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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

JOSÉ AFONSO CORRÊA DA SILVA

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS FARMACOLÓGICOS DO ÓLEO

ESSENCIAL DE Chenopodium ambrosioides

SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL

Itajaí 2015

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

AREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

JOSÉ AFONSO CORRÊA DA SILVA




Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Drª. Márcia Maria de Souza Co-orientadora: Prof. Drª. Angela Malheiros

Itajaí, Março 2015

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FICHA CATALOGRÁFICA

S38a

Silva, José Afonso Corrêa da, 1989- Avaliação dos efeitos farmacológicos do óleo essencial de chenopodium ambrosioides sobre o sistema nervoso central / José Afonso Corrêa da Silva, 2015. 113f. ; il.; fig. Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí, Mestrado em Ciências Farmacêuticas. “Orientadora : Profª . Drª Márcia Maria de Souza” Bibliografia : p. 90-113p. 1. Química farmacêutica. 2. Produtos naturais. 3. Fitoterapia. 4. Estratos vegetais – Uso terapêutico. 5. Preparação de plantas. 6. Chenopodium ambrosioides. I. Título. CDU: 615.32

Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293

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Dedico esta dissertação a todos que me apoiaram, principalmente aos

meus pais, Jadete Maria C. da Silva e Amarante C. da Silva,

à minha esposa, Michele A. C. da Silva e a meu filho,

o pequeno Joaquim que, com apoio

constante, proporcionaram mais essa vitória.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a todas as pessoas que, de alguma forma, contribuíram para a

realização deste trabalho, especialmente:

À minha orientadora, Drª Márcia Maria de Souza, exemplo de cientista e

professora, que me ajudou a superar todas as adversidades e dificuldades, sempre

entregando o que qualquer aluno há de querer, como atenção, carinho e

responsabilidade. Certamente, o que aprendi fez-me crescer, não apenas como

pesquisador mas, principalmente, como pessoa.

À professora Drª Angela Malheiros, pela orientação que me foi dada quanto

ao procedimento de obtenção do Óleo essencial e pelo respeito e companheirismo

que sempre trata todos à sua volta.

Aos alunos e colegas, Ana Elisa Gonçalves, Camila Cazarin, Fernando

Lanziotti, Ruth Tomasoni Degenhardt e Iandra Holzmann, pela ajuda e dedicação no

laboratório.

Agradeço à Coordenação e Secretaria do Curso de Mestrado em Ciências

Farmacêuticas da UNIVALI, em especial à Drª Tania M. B. Bresolin, a Juliano e à

Helenize, sempre prontos a ajudar.

À minha colega, Maristela Girardi, que sempre me apoiou e incentivou,

demonstrando o verdadeiro significado da amizade, vejo você como o maior

exemplo de profissional e farmacêutico ético e apaixonado pela profissão.

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José Afonso Corrêa da Silva

Orientação: Márcia Maria de Souza, Drª. Co-orientação: Angela Malheiros, Drª. Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas. Chenopodium ambrosioides L. (Chenopodiaceae), popularmente conhecida como “Erva de Santa Maria” ou “Mastruz”, é uma das plantas utilizadas na medicina popular como agente vermífugo, antirreumático, anti-infeccioso, antitussígeno, analgésico e anti-inflamatório. Também tem sido reportado seu uso em patologias do SNC, sem a devida comprovação científica. No presente estudo, o óleo essencial da C. ambrosioides L. (OECA) foi investigado em diversos modelos farmacológicos “in vivo” sobre o sistema nervoso central (SNC). Foram utilizados camundongos Swiss Webster (25 a 30 g/ n=8-10, machos), em modelos como: modelo de ansiedade, teste do labirinto de cruz elevado (LCE); modelo de depressão, nado forçado (MNF); modelo de convulsão, induzida por pentilenotetrazol (MCP); modelo de sono induzido por barbitúrico (MSB); modelo de avaliação motora, o teste de campo aberto (TCA) e o Rotarod. Considerando que o efeito ansiolítico do OECA (50mg/kg, 100mg/kg, 150mg/kg, v.o.) no LCE, foi semelhante ao resultado obtido pelo tratamento com o diazepam (75mg/kg, i.p.), utilizou-se o mesmo aparato para testar as diversas vias de mecanismo de ação. Observou-se que, com o pré-tratamento com haloperidol (0,2mg/kg, i.p., antagonista dopaminérgico não seletivo), baclofeno (2,0mg/kg, i.p., antagonista de receptores GABAB), bicuculina (1,0mg/kg, i.p., antagonista de receptores GABAA) e flumazenil (3mg/kg, i.p., antagonista benzodiazepínico) ocorreu o bloqueio total do efeito do OECA (50mg/kg, v.o.) e parcial pelo pré-tratamento com pimozide (0,5mg/kg, i.p., antagonista D2), SCH23390 (0,5mg/kg, i.p., antagonista D1), quetanserina (5mg/kg, i.p., antagonista de receptores 5-HT2A/2C) e NAN-190 (0,5mg/kg, i.p., antagonista de receptores 5-HT1A), influenciando apenas o número de entradas nos braços do aparato. O OECA promoveu o aumento do tempo de sono e diminuição da latência para o mesmo no teste de sono induzido por barbitúricos (MSB), comprovando seu efeito hipnótico. Na avaliação do efeito do OECA sobre a depressão pelo modelo de MNF, não foi constatado uma diferença significativa nos grupos testados. Na avaliação do efeito do OECA sobre a convulsão (MCP), observou-se uma potencial proteção (150mg/kg, v.o.) dos camundongos, que corrobora com os resultados já obtidos. O conjunto de resultados demonstram que o óleo testado apresenta ação depressora do SNC, possivelmente através da via GABAérgica de transmissão, com influencia da via dopaminérgica e serotoninérgica, exibindo os efeitos clássicos da classe dos benzodiazepínicos, sugerindo que o óleo extraído de C. ambrosioides tem efeito hipnótico, anticonvulsivo e ansiolítico. Palavras-chave: Chenopodium ambrosioides, SNC, Óleo essencial.

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EVALUATION OF THE PHARMACOLOGICAL EFFECTS OF THE

ESSENTIAL OIL Chenopodium ambrosioides

ON THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM

José Afonso Corrêa da Silva

Orientation: Márcia Maria de Souza, Drª. Co-orientation: Angela Malheiros, Drª. Concentration area: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances. Chenopodium ambrosioides L. (Chenopodiaceae), popularly known as "Herb of Saint Marie" or "Mastruz", is one of the plants used in traditional medicine as a vermifuge, antirheumatic, anti-infective, antitussive, analgesic and anti-inflammatory agent. Its use has also been reported in diseases of the CNS, though there is no proper scientific evidence of its effectiveness for this purpose. In the present study, the essential oil of C. ambrosioides L. (OECA) was investigated in several pharmacological models "in vivo" on the central nervous system (CNS). Swiss Webster mice were used (25-30 g / n = 8-10 males), in models such as: anxiety model, elevated plus maze test (EPM); model of depression, forced swimming (FSM); model of convulsion induced by pentylenetetrazol (MIP); model of sleep induced by barbituric (MSB); motor assessment model, the open field test (OFT) and the Rotarod test. Considering that the anxiolytic effect of OECA (50 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, v.o.) in the EPM was similar to the results obtained for treatment with diazepam (75 mg / kg, ip), the same device was used to test several routes of action mechanism. It was observed that pretreatment with haloperidol (0.2 mg/kg, i.p., non-selective dopamine antagonist), baclofen (2.0 mg / kg, i.p., antagonist of GABAB receptors), bicuculline (1.0 mg/kg, i.p., antagonist of GABAA receptors) and flumazenil (3 mg/kg, i.p., benzodiazepine antagonist) led to total blocking of the OECA effect (50mg/kg, v.o.), while pretreatment with pimozide (0.5 mg/kg, i.p., D2 antagonist), SCH23390 (0.5 mg/kg, i.p., D1 antagonist), ketanserin (5 mg/kg, i.p., antagonist of 5-HT2A/2C receptors) and NAN-190 (0.5 mg/kg, i.p., antagonist of 5-HT1A receptors) resulted in partial blocking, influencing only the number of entries to the arms of the plus maze. OECA promoted an increase in sleeping time and a decrease in sleep latency in the sleeping test induced by barbiturates (MSB), proving its hypnotic effect. In the evaluation of the effect of OECA on depression in the FSM model, no significant difference was observed between the tested groups. In the evaluation of the effect of OECA effect on convulsions (MIP), a potential protection of the mice was observed, confirming the results already obtained. Taken together, the results demonstrate that the tested oil presents depressant action on the CNS, possibly through the GABAergic pathway, and influences the dopaminergic and serotoninergic pathways, exhibiting the classic effects of the benzodiazepine class, such as lethargy and sleep, suggesting that the extracted oil of C. ambrosioides, has hypnotic, anticonvulsant and anxiolytic effects. Keywords: Chenopodium ambrosioides, CNS, essential oil.

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LISTA DE FIGURAS Figura 1: (A) Fotografia das partes aéreas da Chenopodium ambrosioides (B)

Detalhamento da folha da C. ambrosioides. ........................................................ 22 Figura 2: Mecanismo de formação de ascaridol e outros monoterpenos no gênero

Chenopodium. ..................................................................................................... 24 Figura 3: (A) Óleo essencial de C. ambrosioides; (B) Partes aéreas da Chenopodium ambrosioides..............................................................................................................35 Figura 4: (A) Cromatograma obtido por CG-FID (180ºc) do óleo essencial de

Chenopodium ambrosioides (OECA); (B) Estrutura dos compostos majoritários presentes no óleo essencial. ............................................................................... 36

Figura 5: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a

deambulação dos animais através do TCA. ........................................................ 39 Figura 6: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre o

sistema motor de animais através do Rota rod. .................................................. 40 Figura 7: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a

depressão através do MNF. ................................................................................ 41 Figura 8: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre o MSB.

............................................................................................................................ 42 Figura 9: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a

convulsão induzida por PTZ. ............................................................................... 43 Figura 10: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a

ansiedade através do LCE. ................................................................................. 44 Figura 11: Esquema representativo da investigação do mecanismo de ação da

propriedade ansiolítica do OECA. ....................................................................... 45 Figura 12: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/kg),

administrados pela via oral sobre os parâmetros: número de cruzamentos (crossing) (A) e número de levantadas (rearings) (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância anova seguido pelo teste de Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo. *** p < 0,001. ..................................................................... 49

Figura 13: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/kg),

administrados pela via oral no teste do rotarod. Tempo de permanência dos animais no aparelho Rotarod (A) e número de quedas dos animais do aparelho (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à

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análise de variância anova seguido pelo teste de Bonferroni. os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo.. .................. 50

Figura 14: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/kg) e de

diazepam (0,75 mg/kg), administrados pela via oral e intraperitoneal, respectivamente, no modelo LCE. Freqüência de entrada nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância anova seguido pelo teste de bonferroni. os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo). *** p < 0,001. .................................................................................................................. 52

Figura 15: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/kg) e do

diazepam (1 mg/kg), administrados pela via oral e intraperitoneal, respectivamente no MSB. Tempo de latência para o sono (A) e o tempo total do sono (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância anova seguido pelo teste de bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo). *** p < 0,001. ....................................................................................... 54

Figura 16: Efeito da administração de OECA (50, 100 e 150 mg/kg, v.o.) e da

Imipramina (50 mg/kg, i.p.). Tempo de imobilidade (A), tempo de escalada (B), tempo de nado (C). cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância anova seguido pelo teste de Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo). ** p < 0,01; *** p < 0,001. ..................................................................... 56

Figura 17: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/kg, v.o.) e de

fenobarbital (50 mg/kg, i.p.), no modelo de convulsão induzida por ptz. a figura indica o tempo de latência para primeira crise convulsiva com PTZ. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância anova seguido pelo teste de Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo). *** p < 0,001. ............ 58

Figura 18: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com ioimbina (1 mg / kg, ip,

um antagonista α2-adrenérgico) e prazosina (1 mg / kg, ip, um antagonista α1-adrenérgico) e OECA (50 mg / kg, v.o.), no modelo LCE. frequência de entradas nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B). cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são expressos como média ± S.E.M. (n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo controle................................................................................................................ 60

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Figura 20: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com pimozide (0,5 mg / kg, i.p., antagonista de receptores dopamina d2), haloperidol (10µg/kg, i.p., antagonista não seletivo de receptores de dopamina), SCH23390 (0,5 mg / kg, i.p., antagonista de receptores de dopamina d1), metoclopramida (1mg/kg, i.p., antagonista de receptores 5HT3/d1) e OECA (50 mg / kg, v.o.), no modelo LCE. Frequência de entradas nos braços abertos (a), tempo de permanência nos braços abertos (b). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são expressos como média ± s.e.m. (n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo controle. ### p<0.001, comparação do grupo pré-tratados com antagonistas e o grupo tratado somente com oeca. ...................... 64

Figura 21: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com bicuculina (1,0 mg / kg,

i.p., antagonista de receptores gabaA), baclofeno (2,0 mg / kg, i.p., antagonista do receptor gabaB) e flumazenil (3mg/kg, i.p., antagonista dos benzodiazepínicos), diazepam (1mg/kg, i.p., agonistas gabaérgico) e OECA (50 mg / kg, v.o.), respectivamente, no modelo LCE. Frequência de entradas nos braços abertos (a), tempo de permanência nos braços abertos (b). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são expressos como média ± s.e.m. (n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo controle. ### p<0.001, comparação do grupo pré-tratados com antagonistas e o grupo tratado somente com OECA. (a) p<0.001, comparação do grupo pré-tratado com diazepam+flumazenil e o grupo tratado somente com diazepam. ...................... 66

Figura 22: Esquema representativo de possíveis sistemas de neurotransmissão

afetados nos testes do OECA. ............................................................................ 80

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LISTA DE ABREVIAÇÕES

ADT – Antidepressivo tricíclico

ATV – Área tegmental ventral

α1-ARs - α1-adrenoreceptores

AMPc - Monofosfato de adenosina cíclico

BDNF – Fator neurotrófico derivado do cérebro

BDZ – Benzodiazepínico

CG-EM - Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

CG-FID - Cromatografia gasosa acoplada à detector de ionização de chama

Cl- – Cloreto

DA – Dopamina

DPZ – Diazepam

EPM – Erro Padrão médio

FEA – Freqüência de entrada do braço aberto

FEF – Freqüência de entrada no braço fechado

FLU – Flumazenil

GABA – Ácido γ-aminobutírico

GAD-65 – Glutamato descarboxilase - 65

GMP – Guanosina mono fosfato

IMAO – Inibidores da enzima monoamina-oxidase

i.p. – Intraperitoneal

ISO - International Standard Organization

ISRS – Inibidores seletivos da recaptação de serotonina

i.v. - Intravenosa

LCE – Labirinto em cruz elevado

LS – Latência para o sono

MAO – Monoamina-oxidase

MCP – Modelo de convulsão induzido por pentilenotetrazol

MNF – Modelo de natação forçada

MSB – Modelo de indução do sono por barbitúrico

NaC – Nucleus accumbes

NAN-190 – 1-(2-metoxifenil)-4-[2-ftalimido)butil]piperazina- antagonista 5HT1A)

NDR – Núcleo dorsal da rafe

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NMR – Núcleo mediano da rafe

NMDA – N-metil-D-aspartato

NOR – Noradrenalina

OECA – Óleo essencial de Chenopodium ambrosioides

OMS – Organização Mundial da Saúde

PKC – Proteína quinase C

PTZ – Pentilenotetrazol

%FEA – Percentagem da freqüência de entrada no braço aberto

%TPA – Percentagem do tempo de permanência no braço aberto

SCH23390 - (R(+)-7-Chloro-8-hydroxy-3-methyl-1-phenyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-

benzazepine hydrochloride) - antagonista D1

SIB – Sono induzido por barbitúrico

SNC – Sistema Nervoso Central

TCA – Teste campo aberto

TPA – Tempo de permanência no braço aberto

TPF– Tempo de permanência no braço fechado

TST – Tempo de sono total

5-HT – Serotonina

VLPO - Núcleo pré-óptico ventrolateral

v.o. – Via oral

WHO – World Health Organization

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 17

2.1 Objetivo Geral: ..................................................................................................... 17

2.2 Objetivos Específicos: ......................................................................................... 17

3 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 18

3.1 Uso de plantas medicinais na promoção da saúde ............................................. 18

3.2 Família Chenopodiaceae e o gênero Chenopodium ........................................... 19

3.3 Estudos sobre Chenopodium ambrosioides ........................................................ 21

3.4 Óleos essenciais e a composição de terpenos .................................................... 24

3.5 Plantas que atuam no Sistema Nervoso Central ................................................. 27

3.5.1 Plantas medicinais com propriedades ansiolíticas ........................................... 27

3.5.2 Plantas medicinais com propriedades hipnóticas ............................................. 29

3.5.3 Plantas medicinais com propriedades antidepressivas .................................... 30

3.5.4 Plantas medicinais com propriedades anticonvulsivantes ................................ 32

4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 35

4.1 Material vegetal ................................................................................................... 35

4.2 Extração do óleo essencial .................................................................................. 35

4.3 Ensaios Farmacológicos:..................................................................................... 37

4.3.1 Animais ............................................................................................................. 37

4.3.2 Drogas e tratamentos ....................................................................................... 37

4.3.3 Grupos experimentais....................................................................................... 38

4.3.4 Ensaios farmacológicos .................................................................................... 38

4.3.4.1 Avaliação do efeito do OECA sobre o sistema motor e depressor através do

teste de campo aberto (TCA) e Rota rod .................................................................. 38

4.3.4.2 Avaliação do efeito do OECA sobre a depressão através do modelo da

natação forçada (MNF) ............................................................................................. 40

4.3.4.3 Avaliação do efeito do OECA sobre o sono induzido por barbitúrico (MSB) . 41

4.3.4.4 Avaliação do efeito do OECA sobre a convulsão induzida por

pentilenotetrazol (MCP) ............................................................................................. 42

4.3.4.5 Avaliação do efeito do OECA sobre a ansiedade dos animais através do

modelo de labirinto em cruz elevado (LCE) .............................................................. 43

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4.3.4.6 Determinação do mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do OECA 45

4.4 Análise estatística ................................................................................................ 47

5 RESULTADOS ....................................................................................................... 48

5.1 Avaliação do efeito do OECA sobre a deambulação dos animais através do TCA

e da capacidade motora pelo teste Rota rod. ............................................................ 48

5.2 Avaliação do efeito do OECA sobre a ansiedade dos animais através do modelo

LCE. .......................................................................................................................... 51

5.3 Avaliação do efeito do OECA sobre o sono induzido por barbitúricos (MSB). .... 53

5.4 Avaliação do efeito do OECA sobre a depressão através do Modelo de Nado

Forçado (MNF). ......................................................................................................... 55

5.5 Avaliação do efeito do OECA sobre a convulsão induzida por PTZ. ................... 57

5.6 Determinação do mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do OECA ...... 59

5.6.1 Influencia do sistema adrenérgico sobre o mecanismo de ação da propriedade

ansiolítica do OECA .................................................................................................. 59

5.6.2 Influencia do sistema serotoninérgico sobre o mecanismo de ação da

propriedade ansiolítica do OECA .............................................................................. 61

5.6.3 Influência do sistema dopaminérgico sobre a propriedade ansiolítica do OECA. .

................................................................................................................... 63

5.6.4 Influencia do sistema GABAérgico sobre o mecanismo de ação da propriedade

ansiolítica do OECA .................................................................................................. 65

6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 67

7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 81

8 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 82

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1 INTRODUÇÃO

Como uma prática enraizada na cultura popular, o uso de plantas medicinais

transpassa milhares de anos e, atualmente tem ganhado ênfase como forma

alternativa aos tratamentos com medicamentos sintéticos (CALIXTO, 2005; DIAS-

SOUZA et al., 2014).

Muitas plantas encontradas na natureza exibem efeitos psicotrópicos e são

capazes de atuar no Sistema Nervoso Central (SNC), modificando comportamento,

humor, pensamentos e sensações. Portanto, o entendimento de suas funções

psicofarmacológicas é importante no que tange à segurança na utilização das

mesmas (CARLINI et al., 2006).

Chenopodium ambrosioides (Chenopodiaceae) é uma planta herbácea,

originária da América do Sul e México, e utilizada por povos indígenas dessas

regiões. No Brasil, essa espécie tem ampla distribuição, com ocorrência em quase

todo o território nacional, onde recebe vários nomes. Os mais populares são

“mastruz” e “erva de santa maria” (SOUZA et al., 2011). Das folhas e flores desta

planta pode-se extrair um óleo essencial constituído principalmente de uma mistura

de ascaridol, α-terpineno, isoascaridol e p-cimeno (ZHU et al., 2012).

Recentemente, o governo brasileiro lançou um programa conhecido como a

Relação Nacional de Plantas de Interesse do SUS (RENISUS), que lista 71 plantas

utilizadas com ênfase na medicina popular brasileira. O programa tem como objetivo

apoiar a fitoterapia como tratamento alternativo de doenças e também incentivar

pesquisadores brasileiros para validar as propriedades farmacológicas destas

plantas, incluindo a sua eficácia e segurança (BRASIL, 2012). É importante salientar

que, C. ambrosioides (L) (Amaranthaceae) pertence a esta lista.

A planta triturada é comumente utilizada em processos inflamatórios,

aliviando a dor e proporcionando o aumento da cicatrização, sendo empregada no

tratamento de feridas, fraturas e contusões, problemas respiratórios como bronquite

e tuberculose (LORENZI; MATOS, 2002). Entretanto, é a sua ação anti-helmíntica

que a caracteriza como erva medicinal e que faz com que seja um dos remédios

mais tradicionais utilizados pelo mundo (MONZOTE et al., 2007).

Como citado acima, várias pesquisas já realizadas contemplam o histórico

farmacológico da C. ambrosioides, porém o foco na atividade farmacológica no SNC

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apresenta-se restrita a citações de empregos terapêuticos, sem fundamentação

experimental.

Apesar disso vários estudos têm como foco elucidar terapeuticamente o

emprego de plantas medicinais no SNC (SILVA et al, 2007; ISAAC; LARSON, 2014;

SWART et al., 2014). Desde o tratamento de doenças neurodegenerativas, até

distúrbios neuropsiquiátricos como ansiedade, depressão e insônia, demonstrando

que algumas plantas apresentam os mesmos mecanismos de ação que as drogas

padrão utilizadas na terapêutica atual. Nos estudos de ansiedade e insônia, destaca-

se a Pluchea sagittalis, com mecanismo de ação semelhante ao dos

benzodiazepínicos, voltado para o sistema de transmissão GABAérgico,

apresentando-se como ótimo ansiolítico e, assim como a Valeriana officinalis,

detentora de um grande potencial para o tratamento de distúrbios do sono

(RODRIGUES, 2011; SARRIS et al., 2011). O Hypericum perforatum, utilizado

popularmente para o tratamento de depressão, experimentalmente apresenta

atuação na recaptação de serotonina e inibição da enzima MAO-A, mecanismo de

ação de diversos antidepressivos (CHANG; WANG, 2010).

Desta forma o presente estudo se propõe a avaliar os efeitos do óleo

essencial da planta em estudo, nos modelos farmacológicos específicos, a fim de

fundamentar experimentalmente a ação da C. ambrosioides no SNC.

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Estudar possíveis propriedades farmacológicas no SNC do óleo essencial

obtido de Chenopodium ambrosioides, em diversos modelos farmacológicos “in

vivo”, utilizados no screening de substâncias psicoativas.

2.2 Objetivos Específicos:

Avaliar os efeitos do óleo essencial sobre o sistema motor dos animais

através dos testes do Open Field e Rotarod;

Verificar os efeitos do óleo essencial sobre parâmetros comportamentais de

ansiedade dos animais, através do modelo do labirinto em cruz elevado;

Determinar os efeitos do óleo essencial em parâmetros comportamentais de

depressão dos animais através do modelo do nado forçado;

Determinar os efeitos do óleo essencial na convulsão induzida por

pentilenotetrazol.

Avaliar os efeitos hipnóticos do óleo essencial através do modelo do sono

induzido por barbitúricos;

Comparar o efeito do óleo essencial com fármacos utilizados na terapêutica

de patologias do SNC, utilizados como controles-positivos;

Identificar o efeito farmacológico mais significativo e estudar os mecanismos

de ação envolvidos nesse efeito.

18

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Uso de plantas medicinais na promoção da saúde

O uso de plantas medicinais advém do conhecimento empírico acumulado de

milhares de anos e transmitido pelo uso popular. Entendida como uma das práticas

mais antigas e presentes na história da humanidade, essa pratica tem se perpetuado

e alcançado os dias atuais, apesar dos avanços tecnológicos e científicos no âmbito

dos produtos sintéticos (PETRONILHO et al., 2012). A descoberta e

desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos (MAHANNA; LEE, 2010), assim

como a utilização de produtos naturais como matéria-prima para diversos

medicamentos, produtos da indústria química, alimentícia e cosméticos (MARTINS

et al., 1994; GOSSLAU et al., 2011; MISHRA; TIWARI, 2011), é o que fomenta o

investimento na descrição e caracterização de um número cada vez mais expressivo

de plantas (ANTONIO; TESSER; MORETTI, 2014).

Por esses e outros motivos as plantas tornaram-se recursos permanentes de

compostos biologicamente ativos, utilizados por cerca de 80% da população

mundial, tanto na forma natural de chás, como de fitoterápicos e/ou fitofármacos

(HORN; VARGAS, 2008). Esta cultura é utilizada por mais de 2/3 da população do

planeta que opta pelo uso de produtos naturais pelo alto custo que os medicamentos

sintéticos agregam, evidenciando a importância destes no combate e na prevenção

de doenças na população com baixas condições financeiras (FRIAS; COSTA; FRIAS

et al., 2011). Acredita-se também que os produtos naturais tenham uma baixa

incidência de efeitos adversos e contraindicações (MONTANARI; BOLZANI, 2001),

entretanto, isto é questionável, havendo a necessidade de que os mesmos princípios

de produção do medicamento sintético sejam empregados nos medicamentos

naturais.

A cura através de plantas e seus produtos têm resistido às inovações que

vem ocorrendo. Com o passar dos tempos, as ervas têm conseguido sustentar sua

importância e a confiança das populações atuais. É importante ressaltar que, mesmo

diante dos progressos tecnológicos atuais, existem locais em que a fitoterapia

representa o único recurso de tratamento (MACIEL; PINTO; VEIGA, 2002), muitas

vezes sem cunho científico e experimental (ANTONIO; TESSER; MORETTI, 2014).

19

O Brasil, nos seus três milhões e quinhentos mil quilômetros quadrados de

florestas, representa o país mais biodiverso do planeta, abrigando entre 10 e 20%

das espécies e 30% das florestas tropicais do mundo (LEWINSOHN; PRADO, 2012).

As práticas naturais de utilização de ervas estão presentes em todo o território,

independente das diferenças regionais e culturais, inserindo grande influência na

manutenção das condições de saúde das pessoas (RIBEIRO et al, 2014).

3.2 Família Chenopodiaceae e o gênero Chenopodium

A família Chenopodiaceae, sinonímia Amaranthaceae apresenta grande

diversidade de estrutura foliar, com plantas de anatomia Kranz e não-Kranz, com

numerosas variações destes dois arranjos anatômicos. O mesofilo varia de

dorsiventral a cêntrico, podendo apresentar parênquima aquífero. Esta grande

diversidade está relacionada ao habitat dos membros da família. Muitas espécies da

família são características de regiões marítimas e solos salinos (COSTA; TAVARES,

2006).

Com relação aos gêneros, a família Amaranthaceae tem 169 gêneros e cerca

de 2.360 espécies, sendo os maiores gêneros: Atriplex L. (300 spp.), Gomphrena L.

(120 spp.), Salsola L. (120 spp.), Alternanthera Forssk. (100 spp.), Chenopodium L.

(120 spp.), Ptilotus R. Br. (100 spp.), Suaeda Forssk (100 spp.), Iresine R. (80 spp.),

Amaranthus L. (60 spp.), Corispermum L. (60 spp.) e Celosia L. (50 spp.) (FANK-DE-

CARVALHO; MARCHIORETTO; BÁO, 2010).

O gênero Chenopodium L. compreende cerca de 120 espécies, perenes ou

anuais. O nome genérico é de origem grega “chen” (ganso) e “podus” (pé), pela

semelhança que as folhas têm com os pés de um ganso. O nome específico

“ambrosioides” refere-se à semelhança de suas inflorescências com as de Ambrosia

sp. A maioria destas plantas são cosmopolitas e estão distribuídas principalmente

nas regiões subtropicais e temperadas (KOKANOVA-NEDIALKOVA et al., 2011).

Esse gênero é cultivado há séculos como verdura (Chenopodium album, ou

simplesmente “fedegoso”) e como fornecedora subsidiária de grãos (C. quinoa e C.

album) para o consumo humano e animal, em razão da sua quantidade elevada de

proteína e, por fornecer aminoácidos essenciais de forma equilibrada. As folhas são

alternas, as flores são pequenas e andróginas ou ainda unissexuadas. As sementes

livres ou aderentes e frutos envoltos totalmente, ou em parte, pelo cálice.

20

O gênero é abundante nos trópicos e regiões adjacentes especialmente na

América Tropical e África, onde pode ser encontrada uma grande variedade de

espécies com propriedades medicinais (GRASSI et al., 2013).

Investigações fitoquímicas sobre as espécies do gênero Chenopodium

revelaram grande variedade de compostos orgânicos sendo eles: terpenos,

esteroides, saponinas triterpênicas, flavonoides e alcaloides (KOKANOVA-

NEDIALKOVA; NEDIALKOV; NIKOLOV, 2009). Recentemente foi publicado um

estudo fitoquímico da planta conduzido por Song e colaboradores (2014) os quais

evidenciaram onze compostos e as suas estruturas, pela primeira vez, isolados a

partir da planta C. ambrosioides: campferol-3,7-di-O-alfa-L-ramnopiranosídeo,

patuletin, quercetina-7-O-alfa-L-ramnopiranosídeo, granofer cetona, 4-hidroxi-4-

metil-2-ciclo-hexen-1-ona, siringaresinol, benzil-beta-D-glucopiranósido,

dendranthemoside B, N-trans-feruloil tiramina, N-trans-feruloil 4'-O-metildopamina e

4-hidroxi-N-[2 (4-hidroxifenil) etil] benzamida.

Algumas espécies deste gênero possuem várias aplicações tradicionais, que

têm sido testadas frente a diferentes atividades farmacológicas (YADAV et al.,

2007). Dentre essas espécies podemos ressaltar:

� Chenopodium foliosum, é usada na forma de decocção para tratamento de

câncer através de sua capacidade citotóxica e suas partes aéreas foram

testadas como estimulante do sistema imune, através da ativação da

interleucina-2 (KOKANOVA-NEDIALKOVA et al., 2011; NEDIALKOV et al,

2012);

� Chenopodium quinoa, atualmente muito estudada, possui a semente dotada

de alto teor de proteínas e carboidratos apresentando valor nutricional com

qualidade superior a de muitos cereais, como o milho, aveia, trigo e arroz

(KULJANABHAGAVAD et al., 2008). As sementes têm sido usadas para a

prevenção de enfermidades crônicas como a osteoporose, atividade

cicatrizante, antimicrobiana e agem como imunomoduladoras. (MUJICA;

JACOBSEN, 2006; KULJANABHAGAVAD et al., 2008). As propriedades

farmacológicas como antioxidante (TANG et al., 2015), antineoplásica

(GAWLIK-DZIKI et al., 2013), hipoglicemiante (GRAF et al., 2014),

antinflamatória (YAO et al., 2014) e gastroprotetora (ZEVALLOS et al., 2014),

dentre outras, tem sido comprovadas.

21

� Chenopodium album, é uma erva daninha anual, o pó seco da planta foi

diluído e testado frente a diversos microrganismos apresentando atividade

antibacteriana (SINGH; DWEVEDI; DHAKRE, 2011), anti-helmíntica, laxativa,

antinociceptiva e antioxidante (YADAV et al., 2007). O extrato etanólico da

planta foi testado em leveduras e demonstrou conferir proteção a

determinadas formas de DNA, frente e ao contato com peróxido de

hidrogênio, um agente altamente nocivo para as mesmas (KORCAN et al.

2013).

� Chenopodium murale, conhecida pela alta concentração de ascaridol no

extrato de sua folha fresca e pela sua ação antioxidante e antibacteriana

frente a microrganismos como o Staphylococcus aureus (ABDEL-AZIZ et al.,

2014).

� Chenopodium formosanum, caracterizada por ser utilizada para a produção

de bioetanol, através de processos de hidrolise enzimática, sacarização e

fermentação (YANG et al., 2014), também já foi confirmado seu efeito

antioxidante (TSAI et al., 2010).

3.3 Estudos sobre Chenopodium ambrosioides

C. ambrosioides L., (Figura 1) apresenta sinônimos como C. abovatum Moq.,

C. ambrosioides var. typicum Speg., Ambrina spathulata Moq., Blitum ambrosioides

(L). Ela é conhecida popularmente como “Erva de Santa Maria”, “Mastruço”,

“Ambrosina”, “Mastruz”, “Erva-de-Bicho”, “Mestruz” ou “Erva-do- Formigueiro”, sendo

muito empregada na medicina caseira na região centro oeste, sul e sudeste do

Brasil (BLANCKAERT et al., 2007).

É uma planta originária da América Central e do Sul, ocorre em todos os

países tropicais e temperados de forma silvestre ou cultivados sendo também

considerada com planta invasora (LORENZI; MATOS, 2002). É reconhecida pela

Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS), como

uma das 71 espécies ou gêneros, tradicionalmente utilizados no Brasil, sendo

possivelmente utilizado como planta medicinal em diversas regiões brasileiras

(VERISSIMO et al., 2011).

Lorenzi e Matos (2002) descreveram-na botanicamente como planta perene

ou anual, muito ramificada, podendo atingir até 1 m de altura. Possui folhas simples,

22

alternadas, pecioladas, de tamanho diferente, sendo menores e mais finas nas

extremidades superiores. As flores são pequenas, verdes, dispostas em espigas

axilares densas. Os frutos são muito pequenos e do tipo aquênio, esféricos, pretos,

ricos em óleo e muito numerosos, geralmente confundidos com sementes. Toda a

planta tem um odor forte e característico o qual é decorrente de alta concentração

de óleos essenciais (LORENZI; MATOS, 2002), com maior teor nas sementes, que

apresentam um alto grau de dormência e um baixo poder germinativo (MARTINS;

SILVA; ALMASSY JÚNIOR, 2010).

A população brasileira utiliza C.ambrosioides na forma de chás, infusões ou

xaropes, no tratamento de afecções pulmonares e distúrbios intestinais

(CHEVALLIER, 1996), hemorroidas (MASUCCI, 1992), infecções fúngicas e

helmínticas (KAMEL; EL-EMAM; MAHMOUD, 2011; MONZOTE et al., 2014), úlceras

(ZHU et al., 2012), contusões, equimoses (LORENZI; MATOS, 2002),

gastroproteção (ZHU et al., 2012), hipotensão (ASSAIDI et al., 2014) e na resposta

imunológica (SHARMA; BALA; KUMAR, 2012). Entretanto, apesar da larga

utilização, alguns relatos de toxicidade têm sido encontrados, podendo causar

convulsão, vômito, dor de cabeça, vertigem (PEREIRA et al., 2010) e

hepatotoxicidade (DERRAJI et al., 2014), quando utilizada por tempo mais

prolongado.

Figura 1: (A) Partes aéreas da C. ambrosioides (GRASSI et al., 2013). (B) Detalhamento da folha da C. ambrosioides (CARVALHO, 2013).

23

A composição química do óleo essencial de C. ambrosioides difere de acordo

com o cultivo e preparação do material, sempre variando nas concentrações dos

mesmos componentes. Cavalli e colaboradores (2004) identificaram no óleo de C.

ambrosioides: ascaridol (41.8%), isoascaridol (18.1%), p-cimeno, α-terpineno e

limoneno. Jardim e colaboradores (2008), através de análises de cromatografia

gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM), identificaram treze

compostos, sendo os quatro mais importantes: (Z)-ascaridol (61,4%), (E)-ascaridol

(18,6%), carvacrol (3,9%) e ρ-cimeno (2%).

Degenhardt e colaboradores (2013) estudaram o efeito citotóxico do extrato

etanólico e óleo essencial de C. ambrosioides em células tumorais, mesmo óleo

testado no presente estudo, demonstrando um potencial antitumoral em linhagens

de células K562 e RAJI.

Grassi e colaboradores (2013) estudaram o efeito antiinflamatório, cicatrizante

e antinoceptivo do extrato bruto C. ambrosioides e isolaram dois monoterpenos:

ascaridol (0,089%, em relação à planta seca); e 1,2,3,4-tetrahidroxi-p-mentano

(0,045%, em relação a planta seca).

A síntese enzimática do dieno α-terpineno, resulta na biossíntese do z-

ascaridol. Este é encontrado em maior concentração na espécie C. ambrosioides,

sugerindo esta via como a principal para obtenção do ascaridol. O componente p-

cimeno origina-se da reação do γ-terpineno, este, pouco encontrado na espécie

(DEMBITSKY; SHKROB; HANUS, 2008). A biossíntese das formas do ascaridol

presentes no gênero Chenopodium, encontra-se descrito na Figura 2.

Vários autores verificaram que os ascaridois são os principais compostos

responsáveis por propriedades antiparasitárias da planta (tanto do óleo quanto do

extrato) destacando-se seu efeito contra a leishmaniose (DE QUEIROZ et al., 2014;

SONG et al., 2014). Em altas doses o ascaridol pode causar diversos efeitos

adversos, os quais são relacionados ao abuso no uso medicinal da planta C.

ambrosioides (RUFFA et al., 2002).

24

Figura 2: Mecanismo de formação de Ascaridol e outros monoterpenos no gênero Chenopodium (DEMBITSKY, SHKROB, HANUS, 2008).

3.4 Óleos essenciais e a composição de terpenos

A International Standard Organization (ISO) define óleos essenciais como

produtos obtidos de partes de plantas através de destilação por arraste a vapor ou

pela expressão dos pericarpos de frutos cítricos. A mesma define que os óleos

essenciais são matéria-prima para produtos de higiene, para a indústria de

alimentos, indústria química, farmacêutica, para perfumaria e cosméticos, que hoje

ocupam 15 % do mercado desta área, no Brasil (AHBIPEC, 2012).

Essas substâncias orgânicas, que hoje representam números expressivos

para a indústria de produtos naturais, são consideradas a “alma” da planta e são os

principais componentes bioquímicos responsáveis pela ação terapêutica das plantas

medicinais, principalmente aquelas que são aromáticas. As suas propriedades físico-

químicas, como por exemplo, a aparência oleosa à temperatura ambiente é o que dá

a designação de óleo, uma mistura complexa de substâncias, lipofílicas e

25

geralmente odoríferas, porém com a principal característica de alta volatilidade,

diferente de óleos fixos oriundos de sementes (SIMÕES et al., 2003).

A importância da maioria dos metabólitos secundários vegetais (componentes

de óleos essenciais) era desconhecida por muitos anos e foram considerados

produtos sem função, meramente resultantes do metabolismo comum da planta, já

que os metabolitos primários (lipídios, proteídeos e glicídios), detinham a definição

de serem essenciais para a vida e para a manutenção das funções vitais das

espécies vegetais. Porém, químicos orgânicos passaram a ter interesse nas vias da

biossíntese, à custa de energia, as quais originavam micro moléculas de estruturas

complexas, biologicamente ativas e de baixo peso molecular, conhecidas como

metabólitos secundários e, que eram encontradas em concentrações relativamente

baixas em determinadas plantas. Primeiramente, para essas moléculas foram

desenvolvidos ensaios com o propósito de produzir venenos, aromatizantes e

materiais industriais (TAIZ; ZEIGER, 2004) e posteriormente, no século XX, esses

compostos passaram a ser utilizados com matéria-prima de medicamentos e

cosméticos (VANISREE; HSIN-SHENG, 2007).

Várias espécies de plantas são utilizadas para extração de óleos essenciais,

os quais se encontram concentrados em certos órgãos vegetais, tais como nas

flores, folhas ou ainda nas cascas dos caules, madeira, raízes, rizomas, frutos ou

sementes, variando segundo a localização (SIMÕES et al., 2003). Por exemplo:

Citrus sinensis L., Mentha arvensis L., Eucalyptus globulus L., Citrus limon L.,

Syzygium aromaticum L., são comercializadas mundialmente pelos aromas de

laranja, menta, eucalipto, limão e cravo-da-índia, respectivamente, graças à

característica volátil das mesmas (BIZZO et al., 2009). O conhecimento terapêutico

vem de encontro e novas caracterizações e técnicas utilizadas atualmente, que

possibilitam a determinação especializada de um maior número de substâncias.

Os óleos essenciais são constituídos principalmente de hidrocarbonetos como

os monoterpenos, sesquiterpenos, fenilpropanóides, e compostos oxigenados como

os ésteres, álcoois, aldeídos, cetonas, lactonas, fenóis entre outras substâncias de

baixo peso molecular, tendo os terpenos como maioria. As diversas substâncias

desta classe são, em geral, insolúveis em água e sintetizadas a partir do Acetil-CoA

ou de intermediários glicolíticos (SOUZA et.al., 2010).

Estudos demonstram a possibilidade da utilização dos constituintes dos óleos

essenciais como analgésicos, pela composição rica em terpenos como o isopreno e

26

o linalool (SOUZA, 2011), espasmolíticos (PULTRINI; GALINDO; COSTA, 2006),

anticonvulsivante (ALMEIDA; MOTTA; LEITE, 2003), antidepressivo (COSTA et al.

2011) e ansiolítico (LIS-BALCHIN; HART, 1999). O efeito analgésico é encontrado

adjuvante aos efeitos antioxidantes e antiinflamatórios em determinado óleos

essenciais (QUEIROZ et al., 2014), assim como, de maneira selecionada, o efeito

ansiolítico encontra-se relacionado à presença de determinados monoterpenos

(MOREIRA et al., 2014) em ensaios com o óleo testado por via oral ou por inalação

(CHIOCA et al., 2013).

A capacidade hipoglicemiante e antidiabética de determinados óleos

essenciais, pela regulação de receptores de lipoproteínas vem sendo estudada

(JOO et al., 2013). A versatilidade que determinadas espécies vegetais apresentam,

permitindo a análise de seus componentes por administração do óleo essencial,

extrato e infusão, avança na elucidação dos efeitos adversos e tóxicos dos

preparados. Em ensaios controlados foi demonstrado que os óleos essenciais,

apesar de demonstrarem eficiência na regulação da glicemia, pelos princípios ativos

hipoglicemiantes, não apresentam efeitos tóxicos, como no extrato e infusão da

mesma planta (ANAYA-EUGENIO et al., 2014).

O tratamento empírico de doenças infeciosas e inflamatórias, margeava

apenas o uso popular. Hoje, no entanto, encontramos comprovações científicas

referentes aos efeitos farmacológicos dos óleos essenciais para diversos fins, os

quais podem ser constatados pela inibição in vitro de fungos como Trichosporon

mucoides, Malassezia furfur, Candida albicans, Candida tropicalis e bactérias como

Staphylococcus aureus, Streptococcus sobrinus, Streptococcus mutans e

Escherichia coli (CHEN et al., 2014). Assim como infecções com Trypanosoma

evansi (BALDISSERA et al., 2014) e Haemonchus contortus (KATIKI et al. 2012).

Com a estimativa de que o Brasil possua mais de 50.000 espécies de plantas

superiores, produtoras de madeiras, celulose, fibras, alimentos e óleos essenciais,

percebe-se a possibilidade de novas descobertas dentro da gama de substâncias

aromatizantes já documentadas e de tantas outras que ainda não foram elucidadas

e/ou avaliadas cientificamente.

27

3.5 Plantas que atuam no Sistema Nervoso Central

Várias são as desordens que acometem o SNC, segundo a Organização

Mundial da Saúde (OMS), mais de 450 milhões de pessoas são acometidas por

alguma dessas desordens, dentre elas as neuropsiquiátricas e as

neurodegenerativas. Fazem parte das primeiras a ansiedade, a depressão, a

esquizofrenia, a epilepsia, os distúrbios de sono dentre outras (ISAAC; LARSON,

2014). No segundo grupo encontramos principalmente a Doença de Alzheimer e a

Doença de Parkinson, dentre outras (SILVA et al, 2007; SWART et al., 2014).

A hipótese de que as plantas poderiam ter efeitos sobre o SNC tem origem

histórica e remontam das observações do uso das mesmas em rituais religiosos,

durante os quais a percepção e o comportamento das pessoas poderiam sofrer

alterações com o uso de determinadas espécies (DOS SANTOS, 2013). No Brasil,

especificamente, as comunidades indígenas usam diversas plantas nesse sentido

(NEVADO et al., 2010).

O habito do uso de plantas medicinais com propriedades psicoativas também

é um dos legados deixados por nossos colonizadores europeus e cada vez mais se

tem investigado a composição química de algumas delas, a fim de elucidar o efeito

no SNC (MARQUES et al., 2013). Algumas espécies de plantas da família

Solanaceae, por exemplo, são fontes de alcaloides tropânicos, com importantes

ações farmacológicas. Na Europa da Idade Média e do Renascimento, os cultos

praticados por feiticeiras e mágicos estavam intimamente ligados ao consumo de

beladona (Atropa belladona), meimendro (Hyosciamus niger) e mandrágora

(Mandragora officinarum) (HOSTETTMANN; QUEIROZ; VIEIRA et al., 2013).

3.5.1 Plantas medicinais com propriedades ansiolíticas

De acordo com o manual diagnóstico e estatístico de doenças mentais (DSM-

V) a ansiedade é um estado emocional, com componentes psicológicos e

fisiológicos, naturalmente encontrado na existência humana, geralmente é uma

reação normal a uma situação de desconforto e estresse (MACKENZIE et al., 2011).

Fisiologicamente, está relacionada à antecipação de um evento esperado, ou às

vezes, inesperado. Confunde-se eventualmente a ansiedade com o medo, que se

manifesta quando existe a presença de um perigo real, na falta do mesmo sente-se

28

ansiedade, que é a antecipação do medo de estar exposto a este perigo (HAN et

al.,2007).

A ansiedade pode passar de uma ocorrência normal para um quadro

patológico quando é desproporcional a circunstância que a causa, ou quando não

existe um motivo aparente para a sua instalação (HAN et al., 2007). Farb e Ratner

(2014) reportam que os mesmos circuitos neurológicos envolvidos na ansiedade

patológica estão relacionados a outras patologias do SNC e é provável que

acometam o paciente concomitantemente (FARB; RATNER, 2014).

Os benzodiazepínicos (BDZ) continuam sendo os medicamentos mais

prescritos para o tratamento da ansiedade patológica (SIRDIFIELD et al., 2013). São

considerados fármacos seguros quando comparados aos barbitúricos, os fármacos

de escolha até a década de 60. Seu mecanismo de ação se dá através da mudança

alostérica no receptor GABAA promovendo um aumento da afinidade do

neurotransmissor ácido γ-aminobutírico (GABA), pelo seu sítio ativo no receptor

(UZUN et al., 2010). Nos últimos 45 anos os BDZs foram os fármacos psicoativos

mais estudados, sendo um dos motivos para esses estudos as reações adversas

como sedação, dependência, amnesia anterógrada e tolerância em alguns casos

(CUNNINGHAM; HANLEY; MORGAN, 2010; HOOD et al., 2014).

Estudos recentes apontam para o efeito positivo da utilização de inibidores

seletivos de recaptação de serotonina para o tratamento de tais desordens, e que, o

aumento nos níveis de serotonina pode modular o sinal neuroquímico que desloca o

sistema nervoso para estados de ansiedade (TSAPAKIS et al., 2012; FITZGERALD;

BRONSTEIN, 2013). É considerável o número de evidências de que a fisiopatologia

da ansiedade está relacionada a neurotransmissores como serotonina (5-HT),

norepinefrina (NOR) e dopamina (DA) (LEGOABE et al., 2011).

As desordens de ansiedade são a classe mais prevalente das doenças

psiquiátricas no mundo (KESSLER et al., 2010). Estimativas feitas pela OMS

indicam que 0,1 a 16,9% das pessoas no mundo sofrem com algum tipo de distúrbio

de ansiedade e/ou depressão (ADAMS; GMÜNDER; HAMBURGUER, 2007). A alta

incidência desta patologia e o alto nível de possíveis reações adversas sugerem

cada vez mais investigações de compostos naturais para o tratamento e controle

dos sistemas envolvidos.

Bowdichia virgilioides K., mais comumente utilizada na medicina popular

como antiinflamatório, atua como ansiolítico, pela presença de triterpenos, alcalóides

29

e flavonoides em sua composição, sem comprometer a capacidade motora de

camundongos testados no labirinto em cruz elevada (LCE) e posteriormente no teste

de campo aberto (VIEIRA et al., 2013). Possivelmente pela composição química da

planta, ocorra modulação serotoninérgica e alteração da transmissão GABAérgica

no sistema nervoso (GIRISH et al., 2013), assim como na Gastrodia elata (JUNG et

al., 2006), na Pluchea sagittalis (RODRIGUES, 2011) e na Cecropia glazioui

(ROCHA; LAPA; LIMA, 2002), plantas de composição semelhante.

Os monoterpenos da Myrtus communis L., são os fitoconstituintes que

conferem o efeito ansiolítico da mesma, destacado através de modelos animais LCE

e caixa claro-escuro (MOREIRA et al., 2014). Outros constituintes como linalol,

quercetina e ácido cafeico, promissores agentes com potencial ansiolítico (KUMAR

et al., 2011), foram isolados da Angelica archangelica L., com o efeito comprovado

através de modelos animais (KUMAR et al., 2013). Sinnathambi e colaboradores

(2013) comprovaram o envolvimento do sistema dopaminérgico no estado de

ansiedade, através de testes comportamentais utilizando o extrato etanólico de

Alstonia scholaris L., a qual demonstrou alta eficácia ansiolítica e capacidade de

aumentar os níveis de dopamina no cérebro.

Os quadros de ansiedade podem ser revertidos pelo uso de Curcuma longa,

que atua promovendo aumento das concentrações de serotonina nos sistemas

neuronais de estruturas límbicas (BENAMMI et al., 2014).

3.5.2 Plantas medicinais com propriedades hipnóticas

Sofrer de insônia, um dos distúrbios do sono, tornou-se uma queixa comum

da população mundial e mais particularmente, na brasileira. Cerca de 10-15% das

pessoas adultas sofrem de insônia crônica e adicionalmente de 25-35%, sofrem de

uma insônia transitória (SOMMER et al., 2014). A incidência é tanta que essa

patologia, já considerada a doença da população ocidental, geralmente está ligada a

condições externas e internas como estresse, depressão e processos dolorosos

intensos (ASPLUND, 2012; ROTH; ROEHRS, 2013).

Várias são as hipóteses que circundam o estado fisiopatológico do individuo

com quadros de insônia. Um dos mais aceitos é a “hipervigilância” oriunda da

exacerbação do sistema neuroendócrino, ligada a anormalidades do ritmo circadiano

(envolvendo genes regulatórios), a secreção de melatonina (LAUDON; FRYDMAN-

30

MAROM, 2014) e receptores de adenosina (CARÚS-CADAVIECO; DE ANDRÉS,

2012) assim como irregularidades na transmissão GABAérgica, alta concentração

de cortisol e na secreção de neurotransmissores excitatórios com glutamato e

aspartato (ROTH; ROEHRS; PIES, 2007; PORKKA-HEISKANEN; ZITTING;

WIGREN, 2013) por esse motivo, os tratamentos farmacológicos convencionais para

insônia incluem benzodiazepínicos, agonistas dos receptores GABAA,

antidepressivos, como os antagonistas dos receptores 5-HT2 e anti-histamínicos

(BORJA; DANIEL, 2006).

A insônia e a ansiedade estão diretamente ligadas à modulação da via do

GABA, não obstante quadros de ansiedade podem desencadear insônia por

estresse, e o tratamento é de forma concomitante, para as duas patologias, já que

compartilham vias comuns de regulação neurológica. Devido a isso, várias são as

plantas que apresentam esse efeito dúbio sobre o SNC, como Zizyphus jujuba e

Valeriana officinalis, utilizadas na cultura popular como soníferos, mas também

usados para o tratamento de ansiedade, assim como Scutellaria lateriflora, Withania

somnifera, Passiflora spp., Piper methysticum, Matricaria recutita, Eschscholzia

californica (SARRIS et al., 2011).

Em um estudo desenvolvido por Cho e colaboradores (2010), foram testadas

15 plantas asiáticas, destacando-se Glycyrrhiza uralensis e Albizzia julibrissin,

comumente utilizadas no tratamento popular de insônia, cujo mecanismo parece

ocorrer através da ativação do receptor GABAA, e a ligação com os receptores 5-

HT2c. Os extratos aquosos demonstraram perda do efeito ansiolítico com a dose de

10mg/ml de Flumazenil. O sono induzido por barbitúrico é um teste muito utilizado

para a avaliação comportamental da insônia, através do cálculo da latência do sono

(LS) e também do tempo total de sono, estes, alterados com a utilização de diversas

plantas, com o óleo essencial de Dennettia tripetala (OYEMITAN et al., 2013),

Eucommia ulmoides (LI et al. 2014), Matricaria chamomilla (SHINOMIYA et al.,

2005), Actinidia deliciosa e Actinidia chinensis (YANG et al., 2013), Valeriana

officinalis , Valeriana prionophila, dentre outras (DEY; DEY, 2013)

3.5.3 Plantas medicinais com propriedades antidepressivas

As desordens depressivas atingem, cerca de 350 milhões de pessoas em

todo o mundo e, estima-se que até o ano de 2020, a depressão se tornará a

31

segunda doença com maior aumento na morbidade, após as doenças

cardiovasculares (WHO, 2012).

A fisiopatologia da doença é complexa, e parece ser desencadeada por um

número expressivo fatores biológicos. Nos últimos anos a principal premissa sobre a

doença foi a de uma disfunção na expressão de monoaminas e seus receptores, ou

de segundos mensageiros oriundos da cascata bioquímica derivada da ativação dos

receptores (SARRIS et al., 2011). Porém, hoje já se é conhecido que anormalidades

neuroendócrinas como o excesso de cortisol, a disfunção dos opióides endógenos e

as mudanças na transmissão Glutamatérgica e GABAérgica, podem ser

acrescentadas como causas da depressão (MILLER; HEN, 2014; SINGH; GOTILIB,

2014).

O aumento do nível de serotonina, pela diminuição de sua recaptação, leva a

melhorias no estado depressivo do paciente, assim como a diminuição dos níveis e

da atividade da enzima monoamina oxidase (MAO-A), a qual diminui a quantidade

de monoaminas, melhora o estado do paciente deprimido.

A fitoterapia também é feita na terapêutica da depressão. Várias plantas

utilizadas na medicina popular têm a capacidade de melhorar sensivelmente os

quadros depressivos leves como, por exemplo, Hypericum perforatum (CHANG;

WANG, 2010) e outras espécies de Hypericum (CCANA-CCAPATINTA et al., 2014),

Rhodiola rosea (MATTIOLI; FUNARI; PERFUMI, 2009) e Crocus sativusinibir

(HOSSEINZADEH; NORAEI, 2009). Os estudos atuais sugerem que tais plantas,

quando atuam inibem a recaptação de monoaminas, aumentam a ligação aos

receptores de serotonina e inibem a ação da MAO-A (SAABY; RASMUSSEN;

JÄGER, 2009).

Jäger e colaboradores (2013) demonstraram a ação antidepressiva de

diversas plantas, através da análise de afinidade com o transportador de serotonina

e a capacidade de inibição da MAO-A. Borago officinalis, uma planta rica em

alcalóides pirrolizidínicos e ácidos graxos insaturados, foi uma das plantas com

efetividade. Nesse mesmo estudo, no ensaio de inibição da enzima MAO-A, os

extratos mais ativos foram obtidos de sementes de Trigonella foenum-graecum e

folhas de Apium graveolens e das partes aéreas de Calluna vulgaris.

A Cecropia glaziovii, popularmente conhecida como Embaúba e encontrada

facilmente na costa de sudeste brasileira, contém como fitoconstituintes catequinas,

procianidinas e flavonoides, compostos estes possivelmente responsáveis pelo

32

efeito antidepressivo da planta (TANAE et al., 2007). Kielmeyera coriacea,

popularmente conhecida como “pau-santo”, é empregada na medicina popular

brasileira como um remédio antidepressivo. Sua ação se deve possivelmente em

função das xantonas as quais constituem os compostos majoritários (ZAGOTO et al.,

2006).

Pela diversidade de mecanismos que envolvem o tratamento da depressão,

encontramos plantas como: Canavalia brasiliensis, que tem seu mecanismo

direcionado para os receptores Glutamatérgicos-NMDA, redução de Óxido Nítrico

(NO) e a síntese de GMP-cíclico (RIEGER et al., 2014); Nelumbo nucifera, que em

sua composição possui substâncias que assemelham-se aos antidepressivos típicos

antagonizando receptores serotoninérgicos 5-HT1A (SUGIMOTO et al., 2010); e

Apocynum venetum, que através de seus flavonoides tem seu efeito antidepressivo

anulado com a administração de antagonistas como sulpirida e SCH23390

(antagonistas D1 e D2, respectivamente), demonstrando um mecanismo de ação

ligado a via dopaminérgica de transmissão (ZHENG et al., 2013).

3.5.4 Plantas medicinais com propriedades anticonvulsivantes

A Epilepsia é a condição neurológica mais comum no mundo, mais de

cinquenta milhões de pessoas sofrem dessa doença e oitenta por cento dos

pacientes estão vivendo nos países desenvolvidos, onde, 3/4 dos pacientes não

estão recebendo tratamento adequado (WHO, 2012).

Essa patologia neuropsiquiátrica é caracterizada por uma predisposição

persistente a gerar crises epilépticas e desequilíbrio no centro de atividade elétrica

do cérebro, comumente correlacionada com a perda de consciência ou memória

(DETYNIECKI; BLUMENFELD, 2014).

A falta de tratamento de quadros de epilepsia pode levar o indivíduo uma

diminuição progressiva da função cognitiva, danos cerebrais e outros défices

neurológicos. O tratamento mais eficaz para quadros de epilepsia são obtidos com

fármacos antiepilépticos, porém, quase todas as drogas usadas atualmente têm

significativos défices de segurança (PERUCCA; MULA, 2012). Diante disso, muitos

neurocientistas não medem esforços para descoberta de novos tratamentos, viáveis

e seguros para o paciente.

33

A base da fisiopatologia da doença está relacionada com a atividade elétrica

descontrolada no SNC, que pode ocorrer pela redução da via de neurotransmissão

inibitória (através do neurotransmissor GABA, principalmente), aumento da via de

transmissão excitatória (através do neurotransmissor Glutamato, principalmente, ou

alterações iônicas de condutância através das membranas neuronais (OBNISKA et

al., 2010).

Além das vias clássicas de inibição e excitação neuronal, o sistema

serotoninérgico também modula uma variedade de tipos de epilepsia, através dos

receptores 5-HT1A, 5-HT2C, 5-HT7, mais relacionados com o aumento do limiar

convulsivo e com a inibição de descargas elétricas no hipocampo (MARLET et al.,

2004; OBNISKA et al., 2006). Diante disso, vários compostos são estudados para

essa função de modulação (SAPA et al., 2014).

Várias plantas já foram documentadas com propriedades anticonvulsivantes.

Essas espécies podem servir como fontes de medicamentos eficazes, mais

acessíveis e baratos, melhorando o estado atual do tratamento dessa patologia

(KUMAR; BHAT; KUMAR, 2012).

Acorus calamus, além de ter seu óleo essencial bastante empregado no

tratamento de infecções fúngicas e bacterianas, tem ação anticonvulsivante

aumentando a latência de camundongos para a convulsão, após a administração de

um agente convulsivo, o pentilenotetrazol (PTZ) (JAYARAMAN; ANITHA; JOSHI,

2010). O mesmo método foi utilizado para avaliar ação anticonvulsiva de Ziziyphus

nummularia (GOYAL; SASMAL, 2013). Gladiolus dalenii, uma planta medicinal

comumente utilizada na África, nos modelos de convulsão induzida eletricamente

(“eletrochoque”) e convulsão induzida PTZ, protegeu 100% e 83,3% dos

camundongos, respectivamente testados (NGOUPAYE et al., 2013). Bacopa

monnieri, possui efeito muito semelhante à fenitoína, droga antiepilética padrão,

induziu melhora significativa em todas as fases da convulsão (GIRAMKAR et al.,

2013). Paederia scandens, através do ácido paredeosídico, teve efeito

anticonvulsivo comprovado, resultando no aumento da concentração do ácido gama-

aminobutírico (GABA), no cérebro dos animais testados e diminuição do ácido

glutâmico (Glutamato), o qual foi evidenciado através da técnica de Western Blot

(YANG et al., 2013).

A ação anticonvulsiva mediada pelo GABA, é mecanismo de ação de outras

plantas como a Sutherlandia frutescens (OJEWOLE, 2008) e Morus alba (GUPTA et

34

al., 2014), demonstrando que o aumento nos níveis desse neurotransmissor, pode,

de maneira eficaz proteger o cérebro de crises convulsivas assim como através do

bloqueio direto de canais de cálcio (GILANI et al., 2000).

O canabidiol, um fitocanabinóide extraido da Cannabis, demonstra efeito

protetor nos testes de eletro-choque e na administração do PTZ, mediado pelos

canais de potássio (SHIRAZI-ZAND et al., 2013). Coletivamente vários estudos

comprovam uma modulação terapêutica eficaz da epilepsia, através do sistema

endocanabinóide (HOFMANN; FRAZIER, 2013).

35

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Material vegetal

C. ambrosioides foi coletada no município de Cáceres, estado de Mato Grosso,

Brasil, em março de 2010. A espécie foi identificada pelo botânico M. SC. Oscar

Benigno Iza e uma exsicata de nº HBR 52802 encontra-se depositada no Herbário

Barbosa Rodrigues, Itajaí, SC.

4.2 Extração do óleo essencial

A extração e identificação do óleo essencial foram realizadas pela aluna Ruth

T. Degenhardt em seu trabalho de conclusão de curso sob a orientação da Prof.

Angela Malheiros conforme descrito abaixo.

Para a obtenção do óleo essencial foi utilizado o método por arraste de vapor

de água pelo método de hidro destilação com aparato de Clevenger. O óleo

essencial obtido foi denominado OECA com rendimento de 1,15% (Figura 3).

Figura 3: (A) Óleo essencial de C. ambrosioides; (B) Partes aéreas da C. ambrosioides (GRASSI et al., 2013).

O óleo essencial obtido das folhas secas de C. ambrosioides foi analisado por

cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (CG-FID) e por

cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM Shimadzu,

QP2010 S). A análise realizada por CG-FID, com coluna capilar Rtx-1 (30 m x 0,25

mm x 0,10 µm), teve o gás Helio como carreador (0,8 mL/min); temperatura do

injetor: 180 ºC e interface: 250 ºC, Split: 1:50, no programa de temperatura: 80 °C

36

(80 ºC até 200 ºC em 20 ºC/min; 200 ºC até 300 ºC em 15 ºC/min; 300 ºC até 310 ºC

em 12 ºC/min); FID (310 ºC) H2: 40 mL/min.

O óleo essencial foi também analisado por CG/EM, com temperatura do

injetor de 250ºC; programa de temperatura de 80 ºC até 200 ºC em 20 ºC/min; 200

ºC até 300 ºC em 15 ºC/min; tendo as demais condições iguais às do CG-FID. A

identificação da composição química do óleo essencial e das frações foi realizada

pela comparação dos espectros de massas obtidos com os dados da biblioteca

disponível no aparelho (versão NIST 8.0).

O óleo essencial apresentou dois compostos majoritários, com tempos de

retenção de 3,614 e 5,064 minutos. Os compostos foram identificados como: 1-

isopropil-4-metil-benzeno (p-Cimeno) (42,32%) e 1-isopropil-4-metil-2,3-

dioxabiciclo[2.2.2]oct-5-eno (ascaridol) (49,77%) (Figura 4), respectivamente

(Degenhardt, 2014).

Figura 4: (A) Cromatograma obtido por CG-FID (180ºC) do óleo essencial de Chenopodium ambrosioides (OECA); (B) Estrutura dos compostos majoritários presentes no óleo essencial (DEGENHARDT, 2013). (A)

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

uV (x1,000,000)

Chromatogram

(B)

O

O

Ascaridol p-Cimeno

5,0

64

3,6

14

37

4.3 Ensaios Farmacológicos:

4.3.1 Animais:

Para os experimentos foram utilizados camundongos Swiss machos (25 a

30g), oriundos do Biotério Central da Univali. Os animais foram mantidos no biotério

setorial em caixas com maravalha, com no máximo 20 animais/caixa com ciclo

claro/escuro de 12 horas, aclimatados a temperatura de 22 +/- 2 ºC e tratados com

água e ração ad libitum, exceto durante os experimentos. As caixas foram trocadas

em dias alternados pelo técnico responsável conforme rotina interna do biotério. Os

animais permaneceram no biotério por no máximo 3 dias. Durante os experimentos,

os mesmos foram conduzidos para a sala experimental e permaneceram em

ambientação por um período mínimo de uma hora. Após os experimentos os animais

foram eutanaziados pela equipe responsável, com CO2 (conforme prática local da

instituição) e as carcaças foram descartadas em sacos de lixo hospitalar, para futuro

processo de incineração, também conforme pratica local. Os protocolos foram

submetidos ao comitê de Ética para uso de animais (CEUA) na UNIVALI sendo

aprovado com parecer número 014/13.

4.3.2 Drogas e tratamentos:

Nos ensaios farmacológicos foram utilizadas as seguintes drogas e

reagentes: A imipramina, pentilenotetrazol, pentobarbital, prazosina, ioimbina,

haloperidol, SCH2390 (R(+)-7-Cloro-8-hidroxi-3-metil-1-phenil-2,3,4,5-tetrahidro-1H-

3-benzazepino hidrocloreto), pindolol, metoclopramida, NAN-190 (1-(2-Metoxifenil)-4-

[4-(2-ftalimido) butil] piperazine hidrobrometo), quetanserina, pimozide e bicuculina,

baclofeno, foram obtidos de Sigma Chem. Co. (St. Louis , EUA); e, Flumazenil,

diazepam e ondansetrona de Cristália Prod. Química Farm. Ltda , São Paulo, Brasil.

As doses utilizadas foram baseadas em artigos científicos do grupo de pesquisa

(TOLARDO et al., 2010).

O óleo essencial de C. ambrosioides, foi dissolvido em DMSO e

administradas v.o. pelo método de gavagem, 60 minutos antes dos testes. As outras

drogas foram dissolvidas em solução salina isotônica (NaCl a 0,9%), imediatamente

antes da aplicação, exceto o flumazenil que foi dissolvido em solução de 10% de

38

Twen 80. As drogas foram aplicadas por via intraperitoneal (i.p.), 30 minutos antes

dos testes. O veiculo utilizado como controle negativo é o mesmo meio no qual foi

dissolvido o óleo essencial.

4.3.3 Grupos experimentais:

Para os experimentos comportamentais os animais foram divididos em 5

grupos 3 deles tiveram o tratamento com o óleo essencial da planta nas doses de

50mg/kg, 100mg/kg e 150mg/Kg (ARAÚJO et al., 2005; TOLARDO et al., 2010).

Para a análise do mecanismo de ação os animais foram divididos de acordo com o

número de antagonistas utilizados. O N por grupo experimental foi de 10 animais.

Todas as administrações dos tratamentos e/ou controles negativos foram feitas uma

única vez por via oral (v.o.), os antagonistas e controles positivos foram

administrados por via intraperitoneal (i.p.), de uma única vez. Os tratamentos foram

solubilizados e um volume de 0.10mL/peso corporal para serem administrados nos

animais.

4.3.4 Ensaios farmacológicos

4.3.4.1 Avaliação do efeito do OECA sobre o sistema motor e depressor

através do teste de campo aberto (TCA) e Rota rod:

O aparato utilizado para os experimentos com camundongos foi

confeccionado em madeira (30 x 30 x 15 cm) com a frente de vidro para melhor

visualizar os animais. O interior do aparato foi subdividido em 9 quadrantes. Neste

modelo, dois grupos foram testados como controle: positivo (haloperidol 2,5 mg/kg),

e negativo (veículo). O OECA (50, 100 e 150 mg/Kg) bem como o controle negativo

foram administrados por via oral, 60 minutos antes do experimento. Os testes

avaliaram os efeitos inespecíficos sobre o SNC, sobretudo sobre o sistema motor

dos animais. Foram observados os seguintes parâmetros: número de cruzamentos

dos quadrantes (crossing) e número de atividades exploratórias caracterizadas por

tentativas de levantar o corpo, apoiando-se sobre as patas traseiras (rearings)

conforme descrito por OLIVEIRA et al. (2006). O tempo de observação foi de 6

minutos (Figura 5).

39

O aparato utilizado para o teste do Rotarod consiste em uma barra de 2,5cm

de diâmetro, subdividida em quatro compartimentos por discos de 25cm de

diâmetro. A barra gira a uma velocidade constante de 12 rotações por minuto (rpm).

Os animais foram colocados no aparato e treinados com intervalos de 60 segundos,

durante três tentativas, os que não conseguiram se manter na barra por esse tempo

foram descartados. Após 24 horas os animais foram divididos em grupos e tratados

com OECA (50, 100, 150 mg/kg) e controle negativo (veículo) (Figura 6), após foram

levados ao aparato e foi observado o tempo de permanência na barra (em

segundos) e o número de quedas dos animais (TOLARDO et al., 2008).

Figura 5: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a deambulação dos animais através do TCA.

40

Figura 6: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre o sistema motor de animais através do Rotarod.

4.3.4.2 Avaliação do efeito do OECA sobre a depressão através do modelo da

natação forçada (MNF):

Para a investigação do efeito antidepressivo utilizou-se o MNF. Os

experimentos foram realizados conforme descrito por Rodrigues et al. (2002). Dois

grupos de animais foram testados como controle: o positivo (imipramina 50 mg/kg,

i.p.), e o negativo (veículo, v.o.). O OECA foi administrado oralmente, 60 minutos

antes dos testes. Após esse tempo, os animais foram colocados individualmente

num tanque de vidro (25 cm de altura e 10 cm de diâmetro), cheio com água a uma

temperatura de 24 a 25°C. Durante 6 minutos (Figura 7). Foi cronometrado o tempo

de imobilidade dos animais, o qual foi usado como parâmetro comportamental de

anedonia, comportamento este, que indica o estado de desesperança do animal

após perceber que a fuga do recipiente não será possível, o tempo de nado

41

(mobilidade) e de escalada (tentativa de escape) também foram parâmetros

avaliados no teste (SÁNCHEZ-MATEO et al., 2005).

Figura 7: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a depressão através do MNF.

4.3.4.3 Avaliação do efeito do OECA sobre o sono induzido por barbitúrico

(MSB):

Para investigação de um possível efeito hipnótico do OECA, foi utilizado o

MSB conforme descrito por Devi et al. (2003) com pequenas modificações. Como

controle positivo foi utilizado o diazepam (1mg/Kg, i.p.) e negativo, o veículo (v.o.).

Os animais receberam os tratamentos com o OECA nas concentrações de 50, 100 e

150 mg/Kg (v.o). Após 60 minutos, foi administrado pentobarbital (50 mg/Kg, i.p.).

Imediatamente os animais foram colocados individualmente sob funis de vidro

(Figura 8). A latência para o sono e o tempo total de sono foi cronometrado e

representado respectivamente pela perda e recuperação do reflexo postural (DEVI et

al., 2003; QUINTANS-JÚNIOR; ALMEIDA; ANTONIOLLI, 2005).

42

Figura 8: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre o MSB.

4.3.4.4 Avaliação do efeito do OECA sobre a convulsão induzida por

pentilenotetrazol (MCP):

O efeito anticonvulsivante do OECA foi avaliado através do antagonismo das

convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), conforme descrito por Kasture;

Kasture; Chopde (2002). Os animais receberam os tratamentos com o OECA nas

concentrações de 50, 100 e 150mg/Kg (v.o.), bem como, com os controles: positivo

(fenobarbital 0,5mg/Kg, i.p.) e negativo (veículo, v.o.). Transcorridos 60 minutos

após os tratamentos com OECA e controle negativo e 30 minutos após o tratamento

com o controle positivo, os animais receberam PTZ (100mg/Kg, v.o.). Imediatamente

após a aplicação do PTZ, os animais foram colocados sob funis de vidro e

observados num período de 60 minutos subsequentes (Figura 9), para verificação do

tempo de latência para primeira crise convulsiva (KASTURE; KASTURE; CHOPDE,

2002).

43

Figura 9: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a convulsão induzida por PTZ.

4.3.4.5 Avaliação do efeito do OECA sobre a ansiedade dos animais através do

modelo de labirinto em cruz elevado (LCE):

Para a avaliação do efeito ansiolítico do OECA, o modelo de ansiedade

utilizado foi o LCE, e os procedimentos foram feitos conforme descrito por Pellow et

al. (1985), com pequenas modificações. O aparato utilizado é constituído de

madeira, em forma de cruz grega, com dois braços abertos (30 x 5 x 2,5 cm), e dois

fechados (30 x 5 x 15 cm), os braços são conectados por uma área central aberta (5

x 5 cm). O aparato será elevado a uma altura de 50 cm sobre o chão

(EMAMGHOREISHI; KHASAKI; AAZAM, 2005). Dois grupos foram testados como

controle: positivo (diazepam 0,75 mg/kg, i.p.) e o controle negativo (veículo, v.o.). O

OECA, foi administrado por via oral, em três concentrações diferentes 50, 100 e 150

mg/Kg. Decorridos 60 minutos após a administração do OECA, os animais foram

colocados individualmente no centro do aparato com a cabeça voltada ao braço

44

fechado e observados durante 5 minutos (Figura 10). Durante esse tempo, foi

observado e registrado a frequência de entrada e o tempo de permanência nos

braços abertos (FEA e TPA, respectivamente), e nos fechados (FEF e TPF,

respectivamente). As entradas nos braços do aparato foram definidas quando o

animal esteve com todas as quatro patas no braço visitado.

Para análise estatística, as percentagens das frequências de entradas nos

braços abertos (%FEA) e tempo permanência nesses braços (%TPA) foram

calculados de acordo com as fórmulas: %FEA = FEA / FEA + FEF X 100 e %TPA =

TPA / TPA + TPF X 100, para a análise estatística nos braços fechados foram

seguidas da mesma maneira (SOUZA et al., 1998).

Figura 10: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a ansiedade através do LCE.

45

4.3.4.6 Determinação do mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do

OECA

Para avaliação do envolvimento de sistemas serotonérgico, adrenérgico e

dopaminérgico no mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do OECA, o

protocolo experimental foi delineado conforme mostrado na Figura 11, modificando

somente o antagonista específico conforme o sistema a ser estudado.

Figura 11: Esquema representativo da investigação do mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do OECA.

a) Avaliação do sistema GABAérgico sobre o efeito ansiolítico do OECA:

Para a avaliação do possível envolvimento do receptor dos benzodiazepínicos

no mecanismo de ação e propriedade ansiolítica do OECA, os animais foram pré-

tratados com Flumazenil (3 mg/Kg, i.p., antagonista GABAA/benzodiazepínico

específico) e após 15 minutos foram administrados em grupos diferentes: o

46

Diazepam (0,75mg/kg, i.p., Benzodiazepínico padrão), o Veículo e o OECA (50mg,

v.o.). Decorrido mais 30 (dos tratamentos i.p.) e 60 (dos tratamentos v.o) os animais

foram submetidos ao LCE.

Para avaliar o possível envolvimento dos receptores GABAA e GABAB os

animais foram pré-tratados com Baclofeno (2 mg/kg, i.p., antagonistas seletivo dos

receptores GABAB) e Bicuculina (1mg/kg, i.p., antagonista seletivo de receptores

GABAA), após 15 minutos, foi administrado o OECA (50mg/kg, v.o.) e veículo. Foram

aguardados 60 minutos para a observação no LCE. Avaliou-se o tempo de

permanência nos braços abertos e a frequência de entrada nos braços abertos.

b) Avaliação do sistema Serotoninérgico sobre o efeito ansiolítico do

OECA:

Para investigar o possível envolvimento de receptores serotonérgicos, no

efeito antidepressivo do OECA os animais foram pré-tratados com NAN-190 (0,3

mg/kg, i.p., antagonista dos receptores 5-HT1A), Quetanserina (5 mg/kg, i.p.,

antagonista seletivo dos receptores 5-HT2A/2C), Ondansetrona (0,3 mg, i.p.,

antagonista seletivo dos receptores 5-HT3), e Pindolol (10mg/kg, i.p., antagonista

seletivo dos receptores 5-HT1A/1B), após 15 minutos, foi administrado o OECA

(50mg/kg, v.o.), e aguardado 60 minutos para a observação dos efeitos no Labirinto

em Cruz Elevada. Neste modelo, foram analisados o tempo de permanência nos

braços abertos e a frequência de entrada nos braços abertos do aparato,

respectivamente (Figura 11).

c) Avaliação do sistema Dopaminérgico sobre o efeito ansiolítico do OECA:

Para a avaliação do possível envolvimento do sistema dopaminérgico, os

animais foram pré-tratados com Haloperidol (10µg/kg, i.p., antagonista

dopaminérgico não seletivo), Pimozide (0,5 mg/kg, i.p., antagonista seletivo de

receptores D2), SCH23390 (0,5mg/kg, i.p., antagonista seletivo de receptores D1) e

Metoclopramida (1mg/kg, i.p., antagonista seletivo de receptores 5-HT3/D1). Após 15

minutos, foi administrado o OECA (50mg/kg, v.o.), e aguardado 60 minutos para a

observação dos efeitos no Labirinto em Cruz Elevada. Foram analisados o tempo de

47

permanência nos braços abertos e a frequência de entrada nos braços abertos do

aparato (Figura 11).

d) Avaliação do sistema Adrenérgico sobre o efeito ansiolítico do OECA Para a avaliação do possível envolvimento do sistema adrenérgico, os

animais foram pré-tratados com Prasozina (1mg/Kg, i.p., antagonista seletivo de

receptores α1) e Ioimbina (1mg/kg, i.p., antagonista seletivo de receptores α2). Após

15 minutos, foi administrado o OECA (50mg/kg, v.o.), e aguardado 60 minutos para

a observação dos efeitos no Labirinto em Cruz Elevado. Foram analisados o tempo

de permanência nos braços abertos e a frequência de entrada nos braços abertos

do aparato (Figura 11).

4.4 Análise estatística

Os dados obtidos foram apresentados com médias seguidas pelos

respectivos erros padrões médio (EMP), e os dados foram submetidos às análises

de variância (ANOVA), quando necessários, foram seguidos de teste de múltipla

comparação a partir dos modelos pos hoc de Bonferroni, utilizando o software

GraphPad INSTAT®.

Os resultados foram apresentados como medianas seguidas dos intervalos

interquadil. Foram considerados estatisticamente significantes os valores de p menor

do que 0,05 (p < 0,05) (MANSOURI et al., 2014).

48

5 RESULTADOS

5.1 Avaliação do efeito do OECA sobre a deambulação dos animais através do

TCA e da capacidade motora pelo teste Rota rod.

A Figura 12 ( A/B) mostra o efeito do tratamento dos animais com OECA

(50mg, 100mg, 150mg), administrados por via oral no teste de campo aberto (TCA).

Observa-se que o OECA não promoveu alteração dos parâmetros do teste, não

havendo diferença significativa entre o número de cruzamentos (crossing) e

levantadas (rearings), quando comparadas as doses do OECA com o controle

negativo [F(4,42) = 361,3, p>0,05]; [F(4,35) = 484,7, p>0,05], respectivamente. Como

esperado o haloperidol (2,5mg/kg, i.p.), diminuiu significativamente os dois

parâmetros observados, demonstrando seu efeito letárgico no sistema motor dos

animais.

A Figura 13 (A), representa o tempo de permanência dos animais no teste do

Rota rod (12rpm), o qual não apresentou alteração com a administração do OECA

em todas as doses utilizadas quando comparadas com o controle (F(3,34) = 0,6443,

p>0,05). Da mesma forma, o número de quedas não foi alterado no teste, quando

comparado às doses administradas de OECA e o controle negativo, não se

observou diferença significativa (F(3,36) = 1,311, p>0,05) (Figura 13B).

49

Figura 12: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/Kg), administrados pela via oral sobre os parâmetros: número de cruzamentos (crossing) (A) e número de rearings (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo. *** p < 0,001.

Controle 50 100 150 2,50

50

100

150

VeículoOECA

AHaloperidol

***

Tratamento (mg/kg)

Nú

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ruza

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Controle 50 100 150 2,50

20

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60

80

100

***

B

Tratamento (mg/kg)

Nú

mer

o d

e L

evan

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50

Figura 13: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/Kg), administrados pela via oral no teste do Rotarod. Tempo de permanência dos animais no aparelho Rotarod (A) e número de quedas dos animais do aparelho (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni.

Controle 50 100 1500

20

40

60 A

ControleOECA

Tratamento (mg/kg)

Tem

po

de

per

man

ênci

a (s

)

Controle 50 100 1500

1

2

3

4 B

Tratamento (mg/kg)

Nú

mer

o d

e q

ued

as

51

5.2 Avaliação do efeito do OECA sobre a ansiedade dos animais através do

modelo LCE.

Os resultados da Figura 14 (A) demonstram que o tratamento dos animais

com OECA nas concentrações de 50mg, 100mg e 150mg (F(4,40) = 27,69, p<0,001),

promoveu um maior número de entradas nos braços abertos, quando comparados

com o grupo controle (veículo), assim como uma diminuição das entradas nos

braços fechados, em todas as doses testadas (F(4,39) = 27,24, p<0,001) (figura 14C).

Também se observou que o tempo de permanência nos braços abertos é

significativamente maior quando administrado o OECA. Essa diferença é constatada

nas doses de 50mg, 100mg e 150mg (F(4,46) = 51,73, p<0,001) (Figura 14B). Em

contrapartida ao tempo nos braços abertos que aumentou com a administração do

OECA, ocorreu à diminuição do tempo nos braços fechados, em todas as doses

utilizadas (F(4,36) = 58,76, p<0,001) (Figura 14D).

Também foi observado nesse experimento o efeito ansiolítico clássico do

diazepam. O medicamento promoveu aumento do tempo de permanência (F(4,46) =

51,73, p<0,001) e frequência de entradas (F(4,40) = 26,69, p<0,001), nos braços

abertos (Figuras 14A e 14B), uma diminuição dos mesmos parâmetros de tempo e

frequência nos braços fechados do aparato (Figuras 14C e 14D) [F(4,36) = 58,76,

p<0,001]; [F(4,39) = 27,24, p<0,001], respectivamente.

52

Figura 14: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/Kg) e de diazepam (0,75 mg/Kg), administrados pela via oral e intraperitoneal, respectivamente, no modelo LCE. Freqüência de entrada nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo). *** p < 0,001.

Controle 50 100 150 0,750

20

40

60

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******

******

B

Tratamento (mg/kg)

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Controle 50 100 150 0,750

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*********

***

D

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Controle 50 100 150 0,750

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60

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*** ***

ControleOECA

ADiazepam

******

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Controle 50 100 150 0,750

20

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************

C

Tratamento (mg/kg)

Fre

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nos

bra

ços

fech

ados

(%)

53

5.3 Avaliação do efeito do OECA sobre o sono induzido por barbitúricos (MSB).

Os resultados representados na Figura 15 demonstram que o tratamento dos

animais com OECA, em todas as doses testadas, promoveu significativamente

redução do tempo de latência para o sono (Figura 15A) [F(4,35) = 228,7, p<0,001],

quando comparado com o grupo controle negativo (veículo).

No mesmo experimento verificou-se que o tempo total de sono (Figura 15B)

[F(4,35) = 63,66, p<0,001], quando comparadas com o grupo controle negativo

(veículo). Foi observado também que, conforme esperado, o tratamento dos animais

com diazepam (1 mg/kg, i.p.) promoveu, um aumento significativo no tempo total de

sono (F(4,35) = 63,66, p<0,001) e diminuição da latência para o sono (F(4,35) = 228,7,

p<0,001), quando comparado com o controle negativo (veículo), produzindo seu

característico efeito hipnótico.

54

Figura 15: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/Kg) e de diazepam (1 mg/Kg), administrados pela via oral e intraperitoneal, respectivamente no MSB. Tempo de latência para o sono (A) e o tempo total do sono (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo). *** p < 0,001.

Controle 50 100 150 10

500

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1500

***

****** ***

VeículoOECADiazepam

A

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Controle 50 100 150 10

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****** *** ***

B

Tratamento (mg/kg)

Tem

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s)

55

5.4 Avaliação do efeito do OECA sobre a depressão através do Modelo de

Nado Forçado (MNF).

No MNF, apresentado na Figura 16A, está demonstrado que o OECA não

promoveu mudanças significativas no padrão comportamental dos animais em

nenhum dos parâmetros comportamentais observados no teste (imobilidade,

escalada, mobilidade), em nenhuma das doses utilizadas, quando comparadas com

o veículo.

Em dois dos parâmetros observados (Figura 16A e 16B), a imipramina

(50mg/kg, i.p.), administrada como droga antidepressiva de escolha, exibiu efeito

antidepressivo, promovendo um aumento significativo no tempo de escalada (F(4,38) =

34,76, p<0,001) e diminuição do tempo de imobilidade (F(4,36) = 93,06, p<0,001),

quando comparada com o controle (veículo).

56

Figura 16: Efeito da administração de OECA (50, 100 e 150 mg/Kg, v.o.) e da imipramina (50 mg/Kg, i.p.). Tempo de Imobilidade (A), Tempo de escalada (B), Tempo de nado (C). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo).*** p < 0,001.

Controle 50 100 150 500

50

100

150

200

VeículoOECAImipramina

A

***

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Controle 50 100 150 500

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***

Tratamento (mg/kg)

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Controle 50 100 150 500

50

100

150

200 C

Tratamento (mg/kg)

Mo

bili

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)

57

5.5 Avaliação do efeito do OECA sobre a convulsão induzida por PTZ.

Na Figura 17 está representa os resultados obtidos com animais avaliados no

modelo de antagonismo da convulsão induzida por PTZ, e tratados com OECA.

Neste modelo os animais que receberam tratamento com OECA, na dose de

150mg/kg tiveram aumento significativo da latência para a primeira crise convulsiva

(F(4,40) = 1280, p<0,001), quando comparado com os animais tratados com o

veículo. Porém, o tratamento não protegeu os animais contra a letalidade induzida

pelo PTZ, uma vez que os animais não sobreviveram às crises tônicas induzidas

pelo PTZ (resultados não mostrados). O fenobarbital, utilizado como controle

positivo apresentou seu efeito anticonvulsivante (F(4,40) = 1280, p<0,001),

aumentando significativamente a latência para a convulsão, quando comparado com

o veículo.

58

Figura 17: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/Kg, v.o.) e de fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.), no modelo de convulsão induzida por PTZ. A figura indica o tempo de latência para primeira crise convulsiva com PTZ. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo). *** p < 0,001.

Controle 50 100 150 5000

500

1000

1500

***

VeículoOECAFenobarbital

Tratamento (mg/kg)

***

Lat

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con

vuls

ão (

s)

59

5.6 Determinação do mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do

OECA:

5.6.1 Influencia do sistema adrenérgico sobre o mecanismo de ação da

propriedade ansiolítica do OECA

A Figura 18, mostra que o pré-tratamento dos camundongos com os

antagonistas, α1-adrenérgico, prazosina (1 mg/kg, i.p) ou α2-adrenérgico, ioimbina

(1 mg/kg, i.p.), quando comparados ao grupo tratado apenas com o OECA:, não

foram capazes de reverter o efeito ansiolítico do OECA: (50 mg / kg) no teste do

labirinto de cruz elevada) considerando os parâmetros de: Tempo de permanência

nos braços abertos [F(5,45) = 40,64, p>0.05], Figura 18(B) e, Frequência de entrada

nos braços abertos [F(5,48) = 69,55, p>0,05], Figura 18(A). Os animais tratados

apenas com o OECA (50mg/kg, v.o.), apresentaram diferença significativa em

comparação com o controle (veículo), demonstrando o efeito ansiolítico do óleo.

60

Figura 18: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com Ioimbina (1 mg / kg, ip, um antagonista α2-adrenérgico) e Prazosina (1 mg / kg, ip, um antagonista α1-adrenérgico) e Óleo essencial de C. ambrosioides (50 mg / kg, v.o.), respectivamente, no modelo LCE. Frequência de entradas nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são expressos como média ± S.E.M. (n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo controle.

0

20

40

60

80

OECA 50mg/Kg

Veículo IoimbinaPrasozinaOECA 50mg

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OECA 50mg/Kg

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bra

ços

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tos

(%)

61

5.6.2 Influencia do sistema serotoninérgico sobre o mecanismo de ação da


Os resultados apresentados na Figura 19 mostram que o pré-tratamento dos

animais com os antagonistas de serotonina 5HT1A, o NAN-190 (0,5mg/Kg, i.p.) e

antagonista 5-HT2A, a Quetanserina (5mg/kg, i.p.), foram capazes de reverter o efeito

ansiolítico do OEA representado pela diminuição do número de entradas nos braços

abertos [F(8,401) = 9,78 p<0,001], porém não apresentaram efeito no tempo

desprendido pelos animais nesses respectivos compartimentos do LEC [F(9,73) =

10,73 p>0,05]; Além disso, a Figura 19 mostra que o pré-tratamento dos

camundongos com antagonista de receptores 5-HT3, ondansetrona (0,3mg/kg, i.p.) e

o antagonista dos receptores 5-HT1A/1B, pindolol (10mg/kg, i.p.), não foram capazes

de reverter o efeito ansiolítico do OECA (50mg/kg, v.o.) no labirinto de cruz elevada.

Os animais tratados apenas com o OECA (50mg/kg, v.o.), apresentaram diferença

significativa em comparação com o controle (veículo), demonstrando o efeito

ansiolítico do óleo.

62

Figura 19: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com NAN-190 (0,5 mg, i.p., antagonista de receptores 5-HT1A), Ondansetrona (0,3 mg, i.p., antagonista de receptores 5-HT3), Quetanserina (5mg/kg, i.p., antagonista de receptores 5-HT2A/2C), Pindolol (10 mg / kg, i.p., antagonista de receptores 5-HT1A/1B) e OECA (50 mg / kg, v.o.), no modelo LCE. Frequência de entradas nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são expressos como média ± S.E.M. (n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo controle. ### p<0.001, comparação do grupo pré-tratados com antagonistas e o grupo tratado somente com OECA.

0

20

40

60

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OECA 50mg/Kg

A Veículo Ondansetrona

NAN-190QuetanserinaPindolol

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OECA 50mg/Kg

B

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man

ênci

an

os

bra

ços

aber

tos

(%)

63

5.6.3 Influência do sistema dopaminérgico sobre a propriedade ansiolítica do

OECA.

Todos os antagonistas dopaminérgicos específicos utilizados neste

experimento com o intuito de investigar a influencia do sistema sobre a propriedade

ansiolítica do OECA, reverteram seu efeito ansiolítico. A Figura 20 nos mostra que o

pré-tratamento dos animais com: SCH23390, antagonista dos receptores D1;

Pimozide, antagonista dos receptores D2; e Haloperidol, antagonista não seletivo

dos receptores de dopamina diminuíram a frequência de entradas nos braços

abertos (F (9,75) = 19,59, p<0.001)(Figura 20A), porém apenas o pré-tratamento com

Haloperidol interferiu no tempo de permanência dos animais nos braços abertos (F

(9,72) = 11,72, p<0.001) quando comparado com o OECA administrado isoladamente.

e D). O pré-tratamento dos animais com Metoclopramida, antagonista 5-HT3/D1, não

promoveu alterações significativas em nenhum dos parâmetros avaliados.

64

Figura 20: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com Pimozide (0,5 mg / kg, i.p., antagonista de receptores dopamina D2), Haloperidol (10µg/kg, i.p., antagonista não seletivo de receptores de dopamina), SCH 23390 (0,5 mg / kg, i.p., antagonista de receptores de dopamina D1), Metoclopramida (1mg/kg, i.p., antagonista de receptores 5HT3/D1) e OECA (50 mg / kg, v.o.), respectivamente, no modelo LCE. Frequência de entradas nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B),. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são expressos como média ± S.E.M. (n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo controle. ### p<0.001, comparação do grupo pré-tratados com antagonistas e o grupo tratado somente com OECA.

0

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OECA 50mg/Kg

A Veículo Pimozide

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(%)

65

5.6.4 Influencia do sistema GABAérgico sobre o mecanismo de ação da


O efeito ansiolítico do óleo essencial de C. ambrosioides parece envolver

diretamente o sistema GABAérgico. Os resultados apresentados na Figura 21

demonstraram que o tratamento prévio dos animais com Flumazenil (3mg/kg, i.p.)

reverteu o efeito do Diazepam (1mg/kg, i.p.), droga ansiolítica padrão, assim como

ocorreu com a administração de Bicuculina (1mg/kg, i.p.) e Baclofeno (2mg/kg, i.p.),

que reverteram o efeito do OECA, nos parâmetros de tempo de permanência nos

braços abertos do aparato (F(9,75) = 26,59, p<0.001) e frequência de entradas nos

braços abertos (F(9,79) = 19,35, p<0.001). Os resultados comprovaram o efeito

antagonista do flumazenil, frente à administração concomitante de diazepam,

demonstrando a característica ansiogênica da droga.

66

Figura 21: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com Bicuculina (1,0 mg / kg, i.p., antagonista de receptores GABAA), Baclofeno (2,0 mg / kg, i.p., antagonista do receptor GABAB) e Flumazenil (3mg/kg, i.p., antagonista dos benzodiazepínicos), Diazepam (1mg/kg, i.p., agonistas GABAérgico) e ÓECA (50 mg / kg, v.o.), respectivamente, no modelo LCE. Frequência de entradas nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são expressos como média ± S.E.M. (n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo controle. ### p<0.001, comparação do grupo pré-tratados com antagonistas e o grupo tratado somente com OECA. (a) p<0.001, comparação do grupo pré-tratados com diazepam+flumazenil e o grupo tratado somente com diazepam.

0

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OECA 50mg/Kg

AVeículo Baclofeno

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67

6 DISCUSSÃO

Os óleos essenciais compreendem uma mistura de substâncias voláteis

extraída de plantas. Podem se revelar como matérias-primas de importância para as

indústrias cosmética, farmacêutica e alimentícia, sendo geralmente os componentes

de ação terapêutica de plantas medicinais aromáticas (EL HADI et al., 2013)

Desde muitos séculos, os óleos essenciais são explorados, embora ainda

hoje não se tenha completamente documentado o início exato. Acredita-se que os

primeiros usos para estes, tenha sido através de bálsamos, ervas aromáticas e

resinas que eram usadas para embalsamar cadáveres em cerimônias religiosas há

milhares de anos atrás. Há relatos do uso de óleos essências em 2.700 a.C pelos

chineses, no mais antigo livro de ervas do mundo, Shen Nung. Algumas das plantas

citadas eram o cravo (Syzygium aromaticum) e a papoula (Papaver somniferum).

Outro uso documentado de óleos essencias é datado em 2.000 a.C. em livros

escritos em sânscrito, pelos hindus. A partir dos séculos XVI e XVII, a

comercialização destes óleos se popularizou pelo mundo, devido ao nível de

tecnologia e também conhecimento de suas propriedades jamais explorado e

divulgado no mundo (VIGAN, 2010).

Os óleos essenciais exibem muitas propriedades farmacológicas já reportadas

na literatura, dentre elas destaca-se atividade antimicrobiana (BILIA et al., 2004,

SEOW et al., 2014), anti-inflamatória (SILVEIRA et al., 2014), analgésica (SOUSA,

2011), antioxidante (AMORATI et al., 2013) entre outras (LEE et al., 2012), mas,

reside na aromaterapia a maior aplicabilidade dos óleos essenciais. Estudos de

algumas patologias do SNC apontam seus efeitos na terapêutica, por exemplo, na

ansiedade (KASPER, 2013), depressão (YIM et al., 2009), insônia e demência

(PERRY et al., 2003).

No presente estudo avaliou-se, num primeiro momento, os efeitos centrais do

óleo essencial de C. ambrosioides administrados em animais os quais foram

submetidos a modelos específicos, utilizados para o screening de substancias

psicoativas. Posteriormente, optou-se por aprofundar o estudo de uma das

propriedades farmacológicas detectadas.

O teste do campo aberto (TCA) pode ser utilizado para vários fins

farmacológicos, dependendo do protocolo adotado. Esse teste utiliza a aversão do

68

animal a ambientes claros e abertos, como mecanismo para determinar o grau de

ansiedade do mesmo. O conflito causado pela situação faz com que os animais

fisiologicamente entrem num estado de ansiedade, aumentando a exploração do

local (rearings) e o numero de cruzamentos (crossings). Drogas com efeito

ansiolítico tendem a diminuir ambos os parâmetros, apesar de ser considerado por

alguns autores como um teste pouco sensível para ansiedade, e sim para detectar

uma atividade depressiva inespecífica no SNC (BLANCO et al., 2009). Por outro

lado, o teste revela também as drogas que afetam o sistema motor do animal

(SAUDOU et al., 1994), pois a deambulação e o número de levantadas “rearings”

estão relacionados a uma coordenação motora eficaz (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006).

O teste possibilita excluir o viés da capacidade motora, pois se a droga utilizada

afeta o movimento, pode interferir e mascarar resultados em outros aparatos

(GOMES et al., 2010).

Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que o óleo essencial não

exibiu um efeito importante sobre o sistema motor do animal, nas doses utilizadas,

quando comparado com o controle (veículo). Esses resultados corroboram com os

obtidos por Grassi e colaboradores (2013), que utilizaram as mesmas doses do

extrato das folhas de C. ambrosioides, não observando efeitos motores. No teste

realizado pelos pesquisadores o Diazepam (2mg/Kg, i.p.), benzodiazepínico

empregado como controle positivo, promoveu a diminuição da motricidade, efeito

relacionado à sedação e relaxamento muscular que causa no organismo (GOMES et

al., 2010; MOREIRA et al., 2014).

Os experimentos também demonstraram a diminuição nos dois parâmetros

observados no campo aberto (crossings e rearings), com a administração de

haloperidol (2,5mg/kg, i.p.). Tal resultado é de fato esperado, já que o haloperidol

exibe como efeito adverso uma disfunção motora, relacionado com o antagonismo

de receptores dopaminérgicos D2 em regiões cerebrais chamadas de nucleus

accumbens e sistema nigroestriatal. O medicamento age como antagonista

inespecífico dos receptores dopaminérgicos causando efeito neuroléptico, utilizado

na terapêutica de algumas psicoses (CONCEIÇÃO; FRUSSA-FILHO, 1996). Em

animais o medicamento promove estados catalépticos (DANTAS et al., 2014;

SHIMIZU et al., 2014), efeito semelhante ao de outras drogas utilizadas para

tratamento de esquizofrenia (DE SANTIS et al., 2014).

69

Os resultados acima mencionados completam os encontrados no teste Rota

rod. Trata-se de um clássico modelo animal utilizado para avaliar bloqueio

neuromuscular periférico e perda da coordenação motora dos animais (DUNHAM,

MIYA, 1957), efeito promovido por agentes como os benzodiazepínicos e os

anestésicos (PULTRINI et al, 2006). Quando o desempenho dos animais tratados

com uma determinada substância é investigado usando a barra rotativa do Rota rod,

o resultado mostra-se semelhante ao do grupo controle, sugere-se que a

coordenação motora não foi prejudicada (BLANCO et al., 2009). Em nossos estudos,

o tempo de permanência no aparato não foi diminuído com a administração de

nenhuma das três doses do OECA (50mg, 100mg, 150mg), como o encontrado com

o controle positivo, um BDZ, os quais têm dentre seus efeitos colaterais estados de

ataxia e sedação (CHARNEY et al., 2001).

O teste do labirinto em cruz elevado (LCE) é utilizado para avaliar a eficácia

sobre o perfil neurocomportamental de animais, tratados com agentes ansiogênicos

e/ou ansiolíticos. Este modelo animal para ansiedade é um dos mais utilizados e

populares atualmente em uso. Sua utilização não requer altos custos e o teste é

realizado de forma rápida, onde o pesquisador não precisa de um treinamento

prolongado para desenvolvê-lo (ALMEIDA et al., 2012). O modelo foi validado para

utilização em camundongos e ratos (PELLOW et al, 1985; LISTER, 1987). O modelo

representa uma tarefa aversiva dos roedores. Quando os animais permanecem nos

braços abertos, manifestam o paradigma etológico de apresentar comportamentos

espontâneos, é baseado no conflito natural entre a necessidade de explorar um novo

ambiente e a tendência a evitar um potencial perigo na área, permanecendo mais

nos braços fechados do aparato (KUMAR et al., 2013). Além disso, os animais

exibem aversão nos braços abertos pela falta de tigmotaxia. Roedores se orientam

espacialmente pelas vibrissas, e nos braços abertos eles não possuem as colunas

laterais para se orientarem (LISTER, 1987).

Os índices de ansiedade neste teste como o percentual de entradas nos

braços abertos e tempo gasto nesses braços são sensíveis a agentes que

geralmente podem atuar através do complexo receptor de GABAA, justificando o uso

de diazepam como um controle positivo no estudo (DONALDSON; HEN, 2014;

CAMPOS et al., 2013). Porém, assim como na depressão, na ansiedade ocorre o

envolvimento do sistema monoaminérgico e serotonérgico, diretamente relacionados

com os sintomas neurovegetativos desta patologia (SHIN; LIBERZON, 2010) e

70

presentes em estruturas cerebrais ligadas a ansiedade como os núcleos da rafe e

locus coeruleus. Os sistemas GABAérgico e Glutamatérgico, responsáveis pelo

controle de estados de ansiedade, estão presentes em quantidades consideráveis

em regiões ligadas ao sistema emocional do sistema límbico (BERTOGLIO;

GUIMARÃES; ZANGROSSI JR, 2006).

Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que o óleo essencial

de C. ambrosioides teve perfil farmacológico semelhante ao diazepam, como um

agente ansiolítico, diminuindo o tempo de permanência nos braços fechados do

aparato e aumentando o tempo desprendido nos braços abertos, característica de

compostos com capacidade de diminuir o comportamento aversivo natural do

animal, como encontrado em diversos trabalhos onde o principal constituinte do óleo

essencial era um terpeno atuante sobre o SNC (GUIMARÃES et al., 2010; SOUSA,

2011; MACHADO et al., 2013; MOREIRA, et al., 2014) e que apresenta efeito

ansiolítico no LCE, semelhante ao efeito clássico do diazepam (ALMEIDA et al.,

2012; KUMAR; BHAT; KUMAR, 2012; COSTA et al., 2014).

Assim como no controle da ansiedade, o sistema GABAérgico é a principal via

de controle do circuito do sono, composto de uma série de núcleos chave no tronco

cerebral e no hipotálamo, porém esse processo recebe a entrada de diversos

sistemas sensoriais somáticos e viscerais, dentre outros. Alguns centros, dentro

dessa rede de controle, incluem o locus coeruleus (dominada pelo neurotransmissor

norepinefrina), dorsal e núcleos da rafe (dominada pelo neurotransmissor dopamina)

e núcleos túbero mamilar (dominada pelo neurotransmissor histamina), estes,

projetam-se pelo hipotálamo e prosencéfalo basal, ao córtex, demonstrando que não

só o GABA é responsável pelo controle do sono (ESPANA et al., 2004).

No caso de acontecer uma inibição destes centros de excitação ocorre o

sono. Tal inibição é gerada principalmente pelos núcleos hipotalâmicos, dominados

pelo GABA (BIANCHIN et al., 2004).

Fujimori e Cobb (1995), propõem que o aumento da hipnose barbitúrica é um

bom indicador de atividade depressora do SNC, como exemplo, o pentobarbital que

quando administrado com outro agente com propriedades depressoras promovem

diminuição da latência do sono e também aumento do tempo total do sono dos

animais durante o experimento, sendo um ótimo método para caracterizar a

propriedade hipnótica de alguns compostos (MA et al. 2009; FANG et al., 2010).

71

Vários estudos têm relatado que o prolongamento da hipnose barbitúrica

pode estar relacionado com a inibição metabólica do barbitúrico pela substância-

teste ou, por uma ação central nos mecanismos de neurotransmissores envolvidos

com a regulação do sono (KAUL; KULKAMI, 1978).

Os presentes resultados demonstraram que o óleo de C. ambrosioides,

aumentou o tempo de sono dos animais em todas as doses testadas e da mesma

forma diminuiu a latência para o mesmo, assemelhando-se na dose de 150mg/kg,

ao efeito previsto da administração do diazepam, benzodiazepínico padrão. Estes

resultados comprovam a eficácia sedativa do óleo, em concordância aos testes já

utilizados de ansiedade. Compostos terpênicos menores como o linalol (COELHO et

al., 2011) e o mirceno (VALE et al., 2002), os quais estão presentes nos óleos

essenciais, já foram comprovadamente categorizados como sedativos.

Outra propriedade farmacológica avaliada nesse estudo foi a propriedade

antidepressiva. A utilização de óleos essenciais na terapêutica da depressão como

terapia alternativa tem sido uma constante nos últimos anos. (PERRY; PERRY,

2006; YI et al., 2013; FIßLER; QUANTE, 2014) e os efeitos antidepressivos dos

mesmos têm sido validados em vários modelos farmacológicos de depressão, como

por exemplo, o modelo do nado forçado (MEHTA et al., 2013; MACHADO et al.,

2013)

O teste de nado forçado (MNF) é o teste farmacológico mais amplamente

utilizado em roedores, na pesquisa para avaliar compostos com potencial

antidepressivo (SILVA et al., 2006). Quando os animais são expostos ao MNF

geralmente exibem uma postura imóvel que é considerada reflexo de um estado de

“desespero comportamental”, no pressuposto de que o animais perderam a

esperança de escapar (PORSOLT et al., 1977). Portanto, a exposição ao estresse

de nadar produz uma mudança de comportamento que é tido como um fenótipo

comportamental semelhante ao da depressão (VALVASSORI et al., 2013; CRYAN

et al, 2002). Está bem estabelecido que o tratamento subagudo com a maioria das

classes de antidepressivos, incluindo inibidores seletivos da serotonina (SSRIs),

inibidores seletivos de recaptação de noradrenalina (IRSN), antidepressivos

tricíclicos (ADT) e os inibidores da monoamina oxidase (IMAO), reduzem o tempo de

imobilidade no MNF (GUAN et al., 2014).

O sistema monoaminérgico é um dos alvos mais importantes para o

tratamento da depressão, onde a deficiência das aminas biogênicas, particularmente

72

serotonina (5-HT), noradrenalina (NOR) e dopamina (DO) é um dos fatores

responsáveis pelo surgimento dessa doença (MILLAN, 2004). Nos quadros de

depressão ocorre uma diminuição na quantidade de neurotransmissores liberados,

mas a bomba de recaptação e a enzima continuam trabalhando normalmente

(ELHWUEGI, 2004).

Vários estudos demonstram que o aumento da mobilidade no teste de nado

forçado (MNF), pelo emprego de compostos orgânicos, pode ser resultado de

mecanismos de ação diferentes, relacionada à ativação de receptores de serotonina,

como 5-HT1A (SUGIMOTO et al., 2010), glutamatérgicos, como o NMDA (RIEGER et

al., 2014) e dopaminérgicos (ZHENG et al., 2013), diversificando e dificultando a

construção de uma linha de atuação única entre as drogas e compostos testados.

Atualmente, a depressão e o emprego de substâncias antidepressivas, têm se

relacionado ao fenômeno de neurogênese (SCORZA et al., 2005), paralelo às

alterações morfológicas existentes na formação hipocampal (SHELINE, 2000),

associada a neurotoxicidade mediada pela liberação excessiva de glicocorticóides,

em momentos de estresse. A relação entre a diminuição da neurogênese, causada

pelo estresse (aumento de glicocorticóides) e o surgimento de quadros depressivos,

foi estudada pela primeira vez por Jacob e colaboradores (2000), tendo em vista que

em estudos anteriores, já se havia previsto que em casos de adrenolectomia, onde é

suprimido os esteróides adrenais, ocorria o aumento da neurogênese no giro

dentado de ratos adultos (CAMERON; GOULD, 1994).

Em seguida, novos estudos demonstraram que não apenas os

corticosteróides poderiam interferir na neurogênese e com isso na depressão e sim,

outros mediadores da inflamação (SONG; WANG, 2011; WU et al., 2013), como as

citocinas e interleucinas, reforçando o papel da modulação que a imunidade

desempenha nos processos de neuroplasticidade (YIRMIYA; GOSHEN, 2011).

A persistência do estado fisiopatológico da depressão e a exposição a

situações de estresse contínuo podem diminuir gradualmente o volume do

hipocampo, e alterar a síntese de fatores de crescimento neuronal, principalmente o

BDNF (do inglês, brain-derived neurothophic fator), este, atividade relacionado à

gênese da depressão (MANJI; DREVETS; CHARMEY, 2001).

A redução dos níveis de BDNF em pacientes deprimidos está relacionada

com a gravidade da depressão ao passo de drogas que atuam ativando o BDNF,

73

aumentam as formações dendríticas e a neurogênese, diminuindo a vulnerabilidade

celular (PERITO; FORTUNATO, 2012).

Óleos essências de Perilla frutescens, mostraram ter um mecanismo de ação

ligado à expressão de proteínas hipocampais e ao aumento dos níveis de BDNF,

equiparado ao efeito da administração de Fluoxetina (antidepressivo padrão) (YI, et

al., 2013). Derivados da Allium macrostemon, apresentam da mesma forma

capacidade de aumenta os níveis de BDNF, diminuídos após testes como o nado

forçado e a suspensão pela cauda, ambas as situações que expõem o camundongo

a um alto nível de estresse (LEE et al., 2010).

Como demonstrado no teste de MNF, o tratamento dos animais com OECA,

não alterou os parâmetros comportamentais, no teste do nado forçado quando

comparado o tempo de imobilidade encontrado na administração do controle e o

tempo nas aplicação das doses do OECA, não observamos diferenças significativas,

sugerindo que o mesmo não exibe perfil antidepressivo neste modelo .

Em busca de completar o screening farmacológico, observou-se a convulsão

induzida quimicamente no modelo do PTZ, largamente utilizado para avaliar

possíveis efeitos anticonvulsivantes de substâncias estudadas (BHOSLE, 2013).

Trabalhos têm demonstrado que a ação convulsivante do PTZ se dá pela

inibição dos canais de cloreto do receptor GABAA (GIRAMKAR et al., 2013;

HOSSEINZADEH et al., 2013; GOYAL; SASMAL, 2014; NGOUPAYE et al., 2014) e

consequentemente, a ação do neurotransmissor GABA.

As convulsões contínuas são o estado fisiopatológico que caracteriza a

epilepsia, que pode ser controlada com a utilização de inibidores de canais de cálcio

ou moduladores da resposta do GABAérgica e Glutamatérgica, neurotransmissores

inibitório e excitatório do SNC, respectivamente (GIRAMKAR et al., 2013;

HOSSEINZADEH et al., 2013). É reportado na literatura que mais de 70% dos

pacientes tem suas crises convulsivas controladas com a utilização de drogas que

modulam os canais iônicos ou atuam na transmissão desses dois

neurotransmissores (NASSIRI-ASL; ZAMANSOLTANI; TORABINEJAD, 2009).

No presente estudo foi demonstrado que o OECA não promoveu de maneira

dose dependente, inibição das crises convulsivas induzidas pelo PTZ, sobretudo na

dose de 150mg/kg. Esses resultados corroboram com a hipótese da participação da

via GABAérgica, uma vez que se mostrou ansiolítico e hipnótico, não só diminuindo

a latência de sono dos animais como também aumentando tempo total de sono,

74

característica de plantas com perfil farmacológico benzodiazepínico (YANG et al.,

2013; CHINDO et al., 2014; GOYAL; SASMAL, 2014; GUPTA et al., 2014;

NGOUPAYE et al., 2014) que pelas características apresentam ação

anticonvulsivante. Além disso, trabalhos realizados anteriormente demonstraram que

a classe de constituintes como os terpenos, são a parte responsável pelo efeito

sedativo, ansiolítico, anticonvulsivante e analgésico de diversas plantas da medicina

natural (WIJEWEERA et al., 2006) ainda, sendo promissoras fontes de

anticonvulsivantes de amplo espectro de atividade, através de modificações na

estrutura química.

O segundo foco do estudo foi o de escolher uma das propriedades

farmacológicas detectadas no screening farmacológico do OECA e, aprofundar os

estudos avaliando o mecanismo de ação da propriedade farmacológica escolhida.

Neste contexto, optou-se pela avaliação do mecanismo de ação da propriedade

ansiolítica do OECA, avaliando a influencia de vários sistemas de neurotransmissão,

utilizando como modelo farmacológico o LCE.

O hipocampo é a principal região de ação do sistema adrenérgico no SNC,

recebendo inervação noradrenérgica no locus coeruleus e podendo estar presente

em terminais nervosos não-noradrenérgicos, nas células gliais e nos núcleos da rafe

modulando a transmissão serotoninérgica, por exemplo. Os α1-adrenoreceptores (α1-

ARs) são principalmente pós-sinápticos, enquanto os α2-adrenoreceptores (α2-ARs)

estão localizados tanto pré-sináptica quanto pós-sinapticamente (STUCHLIK;

PETRASEK; VALES, 2009). Os α1-ARs são geralmente acoplados a proteínas Gq,

que ativa a fosfolipase C e o fosfotidil inositol intracelular, sinalizando a ativação da

proteína quinase C (PKC), e a liberação de cálcio intracelular através do inositol

1,4,5-trifosfato. Os α2-ARs estão acoplados a proteínas Gi, o que pode reduzir

intracelularmente o monofosfato de adenosina cíclico (AMPcíclico) inibindo algumas

isoformas da adenilil ciclase (RAMOS; ARNSTEN, 2007).

A ativação dos α1-ARs no hipocampo pode atenuar a neurotransmissão

Glutamatérgica ou pode potenciar os efeitos celulares dos receptores NMDA, além

disso, despolariza uma subpopulação de interneurônios GABAérgico (HILLMAN;

DOZE; PORTER, 2007).

O motivo de utilizar na pesquisa do mecanismo de ação ansiolítica do OECA,

o α2-antagonista, Ioimbina, fundamenta-se na ação que a mesma promove

diminuindo a queima e liberação de serotonina nas áreas terminais do controle da

75

ansiedade, tendo em vista que esses receptores modulam não só o sistema

serotoninérgico, mas também o noradrenérgico e dopaminérgico (WEIKOP et al.,

2004), podendo interferir nos resultados de ensaio de ansiedade, como no labirinto

em cruz elevada (BRAUN et al., 2011). A implicância dos α2-antagonista na

ansiedade foi comprovada, mas com certa confusão ainda, sobre qual o real papel

dos agonistas e antagonistas da via (MILLAN, 2003).

Estudos de microdiálise in vivo do cérebro sugerem que os α1-

adrenoreceptores estão envolvidos no controle dos níveis de serotonina extracelular

(DO-MONTE; ALLENSWORTH; CAROBREZ, 2010; TAKAMURA et al., 2012) e a

administração de prazosina, uma antagonista seletivo α1-adrenérgico diminui os

níveis de serotonina extracelular no hipocampo, córtex pré-frontal e o núcleo da rafe

(PUDOVKINA et al, 2003).

Como demonstram os resultados obtidos a utilização de antagonistas de α-

adrenoceptores não alterou o efeito do óleo de C. ambrosioides, evidenciando que

não há envolvimento da via adrenérgica no mecanismo de ação ansiolítica do óleo.

A dose de 50mg/kg, continuou significativamente efetiva no aparato, quando

comparada com o controle (veículo), o que não se alterou quando administrada

concomitantemente aos antagonistas prazosina e ioimbina, responsáveis por

antagonizar o sistema α-adrenérgico, como encontrado em outros estudos (BOURIN

et al., 2005).

Evidências apoiam o envolvimento da serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT)

na fisiopatologia e na origem dos transtornos de ansiedade (FAJEMIROYE et al,

2012; BRÜNING et al., 2009) e muitos fármacos ansiolíticos que são utilizados

atualmente tem seu mecanismo de ação relacionado com a recaptação de 5-HT

e/ou diretamente ligado aos receptores 5-HT (BARNES; SHARP, 1999; KODISH;

ROCKHILL; VARLEY, 2011), porém ainda há muitas controvérsias em relação a

especificidade do papel da 5-HT na fisiopatologia da ansiedade (KODISH;

ROCKHILL; VARLEY, 2011).

O núcleo dorsal da rafe (NDR) e os núcleos medianos da rafe (NMR)

fornecem quase toda a inervação da 5-HT para a prosencéfalo e núcleo pré-frontal

(ANDRADE, 2011; BIAGIONI et al., 2013), suas projeções são organizadas de tal

maneira que algumas áreas do prosencéfalo recebem projeções mistas da NDR e

NMR, enquanto outras regiões recebem feixes seletivos de NDR ou NMR (ADELL et

al., 1997).

76

Graeff e Deakin propuseram que o sistema serotoninérgico, proveniente do

núcleo dorsal da rafe (NDR), está envolvido no comportamento de ansiedade e na

inibição do pânico. Além disso, tem sido mostrado que as vias de transmissão da 5-

HT que partem do NMR desempenham um papel importante no processamento da

ansiedade, com implicações em patologias como o transtorno de ansiedade

generalizada, stress e depressão (GRAEFF et al., 1996; PAUL et al., 2014).

Os receptores de serotonina 5-HT1A, são expressos tanto em neurônios pré-

sinápticos da rafe, quanto em neurônios pós-sinápticos nas regiões límbicas,

envolvidos na ansiedade (BARNES; SHARP, 1999). Estão relacionados com a

região dos núcleos basolaterias da amigdala, local responsável pelos

comportamentos defensivos, de medo e ansiedade, sendo que a ativação desses

receptores modula essa transmissão nervosa, diminuindo estados como o de pânico

e agitação (ZANGROSSI JR; GRAEFF, 1994; GONZALEZ; ANDREWS; FILE, 1996;

STRAUSS; VICENTE; ZANGROSSI JR, 2013).

Outros receptores de serotonina estão relacionados com a ansiedade, visto

que ao avaliar o comportamento de camundongos “knock out” para receptores 5-

HT2A, observa-se comportamentos ansiosos (WEISSTAUB et al., 2006), assim como

a utilização de Quetanserina como antagonista do receptor demonstra capacidade

de antagonizar o efeito ansiogênico de drogas injetadas no septo lateral de

camundongos (DE PAULA et al., 2012).

Hoje está bem definido o papel dos receptores de serotonina 5-HT1A e 5-HT2A,

nas regiões dos núcleos da rafe e córtex pré-frontal, assim como o papel dos

receptores 5-HT3, únicos receptores de serotonina ligados aos canais de cátions

(RAJKUMAR; MAHESH, 2010), na aprendizagem orientada por recompensa (FRICK

et al., 2014), nos circuitos do controle do medo (HÖFELMANN et al., 2013) e no

controle da ansiedade (GUPTA et al., 2014).

No presente estudo os resultados demonstram que a inibição dos receptores

5-HT3, através da administração do antagonista ondansetrona, não foi capaz de

diminuir o efeito ansiolítico do óleo de C. ambrosioides, não afetando nem o tempo

desprendido nos braços abertos, do labirinto em cruz elevada, nem a frequência de

entrada nos mesmos. Assim como ocorreu na administração do antagonista não-

seletivo 5-HT1A/1B, pindolol, demonstrando que na presença de ambos os

antagonistas o OECA é capaz de ter seu efeito ansiolítico de costume.

77

A fim de elucidar de maneira mais seletiva, utilizou-se o antagonista seletivo

de receptores 5-HT1A, NAN-190, muito empregado em ensaios de ansiedade em

camundongos (HERCULANO; MAXIMINO, 2014; TÕNTSON et al., 2014), o mesmo,

não alterou o tempo de permanência nos braços abertos do aparelho, porém

diminuiu a frequência de entradas nos mesmos, antagonizando parcialmente o efeito

do óleo. O mesmo resultado foi encontrado na utilização do antagonista não-seletivo

5-HT2A/2C, quetanserina, o qual alterou o efeito do óleo no número de entradas nos

braços, porém não no tempo desprendido pelo camundongo.

Os resultados encontrados apresentam uma inibição parcial do efeito do

OECA quando antagonizada a transmissão serotoninérgica pelos receptores 5-HT1A

e 5-HT2A/2C.

Outra via pesquisada foi à via de transmissão dopaminérgica. O sistema

dopaminérgico tem um papel importante nos mecanismos que influenciam os

comportamentos de ansiedade, tanto em seres humanos quanto em animais

(AHMADI et al, 2011; ZARRINDAST et al., 2011), modulando a atividade neuronal

envolvida na excitabilidade do cérebro, na percepção do medo e no controle motor

(PEZZE; FELDON, 2004). A dopamina exerce os seus efeitos através de duas

subfamílias de receptores conhecidos como “D1-like” (D1 e D5) e receptores “D2-

like” (D2, D3 e D4).

Os comportamentos de ansiedade são regulados por várias regiões do

cérebro e vias neuronais, dentre as vias ligadas à dopamina, encontramos as saídas

dopaminérgicas da área tegmental ventral (ATV) para o nucleus accumbens (Nac)

(AHMADI et al, 2011; PEZZE; FELDON, 2004). Demonstrando uma interação

estreita no processo de regulação da ansiedade (SINNATHAMBI et al., 2013;

ZARRINDAST et al., 2011). O nucleus accumbens (Nac) em particular, é um núcleo

profundo que modula algumas funções cognitivas e não-cognitivas, tais como os

comportamentos de ansiedade (AHMADI et al, 2011; LOPES et al, 2012), a emoção

(DAVIDSON; IRWIN, 1999), comportamentos defensivos (DA CUNHA et al., 2008), a

locomoção (MARTINEZ et al, 2002), a depressão (CHAKI; YOSHIKAWA;

OKUYAMA, 2006) e as respostas de recompensa (MARTINEZ et al, 2002).

Estudos demonstram o efeito ansiolítico da administração do antagonista de

receptores de D1, SCH23390, na região do nucleus accumbens (AHMADI, et al.,

2013) e amígdala basolateral (ZARRINDAST, et al., 2011). O antagonismo da

ansiedade através da modulação do sistema dopaminérgico é acompanhado em

78

algumas plantas por comprometimento motor (SINNATHAMBI et al., 2013) e é

antagonizado pela utilização de haloperidol. O antagonista seletivo D2, pimozide foi

capaz de antagonizar o efeito ansiolítico (RANGEL-BARAJAS et al., 2014).

Como demonstram os resultados o haloperidol (antagonista de dopamina, não

seletivo), foi a única droga capaz de reverter o efeito do óleo essencial de C.

ambrosioides no tempo e na frequência de entradas nos braços abertos do aparato.

Pimozide e SCH23390 (antagonista D2 seletivo, antagonista D1 seletivo,

respectivamente), interferiram na frequência de entradas, porém não alteraram o

tempo de permanência nos braços do aparato. A utilização da metoclopramida,

antagonista 5-HT3/D1, não interferiu no efeito do óleo essencial de C. ambrosioides

em nenhum dos parâmetros avaliados.

Os resultados encontrados apresentam uma inibição parcial do efeito do

OECA quando antagonizada a transmissão dopaminérgica pelos receptores de

dopamina.

A última via pesquisada do estudo foi a via de transmissão GABAérgica. O

ácido γ-aminobutírico (GABA) é o principal neurotransmissor inibitório no sistema

nervoso central (SNC) e está amplamente distribuído em todas as regiões cerebrais.

Há dois subtipos de receptores GABA bem documentados, GABAA e GABAB.

(KURIYAMA, et al., 1993). O GABAA é acoplado a um canal iônico de cloreto,

modulado alostericamente por outros receptores, que fazem parte de um mesmo

complexo macromolecular. Este complexo receptor media várias atividades do SNC

e é o alvo de ação de vários fármacos, tais como: anticonvulsivantes, ansiolíticos,

hipnótico/sedativos e relaxantes musculares. O antagonismo do mesmo é alcançado

pela administração da bicuculina e a sua ativação induz um potencial pós-sináptico

inibitório rápido, principal efeito dos fármacos da classe dos benzodiazepínicos

possui atividade ansiolítica e hipnótico/sedativa, além dos anticonvulsivantes e

relaxantes musculares (STAHL et al. 2013). O GABAB é insensível ao antagonismo

da bicuculina e sensível ao baclofeno (ZARRINDAST et al., 2001), foi revelado, que

sua estrutura é da classe dos receptores metabotrópicos ligado a proteína GTP, sua

ativação induz um potencial pós-sináptico inibitório lento. Ambos os receptores têm

função inibitória na região central do sistema nervoso (KURIYAMA et al., 1993).

Estudos demonstram que a utilização da baclofeno e bicuculina como

antagonistas dos receptores GABAB e GABAA, respectivamente, apresentam efeito

em diferentes regiões do organismo, como no trato colón retal, aumentando o

79

peristaltismo (AUTERI et al., 2014), em aplicações no septo lateral (MITRA;

LENGLOS; TIMOFEEVA, 2014), intrahipocampais (LIU et al., 2014) e diretamente

na região do nucleus accumbens (LOPES et al., 2012).

Várias plantas e substâncias são testadas, quando apresentam característica

ansiolítica, através da administração concomitante de Flumazenil, antagonista de

receptores dos benzodiazepínicos (FAJEMIROYE et al., 2012; ISHOLA et al., 2012).

A tendência de apresentar um mecanismo de ação ansiolítico relacionado

com o sistema GABAérgico, vem se confirmado a cada teste comportamental do

OECA. Visto que plantas com mecanismo semelhante aos benzodiazepínicos, ou

seja, baseado no sistema GABAérgico, demonstram efeito letárgico e hipnótico nos

camundongos, antagonizados pela aplicação de Flumazenil. Não excluindo a

participação do sistema serotoninérgico e dopaminérgico no mecanismo de inibição

do SNC.

Os resultados encontrados no estudo da via GABAérgica, demonstram que o

Flumazenil foi capaz de reverter o efeito ansiolítico do diazepam, droga padrão,

diminuindo a frequência de entradas e tempo nos braços abertos, resultado

esperado e amplamente discutido na literatura (FAJEMIROYE et al., 2012; ISHOLA,

et al., 2012). Da mesma forma o Flumazenil reverteu o efeito do óleo de C.

ambrosioides, resultado previsto como em testes de outras plantas ansiolíticas (REX

et al., 2002; KIM et al., 2004; GRUNDMANN et al., 2007). Consequentemente, nas

administrações dos antagonistas GABAA, bicuculina e GABAB, baclofeno, houve

bloqueio da ação do OECA, demonstrando uma alta afinidade do óleo com o

mecanismo GABAérgico de transmissão neuronal.

Sumarizando, através dos testes realizados foi possível delimitar o efeito do

óleo essencial de C. ambrosioides (OECA) no SNC, elucidando pelo menos em

parte, o mecanismo de ação da propriedade ansiolítica e estabelecer certa

semelhança ao efeito ansiolítico clássico dos benzodiazepínicos. Foi representado

no esquema na Figura 22 um resumo dos resultados encontrados e as possíveis

vias de neurotransmissores ligadas ao mecanismo de ação do óleo essencial de C.

ambrosioides. O esquema demonstra que OECA tem efeito hipnótico, ansiolítico, e

anticonvulsivante (mas não antidepressivo e depressor motor), tendo o sistema

GABAergico ligado ao seu mecanismo de ação.

Finalizando a discussão dos resultados obtidos sobre a possível

aplicabilidade do uso dessa planta como remédio para tratamento da ansiedade, não

80

poderíamos deixar de comentar sobre sua segurança. A possibilidade de emprego

terapêutico em doenças do SNC limita-se, visto que o ascaridol (principal

componente do óleo), em altas concentrações ou na utilização por um longo

período, pode induzir toxidade com sintomas de convulsão, vômito, dor de cabeça,

vertigem (PEREIRA et al., 2010) e hepatotoxicidade (DERRAJI et al., 2014). Dessa

forma, estudos toxicológicos com o OECA devem ser conduzidos. Entretanto, outro

componente majoritário do óleo, o p-cimeno apresenta relatos de baixa toxicidade na

literatura (KOBA et al., 2010), abrindo a possibilidade de isolamento e testes

posteriores, a fim de identificar os efeitos de cada componente no SNC.

Figura 22: Esquema representativo de possíveis sistemas de neurotransmissão afetados nos testes do OECA.

--- Parcialmente ligada à ação do óleo de C. ambrosioides - Diretamente lidada à ação do óleo de C. ambrosioides

Planta Chenopodium ambrosioides L.

OECA

Sistema motor

Ansiedade Hipnose

Depressão Convulsão

Sistema Gabaérgico

Sistema Monoaminérgico

GABAA GABAB BDZ-R

81

7 CONCLUSÕES

Os resultados obtidos durante o desenvolvimento no presente estudo

confirmam os efeitos centrais C. ambrosioides através de estudo pré-clinicos e

validam em parte o uso do OECA em distúrbios do SNC, sobretudo os distúrbios do

sono e a ansiedade.

Os experimentos demonstraram que o óleo essencial de C. ambrosioides tem

propriedade ansiolítica e hipnótica, assim como um potencial neuroprotetor contra

crises convulsivas.

O mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do OECA, parece envolver

o sistema GABAérgico e ser parcialmente mediado pelo sistema monoaminérgico.

No entanto, estudos adicionais de toxicologia são necessários para a avalição

da segurança do uso do OECA para fins terapêuticos.

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