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Biologia molecular de Plasmodium falciparum – um curso prático

Gerhard Wunderlich & Carsten Wrenger

São Paulo 2014

Departamento de Parasitologia – Instituto de Ciências Biomédicas –Universidade de São Paulo

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Objetivo do curso

Estudantes de cursos de Ciências da vida (Biologia, Bioquímica, Farmácia, Ciências Biomédicas, etc.) muitas vezes tem pouca oportunidade de conhecer o lado prático de trabalhos de biologia molecular. Neste curso pretendemos ensinar técnicas essenciais da biologia molecular com seus truques e detalhes, e em paralelo mostrar alguns aspectos do ciclo de vida e do manuseio de parasitas do ciclo sanguíneo de Plasmodium falciparum. O aluno egresso deve ser capaz de planejar, conduzir e avaliar de forma autônoma os experimentos aqui mostrados.

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Mapa de atividades do curso

Dia 1: Introdução no organismo Plasmodium falciparum. Formação dos grupos experimentais 1-7. Extração de DNA genômico do parasita. Princípios da preparação de soluções e discussão do protocolo da extração de gDNA. Semear bactérias E. coli DH10B, XL1 blue e BL21 RIL.

Dia 2: Introdução no cultivo de parasitas. Experimento demonstrativo: Sincronização de parasitas para formas trofozoitas/esquizontes. Quantificação de gDNA de P. falciparum. Introdução na reação em cadeia da polimerase (PCR). Setup e início das reações de PCR com gDNA de P. falciparum. Inoculação de LB com cultivo pré-inóculo E. coli DH10B, XL1 blue MRF-, BL21 RIL

Dia 3: Manhã: Experimento demonstrativo: Recolhimento de parasitas em forma anel. Análise da reação PCR e purificação de fragmentos do gel: grupos 1-2 glassmilk, 3-4 kit PCR clean, 5-7 Glassmilk com gel “violeta cristalina”. Grupos 1-2 bactérias químiocompetentes DH10B, grupos 3,4 bactérias químiocompetentes BL21 RIL, grupos 5-7 químiocompetentes XL1 blue. Setup de ligação de fragmentos em pGEM T easy e transformação (plus controles). Recolhimento de formas trofozoita.

Dia 4: Recolhimento de formas esquizonte tardio. Cálculo de eficiência de bactérias competentes. Análise de eficiência através das placas. Preparação de RNAs do parasita 3 grupos (anel 1,2 trofo 3,4 e esquizonte 5-7). Quantificação de RNAs. Inoculação de minipreps dos clones pGEM. Preparação de cDNA: DNAse1, cDNA. PCR controle de qualidade.

Dia 5: Minipreps e análise rápida de inserto, (cortar pGEX2T em paralelo) escolha dos clones, restrição quantitativa, purificação de produção e ligação em pGEX2T, transformação. Background teórico de clonagens (como clonar corretamente genes fusionados)

F I M D A S E M A N ADia 6: Minipreps e análise dos clones pGEX2T recombinantes. Setup da reação de

sequenciamento. Seminários sobre sequenciamento da próxima geração (Plataforma SOLiD, grupos 1-2, Plataforma 454, grupos 3-4, e IonTorrent 5-7), Retransformação de clones recombinantes pGEX2T em E. coli BL21 RIL.

Dia 7: Inocular pré-inóculo e inóculo principal em LB-amp-cam, induzir bactérias e recolher. Análise de sequências no computador, montagem de plasmídeo in silico no programa APE. Seminários temáticos grupos 1,2.

Dia 8: Purificação das proteínas recombinantes. Preparação de géis SDS poliacrilamida. Coomassie staining e transferência. Quantificação de proteínas por teste de Bradford. Seminários temáticos grupos 3,4.

Dia 9: Western blot, ELISA, elaboração e avaliação de resultados. Seminários temáticos 5-7.Dia 10: Help Desk. Seminários: Produção de proteínas em sistema Baculovirus (grupos 1-3)

ou em Pichia Pastoris (4-6). Avaliação escrita sobre assuntos do curso.

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Introdução

Malaria e PlasmodiumA malaria humana continua sendo uma grande ameaça a saúde de populações do planeta e especificamente em áreas pobres e tropicais o parasita da forma mais perigosa, Plasmodium falciparum ainda mata em torno de 800 mi pessoas anuais [1,2]. Entretanto, recentes sucessos na diminuição de mortes por medidas de prevenção ou aceleração do tratamento e no sucesso considerável em termos de desenvolvimento de vacinas, como testes com RTS/S-AS01 [3], MSP3 [4] ou alvos novos como o antígeno PfRh5 [5] contracenam com a observação de casos de infecções graves com Plasmodium vivax [6] ou a ocorrência de falhas no tratamento/resistências de cepas de P. falciparum contra artemisinina [7].

A malária inicia-se em indivíduos pela deposição de esporozoitas na pele durante o repasto sanguíneo de anofelinos infectados. Os esporozoitas migram com o fluxo sanguíneo até o fígado onde invadem hepatócitos e se transformam em esquizontes hepáticos e depois 6-14 dias em até 40.000 merozoitas que - saindo do hepatócito infectado - começam a infectar hemácias. O processo da infecção da hemácia é um processo de múltiplos passos nitidamente coordenados e ocorre dentro de aproximadamente 2 min (revisado em [8]), sob formação de um vacúolo parasitóforo (Figura 1). A fase de multiplicação na hemácia (esquizogônia) demora 48 h (72 h no caso de P. malariae) e a malária é percebida como tal no momento quando ocorrem as primeiras ondas de lise de hemácias liberando novamente 16-32 merozoitas novos juntamente com toxinas. Durante sua fase intraeritrocítica, o parasita modifica grandemente a hemácia, colocando transportadores e antígenos muitas vezes de função ainda desconhecida no citossol ou na superfície da hemácia. Uma parte dos parasitas reinvadidos vai seguir outro programa celular e se desenvolver para o gamonto ou gametócito, que é uma forma não proliferativa. Esta forma é infecciosa para o mosquito vetor (hospedeiro definitivo) e ao ser sugado e mediante sinalização térmica e química percebe a transmissão ao mosquito onde se desenvolve para 8 gametas masculinas flagelados (microgametas) ou um gameta feminino (macrogametas). Estas formas vão formar, dentro do bolo de hemácias dentro do intestino do mosquito, uma forma diploide após fecundação que possui mobilidade e atravessa a membrana peritrófica do material ingerido pelo mosquito e também a membrana das células epiteliais e se instala no lado distal do epitélio como oocisto. Lá ocorre a meiose e multiplicação maciça (esporogonia). Após uns dias o oocisto se rompe e libera milhares de esporozoitas para a hemolinfa do mosquito. Estes esporozoitas migram por quimiotaxia e interação receptor-ligante para a glândula salivar do mosquito onde invadem e ficam inativos até o próximo repasto sanguíneo quando são injetados juntamente com a saliva para dentro da pele do próximo hospedeiro intermediário. O ciclo de vida é resumido em Figura 1. Neste curso amplificamos e clonamos vários antígenos importantes do merozoita que infecta hemácias, na sua totalidade estes antígenos são candidatos ou já partes de vacinas anti-maláricas em teste e no destaque da Figura 1 a localização subcelular destes antígenos é mostrado.

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Figura 1: Ciclo de vida e o merozoita de Plasmodium. RBCs são hemácias. Na parte abaixo, as diferentes fases da invasão da hemácia são destacados. A: associação "frouxa" do merozoita a hemácia. B: Reorientação para aproximar o complexo apical a membrana da hemácia. C: Formação complexo de invasão, interação comprometida de receptores ligantes, "tight junction". D, E: Injeção de fatores para dentro da hemácia (conteúdo de róptrias) e invasão ativa da hemácia (interação de proteínas secretadas das micronemas e ligantes da hemácia). F: Resselamento da hemácia. G: O parasita começa se desenvolver dentro da hemácia, a membrana do vacúolo parasitóforo é permeável para moléculas abaixo de ~1000 Daltons.

Biologia molecular neste cursoA biologia molecular compreende per definitionem aspectos biológicos relativos à molécula de DNA. Desde sua descoberta por James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins e Rosalind Franklin esta área de conhecimento continua em expansão e com ela o grau de complexidade que claramente ultrapassa a quantidade de matérias que podem ser ensinadas em graduações mesmo focalizadas no assunto. Entretanto, existem alguns princípios básicos e experimentais que estão contidos na maioria de trabalhos na área. Neste curso conheceremos uma parte destes princípios básicos e tentamos ensinar técnicas importantes do laboratório de biologia molecular. Estas técnicas são essencialmente as mesmas em laboratórios que estudam os mais diversos sistemas e organismos – em consequência, biologistas moleculares que ontem trabalharam no sistema Anas patyrhynchos (“pato”) facilmente se adaptarão hoje em laboratórios com biologia molecular de Drosophila, Homo sapiens ou Plasmodium.

Neste curso, seguimos uma parte do caminho percorrido do nosso laboratório que busca analisar genes de proteínas expressas por um parasita de seres humanos (P. falciparum) com o intuito de analisar a resposta imunológica humoral contra essas proteínas em questão, muitas delas são alvos de vacinas. O procedimento é o mais straight forward possível.

Dia 1 Metas do dia: Preparação de soluções básicas, meios e extração de DNA genômico do parasita Plasmodium falciparum cepa 3D7, fazer placas de LB(-amp), semear bactérias

O preparo de soluções exatas e limpas é primordial no trabalho com DNA. A pipetagem segura e exata é importantíssimo considerando que muitas reações são em volumes mínimos de alguns microlitros. É essencial neste ponto que o participante do curso tem uma noção dos conceitos de molaridade e porcentagem de soluções. As primeiras soluções a serem preparadas são as soluções de lise de parasitas P. falciparum.

1x PBS de 10x PBS

Soluções concentradas são utilizadas em muitos laboratórios porque elas permitem ter soluções de uso rapidamente por mistura de soluções concentradas com água. Para facilitar, muitas vezes usamos soluções 10 vezes concentradas de estoque, mas é importante lembrar que o conceito “1x” é

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relativo! Uma solução 1x para um experimento pode ser chamado 3x para outro - dependendo do experimentador e experimento.

Para diluição de soluções n vezes concentradas vale para obtenção de soluções uma vez concentradas ("1x", “solução de uso”):

Volumesol. conc * n = Volumesol de uso * 1 ,

onde Volumesol de uso obviamente inclui Volumesol. conc plus água. Vamos a um exemplo: Teremos uma solução 5x (cinco vezes concentrada) e queríamos fazer 300 ml de uma solução de uso (“1x”). A equação acima fica:

Volumesol. conc * 5 = 300 ml * 1 → Volumesol. conc = 300 ml * 1 / 5 → Volumesol. conc= 60 ml.

Desta maneira, cada grupo deve preparar 20 ml de PBS 1x em tubos Falcon 50 ml, através da solução 10x fornecida.

No próximo passo, precisamos fazer a solução para lise de parasitas. Esta solução tem como papel solubilizar qualquer estrutura membranosa (por detergentes iônicos fortes) do parasita e liberar os ácidos nucleicos do mesmo. Para eficiente separação dos ácidos nucleicos dos demais componentes celulares (lipídeos, aminoácidos, proteínas) também é necessário degradar proteínas associadas ao DNA genômico do parasita (histonas, fatores de transcrição, etc.) que ocorre por aplicação de proteinases, neste caso a Proteinase K do fungo Tritirachium album.

A preparação da solução de lise ocorre da mesma forma como a preparação de soluções diluídas a partir de soluções n*x concentradas. No próximo exemplo preparamos 10 ml Tris/HCl pH 8 200 mM de uma solução Tris/HCl pH 8, 1 M.

Está valendo:

Volumesol. conc * Concentraçãosol. conc = Volumesol de uso * Concentraçãosol de uso

que fica:

Volumesol. conc*1 M = 10 ml * 0.2 M, ou Volumesol. conc= 10 ml * 0.2, ou Volumesol. conc= 2 ml

Note que as unidades foram adequadas para molar (M) e se eliminam. Faça agora 1 ml do tampão 4x de lise de Plasmodium:

Tampão lise 4X Solução estoque40 mM Tris/HCl pH 8 1 M Tris/ Tris/HCl pH 84 mM EDTA pH 8 0,5 M EDTA pH 80,8 M NaCl 5 M NaCl4% SDS 20% SDS

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Agora prepare ainda uma solução TE (1 ml)

TE Solução estoque10 mM Tris/HCl pH 8 1 M Tris/ Tris/HCl pH 81 mM EDTA pH 8 0,5 M EDTA pH 8

Cada grupo deve buscar um isopor com gelo neste momento.

Os grupos 1-7 recebem um tubo com 100 µl de sangue compactado com parasitas P. falciparum cada um. Cuidado: nesta forma o parasita ainda está vivo e pode infectar no caso da injeção ou aplicação do material em mucosas! Primeiramente, liberamos o parasita de forma suave da hemácia infectada utilizando uma solução de saponina que interage com o colesterol da membrana plasmática da hemácia mas não do parasita (que não contem colesterol).

Acrescente 1,25 ml de 1xPBS ao pellet de hemácias infectadas e misture suavemente por inversão do tubo fechado

acrescente 150 µl de 1% Saponina (fornecida). incubar por 5 min no gelo, invertendo o tubo de vez em quando. A solução deve ficar

transparente (“suco de groselha”). centrifugar por 5 min a 12000 rpm na centrifuga Eppendorf. Visualize o pellet preto e retire cuidadosamente o sobrenadante sem mexer no pellet

preto (mas retirando a fase branca de membranas no topo do pellet) Resuspende o pellet uma vez com 1 ml 1x PBS. centrifugar por 5 min a 12000 rpm na centrifuga Eppendorf. Retirar o sobrenadante e dissolva o pellet (~50 µl) com 250 µl TE. Acrescente 100 µl tampão de lise 4x, preparado acima. Acrescente 20 µl solução Proteinase K (10 mg/ml, fornecida) incubar 3 h ou o/n a 37°C

Durante esta incubação as membranas do parasita estão sendo solubilizadas pelo SDS (detergente iônico) e proteínas estão sendo degradadas pela Proteinase K que possui seu ótimo de funcionamento em pH 8 e 1% SDS. No próximo passo eliminamos lipídeos e proteínas por extração sequencial com fenol, fenol-clorofórmio e clorofórmio (cuidado: fenol é tóxico, cancerígeno e causa queimadas na pele. Use luvas e não contamine os tubos por fora!).

acrescentar 400 µl de fenol e incubar na gangorra por 10 min centrifugar por 5 min a 8000 rpm na centrifuga Eppendorf. transferir sobrenadante aquoso (não mexer na interfase branca) em tubo novo e acrescente

400 µl fenol-clorofórmio incubar na gangorra por 10 min centrifugar por 5 min a 8000 rpm na centrifuga Eppendorf. transferir sobrenadante aquoso em tubo novo e acrescente 400 µl clorofórmio incubar na gangorra por 10 min centrifugar por 5 min a 8000 rpm na centrifuga Eppendorf.

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acrescentar 800 µl de Etanol 100%, inverter o tubo e observar a solução: um material transparente gosmento (gDNA) deve se transformar em alguns fios, deixar incubar por 15 min no gelo.

centrifugar por 10 min a 8000 rpm e 4°C na centrifuga Eppendorf refrigerada. Verifique a posição da tampa do tubo no rotor para saber a posição onde estará um pellet

Localizar o pellet minúsculo retirar cuidadosamente o sobrenadante Acrescentar 1 ml Etanol 70% e inverter o tubo 5 vezes, incubar 5 min a TA na bancada

Neste ponto, o pellet de gDNA está sendo dessalinizado e descontaminado, isso é, impurezas como aminoácidos e sal entram em solução e apenas ácidos nucleicos maiores (gDNA e RNA) permanecem no pellet e não entram em solução.

centrifugar por 5 min a 8000 rpm na centrifuga Eppendorf. retirar cuidadosamente o sobrenadante na sua totalidade (isso é pipetar embora com pipeta

P1000 e recentrifugar -short spin- e retirar o restante do liquido com a P20. deixar secar brevemente na bancada com tampa aberta até não mais haver cheiro de etanol

ou fenol acrescentar 50 µl de TE, estocar na geladeira a 4°C. O pellet está dissolvendo lentamente.

Semear bactérias E. coli DH10 B, BL21 DE3 pLys RIL e XL1 blue MRF-

(“repique”)Uma das ferramentas mais importantes nos passos que seguem é a obtenção de bactérias competentes. Para isso, é de suma importância ter de fato as bactérias de forma pura e limpa e não eventuais cepas contaminantes que dificilmente se tornarão competentes. Uma medida importante neste quesito é semear as bactérias de forma correta para obtenção de colônias separadas que permitem verificar eventuais contaminantes. A melhor forma para conseguir isso é o método “3-streak” ou das três linhas, usando uma alça bacteriológica de fio de platino (Figura 2).

Antes de poder semear bactérias precisaremos de placas LB com e sem antibióticos. Prepararemos 1 litro de agar em dois Erlenmeyers de 1 l.

Meio LB - agar pré-misturado: 35 g em 1 Litro de agua deionizada, autoclavar por 20 min a 121°C.

depois de esfriar até ~45°C, acrescentar 500 µl ampicilina 100 mg/ml (1000X) em um Erlenmeyer com 500 ml do LB-agar liquido, mexer sem fazer muita bolha.

fazer 8 placas LB sem antibióticos (escrever sempre no fundo da placa o que é), depois acrescentar 300 µl de ampicilina 100 mg/ml.

deixar esfriar no escuro (muitos antibióticos são instáveis na luz) guardar na geladeira, empilhado e embrulhado com vitafilme.

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Figura 2: Esquema do modo de semear corretamente bactérias. Note que entre cada 3 linhas paralelas a alça é esterilizada na chama. Assim, é garantido que ocorre uma diluição seriada na superfície da placa LB-agar e a obtenção de colônias separadas nas últimas diluições.

Outro critério importante é o uso adequado de métodos que selecionam a cepa bacteriana em uso. No caso de E. coli DH10B (ou DH5α), está sendo aplicado estreptomicina (50 µg/ml). No caso da cepa BL21 DE3 pLys RIL usado nos próximos dias, usaremos LB-agar suplementado com cloranfenicol (34 µg/ml). XL1 blue MRF-

e E. coli SURE devem ser crescidas na presença de 12.5 µg/ml Tetraciclina.

Procedimento:

Inicialmente, aplicamos 10 µl de uma solução 100 mg/ml estreptomicina, 20 µl de 34 mg/ml Cloranfenicol, e 20 µl de Tetraciclina (12.5 mg/ml) em três placas LB-agar (uma placa para cada par de grupos) e espalhamos mediante a espátula Drigalski, esterilizada mediante álcool 70% e chama. A queima do álcool na espátula evita que a mesma esquente (não segurar a espátula na chama, deixar queimar sozinho). Incube as placas por 15 min a 37°C.

A partir de uma suspensão feita em 1 ml PBS a partir de uma colônia de placas antigas, semeie a placa LB-strep com DH10B, depois a LB-cloranfenicol com BL21 RIL e a placa LB-tet com XL1blue conforme indicado em figura 2.

1. Escreva no fundo da placa o que será semeado e a data. Evite escrever na tampa porque esta pode ser trocada.

2. Primeiro, esterilize a alça na chama. Depois, esfrie a mesma colocando-a no meio da placa a semear.

3. Mergulhe a alça na solução bacteriana contendo E. coli DH10B/BL21/XL1blue. Verifique se há um fio de liquido na alça.

4. Passe este liquido suavemente na placa sem “arar” o agar, fazendo 3 linhas.

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5. Esterilize a alça, vire placa em 90°, e repita o processo em passo 3. A primeira linha cruza as 3 linhas anteriores, a segunda, duas, e a terceira apenas uma linha antes feita.

6. Repita passo 4.7. Feche a placa e incube-a a 37°C por 12-16 h (até o dia seguinte).

No dia seguinte, precisamos de meios de cultura para crescer as bactérias para o procedimento de torná-las competentes. Grupos 1 e 2 devem crescer E. coli DH10B, 3 e 4 devem crescer E. coli BL21 RIL e os grupos 5 e 6 devem crescer XL1 blue MRF-. Assim cada grupo deve preparar 100 ml de SOB liquido em erlenmeyers de 500 ml (a partir dos componentes fornecidos) e colocar para autoclavar (20 min, 121° C). Vamos usar muitas placas LB agar também. Um grupo deve preparar ainda um litro de LB agar em dois frascos de 1 l.

Receita para 1 litro de SOB: 5 g extrato de levedura, 20 g triptona, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, dissolver em 900 ml água deionizada, ajustar pH para 7.5 (papel pH) com aprox. 2,5 ml 10 M NaOH, autoclavar 20 min a 121°C, depois acrescentar até MgSO4 até 20 mM final.

Receita para 1 litro de LB-Agar (Lysogeny broth, mais conhecido como Luria broth, Luria Bertani broth ou Lennox broth): 10 g Triptona, 5 g Extrato de levedura, 10 g NaCl, 15 g Agar. Deixar esfriar para <50°C, acrescentar antibiótico estoque na concentração certa e despejar aprox. 20 ml por placa Petri. Deixar no escuro a temperatura ambiente até o dia seguinte, depois guarde na geladeira.

Cheque sua bancada e limpe-a antes de sair. Guarde os produtos e soluções na geladeira ou no freezer e descarte seu banho de gelo. Até amanhã!

Dia 2

Metas do dia: Quantificar gDNA, organizar e pipetar PCR com os diversos Oligos, análise do resultado, conhecer cultivo in vitro de P. falciparum separando formas trofozoitas/esquizontes, inocular bactérias em minicultivos de 5 ml (pré-inóculos). Busque um isopor de gelo por grupo.

Ácidos nucleicos consistem de pentoses (ribose) ligados a grupos pirimidinas e purinas (Figura 3). Os grupos pirimidinas e purinas possuem um espectro de absorção de luz que permite a medição da sua concentração em soluções aquosas. Entretanto, é importante considerar que tanto RNA quanto DNA absorvem luz no comprimento de onda de 260/280 nm, tornando difícil medir a quantidade de DNA numa mistura de RNA e DNA, como ocorre por exemplo na nossa preparação de gDNA. Por isso, tentaremos visualizar o gDNA por separação eletroforética em géis de agarose corados com brometo de etídio.

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Figura 3: Ácidos nucleicos que formam RNA e DNA. Note que as bases (purinas e pirimidinas) estão conectadas via o nitrogênio na molécula de açúcar, lá na posição 1. Os açucares são acopladas por ligações di-ester (asterisks, oriundo da reação de grupo alcoólico com um ácido) entre si, formando polímeros. Note que DNA consiste de deoxi-ribose, que significa que o grupo hidroxila no C2 da ribose é apenas um hidrogênio. Origem das imagens: no sentido horário: uic.edu, Absoluteastronomy.com, knowledgeclass.blogspot.com.

Para fazer um gel de agarose, apenas um grupo deve preparar uma solução de 40 ml de 1x TAE (fornecido) contendo 0,4 g de agarose num Erlenmeyer de 250 ml. Esta solução é colocada na microonda e fervida por 1 min ou até a total dissolução de cristais de agarose. Use a luva térmica para mexer a solução e assim dissolver a agarose.

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Enquanto a solução de agarose esfria até ~50°C, o “caminha” – a forma que conterá o gel – é preparada. Use o pente fornecido e coloque em posição para permitir o máximo caminho possível para a amostra migrar no gel (Figura 4).

Figura 4: Montagem do tray ("caminha") para fazer gel de agarose.Tome cuidado para a fita adesiva fechar perfeitamente os lados. Nunca coloque solução acima de 50°C para gelificar porque o acrílico começa a rachar e a fita vai soltar e despejar gel com brometo na bancada.

Quando esfriado, acrescente 1 µl de solução de brometo de etídeo no gel. Cuidado! Brometo de etídeo é cancerígeno e permeia a pele e possui volatilidade em solução aquecida. Assim, não toque no gel sem luvas e não respire os vapores logo após despejar o gel na forma. Depois de colocado a agarose com o brometo de etídeo, tire as luvas e deixe-as no lugar do gel.

Neste momento, cada grupo deve preparar um tubo Eppendorf com 5 µl da solução de gDNA e misturando com a quantidade correta de 6x gel loading buffer (fornecido). Quanto seria esta quantidade certa para ficar 1x concentrado na final?

Após o gel gelificar, o pente é retirado e as amostras são colocadas nos pocinhos formados. Como controle do tamanho das moléculas, colocaremos um marcador de peso molecular que consiste de moléculas de DNA de tamanho conhecido. Em seguida, aplicamos por 20 min um campo elétrico de 120 V para forçar a migração das moléculas de DNA pelo gel. As moléculas separadas são visualizadas no fotodocumentador (“eagle eye”).

PCR (polymerase chain reaction)

Após confirmação da existência de gDNA nas soluções dos grupos, procedemos para a amplificação seletiva de fragmentos de DNA mediante a reação em cadeia da polimerase. Prepare para isso primeiramente um banho de gelo e uma solução de tampão PCR 10x a partir das soluções estoque fornecidos. Quem não tiver certeza da pureza do gDNA, pode receber gDNA 3D7 feito e testado.

Solução estoque de 50x TAE: 242 g Tris Base (MW=121.1), 57.1 mL ácido acético glacial, 100 mL 0.5 M EDTA pH 8. 6X gel loading buffer: 6X TAE, 50% (v/v) glicerol, 0,01% azul de bromofenol.

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10x PCR buffer (escreva as quantidades aqui) Soluções estoque

100 mM TrisCl pH 8.8 1 M TrisCl pH 8.8.

25 mM MgCl2 500 mM MgCl2

500 mM KCl 3 M KCl

Acrescente água milliQ para um volume final de 0.5 ml.

Localize os oligonucleotídeos, cada grupo amplificará um fragmento de um gene diferente. Os oligos são concentrados em 5 pmol/µl. Misture-os, aplique um short spin para coletar o liquido no fundo do tubo e devolva-os ao gelo. Prepare dois tubinhos 0.2 ml escrevendo na lateral (não na tampa – vai apagar durante a reação no termociclador) o que contem: “gDNA” ou “controle” plus seu número de grupo.

Pipete a reação desta maneira, acrescentando na sequencia indicada (use apenas a pipeta P20) no tubo marcado como “controle/grupo No. XY”:

Água milliQ 22.4 µl

10x PCR buffer 4 µl

dNTPs (2.5 mM cada) 4 µl

Oligo forward (5pmol/µl) 4 µl

Oligo reverse (5pmol/µl) 4 µl

Taq Polimerase (5U/µl) 0.2 µl

Ajuste agora a pipeta para 19.5 µl, misture a solução pipetando sem fazer bolhas ou gotículas na parede do tubo e transfira 19.5 µl para o tubo “gDNA/grupo No. XY”. Acrescente neste tubo 0,5 µl do seu gDNA e feche os tubinhos. Se usar em paralelo o gDNA 3D7 backup, terá que preparar solução para 3 reações.

Após todo mundo tiver pipetado a reação, os tubos são colocados no termociclador. O programa foi pré-testado para amplificar todos os fragmentos (94°C, 40 s, 53°C, 40 s, 65°C, 2 min). No próximo passo os fragmentos de PCR são visualizados novamente em gel de agarose. Ao contrário do primeiro gel com gDNA, esta vez vamos retirar o fragmento formado do gel de agarose para purificação do produto de PCR. Neste passo vamos comparar a eficiência da posterior clonagem utilizando métodos de purificação diferentes. Um dos métodos envolve a utilização de gel de TAE agarose que dispensa brometo de etídeo e luz UV para visualizar o DNA: o gel corado com Crystal Violet (utilizado também na microbiologia na coloração segundo Gram). Grupos 5 e 6 fazem o gel com Crystal Violet (um gel para os dois grupos).

Grupos 1-4 preparam um gel 1% TAE-agarose comum, enquanto 5 e 6 preparam um gel 1% CV-TAE. Acrescente as amostras do PCR agora o 6x TAE loading buffer correto (Tampão normal para gel de brometo e 6x CV-TAE loading buffer para o gel CV-TAE). Quanto tampão 6x é para acrescentar aos 20 µl de reação?

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Gel de Crystal violet

Solução estoque: 2 mg/ml Crystal violet em metanol puro (geladeira).

6x CV-TAE loading buffer (0,1 mg/ml Crystal Violet in 6xTAE): 100 µl 6x TAE loading buffer sem azul bromofenol (fornecido) + 5 µl Crystal Violet estoque ≈ 6x CV-TAE.

1% CV-TAE gel: 40 ml TAE + 0,4 g agarose "cloning grade", aquecer, esfriar até 50°C, acrescentar 50 µl Crystal Violet estoque.

Corra o gel por 20 min a 120 V. Grupos 5-6 devem observar o gel durante a corrida porque bandas fracas podem ficar invisíveis rapidamente, a sensibilidade do CV é 10 vezes menor que de géis corados com brometo. Após corrida as bandas são visualizadas (géis de brometo) e as bandas são excisadas com bisturi. Tente não superar 1-2 mm de espessura do pedaço de gel cortado. O fragmento de agarose é colocado num tubo eppendorf identificado com o nome do gene que está amplificando/o número do seu grupo.

Neste momento os grupos 1,2 e 5,6 seguem o protocolo abaixo, enquanto grupos 3 e 4 devem consultar a bula do kit de purificação de fragmentos. Grupos 1,2,5,6 devem preparar juntos antes 20 ml de NEW wash buffer: 20 mM Tris/Cl pH7.5, 0,01 M NaCl, 2 mM EDTA, ≥55% (v/v) EtOH em H 2O milliQ e deixá-lo no gelo. (estoques: 1 M Tris pH 7.5, 0.5 M EDTA, pH8, 5 M NaCl, 100% EtOH)

Purificação de fragmentos de DNA com Glassmilk- cortar banda do gel (evitar muita exposição à luz UV) e colocar no eppendorf 1.5 ml

- adicionar 3 volumes NaI (6 M) e incubar a 37°C até dissolver completamente o agarose

- adicionar 5 µl Glassmilk (100 mg/ml em 3 M NaI)

- incubar 5 min a TA, mexer de vez em quando

- centrifugar 1 min “full speed“, jogar o sobrenadante (tirar com pipeta)

- lavar o pellet branco 1x com 1 ml NEW wash buffer (-> ressuspender (vortex), centrifugar, jogar sobrenadante), re-centrifugar 10 s e tirar todo liquido com a P200, deixar secar 5 min a TA na bancada (para evaporar o álcool)

- Adicionar 15-20 µl TE, LoTE ou H2O, misturar bem e incubar 10 min a TA (o pH certo para soltar o DNA do glassmilk é entre pH 6 e 8)

- centrifugar, 1 min full speed

- Pipetar o sobrenadante para um tubo novo com identificação sem transferir glassmilk

- O fragmento purificado está pronto para uso. Mantenha-o no –20°C (meses-anos?) ou no gelo (uso ~ imediato).

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Purificação de parasitas na fase de trofozoita/esquizonte

Este experimento deve ser conduzido por um voluntário com orientação de um experimentador experiente em cultivo de P. falciparum. Uso de luvas e consciência que o procedimento tem que ser conduzido de forma estéril são essencial. Localize antes de começar: 1 tubo 15 ml fresco estéril, meio RPMI completo, meio RPMI incompleto, "Amido", 2 garrafas de cultivo celular 75cm2, Etanol 70% para lavar, lâminas de vidro e "carrinho", pipetador motorizado, pipetas pasteur estéreis, pipetas de vidro estéreis e contêineres para descarte dos mesmos, e uma caneta prova de água, um lápis, e um isqueiro. Parasitas em cultivo misto (1 garrafa 75cm2) tem seu meio aspirado. Faça-se um esfregaço do material. Logo depois, os parasitas são ressuspendidos em 10 ml de meio RPMI puro e a solução é transferida de forma estéril para um tubo falcon 15 ml e centrifugado a 1500 rpm na centrifuga Sorvall com rotor swing-out.

Depois de voltar ao fluxo laminar, o meio é aspirado e o volume das hemácias compactadas é medido na escala do tubo.

Acrescente agora 1.4 deste volume com meio RPMI completo (com plasma e bicarbonato) e misture suavemente.

Acrescente agora 2.4 volumes Voluven 6% ("Amido", "Plasmagel") e misture sem fazer bolhas.

Feche o tubo e incube-o na posição vertical por aprox. 30 min na estufa a 37°C. Após este tempo, visualize as hemácias que foram para o fundo do tubo formando uma linha nítida para o sobrenadante turvo. Este sobrenadante possui os trofozoitas e esquizontes. Esquizontes tardios e formas anéis não são recuperados (estouram ou ficam no pellet, respectivamente).

Recolhe cuidadosamente o sobrenadante e pipete-o para a mesma garrafa 75cm2. Identifique mais duas garrafas 75cm2 e coloque 10 ml de RPMI completo em cada uma. Acrescente 2.1 ml sangue fresco à solução de trofozoitas purificados Acrescente meio completo para alcançar 15 ml na mesma garrafa com parasitas e sangue

fresco. Aliquote com a mesma pipeta 5 ml em cada uma das 3 garrafas. Acrescente 10 ml de meio completo que apenas contém os 5 ml parasitas ressuspendidos. Feche as tampas sem apertar: é essencial que haja troca de gases entre o ambiente dentro e

fora da garrafa. Coloque as garrafas cuidadosamente na caixa 100% prova de ar e ascenda as velas. Feche a

tampa em seguida espere as velas apagarem sem fazer fumaça. Se ocorrer um burn-out do pavio, abra o box novamente e repita o fechamento com velas acesas.

Coloque a caixa sem tombar na estufa. As tampas não devem molhar neste passo. Deixe o fluxo como o encontrou: limpo e sem lixo, coloque as pipetas pasteur para lavar e

remova qualquer item descartável que utilizou.

Depois de tudo, os pré-inóculos das bactérias tem que ser lançadas. Para isso 5 ml de SOB são tirados dos 100 ml preparados e colocados num Erlenmeyer 50 ml. Acrescente a quantidade correta de estreptomicina (solução estoque 2000X) na garrafa para DH10B, tetraciclina (estoque 1000X), e cloranfenicol (1000X) para as bactérias DH10B, BL21 RIL e XL1 blue, respectivamente. Com a alça bacteriológica esterilizada na chama, inocule uma única colônia de cada linhagem bacteriana por garrafa no meio. Coloque os inóculos no shaker orbital a temperatura ambiente, a 100 rpm.

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Dia 3Metas do dia: Preparação de células competentes: DH10B, BL21 RIL, XL1blue. Recolher parasitas anel (cedinho), trofozoita (mais tarde possível). Ligar fragmento amplificado em pGEM T easy, transformar em DH10B e XL1blue. Busque um isopor com bastante gelo por grupo.

A primeira atividade é inocular 2 ml do pre-inóculo crescido no restante (95 ml) do meio SOB (após colocar os antibióticos necessários), que deve estar a temperatura ambiente. Coloque o cultivo no shaker orbital a 100 rpm e temperatura ambiente. Assegure que a solução CCMB80 está no gelo.

Recolhimento de parasitas em forma anelUm voluntário/a deve preparar o fluxo laminar como descrito anteriormente, sem as garrafas novas. Em vez dos meios, coloque uma garrafa com 1xPBS, não precisa esquentar para usar. Coloque também um tubo 15 ml estéril no fluxo. Verifique se há Trizol LS perto do fluxo/na bancada. O fluxo laminar deve estar ligado com luz UV por uns 20 min até podermos trabalhar com segurança biológica lá dentro (ambiente estéril). Depois deste prazo, o voluntário/a deve retirar a caixa com os cultivos da estufa e abrir no fluxo retirando uma garrafa com cautela para no molhar a tampa dela. As demais garrafas permanecem na caixa; a mesma é fechada com vela acesa. Verifique se não forma fumaça ao apagar. Retorne os cultivos para a estufa. Depois:

Aspire o meio de cultura. faça um esfregaço, core-o, analise o se há predominantemente formas anel. Retire os parasitas lavando com 12 ml 1x PBS e coloque dentro do tubo 15 ml. Acrescente 1,5 ml Saponina 1%. Incube 10 min no gelo, virando o tubo de vez em quando. Quando a solução estiver com cor de suco de groselha, centrifuge o tubo 10 min na

velocidade 2800 rpm (Sorvall) ou 4000 rpm (Eppendorf) no rotor swing out. Aspire e descarte o sobrenadante, mas visualize antes o pellet de parasitas e as membranas

acima do pellet. Deixe aprox. 500 µl no tubo. Os próximos passos devem ocorrer fora do fluxo.

Lave o pellet uma vez com 1 ml 1x PBS e transfira a solução para um tubo Eppendorf identificado como “3D7 ANEL, data”. Centrifuge-o a 12000 rpm,4 ͦC, 5 min.

Retire o sobrenadante e acrescente até 100 µl 1x PBS, resuspenda o pellet até a homogeneidade (sem grumos).

Acrescente 750 µl Trizol. Misture vortexando por 15-30 segundos, não pode sobrar nenhum grumo de pellet.

Guarde esta solução no freezer -20°C.

Arrume o fluxo laminar como descrito anteriormente.

Setup de uma ligaçãoNo próximo passo, ligamos os fragmentos de PCR purificados em um vetor de clonagem de produtos PCR (“A/T cloning vector”). O vetor escolhido é pGEM T easy (Promega). Coloque seu fragmento purificado no gelo. Na figura 5 está mostrado o mapa do plasmídeo com os sítios de restrição e os elementos contidos nele.

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Localize no gelo central os componentes do kit: vetor pGEM T easy (tampa amarela), 2x tampão de ligação (tampa branca) e a enzima T4 DNA ligase (tampa verde). O kit é caro e normalmente é suficiente fazer reações de ligação de 2.5 µl, desde bem pipetados. Prepare dois tubos com a identificação: “pGEM - Número do grupo ou gene amplificado”. Coloque 0,75 µl do fragmento purificado num dos tubos e escreva “L” na tampa, isso identificará que essa é a ligação. Utilize a pipeta P10.

Um voluntário/a preparará a solução “master mix”. Utilize a pipeta P10.

Ligação:

1x 7x

0.25 µl 1.75 µl Vetor pGEM T easy

1.25 µl 8.75 µl 2x Ligation buffer

0.25 µl 1.75 µl T4 Ligase

Cada grupo deve pipetar imediatamente 1.75 µl (Utilize a pipeta P10) da solução master em cima do seu fragmento no tubo marcado com “L” na tampa. Misture a minigotícula por “flicking” e aplique

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um short spin para coletar todo liquido no fundo do tubo. Incube o ensaio num banho de água a aprox. 10 ͦC. Em princípio, 90% dos fragmentos que podem ser ligados, estarão ligados dentro de ~15 min. Nós esperamos mais tempo para aproveitar as células competentes que estão crescendo para fazer a transformação.

Preparação de células E. coli competentesPara a preparação de células competentes é essencial possuir vidraria livre de sabão de qualquer tipo e plasmídeo. Isso significa que a vidraria deve ser fornada tempo suficiente para eliminar qualquer resíduo – 2 h a 180 ͦC. O segundo ponto essencial é que a partir do momento quando a densidade ótica ideal é alcançada, todas as manipulações devem ser no gelo (0-4 ͦC). As soluções devem estar pré-geladas para 0 ͦC. As centrifugas devem estar geladas e os tubos e ponteiras P200 de aliquotar utilizados também. O terceiro ponto é que as bactérias devem estar crescendo de forma logarítmica. Se achar que o inoculo não vai bem, prepare outro. Se a bactéria centrifugada possui muito material preto (bactéria morta) no fundo do tubo após centrifugação, descarte. Procure sempre fazer células competentes a partir de uma placa fresca (< 1 semana na geladeira). Nunca perca ou contamine sua cepa de bactérias, e tenha sempre um backup no nitrogênio liquido.

Prepare os tubos eppendorf onde vai congelar as bactérias depois com antecedência e guarde os no freezer -20 ͦC. Assim, os tubos das células DH10B devem ter uma “10” na tampa, as BL21 RIL um “RIL” e as XL1 blue MRF- um “XL”. Quando o cultivo chega a uma densidade ótica (600 nm) de 0.4, o cultivo é transferido para tubos Falcon 50 e colocado no gelo.

Centrifuge o cultivo por 10 min a 3500 rpm na centrifuga Eppendorf gelada, a 0 ͦC. descarte o sobrenadante ao máximo possível sem perder o pellet, invertendo o tubo para o

frasco do lixo liquido contaminado (pode ser um dos erlenmeyers do cultivo) devolve os tubos para o gelo. Resuspende o pellet com 1 ml CCMB80 buffer de forma suave. Acrescenta mais 15 ml em um tubo (pipeta descartável 10 ml) e 15 no outro tubo com uma

pipeta. Não contamine o tampão CCMB80. Transfira tudo ara um dos tubos, juntando os volumes com a mesma pipeta. Depois,

descarte-a. Incube por 20 min no gelo. centrifuge 10 min a 3000 rpm e 0 ͦC, depois descarte o sobrenadante. resuspende as células em 2 ml CCMB80 suavemente e sem esquentá-las, as células estão

fragilizadas neste ponto. retire 50 µl da solução e acrescente 200 µl LB e meça a DO 600nm, a solução deve dar uma DO

de 1 a 1,5. Se estiver mais alto, acrescente CCMB80 na solução estoque até chegar neste valor.

Incube mais 20 min no gelo. Sempre no gelo, aliquote com as ponteiras P200 geladas 125 µl da solução nos eppendorfs

gelados e previamente identificados na tampa. No final, os tubos com as bactérias são congelados por >30 min no -80 ͦC.

Tampão CCMB80: 10 mM KOAc pH 7.0 (10 ml de um estoque 1M), 80 mM CaCl 2.2H2O (11.8 g/L) 20 mM MnCl2.4H2O (4.0 g/L), 10 mM MgCl2.6H2O (2.0 g/L), 10% glicerol (100 ml/L) ajuste o pH para baixo até 6.4 com 0.1 M HCl se necessário. Esteril-filtrar e guardar no escuro a 4°C (pode formar um pouco de precipitado preto que não tem problema).

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Calculando competência das bactérias competentesA unidade que descreve a competência de bactérias e ó número de colônias formadas a partir de um µg de plasmídeo transformado, em inglês colony forming units per µg of plasmid (cfu/µg). Figura 6 ilustra de forma lúdica qual competência é desejável e qual é insuficiente.

Figura 6: Classificação de qualidade de células competentes. A partir de 105 cfu/µg as bactérias podem ser utilizadas para retransformação de plasmídeos prontos. Bactérias com 106 cfu/µg podem ser utilizadas para clonagens simples (fins coesivos). Bactérias com 107 cfu/µg podem ser utilizadas para A/T cloning e clonagens envolvendo fins blunt, e a partir de 108 cfu/µg as bactérias servem para construção de bibliotecas onde o número de clones tem que ser grande.

Para medir competência de células é necessário ter um plasmídeo quantificado e puro. O plasmídeo é diluído para quantidades por µl que resultarão em números contáveis – temos que estabelecer um valor de competência que esperamos e transformar tanto plasmídeo para que tenhamos um número representativo (entre 20 e 100) de colônias com o valor estimado de competência.

Calcule como tem que diluir um plasmídeo de 1.5 µg/µl para obter 30 colônias, assumindo que tem células com eficiência 106 cfu/µg. Transformamos 1 µl da solução contendo plasmídeo.

Transformação Prepare dois tubos Eppendorf escrevendo o nome do plasmídeo a ser transformado/clonado

na parede e coloque 1 µl da ligação ou do plasmídeo teste diluído (por lote de bactérias, um tubo teste deve ser transformado), coloque no gelo.

Para todos os grupos: Descongele no gelo duas alíquotas de bactérias DH10B e duas alíquotas de XL1 blue.

Acrescente 25 µl de DH10B aos tubos com ligação e ao tubo teste. Repita isso com 25 µl XL1 blue nos demais tubos. No final, cada grupo deve ter 2 tubos: 1 µl de cada ensaio de ligação transformando em DH10B e em paralelo em XL1 blue.

Um grupo deve diluir o plasmídeo teste (fornecido no ato) e transformar 1 µl diluído em DH10B e 1 µl em XL1 blue, para cálculo da competência.

Incube os tubos 30 min no gelo. Prepare placas com 4 µl 1 M IPTG e 20mg/ml X-gal (pode preparar um mastermix destas

soluções, espalhando com espátula Drigalski) Escreva em cada placa (no fundo) qual antibiótico tem (ex. LB-amp, LB-amp-tet, LB-amp-cam)

e qual bactéria transformada com qual plasmídeo está plaqueado. Depois transfira os tubos rapidamente para um banho Maria a 42°C, por exatos 60s. Retorne

os tubos ao gelo.

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Após 1-2 min, acrescente 125 µl de LB,feche o tubo e coloque o na estufa. Incube por 20min. Mediante espátula Drigalski, semeie as bactérias nas placas e coloque as na estufa 37°C.

Recolhimento de formas trofozoitaUm voluntário deve repetir exatamente o que foi feito com as formas anel de manhã. No final, deve se obter um pellet de parasitas maior que o de anel (o parasita aumentou seu volume) que é ressuspendido em PBS/Trizol LS.


Dia 4Metas do dia: Recolhimento de formas esquizonte, cálculo de eficiência de bactérias competentes através das placas com plasmídeo controle. Preparação de RNAs das três formas sanguíneas. Gel de RNA. Síntese de cDNA. Setup de PCR controle de qualidade e contaminação de cDNA. Inóculo de minipreps pGEM. Pegue um banho de gelo.

Recolhimento de formas esquizonteUm voluntário deve repetir exatamente o que foi feito com as formas anel de manhã. No final, deve se obter um pellet de parasitas maior que o de trofozoita e bem mais preto devido a hemozoina que é ressuspendido em PBS/Trizol LS.

Cálculo de competência das bactériasConte o número de colônias na placa. Considere a quantidade de DNA em µg na placa. Divide o número de colônias por µg e compare o resultado com a escala da Figura 6. Na placa com transformações com pGEM, observe a aparência de colônias: Elas estão uniformes ou polimórficos em tamanho? Quais cores observa?

Depois guarde as placas na geladeira (ou deixe na bancada se o tamanho das colônias for ainda inferior a 1 mm em diâmetro).

Purificação de RNA de parasitasNeste procedimento é necessário ter total atenção a partir do momento quando a primeira precipitação de RNA ocorre, porque o ambiente está repleto de RNAse. Todas as partes de dentro do tubo eppendorf incluindo a borda e a parte interna da tampa não devem ser tocados direto com o dedo. Quem não estiver seguro, deve usar luvas.

Descongele o RNA no banho seco a 37 °C ou temperatura ambiente Vortexar 15 segundos deixar 15 min de repouso acrescentar 200 µl de clorofórmio RNAse free, fechar tubo misturar mexendo por 30 segundos, deixar repousar 15 min centrifugar a 4°C, 12000 rpm, 15 min transferir o sobrenadante para um tubo identificado "RNA 3D7 trofo/anel/esquizonte",

acrescente 500 µl Isopropanol 100 % RNAse free deixar repousar 45 min a temperatura ambiente ~20-25°C.

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centrifugar 60 min ("over lunch") a 12000 rpm, 4°C, oriente o flap da tampa do tubo para fora (para depois saber onde é para esperar o pellet!)

Remove o sobrenadante, virando o tubo em cima do lixo liquido. Acrescente 500 µl EtOH 75% RNAse free, não precisa misturar Centrifuge novamente 5 min 12000 rpm, 4 °C depois descarte o sobrenadante por completo

(short spin e tirar o resto do liquido com P200) deixe o pellet secar a TA. Ressuspenda o pellet em 20 µl de água MilliQ fresca e RNAse free (direto do aparelho MilliQ). Neste ponto, pode congelar o RNA a -80 °C. Como procedemos direto para síntese de cDNA,

amarre o tubo no vortex e deixe rodar por 10 min a média força (regule para que a gotícula permaneça mais ou menos no fundo do tubo). Depois guarde o tubo no gelo.

Teste de qualidade do RNA em gel TBEPara averiguar que não ocorreu nenhuma degradação precoce do RNA por RNAses contidas na amostras ou introduzidas no meio da purificação, 2 µl do RNA são misturados com 3 µl de água milliQ limpo em um tubo novo com 1 µl tampão de corrida especial para géis TBE (6x loading buffer apenas com glicerol e azul de bromofenol). Um voluntário deve preparar o gel de 1x TBE igual 0,8% a um gel de TAE agarose (com brometo), mas deve usar a cuba especial de RNA que é manuseada apenas com luvas. O tampão de corrida e 1x TBE. Carregue e corra o gel 30 min e documente o resultado no “eagle eye”.

Síntese de cDNANo próximo passo, sintetizamos a fita complementar ao RNA (complementary DNA, cDNA) mediante a enzima transcriptase reversa (RT), uma enzima encontrada em retrotransposons e alguns vírus com genoma RNA, como por exemplo HIV, HTLV1, Rous Sarcoma vírus e o Moloney Murine Leucemia vírus (MMuLV). A última foi otimizada para fins de Biologia Molecular. Transcriptases reversas possuem comumente duas atividades: A função DNA - polimerase 5´-3’ RNA-dependente e a função RNAse H, que é RNAse 5’-3’ DNA-dependente (Figura 7).

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Figura 7: Atividades da RT (RNAse H+). Note que a enzima necessita de um primer de DNA para iniciar a síntese de DNA. Neste caso o primer é um oligo dT que hibrida em todos os RNAs com um longo trecho de As, como comumente encontrado em transcritos (RNA mensageiro).

Existem no mercado enzimas RT com e sem função RNAse H. Nos utilizamos a versão com RNAse H. A função da RNAse H é importante para posterior amplificação por PCR de fragmentos acima de 1000 nt. Também existem vários métodos para síntese da primeira fita de DNA, no exemplo em figura 7 usa-se um oligonucleotídeo oligo dT (dT18). Quando é necessário analisar qualquer RNA contido na célula, utiliza se DNA hexamérico randômico (dNdNdNdNdNdN = dN6). Em casos onde a quantidade de RNA é muito limitada e/ou existe muito RNA não relevante (organismos intracelulares, recolhidos com muito RNA do organismo hospedeiro), pode-se usar oligos específicos antisense ao gene que é para ser testado. Em nosso caso utilizamos DNA hexamérico randômico.

Cada RNA recolhido por Trizol LS no método batch como utilizado aqui pode resultar em contaminação com DNA que pode posteriormente atrapalhar ou falsificar (contaminar como substrato) análises do cDNA por PCR. Por isso, incluímos um passo onde o RNA é tratado com uma DNAse 1 que degrada seletivamente DNA contaminante na nossa preparação de RNA.

Tratamento de DNAse1 e transcrição reversa Localize tampão DNAse1 e EDTA 50 mM, coloque-os no gelo. Prepare um banho de água a 20°C num isopor com tampa, tenha um flutuador para colocar

tubos ligue o banho seco a 65°C. Pipete com a P20 num tubo fresquinho:

o X µl da preparação RNA (julgar a partir do resultado do gel TBE)o Y µl água milliQo 1 µl DNAse buffero 1 µl DNAse 1 (direto do freezer, não mantenha a enzima no gelo), short spin.o incube por 15 min a 20°C.o após 14 min, prepare num tubo adicional 4 µl de água milliQ, 0.5 µl DNAse 1 buffer e

0.5 µl de DNAse 1, acrescente isso no ensaio (Vtotal= 15 µl), short spin.o incube por mais 15 min a 20°C.o após 14 min, prepare num tubo adicional 4 µl de água milliQ, 0.5 µl DNAse 1 buffer e

0.5 µl de DNAse 1, acrescente isso no ensaio (Vtotal= 20 µl), short spin.o incube por mais 15 min a 20°C, depois transfira para o gelo.o acrescente 2 µl da solução de EDTA, short spin.o aquece a solução por 10 min a 65°C, depois coloque no gelo.

Enquanto a DNAse 1 está sendo desnaturada, prepare dois tubos novos por RNA, identificando “Anel +RT, anel –RT, trofo +RT, trofo –RT, esquiz +RT, esquiz –RT”. Descongele/localize os tubos 5X RevertAid buffer, 10 mM dNTPs. Pipete nos tubos marcados com “RT-“:

10µl DNAse1 RNA 2 µl random oligos (10 pmol/µl) 12,5 µl H2O aquece por 5 min a 65°C coloque no gelo, depois short spin.

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acrescente 4µl dNTPs 10 mM (não confunda com os dNTPs do PCR que são 2.5 mM) acrescente 8 µl reaction buffer 5X acrescente 2µl RNAse inhibitor transfira 28.5 µl em tubo marcado “RT+”. acrescente neste tubo 1.5 µl RevertAid, misture por flicking, short spin, e incube 5 min a

temperatura ambiente. transfira o tubo para um banho seco ou Maria a 42°C e incube por 50 min.

Quando terminada a reação, os ensaios podem ser congelados ou utilizados para testar a viabilidade do cDNA e a ausência de contaminação do RNA com gDNA após tratamento com DNAse 1. Para facilidade, o laboratório possui um “kit teste” para cDNA de P. falciparum que consiste de um PCR mix pronto e para completar a reação é necessário apenas acrescentar cDNA e Taq Polimerase. O gene amplificado, seryl-tRNA synthetase, também será utilizado como calibrador interno na posterior reação de PCR em tempo real. Localize o tubo “1x K1 Mix”. Um voluntário deve pipetar esta reação. São três cDNA a serem testados (3 tubos cDNA RT+, e 3 controles RT-) plus um controle positivo (gDNA de P. falciparum 3D7) e um controle negativo (água).

Prepare um strip tube com 8 tubinhos e escreva aos lados de cada tubo na sequencia o que pipetará lá dentro: a(nel RT)+, a(nel RT)- etc.

coloque 8x 15 µl 1x K1 mix = 120 µl no tubo “con(trole)-“ acrescente neste tubo 8x 0.08 µl = 0.64 µl (P20! não P10) Taq Pol, fique com a ponteira. regule o volume para 15 µl e aliquote 15 µl em cada tubo. acrescente 1 µl de cada substrato (cDNAs ou RT- controle, gDNA) nos tubos individuais. feche os tubos com “tampa strip” insere no termociclador, programa:

o 94°C 40 so 54°C 40 so 72°C 40 s

29 repetições (30 ciclos).

A reação vai ser analisada no dia seguinte e pode permanecer no termociclador sem refrigeração durante a noite. Inocule agora os minipreps para amanha dos clones pGEM recombinante com seu gene amplificado, faça 6 clones por placa (assim cada grupo tem 6 minipreps).

Utilize 1.5 ml TB amp liquido para crescer os minipreps em tubos 15 ml previamente identificados (podem ser tubos usados limpos). Utilize a alça microbiológica para inocular os cultivos. Incube os cultivos inoculados com tampa não totalmente fechada no shaker orbital a 37°C.


Dia 5Metas do dia: Fazer minipreps, correr gel analítico do PCR com cDNA. Preparação quantitativa de pGEX2T BamH1/EcoR1, análise e restrição quantitativa BamH1/EcoR1 dos minipreps pGEM, purificação e ligação em pGEX2T, transformação em DH10B/XL1 blue.

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Minipreparação de DNA plasmidial (segundo Sambrook et al. 1991, [9])A minipreparação de plasmídeos é uma tarefa essencial e importante em cada laboratório de Biologia Molecular e deve ser conduzida com boa qualidade para que haja facilidade no manuseio dos plasmídeos depois (subclonagem, sequenciamento etc.). O procedimento consiste da troca de solvente das bactérias para um tampão isotônico e posterior lise com sabão e álcali para desnaturação parcial de plasmídeos e total de gDNA e depois precipitação de complexos sabão/gDNA e renaturação dos plasmídeos. Depois há eliminação de sais e contaminantes por precipitação com isopropanol e Etanol a 70%.

- Inocular de uma placa LB-amp Agar, contendo colônias de bactérias transformadas com seu plasmídeo, uma colônia em 1,5 ml LB-amp ou LB-amp/tet (Bactérias Sure, XL1 blue MRF -), e incubar no shaker deitado com tampa semi-aberta por 10-16 h (150-200 rpm).

- Peletar 1.5 ml de cultura (12000 rpm, 1 min), descartar sobrenadante

- Dissolver pellet em 200 µl tampão 1 (vortex)

- Lisar as bactérias adicionando 400 µl tp. 2 (10 min RT, mexer gentilmente invertendo o tubo)

- Precipitar proteínas adicionando 300 µl tp. 3 (mexer forte, depois 5 min no gelo)

- Peletar proteínas 5 min 12000 rpm, 4°C

- Retirar sobrenadante para novo tubo e precipitar adicionando 600 µl Isopropanol, inverter o tubo umas 5 vezes para misturar (opcional deixar 10 min a RT)

- Peletar (5 min, 12000 rpm, 4°C ou TA)

- Lavar o pellet com 1 ml EtOH 70%, centrifugar 2 min 12000 rpm, TA.

- Secar pellet a TA, ressuspender com 50 µl TE/RNAse 10 µg/ml

- Analisar 2-4 µl por restrição e/ou gel de agarose com fragmentos esperados acima de 1000 nt, e 4-6 µl abaixo de 1000 nt.

Análise de restrição de plasmídeosNo próximo passo tentamos verificar se o fragmento desejado de fato foi inserido no vetor pGEM T easy. Observe novamente o mapa do plasmídeo nas paginas anteriores e desenhe como seria o plasmídeo com o seu inserto, não esqueça que seu inserto introduz no 5' dele uma sitio BamH1 (GGATCC).

Vamos analisar os clones obtidos no miniprep da forma que já podemos excisar do gel o pedaço de DNA de interesse para subclonagem no vetor de expressão de proteína recombinante em bactérias

Tampão 1 miniprep: 10 mM Tris/HCl pH 7,5 ou 8, 1% Glicose (w/v), 25 mM EDTA pH 8,

Tampão 2: 0,2 M NaOH, 1% SDS.

Tampão 3: 3 M Acetato de potássio, 5 M Acido acético

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E. coli. excisar o fragmento contendo o fragmento do gene respectivo de cada grupo da maneira como segue (por reação):

6 µl Miniprep DNA Mastermix?

1.5 µl tampão "3" µl

0.4 µl EcoR1 µl

0.4 µl BamH1 µl

6.7 µl H2O µl

incubar o ensaio por 2 h a 37°C (estufa).

Cada grupo deve analisar seus 6 minipreps desta maneira. Use o princípio mastermix para pipetar as digestões. Depois corra um gel 1% agarose TAE e excise de uma das digestões a banda que corresponde ao seu fragmento (400-1000 bp) e purifique com Glassmilk como descrito anteriormente (capítulo PCR). O grupo 4 deve digerir em paralelo o vetor vazio pGEX2T (crescido na placa teste de competência) com as mesmas enzimas e deve purificar a banda única formada (em torno de 5 kB).

Ligação de fragmentos com sticky ends (finais coesivos)Após a purificação de vetor e inserto vamos proceder para ligação do fragmento excisado do gel com o vetor pGEX2T. Em figura 8, a região polylinker deste plasmídeo está destacado.

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Figura 8: Mapa do plasmídeo pGEX2T. LacI codifica o repressor lac que reprime o tac promoter.

A ligação de fragmentos com finais coesivos (Sticky ends) ocorre num tampão de ligase levemente diferente da ligação de fragmentos PCR (vide anterior). O tampão consiste de Tris/Cl a pH8, ATP, MgCl2 e Ditiotreitol, mas não contem polietilenglicol que condensam moléculas DNA (como o tampão da ligação em pGEM T easy). Antes da ligação, os fragmentos mantidos no gelo são aquecidos por 3 min a 42°C para desfazer quaisquer dímeros/oligomeros de moléculas interagindo consigo formando concatámeros não ligados. Pipete:

tubo "Lig +" "Lig controle"

vetor pGEX2T digerido com BamH1/EcoR1 0.5 µl 0.5 µl

Inserto digerido com BamH1/EcoR1 1.5 µl --

_______________________ aquece a 42°C por 3 min e retorne os tubos ao gelo. Acrescente:

água milliQ 2.3 µl 3.8 µl

Tampão ligase 10x 0.5 µl 0.5 µl

Ligase 0.2 µl 0.2 µl

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Aplique um short spin e coloque os ensaios num banho de água fria (10°C) num isopor. Incube por 30 min. Depois, transforme 1 µl de cada ensaio em bactérias competentes DH10B ou XL1 blue MRF- como descrito acima. As placas serão recolhidas no sábado de manhã e colônias serão inoculadas no domingo a noite.

Análise de viabilidade do cDNA produzidoNeste passo, olhamos se o cDNA está de boa qualidade. Prepare um gel de TAE Agarose 1.5%. Carregue o gel com os produtos de PCR da reação do cDNA com oligomix K1. Verifique tamanho e intensidade de bandas formadas. Verifique se não há produtos nas canaletas com produtos das reações "-RT".

Cheque sua bancada e limpe-a antes de sair. Guarde os produtos e soluções na geladeira ou no freezer e descarte seu banho de gelo. Até segunda feira!

Dia 6Metas do dia: Minipreps e análise dos clones pGEX2T recombinantes. Setup da reação de sequenciamento. Seminários sobre sequenciamento da próxima geração (Plataforma SOLiD, grupos 1-2, Plataforma 454, grupos 3-4, e IonTorrent 5-6), Retransformação de clones recombinantes pGEX2T em E. coli BL21 RIL.

Minipreps dos pGEX2T recombinantesAnalise o desempenho dos minipreps através da contagem de colônias na placa com controle negativo (pGEX2T sem inserto) e na placa com plasmídeos recombinantes (pGEX2T + inserto). Recolhe os minipreps que foram crescidos e purifique os plasmídeos pGEX2T recombinantes conforme o protocolo anterior. Analise a presença de inserto mediante teste de restrição (clivagem com BamH1 e EcoR1) conforme feito com os clones pGEM recombinantes, descrito anteriormente. Quando pronto, escolha dois clones para retransformação em E. coli BL21 RIL e sequenciamento.

Sequenciamento de plasmídeos pelo método de Sanger (dideoxy)Para averiguar se não houve a introdução indevida de mutações nos fragmentos amplificados por PCR (a Taq Polimerase introduz ≥1 erro por 1000 bp sintetizados), checamos a integridade do fragmento clonado por sequenciamento semi-automático na plataforma ABI 3100. O sequenciamento de DNA pelo método de Sanger, desenvolvido em 1976, inclui a síntese de DNA a partir de um primer e uma moldura (fita simples) usando uma DNA polimerase e a presença de nucleotídeos dideoxy que são randomicamente incorporados. No caso do sequenciamento no ABI 3100, estes nucleotídeos dideoxi são marcados com fluoroforos que emitem luz de quatro cores diferentes dependendo do nucleotídeo dideoxi. Por exemplo dideoxi “A”s emitem luz verde, dideoxi “C”s emitem luz amarela etc., e a emissão de luz destas cores diferentes é medida e computada no aparelho para gerar a sequencia do DNA analisado. Na figura 9, o princípio do sequenciamento segundo Sanger é mostrado.

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Figura 9: Princípio de sequenciamento dideoxi. Note que a incorporação randômica de terminadores (nucleotídeos dideoxi marcados) leva a produção de vários tamanhos de fragmentos de DNA marcados com cores correspondentes ao seu último nucleotídeo. Estes fragmentos são separados em matrizes adequados (géis de poliacrilamida, resina especifica etc.) e analisados por lasers e leitores de luz.

Para conduzir um sequenciamento, utilizamos o protocolo dos componentes do kit de sequenciamento (BigDye 3.1, Applied Biosystems). A reação é pipetada desta maneira em tubos de PCR 0.2 ml:

Miniprep pGEX2T recombinante 2 µl

Mix primer “pGEX seq” (1,25 pmol/µl) 4 µl

BigDye Mix (fornecido) 4 µl

O ensaio é submetido a uma reação de PCR no termociclador da sala de sequenciamento do Dep. Parasitologia no ICB2. Após a reação, são acrescidos 90 µl de Isopropanol 66% e o ensaio e centrifugado a 12000 rpm por 20 min a TA. Use caçapas para centrifugar os tubinhos (tubo 0.5ml em tubo 1.5 ml com tampas cortadas). Após a centrifugação, descarte o sobrenadante (virando o tubo no descarte liquido) e acrescente 100 µl de Isopropanol 75%. Centrifuge mais 10 min a 12000 rpm e TA. Posteriormente, o sobrenadante é descartado (pode retirar o liquido com uma ponteira P20 sem perturbar o pellet invisível) e o pellet é seco no escuro (o cromóforo é instável na luz) e entregue ao técnico que opera o sequenciador.

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Retransforma agora os dois plasmídeos (0.5 µl) que são sequenciados em E. coli BL21 conforme feito anteriormente. Marcando no fundo da placa, divide-a em duas metades e plaqueie as duas transformações na mesma placa nas metades separadas. Não esqueça colocar cloranfenicol (34 ug/ml final) e ampicilina (100 µg/ml) na placa. Coloque as placas na estufa 37°C.


Dia 7Metas dos dia: Inocular pré-inóculo e inóculo principal em LB-amp-cam, induzir bactérias e recolher. Análise de sequências no computador, montagem de plasmideo in silico no programa APE.

Produção de proteínas recombinantes com GST – 1. crescimentoA partir das placas feitas no dia anterior, inocule uma colônia de uma das metades em Erlenmeyer 50 ml com 5 ml de LB-amp-cam liquido (preaquecido para 37°C) suplementado com 100 µl de Glicose 40% e transfira o cultivo no shaker 37°C. Cresça por 2 h. Após este período, cheque se o meio ficou levemente turvo e transfira para um Erlenmeyer 500 ml com 50 ml LB-amp-cam (preaquecido) e continue crescendo a 37°C. Quando o cultivo chegar numa densidade ótica (600 nm) de 0.6, acrescente 10 µl IPTG 1 M (fornecido) e transfira o cultivo para o shaker orbital à temperatura ambiente. Continue crescendo por 3 h. Depois deste tempo, recolha as bactérias por centrifugação em tubos Falcon 50 ml por 15 min a 2800 rpm. Acrescente 2 ml tampão PBS-1% Triton suplementado com lisozima (100 µg/ml), incube 5 min na bancada mexendo periodicamente e depois congele a -20°C no freezer.

Análise de sequências no computadorAs sequências dos plasmídeos são entregues em formato *.ab1 que podem ser abertos em programas que leem este formato. Para facilitar, as sequências são analisadas pelo supervisor do curso pelo programa DNAstar que inclui uma avaliação da qualidade da sequência. Depois as sequências são entregues aos grupos (email) e analisados individualmente, usando os sites do PlasmoDB e do NCBI. Grupos com resultado ruim no sequenciamento devem copiar a sequência correta a partir da sequencias dos oligos utilizados da internet (plasmoDB). A partir das sequências de cada grupo, prosseguimos a montagem do plasmídeo no programa APE (download da internet).


Dia 8Metas do dia: Purificação das proteínas recombinantes. Preparação de géis SDS poliacrilamida. Coomassie staining e transferência. Quantificação de proteínas por teste de Bradford.

Produção de proteínas recombinantes com GST – 2. purificaçãoA partir dos pellets lisados das bactérias que produziram proteínas recombinantes, purificaremos num procedimento one-step as proteínas que contem o domínio GST. Aproveitamos neste contexto o fato que este domínio possui uma grande afinidade para glutationa reduzida. Desta maneira,

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proteínas solúveis são expostas à glutationa reduzida imobilizada numa resina que depois é lavada exaustivamente para retirar proteínas que não interagiram. O procedimento é como segue:

Descongele a solução de bactérias congeladas do dia anterior, banho Maria verifique se a solução está muito viscosa (DNA genômico da bactéria) e em princípio

transparente Utilizando uma seringa 5 ml com agulha G21, passe a solução 10 vezes pela agulha sem fazer

espuma, assim aplicando um shearing na gDNA bacteriano. A solução não pode mais estar viscosa.

Acrescente mais 3 ml de PBS-Triton 1% e centrifuge por 15 min a 4°C e 2800 rpm (Sorvall). Transfira o sobrenadante para um tubo 15 ml novo. Acrescente 200 µl slurry (50% em PBS, fornecida) de glutationa sepharose. incube na gangorra por 1 h. Feche bem o tubo para isso. depois centrifuge a 1500 rpm na Sorvall por 1 min descarte o sobrenadante com a pipeta

P1000. Suas proteínas estão associadas a resina neste momento. Acrescente 15 ml PBS-Triton X100 e ressuspenda a resina, invertendo o tubo uma vezes. depois centrifuge a 2000 rpm na Sorvall por 1 min descarte o sobrenadante virando o tubo

cuidadosamente - não perca resina. Acrescente 15 ml PBS e ressuspenda a resina, invertendo o tubo uma vezes. depois centrifuge a 2000 rpm na Sorvall por 1 min descarte o sobrenadante virando o tubo

cuidadosamente - não perca resina. repita os últimos dois passos mais uma vez. Tente ficar com apenas ≤ 200 µl resina compactada. Acrescente 500 µl de elution buffer (50 mM Tris pH 7.5, 10 mM Glutationa reduzida) e

misture com a P1000, transferindo para um tubo Eppendorf, levando toda resina junto. Incube mais 30 min a TA, mexendo de vez em quando (vortex lento) Depois, precipite a resina centrifugando a 12000 rpm, 1 min a TA. Transfira o sobrenadante

para um tubo novo marcado “GST<sua proteína>” e guarde a proteína no gelo.

Preparação de gel SDS-PAGE (SDS polyacrylamid gel electrophoresis)Um passo importante após a purificação das proteínas recombinantes é o controle se há impureza na preparação e se a proteínas desejada foi produzida com proteína completa ou truncada – o que é frequente para proteínas de P. falciparum. Vamos fazer 3 géis com o mesmo conteúdo (6 proteínas recombinantes produzidas, GST pura (fornecida) e peso molecular): Um será corado para visualizar as proteínas, e as outras serão transferidas para membranas de nitrocelulose para posteriormente verificar se elas são reconhecidas por anticorpos em plasmas de i) pessoas infectadas ou ii) nunca infectadas. O sistema de gel será o descontinuo proposto por Laemmli [10] e consiste de um gel de baixa porcentagem de acrilamida e baixo pH (6.8, stacking gel) para concentração de proteínas e um gel de alto pH (8.8) e mais alta porcentagem de acrilamida (6-15%, running gel) para separação nítida de proteínas. Como as proteínas aqui purificadas terão um peso entre 30 e 60 kDa, uma porcentagem do running gel de 10% é adequada.

Antes de começar, familiarize se com o aparelho que conterá os géis (sistema Mini Protean BioRad) e monte as placas. Marque até onde tem que encher com running gel. Depois prepare as duas soluções do running e do stacking gel.

(Um voluntário para todos os grupos) Use luvas. Pipete num tubo 50 ml:

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4x Running gel buffer 3.75 ml (1.5 M TrisCl pH 8.8, 0.4% SDS)

Acrilamida 40% 3.75 ml

Água MilliQ 7.5 ml

TEMED 90 µl

Acrescente 120 µl de uma solução fresca de 10% persulfato de amônio e despeje imediatamente o liquido entre as placas até a marca. Depois acrescente devagar 1 ml de 20% metanol/azul bromofenol acima do gel. Deixe polimerizar – monitore a polimerização no restante da solução running gel.

(Um voluntário para todos os grupos) Use luvas. Pipete num tubo 15 ml:

4x Stacking gel buffer 1.5 ml (0,5 M TrisCl pH 6.8, 0.4% SDS)

Acrilamida 40% 0.7 ml

Água milliQ 3.7 ml

TEMED 60 µl

Acrescente 60 µl da solução fresca de 10% persulfato de amônio e despeje imediatamente o liquido entre as placas até a 1 mm abaixo da borda das placas. Insere o pente. Deixe polimerizar – monitore a polimerização no restante da solução stacking gel.

Prepare 2 litros de 1x Running buffer (0.192 M glicina, 0.025 M Tris, 0,1% SDS) do 10x Running buffer que não contem SDS. Aliquote 45 µl da sua proteína recombinante em um tubo Eppendorf e acrescente 15 µl 4x Loading buffer (fornecido, 0,25 M TrisCl pH6.8, 6% SDS, 20% glicerol). Aquece esta mistura em banho seco a 95°C por 5 min. Depois de retornar a TA, aplique um short spin.

Coloque os géis no aparelho e acrescente 1x running buffer nos reservatórios: Os eletrodos tem que estar cobertos por liquido e o gel deve ter contato com liquido na parte de cima. Observe o tampão do reservatório do meio: não pode vazar. Agora tire o pente com cuidado e lave os buracos com uma seringa de 2 ml armado com agulha fina. Depois aplique as amostras previamente aquecidas, mas anote antes a posição de cada proteína aplicada em relação ao peso molecular (fornecido) num papel. Deixe os géis correrem a 120 Volts e desligue quando o azul bromofenol acaba de sair do gel (1-1.5 h).

Depois da corrida, usando luvas retire inicialmente 1 gel das placas, cobra-o com solução Coomassie brilliant blue (1% Coomassie brilliant blue, 50% metanol, 7.5% ácido acético - in água) e coloque tudo por 15 seg na microonda e depois incube no shaker orbital por 15 min a TA. Depois, coloque no tampão de descorar (20% metanol, 10% ácido acético, in água). Enquanto este gel incuba, os outros dois géis são preparados para transferência para uma membrana de nitrocelulose reforçada (Hybond C). O setup para esta transferência é como segue em Figura 10. Este procedimento será supervisionado.

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Figura 10: Montagem de gel SDS-PAGE para transferência em membrana. Note que o gel deve estar ENTRE o eletrodo "preto" e a membrana. Inverter significa transferir as proteínas para o tampão e perder.

Por favor, todo mundo que pode observar deve prestar atenção se a pessoa que manipula molhou a membrana em tampão de transferência (1x running buffer sem SDS + 10% metanol) não i) introduz bolhas de ar entre membrana e gel ii) transfere as proteínas para o tampão/papel de filtro. Quando montado o sandwich, o mesmo é transferido para o modulo do aparelho e o tanque é enchido com 1x Running buffer/metanol. Como regra para o campo elétrico sob qual proteínas em gel deve ser transferidas vale: 1 V por cm2 de gel. Normalmente, transferências a 80 Volts por 1 h são suficientes.

Depois de transferir, o aparelho é desmontado e lavado em água deionizada e a membrana e brevemente banhada no corante Poinceau (0.2 g Poinceau, 1 % ácido acético em água). As proteínas transferidas devem aparecer coradas. Depois as membranas são exaustivamente lavadas com água deionizada, colocadas úmidas em vitafilme e congeladas até o dia seguinte.

Teste de BradfordPara medir a quantidade de proteína obtida na expressão, é conduzido o teste de Bradford em microplaca de 96 pocinhos. Para isso, cada grupo deve fazer uma diluição seriada de 20 µl de 0,1% BSA (1 µg/µl) com 5 pontos (Isso é: 1 poço 40 µl de BSA 0.1%, segundo a sexto poço 20 µl de PBS). Depois 20 µl são pipetados com a P20 para o segundo poço, misturados (pipetar 5 vezes) e a mistura é levada para o terceiro poço, misturado, em assim seguindo até o quinto poço do qual 20 µl afinal são descartados. O sexto poço apenas conterá PBS. Coloque agora 20 µl da sua proteína e uma diluição 1:2 da mesma em poços ao lado da diluição seriada de BSA. Acrescente a cada poço 180 µl de uma solução de Bradford (BCA reagent) diluida 1:4 em PBS (1 parte BCA + 3 partes de PBS). Meça o resultado no fotometro de placas a 595 nm. Analise o resultado fazendo um gráfico em Excel com os valores da curva padrão (valores de BSA) e determine assim a quantidade da sua proteína.

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ELISA, 1: CoatingCom o resultado em mãos prossiga agora para colocar em 11 pocinhos (horizontal) de uma microplaca 0.2 µg por pocinho (em 50 µl) diluido em coating buffer (tampão carbonato de sódio 50 mM, pH 9.6). Da mesma maneira, coloque na última coluna 0.2 µg/pocinho de GST recombinante (fornecido). Depois de todo mundo ter colocado a respectiva proteína, a placa é tampada e colocada na geladeira.


Dia 9Metas do dia: Conduzir e revelar o imunoblot, medir a reação de plasmas de indivíduos infectados e não infectados em ELISA.

WesternblotNeste experimento checamos se um indivíduo exposto e um individuo não exposto possuem anticorpos contra especificamente as proteínas recombinantes transferidas para as membranas. O principio é o seguinte: Após bloqueio de sítios de ligação da membrana por incubação com uma solução proteica (neste caso leite desnatado 4% em PBS com 0.1% Tween20 - um detergente não-iônico) por 1 h, depois o antissoro é colocado e os anticorpos lá contidos reconhecem as proteínas ou não, e depois lavagens um anticorpo anti-IgGhumano conjugado a uma enzima capaz de uma reação colorimétrica ou luminescente é aplicado. Em Figura 11 é mostrado esquematicamente como o imuno (Western) blot funciona.

Figura 11: Principio do Western blot. Os conjugados podem ser fosfatase alcalina, peroxidase ou cromóforos como por exemplo Cy5 ou GFP.

Manipule as membranas que saíram da transferência apenas com pinça ou luvas. Tendo as duas membranas com as diferentes proteínas, colocamos nas duas primeiramente uma solução de 4% de

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leite desnatado ("Molico") em PBS/Tween 20 0.1% (PBS-T, fornecido). As membranas devem estar cobertas com líquido (20 ml por membrana, em duas caixas).

Incube as membranas por 1 h a TA na gangorra Lave as duas membranas com 30 ml PBS-T, 5 min na gangorra. Aplique 10 ml de PBS-T 1% leite numa membrana (marque na caixa "AS") e 10 ml PBS-T 1%

leite na outra membrana (marque "neg" na caixa). Acrescente 5 µl de plasma "AS" na caixa AS e 5 µl de plasma "neg" na caixa neg. Incube 1 h a TA na gangorra.

Descarte o liquido com anticorpo num tubo falcon 15 ml e guarde-o no gelo. Lave a membrana 3 vezes como no segundo passo, descartando o PBS-T toda vez. Aplique 10 ml de PBS-T 1% leite na membrana, e acrescente 5 µl de antiHuman IgG

peroxidase Incube 1 h na gangorra, depois descarte a solução. Lave a membrana 3 vezes como no segundo passo, descartando o PBS-T toda vez. Uma

pessoa deve se dirigir ao fotodocumentador e ligar a câmera para esfriar. Tire a membrana da caixa e coloque num pedaço de vitafilme ~4 vezes o tamanho da

membrana (tem que ser possível dobrar o vitafilme em cima do gel) e embrulhe a membrana molhada.

Prepare a solução de revelador: 1 ml Luminol + 1 ml de agua oxigenada em tubo eppendorf de 2 ml.

Junta as membranas empacotadas, uma P1000 com ponteiras, luvas, um velho recibo de supermercado, e a solução reveladora misturada no eppendorf 2 ml, e um pendrive e se dirige ao fotodocumentador.

Tire a foto da membrana (supervisionado pelo técnico/assistente), e grave a série no pendrive.

de volta no lab limpe as caixas com água deionizada.

ELISA 2. revelarAs proteínas colocadas nos pocinhos aderiram fortemente ao plástico da placas 96. Neste momento vamos detectar se há anticorpos num número de soros de pessoas expostas a malária (ou se nossas proteínas são de fato reconhecidas por plasmas ou não). Localize na mesa central: Plasmas no gelo, PBS-T 4% (mesmo do western blot), PBS-T 1%. PBS-T na pisseta, Eppendorfs, papel toalha.

Inicialmente jogue a solução do coating fora (na pia) e lave os pcinhos uma vez com PBS-T da pisseta.

Bate a placa no papel toalha na mesa para retirar o resto do liquido. Coloque 50 µl de PBS-T 4% leite por pocinho que recebeu alguma proteína e incube coberto

a TA por ao menos 30 min.

Devemos ter 7 proteínas na placa (6 de cada grupo plus GST puro). Cada pocinho é carregado com 50 µl de solução de anticorpos durante o ensaio, calcule quanta solução de anticorpo em PBS-1% tem que usar se o anticorpo é para diluir 1:500. Faça essa diluição calculando um pocinho a mais (compensar erro da pipetagem.)

Lave os pocinhos uma vez com a pisseta com PBS-T Aplique os plasmas diluidos 1:500 em PBS-T leite em colunas (lembrando que as linhas

horizontais contém as proteínas diferentes - assim cada plasma reage com cada proteína)

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Incube coberto por 1 h a TA. Prepare o conjugado anti-human IgG -mesmo do Western blot- numa diluição 1:1500 em 15

leite PBS-T e guarde no gelo, volume para 90 pocinhos Descarte o liquido virando a placa na pia e lave os pocinhos com PBS-T como anterior. Lave mais 4 vezes, depois da ultima lavagem, bate a placa no papel toalha no final. Aplique 50 µl da solução do conjugado em leite PBS-T e incube por 1 h. Descarte o liquido virando a placa na pia e lave os pocinhos com PBS-T como anterior. Lave mais 4 vezes, depois da ultima lavagem, bate a placa no papel toalha no final. Prepare o revelador: solução TMB e solução água oxigenada 2.5 ml de cada num recipiente

banquinho limpo. Prepare outro recipiente banquinho com 1 M HCl CUIDADO Usando a pipeta multicanal, aplique 50 µl do substrato, ligue o timer "countdown" em 5 min

antes de aplicar na primeira fileira. Não precisa trocar as ponteiras. Depois de aplicar em todos os pocinhos, descarte as ponteiras. Arme imediatamente a multicanal com novas ponteiras. Observe a formação de cor azul. Quando pocinhos ameaçam entrar em saturação antes dos

5 min, pare a reação aplicando 50 µl de HCl. Com a placa revelada se dirige a um fotômetro de placa para medir o resultado.

Mostre os resultados num gráfico 3D em Excel descontando de cada valor obtido em proteína recombinante do valor obtido em GST.


Dia 10

Atividades do dia: Seminário grupos 1-3: Sistema de expressão em baculovirus - técnica, Grupos 4-6: Sistema de expressão em Pichia pastoris - técnica.

Help desk - questões e respostas sobre os experimentos.

Avaliação escrita

Avaliação do curso: o que pode ser melhorado?

Anexo: Oligos utilizados para amplificar genes MSP3, MSP4, MSP9, MSP10, EBA175 EBA140 e PfD0020c de P. falciparum.

Genes Proteins Expressed parts

Peptide characteristics

Immune epitopes Primers pairs

PFB0310c MSP4 Exon 1 C B and T F_GGATCCGGGGAAGAAAAACCAAATGTGGR_CTACCTTTTTAGGGATAGCTTC

PF10_0345 MSP3 C--terminal C B F_GGATCCACTGGTAATGATTTTAGTGGTGG

R_AACGCCTCCTCCAAATTCCCAAC

PFF0995c MSP10 N--terminal P absent F_GGATCCACATCCCAGAAGAAAATTACATATG

R_CTGAATTCATGATAGATGAATTTTCMAL7P1.176 EBA175 N-- Duffy-like B (NKND F_GGATCCTGTGAGAAGGAATGTATTGATCC

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terminal domains F1and F2 R_GTTTCCAAGACATAATTCTTGCC

PFD0020c PfEMP1severe

N-terminal CIDR domain (C) ? F_ggatccCCCGATTGTGTAGTTGAATGTG

ACAGGGGTTTGGTGTGGGG

MAL13P1.60 EBA140 meio P B F_ GGATCCCAGTGAGAAAATTACTGTATGTGACATGTACCAGGAAATTTGTTCG

PFL1385c MSP9 meio C ? F_ GGATCCGCTACCTACTCTTTTGTTAATACTCATCCATACCAGATACAGTTTC

C, conservado; P, polimórfico. Sitios de restrição inseridos são mostrados em negrito. F, primer forward e R, primer reverse.

Bibliografia

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10. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680–685.

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Anexo

Diretrizes para mostrar figuras no relatório (vale depois para mestrados, doutorados e publicação em revistas científicas também). A Figura tem que mostrar o resultado de forma mais completa possível. Fotos com géis grandes da qual apenas uma parte importante será mostrada, podem ser cortadas ("crop tool"). A legenda deve ser completa e deve tornar a figura autoexplicativa. Note a partir do exemplo abaixo como deve ser feito:

Imagem crua com marcação qual parte será utilizada:

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Aqui a imagem editada:

ReferênciasAs referências devem ser inseridas utilizando um programa adequado. Recomendo o programa Mendeley que pode ser carregado gratuitamente da internet e cria um plug-in para Word e OpenOffice writer. Sempre quando um dado da literatura é citado, a referência deve ser colocada.

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