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KÁTIA MARIA SAMPAIO GOMES PARTICIPAÇÃO DA ENZIMA ALDEÍDO DESIDROGENASE 2 NA INSUFICIÊNCIA CARDÍACA INDUZIDA POR INFARTO DO MIOCÁRDIO São Paulo 2014 Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Morfofuncionais do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para a obtenção do Título de Mestre em Ciências.
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KÁTIA MARIA SAMPAIO GOMES
PARTICIPAÇÃO DA ENZIMA ALDEÍDO DESIDROGENASE 2 NA
INSUFICIÊNCIA CARDÍACA INDUZIDA POR INFARTO DO
MIOCÁRDIO
São Paulo
2014
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Morfofuncionais do
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para a obtenção
do Título de Mestre em Ciências.
KÁTIA MARIA SAMPAIO GOMES
PARTICIPAÇÃO DA ENZIMA ALDEÍDO DESIDROGENASE 2 NA
INSUFICIÊNCIA CARDÍACA INDUZIDA POR INFARTO DO
MIOCÁRDIO
São Paulo
2014
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Morfofuncionais do Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade
de São Paulo, para a obtenção do
Título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Ciências
Morfofuncionais
Orientador: Prof. Dr. Julio Cesar
Batista Ferreira
Versão original
Gomes, Kátia Maria Sampaio.
Participação da enzima aldeído desidrogenase 2 na insuficiência cardíaca
induzida por infarto do miocárdio / Kátia Maria Sampaio Gomes. -- São
Paulo, 2014.
Orientador: Prof. Dr. Julio Cesar Batista Ferreira.
Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências
Biomédicas. Departamento de Anatomia. Área de concentração: Ciências
Morfofuncionais. Linha de pesquisa: Doença cardiovascular, estresse
oxidativo e teste de novos fármacos.
Versão do título para o inglês: Role of aldehyde dehydrogenase 2 in
myocardial infarction-induced heart failure.
1. Estresse oxidativo 2. Insuficiência cardíaca 3. ALDH2 4. 4HNE 5.
Alda-1 I. Ferreira, Prof. Dr. Julio Cesar Batista II. Universidade de São
Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em
Ciências Morfofuncionais III. Título.
ICB/SBIB044/2014
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São
Paulo
© reprodução total
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
Candidato(a): Kátia Maria Sampaio Gomes.
Título da Dissertação: Participação da enzima aldeído desidrogenase 2 na
insuficiência cardíaca induzida por infarto do miocárdio.
Orientador(a): Prof. Dr. Julio Cesar Batista Ferreira.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado,
em sessão pública realizada a .............../................./................., considerou
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................
Nome: ...................................................................................................
Instituição: .............................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................
Nome: ...................................................................................................
Instituição: .............................................................................................
Presidente: Assinatura: ............................................................................................
Nome: ..................................................................................................
Instituição: .............................................................................................
Dedico esse projeto a DEUS que sempre guiou
e iluminou os meus caminhos e aos meus pais
Raimundo e Cilene que abriram mão de seus
sonhos para viverem os meus.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Julio Cesar Batista Ferreira que me agraciou com a oportunidade de
fazer parte de sua equipe de pesquisa, por todas as horas dedicadas ao meu crescimento
profissional, ajudando-me a pensar como pesquisadora. Certamente tudo que sou hoje
profissionalmente dedico a ele que com muita paciência direciona-nos, sempre com
muita ética, profissionalismos e altruísmo.
À minha mãe Cilene, ao meu pai Raimundo e aos meus irmãos Juscélio,
Andréia, Rafaele e Rafael pelo apoio que sempre deram às minhas decisões e pela
compreensão nas horas mais difíceis desse processo.
À algumas pessoas importantes que estiveram em meu caminho e ajudaram-me
financeiramente, espiritualmente e moralmente. Obrigada Luciano, Telma, Nathalie,
Katt, Cláudio, Cristiano, Silmara, Débora, Tábata, Lívia, Juliane, Fátima, Beatriz, Eneli,
Patricia, Mendonça, Ana Paula, Ricardo, Ana Claudia, Pamella, João Artur, Alessandra,
Magda e Rosiane.
À Juliane que foi a minha primeira mentora em técnicas laboratoriais, boa parte
do que sei devo a ela. E a todos os meus amigos de laboratório e agregados que fizeram
ou fazem parte da minha formação. Obrigada Vanessa Lima, Cintia, Luiz, Marcinho,
Laís, André, Vanessa Zambelli, Glória, Marcele, Ney, Úsula, Alex, Vanessa Voltarelli,
Paulo, Máx, Fabi, Chris, Aline, Tiago, Marcelo e Meiri.
À Profa. Dra. Patrícia Brum pelo empenho e dedicação no início da minha
caminhada e ao Prof. Dr. Carlos Negrão que abriu as portas iniciais para o meu
ingresso.
Ao Dr. Paulo Magno pelas análises ecocardiográficas, pelo tempo desprendido
em orientações e ensinamentos, e pelo apoio constante em todas as minhas conquistas.
À Profa. Dra. Viviane Cárceres pelas análises hemodinâmicas e pela dedicação
aos finais de semana.
À Profa. Dra. Alicia Kowaltowski e seus alunos Bruno Queliconi, Fernanda e
Bruno Chausse, e sua técnica Camille por toda a ajuda nos ensaios de função
mitocondrial.
À Rosana profissional de estatística e Patrícia secretária, ambas do
departamento, pelo suporte prestado, sempre com muito profissionalismo e dedicação.
À FAPESP pelo apoio financeiro (processo 2012/02654-5).
“Face à realidade, o que julgamos saber
claramente ofusca o que deveríamos
saber” - Gaston Bachelard
RESUMO
Gomes KMS. Participação da Enzima aldeído desidrogenase 2 na insuficiência cardíaca
induzida por infarto do miocárdio. [dissertação (Mestrado em Ciências
Morfofuncionais)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São
Paulo; 2014.
A formação e o acúmulo de aldeídos decorrentes do estresse oxidativo são
extremamente cardiotóxicos e contribuem para o aparecimento das doenças
cardiovasculares. O 4-hidroxi-2-nonenal (4HNE), um aldeído originado a partir da
oxidação de fosfolipídios, apresenta grande poder deletério ao coração. A enzima
mitocondrial aldeído desidrogenase 2 (ALDH2) é uma das principais responsáveis pela
eliminação do 4HNE e manutenção do controle de qualidade mitocondrial.
Recentemente, nossos colaboradores realizando experimentos ex vivo, observaram uma
correlação inversa entre a atividade da ALDH2 e o grau de infarto do miocárdio após
isquemia cardíaca. Esse estudo ainda demonstrou que a inibição farmacológica da
ALDH2 resulta em acúmulo de 4HNE e maior dano ao miocárdio. De forma
interessante, a utilização de uma pequena molécula ativadora da ALDH2 desenvolvida
pelo grupo, chamada Alda-1, foi capaz de minimizar os efeitos nocivos da isquemia ao
tecido cardíaco. Esses resultados apontam a ALDH2 como uma enzima-chave na
manutenção da viabilidade cardíaca durante o processo de isquemia e abrem uma nova
perspectiva no tratamento de doenças cardiovasculares. Tendo em vista que a
insuficiência cardíaca (IC) é a via final comum da maioria das doenças cardiovasculares
e que até ao momento não há nenhuma caracterização da participação da enzima
ALDH2 nessa síndrome, tivemos como objetivos: 1) caracterizar a atividade da ALDH2
em diferentes tempos pós-infarto do miocárdio, 2) estudar o efeito da ativação
sustentada da ALDH2, através da ativação seletiva por Alda-1, sobre a função e
ultraestrutura cardíaca, função mitocondrial e balanço redox na IC. Nossos resultados
apontam que na 1ª, 2ª, e 4ª semana pós-infarto do miocárdio a atividade da ALDH2
cardíaca apresenta-se reduzida. Nesse período também observamos aumento da
peroxidação lipídica e disfunção mitocondrial, caracterizada pelo aumento na liberação
de peróxido de hidrogênio e redução do consumo de oxigênio em mitocôndria cardíaca
isolada. Todos esses processos são acompanhados pela disfunção cardíaca. O tratamento
com Alda-1 por um período de seis semanas em animais com IC induzida por infarto do
miocárdio (entre a 4ª e 10ª semana pós-infarto do miocárdio) proporciona uma melhora
na função sistólica cardíaca, aumento da complacência do ventrículo esquerdo e redução
da disfunção diastólica em condições basais e após sobrecarga de estresse com
fenilefrina. Além disso, os animais tratados com Alda-1 apresentam uma redução da
fibrose cardíaca quando comparados ao grupo IC tratado com solução veículo. O
tratamento também é capaz de reduzir os níveis de 4HNE e proteínas carboniladas no
coração, além de melhorar a função mitocondrial. A ativação seletiva da ALDH2 reduz
a formação de poros de permeabilidade mitocondrial e a liberação de citocromo c no
grupo IC, além de prevenir a disfunção mitocondrial mediada pelo 4HNE in vitro. Por
fim o tratamento com Alda-1 reduz níveis de hidroperóxidos lipídicos, previne redução
da atividade da enzima superóxido dismutase e não apresenta toxicidade. Podemos
concluir que a ativação seletiva da ALDH2 reduz os níveis de aldeídos citotóxicos,
preserva a função mitocondrial e melhora a função cardíaca de ratos com insuficiência
cardíaca, podendo ser considerada um importante alvo terapêutico no tratamento da IC.
Palavras-chave: Estresse oxidativo. Insuficiência cardíaca. ALDH2. 4HNE. Alda-1.
ABSTRACT
Gomes KMS. Role of aldehyde dehydrogenase 2 in myocardial infarction-induced heart
failure. [Masters thesis (Morphofunctional Science)]. São Paulo: Instituto de Ciências
Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2014.
We previously demonstrated that acute pharmacological activation of mitochondrial
aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) protects the heart against acute
ischemic/reperfusion events. Here we characterized the ALDH2 activity and aldehydic
load in a time-window of 10 weeks after myocardial infarction as well as determined the
benefits of chronic activation of ALDH2 on the progression of heart failure after the
onset of symptoms using a post-myocardial infarction model in rats. We observed a
significant reduction of cardiac ALDH2 activity until the 4th
week after myocardial
infarction surgery. This response was followed by aldehydic overload in failing hearts.
We also showed that a six-week treatment of myocardial infarction-induced heart
failure rats with Alda-1, a selective ALDH2 activator, enhanced contractile function,
improved left ventricular compliance and increased diastolic function under basal
conditions and after sudden pressure-overload stress. Moreover, sustained Alda-1
treatment showed no toxicity and promoted a cardiac anti-remodeling effect by
suppressing myocardial fibrosis. In addition, accumulation of 4-hydroxynonenal (4-
HNE)-protein adducts and protein carbonyls seen in heart failure was not observed in
Alda-1-treated rats, suggesting that increasing the activity of ALDH2 contributes to the
removal of excessive 4-HNE in failing hearts. Moreover, ALDH2 activation-mediated
cardioprotection was associated with improved mitochondrial function, including
elevated mitochondrial respiratory control ratios and reduced H2O2 release. Importantly,
selective ALDH2 activation decreased mitochondrial Ca2+
-induced permeability
transition and cytochrome c release in failing hearts. Further supporting a mitochondrial
mechanism for ALDH2, Alda-1 treatment preserved mitochondrial function in vitro
upon 4-HNE addition. Therefore, selective activation of mitochondrial ALDH2 reduces
aldehydic load, preserves mitochondrial function and improves heart failure outcome,
suggesting that ALDH2 activators, such as Alda-1, have a potential therapeutic value
for treating heart failure patients.
Keywords: Oxidative stress. Heart failure. ALDH2. 4HNE. Alda-1.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Esquema ilustrativo do funcionamento da cadeia de transporte de
elétrons (CTE) --------------------------------------------------------------- 25
FIGURA 2 Estrutura química da Alda-1 ----------------------------------------------- 29
FIGURA 3 Esquema ilustrativo da hipótese do trabalho ----------------------------- 32
FIGURA 4 Esquema ilustrativo do período experimental, cirurgia e tratamento
na IC induzida por infarto do miocárdio --------------------------------- 34
FIGURA 5 Modelo Experimental do Curso Temporal após Infarto do
Miocárdio e Dados Ecocardiográficos ------------------------------- 48
FIGURA 6 Curso Temporal da Atividade da ALDH2 cardíaca após Infarto do
Miocárdio e Correlação com a Fração de Ejeção ----------------------- 51
FIGURA 7 Formação de Hidroperóxidos Lipídicos e Níveis de Glutationa
cardíacos ---------------------------------------------------------------------- 52
FIGURA 8 Consumo de Oxigênio e Liberação de Peróxido de Hidrogênio em
Mitocôndria Cardíaca Isolada --------------------------------------------- 54
FIGURA 9 Desenho Experimental e Dados Ecocardiográficos no modo M dos
períodos pré- e pós-tratamento dos grupos Sham, Insuficiência
cardíaca (IC) e Insuficiência Cardíaca tratado com Alda-1 (IC Alda-
1) ------------------------------------------------------------------------------- 58
FIGURA 10 Avaliação do ciclo cardíaco e Análises Morfométricas Cardíacas --- 64
FIGURA 11 Atividade e Expressão da ALDH2 e Expressão de Proteínas
Danificadas no lisado cardíaco total -------------------------------------- 66
FIGURA 12 Consumo Máximo de Oxigênio e Liberação de Peróxido de
Hidrogênio em Mitocôndria Cardíaca Isolada --------------------------- 68
FIGURA 13 Permeabilidade de Poros Mitocondriais, Liberação de Citocromo c e
4HNE in vitro ---------------------------------------------------------------- 71
FIGURA 14 Peroxidação Lipídica, Atividade da Superóxido dismutase e
Catalase ----------------------------------------------------------------------- 73
FIGURA 15 Análise da Toxicidade da Alda-1. ----------------------------------------- 75
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Dados Ecocardiográficos no modo M referentes aos períodos 1, 2, 4 e
10 semanas pós-infarto do miocárdio (IM). ------------------------------- 49
TABELA 2 Dados Ecocardiográficos referentes aos períodos pré- e pós-
tratamento dos grupos Sham, Insuficiência Cardíaca (IC) e
Insuficiência Cardíaca tratado com Alda-1 (IC Alda-1). ---------------- 59
TABELA 3 Parâmetros Fisiológicos. ----------------------------------------------------- 61
TABELA 4 Parâmetros Hemodinâmicos ------------------------------------------------- 62
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SIMBOLOS
4HNA 4-hidroxi-2-nonenóico
4HNE 4-hidroxi-2-nonenal
A Velocidade do fluxo mitral A
ACDA Artéria coronária descendente anterior
ADH Álcool desidrogenase
Alda-1 Aldehyde dehydrogenase activator 1
ALDH2 Aldeído desidrogenase 2
ALDH2*2 Aldeído desidrogenase mutante
ALDHs Aldeído desidrogenases
ALT Alanina aminotransferase
Ang II Angiotensina II
ANOVA Análise de variância
ASP Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CaCl2 Cloreto de cálcio
CAT Catalase
CCCP Carbonyl cyanide m-chlorophenil hydrazone
CR Glutationa redutase
CTE Cadeia de transporte de elétrons
Cys Resíduos de cisteína
DC Débito cardíaco
DdVE Diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo
DMP Distância máxima percorrida
DNA Ácido desoxirribonucléico
+dP/dt max Elevação máxima da pressão do ventrículo esquerdo
-dP/dt max Declínio máximo da pressão do ventrículo esquerdo
DsVE Diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo
DTNB 5,5' DITIOBIS-2-NITROBENZÓICO
DTT DL-Ditiotreitol
E Velocidade do fluxo mitral E
ʎem Absorbância emissão
ʎex Absorbância excitação
FC Frequência Cardíaca
FE (%) Porcentagem da fração de encurtamento do ventrículo esquerdo
Fenc Fração de encurtamento do ventrículo esquerdo
FOX Ferrous oxidation in xylenol orange
GAPDH Gliceradeído - 3- fosfato desidrogenase
Glu Glutamato
GPx Glutationa peroxidase
GSH Glutationa reduzida
GS-TNB Glutationa oxidada TNB
H+ Hidrogênio
H2O Água
H2O2 Peróxido de hidrogênio
HCL Ácido clorídrico
I/R Isquemia e reperfusão
IC Insuficiência cardíaca
IC Alda Insuficiência cardíaca tratado com Alda-1
ID Isocitrato desidrogenase
IDM Índice de desempenho do miocárdio
KCL Cloreto de potássio
KH2PO4 Fosfato de potássio monobásico
L• Radical lipídico
LOO• Radical peroxila
MgCl2 Cloreto de magnésio
NaCl Cloreto de sódio
NAD+ B-Nicotinamide adenine dinucleotide
NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato reduzida
NYHA New York Heart Association
O2•−
Ânio superóxido
O2 Oxigênio
OH• Radical Hidroxila
ON Óxido nítrico
ONOO− Peróxido nitrito
PAS Pressão Arterial Sistólica
PC Peso Corporal
PDFVE Pressão diastólica final do ventrículo esquerdo
PHE Fenilefrina
PPVEd Parede posterior do ventrículo esquerdo na diástole
PPVEs Parede posterior do ventrículo esquerdo na sístole
PSFVE Pressão sistólica final do ventrículo esquerdo
PTMs Poros de transição mitocondrial
PUFAs Ácidos graxos poliinsaturados
RPVDF Relação pressão volume na diástole final
RPVSF Relação pressão volume na sístole final
-SH Grupo tiol
Sham Grupo controle
SIVd Septo interventricular na diástole
SIVs Septo interventricular na sístole
SNS Sistema nervoso simpático
SOD Superóxido dismutase
SRAA Sistema renina angiotensina aldosterona
SUS Sistema único de saúde
TC Trabalho cardíaco
TE Tempo de ejeção
TNB Cromóforo
TRIV Tempo de relaxamento isovolumétrico
TrxP Tioredoxina peroxidase
TrxR Tioredoxina redutase
VS Volume sistólico
OMS Organização mundial da saúde
Unidades
g Micrograma
m Micrômetro
M Micromolar
µL Microlitro
Bpm Batimento por minuto
g Grama
L Litro
m Metro
Mg Miligrama
Min Minuto
mm Milímetro
mM Milimolar
mmHg Milímetros de mercúrio
nM Nanomolar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO --------------------------------------------------------------------------- 19
2 REVISÃO DE LITERATURA --------------------------------------------------------- 21
2.1 Insuficiência cardíaca ------------------------------------------------------------------ 21
2.2 Mitocôndria e estresse celular -------------------------------------------------------- 22
2.3 4HNE, disfunção mitocondrial e doenças cardiovasculares -------------------- 26
2.4 Aldeído desidrogenase 2 (ALDH2) e Alda-1 --------------------------------------- 28
3 JUSTIFICATIVA ------------------------------------------------------------------------- 31
4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------- 34
5 MATÉRIAIS E MÉTODOS ------------------------------------------------------------ 36
5.1 Amostra ----------------------------------------------------------------------------------- 36
5.2 Protocolo de cirurgia cardíaca para indução do infarto ------------------------ 36
5.3 Tratamento ------------------------------------------------------------------------------- 37
5.4 Avaliação da função ventricular ----------------------------------------------------- 37
5.5 Teste de tolerância ao esforço -------------------------------------------------------- 38
5.6 Medidas de frequência cardíaca de pressão arterial ---------------------------- 38
5.7 Avaliação da hemodinâmica cardíaca ---------------------------------------------- 39
5.8 Sacrifício e coletas de tecido ---------------------------------------------------------- 40
5.9 Avaliação morfométrica cardíaca --------------------------------------------------- 40
5.10 Atividade da enzima ALDH2 ------------------------------------------------------- 41
5.11 Caracterização da função mitocondrial cardíaca ------------------------------- 41
5.12 Análise da expressão de proteínas mitocondriais e citosólicas --------------- 43
5.13 Peroxidação lipídica ------------------------------------------------------------------ 44
5.14 Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes ------------------------------- 45
5.15 Análise de toxidade hepática -------------------------------------------------------- 46
5.16 Análise estatística --------------------------------------------------------------------- 46
6 RESULTADOS (Estudo 1) -------------------------------------------------------------- 47
6.1 Modelo experimental e ecocardiograma modo M do curso temporal após
infarto do miocárdio ------------------------------------------------------------------------ 47
6.2 Curso temporal da atividade da ALDH2 pós-infarto do miocárdio ---------- 50
6.3 Formação de hidroperóxidos lipídico e níveis de glutationa no coração ---- 52
6.4 Consumo de oxigênio e liberação de peróxido de hidrogênio em 53
mitocôndria cardíaca isolada -------------------------------------------------------------
7 RESULTADOS (Estudo 2) -------------------------------------------------------------- 56
7.1 Modelo experimental e caracterização do fenótipo ------------------------------ 56
7.1.1 Análises ecocardiográficas ---------------------------------------------------------- 56
7.1.2 Parâmetros fisiológicos --------------------------------------------------------------- 60
7.1.3 Análises hemodinâmicas e morfométricas cardíaca ----------------------------- 61
7.2 Perfil de atividade e expressão da enzima ALDH2 cardíaca e acúmulo de
proteínas danificadas ----------------------------------------------------------------------- 65
7.3 Caracterização da função mitocondrial -------------------------------------------- 65
7.3.1 Permeabilidade dos poros mitocondriais, liberação de citocromo c e 4HNE
in vitro ------------------------------------------------------------------------------------------ 69
7.4 Peroxidação lipídica e atividade da superóxido dismutase e da catalase ---- 72
7.5 Toxicidade da Alda-1 ------------------------------------------------------------------ 73
8 DISCUSSÃO ------------------------------------------------------------------------------- 76
9 CONCLUSÃO ----------------------------------------------------------------------------- 80
REFERÊNCIAS ----------------------------------------------------------------------------- 81
19
1 INTRODUÇÃO
As doenças cardiovasculares são consideradas um importante problema de saúde pública
em todo mundo, estando associadas a elevadas taxas de morbidade e mortalidade. De acordo
com a organização mundial da saúde (OMS), as doenças cardiovasculares são responsáveis
por cerca de 17 milhões de óbitos anualmente (WHO, 2014), nos Estados Unidos 1 a cada 3
americanos possui 1 ou mais tipos de doença cardiovascular. No Brasil as doenças
cardiovasculares representam 29,4% da mortalidade no país, atingindo mais de 300 mil
pessoas anualmente (Brasil, 2014)
A maioria das doenças cardiovasculares tem como via final comum a insuficiência
cardíaca (IC), uma síndrome degenerativa multifatorial associada a alterações neuro-
hormonais (ex, hiperativação dos sistemas nervoso simpático, SNS, e renina-angiotensina-
aldosterona, SRAA) e consequente prejuízo da função cardíaca. Na IC, a capacidade de um ou
de ambos os ventrículos apresenta-se comprometida, fazendo com que o coração diminua a
sua eficácia no bombeamento adequado de sangue para atender as necessidades metabólicas
do organismo (Liu, Eisen, 2014).
O estabelecimento e o agravamento da IC estão associados ao desbalanço metabólico
cardíaco caracterizado muitas vezes pelo prejuízo do funcionamento da mitocôndria (Abel,
Doenst, 2011; Schwarz et al., 2014; Tsutsui et al., 2011). A mitocôndria é uma organela
importante para a sobrevivência celular, não apenas por gerar ATP (adenosina trifosfato), mas
também por controlar o balanço redox, sintetizar aminoácidos não essenciais, bases
precursoras do DNA (ácido desoxirribonucléico) e moléculas envolvidas na sinalização
intracelular. Além disso, a mitocôndria regula diretamente processos apoptóticos,
diferenciação, crescimento e proliferação celular (Handy, Loscalzo, 2012). Atualmente
sabemos que o prejuízo na produção de energia, associado aos efeitos deletérios da
exacerbada produção de radicais livres está diretamente relacionado à menor viabilidade
cardíaca tanto em modelos animais de IC quanto em pacientes portadores de IC (Abel,
Doenst, 2011; Tsutsui, Kinugawa et al., 2011; Ventura-Clapier et al., 2011).
Recentemente, os conhecimentos sobre a fisiopatologia das doenças cardiovasculares
estabeleceram que a produção exacerbada de radicais livres resulta na formação e no acúmulo
de aldeídos cardíacos (Chen et al., 2014). Dentre os diversos aldeídos acumulados no coração,
o 4-hidroxi-2-nonenal (4HNE), originado a partir da oxidação de fosfolipídios presentes na
membrana interna da mitocôndria, apresenta grande poder nocivo ao coração (Budas et al.,
2010). Esse aldeído eletrofílico é capaz de atacar aminoácidos nucleofílicos e formar adutos
20
com proteínas (adutos de Michaelis), resultando na inativação da proteína-alvo e consequente
desarranjo/disfunção celular (Raza, John, 2006).
A principal enzima responsável pela remoção desse aldeído tóxico é a aldeído
desidrogenase 2 (ALDH2), uma proteína localizada na matriz mitocondrial. Chen e
colaboradores demonstraram que a atividade da ALDH2 cardíaca apresenta uma correlação
inversa com a área de infarto após isquemia cardíaca em ratos (Chen et al., 2008). De fato, a
ativação direta (farmacológica) ou indireta (etanol) da ALDH2 durante a isquemia cardíaca
tem efeito protetor e resulta em menor dano ao miocárdio (Chen, Budas et al., 2008). Este
efeito benéfico é decorrente, pelo menos em parte, da maior remoção do 4HNE pela ALDH2.
A utilização de uma pequena molécula ativadora da ALDH2 desenvolvida por nossos
colaboradores da Universidade de Stanford, denominada Alda-1, foi capaz de minimizar os
efeitos nocivos da isquemia ao tecido cardíaco (Chen, Budas et al., 2008). Recentemente,
nosso grupo demonstrou que a Alda-1 também tem efeito protetor em modelo ex vivo de
isquemia cardíaca (Sun et al., 2011). Esses resultados apontam a ALDH2 como uma enzima-
chave na manutenção da viabilidade cardíaca durante o processo isquêmico e abrem uma nova
perspectiva no tratamento das doenças cardiovasculares. Baseados nos resultados
supracitados, levantamos a hipótese que a ativação sustentada da ALDH2 é capaz de proteger
contra a progressão da IC. Sendo assim, estabelecemos como objetivos do presente estudo: 1)
caracterizar o perfil de ativação da ALDH2 e remoção de aldeídos cardíacos ao longo da
progressão da disfunção cardíaca induzida pelo infarto do miocárdio em ratos (1, 2, 4 e 10
semanas pós-infarto do miocárdio) e 2) estudar o efeito da ativação sustentada da enzima
ALDH2, através do tratamento farmacológico com Alda-1, sobre a função e ultraestrutura
cardíaca, função mitocondrial e balanço redox na IC de etiologia isquêmica em ratos.
21
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Insuficiência cardíaca
A IC atualmente atinge mais de 23 milhões de pessoas em todo o mundo, em taxas
crescentes a cada ano (Liu, Eisen, 2014). Nos Estados Unidos surgem 550 mil novos
casos/ano, e 1 a cada 5 pessoas corre o risco de desenvolver IC (Liu, Eisen, 2014). No Brasil a
IC é a causa mais frequente de internação por doenças cardiovasculares e, em 2007 foi
responsável pelo gasto de 3% dos recursos totais destinados à internação do sistema único de
saúde (SUS) (Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC, 2012).
A etiologia mais recorrente da IC é a cardiomiopatia isquêmica (SBC, 2012),
caracterizada pela redução do aporte sanguíneo nas coronárias cardíacas. O estabelecimento
da IC ocorre da seguinte forma: após o infarto do miocárdio ocorre inicialmente uma redução
do débito cardíaco, essa redução gera uma ativação dos barorreceptores do coração que são
capazes de sinalizar a ativação do SNS na tentativa de preservar a homeostase circulatória,
como conseqüência ocorre um aumento da freqüência cardíaca, pressão arterial sistêmica,
vasoconstrição e consequente aumento da contratilidade cardíaca, essas adaptações atenuam a
queda do débito cardíaco (Montera, 2009). Embora originalmente vista como uma resposta
compensatória benéfica, a liberação endógena sustentada de neuro-hormônios parece exercer
papel deletério no desenvolvimento da IC, pelo aumento da sobrecarga de volume e da pós-
carga do ventrículo com contratilidade já diminuída. Esses neuro-hormônios podem exacerbar
as anormalidades metabólicas presentes, ocasionando o estabelecimento da IC. Essa pode ser
caracterizada (não em sua totalidade) por algumas alterações cardíacas funcionais (disfunção
sistólica e diastólica ventricular esquerda, e redução do debito cardíaco), estruturais (dilatação
ventricular, redução da complacência cardíaca) e elétricas (taquicardia e arritmias cardíacas)
(Chatterjee, 2005). Considerada uma síndrome degenerativa, a IC também pode ser
caracterizada, dependendo do estágio da doença, pela intolerância aos esforços físicos e pela
formação de edema pulmonar.
Em detrimento da hiperativação sustentada de sistemas neuro-humorais, a progressão da
IC também é caracterizada por uma série de anormalidades celulares cardíacas. Um estudo
publicado recentemente pelo nosso grupo demonstrou que ratos com IC de etiologia
isquêmica, apresentam um aumento do estresse oxidativo, acompanhado por elevadas taxas da
peroxidação lipídica e acúmulo de proteínas danificadas. Além disso, esses animais
apresentam uma disfunção mitocondrial e uma redução na atividade do sistema proteolítico
22
ubiquitina-proteassoma (Campos et al., 2012). O sistema ubiquitina-proteassoma auxilia na
remoção de proteínas danificadas, uma vez que o acúmulo dessas proteínas contribui para o
agravamento da disfunção cardíaca e o estabelecimento da IC (Campos, Queliconi et al.,
2012). Outra anormalidade presente na IC, causada pela hiperativação neuro-humoral, é o
aumento dos níveis de angiotensina II (Ang II) no coração. Daí e colaboradores demonstraram
que o aumento nos níveis de Ang II em cardiomiócitos de ratos com IC contribui para o
aumento da fibrose cardíaca, hipertrofia e dano mitocondrial (Dai et al., 2011).
Apesar dos avanços no tratamento da IC, as taxas de morbidade e mortalidade dos
pacientes ainda é alta (Hummel et al., 2010). Portanto, a busca por novos alvos terapêuticos é
importante na tentativa de melhorar a qualidade de vida e a sobrevida desses pacientes. A
disfunção mitocondrial é apontada como uma importante alteração celular associada à
progressão e agravamento da IC (Abel, Doenst, 2011; Schwarz, Siddiqi et al., 2014; Tsutsui,
Kinugawa et al., 2011). Atualmente sabemos que o prejuízo na produção de energia,
associado aos efeitos deletérios do desbalanço redox está diretamente relacionado à menor
viabilidade cardíaca tanto em modelos animais de IC quanto m pacientes portadores de IC
(Abel, Doenst, 2011; Tsutsui, Kinugawa et al., 2011; Ventura-Clapier, Garnier et al., 2011).
2.2 Mitocôndria e estresse celular
A mitocondrial é responsável por produzir a maior parte da energia do coração, > 95% do
ATP gerado no coração é proveniente da mitocôndria (Doenst et al., 2013). O processo de
produção aeróbia de ATP é denominado fosforilação oxidativa, que ocorre devido ao
gradiente eletroquímico mantido entre a membrana interna e o espaço intermembranar da
mitocôndria. O interior da mitocôndria é denominado matriz mitocondrial, onde ocorre boa
parte de suas reações. A oxidação de substratos, aminoácidos e ácidos graxos pela β-oxidação
fornece energia para a cadeia de transporte de elétrons (CTE) por meio das coenzimas
NADH+ e FADH2, essas coenzimas doam elétrons para proteínas que compõem a CTE, dando
início a fosforilação oxidativa. Ao final da CTE esses elétrons são transferidos para o
oxigênio que por sua vez é reduzido à água (H2O), A passagem dos elétrons pela CTE gera o
bombeamento de prótons para espaço intermembranar mitocondrial criando um gradiente
eletroquímico, ou seja, a matriz mitocondrial torna-se mais negativa que o espaço
intermembranar. Os prótons são atraídos para a matriz mitocondrial por essa diferença de
carga. A passagem dos prótons pela ATP sintase (Complexo V) gera uma força mecânica
23
suficiente para a síntese de ATP (Hernandez-Resendiz et al., 2013; Kowaltowski et al., 2009)
(Figura 1).
Alterações no fluxo de elétrons através da CTE podem resultar na formação de radicais
livres. Radicais livres são moléculas que possuem elétrons desemparelhados em sua órbita
mais externa. O ânion superóxido (O2•-) é o primeiro radical a ser gerado. Sua formação
ocorre por uma adição de um elétron a uma molécula de oxigênio (O2). A formação do
peróxido de hidrogênio (H2O2) ocorre quando o O2•- recebe um elétron e dois íons de
hidrogênio. Essa reação ocorre por meio da enzima superóxido dismutase (SOD). O H2O2 não
é considerado um radical, mas é um precursor direto de outros radicais. O radical hidroxila
(OH•) é formado quando H2O2 recebe um elétron e um próton, ou quando o H2O2 reage com
íons de ferro ou cobre, esse radical também pode ser gerado através da reação do H2O2 com o
O2•-
catalisada por íons de metal. Outro importante radical formado é o peróxido nitrito
(ONOO-) que é originado a partir da reação do O2
•- o oxido nítrico (ON) (Kowaltowski, de
Souza-Pinto et al., 2009). Os OH•
e ONOO- são os principais precursores da peroxidação
lipídica.
Uma mitocôndria saudável possui um sistema de defesa antioxidante capaz de combater a
formação exacerbada desses radicais, mantendo níveis fisiológicos para o bom funcionamento
celular (Hernandez-Resendiz, Buelna-Chontal et al., 2013). No entanto, o desbalanço redox,
ou seja, quando a produção de radicas livres é maior que a remoção, resulta na disfunção
mitocondrial e morte celular. A disfunção mitocondrial e o aumento na formação de radicas
livres estão associados à patogênese e progressão de diversas doenças degenerativas, como
Alzheimer, Parkinson, Hipertensão e IC (Abel, Doenst, 2011; Gandhi, Abramov, 2012;
Tsutsui, Kinugawa et al., 2011).
A mitocôndria é a principal fonte de O2•-
e H2O2, oriundos principalmente dos complexos I
e III da CTE. No coração, grande parte das espécies reativas de oxigênio é produzida na CTE
(Poyton et al., 2009). Em condições de homeostase, as espécies reativas de oxigênio são
tamponadas por enzimas como a SOD, catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx),
tioredoxina peroxidase (TrxP) ou por “scavengers” como a vitamina E ou ubiquinol
(Kowaltowski, de Souza-Pinto et al., 2009) (Figura 1). Contudo, em processos como
envelhecimento, hipóxia ou hiperativação neuro-humoral, pode ocorrer uma alteração no
controle redox, resultando em aumento excessivo nas concentrações das espécies reativas de
oxigênio.
Em geral, o aumento exacerbado da produção de EROs pela mitocôndria, resulta em
redução da viabilidade celular. Esse fenômeno está diretamente associado à oxidação de
24
DNA, lipídios, açúcares e proteínas, resultando em uma série de anormalidades na
mitocôndria, com a drástica redução do potencial da membrana interna mitocondrial,
diminuição na síntese de ATP, aumento nas concentrações de cálcio na matriz mitocondrial,
prejuízo no controle de qualidade de proteína mitocondrial e ativação de vias pró-apoptóticas
(Campos, Queliconi et al., 2012; Kowaltowski, de Souza-Pinto et al., 2009). A ativação das
vias pró-apoptóticas ocorre pela da liberação do citocromo c através dos poros de transição
mitocondrial (PTMs), ocasionada pela perda do potencial de membrana mitocondrial,
sobrecarga de cálcio e aumento de espécies reativas de oxigênio (Lumini-Oliveira et al.,
2011). O aumento das espécies reativas de oxigênio leva a formação do radical H•, que por
sua vez oxida o grupo tiol (-SH) do PTM, e resulta na liberação do citocromo c. No citosol, o
citocromo c ativa o complexo apoptosoma e induz a morte celular programada (apoptose). A
abertura de PTMs depende da redução na expressão das proteínas anti apoptóticas (Bcl-2/Bcl-
x), aumento na expressão de proteínas pró-apoptóticas (Bad, que inibe a expressão Bcl-2/ Bcl-
x) (Kroemer et al., 2007).
25
Figura 1 – Esquema ilustrativo do funcionamento da cadeia de transporte de elétrons (CTE): A
oxidação de substratos, aminoácidos e ácidos graxos fornece elétrons para a CTE através das
coenzimas NADH e FADH2, Ao final da CTE esses elétrons são transferidos para o oxigênio (O2) que
por sua vez é reduzido à água (H2O), A passagem dos elétrons pela CTE gera o bombeamento de
prótons para espaço intermembranar mitocondrial, criando um gradiente eletroquímico, ou seja, a
matriz mitocondrial torna-se mais negativa que o espaço intermembranar, Os prótons são atraídos para
a matriz mitocondrial por essa diferença de carga, A passagem dos prótons pela ATP sintase
(Complexo V) gera uma força mecânica suficiente para a síntese de ATP, O escape de elétrons forma
radicais livres como ânion superóxido (O2•-) e peróxido de hidrogênio (H2O2), esses radicais livres
podem ser tamponados por enzimas antioxidantes como superóxido dismutase (MnSOD), catalase
(CAT), glutationa peroxidase (GPx) ou a tioredoxina peroxidase (TrxP), A NADP+ é reduzida pela
isocitrato desidrogenase (ID) a NADH que é utilizada tanto pela glutationa redutase (GR) quanto pela
tioredoxina redutase (TrxR), Figura adaptada de Kowaltowski et al,, 2009 e Tahara et al,, 2009
(Kowaltowski, de Souza-Pinto et al., 2009; Tahara et al., 2009).
Os radicais livres são moléculas muito reativas, porém pouco estáveis, e portanto, agem
em locais próximos aos locais onde são produzioas e por um curto período de tempo.
Entretanto, a oxidação de lipídios insaturados, presentes na membrana interna da mitocôndria,
pelos radicais livres, pode formar moléculas extremamente estáveis, reativas e lipofílicas, que
são capazes de atuar em regiões distantes de sua origem e reagir com diferentes proteínas e
DNA. Dentre os oxidantes produzidos pelos radicais livres, encontram-se os peróxidos
lipídicos, que podem ser metabolizados pela glutationa peroxidase. Contudo, na presença de
um doador de elétron, este peróxido sofre uma reação não-enzimática e se divide para
26
produzir um aldeído tóxico, o 4-hidroxi-2-nonenal (4HNE). Esta molécula, gerada
endogenamente a partir da clivagem de hidroperóxidos lipídicos, é altamente reativa e pode
ligar-se aos resíduos cisteína, lisina e histidina das proteínas. Resumidamente, o processo da
peroxidação lipídica pode ser definido como uma deterioração auto-oxidativa de ácidos
graxos poliinsaturados (PUFAs). Em particular, o 4HNE é formado pela degradação de
PUFAs ômega 3 e 6 presentes em alta quantidades nas membranas biológicas (Yang et al.,
2003).
É interessante mencionar que, quando produzidos em níveis basais (ou seja, < 1 μM), os
aldeídos como o 4HNE, atuam como moléculas sinalizadoras intracelulares (Esterbauer et al.,
1991). Entretanto, sob condições de estresse oxidativo, ocorre produção exacerbada destes
aldeídos, saturando as vias de seu metabolismo, o que favorece modificações irreversíveis de
moléculas biológicas e o início de processos patológicos. A importância clínica do 4HNE
decorre de sua habilidade em se difundir a locais mais distantes de onde é produzido. Assim,
ele pode formar adutos, ligações químicas de alta afinidade, com diversas proteínas. Estudos
têm demonstrado que o 4HNE pode se ligar a albumina plasmática, enzimas do metabolismo,
proteínas de membrana e citosólicas, proteínas da CTE, dentre outros (Houglum et al., 1990;
Hummel, Pauli et al., 2010; Kaplan et al., 2007). O acúmulo desse aldeído tem sido
relacionado à etiologia de diversas doenças, como doenças cardiovasculares, hepáticas e
câncer (Petersen, Doorn, 2004; Takagi et al., 2002; Tanaka, 2014).
2.3 4HNE, disfunção mitocondrial e doenças cardiovasculares
O 4HNE é o principal produto da peroxidação lipídica, possui um carbono reativo
(eletrofílico) localizado na posição 3 (posição central) da molécula. Este carbono pode formar
uma ligação (ligação de Michaelis, ou seja, a ligação do carbono reativo do 4HNE a
proteínas) com resíduos de cisteína, histidina ou lisina da proteína alvo, modificando-a
irreversivelmente (Petersen, Doorn, 2004). Estudos têm demonstrado que cerca de 1 a 8% do
4HNE formado na célula modifica proteínas, resultando em perda de função dessas proteínas.
Outro tipo de modificação decorrente de ataque eletrofílico é a carbonilação de proteínas
(ligação de grupamentos carbonila), um tipo de oxidação protéica que pode ser produzida pela
reação direta de espécies reativas de oxigênio com resíduos de arginina, lisina e treonina. As
carbonilas podem também ser geradas pela reação de Michaelis, entre resíduos de cisteína,
27
lisina ou histidina e intermediários da peroxidação lipídica, como o 4HNE (Backos et al.,
2011; Yang, Sharma et al., 2003).
Devido à sua forte eletrofilicidade, o 4HNE tem elevada capacidade de modificar
covalentemente componentes celulares como fosfolipídios, DNA, e proteínas (Yang, Sharma
et al., 2003). De fato, a formação de adutos de Michaelis e carbonilação de proteínas pelo
4HNE são observados em diferentes modelos animais de doenças cardiovasculares (Awasthi
et al., 2003; Raza, John, 2006). Resultados prévios do nosso grupo mostram que níveis
elevados de proteínas carboniladas são encontrados no coração de roedores e humanos
portadores de IC (Campos, Queliconi et al., 2012; Ferreira et al., 2012), assim, a carbonilação
pode ser considerada um importante biomarcador na IC.
O 4HNE é capaz de inibir a atividade de importantes enzimas mitocondriais envolvidas no
ciclo de Krebs e na CTE como: -cetoglutarato, succinato desidrogenase, isocitrato
desidrogenase, citocromo c; e outras proteínas responsáveis pelo transporte de moléculas
através das membranas mitocondriais (Hummel, Pauli et al., 2010). A inibição dessas
proteínas parece ser mediada pelo ataque de resíduos de cisteína (Cys), críticos na
manutenção da estrutura e função das proteínas. Outros possíveis alvos do 4HNE são os
resíduos de histidinas, lisinas e os centros ferro-enxofre presentes nos complexos
mitocondriais. O resíduo de Cys possui uma maior reatividade ao 4HNE comparado aos
outros resíduos (histidina e lisina). O 4HNE reage com proteínas citosólicas, mitocondriais e
com o proteassoma, resultando na menor produção de ATP pela mitocôndria, formação de
poros mitocondriais, prejuízo do controle de qualidade de proteína e conseqüente acúmulo de
proteínas danificadas, reduzindo a viabilidade mitocondrial e celular. Dessa forma, o 4HNE
vem sendo considerado uma importante molécula envolvida no prejuízo cardíaco, associado à
redução da contratilidade celular e indução de apoptose (Hummel, Pauli et al., 2010; Kaplan,
Tatarkova et al., 2007).
A disfunção mitocondrial, bem como o desbalanço redox, são processos bem conhecidos
nas doenças cardiovasculares. Porém, os mecanismos celulares envolvidos nesses processos
ainda são controversos. Recentemente, nossos colaboradores da Universidade de Stanford
constataram em modelo animal (in vivo) que o processo de isquemia resulta em acúmulo de
4HNE cardíaco em decorrência de dois processos: 1) oxidação de lipídios presentes na
membrana mitocondrial; e 2) inativação da enzima aldeído desidrogenase 2 (ALDH2),
responsável pela remoção do 4HNE, Esse fenômeno acarreta na disfunção mitocondrial,
ativação de vias celulares pró-apoptóticas e consequente redução da viabilidade cardíaca. De
fato, agentes farmacológicos capazes de ativar diretamente ou indiretamente a enzima
28
ALDH2 durante a isquemia são capazes de melhorar a viabilidade celular (Budas et al., 2009;
Budas, Disatnik et al., 2010; Chen, Budas et al., 2008). Dessa forma, o melhor entendimento
do metabolismo e ação do 4HNE, bem como o desenvolvimento de novas terapias capazes de
aumentar a remoção do 4HNE são de grande valia para o tratamento de doenças
cardiovasculares, como a IC.
2.4 Aldeído desidrogenase 2 (ALDH2) e Alda-1
As aldeído desidrogenases (ALDHs) são um grupo de enzimas que catalisa a oxidação de
aldeídos a seus ácidos correspondentes, não tóxicos, em uma reação irreversível dependente
de NAD+. Já foram descritas dezenove isoformas das ALDHs, que estão expressas em
diversos tecidos (Chen, Ferreira et al., 2014).
Nos últimos anos a isoforma ALDH2 vem sendo alvo de constante investigação por estar
associada ao aparecimento de câncer, Parkinson, Alzheimer e doenças cardiovasculares, em
especial na população asiática onde 40% dos indivíduos apresentam uma mutação nessa
enzima (ALDH2*2). Essa mutação é a mais freqüente no mundo, atingindo ~540 milhões de
pessoas, representando 8% da população mundial. A mutação ALDH2*2 é caracterizada pela
síndrome de intolerância ao consumo do álcool, uma vez que os portadores da mutação ao
consumirem baixas doses de álcool apresentam rubor facial, palpitações e náuseas. Esses
sintomas ocorrem devido ao acúmulo de acetaldeído. A mutação ALDH2*2 é caracterizada
pela substituição pontual do glutamato por uma lisina na região 487 da ALDH2, resultando na
perda de densidade dos elétrons próximos aos resíduos 245-262 que formam a α-hélice G, e
dos resíduos 466-478 que formam o “loop” do sitio ativo, gerando uma desestabilização do
sítio de ligação do co-fator NAD+, o que confere perda de até 95% na sua atividade
enzimática (Chen, Ferreira et al., 2014). Alguns estudos retratam a mutação na região 504 da
enzima por levar em consideração o peptídeo sinal da porção N-terminal.
A ALDH2 é uma enzima homo-tetramérica de ~56 kDa, possui 517 polipeptídeos e está
localizada na matriz mitocondrial. Sua codificação ocorre em um gene localizado no núcleo,
cromossomo 12 região q24,1. Após a codificação, a enzima é transportada para matriz
mitocondrial em um processo que depende do peptídeo sinal localizado na porção N-terminal
(17 aminoácidos). Na matriz mitocondrial ocorre a clivagem do peptídeo sinal, permitindo a
maturação completa da enzima, Cada subunidade da enzima é composta por três domínios:
um domínio catalítico (formado por 3 resíduos de cisteína: Cys 301, 302 e 303), um domínio
de ligação da co-enzima NAD+ e um domínio de oligomerização (Chen, Ferreira et al., 2014).
29
A ALDH2 é responsável tanto pelo metabolismo do acetaldeído produzido a partir do
etanol, pela enzima álcool desidrogenase (ADH), como pelo metabolismo de aldeídos
alifáticos de cadeia curta e cadeia longa, sendo responsável pela conversão oxidativa do
4HNE a aldeídos menos tóxicos (4-hidroxi-2-nonenóico, 4HNA) (Hummel, Pauli et al.,
2010). A localização mitocondrial da ALDH2 é de particular importância na remoção de
4HNE, uma vez que a membrana interna da mitocôndria é rica em ácidos graxos insaturados,
sendo um importante alvo de ataque de radicais livres gerados na própria organela (Hulbert et
al., 2007).
Chen e colaboradores demonstraram que a atividade da ALDH2 cardíaca apresenta uma
correlação inversa com a área de infarto após isquemia cardíaca (Chen, Budas et al. 2008). De
fato, a ativação direta ou indireta da ALDH2 durante a isquemia cardíaca tem efeito protetor e
resulta em menores danos ao miocárdio (Chen, Budas et al., 2008). Este efeito benéfico é
decorrente, pelo menos em parte, da maior remoção do 4HNE pela ALDH2. É importante
ressaltar que esse aldeído regula negativamente a atividade da ALDH2, ou seja, quanto maior
a quantidade de 4HNE, menor é a atividade da ALDH2 (Petersen, Doorn, 2004). O
mecanismo sugerido para inativação da ALDH2 é a ligação covalente do 4HNE ao grupo tiol
do sitio catalítico da enzima (Cys 302). Até o momento, esse fenômeno foi demonstrado
apenas em modelo in vitro e na presença de altas concentrações de 4HNE (Doorn et al.,
2006).
Na tentativa de melhor elucidar os mecanismos envolvidos na remoção de aldeídos
tóxicos, bem como os seus feitos deletérios, diversos estudos utilizam modelos geneticamente
modificados para ALDH2, Fernandez e colaboradores analisaram animais nocautes para
ALDH2 e constataram que esses animais apresentam acúmulo de aldeídos tóxicos e maior
suscetibilidade à lesão cardíaca em modelo de isquemia e reperfusão (I/R) (Fernandez et al.,
2006). Outro estudo utilizando animais que hiper-expressam a ALDH2 demonstrou que esses
animais apresentam uma proteção contra lesões agudas e crônicas induzidas pelo estresse
oxidativo ou pela toxicidade do etanol (Doser et al., 2009). Esses resultados conferem um
papel cardioprotetor para enzima ALDH2.
Baseado nos efeitos cardioprotetores da ALDH2,
Mochly-Rosen e colaboradores descobriram por meio de
high–throughput screen uma molécula,N-(1,3-benzodioxol-
5-dylmethyl)-2,6-dichlorobenzamide, capaz de aumentar a
atividade da ALDH2, essa molécula foi chamada de Alda-1
30
(aldehyde dehydrogenase activator 1). A Alda-1 aumenta a atividade da ALDH2 em até duas
vezes, em comparação com sua atividade basal. Essa molécula possui elevada especificidade,
não apresentando atividade sobre a enzima aldeído desidrogenase-1 (citosólica) ou sobre a
enzima aldeído desidrogenase-5 (mitocondrial) (Chen, Budas et al., 2008). A ativação da
ALDH2 pela Alda-1 é devido à ligação da molécula nas proximidades dos resíduos Cys
302/Glu 286 importantes para a catálise do substrato, isso causa uma drástica redução do Km
da ALDH2 para o co-fator NAD+ e aumento do Vmáx, da catálise do substrato, aumentado a
hidrólise e liberação do produto catalítico. Na enzima mutante a Alda-1 restaura a estrutura da
α-hélice e do “loop” da enzima mutante, aumentando em até 11 vezes sua atividade (Chen,
Ferreira et al., 2014).
Recentemente nosso grupo demonstrou em modelo de I/R que a ativação seletiva da
ALDH2, pela Alda-1, foi suficiente para induzir cardioproteção após processo isquêmico
(Sun, Ferreira et al., 2011). A Alda-1 foi desenvolvida por nossos colaboradores (Chen, Budas
et al., 2008) e a partir de 2008 diversos estudos utilizaram a Alda-1 em diferentes modelos
experimentais na tentativa de reduzir os danos causados pela toxicidade de aldeídos. Solito e
colaboradores demonstraram que 20 µM de Alda-1 foi capaz de prevenir disfunção de células
endoteliais de humanos e restaurar a angiogênese (Solito et al., 2013). Outros estudos
demonstraram que a Alda-1 é capaz de melhorar o fluxo autofágico (Ge et al., 2011) e de
reduzir a disfunção contrátil, apoptose e dano mitocondrial cardíaco em modelo experimental
de diabetes, (Zhang et al., 2012), sendo estes efeitos decorrentes, pelo menos em parte, da
diminuição na formação dos adutos de 4HNE. De fato, Nakamura e colaboradores
demonstraram que a redução de 40% das concentrações de 4HNE foi capaz de melhorar a
função cardíaca em pacientes com cardiomiopatia dilatada (Nakamura et al., 2002).
Baseado nesses resultados, concluí-se que a ativação da ALDH2 e consequente redução
do 4HNE se mostra de grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias ou
fármacos que auxiliem no tratamento do infarto agudo do miocárdio. Entretanto, não se sabe
ao certo quais são os benefícios da ativação sustentada da ALDH2 no desenvolvimento e
progressão da IC.
31
3 JUSTIFICATIVA
Além da hiperativação de fatores neuro-hormonais na IC, a progressão da síndrome é
caracterizada por uma série de anormalidades celulares associadas ao remodelamento
cardíaco e disfunção ventricular (Rolim et al., 2007). Dessa forma, a compreensão dos
mecanismos celulares responsáveis pelo agravamento da disfunção cardíaca na progressão da
IC é atualmente um importante foco de estudo. Mais especificamente, alterações na função
mitocondrial e o acúmulo de produtos oriundos do estresse oxidativo, como o 4HNE, parecem
contribuir para o desenvolvimento e/ou agravamento da IC. Considerando a contribuição da
enzima ALDH2 na remoção do 4HNE produzido durante o estresse oxidativo (Petersen,
Doorn, 2004), levantamos a hipótese que durante a IC, ocorre acúmulo de 4HNE pelo
aumento do estresse oxidativo, resultando na inativação de importantes proteínas envolvidas
no metabolismo celular através da formação de adutos de Michaelis (Figura 3). Esse processo
resulta em um ciclo vicioso, uma vez que cronicamente o acúmulo de adutos de Michaelis
contribui para o desbalanço redox e consequente progressão da IC.
32
Figura 3 – Esquema ilustrativo da nossa hipótese: 1, O desequilíbrio redox observado na IC,
decorrente da alteração no metabolismo mitocondrial, resulta em elevada oxidação de fosfolipídios
presentes na membrana interna da mitocôndria e conseqüente formação do aldeído 4-hidroxi-2-
nonenal (4HNE); 2, Em condições fisiológicas o 4HNE é metabolizado pela enzima aldeído
desidrogenase 2 (ALDH2), presente na matriz mitocondrial; 3, O acúmulo de 4HNE, resultado do
estresse oxidativo exacerbado e/ou inativação da ALDH2, resulta na formação do aduto de Michaelis
entre 4HNE e resíduos nucleofílicos (cisteína, histidina e lisina) de diferentes proteínas, acarretando na
inativação de proteínas-alvo; 4/5, O aumento da formação dos adutos de Michaelis resulta em
disfunção mitocondrial, desequilíbrio redox, prejuízo contrátil e colapso/morte celular, e
consequentemente, agravamento da IC; 6/7, A identificação dos alvos celulares do 4HNE bem como a
utilização de terapias farmacológicas capazes de aumentar a atividade da ALDH2 serão de grande
valia para o tratamento da IC,
Esse estudo torna-se interessante uma vez que a compreensão mais detalhada do papel
da ALDH2 na IC poderá contribuir para o futuro emprego de terapias que atuem em
mecanismos-chave envolvidos na fisiopatologia da IC, como o ativador da ALDH2, Alda-1.
Além disso, tendo em vista que a mutação a ALDH2*2 se relaciona com o aparecimento de
diversas doenças cardiovasculares, o nosso estudo poderá ter relevância clínica para esta
população. Até o momento foram publicados apenas 16 estudos utilizando a Alda-1. As
publicações deram início no ano de 2008, sendo 1 artigo de caracterização da molécula (Chen,
Budas et al., 2008), 2 artigos de revisão (Ferreira, Mochly-Rosen, 2012; Hummel, Pauli et al.,
2010), 1 sobre os mecanismos moleculares (Perez-Miller et al., 2010), 3 com modelo de
33
isquemia e reperfusão cardíaca (Fu et al., 2014; Gu et al., 2013; Masi et al., 2013; Sun,
Ferreira et al., 2011), e 9 envolvendo estresse do retículo (Zhang et al., 2013), autofagia (Ge,
Guo et al., 2011), radiação (Ning et al., 2012), diabetes (Zhang, Babcock et al., 2012),
nitroglicerina (Beretta et al., 2010), disfunção endotelial (Solito, Corti et al., 2013),
regeneração hepática (Ding et al., 2014), cardioplegia (Gong et al., 2012) e seletividade da
ALDH2 (Kotraiah et al., 2013).
Atualmente, não foi publicado nenhum trabalho utilizando o tratamento sustentado com
Alda-1 e sua contribuição na função/morfologia cardíaca em modelos crônicos de doenças
cardiovasculares, o que fortalece a relevância e originalidade do presente projeto.
34
4 OBJETIVOS
Estudo 1: Caracterizar a atividade da ALDH2, o balanço redox e o metabolismo mitocondrial
nos períodos de 1, 2, 4 e 10 semanas após o infarto do miocárdio em ratos. Para isso
avaliamos ao longo do tempo as seguintes variáveis:
Função cardíaca;
Atividade da ALDH2;
Peroxidação lipídica no lisado cardíaco;
Quantidade total de glutationa cardíaca;
Consumo de oxigênio da mitocôndria cardíaca isolada;
Liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2) pela mitocôndria cardíaca isolada.
Estudo 2: Melhor compreender o papel da ALDH2 na progressão da IC de etiologia isquemia
com a utilização da Alda-1 em ratos. Para isso, os animais Sham e IC foram tratados com
Alda-1 por seis semanas. O tratamento iniciou-se quatro semanas após a cirurgia (Figura 4).
Figura 4 - Esquema ilustrativo do período experimental, cirurgia e tratamento na IC induzida por
infarto do miocárdio.
Ressaltamos que nesse momento os ratos infartados apresentam sinais de IC, como
remodelamento cardíaco, dilatação ventricular e disfunção diastólica. As variáveis analisadas
foram:
Função cardíaca em repouso e mediante estresse;
Tolerância à realização de esforços físicos;
Comportamento da pressão arterial e freqüência cardíaca no repouso;
35
Morfologia cardíaca (área de infarto, diâmetro dos cardiomiócitos e deposição de
colágeno cardíaco);
Atividade e expressão da ALDH2 no lisado cardíaco;
Formação do aduto de Michaelis (4HNE-proteína) no lisado cardíaco;
Expressão de proteínas carboniladas no lisado cardíaco;
Consumo de oxigênio da mitocôndria cardíaca isolada;
Liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2) pela mitocôndria cardíaca isolada;
Permeabilidade dos poros mitocondriais;
Liberação de citocromo c pela mitocôndria;
Ação do 4HNE em mitocôndria cardíaca isolada in vitro;
Peroxidação lipídica no lisado cardíaco;
Atividade das enzimas antioxidantes: superóxido desmutase e catalase no lisado
cardíaco;
Toxidade da Alda-1.
36
5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Amostra
O presente estudo teve a aprovação do comitê de Ética do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo (n° 036/127/02). Para a realização projeto, foram
utilizados ratos Wistar machos (250-300 gramas) provenientes do Biotério Central do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. Os ratos utilizados neste
estudo foram mantidos em Biotério, com temperatura controlada entre 22 e 25oC, ciclo claro-
escuro 12: 12 horas. Água e comida foram administradas ad libitum. Este estudo foi
conduzido de acordo com os princípios éticos em pesquisa animal adotado pela Sociedade
Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL, www,cobea,org,br).
5.2 Protocolo de cirurgia cardíaca para indução do infarto do miocárdio
A cirurgia cardíaca para a indução do infarto do miocárdio foi realizada em ratos com
doze semanas de idade. Inicialmente os ratos foram anestesiados com uma mistura de
ketamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intraperitoneal e foram entubados para ventilação
mecânica (frequência respiratória de 60-70 ventilações/minuto e volume tidal de 2,5 mL).
Uma toracotomia esquerda, sob condições assépticas, foi realizada no terceiro espaço
intercostal e o pericárdio foi aberto. Foi realizada uma ligadura permanente na artéria
coronária descendente anterior esquerda distalmente a 2 mm de sua origem com fio de
polipropileno não absorvível (5,0, ETHICON, Brasil), finalizando com o fechamento do
tórax, conforme protocolo descrito por Johns e Olson (Johns, Olson, 1954). No período pós-
cirúrgico os animais foram tratados com injeções intraperitoneais de Ampicilina (7 mg/kg) e
Dipirona (7 mg/kg). Para o estudo 1, os animais foram acompanhados ao longo de 10
semanas pós-infarto do miocárdio, sendo as análises realizadas nas semanas 1, 2, 4 e 10. Já no
estudo 2, os grupos experimentais foram divididos da seguinte forma: grupo Sham, que
passou por uma cirurgia fictícia; grupo insuficiência cardíaca (IC) tratado com uma solução
veículo (50% DMSO/50% PEG 400); e grupo insuficiência cardíaca tratado com Alda-1 (IC
Alda-1). As análises foram realizadas 4 e 10 semanas após a cirurgia.
37
5.3 Tratamento
No estudo 2, os animais dos grupos IC foram tratados com Alda-1 (10 mg/kg/dia) ou
solução veículo (50% DMSO/50% PEG 400) por meio da implantação de mini-bombas
osmóticas (Alzet, modelo 2 ml2, 50 l/hora) no dorso. O tratamento teve duração de 6
semanas, iniciando na 4ª semana após a cirurgia de infarto do miocárdio, fase em que a IC
já está estabelecida. Para a implantação das mini-bombas osmóticas, os ratos foram
anestesiados com uma mistura de ketamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg)
intraperitoneal, Após a cirurgia, os animais receberam injeções intraperitoneais de
Ampicilina (7 mg/kg) e Dipirona (7 mg/kg) por um período de cinco dias. As mini-
bombas osmóticas foram trocadas a cada duas semanas de tratamento. A Alda-1 foi
gentilmente cedida pela nossa colaboradora da Universidade de Stanford, Profa. Dra.
Daria Mochly-Rosen.
5.4 Avaliação da função ventricular
A avaliação da função ventricular no estudo 1 foi realizada por ecocardiografia modo
M no Laboratório de Biologia Vascular do Instituto do Coração (InCor) em colaboração com
o Dr. Paulo M, M, Dourado. Já no estudo 2, realizamos tanto o modo M quanto o Doppler
tecidual. Para a análise ecocardiográfica os animais foram anestesiados com uma mistura de
ketamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intraperitoneal. A partir da visualização do
ventrículo esquerdo (corte transversal) na altura dos músculos papilares foi realizado o exame
e obtidos os seguintes parâmetros: Diâmetro diastólico e sistólico final do ventrículo
esquerdo, espessura do septo intraventricular na diástole e na sístole e espessura da parede
posterior do ventrículo esquerdo na diástole e na sístole. Além disso, baseado nos dados
oferecidos pelo equipamento calculamos a fração de encurtamento do ventrículo esquerdo
(FEnc), pela fórmula FEnc (%) = [(DdVE-DsDV)/DdVE)]x100, onde DsVE é o diâmetro
sistólico final do ventrículo esquerdo, o DdVE é o diâmetro diastólico final do ventrículo
esquerdo. As medidas ecocardiográficas seguiram as recomendações do Comitê de
Padronização do modo M (monodimensional) da Sociedade Americana de Ecocardiografia
(Sahn et al., 1978).
O método Doppler tecidual foi realizado no sistema Vevo 770 ultra-som (Visual Sonics,
Canadá), equipado com um transdutor mecânico de alta resolução (17 MHz-scanhead
RMV716). Em resumo, o fluxo sanguíneo cardíaco foi avaliado no eixo longo paraesternal de
38
acordo com as recomendações da Sociedade America de Ecocardiografia (Pellikka et al.,
2013). O fluxo mitral padrão foi avaliado a partir do corte apical das 4 câmaras com Doppler
pulsátil. Da mesma forma, foi realizada a avaliação do Doppler tecidual.
5.5 Teste de tolerância ao esforço
O teste de esforço ou teste ergométrico é utilizado na clínica para determinar a classe
funcional da IC de acordo com as determinações da New York Heart Association (NYHA)
(Tang et al., 2010), uma vez que algumas anormalidades cardíacas podem ser aparentes
somente após a realização de um exercício máximo até a exaustão.
A capacidade máxima de realização do exercício físico foi avaliada na 4ª e 10ª semana
após a cirurgia de infarto do miocárdio por meio de um teste progressivo até a exaustão em
esteira rolante (estudo 2). Foi realizado um exercício progressivo escalonado até a exaustão
em esteira rolante, onde a velocidade inicial da esteira foi de 6 m/min sem inclinação. A cada
três minutos, a velocidade da esteira sofreu um acréscimo de 3 m/min até a exaustão do
animal (Ferreira et al., 2007). As variáveis medidas foram o tempo total e a distância em
metros percorrida por cada animal durante o teste máximo. Essas análises foram realizadas
em colaboração com a Profa. Dra. Patrícia Chakur Brum, no laboratório de Fisiologia Celular
e Molecular do Exercício da EEFE-USP. Não foi possível realizar essas análises no estudo 1
pela logística proposta no estudo.
5.6 Medidas de frequência cardíaca e pressão arterial
Com o intuito de acompanhar possíveis alterações hemodinâmicas no estudo 2, realizamos
a medida indireta da pressão arterial sistólica e da frequência cardíaca através do método de
pletismografia de cauda (RTBP 101 Kent Scientific Corporation, Litchfield, conn., EUA),
conforme previamente padronizado (Rolim, Medeiros et al., 2007). Depois de um período de
adaptação dos animais, foram coletados cinco registros consecutivos por meio de um
esfigmomanômetro de cauda. Esses registros foram realizados em três diferentes dias da
semana, sendo ulteriormente calculada a média dos valores obtidos. As medidas forma
coletadas na 4ª e 10ª semana pós-infarto do miocárdio.
39
5.7 Avaliação da hemodinâmica cardíaca
A avaliação da hemodinâmica cardíaca (método invasivo) foi realizada em repouso e
frente ao aumento da pós-carga induzido por fenilefrina. Essa análise foi realizada em
colaboração com o Prof. Dr. José Eduardo Krieger no Laboratório de Genética e Cardiologia
Molecular do InCor-HCFMUSP. Para a realização desse experimento a veia femoral esquerda
foi canulada para anestesia suplementar, injeção de drogas e salina. Um cateter de pressão-
volume MicroTip (modelo 1,4 French SPR 839; Millar Instruments, Houston, TX) foi
inserido na artéria carótida direita e posicionado imediatamente acima da válvula aórtica para
monitorar a pressão sanguínea cardíaca. Após 5 minutos de medição da pressão sanguínea
arterial, o cateter foi introduzido na cavidade do ventrículo esquerdo para medidas
simultâneas e contínuas de pressão e volume. A veia jugular direita também foi canulada, e 10
µl de solução salina 15% foram injetados para medir a condutância paralela. A calibração
para volume foi realizada usando uma regressão linear da condutância do volume de sangue
total (4 câmaras cilíndricas contendo um volume especificado de sangue de rato recém
heparinizado) versus o sinal adquirido pelo cateter de condutância. Os dados foram adquiridos
através do LabChart 7 Software System (PowerLab, ADInstruments, Bella Vista, NSW,
Austrália) (Pacher et al., 2008). Os seguintes parâmetros foram obtidos: frequência cardíaca
(FC), pressão arterial diastólica e sistólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE e PSFVE,
respectivamente), derivada positiva de pressão do ventrículo esquerdo sobre o tempo (+dP/
dtmax) e derivada negativa de pressão do ventrículo esquerdo sobre o tempo (-dP/dtmax),
volume sistólico (VS), débito cardíaco (DC) e trabalho cardíaco (TC). Os parâmetros
hemodinâmicos foram determinados sob condições basais e durante uma sobrecarga de
pressão com a injeção do vasoconstrictor fenilefrina (PHE) (25–75 mg/kg peso corporal) na
veia femoral esquerda após vagotomia, que foi realizada para prevenir alterações nos valores
de frequência cardíaca pelo baroreflexo. As doses de PHE foram ajustadas para cada animal
para produzir elevações comparáveis de pressão sanguínea (60% a 80% maior que no basal).
A inclinação da relação linear entre a pressão e o volume sistólico final foi obtida durante a
oclusão transiente da veia cava inferior nos grupos de animais, para medir os resultados
médios do desempenho cardíaco (Pacher, Nagayama et al., 2008).
40
5.8 Sacrifício e coletas de tecidos
Vinte e quatro horas após o último experimento, os animais foram anestesiados e
decapitados, sendo os tecidos rapidamente coletados e armazenados a -80°C. Após o
sacrifício foi realizada a excisão do coração para ulterior pesagem. Para as análises
moleculares cardíacas utilizamos a região do coração não infartada (área remota). Para o
isolamento da mitocôndria utilizamos todo o coração. Também foram coletados pulmão e
fígado para calcular a razão peso úmido/seco, além do soro plasmático para posteriores
análises.
5.9 Avaliação morfométrica cardíaca
Para as análises histológicas, parte do ventrículo esquerdo (porção medial) foi colocada
em solução KCl e fixada em paraformaldeído a 4% por um período de 48 horas à temperatura
ambiente. Em seguida, os tecidos foram desidratados por lavagens com etanol 70%, 80%,
90% e 100% sequencialmente. Após as lavagens, o tecido passou por um processo de fixação
em parafina por 48 horas, e posteriormente submetido ao processamento histológico com
cortes de 5 µm ao longo de seu maior eixo (Savergnini et al., 2013). A análise morfométrica
cardíaca foi realizada através da determinação do tamanho da área infartada (corado com
tricomo de Masson), medida do diâmetro dos cardiomiócitos (corado com hematoxilina e
eosina) e avaliação do grau de fibrose do miocárdio (corado com Picrosírius Red).
Todas as análises foram realizadas em corte medial do ventrículo esquerdo. A medida do
diâmetro transverso dos cardiomiócitos foi realizada em sistema computadorizado (LEICA
QUANTIMET 500) acoplado a um microscópio óptico com aumento de 400x. Os
cardiomiócitos utilizados para medida estavam localizados na área remota, ou seja, fora da
área infartada, na parede livre do ventrículo esquerdo e orientados em corte longitudinal. O
diâmetro dos cardiomiócitos foi calculado a partir de uma média de 10 valores por animal
(Ferreira et al., 2008). Para a análise do grau de fibrose foi realizada uma varredura completa
da parede ventricular por sistema computadorizado (Imaging Software NIS- Elements AR
3,1). As imagens foram capturadas em objetiva 20x e a densidade de fibras do colágeno tipo I
(vermelho) e tipo III (verde) foi quantificada com uma ferramenta do programa que reconhece
a variação de cor da imagem usando canais de cor vermelha, verde e azul, permitindo
identificar uma cor por vez, dando a intensidade média da cor na área determinada, sendo que
cada campo equivale a 75384,53 m2. As fibras colágenas foram analisadas sob luz
41
polarizada (Whittaker et al., 1994). Esta análise teve como objetivo identificar possíveis
alterações histopatológicas decorrentes da IC de etiologia isquêmica, bem como os possíveis
benefícios do tratamento com o ativador da ALDH2, Alda-1, As análises histológicas foram
realizadas somente no estudo 2.
5.10 Atividade da enzima ALDH2
A atividade da enzima ALDH2 foi avaliada em mitocôndria cardíaca isolada e medida por
espectrofotometria. Na reação foram adicionados 100 mM de pirofosfato de sódio (pH 9,5),
10 mM de β-Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), 10mM de acetaldeído e 0,1% de
DL-Ditiotreitol (DTT) em volume final de 1 ml. A cinética enzimática da ALDH2 foi
avaliada através da formação de NADH. Esta pode ser medida pelas mudanças na absorbância
(ʎex= 340 nm) por um período de 10 minutos (Chen, Budas et al., 2008). O ensaio consiste na
clivagem do acetaldeido em ácido acético com doação do próton H+ para coenzima NAD+
(forma oxidada), formando NADH (forma reduzida).
5.11 Caracterização da função mitocondrial cardíaca
Isolamento da mitocôndria
Logo após o sacrifício dos animais, os corações foram retirados e a mitocôndria foi
isolada conforme descrito previamente por Tahara et al, 2009 (Tahara, Navarete et al., 2009).
O tecido foi colocado no tampão de lise (Sacarose 300 mM, Hepes 10 mM, EGTA 2 mM,
pH 7,2, 4° C) e triturado na presença de 0,1 mg/ml de protease do tipo I (bovine pancreas)
para liberação das mitocôndrias das fibras musculares cardíacas. Após esse procedimento, a
suspensão foi lavada no mesmo tampão, na presença de 0,1 mg/ml de BSA e homogeneizada
em um moedor de tecido de 40 ml. O homogenato foi centrifugado a 1000g por 5 min (4oC).
O sobrenadante resultante foi centrifugado a 9500g por 10 min (4°C). O pelete resultante foi
lavado, ressuspendido no tampão de lise e submetido a uma nova centrifugação (9500g por 10
42
min, 4ºC). O pelete mitocondrial resultante foi lavado e o pelete final foi ressuspendido no
tampão de lise.
Consumo de oxigênio na mitocôndria cardíaca isolada
A medida do consumo de oxigênio mitocondrial foi realizada utilizando-se um eletrodo
específico de oxigênio (do tipo Clark) acoplado a um registrador (Oxygraph System,
Hansatech), previamente descrito por da Silva et al, 2003 (da Silva et al., 2003). O eletrodo é
composto por um cátodo de platina e um ânodo de prata, imersos em solução eletrolítica de
KCl. A reação se processa pela corrente gerada entre os eletrodos e é relacionada à
concentração de oxigênio na superfície do cátodo. Cada amostra de mitocôndria cardíaca foi
diluída em tampão de KCl (Sacarose 125 mM, KCL 65 mM, Hepes, 10 mM, KH2PO4 2 mM,
MgCl2 2 mM, 0,01% BSA, pH 7,2) numa concentração final de proteína de 0,125 mg/ml. Os
registros de consumo de oxigênio foram feitos na presença de succinato (2 mM), malato-
glutamato (2 mM) e ADP (1 mM). Um inibidor do complexo V (Oligomicina 1 µg/ml) foi
adicionado para inibir sua atividade durante esse ensaio. Além disso, utilizamos um
desacoplador da membrana interna da mitocôndria (CCCP – Carbonyl Cyanide m-
Chlorophenyl Hydrazone, 1 µM) para estimular o consumo máximo de oxigênio. Os valores
estão expressos em micromoles por minuto por miligrama de proteína.
Liberação de peróxido de hidrogênio pela mitocôndria cardíaca isolada
A produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) mitocondrial foi avaliada por
espectrofluorimetria. Cada amostra de mitocôndria cardíaca foi diluída em um tampão de KCl
43
(Sacarose 125 mM, KCL 65 mM, Hepes, 10 mM, KH2PO4 2 mM, MgCl2 2 mM, 0,01%
BSA, pH 7,2) numa concentração final de proteína de 0,125 mg/ml. A produção de H2O2 foi
determinada pela geração de resorufina, fruto da oxidação do Amplex Red (25 μM) na
presença de horseradish peroxidase (0,5 U/ml), identificada pelos comprimentos de onda de
563 nm para excitação e 587 nm para emissão. O ensaio foi realizado na presença de
succinato (2 mM), malato-glutamato (2 mM), ADP (1 mM) e Oligomicina (1 µg/ml) (Tahara,
Navarete et al., 2009). Também foi realizada a quantificação da produção de H2O2 na
presença de inibidores do complexo I (rotenona, 2 μM), complexo III (antimicina A, 0,15
μg/ml) e CCCP (1 µM). A quantificação dos valores foi feita após uma calibração com
quantidades conhecidas de H2O2, expressos em micromoles por minuto por miligrama de
proteína. Esse procedimento foi realizado em colaboração com a Profa. Dra. Alicia Juliana
Kowaltowski, no Laboratório de Mitocôndrias e Viabilidade Celular do Instituto de Química
da Universidade de São Paulo (IQ-USP).
Permeabilidade dos poros da mitocôndria cardíaca isolada
A abertura dos poros mitocondriais foi determinada pela máxima captação de cálcio
medida por espectrofluorimetria. Cada amostra de mitocôndria cardíaca foi diluída em um
tampão de KCl (Sacarose 125 mM, KCL 65 mM, Hepes, 10 mM, KH2PO4 2 mM, MgCl2 2
mM, 0,01% BSA, pH 7,2) numa concentração final de proteína de 0,125 mg/ml. Após a
adição de Calcium Green (0,1 μM), succinato (2 mM), malato-glutamato (2 mM) e
subsequentes adições de 50 µM de CaCl2, a abertura dos poros foi determinada por mudanças
na fluorescência (ʎex= 506 nm e ʎem= 532 nm), e os valores foram expressos em micromoles
por minuto por miligrama de proteína. Para confirmar se o inchamento é derivado da abertura
dos poros de transição mitocondrial (PTM), realizamos o mesmo ensaio na presença de
ciclosporina A (15 nM) um inibidor dos PTMs (Hermes-Lima et al., 1995).
5.12 Análise da expressão de proteínas mitocondriais e citosólicas
A análise da expressão protéica no tecido cardíaco foi realizada por meio da técnica de
Western blot. Na fração mitocondrial foram quantificadas as proteínas: ALDH2 e citocromo
c; já na fração citosólica foram quantificados os adutos de Michaelis, proteínas carboniladas e
citocromo c. Para isso, as amostras contendo tampão Laemmli (Tris-HCl 240 mM, SDS 0,8%,
Glicerol 40%, Azul de bromofenol 0,02%, β-mecaptoetanol 200 mM) (Laemmli, 1970),
44
foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 10%) no aparelho para
minigel (Mini-Protean). Em seguida as proteínas foram transferidas eletricamente para uma
membrana de PVDF utilizando o aparelho Mini-Trans Blot da Bio-Rad. A transferência teve
duração de ~1h sob 100 volts. As membranas foram coradas com Ponceau S (0,1%), para a
verificação da qualidade das amostras bem como da eficácia da transferência. A ligação
inespecífica de proteínas na membrana de nitrocelulose foi diminuída pela incubação de 10 ml
de solução bloqueadora (5% BSA em TBS - Tris-Base 50 mM, NaCl 0.9%) por 2 horas em
temperatura ambiente. Estas membranas foram posteriormente incubadas com os anticorpos
primários para as respectivas proteínas, diluídos em solução bloqueadora a 4°C overnight. Na
sequência as mesmas foram lavadas 3x10 min com TBS-T (Tris-Base 50 mM, NaCl 0.9%,
Tween 20 0,1%), incubada por 1 hora com o anticorpo secundário anti-IgG marcado com
peroxidase em solução bloqueadora. Por fim, a imuno-detecção foi realizada por meio do
método de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante (Enhancer Chemi-
Luminescence, Amersham Biosciences, EUA). As análises quantitativas dos blots foram
realizadas por meio do programa Image J (Scion Corporation based on NIH image), fornecido
gratuitamente pela NIH (USA) via Internet. O gliceroldeído-3-fosfato desidrogenase
(GAPDH) foi utilizado como normalizador (Rolim, Medeiros et al., 2007).
5.13 Peroxidação lipídica
Para a análise da peroxidação lipídica utilizamos o método FOX (Ferrous Oxidation in
Xylenol Orange), que é baseado na oxidação do ferro II a ferro III pelos hidroperóxidos
lipídicos. O ferro III reage com o xilenol orange produzindo um cromóforo azul púrpura que
tem absorção máxima em 560 nm (Hermes-Lima, Willmore et al., 1995). Parte do tecido
cardíaco foi homogenizado em tampão fosfato (50 mM, pH 7,8), centrifugadas a 12,000 rpm
por 15 minutos (4 °C) , após a centrifugação foi retirado o sobrenadante e adicionado metanol
absoluto em uma proporção de 1:10 (metanol:amostra). As amostras ficaram no gelo por um
período de 10 minutos e uma nova centrifugação foi realizada por um período de 10 minutos a
1000 g (4 °C), o sobrenadante foi retirado para a realização do experimento. Na reação foi
adicionado sulfato de ferro amonical (1 mM), ácido sulfúrico (250 mM) e xylenol orage (1
mM). A análise foi realizada em espectrofotômetro e os resultados foram expressos em
nmol/mg de proteína.
45
5.14 Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes
Superóxido dismutase
A atividade da superóxido dismutase (SOD) foi avaliada por um método que consiste na
queda da frequência de redução de citocromo c por radicais superóxidos gerados pelo sistema
xantina-xantina oxidase, proporcionada pela SOD presente na amostra testada, que compete
com o citocromo c pelos radicais gerados, conforme ilustrado abaixo:
Parte do tecido cardíaco foi homogeneizado em tampão fosfato (50 mM PBS pH7,4,
EDTA 1mM) e centrifugado em 12000g durante 15 minutos (4°C). Inicialmente, a taxa de
redução de citocromo c foi avaliada na ausência de amostra, pela leitura da taxa de alteração
de absorbância em 550 nm durante 5 minutos, em solução contendo citocromo c (19 mM),
xantina (1,18 mM) e xantina oxidase diluídos em tampão fosfato (0,05 M, pH 7,8). A
concentração de xantina oxidase foi ajustada para uma taxa de redução de citocromo c de
0,025 unidades de absorbância por minuto (UA/min). Na sequência a taxa de redução de
citocromo c foi acompanhada durante 5 minutos na presença da amostra diluída na solução
supracitada. A atividade da SOD da amostra foi então calculada pela diferença entre a taxa de
oxidação de citocromo c na ausência e na presença de amostra (McCord, Fridovich, 1969).
Atividade da catalase
A atividade da catalase foi avaliada pelo acompanhamento da decomposição de peróxido
de hidrogênio adicionado às amostras e por meio de leitura de absorbância em 240nm em
espectrofotômetro. Os tecidos cardíacos foram homogeneizados em tampão fosfato (50 mM
PBS, pH 7,4 + 1mM EDTA) e centrifugados a 12000 g durante 15 minutos (4°C). A fração
46
sobrenadante foi utilizada no ensaio. Peróxido de hidrogênio foi adicionado ao lisado na
concentração final de 10 mM e a absorbância em 240nm foi acompanhada durante 4 minutos
(Avramovic et al., 2012). A taxa de decaimento da absorbância corresponde à atividade de
catalase presente na amostra testada. Os resultados foram expressos em U/mg de proteína.
Níveis de glutationa
Os níveis de glutationa do tecido cardíaco foram determinados espectrofotometria, tal
como descrito anteriormente (Correa-Costa et al., 2011). O ensaio é baseado na reação da
glutationa reduzida (GSH) com o ácido 5,5’ ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB) que produz
aduto de glutationa oxidada TNB (GS-TNB) e o cromóforo TNB, que tem máxima
absorbância a 412 nm. O produto GS-TNB é, então, reduzido pela glutationa redutase na
presença de NADH. A taxa de formação de TNB é proporcional à concentração de glutationa
da amostra.
5.15 Avaliação da toxicidade hepática
Para avaliar a possível toxicidade causada pelo tratamento sustentado com Alda-1,
utilizamos como marcadores as enzimas alanina aminotransferase (ALT) e aspartato
aminotransferase (ASP) analisados no soro dos animais. Para as análises foram utilizados kits
comerciais da marca Randox, produtos AL3801 e AS3804, respectivamente. A análise foi
realizada no aparelho analisador bioquímico automatizado, marca Randox, modelo Daytona.
Essas análises foram realizadas pela Dra. Clara Satsuki Mori da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da USP/SP.
5.16 Análise estatística
Inicialmente a distribuição dos dados obtidos nesse estudo foi testada por meio do teste de
Shapiro-Wilk. Os dados obtidos neste estudo foram apresentados na forma de média ± erro
padrão e comparados pela análise de variância (ANOVA) de um ou dois caminhos (cirurgia e
tratamento como fatores independentes) seguida de post hoc de Duncan. Para todas as
análises, foi adotado como nível de significância p ≤0,05.
47
6 RESULTADOS (Estudo 1)
6.1 Modelo experimental e ecocardiograma modo M do curso temporal após infarto do
miocárdio
O desenho experimental utilizado para caracterizar a atividade enzimática da ALDH2 na
progressão da disfunção cardíaca após infarto do miocárdio está ilustrado na Figura 5A. Ratos
com doze semanas de idade foram submetidos à cirurgia cardíaca, que consiste na ligadura
crônica da artéria coronária descendente anterior (ACDA). No dia seguinte, os animais
realizaram um exame de ecocardiograma modo M para avaliação da função cardíaca e análise
da efetividade da cirurgia. Os animais foram selecionados para o estudo com base na função
cardíaca (fração de encurtamento ventricular esquerda <30%) e divididos em 4 diferentes
grupos: 1, 2, 4 e 10 semanas pós-infarto do miocárdio. Com o intuito de acompanhar a
evolução da disfunção cardíaca após infarto do miocárdio, o exame ecocardiográfico modo M
foi realizado no final de cada período experimental. Em seguida, os animais foram
sacrificados e avaliamos os seguintes parâmetros: atividade da ALDH2, peroxidação lipídica,
níveis de glutationa e consumo de O2 e liberação H2O2 mitocondrial. Essas análises foram
realizadas no tecido cardíaco total, incluindo áreas viáveis e não viáveis.
Conforme observado na Figura 5, os animais que realizaram a cirurgia de infarto do
miocárdio apresentaram significativa redução das frações de encurtamento e ejeção cardíaca
ao longo do tempo quando comparados ao grupo controle (Sham) (Figuras 5B-C). Além
disso, os animais com infarto do miocárdio apresentaram aumento crescente dos diâmetros
diastólico e sistólico finais ao longo do tempo (Figuras 5D-E). Também observamos um
aumento na espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo na diástole na 4ª e 10ª
semanas pós-infarto do miocárdio (Figura 5F), o que sugere uma hipertrofia cardíaca nesse
período. O septo interventricular na diástole não apresentou diferença entres os grupos (Figura
5G). Outras alterações podem ser melhor observadas na Tabela 1.
48
Figura 5 - Modelo Experimental do Curso Temporal após Infarto do Miocárdio e Dados
Ecocardiográficos, A) Protocolo experimental, B) Fração de encurtamento, C) Fração de ejeção, D)
Diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo (DdVE), E) Diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo
(DsVE), F) Parede posterior do ventrículo esquerdo na diástole (PPVEd), G) Septo interventricular na
diástole (SIVd). Os dados foram analisados pela ANOVA um fator, seguido de post hoc de Duncan *,
p<0,05 vs Sham.
49
Tabela 1: Parâmetros Ecocardiográficos:
Parâmetros Sham 1 sem pós-IM 2 sem pós-IM 4 sem pós-IM 10 sem pós-IM
FC, bpm 295±12
(n=9)
319±6
(n=8)
306±12
(n=13)
271±6
(n=11)
267±14
(n=7)
FEnc, % 45±3
(n=9)
26±2*
(n=8)
20±1*
(n=13)
20±1*
(n=11)
18±3*
(n=7)
FEje, % 81±3
(n=9)
55±4*
(n=8)
46±2*
(n=13)
46±3*
(n=11)
50±3*
(n=7)
DdVE, cm 0,601±0,03
(n=9)
0,833±0,02*
(n=8)
0,902±0,02*
(n=13)
0,931±0,05*
(n=11)
0,967±0,06*
(n=6)
DsVE, cm 0,333±0,02
(n=9)
0,620±0,03*
(n=8)
0,722±0,03*
(n=13)
0,799±0,049*
(n=11)
0,783±0,06*
(n=6)
SIVd, cm 0,103±0,008
(n=9)
0,081±0,006
(n=8)
0,072±0,003
(n=13)
0,087±0,004
(n=13)
0,091±0,007
(n=6)
SIVs, cm 0,173±0,010
(n=9)
0,095±0,006*
(n=8)
0,091±0,008*
(n=13)
0,079±0,006*
(n=11)
0,117±0,007*
(n=10)
PPVEd, cm 0,117±0,003
(n=9)
0,113±0,006
(n=8)
0,118±0,004
(n=13)
0,141±0,008*
(n=12)
0,159±0,009*
(n=5)
PPVEs, cm 0,211±0,009
(n=9)
0,181±0,010
(n=8)
0,190±0,010
(n=13)
0,206±0,014
(n=11)
0,235±0,017
(n=11)
Tabela 1 - Dados Ecocardiográficos no modo M referentes aos períodos 1, 2, 4 e 10 semanas pós-infarto do miocárdio (IM).
Frequencia cardíaca (FC), Fração de encurtamento (FEnc), Fração de ejeção (Feje), Diâmetro diastólico final do ventrículo
esquerdo (DdVE), Diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo (DsVE), Septo intraventricular na diástole (SIVd), Septo
intraventricular na sístole (SIVs), Parede posterior do ventrículo esquerdo na diástole (PPVEd), Parede posterior do ventrículo
esquerdo na sístole (PPVEs). Dados apresentados como média ± erro padrão da média. Os dados foram analisados pela
ANOVA dois fatores, seguida de post hoc de Duncan. *, p<0.05 vs. Sham.
50
Após observarmos essas alterações na função cardíaca dos animais com infarto do
miocárdio ao longo do tempo, tivemos como objetivo caracterizar a atividade da enzima
ALDH2 nesse período.
6.2 Curso temporal da atividade da ALDH2 pós-infarto do miocárdio
Como pode-se observar na figura 6A, a atividade da enzima ALDH2 estava reduzida no
período entre 1ª e 4ª semana após infarto do miocárdio quando comparada ao grupo Sham. Na
10ª semana após a cirurgia de infarto do miocárdio a atividade da ALDH2 foi restabelecida
para valores semelhantes aos encontrados no grupo Sham (controle). Essa resposta pode ser
melhor visualizada na figura 6B, que representa o delta da atividade da ALDH2 (em relação
ao grupo Sham). Além disso, observamos uma correlação positiva entre a fração de ejeção
cardíaca e a atividade da ALDH2 quando agrupamos todos os animais estudados no curso
temporal, ou quando avaliamos isoladamente nas semanas 1, 2 e 4 após infarto do miocárdio
(Figuras C-F). Já na 10ª semana pós-infarto do miocárdio essa associação foi perdida.
51
Atividade ALDH2
Sham
1 se
m.
2 se
m.
4 se
m.
10 s
em.
0.0
2.0
4.0
6.0
* **
12 5 6 8 4
Infarto do Miocárdio
m
ol.m
in-1
.mg
-1
Infarto do Miocárdio - 10 semanas
0 2 4 6 80
20
40
60
80
100
r2=0,01p=0,74
Atividade ALDH2 (mol.min-1.mg-1)
Fra
ção
de E
jeção
(%
)
0 2 4 6 80
20
40
60
80
100
r2=0,30p=0,001
Infarto do Miocárdio
Atividade ALDH2 (mol.min-1.mg-1)
Fra
ção
de E
jeção
(%
)
Infarto do Miocárdio - 1 semana
0 2 4 6 80
20
40
60
80
100
r2=0,57p=0,001
Atividade ALDH2 (mol.min-1.mg-1)
Fra
ção
de E
jeção
(%
)Infarto do Miocárdio - 2 semanas
0 2 4 6 80
20
40
60
80
100
r2=0,72p=0,001
Atividade ALDH2 (mol.min-1.mg-1)
Fra
ção
de E
jeção
(%
)
Infarto do Miocárdio - 4 semanas
0 2 4 6 80
20
40
60
80
100
r2=0,48p=0,002
Atividade ALDH2 (mol.min-1.mg-1)
Fra
ção
de E
jeção
(%
)
Atividade ALDH2
1 se
m.
2 se
m.
4 se
m.
10 s
em.
-100
-80
-60
-40
-20
0
* *
*
5 5 84
Infarto do Miocárdio
%
B)
C) D) E)
F) G)
A)
Figura 6 – Curso Temporal da Atividade da ALDH2 cardíaca após Infarto do Miocárdio e Correlação
com a Fração de Ejeção. A) Atividade da enzima ALDH2, B) Delta da atividade da enzima ALDH2,
C) Correlação entre a atividade da ALDH2 e a fração de ejeção cardíaca de todos os grupos com
infarto do miocárdio e sham. Correlação entre a atividade da ALDH2 e a fração de ejeção na 1ª (D),
2ª (E), 4ª (F) e 10ª (G) semana após infarto do miocárdio. O grupo sham foi incluído em todas as
análises associativas. Os dados obtidos nas Figuras A e B foram analisados pela ANOVA um fator,
seguida de post hoc de Duncan *, p<0,05 vs Sham. Para os demais dados calculamos o coeficiente de
Pearson e o coeficiente de determinação (r2).
A inativação da enzima ALDH2 pode ocorrer pelo aumento das espécies reativas de
oxigênio e consequente formação de hidroperóxidos lipídico como o 4HNE. Esses
hidroperóxidos lipídicos podem ligar-se covalentemente ao sítio catalítico da enzima
causando sua inativação. No entanto, até o momento essa inativação por acúmulo de peróxido
lipídico só foi demonstrada in vitro. Tendo em vista que 1, 2 e 4 semanas pós-infarto do
miocárdio ocorreu uma inativação da ALDH2, o nosso próximo passo foi analisar a
peroxidação lipídica no lisado cardíaco desses animais. Analisamos também os níveis
52
cardíacos de glutationa, uma enzima antioxidante que auxilia na remoção desses aldeídos.
6.3 Formação de hidroperóxidos lipídico e níveis de glutationa no coração
Os animais com infarto do miocárdio apresentaram um aumento na hidroperoxidação
lipídica cardíaca em relação ao grupo controle (Sham) (Figura 7A). Esse aumento ocorreu em
todos os momentos analisados e foi acompanhado pela elevação dos níveis totais de
glutationa (Figura 7B). Apenas na 10ª semana pós-infarto do miocárdio houve uma redução
nos níveis cardíacos de hidroperóxidos lipídicos (porém ainda diferente do grupo controle) e
glutationa total. Acreditamos que o aumento nos níveis de glutationa ocorre na tentativa de
combater o estresse causado pelo acúmulo de hidroperóxidos lipídicos nos corações
infartados.
Figura 7 – Formação de Hidroperóxidos Lipídicos e Níveis de Glutationa. A) Hidroperóxidos lipídico
e B) Níveis de glutationa no lisado cardíaco de animais Sham, 1, 2, 4 e 10 semanas pós-infarto do
miocárdio. Os dados foram analisados pela ANOVA um fator, seguido de post hoc de Duncan *,
p<0,05 vs Sham.
Sabendo que a alta taxa de peroxidação lipídica associada à redução da atividade
enzimática da ALDH2 pode gerar danos na bioenergética mitocondrial, nosso próximo passo
foi caracterizar a função mitocondrial através das análises do consumo máximo de oxigênio e
liberação de peróxido de hidrogênio em mitocôndria isolada do coração desses animais.
53
6.4 Consumo de oxigênio e liberação de peróxido de hidrogênio em mitocôndria
cardíaca isolada
Observamos que os animais que passaram pela cirurgia de infarto do miocárdio
apresentaram uma redução do consumo de oxigênio basal (Estado 2 – Figura 8A) e máximo
(Estado 3 – Figura 8B). Na figura 8C podemos observar que apenas os grupos de 1 e 4
semanas apresentaram um consumo de oxigênio reduzido após o bloqueio da ATP sintase,
representado pelo estado 4. A figura 8D representa o consumo de oxigênio no estado
desacoplado, ou seja, com adição de CCCP. Nesse caso os animais com infarto do miocárdio
também apresentaram um consumo de oxigênio reduzido quando comparados ao grupo
controle. Todas as alterações metabólicas mitocondriais supracitadas podem ser melhor
visualizadas na Figura 8E, onde os animais com infarto do miocárdio apresentam significante
redução no controle respiratório mitocondrial. Paralelo ao reduzido consumo de oxigênio foi
observado um aumento na liberação de peróxido de hidrogênio pela mitocôndria,
especialmente no estado 3 (Figura 8G). Esses dados apontam para uma disfunção
mitocondrial cardíaca nos animais com infarto do miocárdio, independente do estágio de
evolução da doença.
54
Consumo de Oxigênio - Estado 2
Sham
1 se
m.
2 se
m.
4 se
m.
10 s
em.
0
40
80
120
* * **
Infarto do Miocárdio
20 9 7 8 5
nm
ole
s.m
g-1
pro
teín
a Consumo de Oxigênio - Estado 3
Sham
1 se
m.
2 se
m.
4 se
m.
10 s
em.
0
100
200
300
* * * *
Infarto do Miocárdio
18 9 7 8 5
nm
ole
s.m
g-1
pro
teín
a
Consumo de Oxigênio - Estado 4
Sham
1 se
m.
2 se
m.
4 se
m.
10 s
em.
0
40
80
120
* *
Infarto do Miocárdio
18 9 7 8 5
nm
ole
s.m
g-1
pro
teín
a
Consumo de Oxigênio - CCCP
Sham
1 se
m.
2 se
m.
4 se
m.
10 s
em.
0
100
200
300
* *
* *
Infarto do Miocárdio
13 9 7 8 5nm
ole
s.m
g-1
pro
teín
a
Controle Respiratório
Sham
1 se
m.
2 se
m.
4 se
m.
10 s
em.
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
* **
*
Infarto do Miocárdio
18 9 7 8 4
Esta
do
3/4
Liberação de H 2O2 - Estado 2
Sham
1 se
m.
2 se
m.
4 se
m.
10 s
em.
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
* *
*
Infarto do Miocárdio
20 8 10 7 12
nm
ole
s.m
g-1
pro
teín
a
B) C)
D) E) F)
A)
Liberação de H2O2 - Estado 3
Sham
1 se
m.
2 se
m.
4 se
m.
10 s
em.
0.0
0.5
1.0
1.5
** *
*
Infarto do Miocárdio
178 10 7 10
nm
ole
s.m
g-1
pro
teín
a
G) Liberação de H2O2 - Estado 4
Sham
1 se
m.
2 se
m.
4 se
m.
10 s
em.
0.0
1.0
2.0
3.0
*
*
Infarto do Miocárdio
15 8 10 7 10
nm
ole
s.m
g-1
pro
teín
a
H)
Liberação de H2O2 - CCCP
Sham
1 se
m.
2 se
m.
4 se
m.
10 s
em.
0.0
0.5
1.0
1.5
Infarto do Miocárdio
168 10 7 12
* *
*
nm
ole
s.m
g-1
pro
teín
a
I)
Figura 8 – Consumo de Oxigênio e Liberação de Peróxido de Hidrogênio em Mitocôndria Cardíaca
Isolada. A) Consumo de oxigênio no estado 2 (presença de substratos), B) consumo de oxigênio no
estado 3 (presença de ADP), C) Consumo de oxigênio no estado 4 (presença de Oligomicina), D)
Consumo de oxigênio com CCCP, E) Controle respiratório (Estado 3/4), F) Liberação de peróxido de
hidrogênio no estado 2, G) Liberação de peróxido de hidrogênio no estado 3, H) Liberação de
peróxido de hidrogênio no estado 4, I) Liberação de peróxido de hidrogênio com CCCP, ou estado
desacoplado. Os dados foram analisados pela ANOVA um fator, seguido de post hoc de Duncan *,
p<0,05 vs Sham.
Sintetizando os resultados, observamos que animais com 1, 2, 4 e 10 semanas pós-
infarto do miocárdio apresentam disfunção cardíaca, representada pela redução na fração de
encurtamento e fração de ejeção cardíaca. A atividade da ALDH2 está reduzida até a 4ª
semana pós-infarto do miocárdio. Além disso, há uma correlação positiva entre a função
cardíaca e a atividade da ALDH2 em 1, 2 e 4 semanas pós-infarto do miocárdio. Entretanto
essa correlação se perde na 10ª semana pós-infarto do miocárdio. Por fim, observamos uma
redução no consumo máximo de oxigênio, aumento da produção de peróxido, peroxidação
55
lipídica e níveis de glutationa durante a progressão da doença. Apenas na 10ª semana não
observamos alterações nos níveis totais de glutationa, momento em que a atividade da
ALDH2 está restabelecida.
A partir dos resultados supracitados decidimos investigar os possíveis benefícios
terapêuticos da Alda-1 (ativador seletivo da ALDH2) no mesmo modelo experimental.
Escolhemos iniciar o tratamento na 4ª semana pós-infarto do miocárdio, momento em que a
atividade da ALDH2 está reduzida e os animais já apresentam sinais de insuficiência cardíaca
como dilatação ventricular esquerda e disfunção diastólica (ver próximos resultados). O
tratamento teve duração de 6 semanas e foram avaliadas todas as variáveis descritas no
objetivo do estudo 2.
56
7 RESULTADOS (Estudo 2)
7.1 Modelo experimental e caracterização do fenótipo
Os ratos com doze semanas de idade foram submetidos à cirurgia cardíaca, que
consistiu na ligadura crônica da artéria coronária descendente anterior. Após quatro semanas
esses animais foram pré-selecionados com base na função cardíaca (fração de encurtamento
ventricular esquerda <30%) e divididos randomicamente em dois grupos: um grupo tratado
com Alda-1 (IC Alda-1, 10mg/kg/dia) e outro grupo tratado com solução veículo (IC,
50%DMSO+50% PEG). Ainda, outro grupo de animais foi submetido à cirurgia fictícia do
infarto do miocárdio (Sham), utilizado como controle saudável no estudo. O início do
tratamento realizou-se quatro semanas após a cirurgia de infarto do miocárdio, fase em que os
animais já apresentavam sinais de insuficiência cardíaca. A Alda-1 foi administrada através de
mini-bomba osmótica por um período de seis semanas. Durante o período do estudo (período
de tratamento) não tivemos perdas significantes de animais nos diferentes grupos
supramencionados.
7.1.1 Análises ecocardiográficas
As avaliações ecocardiográficas foram realizadas pré- e pós-tratamento com o intuito
de avaliar o efeito da terapia com Alda-1 sobre a função cardíaca e o remodelamento
ventricular esquerdo após infarto do miocárdio. Observamos que os animais com insuficiência
cardíaca apresentaram uma significante redução na fração de encurtamento ventricular
esquerda 4 semanas após a cirurgia de infarto do miocárdio (Figura 9B), a qual foi
acompanhada por dilatação da câmara ventricular esquerda (caracterizada pelo aumento no
diâmetro ventricular ao final da diástole, Figura 9C). Após seis semanas de tratamento com
Alda-1 os animais com insuficiência cardíaca melhoraram a fração de encurtamento
ventricular esquerda comparada ao período pré-tratamento, enquanto os animais tratados com
solução veículo apresentaram um agravamento da disfunção cardíaca no mesmo período
experimental (Figuras 9B e E). Ainda, a ativação sustentada da ALDH2 foi capaz de amenizar
a dilatação ventricular esquerda comparada aos animais infartados tratados com solução
veículo no mesmo período experimental (Figura 9C). A Alda-1 também foi eficaz em evitar a
hipertrofia cardíaca causada pela insuficiência cardíaca na 10ª semana, representada pela
redução da parede posterior do ventrículo esquerdo comparada ao grupo insuficiência
57
cardíaca tratado com solução veículo (figura 9D). Essas modificações benéficas podem ser
melhor observadas nas figuras 9E, 9F e 9G, que representam o delta da fração de
encurtamento, diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo e diâmetro da parede posterior do
ventrículo esquerdo, respectivamente. Esse delta está representado em relação ao período pré-
tratamento.
Além do ecocardiograma modo M, realizamos a análise ecocardiográfica doppler
tecidual, tornando possível a medida de parâmetros funcionais cardíacos (sistólicos e
diastólicos) através da avaliação do fluxo sanguíneo cardíaco. Os dados do ecocardiograma
Doppler tecidual estão apresentados na Tabela 2. Observamos que quatro semanas após o
infarto do miocárdio os animais apresentaram sinais de disfunção diastólica ventricular
esquerda como aumento da onda E de enchimento ventricular esquerdo e elevado índice de
desempenho do miocárdio em relação ao grupo Sham. Já quando avaliados na 10ª semana
pós-infarto do miocárdio, os animais com insuficiência apresentaram um agravamento da
disfunção diastólica, caracterizado pelo aumento da onda E, redução da onda A, e
consequente aumento da razão E/A, além de significante elevação do tempo de relaxamento
isovolumétrico, bem como do índice de desempenho do miocárdio. Esses resultados mostram
que nesse período os animais apresentam sinais mais claros de insuficiência cardíaca. O
tratamento sustentado com Alda-1 foi capaz de minimizar a progressão da disfunção
diastólica cardíaca nos animais com insuficiência cardíaca.
58
Figura 9 – Desenho Experimental e Dados Ecocardiográficos no modo M dos períodos pré- e pós-
tratamento dos grupos Sham, Insuficiência cardíaca (IC) e Insuficiência Cardíaca tratado com Alda-1
(IC Alda-1). O grupo Sham não recebeu nenhum tratamento nesse momento, A) Desenho
experimental, B) Fração de encurtamento ventricular esquerda (FE), C) Diâmetro diastólico do
ventrículo esquerdo (DdVE), D) Parede posterior do ventrículo esquerdo na diástole (PPVEd), E)
Delta da fração de encurtamento, F) Delta do diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo, G) Delta da
parede posterior do ventrículo esquerdo. Os dados foram analisados pela ANOVA um e dois fatores,
seguida de post hoc de Duncan, *,p<0,05 vs, Sham; #, p<0,05 vs, IC; &, p<0,05 vs, Pré-
tratamento.
59
Tabela 2: Parâmetros Ecocardiográficos
Grupos Sham (n=8-22) IC (n=8-14) IC Alda-1 (n=8-13) Sham (n=8-22) IC (n=8-12) IC Alda-1 (n=8-12)
Período Pré-tratamento Pré-tratamento Pré-tratamento Pós-tratamento Pós-tratamento Pós-tratamento
FEje, % 82±2 48±2 * 45±2* 76±3 43±3* 57±4*†‡
FEnc, % 43±1 25±3 * 20±4* 42±2 18±2* 27±4*†‡
DdVE, cm 0,753±0,023 0,849±0,025* 0,865±0,030* 0,767±0,018 0,991±0,029* 0,881±0,038*†‡
DsVE, cm 0,414±0,015 0,758±0,024* 0,718±0,037* 0,489±0,023 0,679±0,050* 0,631±0,026*†‡
SIVd, cm 0096±0,003 0,085±0,004 0,098±0,004 0,101±0,004 0,094±0,004 0,105±0,004
SIVs, cm 0,160±0,004 0,134±0,008* 0,133±0,006* 0,176±0,008 0,117±0,006* 0,134±0,007*
PPVEd, cm 0,129±0,005 0,134±0,007 0,134±0,009 0,145±0,004 0,159±0,006* 0,140±0,004†
PPVEs, cm 0,218±0,008 0,193±0,001 0,211±0,001 0,232±0,007 0,235±0,017& 0,224±0,017
TE, ms 78,5±0,6 68,0±2,3* 64,9±3,9* 81,7±2,4 66,3±2,6* 79,2±4,4
E, cm/s 70,7±1,0 80,8±1,7* 79,9±2,6* 70,5±1,8 93,0±2,7* 74,4±3,7†
A, cm/s 43,5±1,0 43,8±1,8 41,5±2,1 41,9±1,5 31,0±2,1* 39,1±1,5
E/A 1,6±0,1 1,9±0,1* 2,0±0,1* 1,7±0,1 3,1±0,3*‡ 1,9±0,1†
TRIV, ms 24,2±1,7 25,9±1,6 28,2±1,4 26,0±1,8 32,3±3,0* 27,2±2,2
IDM 0,40±0,02 0,54±0,03* 0,58±0,06* 0,41±0,03 0,63±0,03* 0,43±0,04†‡
FC, bpm 295±12 272±6 285±7 296±5 266±14 274±9
Tabela 2 - Dados Ecocardiográficos referentes aos períodos pré- e pós-tratamento dos grupos Sham, Insuficiência Cardíaca (IC) e Insuficiência Cardíaca
tratado com Alda-1 (IC Alda-1). Fração de encurtamento (FE), Diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo (DdVE), Diâmetro sistólico final do
ventrículo esquerdo (DsVE), Septo intraventricular na diástole (SIVd), Septo intraventricular na sístole (SIVs), Parede posterior do ventrículo esquerdo na
diástole (PPVEd), Parede posterior do ventrículo esquerdo na sístole (PPVEs), Tempo de ejeção (TE), Velocidade do fluxo mitral E (E), velocidade do
fluxo mitral A (A), Tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV), Índice de desempenho do miocárdio (IDM) e Frequência cardíaca (FC). Dados
apresentados como média ± erro padrão da média. Os dados foram analisados pela ANOVA dois fatores, seguida de post hoc de Duncan. *, p<0.05 vs.
Sham; †, p<0.05 vs. IC; ‡, p<0.05 vs. Pré-tratamento.
60
7.1.2 Parâmetros fisiológicos
Consideramos como parâmetros fisiológicos as seguintes variáveis: tolerância ao
esforço físico, pressão arterial sistólica (medida indireta), freqüência cardíaca basal (medida
indireta), e peso corporal dos animais. Essas análises foram realizadas em colaboração com a
Profa. Dra. Patrícia Chakur Brum da Escola de Educação Física e Esporte-USP.
Com relação às variáveis distância máxima percorrida, pressão arterial sistólica e
frequência cardíaca não foram observadas diferenças entre os grupos (Tabela 3). Com relação
à massa corporal, todos os animais ganharam peso durante o tempo do protocolo
experimental, não havendo diferença entre os grupos sham e IC pós-período experimental
(Tabela 3).
61
Tabela 3: Parâmetros Fisiológicos
Parâmetros Sham IC IC Alda-1 Sham IC IC Alda-1
Período Pré-tratamento Pré-tratamento Pré-tratamento Pós-tratamento Pós-tratamento Pós-tratamento
DMP, metros 514±36
(n=18)
537±54
(n=13)
447±59
(n=11)
500±38
(n=20)
525±53
(n=10)
478±52
(n=13)
PAS, mmHg 123±5
(n=18)
125±5
(n=13)
125±4
(n=12)
125±5
(n=14)
113±5
(n=10)
119±5
(n=11)
FC, bpm 476±17
(n=18)
484±27
(n=13)
522±23
(n=12)
488±15
(n=13)
479±19
(n=10)
531±23
(n=12)
PC, gr 365±11
(n=14)
337±21
(n=9)
347±18
(n=12)
429±11*
(n=13)
419±21*
(n=6)
419±19*
(n=12)
Tabela 3 - Parâmetros Fisiológicos. Distância máxima percorrida (DMP) em teste de esforço com cargas incrementais até a exaustão em
esteira rolante, Pressão arterial sistólica (PAS), Freqüência cardíaca (FC), Peso Corporal (PC), em ratos Sham, Insuficiência Cardíaca
(IC) e Insuficiência Cardíaca tratado com Alda-1 (IC Alda-1) pré e pós-tratamento. Dados apresentados como média ± erro padrão da
média. Para análise estatística foi realizada ANOVA dois fatores, seguida de post hoc de Duncan. *, p<0.05 vs. Pré-tratamento.
62
7.1.3 Análises hemodinâmicas e morfométrica cardíaca
Para a realização das medidas hemodinâmicas, um cateter com sensores de pressão e
volume foi inserido no ventrículo esquerdo através da artéria carótida direita, sendo possível a
análise do ciclo cardíaco. Essas medidas foram realizadas somente no período pós-
experimental. Inicialmente analisamos a função sistólica representada pela derivada positiva
de pressão sobre o tempo (+dP/dTmáx) e a função diastólica representada pela derivada
negativa de pressão sobre o tempo (-dP/dTmáx) no estado basal. Também avaliamos a pressão
diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE), volume sistólico (VS) e trabalho cardíaco
(TC).
Como podemos observar na Tabela 4, os animais com insuficiência cardíaca
apresentaram uma redução na +dP/dTmáx, volume sistólico e trabalho cardíaco, além de
menor complacência cardíaca, demonstrada pela maior pressão diastólica final do ventrículo
esquerdo. Entretanto, não observamos alterações significativas na -dP/dTmáx cardíaca quando
comparada aos valores do grupo controle (Sham). O tratamento com Alda-1 foi capaz de
minimizar a disfunção cardíaca basal, melhorando os índices de função sistólica e
complacência cardíaca (Tabela 4).
Tabela 4: Parâmetros Hemodinâmicos:
Pós-protocolo experimental (22 sem,)
Parâmetros Sham IC IC Alda-1
PDFVE (mmHg) 3,2±0,6
(n=4)
8,9±1,2*
(n=5)
4,6±0,6#
(n=4)
+dP/Dt máx, (mmHg,s-1
) 10034±455
(n=4)
6913±344*
(n=6)
8521±336#
(n=4)
-dP/Dt máx, (mmHg,s-1
) 6599±467
(n=4)
6220±448
(n=6)
6682±815
(n=4)
VS (mL) 120±5
(n=4)
57±7*
(n=7)
85±9#
(n=5)
TC (mmHg,mL-1
) 12,9±0,9
(n=4)
4,9±1,1*
(n=7)
9,4±1,3#
(n=5)
Tabela 4 - Parâmetros Hemodinâmicos, Pressão Diastólica Final do Ventrículo Esquerdo (PDFVE),
Velocidade Máxima de Elevação da Pressão (+dP/dT máx), Velocidade Máxima de Declínio da
Pressão (-dP/dT máx), Volume Sistólico (VS), Trabalho Cardíaco (TC). Os dados foram analisados
pela ANOVA um fator seguido de post-hoc de Duncan, *, p<0,05 vs, Sham; #, p<0,05 vs, IC.
Muitas alterações cardíacas (positivas ou negativas) podem ser visualizadas somente
quando ocorre um aumento da demanda energética, não podendo ser identificadas em
63
condições basais. Na tentativa de investigar quais os efeitos da insuficiência cardíaca e do
tratamento com Alda-1 sobre a função cardíaca mediante ao estresse, decidimos avaliar a
curva pressão-volume cardíaca desses animais na presença de um vasoconstritor (fenilefrina),
que promove aumento de pós-carga cardíaca (dos Santos et al., 2010). Nossos resultados
demonstram que os animais com insuficiência cardíaca apresentam um déficit nos parâmetros
funcionais cardíacos sistólico (delta de aumento +dP/dTmáx em relação à condição basal)
(Figura 10A) e diastólico (delta de aumento -dP/dTmáx em relação à condição basal) frente ao
estímulo com fenilefrina (Figura 10B), além de apresentarem uma drástica redução da
complacência ventricular esquerda, demonstrada pelo aumento na razão pressão volume no
final da diástole (RPVDF) (Figuras 10C-F).
Diferente dos dados obtidos no ecocardiograma e na avaliação do ciclo cardíaco no
repouso, o tratamento sustentado com Alda-1 foi capaz de normalizar, em relação ao grupo
controle, a porcentagem de aumento dos índices sistólicos e diastólicos frente ao estímulo
com fenilefrina (Figuras 10A-F). Vale ressaltar que as alterações cardíacas que levam à
falência normalmente acontecem em situações de estresse, fortalecendo assim os possíveis
benefícios da Alda-1 no tratamento da insuficiência cardíaca e na melhora da morbidade dos
pacientes.
Além das avaliações funcionais, caracterizamos possíveis alterações morfológicas
cardíacas oriundas da progressão da doença, bem como do tratamento sustentado com Alda-1
nos animais com insuficiência cardíaca. Para isso realizamos as seguintes análises
histológicas: área de infarto, deposição de colágeno cardíaco e diâmetro dos cardiomiócitos.
Todas as análises, exceto a medida da área de infarto, foram realizadas na área remota, ou
seja, área livre de infarto,
Como esperado, a área de infarto não apresentou diferença entre os grupos infartados
(Figuras 10G e K), Os animais com insuficiência cardíaca apresentaram hipertrofia cardíaca,
caracterizada pelo aumento do diâmetro dos cardiomiócitos, e aumento na deposição de
colágeno total e tipo I cardíaco quando comparados ao grupo Sham (Figuras 10G-M), O
tratamento com Alda-1 foi capaz de diminuir parcialmente tanto a hipertrofia do
cardiomiócito quanto a deposição de colágeno cardíaco nos animais com insuficiência
cardíaca. Acreditamos que o aumento do colágeno tipo I observado somente no grupo
insuficiência cardíaca tratado com solução veículo está associado à menor complacência
ventricular esquerda. Não observamos diferenças entre os grupos quando avaliamos as
concentrações do colágeno tipo III, como apresentado na Figura 10I. A Figura 10J apresenta
as razões entre o colágeno tipo I e tipo III.
64
Figura 10 – Avaliação do ciclo cardíaco e Análises Morfométricas Cardíaca, A) Velocidade Máxima
de Elevação da Pressão (+dP/dTmáx,), B) Velocidade Máxima de Declínio da Pressão (-dP/dTmáx,),
C) Razão Pressão Volume Diastólica Final do Ventrículo Esquerdo (RPVDF), D) Imagem
representativa do ciclo cardíaco em animal Sham, E) animal Insuficiência Cardíaca, F) e Insuficiência
Cardíaca tratado com Alda-1 por 6 semanas, G) Imagem da área de infarto (superior) e colágeno total,
tipo I e tipo III (inferior), H) Colágeno tipo I, I) Colágeno tipo III, J) Razão do colágeno Tipo I/Tipo
III, K) Quantificação da área de infarto, L) Diâmetro de cardiomiócitos, M) Deposição de colágeno
total dos grupos Sham, Insuficiência Cardíaca (IC) e Insuficiência Cardíaca tratado com Alda-1 (IC
Alda-1). Os dados foram analisados pela ANOVA um fator, seguida de post hoc de Duncan, *, p<0,05
vs, Sham; #, p<0,05 vs, IC.
Considerando os efeitos benéficos observados no tratamento com Alda-1 referentes à
melhora da função cardíaca e prevenção do remodelamento ventricular na insuficiência
65
cardíaca, nosso próximo passo foi caracterizar a efetividade do tratamento sobre a atividade
da ALDH2 e o acúmulo de proteínas danificadas.
7.2 Perfil de atividade e expressão da enzima ALDH2 cardíaca e acúmulo de proteínas
danificadas
Para confirmar se o nosso tratamento foi efetivo em aumentar a atividade da enzima
aldeído desidrogenase 2 (ALDH2) em animais com insuficiência cardíaca, analisamos a
atividade enzimática da ALDH2 mitocondrial por espectrofotometria, como descrito
anteriormente. Constatamos que, de fato, a Alda-1 aumentou em 120% a atividade da enzima
ALDH2 em animais com insuficiência cardíaca tratados com Alda-1 (Figura 11A). Ainda, o
aumento da atividade da ALDH2 não estava relacionado à maior expressão da enzima
(Figuras 11B e F). Esse resultado já era esperado, pois sabemos que a Alda-1 aumenta a
atividade da ALDH2 através da facilitação tanto da entrada do substrato (no caso o
acetaldeído) quanto do co-fator NAD+, como já descrito anteriormente. A atividade da
ALDH2 não se alterou na insuficiência cardíaca em relação ao grupo controle.
Após a constatação da eficácia da Alda-1 em aumentar a atividade ALDH2 na
insuficiência cardíaca, avaliamos os possíveis benefícios desse processo. Considerando que
um dos papéis da ALDH2 é a remoção do principal aldeído produzido durante o estresse
oxidativo, o 4-hidroxi-2-nonenal (4HNE), decidimos caracterizar os níveis desse aldeído no
coração dos animais com insuficiência cardíaca. Como pode-se observar nas Figuras 11C-D,
os animais com insuficiência cardíaca apresentaram um significante aumento na expressão
tanto de adutos 4HNE-proteína quanto de proteínas carboniladas quando comparados com
grupo controle (Sham). Esses resultados sugerem uma ineficiência enzimática da ALDH2 na
insuficiência cardíaca, caracterizada pelo exacerbado acúmulo de aldeídos tóxicos cardíacos
normalmente metabolizados pela ALDH2 (Figuras C-E). A ativação sustentada da enzima
mitocondrial ALDH2 foi eficaz em normalizar na insuficiência cardíaca os valores de adutos
4HNE-proteína e proteínas carboniladas cardíacas para próximos do grupo sham.
66
Figura 11 – Atividade e Expressão da ALDH2 e Expressão de Proteínas Danificadas no lisado
cardíaco total, A) Atividade da ALDH2, B) Expressão da ALDH2, C) Quantificação de adutos 4-
hidroxi-2-nonenal-proteína (4HNE), D) Proteínas carboniladas nos grupos Sham, Insuficiência
Cardíaca (IC) e Insuficiência Cardíaca tratado com Alda-1 (IC Alda-1), E)- Blot representativo dos
adutos de Michaelis (4HNE-proteína) e proteínas carboniladas, F) Blot representativo da ALDH2. Os
níveis cardíacos de adutos de Michaelis e proteínas carboniladas e ALDH2 foram normalizados pela
GAPDH. Os dados foram analisados pela ANOVA um fator, seguida de post hoc de Duncan, *,
p<0,05 vs, Sham; #, p<0,05 vs,IC.
Sabe-se que a propagação do sinal deletério oriundo da peroxidação lipídica e do
desbalanço redox ocorre em parte pelo acúmulo de 4HNE, onde o excesso desse aldeído
resulta em disfunção mitocondrial e colapso metabólico cardíaco durante processos
isquêmicos (Chen, Budas et al., 2008). Entretanto, ainda não se sabe a contribuição do
acúmulo desse aldeído para com a progressão da disfunção ventricular e insuficiência
cardíaca. Acreditamos que o 4HNE apresenta papel chave na disfunção cardíaca induzida por
infarto do miocárdio, afetando diretamente o metabolismo mitocondrial cardíaco. Sendo
assim, nosso próximo passo foi avaliar a bioenergética mitocondrial e a produção de peróxido
de hidrogênio mitocondrial no coração dos animais com insuficiência cardíaca tratados com
Alda-1 ou veículo.
7.3 Caracterização da função mitocondrial
Para caracterizar a função mitocondrial realizamos os seguintes experimentos:
avaliação do consumo de oxigênio mitocondrial, liberação de peróxido de hidrogênio e
67
captação máxima de cálcio pela mitocôndria. Todos esses experimentos foram realizados com
mitocôndrias isoladas do coração dos animais sham, IC veículo e IC Alda-1.
O consumo de oxigênio mitocondrial foi avaliado utilizando um oxígrafo do tipo Clark,
conforme descrito anteriormente. Todos os experimentos foram realizados na presença dos
substratos malato (complexo I), glutamato (complexo I) e succinato (complexo II). As
medidas avaliadas foram: consumo de oxigênio no Estado 2 (respiração basal), consumo de
oxigênio no Estado 3 (respiração máxima após adição de ADP), consumo de oxigênio no
estado 4 (respiração após adição de oligomicina, uma droga que bloqueia o complexo V) e
consumo de oxigênio no estado desacoplado (após adição de CCCP, um desacoplador -
Carbonyl Cyanide m-Chlorophenyl Hydrazone, 1 µM). Ainda, para avaliar a eficiência
respiratória mitocondrial calculamos a razão estado3/estado4, descrita como controle
respiratório mitocondrial.
Na figura 12B pode-se observar que a mitocôndria isolada do coração dos animais com
insuficiência cardíaca apresentou um déficit no consumo máximo de oxigênio, representado
pela redução no estado 3. A respiração mitocondrial também estava prejudicada no estado
desacoplado em relação ao grupo controle (Figura 12D). Ainda, o controle respiratório
mitocondrial estava reduzido na insuficiência cardíaca (Figura 12E), apontando para um
prejuízo no acoplamento entre a cadeia transportadora de elétrons e a fosforilação oxidativa
mitocondrial na insuficiência cardíaca. O tratamento sustentado com Alda-1 foi capaz de
restaurar o consumo de O2 nos estados respiratórios 3 e desacoplado (CCCP) (Figuras 12C e
D), bem como melhorar o controle respiratório mitocondrial (Figura 12E). Esses resultados
sugerem que a ativação crônica da enzima mitocondrial ALDH2 é suficiente para impedir a
disfunção mitocondrial associada à fisiopatologia da insuficiência cardíaca. Baseado nesses
resultados, nosso próximo passo foi avaliar a produção de peróxido de hidrogênio pela
mitocôndria nos seus diferentes estados de ativação.
A liberação de H2O2 pela mitocôndria foi avaliada por espectrofluorimetria, conforme
descrito anteriormente. Nossos resultados apontam para uma exacerbada liberação de H2O2
mitocondrial na insuficiência cardíaca (Figuras 12 F-I). Esse aumento de radicais livres parece
acontecer tanto em situações basais (Estado 2) quanto extremas (Estados 3, 4 e
desacoplamento por CCCP) (Figuras 12 F-I). O tratamento com Alda-1 amenizou a liberação
de H2O2 mitocondrial na insuficiência cardíaca. Esses resultados são extremamente
promissores, pois demonstram que o acúmulo de 4HNE na insuficiência cardíaca é suficiente
para desencadear danos na maquinaria mitocondrial, sendo que a Alda-1 reverte todo esse
processo basicamente através da remoção do 4HNE com mais eficiência.
68
Sham IC
IC A
lda-
10
50
100
150
24 7 13
Resp
iração
máxim
a e
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2
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rot-1
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Sham IC
IC A
lda-
1
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100
200
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Resp
iração
máxim
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#
Sham IC
IC A
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1
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918 12
Resp
iração
máxim
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4
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)
A) B) C)
Sham IC
IC A
lda-
1
0
50
100
150
200
250
*
616 5
Resp
iração
máxim
a C
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P
(nm
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s. m
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. m
in-1
)
Sham IC
IC A
lda-
1
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1
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#
**
918 12
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do 3
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Sham IC
IC A
lda-
1
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Sham IC
IC A
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1
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*
717 8H2O
2/O
2E
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Sham IC
IC A
lda-
1
0
1
2
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#
*
713 9H2O
2/O
2E
sta
do 4
D) E) F)
G) H)
Sham IC
IC A
lda-
1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
#
*
*
412 6
H2O
2/O
2C
CC
P
I)
Figura 12 - Consumo Máximo de Oxigênio e Liberação de Peróxido de Hidrogênio em Mitocôndria
Cardíaca Isolada, A) Consumo de oxigênio no estado 2, B) Consumo de oxigênio no estado 3, C)
Consumo de oxigênio no estado 4, D) Consumo de oxigênio com CCCP, E) Controle respiratório
(Estado 3/4), F) Liberação de peróxido de hidrogênio no estado 2, G) Liberação de peróxido de
hidrogênio no estado 3, H) Liberação de peróxido de hidrogênio no estado 4, I) Liberação de peróxido
de hidrogênio com CCCP, ou estado desaclopado. Os dados foram analisados pela ANOVA um fator,
seguido de post hoc de Duncan *, p<0,05 vs Sham, # , p<0,05 vs IC.
Após a constatação da exacerbada liberação de radicais livres pela mitocôndria na
insuficiência cardíaca, decidimos avaliar outros parâmetros da biologia mitocondrial
importantes para sua funcionalidade. Essas análises foram realizadas com o intuito de
entender quão fragilizada estava a mitocôndria na insuficiência cardíaca, e quais seriam os
possíveis benefícios da ativação seletiva da enzima mitocondrial ALDH2. Para isso,
avaliamos a permeabilidade dos poros mitocondriais e liberação do citocromo c para o citosol
no coração dos animais com insuficiência cardíaca.
69
7.3.1 Permeabilidade dos poros mitocondriais, liberação de citocromo c e 4HNE in vitro
A formação de poros de transição mitocondriais está relacionada ao aumento da
permeabilidade mitocondrial e consequente morte celular (Kroemer, Galluzzi et al., 2007).
Avaliamos a permeabilidade dos poros de transição mitocondrial utilizando o ensaio de
captação máxima de cálcio pela mitocôndria cardíaca isolada, como descrito anteriormente.
Observamos que a captação máxima de cálcio mitocondrial estava debilitada no coração dos
animais com insuficiência cardíaca em relação ao grupo sham, demonstrando uma maior
abertura dos poros de transição mitocondriais (Figura 13A). O tratamento com Alda-1 foi
capaz de restaurar este efeito. Esses resultados foram validados com a utilização de
ciclosporina A, uma molécula capaz de bloquear a formação dos poros mitocôndrias
(Broekemeier et al., 1989). De fato, a utilização de ciclosporina A nos ensaios in vitro foi
capaz de normalizar a captação máxima de cálcio pela mitocôndria isolada dos corações dos
animais com insuficiência cardíaca (Figura 13A).
Uma outra forma de avaliar a abertura dos poros mitocondriais é analisar o
extravasamento de citocromo c da mitocôndria (uma proteína ancorada na membrana interna
da mitocôndria) para o citosol. Já está bem descrito na literatura que o citocromo c no citosol
ativa diretamente proteínas apoptóticas da família Bcl2 e induz morte celular (Kroemer,
Galluzzi et al., 2007). Nossos resultados apontam que na insuficiência cardíaca existe um
exacerbado extravasamento de citocromo c para o citosol, caracterizado pela elevada razão
citocromo c citosol/mitocôndria (Figuras 13 B-D). Esses resultados comprovam a maior
abertura dos poros mitocondriais na insuficiência cardíaca. O tratamento com Alda-1 foi
capaz de reverter esse processo, normalizando os valores de citocromo c no citosol para
próximo do grupo sham.
Até o momento, nossos achados apontam que o acúmulo de 4HNE no coração é
essencial para a progressão da insuficiência cardíaca, e que essa progressão está diretamente
associada à disfunção mitocondrial, exacerbada produção de radicais livres e abertura dos
poros mitocondriais. Entretanto, nossos dados são associativos e não podem explicar os
mecanismos pelos quais o acúmulo de 4HNE contribui para a disfunção mitocondrial na
insuficiência cardíaca. Dessa forma, com o intuito de traçar uma relação causal entre 4HNE e
alguns processos observados na insuficiência cardíaca, como a disfunção mitocondrial,
decidimos realizar experimentos mais pontuais. Para isso, incubamos mitocôndrias isoladas
com diferentes concentrações de 4HNE in vitro e avaliamos seu efeito na respiração
mitocondrial. Ainda, considerando que a Alda-1 foi uma importante ferramenta na reversão
70
da disfunção mitocondrial na insuficiência cardíaca em nosso modelo, testamos se a
incubação in vitro com Alda-1 em mitocôndrias isoladas poderia prevenir agudamente os
efeitos negativos do 4HNE.
Portanto, o nosso objetivo neste experimento foi investigar se de fato o 4HNE in vitro
provoca danos na respiração mitocondrial e qual o efeito da Alda-1 nesse processo. Esse
experimento foi realizado em mitocôndria isolada do coração de ratos Wistar controle, ou
seja, não passaram por nenhum procedimento cirúrgico. Na Figura 13E, podemos observar o
consumo máximo de oxigênio no estado 3, consumo máximo de oxigênio no estado 4 e
controle respiratório. Os dados estão apresentados em porcentagem do controle (sem
tratamento).
Como mostra a Figura 13, o 4HNE reduziu o consumo de oxigênio mitocondrial no
estado 3. Esse processo parece ser dose-dependente, pois quanto maior a concentração de
4HNE menor é a respiração mitocondrial. A respiração mitocondrial no estado 4 (na presença
de oligomicina) não foi alterada pelo 4HNE, sugerindo que o 4HNE não afeta o acoplamento
mitocondrial. Por fim, quando calculamos o controle respiratório observamos um
comportamento semelhante ao estado 3 mitocondrial. Esses resultados apontam que o 4HNE
afeta negativamente a respiração mitocondrial cardíaca. Quando testamos a Alda-1,
observamos que a pré-incubação das mitocôndrias com Alda-1 ameniza os danos oriundos do
4HNE (10 M). Escolhemos essa concentração de 4HNE uma vez que é próxima da
observada no coração após processos isquêmicos. Nossos resultados in vitro reproduziram os
achados in vivo, demonstrando que a Alda-1 é capaz de reverter os danos mitocondriais
oriundos do 4HNE. Entretanto, as proteínas-alvo do 4HNE nesse processo ainda não foram
identificadas, Outro projeto do nosso laboratório identificará essas proteínas.
71
Figura 13 – Permeabilidade de Poros Mitocondriais, Liberação de Citocromo c e 4HNE in
vitro, A) Captação máxima de cálcio, B) Blot representativo do citocromo c e da eficiência de
fracionamento celular, C) Expressão do citocromo c na fração citosólica, D) Expressão do
citocromo c na fração mitocondrial dos grupos Sham, Insuficiência Cardíaca (IC) e
Insuficiência Cardíaca tratado com Alda-1 (IC Alda-1), E) Avaliação da respiração mitocondrial
após incubação in vitro com 4HNE e Alda-1, As mitocôndrias foram isoladas do coração de
animais controle (sham). As doses de 4HNE variaram entre 0,5 e 10,0M e o tratamento teve
duração de 5 minutos. No experimento com Alda-1 e 4HNE as mitocôndrias foram incubadas
primeiramente com Alda-1 seguida de 4HNE. Os dados foram analisados pela ANOVA um
fator, seguida de post hoc de Duncan, *, p<0,05 vs, controle; #, p<0,05 vs, IC; &, p<0,05 vs,
Pré-tratamento; †, p<0,05 vs, 4HNE 10µM.
72
Esses dados demonstram que um dos possíveis mecanismos associados aos efeitos
benéficos da ativação da ALDH2 na insuficiência cardíaca é pela maior remoção de aldeídos
tóxicos (ex, 4HNE) produzidos a partir da peroxidação lipídica. Portanto o nosso próximo
passo foi a avaliação a peroxidação lipídica no lisado cardíaco de animais Sham, IC veículo e
IC Alda-1. Além disso, como nossos resultados apontam para uma exacerbada liberação de
radicais livres pela mitocôndria na insuficiência cardíaca, decidimos avaliar a atividade de
algumas enzimas antioxidantes com o intuito de traçar um perfil do balanço redox na
insuficiência cardíaca, bem como os possíveis efeitos da ativação sustentada da ALDH2 nesse
processo.
7.4 Peroxidação lipídica e atividade da superóxido dismutase e da catalase
A formação de hidroperóxidos lipídicos ocorre devido ao ataque de espécies reativas, tais
como o H• e o ONOO
−, ocasionando uma autodestruição da membrana. O processo de
peroxidação ocorre em três etapas distintas, inicialmente ocorre o ataque o radical ao PUFA,
essa etapa é denominada iniciação e tem como produto um radical lipídico (L•), esse radical
associa-se com um O2 formando um radical peroxila (LOO•) que ataca outro PUFA e forma
um L• e um LOO
• em uma etapa denominada de propagação, a ultima etapa denominada
terminação ocorre quando L• e um LOO
• propagam-se até a auto destruição. A peroxidação
lipídica é considerada o principal indutor da disfunção mitocondrial e celular em situações de
estresse por induzir a formação de aldeídos tóxicos como o 4HNE (Hermes-Lima, Willmore
et al., 1995). Tendo em vista o aumento nas concentrações de 4HNE no nosso modelo de
insuficiência cardíaca, fomos analisar a formação desses hidroperóxidos lipídicos através de
espectrofotometria, como descrito anteriormente. Como podemos observar na Figura 14A o
grupo IC Alda-1 apresentou uma menor peroxidação lipídica quando comparado com o grupo
insuficiência cardíaca sem tratamento.
A superóxido dismutase e a catalase são importantes enzimas antioxidantes envolvidas
na manutenção do balanço redox na fisiopatologia da insuficiência cardíaca. Investigamos a
atividades dessas enzimas em nosso modelo através da técnica de espectrofotometria, como
descrito anteriormente. A atividade da superóxido dismutase estava diminuída nos animais
com insuficiência cardíaca (Figura 14B). O tratamento com Alda-1 foi capaz de restaurar a
atividade da enzima (Figura 14B). A enzima superóxido dismutase é uma enzima essencial
para a vida, pois a deleção sistêmica da SOD2 gera letalidade em camundongos neonatos e a
deleção condicional gera cardiomiopatia dilatada (Koyama et al., 2013; Lebovitz et al., 1996).
73
Portanto, é de fundamental importância a melhora da atividade da SOD gerada após seis
semanas de tratamento com Alda-1 em animais com insuficiência cardíaca. A atividade da
enzima catalase não apresentou diferenças entre os grupos como mostra a Figura 14C.
Sham IC
IC A
lda-
1
0
2
4
6
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ína)
Sham IC
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ad
e C
ata
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(Redução H
2O
2m
ol/m
g p
rote
ína)
A) B)
C)
Figura 14 – Peroxidação Lipídica, Atividade da Superóxido Dismutase e Catalase, A) Hidroperóxidos
Lipídicos, B) Atividade da Enzima Superóxido Dismutase – SOD e C) Atividade da catalase nos
grupos Sham, Insuficiência Cardíaca (IC) e Insuficiência Cardíaca tratado com Alda-1 (IC Alda-1). Os
dados foram analisados pela ANOVA um fator, seguida de post hoc de Duncan, *, p<0,05 vs, Sham;
#, p<0,05 vs, IC.
O nosso próximo questionamento foi a respeito da toxidade da molécula Alda-1. Visto
que até o momento não existe nenhum dado na literatura a respeito da toxicidade causada pelo
tratamento sustentado com Alda-1. Decidimos então analisar no plasma dos animais enzimas
que apontam sinais de toxicidade hepática.
7.5 Toxicidade da Alda-1
As enzimas alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) são
enzimas que estão envolvidas no metabolismo celular. A quantificação dessas enzimas no
74
plasma é comumente utilizada na clínica para identificação de dano hepático. A análise foi
realizada no plasma dos animais Sham, IC e IC Alda-1, como descrito anteriormente. Como
podemos observar na Figura 15, a razão dos níveis circulantes dessas enzimas apresenta-se
inalterada, sugerindo que o nosso tratamento não possui nenhum efeito tóxico.
Figura 15 - Análise da Toxicidade da Alda-1. Razão dos níveis circulantes das enzimas alanina
aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (ASP) em animais Sham, IC e IC tratado com
Alda-1. Os dados foram analisados pela ANOVA um fator, seguida de post hoc de Duncan.
75
8 DISCUSSÃO
Nos últimos anos, o tratamento das doenças cardiovasculares, como a insuficiência
cardíaca, avançou consideravelmente. No entanto, a insuficiência cardíaca continua sendo
uma importante causa de mortalidade e morbidade mundial (Hummel, Pauli et al., 2010).
Assim, torna-se necessário a busca por novas terapias farmacológicas que melhorem a
qualidade de vida e sobrevida desses pacientes, uma vez que a disfunção cardíaca já está
estabelecida.
A mitocôndria é apontada como uma importante organela associada ao agravamento
e/ou aparecimento da insuficiência cardíaca devido ao seu importante papel na bioenergética e
balanço redox celular. A disfunção mitocondrial existente na insuficiência cardíaca leva a
redução da produção de energia, a diminuição da contratilidade dos cardiomiócitos e aumento
da morte celular, resultando no agravamento da disfunção ventricular (Ahuja et al., 2013).
Diversos mecanismos e vias moleculares são propostos para explicar a disfunção mitocondrial
e a disfunção cardíaca presente na insuficiência cardíaca, no entanto, o aumento da produção
de espécies reativas de oxigênio parece ser um importante fator deletério e está diretamente
relacionado à disfunção do miocárdio (Ide et al., 2000).
O aumento de espécies reativas de oxigênio gera um desbalanço redox e como
consequência ocorre o aumento da peroxidação lipídica e a formação de aldeídos tóxicos,
como o 4HNE. O 4HNE pode prontamente interagir com resíduos de cisteína, histidina e
lisina de proteínas chave, inativando-as e contribuindo para o prejuízo metabólico e contrátil
observado na insuficiência cardíaca (Petersen, Doorn, 2004). De fato, esse aldeído parece
estar diretamente relacionado com a disfunção cardíaca. Nakamura e colaboradores
demonstraram que a redução de 40% dos níveis circulante de 4HNE, em pacientes com
cardiomiopatia dilatada, está associada à melhora da função cardíaca (Nakamura, Kusano et
al., 2002).
A ALDH2 é a principal enzima responsável na remoção do 4HNE. Diversas
patologias estão diretamente relacionadas com a redução da atividade dessa enzima. A
deficiência na ALDH2 está associada com o aparecimento de doenças com Alzheimer (Wang
et al., 2008), câncer (Seitz et al., 2001) e doenças cardiovasculares como hipertensão (Hui et
al., 2007) e diabetes (Xu et al., 2010). Recentes estudos apontam a ALDH2 como enzima
chave em mecanismos de cardioproteção, uma vez que elimina de forma eficiente aldeídos
tóxicos. No entanto, o papel da ALDH2 na insuficiência cardíaca ainda não foi determinado.
76
No presente estudo, utilizamos um modelo experimental de insuficiência cardíaca
induzida por infarto do miocárdio. Nossos resultados demonstram, pela primeira vez, a
caracterização da atividade da ALDH2 pós-infarto do miocárdio, além de concordarem com a
literatura, apontando a ALDH2 como uma enzima importante para a manutenção da
viabilidade cardíaca.
Na parte I dos nossos resultados (estudo 1) evidenciamos que a atividade da ALDH2
apresentam-se reduzida em 1, 2 e 4 semanas pós-infarto do miocárdio (Figura 6A). Essa
redução foi acompanhada pelo aumento da produção das espécies reativas de oxigênio (Figura
8) e aumento da formação de hidroperóxidos lipídicos (Figura 7A). Esses resultados sugerem
que a ALDH2 apresenta papel chave na remoção de aldeídos tóxicos, onde sua inativação
pode estar associada ao agravamento do desbalanco redox e disfunção contrátil observados na
progressão da disfunção cardíaca pós-infarto do miocárdio (Figura 6). Porém, nossos dados
apontam apenas uma associação entre os fatores supracitados. Estudos anteriores in vitro
demonstram que o 4HNE é capaz de inibir a atividade da ALDH2 através de uma ligação
covalente ao sítio catalítico da enzima (Doorn, Hurley et al., 2006). Contudo, são necessários
outros experimentos que comprovem o aumento desse aldeído nas primeiras semanas pós-
infarto do miocárdio.
O 4HNE pode ser removido também pela glutationa, uma importante enzima
antioxidante, através de uma ligação do 4HNE como o grupo tiol da enzima. Essa reação
ocorre por meio da enzima glutationa-s-transferase. Alterações nos níveis de glutationa
podem induzir aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, danos mitocondriais e
cardíacos (Raza, John, 2006). Sendo assim, investigamos os níveis dessa enzima em nosso
modelo, nossos resultados apontam um aumento dos níveis de glutationa na 1ª, 2ª e 4ª semana
pós-infarto do miocárdio. Acreditamos que esse aumento ocorra na tentativa de combater a
redução da atividade da ALDH2 e o aumento de hidroperóxidos lipídico demonstrado na
Figura 7. Os efeitos deletérios do infarto do miocárdio ao longo do tempo, apresentados até o
momento, foram associados com redução do consumo máximo de oxigênio pela mitocôndria
(Figura 8E) e redução da fração de encurtamento e ejeção cardíaca (Figura 5), sugerindo uma
disfunção mitocondrial e cardíaca.
Após a caracterização do curso temporal da atividade da ALDH2 e acúmulo de 4HNE
e hidroperóxidos lipídicos após infarto do miocárdio, decidimos utilizar animais com quatro
semanas pós-infarto para compreender o papel da ALDH2 na insuficiência cardíaca de
etiologia isquêmica e investigar os possíveis benefícios terapêuticos da Alda-1 nessa
síndrome. A utilização de animais com quatro semanas pós-infarto foi baseada em nossos
77
resultados que apontam que animais com infarto do miocárdio apresentam disfunção cardíaca
sistólica e diastólica em repouso, além de dilatação ventricular esquerda e maior índice de
desempenho do miocárdio nesse período (Tabela 2).
A segunda parte dos nossos resultados (estudo 2) aponta que a ativação sustentada da
ALDH2 utilizando Alda-1 aumenta a contratilidade cardíaca tanto em repouso (Figura 9)
quanto em estresse (Figura 10A-F), além de reverter o remodelamento cardíaco patológico
(Figura 10G-M). A cardioproteção induzida por Alda-1 é evidenciada pela melhora da função
cardíaca, diminuição da dilatação do ventrículo esquerdo e diminuição da fibrose cardíaca.
Para testar a efetividade do nosso tratamento realizamos a análise da atividade da
ALDH2. Constatamos que o nosso tratamento foi efetivo em aumentar 2,7 vezes a atividade
da ALDH2 sem alterar sua expressão. Em publicações anteriores foi demonstrado que a Alda-
1 é um agonista alostérico da ALDH2, sendo capaz de diminuir drasticamente o Km da
ALDH2 para o co-factor NAD+, e aumentar o Vmáx. da catálise do substrato de aldeídos
(Chen, Ferreira et al., 2014). De fato, o aumento da atividade da ALDH2 não está associado à
expressão da enzima (Figura 11B). Sendo assim, nossos resultados corroboram os dados
encontrados na literatura em outros modelos experimentais, onde o tratamento com Alda-1
torna a enzima mais eficiente. Testamos essa eficiência da ALDH2, por meio da técnica de
western blot para quantificação de acúmulo de aldeídos tóxicos e proteínas carboniladas.
Verificamos que o aumento da atividade enzimática da ALDH2 foi capaz de atenuar a carga
de aldeídos no miocárdio de ratos com insuficiência cardíaca, caracterizada pela redução de
adutos de proteína-4HNE e de carbonilação de proteínas, o que sugere uma redução de
proteínas danificadas cardíacas (Figura 11).
O acúmulo de aldeídos tóxicos pode inativar proteínas importantes, tanto da via
glicolítica como da via oxidativa e proteínas da cadeia de transporte de elétrons (Chen et al.,
2010) gerando disfunção mitocondrial. Além disso, sabemos que a produção excessiva de
espécies reativas de oxigênio e a sobrecarga de cálcio provoca a dissipação do gradiente
eletroquímico e consequente aberturas de poros de transição mitocondrial, o que resulta na
maior da produção de espécies reativas de oxigênio. Essas alterações podem levar a liberação
de citocromo c para o citosol e consequente ativação de vias pró-apoptóticas através de
proteínas da família Bcl (Kroemer, Galluzzi et al., 2007). Portanto decidimos investigamos se
o acúmulo desses aldeídos se relaciona com a disfunção mitocondrial.
De fato, nossos resultados apontam que os animais com insuficiência cardíaca
apresentam uma disfunção mitocondrial, caracterizada pela redução no consumo de oxigênio
pela mitocôndria (figura 12) e pelo aumento na liberação de espécies reativas de oxigênio pela
78
mitocôndria (Figura 12). Além disso, os nossos resultados sugerem que a mitocôndria dos
animais com insuficiência cardíaca apresenta maior formação de poros de transição
mitocondrial (Figura 13A), visto que a mitocôndria desses animais apresentou baixa
tolerância às adições consecutivas de cálcio in vitro, sendo que o tratamento dessas
mitocôndrias com ciclosporina A (bloqueador de poros de transição mitocondrial) restaurou a
tolerância ao cálcio. O nosso tratamento com Alda-1 foi efetivo em melhorar a respiração
mitocondrial, reduzir a produção de espécies reativas de oxigênio e reduzir a formação de
poros de transição mitocondrial. Outro resultado que confirma a abertura de poros de
permeabilidade mitocondrial é a liberação do citocromo c para o citosol. Nossos resultados
apontam uma maior liberação do citocromo c para o citosol nos animais com insuficiência
cardíaca. O tratamento com Alda-1 foi eficaz em diminuir essa liberação, o que sugere uma
redução da ativação de vias apoptóticas. No entanto, experimentos mais pontuais são
necessários para avaliar morte celular nesse modelo experimental.
A literatura demonstra claramente que os aldeídos podem prejudicar diversas funções
celulares, como já descrito anteriormente. De fato, nossos resultados indicam que os aldeídos
são extremamente tóxicos e prejudicam a função mitocondrial e cardíaca. Quando testamos a
reatividade do 4HNE em mitocôndria cardíaca isolada de animais saudáveis in vitro, através
de uma curva de dose resposta, verificamos que o 4HNE reduz o consumo de oxigênio
mitocondrial proporcional as quantidades adicionadas. Além disso, a Alda-1 foi capaz de
evitar a disfunção mitocondrial ocasionada pelo 4HNE (Figura 13E). Portanto, nossos
resultados in vitro reproduziram os achados in vivo, demonstrando que a Alda-1 é capaz de
reverter os danos mitocondriais oriundos do 4HNE.
O aumento do 4HNE no tecido cardíaco do nosso modelo de insuficiência cardíaca se
relaciona com aumento da peroxidação lipídica e redução da enzima superóxido dismutase
(Figura 14A e 14B, respectivamente). O tratamento com Alda-1 reverteu esse processo,
reduzindo os níveis de hidroperóxidos lipídicos e restaurando a atividade da superóxido
dismutase cardíaca. Dados publicados anteriormente demonstram que pacientes com
insuficiência cardíaca crônica apresentam redução na atividade da superóxido dismutase (Xu,
Chen et al., 2010) corroborando com os nossos resultados.
Por fim, decidimos analisar a toxidade da Alda-1 visto que nenhum estudo até o
momento testou o efeito sustentado dessa molécula. Para testa a toxicidade da Alda-1 foi
realizada a análise dos níveis circulantes das enzimas alanina aminotransferase (ALT) e
aspartato aminotransferase (ASP), essa análise é muito utilizada na clínica para testa toxidade
hepática (Tahir, Sultana, 2011). A enzima ALT é encontrada principalmente no fígado, assim
79
como a enzima ALT que também é encontrada no coração e músculo esquelético, danos
hepáticos causam aumento dos níveis circulantes dessas enzimas. Nossos resultados apontam
a não toxidade da Alda-1 (figura 15) sendo um tratamento seguro em longo prazo em ratos
com IC induzido por infarto do miocárdio.
Acreditamos que os aldeídos tóxicos, como o 4HNE, estão no centro de um ciclo de
retro-alimentação positivo em um coração insuficiente, em que espécies reativas de oxigênio
produzem aldeídos através da peroxidação lipídica, que, em seguida promovem disfunção
mitocondrial e levam a uma maior geração de espécies reativas de oxigênio. A interrupção
desse ciclo, através da maior remoção de 4HNE cardíaco pela ALDH2 melhora a função
mitocondrial e diminui a produção de espécies reativas de oxigênio, o que resulta na melhora
da função cardíaca e melhora do quadro de insuficiência cardíaca. Ao contrário dos
tratamentos antioxidantes, que visam reduzir os níveos de espécies reativas de oxigênio, que
são instáveis, e devem ser biologicamente disponível no local certo (por exemplo, no interior
da mitocôndria) a uma concentração estequiométrica, a Alda-1 funciona cataliticamente sobre
um produto estável de estequiométrica, a Alda - aldeídos - dentro do microambiente correto -
mitocôndria.
80
9 CONCLUSÃO
Nossos resultados fornecem evidências de que a ALDH2 é uma importante enzima
que auxilia na manutenção da viabilidade cardíaca pós-infarto do miocárdio, e que a redução
da carga de aldeídos cardíacos através da ativação seletiva ALDH2 é suficiente para atenuar
danos causados pela insuficiência cardíaca em ratos. Dessa forma, baseados em nossos
estudos pré-clínicos, podemos concluir que o ativador da ALDH2 (Alda-1) tem um
importante papel na melhora da bioenergética mitocondrial associada à redução do estresse
oxidativo, contribuindo sobremaneira para a reversão da fisiopatologia da insuficiência
cardíaca. Portanto, a ALDH2 pode ser apontada como um novo alvo terapêutico no
tratamento da insuficiência cardíaca. Entretanto, outros estudos, incluindo a utilização de
diferentes modelos experimentais de insuficiência cardíaca, são necessários para validar o uso
terapêutico da Alda-1 no tratamento desta síndrome.
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