27.8 1.3 6.2 1.9 4.4 6.3

Tabela A2.2: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii


Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR

(b) (g/L) (g/L) (g/L) {g/L) (g/L) (-) (g!L) (g/L) (g/L)

o 5.8 73.6 10.2 2.7 4.0 0.6 0.6 24 5.7 72.4 9.8 2.7 4.1 0.7 0.1 0.8 48 1.9 69.7 8.5 1.5 2.5 4.1 1.2 0.2 1.4 72 66.0 8.2 3.3 2.1 4.1 1.2 0.6 1.8 96 61.2 8.1 6.2 1.5 4.2 1.2 0.8 2.0 120 53.8 7.8 11.1 1.0 4.3 1.2 1.1 2.3



Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (b) (g!L) {g/L) {g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 2.9 41.8 7.0 2.6 4.0 0.7. 0.7 24 38.8 5.8 2.5 2.4 4.1 1.7 0.3 2.0 48 31.1 5.2 6.1 1.1 4.3 1.8 1.0 2.8 72 22.3 4.5 11.3 4.6 1.9 2.9 4.8 96 13.4 3.6 15.5 4.3 1.9 5.5 7.4 120 8.4 3.3 18.4 4.1 1.9 7.7 9.6



Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR

(h) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 3.7 65.0 12.3 2.5 6.0 0.6 0.6 24 56.1 9.3 5.6 2.1 5.7 2.4 1.5 3.9 48 47.3 9.1 12.0 1.2 6.7 2.4 3.6 6.0 72 40.l 8.5 16.9 0.5 7.2 2.6 6.2 8.8



Tempo Glicose Xilosc Arabinose Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (g/L) . (g/L) (g/L) (g/L) (-) {g/L) (g/L) (g/L)

o 3.9 45.9 4.8 2.7 4.0 0.5 0.5 24 42.2 4.8 1.8 2.1 4.1 1.7 0.4 2.1 48 32.9 4.5 7.9 0.7 4.3 1.8 1.8 3.6 72 19.6 3.9 17.4 4.3 1.8 3.5 5.3

-. 96 7.3 3.3 27.6 4.2 1.8 4.1 5.9 '-. - ~ 120 1.0 2.0 32.8 4.1 1.8 4.9 6.i



Tempo Glicose Xilose Arabíaose Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (gfL) (g/L) (glL) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 6.5 76.l 8.8 3.1 6.0 0.6 0.6 24 66.2 8.6 4.4 2.4 5.8 2.7 2.1 4.8 48 58.0 8.4 9.7 1.3 6.9 2.9 5.3 8.2 72 50.0 8.1 14.l 0.7 7.1 3.1 8.1 11.2

Tabela A2. 7: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii


Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A Acético pH Xm XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 2.8 41.1 6.7 2.7 6.0 0.6 0.6 24 32.6 5.4 3.9 2.1 6.5 3.2 3.1 6.3 48 27.9 5.4 5.4 0.7 6.7 4.5 5.7 10.2 72 22.3 5.1 6.0 7.1 4.6 6.2 10.8



Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A .t\cético pH Xru XRM XR (b) (g/L) (gfL) (g/L) (g/L) (gil,) (-) (gfL) (gfL) (gfL)

o 5.6 70.0 9.7 2.5 4.0 0.6 0.6 24 3.0 67.4 8.4 1.4 2.2 4.1 1.2 0.4 1.6 48 62.8 7.9 3.9 1.4 4.1 2.1 1.3 3.4 72 43.3 7.9 7.5 4.1 2.4 5.9 8.3 96 31.6 7.6 11.6 3.9 2.4 9.5 11.9 120 17.0 7.2 14.8 .., -r 2.4 12.9 15.3 .)./



Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A Acético pH Xru XRM XR (b) (gfL) (gfL) (gfL) (gfL) (gfL) (-) (gfL) (gfL) (g/L)

o 3.1 42.9 4.7 2.7 4.0 1.4 1.4 24 0.6 41.l 4.6 2.3 2.6 4.0 2.3 0.1 2.4 48 36.0 4.4 4.2 2.1 4.1 2.3 0.4 2.7 72 30.9 4.2 7.1 1.5 4.1 2.3 0.9 3.2 96 23.4 3.8 11.8 0.9 4.2 2.3 1.3 3.6 120 14.0 3.7 17.0 4.2 2.3 1.9 4.2



Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR

(b) (g/L) (g/L) (g/L) {g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 6.6 74.3 7.9 2.9 6.0 1.5 1.5 24 66.4 7.5 6.3 2.7 5.6 3. l l. l 4.2 48 51.4 7.2 14. l 2.3 5.7 3.3 2.1 5.4 72 38.9 6.9 27.9 1.9 6. l 3.3 2.6 5.9 96 25.7 6.9 38.9 1.7 6.4 3.3 3.2 6.5 120 12.0 6.7 47.9 1.3 6.5 3.3 4.1 7.4

Tabela A2.ll: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii


Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) {g/L)

o 3.5 46.0 4.6 3.1 6.0 1.3 1.3 24 31.7 4.5 7.0 2.3 5.8 3.5 2.3 5.8 48 18.5 4.4 13.9 1.3 6.9 3.7 5.7 9.4 72 13.2 4.4 15.1 0.7 7.5 4.0 8.2 12.2



Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g/L) {g/L) (g/L) (g/L) {g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 6.2 73.2 8.1 2.6 4.0 1.4 1.4 24 4.3 70.7 7.9 1.9 2.4 4.1 2.5 0.2 2.7 48 0.8 64.4 7.4 4.6 1.6 4.1 2.8 0.7 3.5 72 54.3 7.2 9.5 0.7 4.1 2.8 2.1 4.9 96 36.1 6.8 18.4 4.0 2.8 4.1 6.9 120 16.6 6.7 30.5 3.8 2.8 5.2 8.0



Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 3.3 45.4 5.4 2.7 6.0 1.3 1.3

24 32.4 4.9 5.2 1.8 6.6 4.0 3.7 7.7

48 24.0 4.6 8.1 0.9 6.9 4.0 7.8 11.8

72 18.8 4.4 9.8 0.7 7.5 4.1 10.1 14.2

Tabela A2.14: Fermentação do hidrolísado de bagaço de cana por Candida guilliermondii


Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A Acético pH Xru XRM XR (h) {g/L) {g/L) {g/L) (g/L) (g/L) (-) {g/L) (g/L) (g/L)

o 4.8 73.3 8.3 2.7 4.0 1.3 1.3

24 4.4 70.8 7.7 2.5 2.7 4.1 2.1 0.1 2.2

48 63.5 7.3 5.1 2.1 4.2 3.1 0.3 3.4

72 54.4 6.8 9.4 1.2 4.3 3. 1 1.5 4.6

96 39.4 6.8 19.4 4.4 3.1 3.0 6.1

120 19.9 6.2 28.9 4.4 3.1 5.6 8.7



Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (g/L) {g/L) {g/L) {g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 3.6 44.6 5.7 2.6 4.0 1.5 1.5

24 37.8 5.1 3.7 2.0 4.1 3.0 0.4 3.4

48 23.9 4.9 9.0 4.1 3.1 3.6 6.7

72 10.5 4.3 12.9 3.8 3.4 8.7 12.l

96 1.9 3.8 13.5 3.7 3.4 12.5 15.9

Tabela A2.16: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondit


Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g(L) (g(L) (g(L) (-) (g(L) (g(L) (g/L)

o 3.6 68.0 8.6 1.8 6.0 1.5 1.5 24 59.8 7.1 4.8 1.6 5.9 3.7 3.7 7.4 48 35.5 6.9 12.7 0.9 6.6 3.8 8.0 11.8 72 13.7 6.0 23.6 0.3 7.2 3.9 11.7 15.6



Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g/L) (gfL) (g(L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 3.7 58.6 9.1 2.9 5.0 1.1 1.1

24 47.0 7.0 5.9 2.3 5.2 2.4 1.0 3.4 48 35.3 6.2 14.0 1.5 5.8 2.4 3.6 6.0 72 22.9 4.9 22.9 1.0 6.7 2.4 6.2 8.6 ··- ..

96 14.4 4.0 27.5 0.6 6.6 2.4 8.9 11.3 - -- 120 10.2 3.7 27.9 6.5 2.4 10.4 12.8



Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g/L) (gfL) (g/L) (g/L) (g!L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 5.7 62.3 7.1 2.8 5.0 0.9 0.9 24 52.2 7.0 4.7 2.0 5.1 2.4 1.2 3.6 48 38.4 6.8 14.0 1.0 6.0 2.5 3.8 6.3 72 23.7 6.6 19.5 6.3 2.6 6.2 8.8 96 14.4 6.3 21.1 5.8 2.6 8.7 11.3 120 5.8 6.2 22.1 5.7 2.6 11.2 13.8



Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A Acético pH XRJ XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 5.8 63.3 7.0 3.0 5.0 1.0 1.0 14 52.3 6.7 4.3 2.3 5.1 2.4 1.2 3.6 48 39.1 6.3 15.0 1.2 5.7 2.5 3.4 5.9 72 19.3 6.2 25.2 0.4 6.8 2.6 6.0 8.6 96 9.8 6.1 27.5 6.4 2.6 9.2 11.8

120 4.9 6.1 29.5 6.2 2.6 11.6 14.2

Anexo 3



Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A Acético pH XRJ XRM XR (b) (g{L) (g{L) (g{L) (g{L) (g{L) (-) (g{L) (g{L) (g{L)

o 4.0 48.4 7.0 3.1 5.0 1.0 1.0

24 35.8 5.1 5.0 2.1 5.0 1.9 1.5 3.4

48 17.7 4.4 16.9 0.9 6.0 2.0 3.4 5.4

72 6.8 4.3 21.2 7.1 2.1 7.7 9.8



Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A Acético pH XRJ XRM XR (h) (g{L) (g/L) (g{L) (g{L) (g{L) (-) (g!L) (g{L) (g/L)

o 6.3 75.0 11.3 2.7 5.0 1.1 1.1

24 63.9 8.7 5.9 2.2 5.1 2.1 1.0 3.0

48 49.8 7.5 13.4 1.3 5.4 2.1 2.6 4.7

72 30.0 6.8 29.8 0.6 6.1 2.2 4.4 6.6



Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A Acético pH XRJ XRM XR (b) (g/L) (g{L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 5.1 62.7 8.6 2.8 5.0 0.9 0.9

24 52.7 6.7 4.9 2.4 5.1 2.1 1.0 3.0

48 40.8 6.3 12.8 1.9 5.3 2.1 1.8 3.9

72 27.6 5.8 24.4 1.3 5.8 2.1 2.5 4.6



Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 5.4 64.7 9.2 3.0 5.0 1.0 1.0 24 50.8 7.4 6.2 2.0 5.2 2.0 1.9 3.9 48 32.9 6.8 17.6 0.7 6.7 2.3 5.2 7.5 72 23.7 6.7 22.0 6.8 2.5 9.9 12.3



Tempo Glicose Xilosc Arabinose Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g/L) (g{L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g(L) (g(L) (g(L)

o 5.7 65.6 7.4 3.2 5.0 1.1 1.1

24 53.6 6.2 5.1 2.5 5.0 2.0 1.3 3.3 48 38.8 6.0 15.7 1.7 5.4 2.1 2.2 4.3 72 21.5 5.9 30.5 1.0 6.3 2.2 3.0 5.2

-·-·· - -



Tempo Glicose Xilosc Arahinose Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g(L) (g/L) (g/L) (g/L) (g(L) {-) (g(L) (g(L) {g/L)

o 5.7 65.l 8.0 3.0 5.0 1.1 1.1

24 51.2 6.7 5.6 1.9 5.3 2.3 2.4 4.8 48 34.3 6.5 15.1 6.9 2.4 7.5 9.9 72 20.2 6.5 23.8 6.5 2.5 10.7 13.3



Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (h) (g/L) {g/L) (g/L) (g!L) (g/L) (-) (g!L) (g/L) (g/L)

o 5.1 62.3 9.7 2.8 5.0 0.6 0.6

24 53.6 7.2 4.2 2.5 5.0 1.8 0.4 2.2

48 39.9 6.2 11.3 1.5 5.4 1.8 2.5 4.3

72 22.2 5.6 25.8 0.7 6.6 1.8 4.3 6.l



Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g!L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 3.6 61.7 8.1 3.1 5.0 1.5 1.5

24 51.0 6.9 6.1 2.1 5.1 2.4 1.4 3.7

48 34.0 6.3 16.2 1.1 5.6 2.4 3.0 5.5

72 17.6 5.1 27.4 0.4 6.6 2.5 4.6 7.1



Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (h) (g/L) (g!L) (g!L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g!L) (g/L)

o 5.0 60.l 9.7 2.7 4.0 1.0 1.0

24 0.7 55.2 7.5 2.5 2.3 4.1 1.8 0.2 2.0

48 46.4 6.8 5.7 1.4 4.1 1.9 1.2 3.1

72 33.7 6.1 14.4 0.5 4.2 1.9 2.2 4.1



Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (g/L) (g/L) {g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 5.4 64.0 7.5 3.0 6.0 0.9 0.9 24 51.9 7.2 5.4 2.2 6.1 2.8 2.9 5.6 48 38.3 6.5 13.2 1.1 6.9 3.1 6.5 9.6 72 30.0 6.4 18.0 0.5 7.2 3.2 9.9 13.1



Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (gfL) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 3.6 59.7 7.4 3.1 5.0 0.9 0.9 24 51.2 7.0 7.5 2.2 5.1 2.3 1.0 3.3 48 37.3 6.2 17.5 1.3 6.1 2.3 2.7 5.0 72 21.6 4.7 26.6 0.9 6.8 2.3 4.5 6.8



Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (gfL) (g/L) (g/L) (gfL) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 5.4 64.l 7.9 3.0 5.0 1.0 1.0 24 52.7 6.3 4.7 2.2 5.1 2.0 1.6 3.6 48 35.2 6.0 16.8 1.1 5.8 2.1 3.6 5.6 72 15.6 5.9 32.0 0.3 6.5 2.2 5.5 7.7

Anexo 4


imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio de comprovação dos modelos

Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (b) (g{L) (gfL) (gfL) (g{L) (g{L) (-) (g{L) (g{L) (g{L)

o 4.8 68.8 9.4 3.0 6.0 1.4 1.4 6 1.4 66.9 8.2 0.3 2.9 5.5 0.1

12 62.4 8.1 3.3 2.8 5.5 0.6 24 59.4 ~-º 5.9 2.6 5.5 0.8 48 51.6 7.5 12.9 2.5 5.6 1.7 72 38.4 7.2 25.2 2.1 5.9 2.3 96 22.0 6.3 36.6 1.8 6.2 2.7

120 9.9 5.7 47.5 1.7 6.3 3.2 144 4.6 50.1 1.3 6.4 2.7 3.8 6.5

Anexo 5

Tabela A5.l: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii

imobilizada em gel de alginato de cálcio, em reator de mistura, no sistema de bateladas

repetidas - 1 a batelada

Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A. Acético pH XRJ XR/11 XR (h) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 6.3 76.4 7.2 3.7 6.0 1.4 1.4 6 1.6 74.1 7.1 0.9 3.7 5.5 0.2

24 64.2 7.1 5.1 3.3 5.5 1.2

48 52.8 6.9 12.3 2.9 5.6 2.0 72 40.2 6.7 22.3 2.5 5.9 2.5 96 24.7 6.5 34.7 2.1 6.1 2.6 120 10.8 6.3 46.7 1.8 6.2 3.2 2.9 6.1

Tabela AS.2: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii

imobilizada em gel de alginato de cálcio, em reator de rrústura, no sistema de bateladas

repetidas - 2ª batelada

Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitof A. Acético pB XRJ XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 6.4 73.0 9.8 6.0 4.2 6.0 3.2 0.1 3.3 6 1.0 77.6 8.9 7.8 4.0 5.7 0.5

24 64.0 8.4 15.8 3.1 5.7 1.5

48 54.7 8.1 23.4 3.0 5.7 2.0 72 40.3 8.1 34.3 2.6 5.9 2.3 96 30.2 7.6 42.2 2.5 6.1 2.7 120 9.9 7.5 51.3 2.4 6.2 3.8 3.0 6.8





o 6.2 80.6 8.3 5.8 4.3 6.0 3.8 0.3 4. l 6 l.7 79.8 8.1 6.l 4.0 5.8 0.7

24 69.4 8.0 13. l 3.9 5.7 2.0 48 55.6 7.9 22.7 3.5 5.9 2.7 72 41.0 7.9 34.6 3. l 6.1 3.5 96 25.2 7.7 48.5 2.6 6.4 3.7 120 8.1 6.9 55.7 1.9 6.5 3.5 4.3 7.8





o 5.0 77.5 8.6 6.6 4.5 6.0 3.5 0.7 4.2 6 2.0 76.8 7.9 7.1 4.0 5.6 1.2

24 68.4 7.8 11.6 3.9 5.6 2.5 48 54.8 7.8 21.0 3.7 5.8 2.7 72 40.l 7.4 31.3 3.0 6.0 3.2 96 23.4 6.8 43.5 2.2 6.2 3.5 110 9.4 6.5 53.9 2.0 6.2 3.5 3.9 7.4

\




Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (h) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)

o 5.0 77.0 8.9 5.5 4.0 6.0 3.5 0.6 4.1 6 2.2 75.5 8.1 6.5 3.9 5.6 1.0

24 70.8 7.6 9.5 3.8 5.6 2.5 48 55.7 7.6 17. l 3.3 5.7 2.7 72 42.6 7.4 28.2 3.2 5.9 3.3 96 29.0 7.4 40.0 2.7 6.0 3.4 120 13.9 7.3 50.3 2.4 6.1 3.3 3.9 7.2

Anexo 6


imobilizada em gel de alginato de cálcio, em frascos Erlenmeyer, no sistema de bateladas

repetidas - Ensaio A: Adição de sulfato de amônia e de extrato de farelo de arroz em todas as

bateladas

Batelada Tempo (h) Xilose (g/L) Xilitol (g/L)

1· o 96

78.0

20.7

o 25.9

o 96

76.5

2.6

4.0

46.8

o 96

76.8

1.7

7.1

48.7



repetidas - Ensaio B: Adição de sulfato de amônio e de extrato de farelo de arroz na 1ª e na 3ª

bateladas


o 96

75.0 O

18.3 26.7 ------------------------· l8 O 70.2 3.7

96 28.4 14.1 ------------------------· 3• O 70.2 4.3

96 4.8 42.0

Tabela A6.3: F ennentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii


repetidas - Ensaio C: Adição de sulfato de amônio e de extrato de farelo de arroz na 1ª

batelada

Batelada Xilose (g/L) Xilitol (g/L) Tempo (h)

1· 74.6 O o 96 15.8 27.5

o 96

75.9

25.9

4.1

15.2

3• 76.2

25.8

2.7

12.0

o 96



repetidas - Ensaio D: Adição de extrato de farelo de arroz em todas as bateladas


1· 77.9 O o 96 28.6 16.5 ------------------------· 2• O 81.l 2.3

96 35.3 25.0 ------------------------· 3• O 79.7 3.3

96 35.4 26.5



repetidas - Ensaio E: Adição de sulfato de amônio em todas as bateladas

Batelada Tempo (b) Xilose (g/L) Xilitol (g/L)

l" o 96

76.4 O

32.8 14.2

o 96

81.5

43.5

2.0

12.4

o 96

78.5

49.3

2.4

9.6



repetidas - Ensaio F: Sem adição de sulfato de amônio e de extrato de farelo de arroz em

todas as bateladas

Batelada Tempo (b) Xilose (g/L) Xilitol (g/L)

1· o 72.3 o 96 31.4 12.1

.. - -- ------------------------· 2· o 74.5 2.5

96 42.2 9.0

3• o 96

79.7

40.7

1.7

8.7

Lorena - S.P. - Brasil . 2004sistemas.eel.usp.br/bibliotecas/antigas/2004/BIT04004OCR.pdfEm...

Documents

Transcript of Lorena - S.P. - Brasil . 2004sistemas.eel.usp.br/bibliotecas/antigas/2004/BIT04004OCR.pdfEm...