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UNIVERSIDADE CEUMA – UNICEUMA
GERÊNCIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
ISRAEL VIEGAS MOREIRA
Detecção de atividade antimicrobiana de microrganismos isolados
de solos do Maranhão
São Luís - MA
Outubro / 2015
2
ISRAEL VIEGAS MOREIRA
Detecção de atividade antimicrobiana de microrganismos isolados
de solos do Maranhão
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Biologia Parasitária da
Universidade CEUMA, como requisito para a
obtenção do título de Mestre em Biologia
Parasitária.
Orientado: Israel Viegas Moreira
Orientador: Prof. Dr. Valério Monteiro Neto
Co-orientadora, Profª. Dra. Maria Rosa
Quaresma Bomfim
São Luís - MA
Outubro / 2015
3
Moreira, Israel Viegas.
Detecção de atividade antimicrobiana de microrganismos isolados
de solos do Maranhão/ Israel Viegas Moreira. São Luís:
UNICEUMA, 2015.
75 p.: il. color.
Dissertação (Mestrado) – Programa de pós-graduação em
Biologia Parasitária. Universidade CEUMA, 2015.
1. Bioprospecção. 2. Microrganismos. 3. Atividade antimicrobiana. I.
Monteiro Neto, Valério (Orientador). II. Título.
CDU: 579.67:631.4 (812.1)
CDU: 579.67:631.4 (812.1)
M835d
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ISRAEL VIEGAS MOREIRA
Detecção de atividade antimicrobiana de microrganismos isolados
de solos do Maranhão
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em
Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / , considerou
o(a) candidato(a)
( ) APROVADA ( ) REPROVADA
1) Examinador ________________________________________
2) Examinador _________________________________________
3) Examinador _________________________________________
4) Presidente (Orientador)_________________________________
5
“Eu guardei muitas coisas em minhas mãos, e perdi todas. Mas todas que coloquei nas
mãos de Deus, essas eu ainda possuo” (Marthin Luther King)
6
Aos meus pais, João Furtado e Severina Viegas, pelo ensino, dedicação e amor.
7
A minha esposa Joama Gusmão, pela dedicação, incentivo, paciência e seu amor.
8
Agradecimentos
Agradeço a Deus pelo seu amor, graça e misericórdia, por ser o criador de
todas as coisas, inclusive de bactérias e fungos, e sustentador da vida. Agradeço
por ter escutado minha oração quando clamei por resultados.
À minha família, que tem imenso amor por mim.
Ao Prof. Dra. Valério Monteiro Neto, pela orientação, disposição,
conhecimento e competência. Obrigado pela convivência agradável e confiança no
desenvolvimento deste trabalho.
Agradeço sem medida à minha co-orientadora, Profª. Dra. Maria Rosa
Quaresma Bomfim pela paciência, confiança, conhecimento e dedicação. Obrigado
pela convivência amável.
À Profª Cristina Monteiro, pela participação neste trabalho.
Agradeço à Márcia Barros, pela sua Importante contribuição laboratorial.
Ao Prof Stelito pelo seu companheirismo, coleta de amostras e conversas
incentivadoras.
Agradeço à Profª Andrea Pires, da Universidade Federal do Maranhão, pela
apoio.
À Monique do Carmo pelo conhecimento transmitido, ajuda técnica e atos de
gentileza.
À Margareth Penha, por todos os atos de ajuda, empenho e palavras
incentivadoras.
À todos os professores do Mestrado em Biologia Parasitária pelos
conhecimentos adquiridos.
Aos meus irmãos Júnior e Geovane pelo incentivo e amor dispensado.
Aos meus sobrinhos Alayne e Higor pela contribuição de coleta de amostras.
À Dário Gusmão, Marcos Antônio, Diná Elda, Rilton Filho e Rilton Neto pelas
numerosas coletas.
Aos colegas, alunos do mestrado, pelos momentos agradáveis e de
aprendizagem vividos.
À FAPEMA, pelo auxílio financeiro.
Por fim, agradeço àquelas pessoas que contribuíram direta ou indiretamente
na realização desta pesquisa.
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RESUMO
A detecção de antibióticos produzidos por microrganismos do solo tem proporcionado a maior parte do arsenal disponível para o combate das doenças infecciosas no mundo. O crescente aumento de microrganismos multidroga-resistentes (MDR) e a falta de opções terapêuticas têm levado a busca de novos antibióticos, principalmente de microrganismo do solo. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar a presença de microrganismos produtores de substâncias com atividade antimicrobiana em solos oriundos de diferentes ecossistemas do Estado do Maranhão. As amostras de solo foram coletadas no período de julho de 2011 a abril de 2013 em dezenove cidades do norte e do leste do Estado do Maranhão que compreenderam solos de restinga, cerrado, campo e mata de transição. Os isolamentos dos microrganismos foram realizados por diluições das amostras e inoculação em ágar cobre, ágar Sabouraud-dextrose e ágar amido-caseína. Os isolados foram submetidos a triagem inicial da atividade antimicrobiana com as linhagens de referência Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Candida albicans (ATCC 18804), utilizando o método de ágar difusão e também contra isolados clínicos MDR, incluindo-se: Enterococcus faecalis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas. aeruginosa, S. aureus e C. albicans. Posteriormente, os isolados com atividade antimicrobiana foram identificados por sequenciamento de região do rDNA da subunidade 16S, no caso de bactérias, e das regiões ITS1 e ITS4, para os fungos. Foram isolados 599 microrganismos, destes 95 (15,9%) apresentaram atividade antimicrobiana contra pelo menos um dos microrganismos ATCC avaliados. Entre os isolados, 79 (83,2%) bactérias e 16 (16,8%) eram fungos. Um total de 60 (63,2%) isolados apresentou atividade inibitória do crescimento contra uma única cepa padrão, enquanto que 35 (36,8%) apresentaram atividade antimicrobiana contra duas ou três das cepas padrão empregadas (S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 e C. albicans ATCC 18804). Quanto à atividade antimicrobiana contra bactérias MDR e fungo de origem clínica, 43 (58,9%) isolados do solo apresentaram atividade contra uma única cepa, enquanto que 18 (24,7%) inibiram duas das cepas empregadas no ensaio, incluindo C. albicans, E. faecalis e/ou S. aureus. Doze isolados (16,4%) apresentaram atividade contra três a sete microrganismos, simultaneamente. A maior frequência de isolados com atividade inibitória do crescimento específica foi observada em 36 (49,3%) isolados do solo contra C. albicans, seguida da atividade contra S. aureus MDR evidenciada em seis (8,2%) microrganismos. A análise de identificação genotípica dos isolados avaliados neste estudo evidenciou 40 bactérias, 39 actinomicetos e 16 fungos, os quais apresentaram a seguinte distribuição de gêneros entre as bactérias: Kitasatospora, Streptomyces, Bacillus, Burkholderia, Paenibacillus e Pseudomonas. Quanto aos fungos filamentosos foram identificados três gêneros: Aspergillus, Penicillium, e Trichoderma. Em suma, foi demonstrado que o solo do Estado do Maranhão contém microrganismos com ação antimicrobiana, principalmente bactérias, com maior frequência de atividade inibitória contra fungos, além da ação contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas ou ambas. Alguns podem representar microrganismos ainda não conhecidos ou caracterizados, considerando as suas características fenotípicas e moleculares.
Palavras chave: Bioprospecção, microrganismos, atividade antimicrobiana.
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ABSTRACT
Detection of antibiotics produced by soil micro-organisms has provided most of the available
arsenal to combat infectious diseases in the world. The increasing number of multidrug-
resistant organisms (MDR) and the lack of therapeutic options have led to the search for new
antibiotics, especially from soil microorganisms. Therefore, the aim of this study was to
investigate the presence of microorganisms that produce substances with antimicrobial
activity in soils from different ecosystems in the state of Maranhão. Soil samples were
collected from July 2011 to April 2013 in nineteen cities in the north and east of the
Maranhão State who understood sandbank land, savanna, fields and transition forest. The
isolation of microorganisms was carried out by plating tenfold dilutions of samples onto
copper agar, Sabouraud dextrose agar, and starch-casein agar. Microbial isolates were
subjected to initial screening of antimicrobial activity with the reference strains of
Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) and Candida albicans
(ATCC 18804) using the agar diffusion method and also against MDR isolates, including:
Enterococcus faecalis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas. aeruginosa, S. aureus
and C. albicans. Subsequently, the antimicrobial isolates were identified by sequencing rDNA
region of the 16S subunit, in the case of bacteria, and the ITS1 and ITS4 regions for fungi. Of
599 isolated microorganisms, 95 (15.9%) showed antimicrobial activity against at least one of
the evaluated ATCC microorganisms. Of these isolates, 79 (83.2%) were bacteria and 16
(16.8%) were fungi. A total of 60 (63.2%) isolates showed growth inhibitory activity against a
single reference strain, whereas 35 (36.8%) showed antimicrobial activity against two or
three of standard strains used (S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 and C. albicans
ATCC 18804). Regarding antimicrobial activity against MDR bacteria and fungi of clinical
origin, 43 (58.9%) isolates showed activity against a single strain, while 18 (24.7%) inhibited
two of the strains used in the assay, including C. albicans, E. faecalis and/or S. aureus.
Twelve isolates (16.4%) showed activity against three to seven microorganisms,
simultaneously. The higher frequency of isolates with specific growth inhibitory activity was
observed in 36 (49.3%) isolates from soil against C. albicans, followed by the activity against
MDR S. aureus evidenced in six (8.2%) microorganisms. Genotypic identification analysis of
the isolates in this study showed 40 bacteria, 39 actinomycetes and 16 fungi, which showed
the following distribution of genders among bacteria: Kitasatospora, Streptomyces, Bacillus,
Burkholderia, Paenibacillus and Pseudomonas. Regarding filamentous fungi, three genera
were identified: Aspergillus, Penicillium, and Trichoderma. In sum, it was demonstrated that
soil samples of Maranhão contains microorganisms with antimicrobial activity, mainly
bacteria, most commonly inhibitory activity against fungi, and also action against Gram-
positive bacteria, Gram-negative or both microorganisms. Some may represent
microorganisms not known yet or characterized, considering their phenotypic and molecular
characteristics.
Keywords: Bioprospecting, microorganisms, antimicrobial activity
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Marcos históricos dos antibióticos.................................................... 19
Figura 2 Mortes atribuídas à resistência antimicrobiana por ano até 2050
21
Figura 3 Ecossistemas do estado do Maranhão............................................ 26
Figura 4 Municípios onde foram coletas amostras de solos.........................
28
Figura 5 Esquema de isolamento de microrganismos do solo e fragmento de meio de cultura após crescimento dos isolado...........................
30
Figura 6 Esquema da atividade antimicrobiana de isolado do solo contra
bactérias ATCC................................................................................
31
Figura 7 Esquema da atividade antimicrobiana de isolado do solo contra microrganismos de isolados clínicos................................................
32
Figura 8 Pesquisa da atividade antimicrobiana em isolados do solo pelo método de difusão em ágar..............................................................
32
Figura 9 Esquema do teste de atividade enzimática dos isolados do solo antes e após ebulição......................................................................
34
Figura 10 Esquema da atividade antimicrobiana de isolado do solo contra microrganismos ATCC com fragmentos após ebulição...................
34
Figura 11 Teste de produção de protease de isolado do solo em Ágar Mueller Hinton adicionado de “Skim Milk”........................................
35
Figura 12 Teste de produção de lípase dos isolados do solo em Ágar Mueller Hinton com 1% de Tween-80..............................................
36
Figura 13 Teste de produção de fosfatase alcalina de isolado do solo em ágar de Sperber...............................................................................
36
Figura 14 Demonstração do perfil de crescimento de isolados microbianos recuperados de amostras de solo avaliadas neste estudo..............
40
Figura 15 Pesquisa da atividade antimicrobiana em isolados do solo pelo método de difusão em ágar..............................................................
43
Figura 16 Perfis de amplificação pela Reação em Cadeia pela Polimerase de alguns isolados do solo com os diferentes iniciadores utilizados no presente estudo...........................................................
48
Figura 17 Árvore filogenética dos isolados de Actinomicetos isoladas de diferentes tipos de solos do Estado do Maranhão...........................
54
12
Figura 18 Árvore filogenética obtida com sequencias dos isolados
identificados com o par de iniciadores universais 8F e 1492R e sequencias de bactérias existentes no Genbank.............................
55
Figura 19 Árvore filogenética mostrando o grupamento das sequencias dos fungos isolados a partir de amostras de solo do Estado do Maranhão.........................................................................................
56
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Alguns microrganismos e seus metabólitos secundários de importância industrial.......................................................................
24
Tabela 2 Número de amostras de solo e isolados microbianos testados oriundos de diferentes cidades do Maranhão .................................
42
Tabela 3 Espectro da atividade antimicrobiana dos isolados do solo testado inicialmente contra microrganismos ATCC......................................
43
Tabela 4 Atividade antimicrobiana de isolados de solo contra microrganismos ATCC por microrganismos identificados................
44
Tabela 5 Espectro da atividade antimicrobiana dos microrganismos isolados do solo contra isolados clínicos ........................................
45
Tabela 6 Atividade antimicrobiana de isolados de solo contra isolados clínicos.............................................................................................
46
Tabela 7 Avaliação da atividade enzimática dos isolados do solo em relação à atividade antimicrobiana antes e após ebulição...............
47
Tabela 8 Diversidade e frequência de microrganismos do solo identificados por sequenciamento com iniciadores desenhados para Actinobactérias, Universais para a região 16S do rDNA de bactérias e para região ITS de fungos.............................................
50
Tabela 9 Análise de similaridade genética das sequências dos isolados do solo das diferentes cidades em relação às sequências do Genbank...........................................................................................
51
14
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ATCC American Type Culture Collection
BTT Benedict
dATP Desoxiadenosina trifosfatado
dCTP Desoxicitidina trifosfatado
dGTP Desoxiguanosina trifosfatado
DNA Ácido desoxiribonucléico (do inglês, DeoxyriboNucleic Acid)
dTTP Desoxitimidina trifosfatado
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês, Ethylenediaminetetraacetic acid)
Kb Kilobase
MDR Multidroga-resistentes
PBS Solução salina tamponada com fosfato (do inglês, phosphate-buffered saline)
PCR Reação em cadeia pela polimerase (do inglês, Polymerase Chain Reaction)
TBE Tris-Borato-EDTA
TE Tris-EDTA
UFC Unidades Formadoras de Colônias
UV Ultravioleta
15
LISTA DE SÍMBOLOS
ºC Grau Celsius
µg Micrograma
µL Microlitro
µM Micromolar
mg Miligrama
MgCl2 Cloreto de magnésio
mL Mililitros
mM Milimolar
mV Milivolt
pmol Picomol
V Volts
16
SUMÁRIO
RESUMO ABSTRACT LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS LISTA DE SÍMBOLOS 1 INTRODUÇÃO........................................................................................... 15 2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................... 17 2.1 Produtos naturais....................................................................................... 17 2.2 Marcos históricos dos antibióticos............................................................. 18 2.3 Novos antibióticos...................................................................................... 20 2.4 Resistência microbiana.............................................................................. 20 2.5 Bactérias produtores de antimicrobianos................................................... 22 2.6 Fungos produtores de antimicrobianos...................................................... 23 3 Justificativa................................................................................................. 25 4 OBJETIVOS............................................................................................... 27 4.1 Objetivo Geral............................................................................................ 27 4.2 Objetivos Específicos................................................................................. 27 5 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................... 28 5.1 Coleta e processamento das amostras de solo ........................................ 28 5.2 Isolamento e identificação de microrganismos produtores de antibióticos
presentes no solo ...................................................................................... 29
5.3 Atividade Antimicrobiana............................................................................ 30 5.4 Testes de atividade enzimática.................................................................. 33 5.4.1 Pesquisa de atividade de proteases.......................................................... 35 5.4.2 Pesquisa de atividade de lipases............................................................... 35 5.4.3 Pesquisa de atividade de fosfatase alcalina.............................................. 36 6 Caracterização molecular dos isolados .................................................... 37 6.1 Extração de DNA....................................................................................... 37 6.2 Amplificação e análise dos amplicons....................................................... 37 6.3 Identificação genotípica dos isolados pelo sequenciamento do
fragmento amplificado de DNA.................................................................. 39
7 RESULTADOS........................................................................................... 40 7.1 Isolados de solo com atividade antimicrobiano de diferentes cidades do
Maranhão...................................................................................................
38
7.2 Atividade antimicrobiana de isolados contra cepas de referência............. 41 7.3 Atividade antimicrobiana dos isolados do solo contra amostras clínicas... 44 7.4 Avaliação da atividade enzimática de proteases, lipases e fosfatase
alcalina e atividade antimicrobiana após ebulição.....................................
46
7.5 Identificação molecular dos isolados do solo ............................................ 47 7.6 Análise de similaridade genética das sequências dos isolados em
relação às sequências do Genbank........................................................... 48
08 DISCUSSÃO.............................................................................................. 57 09 CONCLUSÕES.......................................................................................... 65 10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 66
15
1 INTRODUÇÃO
Na natureza encontra-se um número gigantesco de produtos naturais que
beneficiam o ser humano, entre esses estão os compostos químicos com finalidade
para a saúde. Uma grande parte deles é produzida por microrganismos pertencentes
ao solo (BÉRDY, 2005).
A indústria internacional farmacêutica ao longo da história tem explorado
produtos naturais e entre eles os antibióticos, os quais são produzidos por diversos
gêneros de microrganismos (HARVEY, 2008).
A detecção de microrganismos do solo que produz algum tipo de metabólito
com atividade biológica e a industrialização destes produtos metabólicos
proporcionaram a maior parte do arsenal antimicrobiano atual, para o combate das
doenças infecciosas. A corrida por novos antimicrobianos nos últimos anos foi
gerada pelo crescente aumento de agentes infecciosos resistentes a vários
antimicrobianos (RICE, 2008).
Algumas bactérias multirresistentes têm sido alvo de preocupação na saúde
pública como: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococos
aureus, espécies de Enterococcus e de Enterobactéria. Os fungos também têm
causado preocupação pela ocorrência de linhagens multidroga-resistentes como
Candida albicans e espécies Aspergillus (PIDOT, 2014). Esse cenário e a falta de
novos antimicrobianos tem ocasionado novos investimentos direcionados às
pesquisas com solo, inclusive com apoio das ferramentas da biologia molecular
(BUSTI et al., 2006a).
Alguns gêneros de bactérias e fungos têm se destacado como produtores de
antibióticos. Entre as bactérias o gênero Bacillus, as cianobactérias, espécies de
Pseudomonas e actinomicetos, especialmente do gênero Streptomycetes, são
fontes de compostos com inúmeras atividades biológicas. Estes compostos têm
aplicação na antibioticoterapia, agentes anticancerígenos e outros compostos
farmacêuticos (BIBB, 2005; PIDOT, 2014).
Os antibióticos sintetizados por fungos possuem um percentual menor
comparado às bactérias, porém, não menos importante no combate e controle de
doenças infecciosas. Podem ser citados alguns importantes gêneros como
Aspergillus, Cephalosporium e Penicillium, (YU; KELLER, 2005).
16
O Estado do Maranhão possui uma variedade de ecossistemas, incluindo
manguezais, cerrados, restingas, florestas e campos, os quais apresentam uma
biodiversidade de microrganismos com potencial de produção de novos compostos
químicos com atividade antimicrobiana.
17
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Produtos naturais
As bactérias e fungos estão presentes em todos os ambientes naturais. No
solo, esses microrganismos possuem papel importante nos ciclos do carbono,
nitrogênio e enxofre e são os principais agentes na decomposição de matéria
orgânica e exercendo influência na fertilidade do solo (POTTER; MEYER, 1990).
Os microrganismos tem a capacidade de inibir outros microrganismos,
através da produção de metabólitos secundários, objetivando manter a
sobrevivência de suas espécies no seu habitat e, algumas vezes, pela competição
de recurso entre os microrganismos (OSBURNE et al., 2000).
O metabolismo primário é composto por atividades metabólicas associadas
ao crescimento celular, representadas principalmente por enzimas, ácidos orgânicos
e etanol, Enquanto a síntese de metabólitos secundários ocorre no fim ou durante a
fase estacionaria, podendo acontecer por via ribossomal ou não-ribossomal. Esses
metabólitos não são essenciais a vida, portanto, não participam do crescimento
celular (KLEINKAUF; VON DOHREN, 1996).
A produção de metabólitos secundários é de grande interesse para a
comunidade cientifica, devido às suas propriedades farmacêuticas, como os
antibióticos, mas também são importantes pelos seus produtos tóxicas (YU;
KELLER, 2005). Entre os metabólitos secundários gerados por microrganismos com
atividade antimicrobiana estão por exemplo, os policetídeos (PK) não ribossômicos,
produzidos pelas enzimas policetídeo sintases (PKS) e peptídeos sintetase não-
ribossomal (NRPS) (WENZEL; MULLER, 2005). Eles são produzidos naturalmente
por inúmeras espécies de microrganismos, principalmente por fungos e bactérias, e
podem apresentar várias atividades farmacológicas como: antibióticas, antitumorais,
antifúngicas, agentes imunossupressores, antivirais (YADAV; GOKHALE;
MOHANTY, 2003). Como exemplo de antimicrobiano policetídeos podemos citar o
macrolídeo (eritromicina), a ansamicina (rimamicina) e o poliene (anfotericina )
(STAUNTON; WEISSMAN, 2001).
18
2.2 Marcos históricos dos antibióticos
Em 1877, Pasteur e seu auxiliar Jules Joubert foram os primeiros a mostrar
interesse em produtos microbianos como agentes terapêuticos. A partir das suas
observações sobre a capacidade do bacilo do antraz inibir a multiplicação de outros
microrganismos (TAVARES, 2006).
No entanto, Jean Paul Vuillemin foi quem primeiro utilizou o termo antibiose,
para drogas antibacterianas, e expressar que são “contra vida” (FOSTER; RAOULT,
1974) o que foi descrito, em 1877, por Louis Pasteur e Robert Koch (LANDSBERG,
1949). Em 1909, um composto sintético de arsênio chamado Salvarsan, foi
introduzido para tratar pela primeira vez a sífilis (LLOYD et al., 2005).
Posteriormente, Domagk, em 1932, descobriu que um pigmento de cor
vermelha, usado como corante denominado de protosil, possuía atividade
antibacteriana, neste momento descobria-se as sulfas. Esse evento foi o início para
o surgimento de várias outras sulfas que foram produzidas até 1942, como
sulfadiazina, sulfatiazol, sulfaguanidina e sulfamerazina (DOMAGK, 1935).
Em 1942, o termo antibiótico foi usado por Waksman (1947) como
substância elaborada por seres vivos com a capacidade tóxica seletiva usada em
pequenas quantidades sobre os microrganismos. Posteriormente, em 1943, esses
pesquisadores descobriram a estreptomicina, a partir da cultura de Streptomyces
griseus, o que revolucionou o tratamento das infecções por bacilos Gram-negativos
e também por Mycobacterium tuberculosis (WOODRUFF, 2014).
Contudo, a maioria dos antibióticos foi descoberta no período entre 1940 e
1960, designado a “era de ouro” dos antibióticos (BALTZ, 2008; AMINOV, 2010). Na
realidade, esse período foi iniciado com a descoberta da penicilina por Alexander
Fleming, em 1929, quando observou-se que colônias de Staphylococcus aureus,
semeadas em placa de Petri, haviam sido mortas por um composto produzido por
um fungo contaminante, o Penicillium notatum (FLEMING, 1929). Anos depois esse
composto foi isolado e denominado de penicilina, muito usado durante a segunda
guerra mundial (DEMAIN; SANCHEZ, 2009).
O uso clínico da penicilina, em 1940, impulsionou a busca e descobertas de
inúmeros antibióticos, principalmente a partir de culturas de actinomicetos e de
fungos do solo), proporcionando a identificação das tetraciclinas, cefalosporinas,
aminoglocosídeos, macrolídeos, cloranfenicol, glicopeptídeos e rifamicinas, os quais
19
formam a base atual do arsenal terapêutico contra vários agentes infecciosos (2005;
BÉRDY, 2005; PELÁEZ, 2006; OVERBYE; BARRETT, FERNANDES, 2006).
Segui-se a descoberta da neomicina, em 1948, por Lechevalier e Waksman,
um aminoglicosídeo produzido pelo Streptomyces fradiae. Posteriormente, em 1953,
a candicidina, um composto produzido pelo Streptomyces griseus utilizado como
produto antifúngico tópico (DEMAIN, 2006).
Figura 1. Marcos históricos dos antibióticos.
Fonte: Modificado de Wright, Nat. Rev. Microbiol., 2007.
20
2.3 Novos antibióticos
A Associação Americana Food and Drug Administration (US-FDA) aprovou
os dois antibióticos resultantes das modificações da tetraciclina a tigeciclina, primeira
glicilciclina, tendo suas vantagens em termos de espectro, potência e propriedades
farmacocinéticas (COATES et al., 2002). Nos últimos 30 anos, somente a
dalfopristina, daptomicina, platensimicina e linezolida foram inseridos na classe de
novos antibióticos, de forma que a última é considerada uma droga totalmente
sintética (OVERBYE; BARRETT, 2005; COATES et al.,2002; WANG et al., 2006).
Além de antibióticos, muitos metabólitos secundários extraídos de
microrganismos são utilizados como: agentes antitumorais, imunossupressores,
hipocolesterolêmico, inibidores enzimáticos, anti-enxaqueca e antiparasitário
(DEMAIN; FANG, 1999).
Com a descoberta das sulfonamidas e da penicilina os infectologistas da
época imaginaram que a problemática das infecções bacterianas tinha terminado.
No entanto, na década de 30, surgiram alguns casos de infecção por Streptococcus
pyogenes que não respondiam ao uso de sulfas. Posteriormente, na década de 40,
foram isolados S. aureus apresentando resistência às penicilinas (LEVY;
MARSHALL, 2004; PIDOT et al., 2014).
2.4 Resistência microbiana
Estudos mostram que a forma como os antibióticos têm sido utilizados na
medicina, na agricultura e na pecuária tem promovido uma rápida disseminação de
microrganismos resistentes (CHAIT; VETSIGIAN; KISHONY, 2012). O uso abusivo e
de forma indiscriminada, tem sido o principal fator para a emergência de
microrganismos resistentes aos antibióticos (DOERN; TILLOTSON, 2002). O
aumento e a disseminação da resistência aos antibióticos tem se constituído um
grande desafio para a ciência e a medicina principalmente. Segundo a American
Academy of Microbiology (2003), a resistência aos agentes antimicrobianos é uma
consequência natural, inevitável e irreversível do microrganismo, pela seleção frente
à exposição continuada aos antimicrobianos.
Um grande número de bactérias, principalmente as que circulam no
ambiente hospitalar tem demonstrado resistência a múltiplas drogas (MDR, multidrug
21
resistance) o que gera grandes desafios no tratamento. Como exemplo de bactérias
nosocomiais podem ser citadas as mais comumente encontradas, tais como:
Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, A. baumannii, S. aureus,
Enterococcus spp. e várias espécies de Enterobactérias (BOUCHER; TALBOT;
BRADLEY, 2009; LEWIS, 2013; PIDOT, 2014). Relato recente demonstrou a
ocorrência de linhagens multidroga-resistentes de Mycobacterium tuberculosis,
Candida albicans e Aspergillus spp. O crescente aumento da resistência bacteriana,
associado ao investimento reduzido na pesquisa de novos antibióticos poderá tornar
sem eficácia a terapêutica de muitas doenças infecciosas bacterianas, levando a
humanidade de volta a era pré-antibiótica podendo chegar a inúmeras mortes por
ano, mostrado na Figura 2 (NEILL, J. O., 2014; PIDOT et al., 2014; OVERBYE;
BARRETT, 2005).
Figura 2. Mortes atribuídas à resistência antimicrobiana por ano até 2050.
Fonte: Neill, J. O. (2014)
22
2.5 Bactérias produtoras de antimicrobianos
Historicamente, os produtos naturais têm um papel importante na síntese de
muitos antibióticos (NEWMAN, CRAGG; 2007). Como fonte destes produtos,
encontram-se os microrganismos do solo, especialmente os actinomicetos, pois têm
sido a fonte de vários antibióticos, tais como estreptomicina, gentamicina,
cloranfenicol, actinomicina, eritromicina e vancomicina, para citar somente alguns
(CLARDY; 2005).
Os actinomicetos são bactérias produtoras de antibióticos e de outros
compostos bioativos. Eles compreendem um grande grupo de bactérias Gram-
positivas, geralmente filamentosas e esporuladas, com elevado conteúdo de guanina
e citosina no seu material genético, sendo o seu ácido desoxirribonucleico (DNA)
constituído de 57 a 75%, dessas bases (BHATTACHARJEE; BANERJEE; JOSHI,
2012). Possuem em torno de 2.500 espécies, as quais estão distribuídas em 238
gêneros, 37 famílias e nove subordens conhecidas (MÜLLER; WINK, 2014). Elas
têm fornecido cerca de dois terços dos antibióticos conhecidos e continuam a ser a
maior fonte de recursos para descoberta de novos compostos (BÉRDY, 1989). A
ordem Actynomycetales compreende mais de 80 gêneros, como: Micromonospora,
Nocardia e Saccharopolyspora que produzem aminoglicosídeos; Micromonospora e
Saccharopolyspora que sintetizam macrolídeos; Amycolatopsis mediterranei que
produzem ansamicinas (rifamicina); Amycolatopsis orientalis (vancomicina) e
Actinoplanes teichomyceticus (teicoplanina) (EMBLEY, 1994; VARA et al., 2002)
podendo haver outros ainda não conhecidos. A maioria dos metabólitos bioativos
com atividade antibiótica foi isolada de espécies de Streptomyces, um dos gêneros
pertencentes a essa ordem (STACKEBRANDT; RAINEY; WARD-RAINEY, 1997).
Em ambientes naturais como água, plantas, sedimentos e, principalmente,
solo, é possível a detecção de uma quantidade elevada de actinomicetos e outras
bactérias produtoras de substâncias com atividade antibiótica. Estima-se que cerca
de 10% dos isolados bacterianos, em determinadas condições de cultura, têm sido
testadas e menos de 1% do total de produtos naturais tem sido identificado,
podendo significar que uma grande quantidade de metabólitos poderá ser
descoberta e estudada (FISCHBACH; WALSH, 2009; WATVE; TICKOO; JOG,
2001).
O gênero Streptomyces foi proposto por Waksman e Henrici (1943). Muitas
espécies pertencentes a este gênero têm contribuído pela sua capacidade de
23
produção de inúmeros produtos naturais e elevada importância comercial, incluindo
os antibióticos. As espécies pertencentes ao gênero de Streptomyces contem
aproximadamente 649 espécies e 38 subespécies (LEE et al., 2014).
Além dos actinomicetos, outros gêneros bacterianos, tais como:
Myxobacteria, Cyanobacteria, algumas espécies do gênero Pseudomonas e os
Bacillus têm participado como importantes fontes de metabólitos secundários
aplicados na antibioticoterapia (YILMAZ; SORAN; BEYATLI, 2006; MÜLLER; WINK,
2014).
2.6 Fungos produtores de antimicrobianos
Além das bactérias, os fungos constituem outro importante grupo de
microrganismos produtores de substâncias com atividade antimicrobiana. Eles são
classificados como eucariontes e heterotróficos. Eles estão distribuídos em
diferentes locais como solo, água, parasitas de plantas, peixes, insetos e animais
(FEOFILOVA, 2001).
A produção de metabólitos secundários por fungos é um processo complexo
e, em muitos casos, desconhecido, pois leva em consideração o desenvolvimento
morfológico. Tais compostos têm muitas aplicações para a indústria farmacêutica,
incluindo-se a de antibióticos (YU; KELLER, 2005). Entre os inúmeros metabólitos
secundários produzidos pelos fungos, algumas são tóxicas, como as micotoxinas,
que tem poder carcinogênico elevado e são produzidos principalmente pelos fungos
filamentosos Penicillium, Aspergillus e Fusarium, outras são atóxicas, como a
griseofulvina produzida pelo fungo Penicillium griseofulvum que é utilizada no
tratamento de micoses da pele, cabelos e unhas (GUPTA; SAUDER; SHEAR, 1994).
Os antibióticos produzidos pelo Penicillium chrysogenum (Penicillium
notatum) e outras espécies de Penicilium são usados pela indústria farmacêutica na
produção de antibióticos betalactâmicos realizando modificações do anel
betalactâmicos formando penicilinas semissintéticas, como amoxicilina, ampicilina,
oxacilina, meticilina, carbenicilina, ticarcilina e piperacilina (ROLINSON; GEDDES,
2007).
O fungo Cephalosporium acremonium, produz a cefalosporina C e dela são
sintetizados vários representantes desta importante classe de antibióticos (DEMAIN;
ZHANG, 1998). As Cefalosporinas podem ser classificadas por gerações como
24
exemplo podemos citar as de primeira geração: cefalotina, cefadroxil, cefazolina,
cefalexiana; segunda geração: cefuroxima, cefaclor, cefoxitina; terceira geração:
ceftriaxona, cefotaxima, ceftazidima; quarta geração: cefpiroma, cefepime
(ROLINSON; GEDDES, 2007).
Além de compostos antibacterianos, várias metabólitos secundários também
possuem atividade antifúngica, incluindo-se polienos (anfotericina B), azóis
(cetoconazol, itraconazol, fluconazol e voriconazol) e flucitosina, entre outros
(DENNING, 2003). Mais recentemente, uma nova classe de antifúngico tem sido
proposta, a equinocadina, a qual possui como representantes a anidulafungina,
caspafungina e a micafungina (KOFLA; RUHNKE, 2011; CHEN et al.,2013).
Outros importantes metabólitos secundários e o seu respectivo
microrganismo produtor estão mostrados na Tabela 1 (BARRIOS-GONZALEZ;
TOMASINI, 2003).
Tabela 01. Alguns microrganismos e seus metabólitos secundários de importância
industrial.
Atividade Exemplo Microrganismo produtor
Antibacteriana Cefalosporina Acremonium chrysogenum
Cefamicina Streptomyces glavuligerus
Cloranfenicol Streptomyces venezuelae
Eritromicina Saccharopolyspora erythraea
Kanamicina Streptomyces hanamyceticus
Tetraciclina Streptomyces aureofaciens
Penicilina Penicillium chrysogenum
Rifamicina Amycolatopsis mediterranei
Esptinomicina Streptomyces spectablis
Estreptomicina Streptomyces griseus
Antifúngica Anfotericina Streptomyces nodosus
Ácido aspergillico Aspergillus flavus
Aureofacina Streptomyces aureofaciens
Candicidina Streptomyces griseus
Griseofulvina Penicillium griseofulvum
Nistatina Streptomyces nourse
Oligomicina Streptomyces diastachromogenes
Fonte: Adaptado de (BARRIOS-GONZALEZ; TOMASINI , 2003).
25
3. Justificativa
O crescente aumento da resistência microbiana tem gerado uma crise na
saúde pública mundial. A Organização Mundial de Saúde prevê uma catástrofe
devido a esse fenômeno e aponta para a necessidade de grandes investimentos e a
rápida produção de novos antimicrobianos, com o objetivo de contornar a resistência
microbiana (COOPER; SHLAES, 2011).
No entanto, o que tem ocorrido é uma diminuição de indústrias que
desenvolvem projetos visando a descoberta de novos antimicrobianos. Entre 1993 e
2012 existiam mais de vinte grandes indústrias envolvidas nessa área, enquanto que
em 2013 foram relacionados somente quatro grandes indústrias farmacêuticas
investindo em novos antimicrobianos (SHLAES et al., 2013). Este desinteresse da
indústria é justificado pelos grandes investimentos econômicos na descoberta de
novas drogas antimicrobiana e também pelos testes clínicos exigidos pelos órgãos
fiscalizadores de saúde, isso faz com que as indústrias invistam em outros
medicamentos mais lucrativos (PENESYAN; GILLINGS; PAULSEN, 2015).
Atualmente existem poucos antibióticos realmente novos, encontrando-se
apenas variações de classes já conhecidas. Isso conduz a grandes investimentos
para a modificação das moléculas e antibióticos já existentes. Outro problema é que
há uma maior predisposição para a adaptação bacteriana, com seleção de mutantes
resistentes, uma vez que a base da estrutura primaria de vários antibióticos tem sido
empregada há décadas (FERNANDES, 2006).
Ressalta-se a importância de mais estudos que propiciem a descoberta de
novas espécies de microrganismos, bem como a produção de novos metabólitos
que possam ser utilizados como antimicrobianos. Neste contexto, o Estado do
Maranhão possui vários ecossistemas, ainda não estudados em termos de
microbiota produtora de antimicrobianos. Esses ecossistemas incluem manguezais,
cerrados, restingas, florestas, campos, entre outros (Figura 3). Desta forma, há a
possibilidade de detecção de novas espécies de microrganismos produtores de
novas moléculas com atividade antibiótica.
26
Figura 3. Ecossistemas do estado do Maranhão.
Fonte: MARTINS; GALILEO; MARIA HELENA, 2009.
27
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
Investigar a presença de microrganismos produtores de substâncias com
atividade antimicrobiana em solos oriundos de diferentes ecossistemas do Estado do
Maranhão.
4.2 Objetivos Específicos
Avaliar a atividade antimicrobiana dos microrganismos isolados do solo e seu
antagonismo contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e fungos,
incluindo-se microrganismos de referência (ATCC) e isolados clínicos;
Identificar os microrganismos isolados do solo pelo sequenciamento do gene
rDNA da subunidade 16S para bactérias e de sequências das regiões ITS de
DNA para os fungos;
Verificar se há relação entre atividade antimicrobiana e a produção das
enzimas fosfatase alcalina, lipases e proteases.
28
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Coleta e processamento das amostras de solo
As amostras de solo foram coletadas entre julho de 2011 a abril de 2013 em
dezenove cidades do norte e do leste do Estado do Maranhão. As áreas de coletas
compreenderam municípios com vegetações de restinga, cerrado, campo e mata de
transição. As amostras de solo foram coletadas em locais sem influência antrópica,
até uma profundidade de 10 cm. Os 3 cm da camada superior foram descartados.
As amostras foram misturadas e transportadas em sacos plásticos tipo Zip ao
laboratório, dentro de 4h após a coleta, em recipientes isotérmicos. As amostras
foram submetidas a tamis estéril (2 mm) e processadas no Laboratório de Biologia
Parasitária e no Laboratório de Biologia Molecular do UNICEUMA. As amostras de
solos foram armazenadas a 4ºC, mostrado na Figura 4.
Figura 4: Municípios onde foram coletas amostras de solos.
Fonte: google earth
29
5.2 Isolamento e identificação de microrganismos produtores de antibióticos
presentes no solo
Para o isolamento dos microrganismos um grama de cada amostra de solo
foi suspendido em 9 mL de salina tamponada estéril (Sigma aldrich) e
homogeneizado em agitador de tubos do tipo vortex. As amostras de solo foram
submetidas a diluições seriadas decimais até 10-5 e inoculação em meios de cultura.
Em seguida, alíquotas de 100 µL das diferentes diluições foram inoculadas na
superfície de placas de Petri contendo ágar Cobre (CASIDA et al., 1987), ágar
Sabouraud-dextrose (Difco, EUA) com cloranfenicol e ágar amido-caseína,
espalhando o inoculo com alça de Drigalski. Antes da inoculação em ágar amido-
caseína, as diluições foram previamente submetidas a aquecimento a 60C por 6
minutos, para facilitar o isolamento de Actinomicetos (BHATTACHARJEE;
BANERJEE; JOSHI, 2012). Todas as placas foram incubadas a 28°C em estufa de
B.O.D de 2 a 5 dias (Figura 5). As bactérias isoladas foram estocadas em caldo BHI
com 20% de glicerol e conservadas na temperatura de -20°C. Os fungos foram
armazenados em tubos com água estéril e em tubos com ágar Sabouraud-dextrose
inclinado, os quais foram mantidos ao abrigo da luz. Os isolados foram submetidos à
pesquisa de atividade antimicrobiana. As amostras formadoras de halo de inibição
foram submetidas a testes enzimáticos e identificadas por meio de aspectos
morfotintoriais. Posteriormente, foram feitos os ensaios moleculares de amplificação
e sequenciamento genômico, da região 16S do DNA ribossomal (rDNA), no caso de
bactérias, e das regiões ITS1 e ITS4, para os fungos.
30
Figura 5. Esquema de isolamento de microrganismos do solo e fragmento de meio
de cultura após crescimento dos isolado.
Fonte: O autor (2015).
5.3 Atividade Antimicrobiana
A triagem inicial da atividade antimicrobiana dos isolados microbianos foi
realizada com as cepas de referência de Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Escherichia coli (ATCC 25922) e Candida albicans (ATCC 18804). Suspensões
padronizadas de cada microrganismo foram feitas em solução salina estéril de
acordo com o tubo No. 0,5 da escala de MacFarland (1,8 x 108 UFC/mL). Elas foram
semeadas com auxílio de swab estéril em placas contendo ágar Mueller-Hinton
(para bactérias) ou ágar Sabouraud (para fungos) (BUSTI et al., 2006b). A
determinação da atividade antimicrobiana foi realizada com os isolados microbianos
cultivados em ágar de Benedict (BTT) a 28°C por dez dias. Fragmentos cilíndricos
de diâmetro de 9 mm do meio foram obtidos e depositados sob a superfície do ágar
Mueller-Hinton (para bactérias) ou ágar Sabouraud (para fungos). Os testes foram
considerados positivos quando houve a formação de halo de inibição do crescimento
em torno dos fragmentos (Figura 6). Um fragmento de ágar BTT sem crescimento
microbiano foi empregado como controle negativo dos testes. Após os ensaios de
atividade antimicrobiana com os microrganismos padrão (ATCC), aqueles que
31
demonstraram atividade foram selecionados para os testes de antagonismo com os
seguintes isolados clínicos bacterianos MDR da coleção de culturas do Laboratório
de Microbiologia da Universidade CEUMA: S. aureus IJF1 (Benzilpenicilina,
Clindamicina, Eritromicina, Linezolida, oxacilina), E. faecalis IJF4 (ciprofloxacina,
clindamicina, eritromicina, estreptomicina, gentamicina, moxifloxacina e
norfloxacina), K. pneumoniae CNM7 (Amoxicilina + Clavulanato, Cefuroxima,
Cefalotina, Ceftazidima, ciprofloxacina e Sulfametoxazol + Trimetoprim), P.
aeruginosa IJF3 (amicacina, amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina, cafalotina,
cefepime, ceftriaxona, cefuroxima, ciprofloxacina, gentamicina, meropenem,
nitrofurantoína, norfloxacina, piperacina/tazobactam, trimetroprim/sulfametoxazol e
ácido nalidíxico) e E. coli IJF2 (ampiilina, cefalotina, ciprofloxacina, norfloxacina,
trimetroprim/sulfametoxazol e ácido nalidíxico). Além desses isolados bacterianos,
foi analisado um isolado clínico de C. albicans SV85 da coleção de cultura do
Laboratório de Micologia, gentilmente cedidos pela Profa. Dra. Cristina de Andrade
Monteiro (Figura 7).
Figura 6. Esquema da atividade antimicrobiana de isolado do solo contra bactérias
ATCC.
Fonte: O
autor (2015).
32
Figura 7. Esquema da atividade antimicrobiana de isolado do solo contra
microrganismos de isolados clínicos.
Fonte: O autor (2015).
Figura 8 Pesquisa da atividade antimicrobiana em isolados do solo pelo método de
difusão em ágar.
Fonte: O autor (2015). Legenda: Em A: Microrganismo do solo com atividade antimicrobiana
caracterizada pela formação de halo de inibição de crescimento ao redor de fragmentos de
crescimento em B microrganismo sem atividade inibitória (à direita).
A B
33
5.4 Testes de atividade enzimática
Com a finalidade de descartar a possibilidade da atividade antimicrobiana
ser devido a ação enzimática foi desenvolvido um método in house para avaliação
enzimática de Protease em agar “Skim Milk”, fosfatase alcalina com agar BHI com
1% de tween-80 e lípase em agar de Sperber. Para tal, uma alçada de cada cultivo
oriundo do caldo BHI com glicerol, foi semeado em placa com ágar BTT, incubado a
28°C e após 10 dias uma colônia de cada isolado foi repicada com auxílio de agulha
de platina para os devidos meios teste. Os resultados com atividade de protease e
fosfatase alcalina formaram uma zona clara em torno da colônia e da lípase
formação de turbidez. Em seguida o Agar BTT com crescimento de cada isolado foi
cortado em fragmentos e realizados teste sem ebulição e com ebulição. Para
realização dos testes sem ebulição fragmentos dos isolados foram adicionados
sobre a superfície de cada meio de cultura teste e estes testes apresentaram os
mesmos resultados aos das colônias repicadas. Para os testes enzimático com
ebulição fragmentos do agar BTT com crescimento dos isolados foram colocados em
frasco plástico cilíndrico, estéril, de capacidade 1,5 mL e com tampa. Estes foram
colocados no Banho-Maria a 100°C durante 10 minutos. Em seguida foram
invertidos sobre bancada de superfície plana, para solidificação do meio de cultura.
Depois eles foram abertos e realizado um corte transversal no agar utilizando um
bisturi estéril, formando um fragmento cilíndrico de 5 mm de diâmetro por 4 mm de
altura (Figura 9). Como controle para os testes enzimáticos, utilizou-se fragmentos
do meio que não foram fervidos. Os fragmentos foram transferidos com auxílio de
agulha de platina em forma de “L”, previamente flambada e esfriada, para os
respectivos meios de cultura de testes enzimáticos, conforme descrito abaixo, bem
como para os testes de atividade antimicrobiana com ATCC (Figura 10).
34
Figura 9. Esquema do teste de atividade enzimática dos isolados do solo antes e
após ebulição.
Fonte: O autor (2015).
Figura 10. Esquema da atividade antimicrobiana de isolado do solo contra
microrganismos ATCC com fragmentos após ebulição.
Fonte: O autor (2015).
35
5.4.1 Pesquisa de atividade de proteases
A atividade proteolítica foi considerada positiva quando houve a formação de
uma zona clara ao redor do inóculo por picada e fragmento, dos microrganismos
previamente cultivados em ágar BTT a 28°C/10 dias, realizados em placas de Ágar
Mueller Hinton (HIMEDIA), adicionado de 10% de “Skim Milk” (HIMEDIA), mostrado
na Figura 11 (JAGGE; BAHNER; WARREN, 1983).
Figura 11. Teste de produção de protease de isolado do solo em Ágar Mueller
Hinton adicionado de “Skim Milk”.
Fonte: O autor (2015). Legenda: Em A: teste de protease positiva com a formação de uma
zona clara em torno do fragmento testado, em B: teste de protease negativa sem a zona clara em
torno do fragmento.
5.4.2 Pesquisa de atividade lipases
Para a atividade lipolítica dos microrganismos isolados com atividade
antimicrobiana (formação de halo de inibição) foi utilizado o método descrito por
Edberg, Gallo e Kontnick (1996). Os microrganismos, previamente cultivados em
ágar BTT a 28ºC/ 10 dias, foram semeados por picada e com fragmentos de ágar,
do mesmo modo ao descrito no item 4.4 sem ebulição, da atividade antimicrobiana,
em placas com ágar BHI com 1% de Tween-80. As placas foram incubadas à
temperatura ambiente e avaliadas durante três dias. Os resultados foram
considerados positivos quando houve a formação de um halo turvo ao redor da
picada e do fragmento com crescimento em ágar BTT (Figura 12).
A B
36
Figura 12. Teste de produção de lípase dos isolados do solo em Ágar Mueller
Hinton com 1% de Tween-80.
Fonte: O autor (2015). Legenda: Em A: Teste lipofílico positivo caracterizado por aspecto turvo em torno do
fragmento, em B: teste negativo sem o aspecto turvo em torno do fragmento.
5.4.3 Pesquisa de atividade de fosfatase alcalina
Para a pesquisa de atividade de fosfatase alcalina foi utilizado o ágar de
Sperber em placa (SARIKHANI et al, 2010). Os microrganismos foram previamente
cultivados em ágar BTT a 28ºC por 10 dias, foram semeados por picada e com
fragmentos com crescimento em ágar BTT. A presença de atividade de fosfatase
alcalina foi considerada positiva quando foi observada a formação de cor azul, bem
como pela presença de um halo formado em torno da colônia e ou do fragmento de
ágar do microrganismo após 24 e 48 h (Figura 13).
Figura 13. Teste de produção de fosfatase alcalina de isolado do solo em ágar de
Sperber.
Fonte: O autor (2015). Legenda: Em A: teste de fosfatase alcalina positiva com a formação de uma
zona clara em torno do fragmento testado, em B: teste de protease negativa sem a zona clara em
torno do fragmento.
A B
A B
37
6 Caracterização molecular dos isolados
6.1 Extração de DNA
Para a obtenção do DNA molde dos isolados a ser utilizado nas reações de
amplificação pela Reação em Cadeia da Polimerase, uma alçada dos isolados que
apresentaram algum tipo de atividade antimicrobiana foi inoculada em 5 mL de caldo
BTT, incubado por 5 dias a 28°C. Após o crescimento bacteriano o conteúdo foi
centrifugado por 5 minutos a 10.000 rotações por minuto (rpm) e o sobrenadante foi
descartado. O DNA genômico foi extraído a partir do sedimento microbiano
utilizando-se o kit comercial Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega),
segundo as instruções do fabricante. O DNA dos fungos foi extraído pela técnica
trituração com bastão de vidro e areia da praia estéril (ALVES, 2011). Em seguida o
material genômico obtido foi quantificado por eletroforese de gel de agarose a 0,8%
em tampão TBE 0,5X (Tris-borato-EDTA) [100 mM Tris-base; 2,0 mM de solução 0,5
EDTA (pH 8,0) e 50 mM ácido bórico] a 85 mV durante 1 hora (SAMBROOK;
FRITSCH; MANIATIS, 2001). Após a corrida os géis foram corados em uma solução
de brometo de etídio e água destilada (0,5 µg/mL), durante 20 minutos e observados
em transiluminador de UV, comparando-se a intensidade da coloração da banda
com um padrão comercial de massa molecular. O DNA extraído foi armazenado a -
20°C até o momento do uso.
6.2 Amplificação e análise dos amplicons
Todas as 95 reações foram feitas em termociclador Amplitherm e cada tubo
de reação recebeu 12,5 μL do Master Mix PCR-kit (Promega, Madison – WI, EUA), a
qual continha: 500 U de Taq DNA polimerase, 400 µM de dATP, dGTP, dCTP, dTTP
e 3 mM de MgCl2, acrescido de 10 pmoles (1 μL) de cada iniciador (senso e
antissenso), dependendo do tipo de microrganismo.
Os iniciadores empregados para a amplificação do DNA das actinobacterias
foram especialmente desenhados para este estudo e amplificam um fragmento de
842 pares de base. Estes iniciadores foram denominados: StrepFW: 5’ -
38
CATGCAAGTCGAACGATGAACCTCCT-3’ e StrepRV 5’ -
TCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGG-3’. Para a identificação de outros gêneros
bacterianos foi usado o par de iniciadores 08/FW: 5’ -AGAGTTGTATCCTGGCTCAG
-3’ e 1492/RV 5’ - GGTTACCTTGTTACGACTT-3’, considerados universais que
amplificam um fragmento específico de 1.500 pb da região 16S rDNA, previamente
descritos (WEISBURG et al., 1991). Como molde em cada ensaio de PCR foi
utilizado, aproximadamente, 100 ng do DNA bacteriano extraído e H2O estéril (livre
de nuclease) para completar o volume final de 25 µL. As condições de amplificação
para actinobacterias incluíram um ciclo inicial de 94°C por 5 minutos, seguidos de 30
ciclos de desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 54°C por 1 minuto e
extensão a 72°C por 1 minuto e uma extensão final de 72°C por 6 minutos. As
condições de amplificação com o par de iniciadores universais para outras bactérias
foram um ciclo inicial de 94°C por 5 minutos, seguidos de 30 ciclos de desnaturação
a 94°C por 1 minuto e 10 segundos, anelamento a 53°C por 1 minuto e 10 segundos
e extensão a 72°C por 2 minutos e uma extensão final de 72°C por 7 minutos
(WEISBURG et al., 1991).
Para os fungos filamentosos os iniciadores usados foram FW (ITS1) 5’ -
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ e o RV (ITS4) 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
que amplificam um fragmento de 645 pb. As amplificações do DNA genômico dos
fungos isolados foram realizados utilizando-se os iniciadores ITS1 e ITS4, os quais
são específicos para a região 18S do DNA ribossômico. As condições de
amplificação foram as seguintes: um ciclo inicial e 94°C por 5 minutos, seguidos de
30 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 56°C por 45
segundos e extensão a 72°C por 2 minutos e uma extensão final de 72°C por 7
minutos (MIRHENDI et al, 2007) 97.
Todos os produtos amplificados nos ensaios de PCR foram analisados por
eletroforese em gel de agarose a 1,2% em tampão TBE 0,5X (Tris-borato-EDTA)
[100mM Tris-base; 2,0 mM de solução 0,5 EDTA (pH 8,0) e 50 mM ácido bórico] a
85 mV durante 1 hora (SAMBROOK; FRITSCH; MANIATIS, 2001). Após a
eletroforese, os géis foram corados em uma solução de brometo de etídio e água
destilada (0,5 µg/mL), durante 20 minutos e observados em transiluminador de UV.
Para a determinação do tamanho dos produtos amplificados pela PCR foi incluído
em cada corrida um marcador de peso molecular de 1Kb DNA ladder (Promega).
39
6.3 Identificação genotípica dos isolados pelo sequenciamento do fragmento
amplificado de DNA
Os produtos de PCR foram purificados com o kit Wizard® SV Gel and PCR
Clean-Up System (Promega), segundo as instruções do fabricante. O
sequenciamento de cada produto purificado foi realizado pelo método da terminação
da cadeia por dideoxinucleotídeos (SANGER; NICKELEN; COULSON, 1977), em
ambas as direções da dupla fita (senso positivo e senso negativo) com o “Kit ABI
Prism BigDye” no sequenciador automático ABI 3130 Genetic Analyser (Applied
Biosystems). Todas as amostras foram sequenciadas pela empresa Myleus
Biotecnologia Ltda, em Belo Horizonte-MG. Para as análises computacionais das
sequencias os eletroferogramas obtidos através do sequenciamento foram
analisados no programa ChromasPro (TechnelysiumPty. Ltd -
http://www.technelysium.com.au/chromas. html). A similaridade das sequências
nucleotídicas obtidas foi verificada com o auxílio do programa BLASTn do pacote
BLAST 2.0 (Basic AlignmentSearch Tool – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
(ALTSCHUL et al., 1997). Para as análises comparativas foram selecionadas
aleatoriamente sete amostras de referências de diferentes espécies de
Streptomyces, constantes do Genbank. As sequências foram alinhadas e analisadas
pelo programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, versão 3.1)
disponível em: http://www.megasoftware.net/. O nível de reprodutibilidade da árvore
foi garantido pela análise de bootstrap de 1000 repetições.
40
7 RESULTADOS
7.1 Isolados de solo com atividade antimicrobiano de diferentes cidades do Maranhão
Neste trabalho foram coletadas 65 amostras de solo, nos 19 municípios
pesquisados. Foi verificado que existe grande variedade de morfotipos nas
amostras, pertencentes a diferentes ecossistemas do Estado do Maranhão. Os
aspectos morfológicos de alguns isolados microbianos nos três meios de isolamento
utilizados foram mostrados na Figura 14. Foi selecionada pelo menos uma colônia
de cada tipo morfológico para os ensaios de atividade antimicrobiana, obtendo-se
um total de 599 colônias escolhidas aleatoriamente.
Figura 14. Demonstração do perfil de crescimento de isolados microbianos
recuperados de amostras de solo avaliadas neste estudo
Fonte: O autor (2015). Legenda: Em A: ágar amido-caseína, em B: ágar cobre e em C: ágar
Sabouraud-dextrose.
A B C A
41
7.2 Atividade antimicrobiana de isolados do solo contra cepas de referência
No ensaio de atividade antimicrobiana 95 (15,9%) dos isolados
apresentaram atividade antimicrobiana contra pelo menos um dos microrganismos
ATCC avaliados. Desses isolados, 79 (83,2%) eram bactérias e 16 (16,8%) eram
fungos. Os isolados do solo com atividade antimicrobiana foram detectados em
todas as 19 cidades incluídas no estudo. No entanto, a análise por munícipio revelou
um maior número de isolados por município eram provenientes de Morros (Tabela
2).
A atividade antimicrobiana dos 95 isolados foi caracterizada pela formação
de halo de inibição contra pelo menos uma das cepas padrão testadas (Figura 15).
Um total de 60 (63,2%) isolados apresentou atividade inibitória do crescimento
contra uma única cepa padrão, enquanto que 35 (36,8%) apresentaram atividade
antimicrobiana contra duas ou três das cepas padrão empregadas (S. aureus ATCC
25923, E. coli ATCC 25922 e C. albicans ATCC 18804). Dos isolados que
apresentaram atividade contra mais de uma cepa padrão, 22 (23,2%) eram contra S.
aureus e C. albicans e 10 (10,5%) foram ativos contra os três simultaneamente
(Tabela 3).
A maior frequência de atividade inibitória do crescimento específica foi
observada para C. albicans em 33 (34,7%) dos isolados do solo. No geral, 24
(25,3%) microrganismos apresentaram atividade inibitória contra S. aureus, 33
(34,7%) para C. albicans e apenas três (3,2%) inibiram E. coli. ( Tabela 3).
Dentre as bactérias que demonstraram capacidade inibitória contra os
patógenos de referência testados 40 foram classificadas como outras espécies de
bactérias, 39 como actinomicetos e 16 como fungos (Tabela 4).
Quanto à atividade dos isolados caracterizados como “outras bactérias”
dentre elas: Betaprotobacteria não cultivável, Bacillus, Burkholderia, Paenibacillus e
Pseudomonas foi observada uma frequência de atividade inibitória maior contra C.
albicans (84,6%), seguida por S. aureus (56,4%) e E. coli (17.9%). Os actinomicetos
inibiram em maior frequência C. albicans (65,5%), seguida por S. aureus (60,9%) e
E. coli (17.0%). Enquanto os fungos isolados apresentaram maior frequência de
atividade inibitória contra S. aureus (73,3%), seguida por C. albicans (40%) e E. coli
(13,3%), conforme demonstrado na Tabela 4.
42
Tabela 2. Número de amostras de solo e isolados microbianos testados oriundos
de diferentes cidades do Maranhão.
Cidade No.
Amostras
No. de isolados testados
Microrganismos com atividade
inibitória
Arari 04 43 06
Barreirinhas 04 22 03
Bequimão 03 36 01
Cachoeira Grande 04 26 11
Central do Maranhão 01 11 03
Guimarães 02 24 01
Icatu 04 21 03
Matinha 04 31 06
Morros 04 35 20
Olinda Nova 04 40 07
Palmeirândia 02 17 02
Perimirim 02 12 02
Pinheiro 02 41 01
São Bento 04 27 04
São Luís 07 79 02
São Vicente 04 34 05
Turiaçu 02 37 04
Viana 04 30 06
Vitória 04 33 08
TOTAL 65 599 95
43
Figura 15. Pesquisa da atividade antimicrobiana em isolados do solo pelo método
de difusão em ágar.
Fonte: O autor (2015). Legenda: Em A: Microrganismo do solo com atividade antimicrobiana
caracterizada pela formação de halo de inibição de crescimento ao redor de fragmentos de
crescimento em B microrganismo sem atividade inibitória (à direita).
Tabela 3. Espectro da atividade antimicrobiana dos microrganismos isolados do solo
testado inicialmente contra bactérias ATCC.
Legenda: *SA = S. aureus ATCC 25922; EC = E. coli ATCC 25923; CA = C. albicans ATCC18804
Cepas de referência* Isolados do solo com
atividade inibitória N (%)
SA 24 (25,3)
EC 3 (3,2)
CA 33 (34,7)
EC + SA 2 (2,1)
CA + SA 22 (23,2)
CA + EC 1 (1,0)
CA + EC + SA 10 (10,5)
TOTAL 95 (100)
A B
63,2%
36,8%
44
Tabela 4. Atividade antimicrobiana de isolados de solo contra microrganismos ATCC
por microrganismos identificados.
7.3 Atividade antimicrobiana dos isolados do solo contra amostras clínicas
Dos 95 isolados microbianos com atividade antimicrobiana contra bactérias
MDR e fungos de origem clínica, 43 (58,9%) isolados do solo apresentaram
atividade contra uma única linhagem, enquanto que 18 (24,7%) inibiram duas das
linhagens empregadas no ensaio, incluindo-se C. albicans SV85, E. faecalis IJF4, S.
aureus IJF1. Doze isolados (16,4%) apresentaram atividade contra três a sete
microrganismos, simultaneamente. A maior frequência de isolados com atividade
inibitória do crescimento específica foi observada em 36 (49,3%) isolados do solo
contra C. albicans SV85, seguida da atividade contra E. faecalis IJF4 evidenciada
em seis (8,2%) microrganismos (Tabela 5).
Neste estudo, pode-se verificar que houve maior frequência da atividade
inibitória dos isolados identificados como actinobacterias contra C. albicans SV85
(21/51,2%), seguida por S. aureus IJF1 (17/41,5%), E. faecalis IJF4 (13/31,7%), E.
coli IJF2 (4/9,8%), K. pneumoniae CNM7 (4/9,8%) e (3/7,3%) contra P. aeruginosa
IJF3 (Tabela 6).
Por outro lado, observou-se uma maior frequência de isolados classificados
como “outras bactérias” (76,9%) apresentando atividade inibitória do crescimento de
C. albicans SV85, seguida pela atividade contra bactérias Gram-positivas (S. aureus
IJF1 - 23,0% e E. faecalis IJF4 - 17,9%) e depois contra as bactérias Gram-
negativas (E. coli IJF2 - 10,3% e K. pneumoniae CNM7- 7,7%). Quanto aos fungos
Cepas ATCC Actinobactérias
(N = 39) n (%)
Outras bactérias (N = 40)
n (%)
Fungos (N = 16)
n (%)
Total (N =95) n (%)
C. albicans 27 (65,5) 33 (84,6) 6 (40,0) 66 (69,5)
E. coli 7 (17,0) 7 (17,9) 2 (13,3) 16 (16,8)
S. aureus 25 (60,9) 22 (56,4) 11 (73,3) 58 (61,0)
45
do solo a maior frequência de atividade foi evidenciada contra S. aureus IJF1
(40,0%), seguida por C. albicans SV85 (33,3%), sem evidenciação de atividade
antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas.
Tabela 5. Espectro da atividade antimicrobiana dos microrganismos isolados do solo
contra isolados clínicos MDR.
Legenda: CA = C. albicans SV85; EC = E. coli IJF2; KP = K. pneumoniae CNM7; PAC = P. aeruginosa IJF3; SA = S. aureus IJF1; EF = E. faecalis IJF4.
Isolados clínicos N (%)
EF 1 (1,4)
CA 36 (49,3)
SA 6 (8,2)
CA + SA 3 (4,1)
CA + EF 3 (4,1)
CA + SA 3 (4,1)
SA + EF 9 (12,3)
CA + EC + SA 1 (1,4)
CA + SA + EF 4 (5,5)
CA + EC + EF 1 (1,4)
KP + EC + SA 1 (1,4)
CA + KP + EC + SA 1 (1,4)
CA + KP + EC + SA + EF 1 (1,4)
CA + KP + PA + EC + SA + EF 3 (4,1)
TOTAL 73 (100)
36,8%
16,4%
24,7%
58,9%
46
Tabela 6. Atividade antimicrobiana de isolados de solo contra isolados clínicos.
7.4 Avaliação da atividade enzimática de proteases, lipases e fosfatase alcalina
e atividade antimicrobiana após ebulição.
Com o objetivo de confirmar se a atividade inibitória observada era pela
produção de substâncias antimicrobianas e não em decorrência da eventual
participação de algumas enzimas que poderiam afetar a viabilidade dos
microrganismos teste, foram realizados ensaios para as enzimas fosfatase alcalina,
protease e lipase, com e sem ebulição, bem como da atividade antimicrobiana. No
geral, foi observado que a atividade era de fato causada por substâncias
antimicrobianas e não pela atividade enzimática (Tabela 7).
Contudo, alguns resultados inconclusivos foram obtidos, principalmente com
relação à pesquisa de protease. Quatorze isolados mostraram atividade de protease
após a ebulição, dos quais 11 (78.5%) apresentaram atividade antimicrobiana. Neste
caso, não se pode afirmar se a atividade inibitória observada era de fato decorrente
de algum antibiótico ou devido à ação de alguma enzima proteolítica. Quanto aos
Isolados clínicos
Actinobactérias (N = 39)
n (%)
Outras bactérias (N = 40)
n (%)
Fungos (N = 16)
n (%)
Total (N = 95)
n (%)
C. albicans 21 (51,2) 30 (76,9) 5 (33,3) 56 (58,9)
S. aureus 17 (41,5) 9 (23,0) 6 (40,0) 32 (33,7)
E. faecalis 13 (31,7) 7 (17,9) 2 (13,3) 22 (23,2)
E. coli 4 (9,8) 4 (10,3) - 8 (8,4)
K. pneumoniae 4 (9,8) 3 (7,7) - 7 (7,4)
P. aeruginosa 3 (7,3) - - 3 (3,2)
47
outros 81 isolados os resultados sugeriram se tratar da ação de alguma substância
antimicrobiana, seja um antibiótico conhecido ou não.
Tabela 7. Avaliação da atividade enzimática dos isolados do solo em relação à
atividade antimicrobiana antes e após ebulição.
Isolados do solo
Atividade antimicrobiana
Protease Lipase Fosfatase Alcalina
Ebulição
antes após antes após antes após antes após
Actinobactérias 39 32 19 4 30 1 34 -
Outras bactérias 40 32 17 8 24 - 29 1
Fungos 16 10 7 2 5 - 12 -
TOTAL 95 74 43 14 59 1 75 1
7.5. Identificação molecular dos isolados do solo
A análise de identificação genotípica dos isolados com atividade
antimicrobiana avaliados neste estudo mostrou a presença de seis gêneros
bacterianos: Kitasatospora, Streptomyces, Bacillus., Burkholderia, Paenibacillus e
Pseudomonas. Quanto aos fungos filamentosos foram identificados três gêneros:
Aspergillus, Penicillium, e Trichoderma.
Dos 95 isolados que apresentaram atividade antimicrobiana, 79 (83,2%)
foram identificados fenotipicamente como bactérias e 16 (16,8%) como fungos
filamentosos. Com o objetivo de fazer uma identificação molecular desses isolados,
iniciadores específicos foram desenhados baseados na região do rDNA da
subunidade 16S de Actinomicetos.
48
Os resultados de amplificação por PCR com os iniciadores mostraram um
fragmento específico de 842 pb, como esperado (Figura 16) para 39(41,1%) dos
isolados bacterianos. O DNA dos 40 restantes que não amplificaram com este par
de iniciadores foram submetidos a PCR com iniciadores universais 08F e 1492R e
todos mostraram um fragmento específico de 1.500 pb. Os isolados identificados
fenotipicamente como fungo tiveram o seu DNA amplificado com iniciadores
específicos para as regiões ITS1 e ITS4 sendo observado um fragmento de 645 pb
(Figura 16).
Figura 16: Perfis de amplificação pela Reação em Cadeia pela Polimerase de
alguns isolados do solo com os diferentes iniciadores utilizados no presente estudo.
Fonte: O autor (2015). Legenda: Gel de agarose 1,2% com os produtos da PCR de alguns
isolados do solo amplificados com iniciadores universais para bactérias 8F e 1492 RV (229, 474
e 360). Perfil do isolado nº. 299 com o iniciador para actinomicetos. Perfil do isolado 478 com os
iniciadores ITS1 e ITS4. PM = padrão de tamanho molecular 100 pb DNA ladder.
7.6 Análise de similaridade genética das sequências dos isolados em relação
às sequências do Genbank
Do total de 95 isolados microbianos de solos 50 foram identificados somente
em nível de gêneros, 35 em nível de espécies e nove ainda não identificados. Dos
39 isolados que tiveram o seu DNA amplificado por PCR com o par de iniciadores
desenhados para detectar Actinomicetos, 32 (82%) foram sequenciados até o
645pb
100pb 229 299 474 360 478
842 pb
1500 pb
49
momento. Destes 19 (48,7%) foi identificada como pertencente ao gênero
Streptomyces. Além desse, o gênero Kitasatospora também foi identificado com este
par de iniciadores. Dos 39 isolados amplificados, sete ainda não tiveram o seu
produto de PCR sequenciado para a identificação molecular da espécie (Tabelas 8 e
9).
Dos 40 isolados microbianos que tiveram seu DNA amplificado com o par de
iniciadores universais 08F e 1492R, 16 (40%) foram identificados como
Burkholderia. Outros gêneros bacteriano identificados foram: Paenibacillus (dois
isolados), Bacillus (um) e Pseudomonas (cinco isolados) (Tabelas 8 e 9).
Com relação aos 16 isolados fúngicos que tiveram o seu material genético
amplificado com os iniciadores específicos para a região intergênica (ITS1 e ITS4) a
maioria 14 (87,5%) foi utilizado através da sequenciada. Destes, 5 (35, 7%) foi
identificada como pertencente a espécie Aspergillus terreus. Além disso, outros
isolados foram identificados em nível de gênero: Aspergillus (quatro isolados),
Penicillium (um isolado) e Trichoderma (um isolado) (Tabelas 8 e 9).
A análise das sequencias dos isolados para a busca de similaridade
genética foi feita através da comparação com sequencias existentes no GenBank.
Para tal, foram utilizados os programas BLASTn do pacote BLAST 2.0 (BASIC
ALIGNMENT SEARCH TOOL), desenvolvido pelo NCBI (ALTSCHUL et al., 1997),
para a busca de sequencias similares. A análise comparativa das sequencias
obtidas dos produtos de PCR com os iniciadores desenhados para actinobactérias,
para o par de iniciadores universais para bactérias, bem como para os fungos,
revelaram similaridade que variou entre 99 a 100% com sequências depositadas no
Genbank (Tabela 9).
50
Tabela 8. Diversidade e frequência de microrganismos do solo identificados por
sequenciamento com iniciadores desenhados para Actinobactérias, Universais para
a região 16S do rDNA de bactérias e para região ITS de fungos.
Microrganismos N (%)
Actinobactérias 39 (41,1)
Kitasatospora spp. 05 (5,2)
Kitasatospora griseola 01 (1,0)
Streptomyces spp. 19 (20,5)
Streptomyces albospinus 01 (1,0)
Streptomyces aureofaciens 01 (1,0)
Streptomyces cinnamoneus 01 (1,0)
Streptomyces parvulus 01 (1,0)
Streptomyces rameus 01 (1,0)
Streptomyces racemochromogenes 01 (1,0)
Streptomyces lannensis 01 (1,0)
Ainda não sequenciado 07 (7,4)
Outras Bactérias 40 (42,1)
Bacillus amyloliquefaciens 04 (4,2)
Bacillus mojavensis 01 (1,0)
Bacillus sp. 01 (1,0)
Bacillus tequilensis 04 (4,2)
Betaprotobacteria não cultivável 01 (1,0)
Burkholderia cepacia 03 (3,1)
Burkholderia spp. 16 (17,1)
Paenibacillus polymyxa 02 (2,1)
Pseudomonas aeruginosa 02 (2,1)
Pseudomonas spp. 06 (6,3)
Fungo filamentoso 16 (16,8)
Aspergillus ochraceopetaliformis 01 (1,0)
Aspergillus tamari 01 (1,0)
Aspergillus fumigatus 01 (1,0)
Aspergillus spp. 02 (2,1)
Aspergillus terreus 05 (5,6)
Paecilomyces lilacinus 01 (1,0)
Penicillium singorense 01 (1,0)
Penicillium sp. 01 (1,0)
Trichoderma harzianum 01 (1,0)
Ainda não sequenciado 02 (2,1)
TOTAL 95
51
Tabela 9. Análise de similaridade genética das sequências dos isolados do solo das
diferentes cidades em relação às sequências do Genbank.
Local Isolado Tamanho pb
Identidade Similaridade (%)
Iniciadores
Arari 546 1406 B. tequilensis 99 GALKIEWICZ et al., 2008
553 1404 B. tequilensis 99 GALKIEWICZ et al., 2008
560 840 Kitasatospora sp. 99 O autor
545 1395 Pseudomonas sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
526 734 Streptomyces sp. 99 O autor
556 834 Streptomyces sp. 99 O autor
Barreirinhas 601 894 B. tequilensis 99 GALKIEWICZ et al., 2008
599 1351 Burkholderia sp. 100 GALKIEWICZ et al., 2008
600 586 P. lilacinus 100 GALKIEWICZ et al., 2008
Bequimão 563 935 B. amyloliquefaciens 99 GALKIEWICZ et al., 2008
Cachoeira Grande
263 601 A. terreus 99 MIRHENDI et al., 2007
264 564 A. terreus 97 MIRHENDI et al., 2007
246 902 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
247 899 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
260 884 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
242 821 S. cinnamoneus 99 O autor
250 833 Streptomyces sp. 99 O autor
254 796 Streptomyces sp. 99 O autor
255 794 Streptomyces sp. 98 O autor
261 842 Streptomyces sp. 99 O autor
Central do Maranhão
578 594 A. fumigates 100 MIRHENDI et al., 2007
576 944 B.amyloliquefaciens 99 GALKIEWICZ et al., 2008
03 630 T. harzianum 99 MIRHENDI et al., 2007
Icatu 304 929 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
307 897 Pseudomonas sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
Matinha 430 963 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
403 819 Kitasatospora sp. 99 O autor
407 840 K. grisiola 99 O autor
426 830 Kitasatospora sp. 99 O autor
425 839 Streptomyces sp. 99 O autor
Morros
214 927 B. cepacia 99 GALKIEWICZ et al., 2008
226 1384 B. cepacia 99 GALKIEWICZ et al., 2008
213 917 Burkholderia sp. GALKIEWICZ et al., 2008
224 878 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
225 1401 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
231 953 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
235 894 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
236 866 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
237 828 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
219 823 Kitasatospora sp. 100 O autor
234 928 Betaprotobacteria não
cultivável 99 GALKIEWICZ et al., 2008
212 931 Pseudomonas sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
52
Local Isolado
Tamanho pb
Identidade Similaridade
(%) Iniciadores
223 921 Pseudomonas sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
221 842 S. aureofaciens 99 O autor
228 812 Streptomyces rameus 99 O autor
216 828 Streptomyces sp. 99 O autor
218 826 Streptomyces sp. 99 O autor
220 826 Streptomyces sp. 99 O autor
232 832 Streptomyces sp. 99 O autor
Olinda Nova 361 595 P. singorense 99 MIRHENDI et al., 2007
382 900 Pseudomonas sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
385 831 S. parvulus 99 O autor
366 842 Streptomyces sp. 99 O autor
371 842 Streptomyces sp. 99 O autor
Palmeirândia 196 645 A. tamari 99 MIRHENDI et al., 2007
209 839 Streptomyces sp. 99 O autor
Perimirim 193 974 Pseudomonas sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
187 839 Streptomyces sp. 99 O autor
Pinheiro 586 498 Penicillium sp. 99 MIRHENDI et al., 2007
São Bento 278 600 A. terreus 99 MIRHENDI et al., 2007
275 937 Bacillus sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
265 914 P.aeruginosa 99 GALKIEWICZ et al., 2008
268 835 S. lannensis 98 O autor
São Luís 574 596 A. ochraceopetaliformis 100 MIRHENDI et al., 2007
570 610 A. terreus 99 GALKIEWICZ et al., 2008
São Vicente 338 680 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
323 842 Kitasatospora sp 100 O autor
319 899 P. polymyxa 99 GALKIEWICZ et al., 2008
322 893 P. polymyxa 99 GALKIEWICZ et al., 2008
324 825 Streptomyces sp. 99 O autor
Turiaçu 09 957 B. mojavensis 99 GALKIEWICZ et al., 2008
06 1388 B. cepacia 99 GALKIEWICZ et al., 2008
21 900 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
29 1390 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008
Viana 463 589 Aspergillus sp. 99 MIRHENDI et al., 2007
453 609 A.terreus 99 MIRHENDI et al., 2007
451 909 B. tequilensis 99 GALKIEWICZ et al., 2008
458 920 P. aeruginosa 99 GALKIEWICZ et al., 2008
450 820 S. racemochromogenes 100 O autor
473 837 Streptomyces sp. 99 O autor
Vitória 487 618 Aspergillus sp. 99 MIRHENDI et al., 2007
474 985 B. amyloliquefaciens 99 GALKIEWICZ et al., 2008
502 948 B. amyloliquefaciens 99 GALKIEWICZ et al., 2008
516 810 S. albospinus 99 O autor
504 842 Streptomyces sp. 99 O autor
518 831 Streptomyces sp. 99 O autor
Nota: Nove isolados ainda não foram sequenciados: Cachoeira Grande (1), Guimarães (1), Icatu (1),
Morros (1), Olinda Nova (2), São Luís (1) e Vitória (2).
53
Para a determinação da inferência filogenética entre as sequências
consensos obtidas a partir dos sequenciamentos dos produtos de PCR amplificados
com os três diferentes pares de iniciadores StrepFW/ StrepRV, (842pb) universais
8F e 1492R (1.500pb) e os específicos para a região ITS1 e ITS4 (645pb) de fungos,
foram feitos alinhamentos individualizados das sequencias de cada par de iniciador.
Para tal, diferentes sequencias existentes no Genbank foram utilizadas para a
construção da árvore filogenética com o uso do programa MEGA versão 5.2.2
(TAMURA et al., 2013). Os seguintes parâmetros foram utilizados: algoritmo
UPGMA-Unweighted Pair-Group Method using arithmetic Averages, no qual os
pares de sequências que mostram a menor distância evolutiva são agrupados em
primeiro lugar e o grau de confiança ou reprodutibilidade (Bootstrap) de 1.000
repetições.
Para as sequencias obtidas com o fragmento de 842pb para bactérias do
gênero Actinomyces foi feito o alinhamento com sequencias de diferentes espécies
pertencentes a esse gênero bacteriano: Streptomyces sp (17 sequencias);
Kitasatospora sp. (4 sequencias), Streptomyces aureofaciens (3 sequencias) e uma
de cada das seguintes espécies: Streptomyces owasiensis, Streptomyces violaceus,
Streptomyces parvulus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces roseoverticillatus,
Streptomyces thioluteus, Streptomyces flocculus, Streptomyces sclerotialus,
Streptomyces chattanoogensis, Streptomyces albospinus, Streptomyces galbus,
Streptomyces racemochromogenes, Streptomyces chromofuscus, Streptomyces
lannensis, Kitasatospora azatica, Streptomyces purpeofuscus, Kitasatospora
griseola, Streptomyces cinereorectus, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces
aburaviensis, Streptomyces avellaneus, Streptomyces psammoticus e Streptomyces
xanthocidicus (Figura 17).
Para o alinhamento das sequencias obtidas com os iniciadores universais
para a região 16S do rDNA dos isolados bacterianos, com diferentes sequencias do
Genbank dos seguintes gêneros Burkholderia spp, Pseudomonas spp e Bacillus spp.
(Figura 18).
As sequencias obtidas dos isolados com os iniciadores ITS1 e ITS4 de
fungos foram alinhadas com sequencias do Genbank de diferentes espécies dos
gêneros Aspergillus, Penicillium, e Trichorderma (Figura 19).
54
Figura 17. Árvore filogenética dos isolados de Actinomicetos isoladas de diferentes
tipos de solos do Estado do Maranhão.
55
Figura 18. Árvore filogenética obtida com sequencias dos isolados identificados com
o par de iniciadores universais 8F e 1492R e sequencias de bactérias existentes no
Genbank.
56
Figura 19. Árvore filogenética mostrando o grupamento das sequencias dos
fungos isolados a partir de amostras de solos do Estado do Maranhão.
57
8. DISCUSSÃO
A procura por microrganismos produtores de substâncias com algum tipo de
atividade biológica tem crescido muito nos últimos anos. Para esse fim, diferentes
ecossistemas têm sido pesquisados, entre os quais o solo tem sido uma importante
fonte para estudos de bioprospecção, a fim de se detectar microrganismos
produtores de novas moléculas com potencial aplicação na medicina (fármacos), na
agricultura (agroquímicos) e em estudos de processos biológicos (biologia química)
(BEATTIE et al., 2005)
Neste contexto, o presente estudo teve por objetivo investigar a atividade
antimicrobiana de bactérias e fungos isolados de solos de diferentes municípios do
Estado do Maranhão contra microrganismos de referência e isolados de importância
clínica. Os dados demonstraram uma variedade de microrganismos com a referida
atividade no solo dos municípios avaliados, com espectro de atividade contra S.
aureus (ATCC 25923), E. coli (ATCC 25922) e C. albicans (ATCC 18804), bem como
contra isolados clínicos Gram-positivos e Gram-negativos com perfil de
multirresistência.
Os métodos moleculares utilizados para identificar os isolados que
apresentaram atividade inibitória contra os patógenos testados mostram vários
gêneros e espécies de microrganismos. A maior frequência de atividade
antimicrobiana dos isolados identificados por biologia molecular como pertencentes
ao gênero Actinomyces foi evidenciada contra C. albicans do que contra bactérias,
no geral. Este achado corrobora com os resultados de diferentes pesquisadores.
Relatos prévios de Saadoun e Saadoun (2003) mostraram que 18%, dos 116
diferentes isolados de Streptomyces, de solo do norte da Jordânia, exibiram
atividade contra C. albicans. Semelhantemente Kang; Janice e Donald (2010)
encontraram actinobacterias isoladas do solo de Lewiston, Estados Unidos da
America, com forte atividade contra C. albicans. Também outros trabalhos
demonstraram que novos compostos químicos podem ser obtidos de
microrganismos do solo. Foram observados por Wang et al (2014) que quatro
compostos químicos denominados de (4S)-4,10-dihidroxidodeca-2-en-1,4-olide,
(4S)-4,8,10-trihidroxi-10-metildodeca-2-en-1,4-olide, MKN-003B e MKN-003C
58
produzidos por bactérias do solo caracterizada como Streptomyces, apresentaram
atividade antifúngica.
Os actinomicetos são reconhecidos pela produção de vários tipos de
antibióticos como peptídeos, glicopeptídeos, tetraciclinas, fenazinas, macrolídeos,
antraquinona, polienos, lactonas e outros (DEMAIN; FANG, 1999). Entre os gêneros
de Actinomicetos mais comumente associados a essa atividade estão algumas
espécies de Streptomyces produtoras de metabólitos de importância na medicina e
na indústria farmacêutica (CLARDY; 2005). Eles são responsáveis por mais de
2.400 de diferentes produtos de mais de 1.900 estirpes e subestirpes (WATVE;
TICKOO; JOG, 2001; LUCAS; SENGER; ERXLEBEN, 2013). Cerca de dois terços
de antibióticos e de uma grande variedade de metabólitos secundários, como
agentes anti-helmínticos, antifúngicos e herbicidas tem sido produzidos a partir de
culturas de Streptomyces spp. (BEKKER et al., 2014; KAWAGUCHI et al., 2013).
As cepas de referência de S. aureus avaliadas no presente estudo também
demonstraram sensibilidade aos metabólitos produzidos pelas bactérias do gênero
Streptomyces isoladas de solo. Estudo feito por Lee et al. (2014) evidenciou que um
isolado do gênero Streptomyces denominado de MUSC 135 contra S. aureus.
Semelhantemente outro estudo mostrou um novo actinomiceto denominado de BT-
408 produziu um antibiótico com excelente atividade contra S. aureus resistente a
meticilina (SUJATHA; RAJU; RAMANA, 2005).
A resistência de S. aureus aos antibióticos tem demonstrado ser um grave
problema de saúde pública e se destaca como um grande desafio na busca de
novos compostos químicos para debelar ou controlar os efeitos patogênicos desta
bactéria na clínica (MORELL; BALKIN, 2010).
Outro gênero isolado e identificado neste estudo e que também demonstrou
atividade contra C. albicans foi Burkholderia. Muitas espécies de Burkholderia tem
habilidade de produzir vários metabólitos biologicamente ativo, incluindo-se
compostos antifúngicos (PARTIDA-MARTINEZ, 2005). Quando Li et al (2008)
investigaram um composto denominado de CF66I produzido pela espécie de
Burkholderia cepacia verificaram uma excelente atividade contra C. albicans onde o
composto interagiu contra a parede celular do fungo e apresentou capacidade de
penetração na célula. Este dado corrobora com os resultados deste estudo e pode
explicar a ação antifúngica observada nos isolados de solos maranhenses.
59
O gênero Burkholderia está presente em vários nichos ecológicos, como
solo, água, rizosfera de plantas, em pessoas, vários animais e ambiente hospitalar
(COENYE; VANDAMME, 2003). Algumas espécies são patógenos humanos
oportunistas, como a Burkholderia pseudomallei, que é o agente causador da
melioidose, bem como o complexo Burkholderia cepacia (Bcc) que possui mais de
17 espécies diferentes dentre elas: B. cepacia, Burkholderia multivorans,
Burkholderia cenocepacia, Burkholderia stabilis, Burkholderia vietnamiensis,
Burkholderia dolosa, Burkholderia ambifaria, Burkholderia anthina, Burkholderia
pyrrocinia, Burkholderia ubonensis, Burkholderia latens, Burkholderia diffusa,
Burkholderia arboris, Burkholderia seminalis, Burkholderia metallica, Burkholderia
lata, Burkholderia contaminans. Embora algumas espécies de Burkholderia estejam
envolvidas em infecções humanas elas também são capazes de produzir
metabólitos biologicamente ativos como o composto antifúngico rizoxina (PARTIDA-
MARTINEZ; PIDOT et al., 2014; THOMAS, 2007). Outros estudos relatam, ainda, a
presença de compostos antifúngicos produzidos por Burkholderia como
lipopeptideos (Kang et al., 1998), cepaciamidas A e B (YING et al.,1996),
cepacidinas (LEE et al., 1994), altericidina (KIRINUKI; ICHIBA; KATAYAMA, 1984),
pirronitrina (ARIMA et al., 1964), glidobactinas (SHOJI et al., 1990;
SCHELLENBERG; BIGLER; DUDLER, 2007), fenazinas (CARTWRIGHT; CHILTON;
BENSON, 1995) e 2-hidroximetil-cromo-4-one (KANG al.,2004).
Os isolados de Burkholderia deste estudo também apresentaram atividade
antimicrobiana contra a cepa ATCC de S. aureus. Embora algumas espécies deste
gênero possuam representantes classificados como patógenos oportunistas
humanos, como do complexo Burkholderia cepacia, essas bactérias são também
capazes de produzir metabólitos biologicamente ativos, inclusive antimicrobianos
(CORDOVA-KREYLOS et al., 2013). O gênero Burkholderia além de produzir vários
compostos antifúngicos, já citados anteriormente, são também capazes de produzir
compostos de amplo espectro de ação, como a enaciloxina que possui atividade
antimicrobiana, contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (WATANABE;
IZAKI; TAKAHASHI, 1982; PIDOT et al., 2014). É provável que a atividade
antimicrobiana de Burkholderia observada contra o S. aureus pode ser explicada
pela grande quantidade de metabólitos produzidos por essa bactéria, incluindo-se a
pirrolnitrina que tem ação contra bactérias Gram-positivas (VIAL et al., 2007). Já as
enaciloxinas, outro grupo de compostos antibacterianos produzidos por Burkholderia
60
(WATANABE; IZAKI; TAKAHASHI, 1982; MAHENTHIRALINGAM et al., 2011), tem
demonstrado atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Esses
achados corroboram com os resultados da presente pesquisa, onde foi observada
uma excelente atividade antimicrobiana de Burkholderia contra S. aureus ATCC e
isolados clínicos com perfil de multirresistência.
Neste trabalho, os isolados do solo identificados como pertencentes ao
gênero Pseudomonas apresentaram atividade inibitória contra C. albicans, em
concordância com este resultado Morales et al. (2010) mostraram que P. aeruginosa
inibiu C. albicans através de um novo composto fenazinico denominado 5-metil-
fenazina-1-ácido carboxílico. Além disso, em outro estudo, Morales et al. (2013)
também observaram efeito toxico dos fenazínicos piocianina, metassulfato de
fenazina e fenazina-1-carboxilato contra C. albicans a partir de metabólitos
produzidos por P. aeruginosa. É possível que estes compostos sejam os
responsáveis pelos resultados da atividade inibitória das Pseudomonas isoladas
contra as C. albicans nesta pesquisa.
O gênero Pseudomonas é composto por mais de 60 espécies e estão
presentes em uma grande variedade de ambientes, como: solo, água, superfície de
plantas e animais. Algumas dessas bactérias estão envolvidas em infecções
humanas, incluindo-se P. aeruginosa, causando fibrose cística e outras infecções
oportunistas, mas também associada com a produção de metabólitos secundários,
inclusive alguns com atividade antibiótica (GROSS; LOPER, 2009).
Muitos metabólitos microbianos têm um papel importante na aquisição de
nutrientes, na virulência e na defesa contra competidores nos ambientes naturais
onde estão presentes. Dentre os metabólitos com atividade contra competidores e
predadores estão os antimicrobianos com ação contra fungos fitopatogenos
(ANJAIAH et al., 1998; NIELSEN et al., 2002; BOLWERK et al., 2003). A pirrolnitrina
é um metabólito biologicamente ativo que possui forte ação antifúngica sendo
produzido inicialmente por Pseudomonas pyrocinia (GROSS; LOPER, 2009) e
depois relatada por outras espécie de Pseudomonas, assim como outros
microrganismos, como: Enterobacter agglomerans, Myxococcus fulvus, Burkholderia
spp. e Serratia spp. Esse composto é muito usado na agricultura e também pela
indústria farmacêutica como antimicótico tópico (GROSS; LOPER, 2009).
O 2,4-diacetil-floroglucinol produzido por Pseudomonas é composto que
também possui ação antifúngica contra fitopatógenos (DE WERRA et al., 2011),
61
assim como outros compostos como o 2,5-dialquilresorcinol (NOWAK-THOMPSON
et al., 2003), orfamidas (GROSS et al., 2007), rizoquicinas (IWASAKI et al., 1984).
Dados sugestivos de que esses, ou outros compostos ainda não identificados,
podem estar relacionados à ação antifúngica dos isolados de Pseudomonas contra
C. albicans observada na presente pesquisa.
A atividade antifúngica que foi observada pelos isolados do solo identificados
como Paenibacillus polymyxa contra C. albicans pode estar relacionada, ou não,
com a produção de compostos como a piocianina, metasulfato de fenazina e a
fenazina -1-carboxilato descritos por Beatty e Jensen (2002). Estudos realizados
com a bactéria P. polymyxa SCE2, isolada de solo do cerrado brasileiro,
constataram uma inibição do crescimento de bactérias Gram-positivas, Gram-
negativas e de fungos (SELDIN et al., 1999; ROSADO; SELDIN, 1993), o que está
em consonância com o observado neste estudo.
Um achado interessante neste estudo foi que as amostras de C. albicans
testadas foram sensíveis à ação de metabólitos produzidos pelos fungos
filamentosos A. tamarii, A. fumigatus, A. terreus, P. lilacinus e Trichoderma
harzianum. Estudo de Kawaguchi et al. (2013) com 151 fungos isolados do solo de
Kanagawa e Tokyo, no Japão, dos quais 29 fungos de diferentes gêneros, com
atividade contra C. albicans, entre estes estão Aspergillus e Trichoderma. A
literatura relata que os fungos filamentosos são conhecidos pela produção de grande
variedade de compostos bioativos de baixo peso molecular, principalmente
antibióticos (BRAKHAGE; SCHROECKH, 2011).
Os isolados de fungos identificados por biologia molecular como: Aspergillus
sp., A. terreus, P. lilacinus, Penicillium spp., P. singorense e Trichoderma harzianum
sp., também apresentaram efeito inibitório contra S. aureus ATCC 25923 e S. aureus
de isolado clínico MDR. Esses fungos já foram relatados na literatura como
produtores de compostos com atividade antimicrobiana (ISOGAI et al., 1980;
CAZAR; SCHMEDA-HIRSCHMANN; ASTUDILLO, 2005; ELAASSER; ABDEL-AZIZ;
EL-KASSAS, 2011; AHLUWALIA et al., 2014). Quanto ao P. singorense, até onde se
sabe, este estudo foi o primeiro a relatar a sua atividade antimicrobiana. Na
realidade, trata-se de uma nova espécie recentemente catalogada (VISAGIE et al.,
2014).
Além dos fungos produtores de metabólitos biologicamente ativo isolados
por métodos tradicionais, o conhecimento de técnicas de biologia molecular através
62
do uso de estratégias de ativação de cassetes de genes silenciosos pode levar a
descoberta de inúmeros novos metabólitos de fungos filamentosos, principalmente
do gênero Aspergillus com diversas aplicações (BRAKHAGE; SCHROECKH, 2011).
É importante notar que existem isolados com atividade especifica, enquanto
outros podem apresentar atividade contra múltiplos agentes bacterianos e até
fungos. Nesse aspecto, a maioria dos isolados do solo maranhense apresentou
atividade específica, ou seja, contra apenas uma espécie de microrganismo, 60
(63,2%) dos isolados testados contra cepas ATCC e 43 (58,9%) dos isolados contra
microrganismos clínicos, enquanto outros mostraram ação contra dois ou mais
microrganismos. Existem algumas possibilidades que explicam este fato, uma é que
estes microrganismos produzam mais de um composto com atividade antimicrobiana
e a outra é que eles produzam um composto com intensa ação citotóxica, a qual
afetaria a viabilidade de qualquer célula inclusive bactérias e fungos ao mesmo
tempo. Espécies de Streptomyces produzem simultaneamente inúmeros compostos
com atividade biologicamente ativa contra bactérias Gram-negativas, Gram-positivas
e fungos (WATVE; TICKOO; JOG, 2001). Como a espécie S. albospinus, que produz
metabólito fungicida denominado fenamida (MAKKAR et al, 1995) e também
compostos com ação bactericida contra Gram-positivos, atribuída à fenelfamicina G
e H (BRÖTZ; et al., 2011). Nesse sentido, supõe-se que esses metabólitos, ou
outros, ainda não descritos, possam explicar a ação antimicrobiana observada no
presente estudo, com os isolados de S. albospinus do solo maranhense. Dessa
forma, acredita-se que existam espécies ainda desconhecidas pertencentes a
ecossistemas ainda não explorados, como observado na presente pesquisa, as
quais poderiam levar a grandes expectativas na descoberta de novos
antimicrobianos.
Poucos isolados tiveram atividade contra as bactérias Gram-negativas
avaliadas, tais como E. coli, K. pneumoniae e P. aeruginosa. Em um estudo feito por
Busti et al. (2006b), em solo da floresta de Gerenzeno, na Itália foi encontrado um
isolado, denominado Gamma 22, com ação contra bactérias Gram-positivas,
Micrococcus luteus e B. subtillis, porém o mesmo apresentou fraca atividade contra
E. coli. Ainda, outro estudo realizado com isolados de solo demonstrou maior
atividade contra bactérias Gram-positivas do que bactérias Gram-negativas
(GONZÁLEZ et al., 2005). Estes dados confirmam os resultados do presente estudo
63
que mostrou poucos isolados produtores de atividade antimicrobiana contra
bactérias Gram-negativas.
Nas duas últimas décadas, a busca de novos antimicrobianos tem mostrado
que há maior dificuldade na descoberta de novos metabólitos bioativos contra
bactérias Gram-negativas do que contra as Gram-positivas. Entre essas estão E.
coli, K. pneumoniae e P. aeruginosa, as quais são as bactérias Gram-negativas que
mais têm demonstrado perfil MDR (RICE, 2008; BASSETTI; FRANCESCA;
MALGORZATA, 2011).
As bactérias Gram-negativas são também mais resistentes aos
antimicrobianos do que as bactérias Gram-positivas por vários mecanismos,
inclusive porque as bactérias Gram-negativas possuem uma membrana externa
constituída de lipopolissacarídeos que funciona como uma barreira contra a entrada
de drogas antimicrobianas (HANCOCK, 1997). Outra explicação por esta pouca
suscetibilidade aos isolados de solo são os mecanismo de bomba de efluxo, que
bactérias como Pseudomonas e E. coli possuem, expulsando compostos estranhos
à célula bacteriana e desta forma os compostos responsável pela atividade
antimicrobiana não seriam capazes de atuar contra estas bactérias (LEVY, 1992).
Ainda outra hipótese poderia explicar este resultado através do mecanismo de
resistência mediada por enzimas inativadoras e modificadoras, onde compostos
produzindo pelos isolados do solo poderia ser destruído por enzimas das bactérias
Gram-negativas (LEVY; MARSHALL, 2004).
Considerando que a análise filogenética revelou a identidade potencial de 86
isolados e que 45 isolados não foram definidos em nível de espécie, pode-se deduzir
que a atividade antimicrobiana observada pode ser decorrente de metabólitos já
conhecidos e de outros ainda não descritos. A produção de metabólitos secundários
pode ser influenciada pelo nicho ecológico, produção de mecanismos de defesa com
o objetivo de manter sua sobrevivência contras outros microrganismos (KUMBHAR;
WATVE, 2013).
Por outro lado, vale ressaltar que a identificação molecular pelo
sequenciamento do fragmento de DNA da subunidade 16S e da região ITS dos
isolados permitiu o conhecimento das relações filogenéticas entre os
microrganismos deste estudo e as sequências de DNA microbiano existentes no
Genbank. Com isso, utilizou-se esta identificação para fazer uma análise
comparativa do perfil morfológico obtido, para cada um dos isolados, com imagens
64
disponíveis em artigos publicados. O resultado dessa análise mostrou que o
sequenciamento foi importante na determinação e/ou identificação final dos isolados.
Finalmente, o isolamento em solo maranhense de diferentes espécies de
microrganismos com atividade contra os patógenos: C. albicans, S. aureus, E.
faecalis e outras microrganismos testados, poderá mostrar novas perspectivas para
o desenvolvimento de antimicrobianos a partir desses isolados. Principalmente,
porque muitos deles não apresentaram similaridade genética com microrganismos
de antibióticos já conhecidos, indicando que pode-se estar diante de novos
microrganismos. Consequentemente, há um potencial inerente de descoberta de
novos antibióticos a serem caracterizados em estudos posteriores.
65
9. CONCLUSÕES
O solo do Estado do Maranhão contém microrganismos com ação
antimicrobiana, principalmente antifúngica e contra bactérias Gram-positivas,
contudo, uma boa parcela ainda não foi identificada. Entre estes gêneros é possível
haver espécies não catalogadas que produzem novos compostos antimicrobianos
farmacologicamente viáveis para tratamento de infecções causas por
microrganismos multirresistentes. A atividade inibitória observada neste estudo não
está relacionada a alguma atividade enzimática, o que sugere que, de fato, há uma
produção de metabólitos com atividade antimicrobiana afetando a viabilidade das
cepas e linhagens indicadoras testadas.
Houve uma predominância de isolados identificados apenas em nível de
gênero, ou seja, não foram caracterizados do ponto de vista molecular,
considerando-se a análise filogenética realizada. Desta forma, abre-se um leque de
possibilidades de refinamento do trabalho, com o objetivo de identificar as espécies
e os compostos responsáveis pelas atividades antimicrobianas aqui observadas.
Obviamente, mais estudos com o emprego de técnicas mais avançadas, como por
exemplo, a utilização de microchips para cultivos de microrganismo, são necessários
a fim de elucidar se estes compostos já foram descritos na literatura ou não.
66
10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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