Interacção do vanádio com a miosina de músculo esquelético ... · A todos os meus colegas dos...

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Relatoacuterio de Projecto de Bioquiacutemica

Interacccedilatildeo do vanaacutedio com a

miosina de muacutesculo

esqueleacutetico de coelho

Joana Wilton Pereira

nordm 20201

Licenciatura em Bioquiacutemica

Julho de 2009

1

Agradecimentos

Ao meu orientador Doutor Rui O Duarte pela oportunidade dada para estudar este sistema tatildeo

fascinante e pelos preciosos conselhos em relaccedilatildeo agrave espectroscopia de Ressonacircncia

Paramagneacutetica Electroacutenica

Agrave Susana Ramos pela orientaccedilatildeo equilibrada paciecircncia dedicaccedilatildeo conselhos preciosos humor e

amizade sem os quais natildeo teria sido possiacutevel realizar este trabalho Obrigada por me teres

desafiado a ser a melhor aprendiz de cientista que conseguisse ndash com planeamento e

determinaccedilatildeo tudo se consegue

Ao Professor Doutor Manuel Aureliano (supervisor) da Faculdade de Ciecircncias e Tecnologia da

Universidade do Algarve pela recepccedilatildeo calorosa disponibilidade das suas instalaccedilotildees para a

obtenccedilatildeo da actina e pela gentil cedecircncia do subfragmento-1 de miosina imprescindiacutevel para o

estudo que realizei

Ao Rui Almeida pelos preciosos conselhos e colaboraccedilatildeo que estimularam o meu fasciacutenio pela

ciecircncia A disponibilidade que mostraste para me esclarecer sempre com clareza e simpatia

tornaram o meu trabalho de todos os dias mais agradaacutevel

Ao Ameacuterico Duarte pela indispensaacutevel ajuda para a realizaccedilatildeo da electroforese em condiccedilotildees

desnaturantes e pela amizade demonstrada nos momentos em que o nervosismo tomou conta de

mim

Agrave Dra Maria do Rosaacuterio Caras-Altas pela disponibilidade concedida no uso do espectroacutemetro de

RMN equipamento crucial na realizaccedilatildeo deste trabalho

A todos os meus colegas dos laboratoacuterios 407 e 613 cujo bom-humor e entreajuda tornaram os

meus dias mais agradaacuteveis

2

Abreviaturas e Siacutembolos

Absx ndash Absorvecircncia ao comprimento de onda x (em nm)

ADP - Adenosina 5rsquo-difosfato

ATP ndash Adenosina 5rsquo-trifosfato

ATPase ndash Adenosina 5rsquo-trifosfatase

BSA ndash Albumina de soro bovino

-Me - -Mercaptoetanol

CNT ndash Aniatildeo 3-carboxilato-4-nitrotiofenolato

Cys ndash Cisteiacutena

DTNB ndash 55rsquo-ditiobis(2-aacutecido nitrobenzoacuteico)

- Coeficiente de extinccedilatildeo (molar)

EDTA ndash Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico

ELC ndash Cadeia leve essencial de miosina

F-actina ndash Forma filamentosa da actina

g ndash Aceleraccedilatildeo da gravidade

G-actina ndash Forma monomeacuterica da actina

h ndash Horas

HEPES ndash Aacutecido 4-(2-hidroxiletil)-1-piperazineetanosulfoacutenico

HMM ndash Meromiosina pesada

IC50 ndash Concentraccedilatildeo inibitoacuteria 50

LDH ndash Lactato desidrogenase

Miosina-II ndash Miosina do tipo II

Met - Metionina

NAD+ ndash Nicotinamida adenina dinucleoacutetido (forma oxidada)

NADH ndash Nicotinamida adenina dinucleoacutetido (forma reduzida)

PDB ndash Protein Data Bank

Pi ndash Fosfato inorgacircnico

PEP ndash Fosfoenolpiruvato

PK ndash Piruvato cinase

PM ndash Peso Molecular

3

ppb ndash Partes por biliatildeo (1 gL)

ppm ndash Partes por milhatildeo (1 mgL)

PSA ndash persulfato de amoacutenio

Rf - Mobilidade relativa

RLC ndash Cadeia leve regulatoacuteria de miosina

RMN ndash Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

ROS ndash Espeacutecies reactivas de oxigeacutenio

RPE ndash Ressonacircncia Paramagneacutetica Electroacutenica

S1 ndash Subfragmento-1 da miosina II

SDS ndash Dodecilo sulfato de soacutedio

SDS-PAGE ndash Electroforese em gel de poliacrilamida com SDS (condiccedilotildees desnaturantes)

SH1 ndash Grupo tiol mais reactivo da miosina (resiacuteduo Cys-707)

SH2 ndash segundo grupo tiol mais reactivo da miosina (resiacuteduo Cys-697)

SNC ndash Sistema Nervoso Central

TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico

TEMED ndash NNNrsquoNrsquo-tetrametiletilenodiamina

Tris ndash 2-amino-2-hidroximetil-13-propanodiol

Trp ndash triptofano

Tyr ndash tirosina

UV ndash gama ultravioleta do espectro electromagneacutetico

Vis ndash gama visiacutevel do espectro electromagneacutetico

4

Resumo

A exposiccedilatildeo a vanaacutedio conduz a uma diminuiccedilatildeo na actividade ATPaacutesica da miosina e provoca a

oxidaccedilatildeo dos grupos sulfidrilo desta proteiacutena No entanto natildeo estaacute integralmente esclarecido

quais os efeitos especiacuteficos que ocorrem na miosina quando exposta ao vanaacutedio Nesse sentido

interessou determinar in vitro quais as alteraccedilotildees estruturais funcionais e moleculares ocorridas

no Subfragmento-1 de miosina de muacutesculo esqueleacutetico de coelho apoacutes a exposiccedilatildeo croacutenica a

soluccedilotildees de metavanadato decavanadato e vanadilo Verificou-se que a exposiccedilatildeo de S1 (005

mgmL) a decavanadato inibe a sua actividade Mg2+

-ATPaacutesica sendo o valor de IC50 para esta

inibiccedilatildeo de 266 plusmn 07 microM decavanadato Na presenccedila de actina o valor de IC50 eacute de 28 plusmn 1 microM

decavanadato A perda de funcionalidade proteica poderaacute dever-se agrave oxidaccedilatildeo de 2 resiacuteduos de

Cys de S1 natildeo expostos ao solvente apoacutes exposiccedilatildeo a 1000 microM de decavanadato Verificou-se

que as espeacutecies oligomeacutericas de vanaacutedio com maior afinidade para o S1 satildeo o decavanadato e o

tetravanadato Revelaram-se os possiacuteveis ligandos do vanaacutedio no S1 atraveacutes de espectroscopia de

RPE Globalmente os resultados obtidos sugerem um efeito significativo do vanaacutedio nos estados

de oxidaccedilatildeo (IV) e (V) na estrutura e funccedilatildeo do S1 em concentraccedilotildees facilmente alcanccedilaacuteveis

daquele metal no ambiente terrestre

Summary

The exposure to vanadium leads to a decrease of the myosin ATPase activity and provokes the

oxidation of its sulfydryl groups However the specific effects of vanadium on myosin are not yet

fully understood Consequently the objectives of the present work were to establish the structural

funtional and molecular changes suffered by rabbit myosin subfragment-1 after cronic exposure to

metavanadate decavanadate and vanadyl solutions It was verified that the exposure of S1 (005

mgmL) to decavanadate results in the inhibition of its Mg2+

-ATPase activity resulting in the

IC50 value 266 plusmn 07 microM decavanadate In the presence of actin the IC50 value was 28 plusmn 1 microM

decavanadate It is suggested that the loss of protein function may be due to the oxidation of 2

core cysteine residues after exposure to 1000 microM decavanadate It was also observed that the

decavanadate and tetravanadate species show the highest affinity for S1 Lastly the possible S1

ligands to vanadium were revealed through EPR spectroscopy Globally the obtained results

point to significant effect of V(V) and V(IV) states on S1 structure and function for easily

reachable environmental vanadium concentrations

5

Iacutendice

1 Introduccedilatildeo

11 Muacutesculo esqueleacutetico

111 Miosina

112 Actina

113 Mecanismos moleculares da contracccedilatildeo muscular

1131 Regulaccedilatildeo da contracccedilatildeo muscular

12 Vanaacutedio

121 Propriedades quiacutemicas

1211 Vanaacutedio (IV)

1212 Vanaacutedio (V)

122 Metabolismo e efeito na actividade enzimaacutetica

13 Vanaacutedio e muacutesculo esqueleacutetico

14 Objectivos do projecto

2 Discussatildeo de Resultados

21 Caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas isoladas

211 Anaacutelise do estado de pureza

212 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo proteica

2121 Subfragmento-1 de miosina

2122 Actina

22 Mediccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de S1 de miosina

221 Mediccedilatildeo das actividades de Ca2+

-ATPase e K+EDTA-ATPase de S1 pelo meacutetodo de Fiske-

Subarow modificado

222 Mediccedilatildeo da actividade de Mg2+

-ATPase de S1 estimulada por actina pelo meacutetodo de

enzimas acopladas

23 Preparaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo das soluccedilotildees de vanaacutedio

231 Anaacutelise da composiccedilatildeo das soluccedilotildees de vanadato por espectroscopia de 51V-RMN efeito da

concentraccedilatildeo da espeacutecie

232 Estabilidade das soluccedilotildees de decavanadato anaacutelise por espectroscopia de absorccedilatildeo UVVis

24 Interacccedilatildeo de S1 com vanaacutedio(V)

241 Anaacutelise por espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

242 Actividade Mg2+

-ATPaacutesica de S1 de miosina na presenccedila de decanadato

243 Quantificaccedilatildeo de cisteiacutenas reduzidas pelo meacutetodo de Ellman

25 Interacccedilatildeo de S1 com vanaacutedio(IV)

251 Anaacutelise por espectroscopia de Ressonacircncia Paramagneacutetica Electroacutenica

3 Procedimento Experimental

31 Reagentes

32 Meacutetodos

321 Isolamento e purificaccedilatildeo das proteiacutenas de muacutesculo esqueleacutetico de coelho

3211 Purificaccedilatildeo da miosina preparaccedilatildeo de Subfragmento 1 por digestatildeo quimotriacutepsica da

miosina

32111 Purificaccedilatildeo da miosina

32112 Preparaccedilatildeo de Subfragmento-1 de miosina por digestatildeo quimotriacutepsica

3212 Isolamento e purificaccedilatildeo de actina

32121Obtenccedilatildeo do ldquopoacute de acetonardquo

32122 Purificaccedilatildeo da actina a partir de ldquopoacute de acetonardquo

331 Quantificaccedilatildeo das proteiacutenas isoladas

3311 Quantificaccedilatildeo pelo meacutetodo de Bradford

6

3312 Quantificaccedilatildeo pelo meacutetodo directo

332 Electroforese em condiccedilotildees desnaturantes (SDS-PAGE)

34 Mediccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de S1



Subarow modificado



enzimas acopladas

35 Preparaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo das soluccedilotildees de vanaacutedio por Espectroscopia UV-Visiacutevel e

Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

351 Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de vanadato

352 Anaacutelise por UV-Vis para determinaccedilatildeo da ordem da reacccedilatildeo


36 Interacccedilatildeo de S1 com vanaacutedio

361 Quantificaccedilatildeo de cisteiacutenas reduzidas

362 Interacccedilatildeo de V(IV) com subfragmento-1 de miosina

362 1 Anaacutelise por Ressonacircncia Paramagneacutetica Electroacutenica

363 Interacccedilatildeo de S1 com V (V) por Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN)

4 Conclusotildees gerais

5 Estudos futuros

6 Referecircncias bibliograacuteficas

7



A capacidade de locomoccedilatildeo eacute uma das caracteriacutesticas fundamentais da maioria dos organismos

vivos A contracccedilatildeo muscular um dos fenoacutemenos que a torna possiacutevel apresenta grande

complexidade e tem vindo a ser utilizado como modelo para a compreensatildeo de sistemas menos

especializados de mobilidade celular [1]

No que diz respeito agrave sua fisiologia morfoloacutegica os muacutesculos dos vertebrados dividem-se em

lisos e estriados Estes uacuteltimos devem o seu nome agrave alternacircncia de zonas claras e escuras

observaacuteveis ao microscoacutepio electroacutenico de que resulta um aspecto estriado Os muacutesculos

estriados podem ainda ser divididos em duas subclasses muacutesculos esqueleacuteticos e cardiacuteacos [2]

consoante a forma celular (respectivamente longitudinal ou ramificada) ou tipo de contracccedilatildeo das

ceacutelulas que o compotildeem (respectivamente voluntaacuteria e involuntaacuteria) [3]

Os muacutesculos estriados esqueleacuteticos satildeo assim designados devido agrave sua localizaccedilatildeo no

organismo ndash ligados aos ossos da coluna vertical braccedilos e pernas Satildeo constituiacutedos por feixes de

ceacutelulas multinucleadas (miofibras) que contecircm miofibrilas paralelas de cerca de 1 m de

diacircmetro associadas agrave contracccedilatildeo voluntaacuteria raacutepida e forte em actividades de coordenaccedilatildeo

complexa [4] Cada feixe apresenta um diacircmetro compreendido entre 20 e 100 m e um

comprimento maacuteximo que pode atingir vaacuterios centiacutemetros (Fig 11)

Figura 11 ndash Organizaccedilatildeo hieraacuterquica geral do muacutesculo-esqueleacutetico (adaptado de Purves et al 2003 [3])

No muacutesculo-esqueleacutetico as zonas claras e escuras supramencionadas correspondem a zonas de

menor e maior densidade electroacutenica respectivamente As zonas claras constituem as bandas I (de

8

ldquoisotropiardquo ndash polarizaccedilatildeo uniforme em todas as direcccedilotildees) enquanto as zonas escuras constituem

as bandas A (de ldquoanisotropiardquo ndash polariza a luz visiacutevel) A banda I encontra-se dividida

transversalmente por uma linha escura ndash linha Z de densidade electroacutenica e refracccedilatildeo superiores

No interior de cada banda A existe uma zona transversal menos densa ndash zona H ndash rica em enzimas

importantes para o metabolismo celular No centro desta zona existe uma linha perpendicular

mais escura ndash linha M [2]

A unidade fundamental da contracccedilatildeo muscular eacute designada por sarcoacutemero (Fig 12) Encontra-se

repetida de forma regular ao longo das miofibrilas apresentando um comprimento de 25 a 3 m

aquando do relaxamento muscular diminuindo aquando da contracccedilatildeo muscular

Figura 12 ndash Representaccedilatildeo de fotomicrografia electroacutenica e esquemaacutetica do sarcoacutemero Os filamentos grossos e

finos satildeo maioritariamente constituiacutedos por miosina e actina respectivamente (Adaptado de Stryer 2002 [2])

As secccedilotildees de corte do sarcoacutemero datildeo conta da presenccedila de dois tipos de filamentos proteicos ndash os

filamentos grossos cujo diacircmetro eacute de 15 nm constituiacutedos sobretudo por miosina e os filamentos

finos com um diacircmetro de 9 nm constituiacutedos sobretudo por actina tropomiosina e pelo complexo

de troponina [2]

111 Miosina

Actualmente o termo miosina refere-se a uma superfamiacutelia diversa de motores moleculares

capazes de hidrolisar ATP e de se ligarem reversivelmente agrave actina A classificaccedilatildeo da

superfamiacutelia das miosinas nas 15 classes distintas faz-se atraveacutes de homologia entre as diferentes

sequecircncias [A] Eacute tambeacutem possiacutevel a classificaccedilatildeo por subclasses das quais se destaca a subclasse

4 proveniente do muacutesculo-esqueleacutetico e cardiacuteaco de vertebrados Este estudo focar-se-aacute apenas

nas miosinas de classe II (miosina-II) presente nos filamentos grossos do muacutesculo estriado

esqueleacutetico [B] e em ceacutelulas natildeo musculares A funccedilatildeo da miosina-II depende da sua localizaccedilatildeo

celular e tecidular

9

A miosina-II eacute constituiacuteda por duas cadeias polipeptiacutedicas idecircnticas denominadas cadeias pesadas

de miosina (HC) enroladas entre si e cujo peso molecular (PM) estaacute compreendido entre 171 e

241 kDa) Estruturalmente as HC dividem-se em 3 domiacutenios funcionais - cabeccedila pescoccedilo e

cauda como se pode observar na Fig 13 Agraves cabeccedilas ou zonas globulares estatildeo associados dois

pares de cadeias leves (peso molecular entre 15 e 30 kDa) que se dividem em dois tipos

essencial (ELC) e regulatoacuterio (RLC)

Figura 13 ndash Estrutura esquemaacutetica da moleacutecula de miosina-II Destacam-se as duas cabeccedilas globulares e a cauda

filamentosa ligadas entre si por uma zona flexiacutevel denominada pescoccedilo As cadeias leves (a verde e vermelho)

encontram-se associadas agraves cabeccedilas globulares

As cabeccedilas globulares contendo os locais de ligaccedilatildeo agrave actina e aos nucleoacutetidos mantecircm os seus

elementos estruturais baacutesicos conservados em todas as classes sendo estes constituiacutedos por 720-

80 aa A regiatildeo do pescoccedilo eacute constituiacuteda por uma longa heacutelice pertencente agrave cadeia pesada

que se encontra estabilizada atraveacutes da ligaccedilatildeo a subunidades de cadeia leve A estrutura do

pescoccedilo envolvida na ligaccedilatildeo agraves cadeias leves eacute denominada de motivo IQ cuja estrutura

consensual eacute IQXXXRGXXXR1 O pescoccedilo serve como extensatildeo do comprimento da cabeccedila de

modo a actuar como alavanca durante a contracccedilatildeo muscular [A]A regiatildeo da cauda ou acircncora

apresenta bastante divergecircncia no que respeita agrave sua sequecircncia estrutura e funccedilatildeo No entanto

pensa-se que a sua funccedilatildeo centrar-se-aacute na autoassociaccedilatildeo das vaacuterias moleacuteculas de miosina-II

atraveacutes da regiatildeo de coiled-coil Esta confere assimetria agrave moleacutecula e permite a formaccedilatildeo de

filamentos grossos capazes de translocar filamentos de actina [A]

Na regiatildeo da cabeccedila da miosina existem 2 regiotildees extremamente sensiacuteveis agrave proteoacutelise A

clivagem em ambos os locais resulta na produccedilatildeo de trecircs fragmentos um compreendendo o N-

terminal (fragmento 25 kDa) outro a regiatildeo central (50 kDa) e um terceiro o C-terminal (20 kDa)

(Fig 14) Estes fragmentos dissociam-se em condiccedilotildees desnaturantes e natildeo constituem domiacutenios

independentes da cabeccedila mas provavelmente loops flexiacuteveis uma vez que natildeo foram observadas

na estrutura cristalina Os vaacuterios fragmentos obtidos em diferentes condiccedilotildees foram cruciais para

a elucidaccedilatildeo das vaacuterias funccedilotildees da moleacutecula

A regiatildeo compreendida entre os fragmentos 25 e 50 kDa (loop 1) localiza-se directamente por

1 I = Isoleucina Q= Glutamina X = qualquer dos 20 aminoaacutecidos padratildeo R= Arginina G= Glicina

10

cima do local de ligaccedilatildeo ao nucleoacutetido A regiatildeo entre os fragmentos de 50 e 20 kDa (loop 2)

encontra-se perto da intersecccedilatildeo entre os domiacutenios da cabeccedila e do pescoccedilo e deveraacute interagir com

a actina uma vez que a ligaccedilatildeo desta a protege da proteoacutelise Na ausecircncia do loop 2 a miosina

liga mais fracamente agrave actina do que no caso da miosina intacta A sequecircncia primaacuteria de ambos

os loops apresenta conservaccedilatildeo reduzida sendo provaacutevel que sejam responsaacuteveis por muita da

diversidade das diferentes propriedades enzimaacuteticas presentes em diferentes isoformas

No fragmento de 20 kDa existem dois grupos sulfidrilo Cys-707 e -697 usualmente

denominados de SH1 e SH2 devido agrave ordem da sua reactividade quiacutemica Na presenccedila de

nucleoacutetidos pode ocorrer o ldquocross-linkingrdquo entre estes dois grupos incluindo a oxidaccedilatildeo a uma

ponte dissulfureto

Devido agrave insolubilidade da miosina-II nativa a estrateacutegia adoptada para os estudos com esta

proteiacutena eacute frequentemente a sua clivagem em fragmentos funcionais separaacuteveis Um dos locais de

clivagem ocorre tipicamente a 130 kDa do N-terminal produzindo a meromiosina pesada (HMM)

e a meromiosina leve (LMM) [C] A HMM eacute formada pelas 2 cabeccedilas e pescoccedilo e apresenta

propriedades semelhantes agrave miosina sem digestatildeo (ligaccedilatildeo e translocaccedilatildeo de actina e hidroacutelise de

MgATP)

A HMM pode ser novamente clivada atraveacutes de uma reacccedilatildeo de proteoacutelise produzindo os

subfragmentos 1 (S1) e 2 (S2)O S1 (90 kDa) eacute enzimaticamente activo sendo constituiacutedo pelos

domiacutenios da cabeccedila e do pescoccedilo e apresentando associaccedilatildeo agraves duas cadeias leves ou apenas agrave

ELC (Fig 14)Em alternativa o S1 pode ser produzido por clivagem directa da miosina intacta

formando-se tambeacutem um fragmento em forma de cilindro que consiste nas regiotildees S2 e LMM

(Ref)Utiliza-se extensivamente o S1 para estudos cineacuteticos e de ligaccedilatildeo agrave actina uma vez que a

sua solubilidade simplifica o planeamento da experiecircncia e a subsequente interpretaccedilatildeo dos dados

[A]

Figura 14- Estrutura do subfragmento-1 de miosina de muacutesculo esqueleacutetico com ecircnfase nos domiacutenios de 50 kDa

central (a vermelho) 25 kDa no N-terminal (a verde) e 20 kDa no C-terminal (a azul) As cadeias leves essenciais

encontram-se a amarelo e as cadeias leves regulatoacuterias a lilaacutes Os locais de ligaccedilatildeo agrave actina e ao ATP estatildeo

igualmente destacados (adaptado de Holmes e Geeves 1999 [D])

11

112 Actina

O termo ldquoactinardquo refere-se a uma famiacutelia extremamente conservada de proteiacutenas citoplasmaacuteticas

presente em todos os eucariotas Esta proteiacutena natildeo se encontra nos procariotas [E] A maioria das

actinas possui peso molecular proacuteximo de 42 kDa outra evidecircncia do seu grau elevado de

conservaccedilatildeo no que concerne agrave sequecircncia e ao nuacutemero de aminoaacutecidos Os eucariotas superiores

apresentam um grande nuacutemero de isoformas de actina que por sua vez se encontram codificados

por um ainda maior nuacutemero de genes (Ref) A expressatildeo das isoformas eacute diferencial consoante o

tecido e sua especializaccedilatildeo pelo que deveratildeo possuir funccedilotildees e mecanismos direccionais

diferentes (Ref) Foi ainda observado que os mRNA das diferentes isoformas apresentam uma

distribuiccedilatildeo heterogeacutenea nas ceacutelulas de forma semelhante aos seus produtos proteicos [F] Estes

dados suportam a hipoacutetese supramencionada do direccionamento das isoformas de actina para um

determinado local na ceacutelula de acordo com as suas funccedilotildees

A actina presente no citoesqueleto eacute responsaacutevel por processos como o mecanismo contraacutectil

fagocitose manutenccedilatildeo e alteraccedilatildeo da estrutura celular locomoccedilatildeo transporte de organelos

regulaccedilatildeo do transporte de solutos entre outras Nos eucariotas superiores estaacute ainda envolvida

no transporte de gracircnulos de pigmento retinoacuteide [G] transporte de gracircnulos no axoplasma [H] e

secreccedilatildeo entre outros [E] Actualmente a isoforma da actina (-actina) eacute a melhor estudada

encontrando-se envolvida no mecanismo contraacutectil [E]

Os filamentos de -actina tecircm cerca de 1m de comprimento e 80 Å Consistem em duas cadeias

de actina filamentosa (F-actina) organizados em heacutelice [I] (Holmes et al 1990) sobre os quais

se encontram outras proteiacutenas ndash a troponina (C I e T) e a tropomiosina (Azevedo 1999) (Figura

15) A troponina eacute filamentosa e localiza-se nas depressotildees da heacutelice de F-actina conferindo

rigidez aos filamentos finos Por sua vez a tropomiosina eacute essencial na regulaccedilatildeo do mecanismo

contraacutectil

Figura 15 ndash Modelo estrutural dos filamentos de F-actina contendo a tropomiosina e o complexo de troponina (I C

e T) (Adaptado de Susana Ramos 2005 [J])

12

A F-actina eacute formada atraveacutes da polimerizaccedilatildeo de subunidades globulares de actina (G-actina) A

G-actina eacute composta por 2 domiacutenios de tamanho semelhante separados pelos bolsos de ligaccedilatildeo(1)

de catiotildees divalentes e(2) de nucleoacutetidos [KLM] Estes por sua vez estatildeo subdivididos noutros

dois de menores dimensotildees (1-4) (Fig 16) cada um envolvido nas interacccedilotildees actina-actina ou

na formaccedilatildeo do topo de ligaccedilatildeo do nucleoacutetido As regiotildees N-terminal e C-terminal estatildeo proacuteximas

uma da outra no subdomiacutenio 1 [E]

Figura 16 ndash Estrutura do monoacutemero de actina Encontram-se representados os subdomiacutenios 1 a 4 e a vermelho a

moleacutecula de ATP junto do respectivo local de ligaccedilatildeo (Protein Data Bank ID 1j6z)


A contracccedilatildeo muscular ocorre atraveacutes do deslizamento dos filamentos finos (de actina) por entre

os filamentos grossos (de miosina) conseguida pela reacccedilatildeo de hidroacutelise de ATP e regulada pela

tropomiosina e pelo complexo de troponina em resposta a impulsos nervosos Este mecanismo foi

inicialmente proposto por Huxley-Niedergerke [N] e Huxley-Hanson [O] ambos em 1954 A base

experimental de ambos os estudos foi a inexistecircncia de variaccedilatildeo do tamanho dos filamentos

durante a contracccedilatildeo A banda A apresenta sempre as mesmas dimensotildees por outro lado a banda

I a zona H diminuem consideravelmente aquando da contracccedilatildeo (Figs 12 e 17)

Figura 17 ndash Modelo da contracccedilatildeo muscular ndash deslizamento dos filamentos finos (azuis) relativamente aos

filamentos grossos (rosa) (Adaptado de Stryer 2002 [2])

13

Na ausecircncia de ATP e supondo a ausecircncia de inibiccedilatildeo da interacccedilatildeo actina-miosina as proteiacutenas

encontram-se fortemente associadas formando o complexo actomiosina (AM) (Figura 15)

Nestas condiccedilotildees as cabeccedilas de miosina formam um acircngulo de 45ordm com o eixo dos filamentos

finos de actina [P]

Na presenccedila de ATP o complexo AM dissocia-se jaacute que a afinidade do complexo M-ATP para a

actina eacute 105 vezes inferior agrave afinidade da miosina para a actina O ATP liga-se agrave miosina

ocorrendo seguidamente a reacccedilatildeo de hidroacutelise de ATP Os produtos daiacute resultantes ndash ADP e Pi -

permanecem ligados agrave miosina formando o complexo M-ADP-Pi Com a ligaccedilatildeo subsequente agrave

actina forma-se o complexo AM-ADP-Pi no qual as cabeccedilas de miosina apresentam um acircngulo

recto com o eixo do muacutesculo [P] Neste ponto daacute-se a libertaccedilatildeo progressiva de Pi e ADP Eacute

provaacutevel que a energia proveniente da hidroacutelise do ATP provoque uma alteraccedilatildeo do acircngulo de

ligaccedilatildeo das cabeccedilas de miosina ao filamento de actina passando novamente de 90ordm para 45ordm [P]

Esta alteraccedilatildeo conformacional provoca o deslizamento do filamento de actina para o centro do

sarcoacutemero cujo encurtamento promove a contracccedilatildeo das miofibrilas O processo supracitado

ocorre em cerca de 1ms[Q] e encontra-se resumido na Fig 18

Figura 18 ndash Esquema cineacutetico da hidroacutelise de ATP pela miosina (Adaptado de Sellers 1999 [A])


O mecanismo pelo qual se processa a regulaccedilatildeo muscular foi inicialmente descrito por estudos

distintos de Haselgrove Huxley e Parrey-Squire todos em 1973 [RST] Aleacutem da implicaccedilatildeo

directa da tropomiosina e do complexo de troponina a concentraccedilatildeo de Ca2+

no muacutesculo em

relaxamento eacute bastante reduzida (10-7

M) aumentando notavelmente aquando da contracccedilatildeo (10-5

-

10-3

M)

Resumidamente quando ocorre a excitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a despolarizaccedilatildeo da

membrana plasmaacutetica eacute difundida ateacute ao interior do tecido atraveacutes dos tuacutebulos transversais

(invaginaccedilotildees da membrana plasmaacutetica da fibra muscular) A despolarizaccedilatildeo provoca a abertura

dos canais ioacutenicos de Ca2+

do retiacuteculo sarcoplasmaacutetico adjacente Como a concentraccedilatildeo de Ca2+

no interior do organelo eacute muito elevada o caacutelcio passa raacutepida e uniformemente para o citosol

14

Assim a regulaccedilatildeo da contracccedilatildeo ocorre com coordenaccedilatildeo e rapidez na totalidade das miofibrilas

do tecido muscular (Ref)

Em repouso a troponina I encontra-se posicionada de tal forma que a proteiacutena adjacente

troponina C impede estruturalmente a ligaccedilatildeo das cabeccedilas da miosina agrave actina (acircngulo =50ordm) O

aumento da concentraccedilatildeo intracelular de Ca2+

provoca um aumento da sua disponibilidade para

ligar agrave troponina C (Fig 19)

Figura 19ndash Regulaccedilatildeo do mecanismo contraacutectil no muacutesculo esqueleacutetico pelo complexo de troponina

Como consequecircncia a troponina C altera a sua conformaccedilatildeo (=70ordm) associando-se agrave troponina I

que deixa de inibir a ligaccedilatildeo das pontes transversais A alteraccedilatildeo anterior eacute transmitida agrave

tropomiosina atraveacutes da troponina T adjacente agrave C o que provoca o deslocamento da

tropomiosina na direcccedilatildeo do interior do sulco do filamento de actina Assim eacute possiacutevel a

interacccedilatildeo eficaz entre actina e miosina A Ca2+

-ATPase do retiacuteculo sarcoplasmaacutetico provoca a

reacumulaccedilatildeo do iatildeo caacutelcio no organelo impedindo o prolongamento desnecessaacuterio da contracccedilatildeo

(Refordf)

12 Vanaacutedio

O vanaacutedio eacute um metal de transiccedilatildeo pertencente ao grupo VB da tabela perioacutedica Foi

primeiramente descoberto em 1801 por Andreacutes Manuel del Riacuteo que concluiu erradamente que era

idecircntico ao croacutemio e definitivamente por Nils Gabriel Svenson em 1831 Recentemente foram

descobertas importantes funccedilotildees bioloacutegicas deste elemento provavelmente essencial para os

humanos de que se destaca no contexto do presente relatoacuterio a possibilidade de actuar como

anaacutelogo do grupo fosfato e a inibiccedilatildeo de enzimas in vitro como eacute o caso da actividade ATPaacutesica

da miosina

Eacute um metal soacutelido agrave temperatura ambiente que se encontra amplamente distribuiacutedo nos vaacuterios

ecossistemas em dois isoacutetopos naturais ndash 50

V e 51

V ndash raramente excedendo 01 partes por biliatildeo

15

(ppb) Estaacute associado a cerca de 70 minerais diferentes na natureza (dos quais se destacam o

uracircnio cobre chumbo zinco fosfato e titacircnio ferroso) especialmente na forma de vanadato ou

pentoacutexidos de vanaacutedio O vanaacutedio eacute um dos principais constituintes da mateacuteria orgacircnica foacutessil

com especial ecircnfase para o carvatildeo oacuteleo de crude e foacutesseis carbonaacuteceos [UV] bem como em

alimentos consumidos pelo Homem (salsa pimenta preta cogumelos marisco vegetais cereais

gorduras e oacuteleos) [W] Estes constituem a maior fonte de exposiccedilatildeo ao vanaacutedio da maioria da

populaccedilatildeo humana [X]

Normalmente a entrada do vanaacutedio no organismo ocorre por inalaccedilatildeo ou em menores

quantidades por absorccedilatildeo pelo tracto gastrointestinal ou pela pele O seu armazenamento centra-

se no fiacutegado rins ceacuterebro coraccedilatildeo muacutesculos e ossos No entanto a retenccedilatildeo de vanaacutedio no

organismo humano eacute reduzida ndash em condiccedilotildees normais cerca de 100 M (em muitos tecidos a

quantidade eacute inferior a 10 ngg de tecido) [Y]

Actualmente natildeo existem provas de deficiecircncia nutricional de vanaacutedio em humanos ou de

enzimas que contenham vanaacutedio em animais superiores No entanto vaacuterios estudos relacionam a

ocorrecircncia de deficiecircncia em galinhas e ratos devido a uma alimentaccedilatildeo pobre em vanaacutedio Os

sintomas relatados incluem retardamento do crescimento malformaccedilotildees oacutesseas perturbaccedilotildees no

metabolismo lipiacutedico e estagnaccedilatildeo reprodutiva entre outros [Z AA AB] Os efeitos fisioloacutegicos

do vanaacutedio podem depender do tipo de composto ou de oligoacutemero uma vez que consoante as

suas estabilidade labilidade e nuacutemero de coordenaccedilatildeo as respostas seratildeo diferenciadas ao niacutevel

dos organismos vivos

Por outro lado a toxicidade do vanaacutedio encontra-se bem caracterizada existindo sintomas

descritos em vaacuterios mamiacuteferos (inclusive o Homem) que incluem diarreias catildeibras irritaccedilatildeo da

pele e mucosas palpitaccedilotildees cardiacuteacas anemia pneumonia bronquite perturbaccedilotildees no Sistema

Nervoso Central (SNC) entre outros (Ref) A toxicidade varia geralmente com a natureza do

composto com aumento proporcional agrave sua valecircncia Verificou-se que a forma de entrada do

vanaacutedio tem tambeacutem efeito na sua toxicidade ndash os maiores niacuteveis verificaram-se por injecccedilatildeo

intravenosa da amostra sendo progressivamente inferiores por inalaccedilatildeo e finalmente por

ingestatildeo [X AA] A ampla utilizaccedilatildeo dos compostos de vanaacutedio na induacutestria quiacutemica bem como

as elevadas quantidades de vanaacutedio libertadas atraveacutes da combustatildeo dos oacuteleos de crude

contribuem consideravelmente para o aumento da biodisponibilidade do vanaacutedio Como tal o

interesse neste elemento e nos problemas ambientais por ele causados tem vindo a aumentar

significativamente [V]


16

A quiacutemica do vanaacutedio eacute extraordinariamente complexa pelo que originou vaacuterias interpretaccedilotildees

incorrectas desde a sua descoberta No entanto as suas propriedades dependem em uacuteltima

anaacutelise da configuraccedilatildeo electroacutenica do elemento Assim a variabilidade encontrada no

comportamento quiacutemico do vanaacutedio pode dever-se agrave sua configuraccedilatildeo ndash [Ar] 3d2 4s

2 ndash que

permite a formaccedilatildeo de vaacuterios estados de oxidaccedilatildeo (de +2 a +5) Em soluccedilatildeo aquosa os estados de

oxidaccedilatildeo estaacuteveis vatildeo de V(V) a V(II) Destes apenas os +3 a +5 satildeo biologicamente importantes

jaacute que o V(II) apresenta demasiada capacidade redutora para existir nos organismos vivos

conhecidos [AC]

No fluido extracelular os compostos de vanaacutedio encontram-se predominantemente na forma de

monovanadatos (V(V)) livres ou ligados agrave transferina do soro ou agrave hemoglobina (Refordf) Os iotildees de

vanadato livres satildeo transportados para o meio intracelular atraveacutes de canais ioacutenicos inespeciacuteficos

Jaacute no ambiente intracelular os compostos sofreratildeo uma bio-reduccedilatildeo atraveacutes da acccedilatildeo da

glutationa ou outros compostos com grupos ndashOH como pentoses hexoses ou etanolaminas [V] A

reoxidaccedilatildeo de vanadilo (V(IV)) intracelular a vanadato (V(V)) provocaria a acumulaccedilatildeo toacutexica

destes uacuteltimos pelo que a complexaccedilatildeo da espeacutecie reduzida o impede O transporte de vanaacutedio

para o interior da ceacutelula encontra-se na Fig 110

Figura 110 ndash Transporte de vanaacutedio para a ceacuteluka e seu subsequente metabolismo (P=Proteiacutena) (Adaptado de

Zaporowska e Scibor 1998)

1211 Vanaacutedio(IV)

A espeacutecie de vanaacutedio (IV) mais bem conhecida eacute o iatildeo vanadilo (VO2+

) espeacutecie estaacutevel a pH

aacutecido sendo a maioritaacuteria a pH 3[AD] Apresenta uma cor azulada e forma complexos penta e

hexacoordenados Forma-se rapidamente a partir de V(V) na presenccedila de um agente redutor em

soluccedilatildeo aquosa No ambiente intracelular a presenccedila de glutationa reduzida aacutecido ascoacuterbico

NAD(P)H entre outros conduzem a que o principal estado de oxidaccedilatildeo nos sistemas bioloacutegicos

seja provavelmente o +4 encontrando-se o V(IV) fortemente complexado com proteiacutenas ou

aminoaacutecidos livres citrato ATP e pirofosfato (Refordfs) Em alternativa o V(IV) pode existir

17

livremente em ambientes fortemente aacutecidos como os lisossomas jaacute que a pH superior a 3 as

soluccedilotildees de vanadilo tendem a ser oxidadas pelo ar formando-se vanadato Esta grande

capacidade redutora justifica parcialmente a utilizaccedilatildeo pouco extensiva do iatildeo VO2+

como

inibidor [W]


O vanaacutedio (V) eacute a forma mais estaacutevel num intervalo de pH amplo [W] O iatildeo anioacutenico VO3-tende

a constituir complexos polinucleares pelo que as soluccedilotildees aquosas de vanadato satildeo extremamente

complexas com ocorrecircncia simultacircnea de vaacuterios equiliacutebrios de protonaccedilatildeo (pKa(vanadato)= 35

78 e 125) e oligomerizaccedilatildeo As espeacutecies presentes (H3VO4 H2VO4- HVO4

2- e VO4

3-) dependem

do pH forccedila ioacutenica e temperatura da soluccedilatildeo e da concentraccedilatildeo total do elemento

[AEAFAGAHAI]

O VO43-

- monoacutemero ortovanadato V1 ndash estaacute associado a uma grande parte da importacircncia

bioloacutegica do vanaacutedio uma vez que se trata de um anaacutelogo electroacutenico e estrutural do ortofosfato

(PO43-

) A coordenaccedilatildeo do ortovanadato pode ser tetraeacutedrica ou bipiramidal trigonal (Refordfs)

A oligomerizaccedilatildeo do vanadato monomeacuterico daacute origem ao diacutemero (V2O72-

- V2) que apresenta

tambeacutem equiliacutebrios de protonaccedilatildeo Presume-se a existecircncia de analogia do vanadato dimeacuterico com

o pirofosfato embora natildeo haja evidecircncia estrutural (Refordf) A dimerizaccedilatildeo do V2 origina o

vanadato tetrameacuterico ou metavanadato (V4O124-

- V4) que constitui a espeacutecie maioritaacuteria em

soluccedilotildees aquosas concentradas (Refordf) As estruturas do metavanadato e a sua espeacutecie protonada

satildeo ciacuteclicas [AJ] Outra espeacutecie oligomeacuterica importante eacute o vanadato pentameacuterico (V5O153-

) cuja

estrutura presumida eacute ciacuteclica [AI]

O oligoacutemero com maior importacircncia bioquiacutemica eacute o vanadato decameacuterico (V10O286-

-V10)(Refordf) a

espeacutecie predominante em soluccedilotildees de pH 2-6 quando a concentraccedilatildeo total de vanadato eacute superior

a 100 M (Ref) A estrutura do V10 natildeo difere em soluccedilatildeo ou no estado soacutelidoOs 10 aacutetomos de

vanaacutedio da espeacutecie decameacuterica estatildeo divididos em trecircs grupos identificados na figura como VA-C

consoante o seu ambiente quiacutemico circundante (Refordf) (Fig 111)

A expressatildeo ldquodecavanadatordquo refere-se a uma soluccedilatildeo aquosa na qual a espeacutecie decameacuterica se

encontra em equiliacutebrio quiacutemico com as espeacutecies V1 V2 V4 e V5 sendo que a oligomerizaccedilatildeo

progressiva do vanaacutedio eacute proporcional agrave sua concentraccedilatildeo total (Ref) Nesta soluccedilatildeo a

concentraccedilatildeo de V10 corresponde a aproximadamente 10 da concentraccedilatildeo total de vanaacutedio [AK]

18

Figura 111 ndash Estruturas esquemaacuteticas das espeacutecies de vanadato (espeacutecie monomeacuterica (V1) dimeacuterica (V2)

tetrameacuterica (V4) pentameacuterica (V5) e decameacuterica (V10) (Adaptado de Aureliano e Crans 2008)


Apesar de natildeo terem sido ainda encontradas as provas categoacutericas das suas funccedilotildees nos seres

vivos sabe-se que o iatildeo vanadato eacute capaz de inibir uma grande quantidade de enzimas in vitro

com especial ecircnfase na actividade ATPaacutesica da miosina [AL Teresa] Como referido

anteriormente o vanadato eacute capaz de actuar em alternativa ao fosfato nas reacccedilotildees bioquiacutemicas

incluindo a sua preferecircncia de ligaccedilatildeo agraves enzimas [W]

Eacute conhecido o papel do vanaacutedio no metabolismo do caacutelcio promovendo a mineralizaccedilatildeo dos

dentes e ossos na biossiacutentese de liacutepidos (trigliceacuteridos e colesterol) com posterior inibiccedilatildeo da

acumulaccedilatildeo destes nos vasos sanguiacuteneos e no SNC na reproduccedilatildeo e desenvolvimento por

mimetizaccedilatildeo e potenciaccedilatildeo de factores de crescimento na estimulaccedilatildeo do consumo de glucose e

da siacutentese de glicogeacutenio com actuaccedilatildeo equivalente aos efeitos da insulina ao niacutevel celular na

transduccedilatildeo de sinais celulares com regulaccedilatildeo da actividade de segundos mensageiros no

transporte de iotildees e aminoaacutecidos na transcriccedilatildeo geneacutetica e siacutentese de proteiacutenas e DNA entre

outros [W Y AB]

Assim o vanaacutedio cnseguiraacute provocar inuacutemeras mudanccedilas bioquiacutemicas nas ceacutelulas Alguns

exemplos da influecircncia bioquiacutemica do vanaacutedio incluem os seus efeitos nos processos de

fosforilaccedilatildeo e desfosforilaccedilatildeo de proteiacutenas e na participaccedilatildeo na formaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de

oxigeacutenio devido ao seu efeito proacute-oxidante sobre agentes redutores a niacutevel celular [AM]

Quanto ao seu efeito na actividade enzimaacutetica pode dividir-se em dois tipos principais ndash inibitoacuterio

e estimulante - dependendo da enzima ou do tipo de reacccedilatildeo por esta catalisada No primeiro

grupo incluem-se enzimas como as ATPases (de miosina de canais ioacutenicos e fosfoenzimas

19

transportadoras) e as fosfatases (da tirosina aacutecida e alcalina) a fosfofrutocinase adenilato ciclase

e catalase entre outras [AA] O segundo grupo inclui a maioria das cinases a glucose-6-fosfato

desidrogenase a fosfoglicerato mutase e a fosfoglicerato fosfatase (Refordf)

O efeito do vanaacutedio (V) na actividade enzimaacutetica estaacute relacionado com o seu nuacutemero de

coordenaccedilatildeo podendo actuar como estado de transiccedilatildeo ou por mimetizaccedilatildeo de cofactores

substratos (especialmente o fosfato) e interacccedilotildees proteiacutena-proteiacutena (como no caso das

polimerases e transcriptases) Pode ainda estar envolvido na formaccedilatildeo de ligaccedilotildees de hidrogeacutenio

interacccedilotildees electrostaacuteticas esteacutereas e de oxidaccedilatildeo-reduccedilatildeo Uma evidecircncia desta uacuteltima eacute a sua

capacidade de alternacircncia entre os estados de oxidaccedilatildeo +5 a +3 o que torna faacutecil a sua interacccedilatildeo

redox com enzimas contendo resiacuteduos de cisteiacutenas (Cys) ou qualquer outro composto orgacircnico

com actividade redox [AN]


A primeira evidecircncia da presenccedila de vanaacutedio no muacutesculo esqueleacutetico proveio de uma amostra de

ATP isolado de muacutesculo de cavalo que continha uma impureza ndash vanaacutedio ndash cuja presenccedila

provocou a inibiccedilatildeo da actividade da bomba de Na+K

+-ATPase [AO] Desde entatildeo vaacuterios

estudos tecircm sido realizados com ecircnfase na interacccedilatildeo das vaacuterias espeacutecies de vanadato com o

tecido muscular Destes destaca-se a descoberta da interacccedilatildeo forte da espeacutecie V10 com a miosina

fosforilada [AP] e agrave sua inibiccedilatildeo da actividade ATPaacutesica da miosina[AQ AR]

No quediz respeitoao iatildeo monovanadato destaca-se a sua inibiccedilatildeoda actividade Mg2+

-ATPaacutesica

da miosina [AS] que ocorre de duas formas distintas (1) na presenccedila de concentraccedilotildees reduzidas

de V1 a inibiccedilatildeo ocorre a velocidade reduzida dependente da concentraccedilatildeo da espeacutecie

monomeacuterica (2) na presenccedila de concentraccedilotildees elevadas de V1 o niacutevel de inibiccedilatildeo aproxima-se de

100 desde que [V1] seja superior agrave concentraccedilatildeo total de locais com actividade Mg2+

-ATPaacutesica

no ensaio Esta inibiccedilatildeo eacute irreversiacutevel tanto por diaacutelise ou adiccedilatildeo de agentes redutores do

vanadato [AL]Segundo Pate et al(1994)[AT] a espeacutecie monomeacuterica podeinibir a velocidade de

contracccedilatildeo a temperatura inferior a 20ordmC perdendogradual e rapidamente essa capacidade ateacute os

50ordmC temperatura agrave qual cessa a capacidade inibitoacuteria Os resultados obtidos sugeremainda uma

interacccedilatildeo altamente cooperativa entre o iatildeo vanadato e as proteiacutenas componentes do muacutesculo

esqueleacuteticoDestaca-se tambeacutem a descoberta da inibiccedilatildeo da geraccedilatildeo de forccedila contraacutectil nas fibras

musculares por parte da espeacutecie monomeacuterica[AT]Wilson et al(1995) [AU ]determinaram que a

afinidade da espeacutecie V1 para o S1 de miosina eacute significativamente mais elevada do que a do iatildeo

Pi seu anaacutelogo Descobriram ainda que que a ligaccedilatildeo do vanadato poderaacute envolver transiccedilotildees

entre estados energeacuteticos com energia livre independente dos impedimentos esteacutereos impostos

20

pela estrutura das miofibrilas Os estudos desenvolvidos por Smith et al (1990)[AV]

determinaram queo iatildeo monovanadato natildeo apresenta um efeito pronunciado na inibiccedilatildeo da

actividadeacto-S1-miosina-ATPaacutesica excepto em concentraccedilotildees superiores a 900microM a partir das

quais existe produccedilatildeo de espeacutecies oligomeacutericas para as quais o efeito inibitoacuterio seraacute mais

elevadoA espeacutecie monomeacuterica de vanadato consegue adoptar facilmente uma geometria do tipo

bipiramidal trigonal que mimetiza o intermediaacuterio formado (MgADP

Pi)aquando da reacccedilatildeo de

hidroacutelise de ATP no local activo da miosina [AW] De facto a interacccedilatildeo do vanaacutedio com a

miosina eacute inesperadamente estaacutevel na presenccedila de ADP Esta interacccedilatildeo resulta na formaccedilatildeo de

um complexo enzimaacutetico inactivo e estaacutevel com estequiometria de 11 ADPvanadato por siacutetio

activo da proteiacutena A formaccedilatildeo do complexo estaacutevel miosina-vanadato foi proposta por Goodnoet

al (1982) [AS] Nesta ocorre um preacute-equiliacutebrio raacutepido que induz a formaccedilatildeo de um complexo

ternaacuterio reversiacutevel (MADP

V) com formaccedilatildeo lenta do isoacutemero M

ADP

V A diferenccedila entre os

compostos de vanaacutedio e de fosfato centra-se no tempo de meia vida (t12) do Pi ou do V (no

primeiro t12=12 s enquanto no segundo t12=24 h) (Refordf) A diferenccedila dever-se-aacute agrave possiacutevel

complexaccedilatildeo do vanaacutedio com grupos nucleofiacutelicos no siacutetio activo o que provocaria uma

estabilizaccedilatildeo da miosina na conformaccedilatildeo MADP

V

No que respeita aos estudos realizados com a espeacutecie tetrameacuterica Cremo et al determinou que a

cadeia pesada do S1 de miosina pode ser clivada em dois locais distintos (designados V1 e V2)

pela espeacutecie V4 apoacutes irradiaccedilatildeo com luz UV na presenccedila de concentraccedilotildees de vanadato na ordem

dos milimolar e na ausecircncia de nucleoacutetidos ou metais divalentes

Jaacute no que concerne aos estudos realizados com ecircnfase na espeacutecie decameacuterica foi sugerido

porRamos et al (2006) [AK]que a interacccedilatildeo do decavanadato com a G-actina favorecida pela

polimerizaccedilatildeo desta uacuteltima estabiliza a espeacutecie V10 e induz a inibiccedilatildeo da formaccedilatildeo de F-actina A

estabilizaccedilatildeo da espeacutecie V10 por proteiacutenas tansmembranares e do citoesqueleto pode ser a razatildeo

pela qual ocorre a toxicidade do decavanadato reportada na avaliaccedilatildeo dos efeitos do V(V) nos

sistemas bioloacutegicosTiago et al (2007) [AR] concluiram que o V10 apresenta uma clara preferecircncia

de ligaccedilatildeo ao ldquoback-doorrdquo da S1-miosina-ATPase o que se verifica apenas na estrutura

conformacional desimpedida com acesso facilitado ao local de ligaccedilatildeo do Pi Sugere tambeacutem que

o V10 actua como um ldquoback-door stoprdquo bloqueando estaabertura do fragmento de 50-kDa

necessaacuteria para a hidroacutelise do ATP--fosfato o que constitui uma explicaccedilatildeo simples do

comportamento natildeo competitivo da espeacutecie decameacuterica estimulando a utilizaccedilatildeo deste oligoacutemero

como uma feramenta da elucidaccedilatildeo das mudanccedilas conformacionais ldquoback-doorrdquo da miosina no

21

processo da contracccedilatildeo muscular(ref)Destaca-se ainda a descoberta da capacidade inibitoacuteria do

V10 em relaccedilatildeo agrave fosforilaccedilatildeo oxidativa mitocondrial [AX]

Finalmente no que concerne aos estudos realizados com a presenccedila de vaacuterias espeacutecies

oligomeacutericas Aureliano e Madeira (1994) [AY]observaram que na presenccedila de Ca2+

as espeacutecies

V4 e V10se ligam agrave Ca2+

-ATPase do retiacuteculo sarcoplasmaacutetico enquanto a espeacutecie V1 se liga apenas

na presenccedila de ATP Aparentemente o aumento da concentraccedilatildeo de Ca2+

tem o efeito contraacuterio da

inibiccedilatildeo da ATPase do retiacuteculo sarcoplasmaacutetico pelo V1 natildeo tendo no entanto efeito significativo

sobre a inibiccedilatildeo por parte da espeacutecie V10 Tiago et al (2002) [AP] concluiacuteram que em condiccedilotildees

proacuteximas agraves fisioloacutegicas a espeacutecie V10 difere das espeacutecies presentes na soluccedilatildeo de metavanadato

devido agrave sua forte interacccedilatildeo com a miosina fosforilada e agrave sua inibiccedilatildeo da actividade ATPaacutesica

da miosina Para aleacutem disso o ATP diminui a afinidade da miosina para o V4 induzindo a

interacccedilatildeo com V1 e natildeo tendo qualquer efeito no que diz respeito ao V10 Foi tambeacutem proposto

[AQ] que a ligaccedilatildeo das espeacutecies oligomeacutericas de vanadato aoS1 de miosina nos locais onde o

fosfato coordenaeacute provavelmente a causa da inibiccedilatildeo da actividade ATPaacutesica da miosina

estimulada por actina atraveacutes da prevenccedilatildeo da troca entre ATPADP sendo esta favorecida para

aniotildees de vanadato com valecircncias superiores como eacute o caso do V10

Na presenccedila de actina as velocidades de dissociaccedilatildeo do Pi e do V aumentam consideravelmente

este uacuteltimo em menor quantidade Assim a ligaccedilatildeo da actina ao complexo MADP

V e

Pi eacute

bastante fraca pelo que se sugere que o ADPV teria um efeito de relaxamento semelhante ao

ATP No entanto a capacidade do vanaacutedio em inibir a actividade ATPaacutesica da miosina e da

actomiosina eacute diferenciada uma vez que na ausecircncia de actina a inibiccedilatildeo eacute total para

concentraccedilotildees na gama dos M mas na sua presenccedila a inibiccedilatildeo eacute totalmente conseguida apenas

em concentraccedilotildees na gama dos mM (Ref) No entanto eacute necessaacuterio considerar a possiacutevel

formaccedilatildeo de espeacutecies oligomeacutericas de vanadato cuja afinidade e efeito na enzima seratildeo

diferentes Assim pode concluir-se que o efeito de inibiccedilatildeo observado para a actividade ATPaacutesica

de miosina estimulada por actina se pode dever agrave presenccedila das diferentes espeacutecies oligomeacutericas o

que foi jaacute sugerido por Aureliano (2000) [AZ] ndash as espeacutecies tetrameacuterica e decameacuterica de vanadato

interactuariam com a miosina com alteraccedilatildeo da sua interacccedilatildeo com a actina No entanto natildeo eacute

conhecida a contribuiccedilatildeo absoluta das restantes espeacutecies oligomeacutericas para a inibiccedilatildeo da ATPase

da miosina estimulada por actina (Refs)


Pretende-se com este projecto o isolamento purificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da actina do muacutesculo

22

esqueleacutetico de coelho sendo esta uacuteltima tambeacutem realizada para o sufragmento-1 de miosina

Seguidamente realizar-se-aacute a quantificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas por espectroscopia UV-

Vis e SDS-PAGE e a caracterizaccedilatildeo das soluccedilotildees de vanaacutedio por UV-Vis e ressonacircncia magneacutetica

nuclear (RMN) Por uacuteltimo a interacccedilatildeo do S1 de miosina com o vanaacutedio seraacute avaliada atraveacutes

das teacutecnicas de UVVis RMN e ressonacircncia paramagneacutetica electroacutenica (RPE)



211Anaacutelise do estado de pureza

O estado de pureza das soluccedilotildees de actina e de S1 foi analisado por electroforese em gel de

poliacrilamida em condiccedilotildees desnaturantes (SDS-PAGE) (Fig 22) que separa as moleacuteculas de

acordo com o seu peso molecular (PM) A concentraccedilatildeo de acrilamida escolhida (10) permite a

detecccedilatildeo simultacircnea de componentes com peso molecular inferior a 20 kDa e outros com elevado

peso molecular

Figura 21 ndash Fotografia de gel de SDS-PAGE (10 acrilamida) Poccedilo (a)

10 L do marcador de elevado peso molecular () Poccedilo (b) 20 L de [G-

actina]=1 mgmL Poccedilo (c) 20 L de [S1]=1 mgmL Aplicou-se uma

voltagem de V durante h e min

A partir da recta de calibraccedilatildeo obtida log PM = -1177 Rf + 2247 (ver ponto 2 da secccedilatildeo

Anexos) pode verificar-se a presenccedila de actina na amostra do poccedilo (b) presente numa banda

bastante intensa (PMaparente=40 kDa) bem como a presenccedila minoritaacuteria de outros componentes

desconhecidos que natildeo teratildeo sido eliminados durante o processo de extracccedilatildeo e purificaccedilatildeo e natildeo

satildeo relevantes para o estudo em questatildeo Na amostra do poccedilo (c) nota-se a presenccedila de S1

(PMaparente=92 kDa) bem como a de outros componentes cuja banda eacute ligeiramente menos intensa

Estes poderatildeo ser fragmentos proteoliacuteticos de miosina e de S1 Estaacute ainda presente uma bada de

23

maior intensidade que poderaacute ser a proteiacutena-C (PM=135 kDa) uma vez que a sua remoccedilatildeo

completa da amostra necessitaria de um passo adicional de cromatografia de troca ioacutenica [BA]

No entanto natildeo podemos confirmar que se trata desta proteiacutena ou de qualquer outra uma vez que

se encontra fora do intervalo de migraccedilatildeo dos marcadores de peso molecular


2121Subfragmento-1 de miosina

A partir da recta de calibraccedilatildeo obtida pelo meacutetodo de Bradford [BB](ver secccedilatildeo 3311 do

Procedimento Experimental) A595nm = 00546[BSA] + 00209 (ver secccedilatildeo de Anexos)foi possiacutevel

determinar um intervalo de concentraccedilatildeo de S1 de miosina compreendido entre 226 e 117(plusmn

423M) (203 e 1056 (plusmn 381 mgmL)) (n=8) A concentraccedilatildeo meacutedia de S1 de miosina apoacutes

diaacutelise contra a soluccedilatildeo tampatildeo 10 mM HEPES pH 75 25 mM KCl determinada pela leitura da

Abs280 nmfoi de 20430M (1803 mgmL)(n=7)

As amostras a quantificar atraveacutes do meacutetodo de Bradford natildeo sofreram diaacutelise o que permite

explicar a concentraccedilatildeo superior de S1 de miosina em comparaccedilatildeo com o valor obtido atraveacutes do

meacutetodo directo Esta razatildeo aliada agrave sensibilidade e rapidez superiores deste uacuteltimo fez com que

se optasse pelo meacutetodo directo para a quantificaccedilatildeo da grande maioria dos ensaios

2122Actina

A concentraccedilatildeo de actina foi determinada quando esta se encontrava na forma monomeacuterica (G-

actina) por mediccedilatildeo da leitura directa da Abs290 nm tendo-se obtido uma concentraccedilatildeo meacutedia de

691481M (290202 mgmL) (n=3) em 2 mM Tris-HCl pH 80 02 mM CaCl2 02 mM Na-

ATP Ao comprimento de onda utilizado (290 nm) absorvem fortemente apenas os resiacuteduos de

Trp pelo que a mediccedilatildeo efectuada tem menor sensibilidade do que se tivesse sido efectuada a 280

nm uma vez que a actina apresenta apenas 4 resiacuteduos deste aminoaacutecido embora tenha 16

resiacuteduos de Tyr



-ATPase e K+EDTA-ATPase de S1 pelo meacutetodo de

Fiske-Subarow modificado

As actividades ATPaacutesicas de S1 de miosina dependentes de Ca2+

e K+foram analisadas pelo

caacutelculo das velocidades de consumo inicial do fosfato inorgacircnico (Pi) Definiu-se os tempos de 5

e 3 minutos para a mediccedilatildeo da Ca2+

e da K+EDTA-ATPase respectivamente Os valores obtidos

24

a partir do protocolo presente no ponto 341 da secccedilatildeo Procedimento experimental encontram-se

descritos na Tabela 2I

Tabela 2I ndash Acrividades natildeo-fisioloacutegicas de subfragmento-1 determinadas pelo meacutetodo de Fiske-Subarow

modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade

ATPaacutesica natildeo

fisioloacutegica

Actividade (nmol

Piminmg proteiacutena) Actividade (s-1)

S1

Ca2+

-ATPase 1400 plusmn 30 2100 plusmn 0045

K+EDTA-ATPase 2334 plusmn 50 3500 plusmn 0075

As actividades natildeo-fisioloacutegicas reflectem o estado de oxidaccedilatildeo dos resiacuteduos expostos de Cys 707

(SH1) e 697 (SH2) Se o grupo SH1 sofrer oxidaccedilatildeo a actividade ATPaacutesica dependente de Ca2+

aumenta e a actividade dependente de K+ diminui Por outro lado se o grupo SH2 sofrer

oxidaccedilatildeo regista-se a perda completa destas actividades

De acordo com Margossian e Lowey (1982) [BA] as actividades ATPaacutesica de S1 de miosina

dependente de Ca2+

e K+EDTA da miosina satildeo respectivamente de 24 e 112 s-1

Estaacute tambeacutem

descrito que a actividade ATPaacutesica dependente de K+ eacute em meacutedia cerca de 3 vezes superior agrave

dependente de Ca2+

reflectindo a quantidade das preparaccedilotildees A razatildeo obtida entre os valores das

actividades ATPaacutesicas dependentes de K+ e Ca

2+ eacute de 166 Os valores obtidos para as actividades

(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s

-1) satildeo inferiores agrave valores obtidos por

Margossian e Lowey [BA] e Tiago [BC] com forccedila ioacutenica inferior O valor obtido para a

actividade ATPaacutesica dependente de Ca2+

eacute superior ao obtido por Polosukhina et al (2000) [BD]

cujo meio de reacccedilatildeo continha MOPS e apresentava forccedila ioacutenica inferior Os dados

supramencionados comprovam a variaccedilatildeo da actividade a ATPaacutesica natildeo fisioloacutegica em relaccedilatildeo agrave

forccedila ioacutenica temperatura e pH

222 Mediccedilatildeo da actividadeMg2+

-ATPaacutesica de S1 pelo meacutetodo de enzimas acopladas

A actividade de Mg2+

-ATPase eacute a uacutenica que possui significado fisioloacutegico sendo as restantes

bastante uacuteteis apenas para indicaccedilatildeo da qualidade de preparaccedilatildeo do S1[BA] A 0575 M KCl a

actina e o S1 formam uma soluccedilatildeo viscosa e tuacuterbida Apoacutes a adiccedilatildeo de MgATP o complexo acto-

S1 dissocia-se e a turbidez da soluccedilatildeo diminui Se a forccedila ioacutenica for reduzida a dissociaccedilatildeo do

complexo actoS1 que se encontra na forma de suspensatildeo eacute induzida O MgATP eacute rapidamente

hidrolisado diminuindo a sua concentraccedilatildeo no meio reaccional Nestas condiccedilotildees haacute

reassociaccedilatildeo e subsequente contracccedilatildeo dos filamentos de actina e de S1 com formaccedilatildeo de

25

precipitado O meacutetodo descrito traduz de forma bastante elementar o fenoacutemeno da contracccedilatildeo in

vivo e elimina o problema anterior da solubilizaccedilatildeo ineficiente da miosina de modo a obter uma

mediccedilatildeo exacta da actividade [A] A utilizaccedilatildeo de forccedilas ioacutenicas reduzidas aumenta a afinidade da

actina para o S1 permitindo contornar a extrema dificuldade em obter a concentraccedilatildeo proteica dos

muacutesculos (cerca de 100 mgmL do complexo actomiosina) As actividades Mg2+

-ATPaacutesicas de S1

de miosina foram determinadas a partir do declive da variaccedilatildeo da Abs340 relativo agrave oxidaccedilatildeo de

NADH em funccedilatildeo do tempo como eacute descrito no ponto 342 do Procedimento Experimental Os

valores obtidos para a actividade Mg2+

-ATPaacutesica encontram-se apresentados na Tabela 2II

Tabela 2II ndash Actividade Mg2+

-ATPaacutesica de subfragmento-1 de miosina determinadas pelo meacutetodo das enzimas

acopladas

Actividade (nmol

ATPmin mg(S1)) Actividade (s

-1)

1097 plusmn 269 164 plusmn 04

Ramos (2005) [J] obteve o valor de 01 s-1

para a actividade Mg2+

-ATPaacutesica de S1 de miosina

com forccedila ioacutenica intermeacutedia Tiago (2005) [BC] obteve o valor de 011 s-1 em condiccedilotildees de forccedila

ioacutenica reduzida em relaccedilatildeo agrave utilizada no presente relatoacuterio


231 Anaacutelise da composiccedilatildeo das soluccedilotildees de vanadato por espectroscopia de 51

V-RMN

efeito da concentraccedilatildeo da espeacutecie

A diluiccedilatildeo das soluccedilotildees stock de meta- e decavanadato iraacute determinar fortemente a composiccedilatildeo

em soluccedilatildeo dos diferentes oligoacutemeros de vanadato (ref) No caso do decavanadato o periacuteodo de

tempo apoacutes a diluiccedilatildeo iraacute tambeacutem ser um factor importante a considerar devido agrave decomposiccedilatildeo

da espeacutecie V10(ref)Torna-se assim fundamental determinar a composiccedilatildeo quiacutemica das soluccedilotildees

no meio de ensaio utilizado (HEPES 10 mM KCl 25 mM) de modo a correlacionaacute-la

correctamente com os possiacuteveis efeitos promovidos pelas diferentes espeacutecies de vanadato no

sistema em estudo

Aleacutem disso deve ser dado ecircnfase agraves importantes interacccedilotildees que ocorrem entre o vanaacutedio e os

tampotildees escolhidos O tampatildeo com menor nuacutemero e magnitude de interacccedilatildeo eacute o HEPES [AD]

seguido do Tris sendo este uacuteltimo especialmente aconselhado em concentraccedilotildees baixas para casos

de incompatibilidade enzimaacutetica ou quiacutemica redox No caso especial da reacccedilatildeo redox

NAD(P)HNAD(P) o tampatildeo adequado eacute o imidazole de modo a natildeo haver reacccedilatildeo com o

26

vanadato Os tampotildees a evitar em qualquer situaccedilatildeo incluem a trietanolamina fosfato citrato e

glicina entre outros [AD] uma vez que todos interactuam fortemente com V(V) com formaccedilatildeo

de complexos estaacuteveis

Assim procedeu-se agrave anaacutelise da composiccedilatildeo das soluccedilotildees de meta- e decavanadato apoacutes diluiccedilatildeo

das soluccedilotildees stock (50 mM em vanadato total) no meio de reacccedilatildeo (tampatildeo D) atraveacutes da

espectroscopia de ressonacircncia magneacutetica nuclear de 51

V Nas figuras x1 e x2 apresentam-se os

espectros obtidos para as soluccedilotildees de deca- e metavanadato num intervalo de concentraccedilotildees de 1 a

10 mM A Tabela seguinte resume os paracircmetros espectroscoacutepicos obtidos para cada espeacutecie

presente nas soluccedilotildees analisadas

Figura 22ndash Espectros de RMN de 51

V de

concentraccedilotildees crescentes das espeacutecies oligomeacutericas

de vanadato obtidos apoacutes diluiccedilatildeo da soluccedilatildeo stock

de decavanadato em 10 mM HEPES pH 70 25 mM

KCl para concentraccedilotildees finais de A) 1 mM B)2

mM C) 4 mM D) 8 mM E) 10 mM de

decavanadato total V1refere-se agraves espeacutecies

monomeacutericade vanadato V10A V10B e V10C

correspondem respectivamente aos grupos de aacutetomos

de vanaacutedio presentes na figura 1 do capiacutetulo 1V1

corresponde agrave espeacutecie monomeacuterica

Tabela 2IIIndash Desvios quiacutemicos meacutedios (part) das ressonacircncias das espeacutecies decameacuterica (V10) monomeacuterica (V1) e

tetrameacuterica (V4) presentes nos espectros da soluccedilatildeo de decavanadatoLargura a meia altura (∆12) da espeacutecie V10A

Paracircmetros V10A V10B V10C V1 V4

part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748

∆12 (Hz) 175 nd nd nd nd

Figura 23 ndash Distribuiccedilatildeo graacutefica das

espeacutecies oligomeacutericas de vanadato vs a

concentraccedilatildeo de decavanadato total As

concentraccedilotildees de cada espeacutecie foram

obtidas segundo a formula descrita na

secccedilatildeo 35 do Procedimento

Experimental (aacutereas dos sinais de 51

V-

RMN observadas na figura x1)V10 V1 e

V4 correspondem agraves espeacutecie monomeacuterica

dimeacuterica e tetrameacuterica respectivamente [Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

van

aacutedio

] (m

M)

[Decavanadato]total (mM)

V10

V1

V4

27

Nas soluccedilotildees de decavanadato as espeacutecies monomeacuterica e decameacuterica de vanadato satildeo as uacutenicas

presentes para concentraccedilotildees de decavanadato inferiores a 8 mM Ambas as espeacutecies aumentam

linearmente com o aumento da concentraccedilatildeo total de vanadato Tal como constatado em [AY] e

em (Teresa) quando a concentraccedilatildeo de V1 eacute igual ou superior a 200 microM inicia-se a sua

oligomerizaccedilatildeo para originar a espeacutecie tetrameacuterica No entanto nas condiccedilotildees de realizaccedilatildeo dos

ensaios descritos no presente relatoacuterio natildeo foi possiacutevel identificar a espeacutecie tetrameacuterica neste

estudo em concentraccedilotildees inferiores a 8 mM tendo o mesmo sido observado por Ramoset al

(2006) [AK] Os resultados obtidos mostram claramente o equiliacutebrio entre a espeacutecie decameacuterica e

a monomeacuterica e que o aparecimento de outras espeacutecies oligomeacutericas se encontra dependente da

concentraccedilatildeo desta uacuteltima Apesar de natildeo ter sido realizado o ensaio com 5 mM de decavanadato

total no presente relatoacuterio estaacute reportado em Ramos et al (2006) [AK] que as concentraccedilotildees da

espeacutecie decameacuterica e monomeacuterica satildeo respectivamente de 500 microM e 200 microM Assim pode inferir-

se que para concentraccedilotildees inferiores a 5 mM e intervalos de tempo de cerca de 20 minutos (que

inclui o tempo de preparaccedilatildeo da amostra e de aquisiccedilatildeo do espectro) existem em soluccedilatildeo apenas

as espeacutecies decameacuterica e monomeacuterica de vanadato

Figura 24 ndash Espectros de RMN de 51

V de concentraccedilotildees

crescentes das espeacutecies oligomeacutericas de vanadato obtidos

apoacutes diluiccedilatildeo da soluccedilatildeo stock de metavanadato em 10 mM

HEPES pH 70 25 mM KCl para concentraccedilotildees finais de A)

1 mM B) 2 mM C) 4 mM D) 8 mM E) 10 mM de

metavanadato total V1 refere-se agraves espeacutecies monomeacuterica de

vanadatoV1 e V2 correspondem respectivamente agrave espeacutecie

monomeacuterica e dimeacuterica

Figura 25 ndash Distribuiccedilatildeo graacutefica das espeacutecies

oligomeacutericas de vanadato vs a concentraccedilatildeo de

metavanadato total As concentraccedilotildees de cada

espeacutecie foram obtidas segundo a formula descrita

na secccedilatildeo 35 do Procedimento Experimental

(aacutereas dos sinais de 51

V-RMN observadas na

figura x1)V10 V1 e V4 correspondem agraves espeacutecie

monomeacuterica dimeacuterica e tetrameacuterica

respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

nad

ato

(m

M)

[Metavanadato]total (mM)

V1

V2

V4

V5

28

Tabela 2IVndash Desvios quiacutemicos meacutedios (part)das ressonacircncias das espeacutecies tetrameacuterica (V4) monomeacuterica (V1) e

dimeacuterica (V2) presentes no espectro da soluccedilatildeo de metavanadato (total) 10 mM

Paracircmetros V1 V2 V4 V5

part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869

Nas soluccedilotildees de metavanadato as espeacutecies monomeacuterica dimeacutericae tetrameacuterica de vanadato estatildeo

presentes para concentraccedilotildees de metavanadato inferiores a 4 mM Todas estas as espeacutecies

aumentam linearmente com o aumento da concentraccedilatildeo total de vanadato Tal como constatado

em (Aureliano e Madeira 1998) e em (Tiago et al 2004) quando a concentraccedilatildeo de V1 eacute igual ou

superior a 200 microM inicia-se a sua oligomerizaccedilatildeo para originar a espeacutecie tetrameacuterica Nas

condiccedilotildees de realizaccedilatildeo dos ensaios descritos no presente relatoacuterio natildeo foi possiacutevel identificar a

espeacutecie pentameacuterica neste estudo em concentraccedilotildees inferiores a 4 mM tendo o mesmo sido

observado por Ramos 2006 Os resultados obtidos mostram claramente o equiliacutebrio entre a

espeacutecie V4 e as espeacuteciesV1 e V2 no qual o aparecimento de outras espeacutecies oligomeacutericas se

encontra dependente da concentraccedilatildeo da espeacutecie V1 Por uacuteltimo pode inferir-se que para

concentraccedilotildees inferiores a 2 mM e intervalos de tempo de cerca de 20 minutos (que inclui o

tempo de preparaccedilatildeo da amostra e de aquisiccedilatildeo do espectro) existem em soluccedilatildeo apenas as

espeacutecies V1 V2 e V4 com concentraccedilotildees respectivas de 0796 0192 e 0196 mM

232Estabilidade das soluccedilotildees de decavanadato anaacutelise por espectroscopia de absorccedilatildeo

UVVis

Caracterizou-se a estabilidade da espeacutecie V10 numa soluccedilatildeo com 1 mM decavanadato total em

tampatildeo D atraveacutes da leitura da Abs400 Obteve-se uma cineacutetica de dissociaccedilatildeo de 1ordf ordem tal

como se pode verificar pela linearidade do graacutefico de ln(Abs400)vs o tempo de aquisiccedilatildeo espectral

(segundos) (Fig26 )

Figura 26ndash Graacutefico de ln(Abs400 nm) em funccedilatildeo do tempo

(em segundos) para uma soluccedilatildeo de decavanadato total de 1

mM em tampatildeo D a 25ordmC (n=2)

Sendo uma reacccedilatildeo de primeira ordem pode ser descrita pela equaccedilatildeo cujo

declive eacute ndashK (constante de dissociaccedilatildeo) e a intersecccedilatildeo no eixo das ordenadas corresponde

Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29

aln(A0) Numa reacccedilatildeo de 1ordf ordem o tempo de meia-vida eacute independente da concentraccedilatildeo inicial

do reagente sendo descrito pela equaccedilatildeo [2] Deste modo a partir da recta

Ln(Abs400 nm) = -436E-5

K - 105 obteve-se um tempo de meia-vida de 4490 plusmn 0823 horas para

as condiccedilotildees supramencionadas

Apoacutes a adiccedilatildeo de S1 8 microM ao meio reaccional verificou-se que a reacccedilatildeo de desoligomerizaccedilatildeo

da espeacutecie decameacuterica de vanadato seguia igualmente uma cineacutetica de 1ordf ordem tal como se pode

verificar pela linearidade do graacutefico de ln(Abs400) versus o tempo de aquisiccedilatildeo espectral

(segundos) (Fig27)

Figura 27ndash Graacutefico de ln(Abs400 nm) em funccedilatildeo do

tempo (em segundos) para uma soluccedilatildeo de decavanadato

total de 1 mM em tampatildeo D a 25ordmC na presenccedila de 8

microM (n= 2)

A partir da equaccedilatildeo da recta Ln(Abs400 nm) = -7520E-5

K - 0613determinou-se o valor de K para

a espeacutecie decameacuterica de onde se obteve um tempo de meia-vida de 2430 plusmn 0191 horas para as

condiccedilotildees supramencionadas

Tanto este valor como o valor registado na ausecircncia de S1 satildeo substancialmente superiores agrave

duraccedilatildeo dos ensaios de interacccedilatildeo entre a espeacutecie V10 e o S1 de miosina descritos no presente

relatoacuterio


241Anaacutelise por espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

De modo a analisar qual o efeito da adiccedilatildeo de S1 de miosina (tampatildeo D) produzia nos sinais de

51V-NMR titulou-se uma soluccedilatildeo de 5mM de decavanadato total com concentraccedilotildees crescentes

de S1 (5 10 15 e 20 microM) Os espectros de 51

V-RMN encontram-se apresentados na Fig 2

No graacutefico da figura 2 Apresenta-se a concentraccedilatildeo de S1 em funccedilatildeo do factor de alargamento

corrigido dos espectros acima referidos

Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30

Figura 28 ndash Graacutefico de

representaccedilatildeo da

concentraccedilatildeo de S1 em

funccedilatildeo do factor de

alargamento A

concentraccedilatildeo de

decavanadato total foi de 5

mM e as concentraccedilotildees

utilizadas de S1 foram de 0

5 10 e 15 microM

Verifica-se que o factor de alargamento aumenta linearmente em funccedilatildeo da concentraccedilatildeo de S1 no

ensaio o que indica a existecircncia de interacccedilatildeo entre a espeacutecie V10 e o S1 de miosina Observou-

se ainda que a adiccedilatildeo de S1 ao meio reaccional natildeo provocou qualquer alteraccedilatildeo dos desvios

quiacutemicos dos sinais de 51

V-RMN

Realizaram-se ensaios na presenccedila de ATP e de S1 com intuito de verificar o efeito do ATP na

interacccedilatildeo do S1 de miosina com o decavanadato

Figura 29 - Espectros de RMN de 51

V contendo 2

mM Decavanadato (A) (controlo) (B) na presenccedila

de 2 mM de ATP (C) na presenccedila de 2 mM de ATP

e 8 microM de S1 de miosina V10A V10B e V10C




Tabela 2Vndash Desvios quiacutemicos(part) das ressonacircncias das espeacutecies decameacuterica (V10) e monomeacuterica (V1) presentes nos

espectros da soluccedilatildeo de decavanadato na presenccedila de 8 microM de S1 de miosina

Paracircmetros V10A V10B V10C V1

part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614

Observa-se que a presenccedila de ATP (espectro B) natildeo provoca qualquer alteraccedilatildeo visiacutevel em

relaccedilatildeo ao espectro que contem apenas soluccedilatildeo de decavanadato Jaacute a presenccedila simultacircnea de ATP

e S1 provoca um alargamento da ∆12 do sinal do V10A de 1736 Hz (espectro (A)) para 2366 Hz

(espectro (C) Fig 29) Tendo em conta que a concentraccedilatildeo de S1 apresenta uma relaccedilatildeo linear

com o factor de alargamento converteu-se o valor da ∆12 e comparou-se com o valor esperado agrave

F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31

concentraccedilatildeo de S1 utilizada O factor de alargamento obtido para 8 microM ndash 0376 ndash eacute inferior ao

valor esperado agrave mesma concentraccedilatildeo de S1 obtido atraveacutes da equaccedilatildeo da recta apresentada na

Fig 28 ndash 0457 ndash o que indica que o ATP poderaacute exercer um efeito de protecccedilatildeo do S1

diminuindo a sua interacccedilatildeo com a espeacutecieV10

Por uacuteltimo realizaram-se ensaios com metavanadato na presenccedila de 8 microM S1 de modo a verificar

se as espeacutecies oligomeacutericas contidas nesta soluccedilatildeo interagiam com a proteiacutena em estudo


V contendo 2

mM metavanadato (A) (controlo) (B) na presenccedila

de 8 microM de S1 de miosina V1 V2 e V4

correspondem respectivamente aacutes espeacutecies


Tabela 2VIndash Desvios quiacutemicos(part) das ressonacircncias das espeacutecies monomeacuterica (V1) dimeacuterica (V2) e tetrameacuterica (V4)

presentes nos espectros da soluccedilatildeo de metavanadato na presenccedila de 8 microM de S1 de miosina

Paracircmetros V1 V2 V4

part (ppm) -5613 -5747 -5789

Como eacute possiacutevel observar na Fig 210 ocorre uma ligeiro alargamento dos sinal de V4 bem

como uma perda da intensidade pelo que se conclui quedas espeacutecies presentes na soluccedilatildeo de

metavanadato (V1 V2 e V4) apenas a espeacutecie tetrameacuterica interage com o S1 de miosina o que

estaacute de acordo com o reportado por Tiago et al 2002

242 Actividade Mg2+


Com o intuito de avaliar o efeito do decavanadato na actividade Mg2+

-ATPaacutesica do S1 de

miosina monitorizou-se a reacccedilatildeo de oxidaccedilatildeo do NADH atraveacutes da leitura de Abs340 na

presenccedila de 005 mgmL de S1 de miosina e no caso da actividade estimulada 2microM de actina em

3125 mM Tris-HCl pH 71 e 375 mM MgCl2 pelo meacutetodo de enzimas acopladas (ver seccccedilatildeo xx

dos MM)Para tal realizaram-se ensaios com vaacuterias concentraccedilotildees de decavanadato total (10 50

100 250 500 e 1000) de modo a determinar qual o seu efeito na actividade MgATPaacutesica de S1

de miosina na ausecircncia e na presenccedila de um dos seus ligandos naturais Os ensaios foram

realizados agrave temperatura ambiente com incubaccedilatildeo preacutevia a 25ordm C durante 20 minutos

32

Figura 211 ndash Representaccedilatildeo

graacutefica da Actividade Mg2+

-

ATPaacutesica de S1 () (os ajustes

teoacutericos estatildeo representado a por

uma linha os resultados

experimentais estatildeo representados

por triacircngulos (Actividade

estimulada) e cruzes (Actividade

natildeo estimulada)) vs

[Decavanadato]total medidas pelo

meacutetodo das enzimas acopladas

(n=3) Os dados foram ajustados ao modelo de decaimento exponencial usando o programa GraphPad Prism para a

determinaccedilatildeo dos valores de IC50 (na ausecircncia de actina IC50= 266 plusmn 07 M decavanadato na presenccedila de actina

IC50= 28 plusmn 1 M decavanadato

A partir do graacutefico presente na Fig 29 verifica-se que o ajuste dos dados experimentais foi bem

sucedido A inibiccedilatildeo da actividade Mg2+

-ATPaacutesica do S1 de miosina eacute afectada em menor

amplitude na presenccedila de actina (60 de inibiccedilatildeo da actividade) do que na sua ausecircncia

(aproximadamente 80 de inibiccedilatildeo de actividade) Devido a esta diferenccedila pode sugerir-se que a

actina iraacute impedir parcialmente a ligaccedilatildeo do decavanadatoao S1 demiosina atraveacutes de

impedimentos esteacutereos ou interacccedilotildees electrostaacuteticas por exemplo A teacutecnica utilizada natildeo nos

permite concluir acerca de que regiatildeo(otildees) ou resiacuteduo(s) da actina participaratildeo na preservaccedilatildeo

parcial da actividade Mg2+

-ATPaacutesica

Por outro lado os valores de IC50 dos dois tipos de actividades natildeo apresentam diferenccedilas

significativas tendo-se obtido 266 plusmn 07 e 28 plusmn 1M decavanadato na ausecircncia e na presenccedila de

actina respectivamente o que corresponde a uma concentraccedilatildeo de cerca de 27 M de V10 O

meio de reacccedilatildeo utilizado nestes ensaios foi 10 mM HEPES e 25 mM KCl com 2 mM ATP Em

(Tiago et al 2004) o valor de IC50 para a actividade Mg2+-ATPaacutesica na ausecircncia de actina foi de

125 plusmn 025 microM enquanto o valor da actividade estimulada por actina foi de 136 plusmn 14 microM O

meio de reacccedilatildeo utilizado nos ensaios foi 20 mM HEPES 50 mM KCl e 2 mM ATP o que resulta

precisamente no dobro da forccedila ioacutenica a que foi realizado o ensaio do presente relatoacuterio

(exceptuando a contribuiccedilatildeo dos produtos da hidroacutelise de ATP uma vez que este meacutetodo

pressupotildee a ocorrecircncia de um ciclo de reacccedilotildees de hidroacutelise e siacutentese deste composto) Ora tendo

sido anteriormente referido que a afinidade do S1 de miosina para com a espeacutecie V10 diminui com

Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a

[Decavanadato] (microM) Actividade Estimulada ()

Actividade Natildeo Estimulada ()

Ajuste Actividade Estimulada

Ajuste Actividade Natildeo Estimulada

33

o aumento da forccedila ioacutenica (Tiago et al 2004 tal poderaacute explicar a diferenccedila obtida entre estes

dois conjuntos de valores

243Quantificaccedilatildeo de cisteiacutenas reduzidas pelo meacutetodo de Ellman

A interacccedilatildeo do vanaacutedio com alguns tipos de aminoaacutecidos sensiacuteveis agrave oxidaccedilatildeo pode fornecer-nos

informaccedilatildeo bastante uacutetil em relaccedilatildeo agraves alteraccedilotildees estruturais que conduzem a uma diminuiccedilatildeo da

actividade fisioloacutegica do S1 de miosina Os estudos realizados por Chasteen 1983 concluiacuteram

que a reduccedilatildeo de vanadato (V) a vanadilo (IV) ocorre na presenccedila de agentes redutores comuns no

ambiente celular de que se destaca o aminoaacutecido cisteiacutena Esta eacute tambeacutem um alvo de

complexaccedilatildeo por parte do iatildeo VO2+

Jaacute Ramos et al (2009) demonstrou que a incubaccedilatildeo de

actina com a soluccedilatildeo de decavanadato induz a oxidaccedilatildeo de resiacuteduos de cisteiacutena e agrave formaccedilatildeo do

oxidovanaacutedio (IV) Este grupo de investigadores descobriu ainda que apenas a espeacutecie V10 induz a

oxidaccedilatildeo das cisteiacutenas ldquoraacutepidasrdquo da actina atraveacutes do processo proposto que eacute parcialmente

responsaacutevel pela inibiccedilatildeo jaacute descrita da actividade de ATPase do S1 de miosina estimulada por

actina quando exposta agrave soluccedilatildeo de decavanadato Esta inibiccedilatildeo apresenta-se afectada com a

presenccedila de ATP uma vez que os resiacuteduos de cisteiacutena permaneceram intactos nos ensaios

realizados com este ligando Jaacute Crans et al (2004) concluiu que o siacutetio activo de muitas fosfatases

(que conteacutem grupos tiol) pode formar um equiliacutebrio redox com o iatildeo vanadato (V) de forma natildeo

reversiacutevel

Os resultados obtidos por Sakurai e Shiromura (1980) sugeriram que o vanaacutedio (V) sofre reduccedilatildeo

a vanaacutedio (IV) sem dependecircncia do valor de pH do ensaio Registaram ainda uma estequiometria

de 31 na reacccedilatildeo do vanadato (V) com os resiacuteduos de Cys enquanto a estequiometria dos ensaios

com o vanadilo (IV) foi de 21

Berlett e Stadtman (1997) observaram que os tipos de aminoaacutecidos mais facilmente oxidaacuteveis

englobam entre outros os resiacuteduos de Cys Trp e MetAssim analisou-se o estado redox dos

grupos tiol dos resiacuteduos de Cys do S1 na presenccedila do decavanadato atraveacutes da monitorizaccedilatildeo da

Abs412 nm na presenccedila de 1 mgmL de S1 de miosina em tampatildeo 10 mM HEPES 25 mM KCl

variando a concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo de decavanadato de modo a determinar que tipo de alteraccedilotildees

estruturais ocorrem na sua presenccedila no que diz respeito agrave diminuiccedilatildeo da actividade ATPaacutesica de

S1 na presenccedila de decavanadato

Os resultados referentes agrave quantificaccedilatildeo das cisteiacutenas reduzidas apoacutes o tratamento de S1 com

diferentes concentraccedilotildees de decavanadato em tampatildeo 10 mM HEPES pH 75 e 25 mM KCl a

25ordmC durante 20 minutos encontram-se descritos na Tabela 2VII

Tabela 2VII ndash Cisteiacutenas reduzidas totais e ldquoraacutepidas de S1 (1 mgmL) apoacutes tratamento com decavanadato

34

(010501002505001000 uM) em 10 mM HEPES 25 mM KCl pH 7 a 25ordmC durante 20 minutos A detecccedilatildeo

espectrofotomeacutetrica foi feita com DTNB (e 412=8400 uM-1 cm-1) (n variaacutevel entre 1 e 8)

Amostras Cys raacutepidas Cys totais

11 M S1 (controlo) 22 plusmn 04 106 plusmn 14

11 M S1 + 10 M Decavanadato 22 plusmn 05 95 plusmn 08

11 M S1 + 50 uM Decavanadato 20 plusmn 02 98 plusmn 14

11 M S1 + 100 uM Decavanadato 17 plusmn 03 97 plusmn14




A partir dos resultados obtidos pode sugerir-se que o S1 possui 11 resiacuteduos de Cys (controlo) o

que estaacute de acordo com o anteriormente descrito Verifica-se que o tratamento da proteiacutena com

concentraccedilotildees crescentes de decavanadato provoca a oxidaccedilatildeo de dois resiacuteduos de Cys do S1 de

miosina natildeo expostos ao solvente No entanto a teacutecnica utilizada natildeo nos permite identificar

quais

Tendo em consideraccedilatildeo que o valor de IC50 obtido para a reacccedilatildeo de inibiccedilatildeo daactividade Mg2+-

ATPaacutesica de S1 na presenccedila de decavanadato eacute de cerca de 27 microM pode sugerir-se que este seraacute o

valor ao qual ocorreraacute a oxidaccedilatildeo do primeiro resiacuteduo de Cys o que poderaacute contribuir para a

diminuiccedilatildeo da actividade de S1 observada

25Interacccedilatildeo de S1 com vanaacutedio(IV)

251Anaacutelise por espectroscopia de Ressonacircncia Paramagneacutetica Electroacutenica

A acumulaccedilatildeo intracelular de oxovanaacutedio (IV) in vivo constitui uma das principais formas de

apresentaccedilatildeo de vanaacutedio no organismo Deste modo torna-se bastante interessante analisar a

interacccedilatildeo entre este iatildeo e o S1 de miosina atraveacutes da teacutecnica de espectroscopia de Ressonacircncia

Paramagneacutetica Electroacutenica o meacutetodo de eleiccedilatildeo do estudo do iatildeo vanadilo e dos complexos por si

formados O electratildeo desemparelhado encontra-se fortemente acoplado ao nuacutecleo 51

V o que

35

resulta num espectro de RPE consistindo de 8 desdobramentos na direcccedilatildeo paralela e outros tantos

na direcccedilatildeo perpendicular (Chasteen 1983)

Os estudos realizados por Ahmed et al (1987) centraram-se na interacccedilatildeo do vanadilo com

proteiacutenas como eacute o caso da insulina transferrina entre outros obtendo um espectro caracterizado

por 8 linhas amplamente espaccediladas (na direcccedilatildeo paralela) Jaacute Ramos et al 2009 concluiu que a

exposiccedilatildeo da soluccedilatildeo de decavanadato agraves formas globular e filamentosa de actina produz um

espectro tiacutepico do iatildeo oxidovanaacutedio (IV) indicando a reduccedilatildeo do vanadato

Para aferir qual a concentraccedilatildeo de S1 que permitia obter uma boa razatildeo sinalruiacutedo titulou-se uma

soluccedilatildeo de sulfato de vanadilo 15 microM ([VOSO4]stock = 5 mM) com concentraccedilotildees crescentes de

proteiacutena (0 5 10 15 e 20 microM) em 10 mM HEPES 25 mM KCl A existecircncia de uma correlaccedilatildeo

linear entre a concentraccedilatildeo de proteiacutena e a intensidade dos sinais de RPE correspondente agrave banda

-12 perpendicular encontra-se representada na Fig 210

Figura 2 12ndash Representaccedilatildeo graacutefica da variaccedilatildeo da intensidade do sinal de RPE vs a concentraccedilatildeo de S1 utilizada

Apoacutes verificar que com uma concentraccedilatildeo de S1 igual a 20 microM se obtinham sinais com uma razatildeo

sinalruiacutedo adequada ao prosseguimento dos estudos sobre a interacccedilatildeo V(IV)-S1 de miosina

titulou-se uma soluccedilatildeo de 20 microM S1 com 0 25 5 10 15 25 50 75 100 150 200 500 e 1000

microM VOSO4

Traccedilou-se o graacutefico da intensidade da banda -12 perpendicular do sinal de EPR em funccedilatildeo da

concentraccedilatildeo de VOSO4 tendo-se determinado uma constante de dissociaccedilatildeo (KD) do complexo

S1-vanadilo de 8748 plusmn 2621 microM V(IV)

y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36

Figura 213 ndash Representaccedilatildeo graacutefica da variaccedilatildeo do sinal de RPE vs a concentraccedilatildeo de vanadilo utilizada (os valores

experimentais estatildeo representados por losangos o seu ajuste estaacute representado pela linha)

A simulaccedilatildeo do espectro de EPR foi efectuada a partir do espectro obtido para uma concentraccedilatildeo

de 1 mM VOSO4 apoacutes adiccedilatildeo de 20 microM S1 de miosina tendo-se obtido os valores da constante de

acoplamento hiperfina (A=5016) e do factor g (g0=195)

Figura 214 ndash Representaccedilatildeo graacutefica do espectro de EPR obtido com 1000 microM de vanadilo e 20 microM de S1 (a cinzento

escuro) A simulaccedilatildeo do espectro encontra-se a cinzento claro

Por comparaccedilatildeo destes com os valores presentes na tabela de correspondecircncia xxx eacute possiacutevel

predizer quais os ligandos provaacuteveis do vanadilo na presenccedila de proteiacutena Assim concluiu-se que

o vanadilo estaacute coordenado com duas moleacuteculas de aacutegua um grupo hidroxilo e um grupo R=NR

O grupo hidroxilo pode indicar os resiacuteduos de aminoaacutecidos Tyr Treonina e Serina enquanto o

grupo R=NR poderaacute indicar a presenccedila de Arginina e Histidina como ligandos do vanadilo

Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)

Ajuste dos dados exp Dados experimentais

Campo magneacutetico (G)

Espectro Experimental Ajuste

37


31 Reagentes

Todos os reagentes utilizados satildeo de elevado grau de pureza (analiacutetico) Apresentam-se as suas

foacutermulas quiacutemicas ou abreviaturas quando necessaacuterio acrescentou-se a sua descriccedilatildeo Entre

parecircntesis colocou-se as empresas que os comercializam

Aacutecido aceacutetico glacial 100 (Riedel) Acrilamida 99 (Merck) Azul de bromofenol (Riedel-de-

Haumlen) -Mercaptoetanol (Sigma) Bissulfito de soacutedio (Sigma)Bradford (reagente de)

(BioRad)BSA (albumina de soro bovino Sigma-Aldrich) CaCl22H2O (cloreto de caacutelcio

dihidratado Fluka) CH3CH2OH 96 (etanol Panreac) Coomassie Blue R250 (Merck) D2O

(oacutexido de deuteacuterio SDS) DTNB (55rsquo-ditiobis(2-aacutecido nitrobenzoacuteico) Aldrich) EDTA (aacutecido

etilenodiaminatetraaceacutetico Merck) Fosfoenolpiruvato 98 (Fluka) Glicerol (Sigma) Glicina

985 (Panreac) HCl 37 (Riedel-de Haumlen) H2SO4 96 (Pronalab) HEPES 99 (aacutecido 4-(2-

hidroxiletil)-1-piperazineetanosulfoacutenico Sigma) KH2PO4 99 (hidrogenofosfato de potaacutessio)

MgATP (Sigma) Na

ATP (Sigma) Na2HPO4 99 (hidrogenofosfato de soacutedio Riedel-de Haumlen)

NaH2PO4 (fosfato de soacutedio ) NaOH 986 (hidroacutexido de soacutedio Pronalab) KCl 99 (Cloreto de

potaacutessio Panreac) L-Cys 995 (enantioacutemero levoacutegiro do resiacuteduo de Cisteiacutena Fluka)Metanol

99 (Merck) Molibdato de amoacutenio (Sigma)NNrsquo-metil-bis-acrilamida 98 (Merck) NH4VO3

99 (metavanadato de amoacutenia Sigma) PSA 10 (persulfato de amoacutenio Merck) SDS

(dodecilo sulfato de soacutedio Sigma) Sulfito de soacutedio (Sigma) VOSO4 (sulfato de vanadilo

Aldrich) TEMED 99 (Tetrametiletilenodiamina Merck) Tris (2-amino-2-hidroximetil-13-

propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos


3211 Purificaccedilatildeo da miosina preparaccedilatildeo de Subfragmento 1 por digestatildeo quimotriacutepsica

da miosina

O subfragmento-1 de miosina-II (S1) foi gentilmente cedido pelo Prof Doutor Manuel Aureliano

do Departamento de Quiacutemica Bioquiacutemica e Farmaacutecia da Faculdade de Ciecircncias e Tecnologia da

Universidade do Algarve

No entanto descreve-se abaixo de forma resumida o procedimento efectuado

38


O protocolo de isolamento foi adaptado do meacutetodo previamente descrito por Margossian e Lowey

(1982) apresentando-se de forma esquemaacutetica na Fig 31

Sucintamente os tecidos musculares dorsais e das pernas foram extraiacutedos apoacutes o sacrifiacutecio do

animal (Fig31) De seguida foram adicionados 3 volumes da soluccedilatildeo de extracccedilatildeo A2

Centrifugou-se a soluccedilatildeo e filtrou-se o sobrenadante O sedimento foi entatildeo diluiacutedo em 14

volumes de aacutegua destilada de modo a que a forccedila ioacutenica atingisse 004 M Apoacutes adiccedilatildeo de szlig-

mercaptoetanol (szlig-me) deixou-se a precipitar a 4ordmC removendo o sobrenadante Centrifugou-se

novamente e ressuspendeu-se o sedimento na soluccedilatildeo de extracccedilatildeo A Adicionou-se a soluccedilatildeo

tampatildeo B3 para que a forccedila ioacutenica atingisse 05 M Homogeneizou-se e deixou-se repousar

durante 2h Homogeneizou-se novamente e centrifugou-se de modo a ocorrer precipitaccedilatildeo dos

complexos de actomiosina e proteiacutena desnaturada Apoacutes filtraccedilatildeo do sobrenadante em latilde de vidro

quantificou-se a soluccedilatildeo de miosina resultante pelo meacutetodo directo (ver secccedilatildeo 3312 do

Procedimento Experimental)

2 Soluccedilatildeo de extracccedilatildeo A 0012M K2CO3 004M KHCO3 06M KCl pH 65

3 Soluccedilatildeo-tampatildeo B Tris 100 mM pH 7 KCl 2M

39

Figura 31 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica do protocolo de isolamento de miosina (Margossian e Lowey 1982) Todo o

procedimento foi realizado a 4ordmC (Adaptado de Susana Ramos Relatoacuterio de Estaacutegio 2005)

32112 Preparaccedilatildeo de Subfragmento-1 de miosina por digestatildeo com quimiotripsina

O S1 de miosina foi isolado apoacutes diaacutelise da miosina durante a noite contra a soluccedilatildeo C4 A

presenccedila do EDTA eacute essencial uma vez que a sua substituiccedilatildeo por MgCl2resulta na produccedilatildeo de

HMM em vez de S1 A suspensatildeo de miosina foi equilibrada e digerida com -quimotripsina

A digestatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de PMSF Seguidamente ultracentrifugou-se o produto

da digestatildeo desprezando-se o sedimento (Fig 32) A soluccedilatildeo de sobrenadante maioritariamente

S1 foi quantificada pela leitura directa da Abs280 ou pelo meacutetodo de Bradford (ver as secccedilotildees

3311 e 3312 do Procedimento Experimental respectivamente) e armazenada em 10 sacarose

e 2 mM szlig-Me a -80ordmC

4 Soluccedilatildeo C 25mM Tris pH 70 012M KCl 1mM EDTA

40

Antes da realizaccedilatildeo dos ensaios descritos no presente relatoacuterio o S1 de miosina foi dialisado

contra a soluccedilatildeo D5 de modo a remover qualquer composto que pudesse complexar como

vanaacutedio Seguidamente quantificou-se a proteiacutena pelo meacutetodo de Bradford ou pelo meacutetodo

directo (ver secccedilotildees 3311 e 3312do Procedimento Experimtental)

Figura 3 2ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica do protocolo de preparaccedilatildeo do S1 de miosina por digestatildeo quimiotripsina de

acordo com o previamente descrito por Margossian e Lowey (1982) Todo o procedimento foi realizado a 4ordm C

excepto quando indicaccedilatildeo do contraacuterio (Adaptado de Susana Ramos Relatoacuterio de Estaacutegio 2005)


Isolou-se e purificou-se a actina segundo o meacutetodo descrito por Pardee e Spudish que

compreende dois passos ndash a obtenccedilatildeo de um resiacuteduo seco denominado ldquopoacute de acetonardquo e a

extracccedilatildeo subsequente da actina a partir do ldquopoacute de acetonardquo na forma de G-Actina com a

posterior polimerizaccedilatildeo a F-Actina

32121 Obtenccedilatildeo do ldquopoacute de acetonardquo

Sacrificou-se o coelho com uma pancada atraacutes do pescoccedilo e sangrou-se o animal apoacutes o corte da

arteacuteria jugular Esfolou-se e colocou-se numa tina com gelo Retiraram-se as partes de tecido

conjuntivo que envolvem o tecido muscular com auxiacutelio de uma pinccedila e bisturi Seguidamente

retirou-se os muacutesculos dorsais e os muacutesculos brancos das pernas Passou-se os muacutesculos por aacutegua

destilada de modo a remover as impurezas e pesou-se num copo Trituraram-se os muacutesculos

numa maacutequina de triturar carne e extraiu-se o resultante com 3 volumes da soluccedilatildeo E6 durante 10

minutos com agitaccedilatildeo suave Centrifugou-se a suspensatildeo a 4000 g durante 10

5 Soluccedilatildeo D HEPES 10 mM pH 70 KCl 25 mM

6 Soluccedilatildeo E 01 M KCl 015 M K2HPO4 pH 65

41

minutosdesprezando-se o sobrenadante Ressuspendeu-se o sedimento em 6 volumes de soluccedilatildeo

F7durante 10 minutos com agitaccedilatildeo suave Verificou-se se o pH da soluccedilatildeo estava compreendido

entre 82 e 85 acertando-se estecom soluccedilatildeo G8 se necessaacuterio Centrifugou-se durante 10

minutos a 4000 g Desprezou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o sedimento em 3 volumes de

soluccedilatildeo H9 durante 10 minutos Centrifugou-se novamente a 4000 gdurante 10 minutos

desprezando-se o sobrenadante Ressuspendeu-se o sedimento duas vezes consecutivas em 6

volumes de aacutegua destilada durante 5 minutos Centrifugou-se a 4000 g durante 10 minutos apoacutes

cada adiccedilatildeo de H2O

Seguidamente ressuspendeu-se o sedimento 5 vezes consecutivas utilizando 3 volumes de

acetona de cada vez agitando suavemente durante 10 minutos agrave temperatura ambiente Colocou-

se o resiacuteduo filtrado numa tina de vidro sobre papel de filtro deixando-se evaporar o solvente

durante a noite num nicho Triturou-se o resiacuteduo seco numa maacutequina de triturar carne e deixou-se

novamente evaporar o solvente O ldquopoacute de acetonardquo obtido foi armazenado a -20 ordmC


Apoacutes a obtenccedilatildeo do poacute de acetona como acima indicado efectuou-se o protocolo seguidamente

descrito de modo a obter monoacutemeros de actina (G-Actina) e actina filamentosa (F-Actina)

Pesou-se 35 g de poacute de acetona e adicionaram-se 50 mL de soluccedilatildeo-tampatildeo I10

sendo a

extracccedilatildeo feita com agitaccedilatildeo suave durante 30 minutos Separou-se o extracto do poacute de acetona

hidratado filtrando a suspensatildeo com 4 camadas de gaze esterilizada tendo o cuidado de natildeo

espremer o resiacuteduo Voltou a extrair-se com 50 mL de soluccedilatildeo I durante 30 minutos mexendo

lentamente Adicionou-se este ao extracto obtido anteriormente Centrifugou-se o extracto total a

16 000 g durante 30 minutos Decantou-se para uma proveta sobre a qual se colocou gaze para

que o sedimento solto natildeo se juntasse ao sobrenadante e leu-se o volume De seguida adicionou-

se KCl ateacute uma concentraccedilatildeo final de 50 mM MgCl2 ateacute 2mM e ATP ateacute 1mM lentamente e com

agitaccedilatildeo contiacutenua de modo a promover a polimerizaccedilatildeo dos monoacutemeros de actina

Deixou-se polimerizar durante 2h a 25ordmC observando-se a presenccedila de pequenas bolhas de ar

indicativas de um aumento de viscosidade da soluccedilatildeo Arrefeceu-se em gelo durante 15 minutos e

adicionou-se KCl ateacute uma concentraccedilatildeo final de 06M Mexeu-se lentamente durante 30 minutos

apoacutes os quais se ultracentrifugou a 110 000g durante 1hora Desprezou-se o sobrenadante

ressuspendeu-se o sedimento com soluccedilatildeo tampatildeo E e transferiu-se para um potter

Dialisou-se durante a noite contra 1L de soluccedilatildeo-tampatildeo I a uma temperatura de 4ordmC com rotaccedilatildeo

7 Soluccedilatildeo F 005 M NaHCO3 pH 82-85

8 Soluccedilatildeo G 1M Na2CO3

9 Soluccedilatildeo H 1 mM EDTA pH 70

10 Soluccedilatildeo I 2 mM Tris-HCl pH 8 02 mM CaCl2 02 mM Na2ATP 05 mM szlig-Me 0005 NaN3

42

contiacutenua e mudanccedila de tampatildeo 2 a 3 vezes De seguida a actina foi centrifugada a 110

000gdurante 1hora Decantou-se a soluccedilatildeo de G-Actina (sobrenadante) e desprezou-se o

sedimento Determinou-se a concentraccedilatildeo de G-Actina pelo meacutetodo directo (ver secccedilatildeo 3312 do

Procedimento Experimental) A soluccedilatildeo de G-actina foi armazenada a uma temperatura de 4ordmC

apoacutes adiccedilatildeo de 002NaN3 mantendo-se estaacutevel durante 3 a 5 dias



O meacutetodo de Bradford (Bradford 1976) baseia-se na utilizaccedilatildeo do reagente de Bradford

composto por entre outros aacutecido fosfoacuterico e o corante ldquoCoomassierdquo Este corante possui carga

negativa e a sua coloraccedilatildeo varia entre a vermelha (Absmax=465 nm) predominante em soluccedilatildeo e a

azul (Absmax=595 nm) presente aquando da ligaccedilatildeo aos grupos amina das proteiacutenas Em soluccedilotildees

aacutecidas diluiacutedas a coloraccedilatildeo varia proporcionalmente com a quantidade do corante ligado agrave

proteiacutena que por sua vez eacute directamente proporcional agrave concentraccedilatildeo da proteiacutena permitindo a

sua quantificaccedilatildeo ateacute a um limite de detecccedilatildeo de 20 gmL (Bradford 1976)

Deste modo prepararam-se amostras de BSA ([BSA]stock= 1mgmL) utilizando um intervalo de

concentraccedilotildees compreendido entre 0 e 15 gmL de acordo com a tabela 3I Apoacutes a adiccedilatildeo da

H2O MilliQ e do reagente de Bradford as soluccedilotildees foram sucessivamente homogeneizadas no

voacutertex

Tabela 3Indash Amostras utilizadas para a obtenccedilatildeo da recta de calibraccedilatildeo no meacutetodo de Bradford

BSA (L) BSA (g) H2O MilliQ (L) Reagente de Bradford (L)

0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200

Apoacutes incubaccedilatildeo a 25ordmC por 5 minutos leram-se os valores de Abs595 num

espectrofotoacutemetro (Shimadzu UV-160A) para todas as amostras Seguidamente traccedilou-se a recta

de calibraccedilatildeo (Abs595vs quantidade de BSA (g))

43

Para determinar a concentraccedilatildeo de proteiacutena apoacutes o processo de isolamento purificaccedilatildeo e

diaacutelise quando necessaacuterio colocou-se 5 L da amostra num tubo de Eppendorf e adicionou-se

795 L de H2O MilliQ homogeneizando a soluccedilatildeo no voacutertex Adicionou-se posteriormente 200

L de reagente de Bradford e repetiu-se a homogeneizaccedilatildeo Incubou-se a mistura a 25ordmC por 5

minutos apoacutes os quais se leu os valores de Abs595 nm no espectrofotoacutemetro Por interpolaccedilatildeo deste

valor a partir da recta de calibraccedilatildeo determinou-se a concentraccedilatildeo de proteiacutena na amostra


A quantificaccedilatildeo das amostras proteicas pode tambeacutem ser efectuada atraveacutes da leitura directa da

absorvacircncia tendo por base a lei de Beer-Lambert onde Abs corresponde agrave

absorvacircncia ao comprimento de onda ao qual o ensaio foi realizado corresponde ao coeficiente

de extinccedilatildeo (substituiacutedo pela letra a se as unidades forem distintas da molaridade) b corresponde

ao percurso oacuteptico da radiaccedilatildeo na ceacutelula amostral e c corresponde agrave concentraccedilatildeo amostral

Assim no caso de S1 de miosina mediu-se a Abs280e calculou-se a concentraccedilatildeo da proteiacutena

sabendo que o coeficiente de extinccedilatildeo de S1 eacute (Ref)

No caso da actina mediu-se a Abs290ecalculou-se a concentraccedilatildeo da proteiacutena sabendo que o

coeficiente de extinccedilatildeo da actina eacute (Ref)

332Electroforese em condiccedilotildees desnaturantes (SDS-PAGE)

De modo a melhor caracterizar as proteiacutenas isoladas foi realizada uma electroforese em

condiccedilotildees desnaturantes (SDS-PAGE do inglecircs Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel

Electrophoresis) O SDS (dodecilo sulfato de soacutedio) eacute um detergente anioacutenico utilizado neste

meacutetodo para desnaturar as proteiacutenas que se ligam ao SDS na proporccedilatildeo 14 g SDS g proteiacutena

(aproximadamente 1 moleacutecula de SDS por cada 2 resiacuteduos de aminoaacutecidos) (Stryer) O SDS induz

uma densidade de carga negativa significativa nas proteiacutenas a que se liga mascarando a sua carga

intriacutenseca pelo que as razotildees cargamassa satildeo tendencialmente idecircnticas Assim a SDS-PAGE

separa as proteiacutenas quando sujeitas a um campo eleacutectrico de acordo com o seu peso molecular

sendo a sua migraccedilatildeo directamente proporcional ao logaritmo deste uacuteltimo (Stryer)

O gel de resoluccedilatildeo com 10 de acrilamida foi obtido atraveacutes da adiccedilatildeo de 167 mL de soluccedilatildeo

stock de acrilamida11

075 mL de tampatildeo de resoluccedilatildeo12

251 mL de aacutegua destilada e 50 L de

SDS 10 Para promover a polimerizaccedilatildeo adicionou-se em seguida 38 L de PSA 10

11

soluccedilatildeo stock de acrilamida soluccedilatildeo de 30 (mv) de acrilamida e 08 (mv) de NNrsquo-metil-bis-acrilamida 12

tampatildeo de resoluccedilatildeo 15 M Tris-HCl pH 88

44

(persulfato de amoacutenia) 10 e 25 L de TEMED 99 (tetrametiletilenodiamina) Agitou-se

cuidadosamente de modo a natildeo formar bolhas e pipetou-se a soluccedilatildeo para a cassette de vidro

previamente montada no suporte De seguida adicionou-se uma peliacutecula de cerca de 2 mm de 2-

metil-2-butanol para verificar posteriormente a polimerizaccedilatildeo Apoacutes a polimerizaccedilatildeo que demora

cerca de 45 minutos verteu-se a agrave superfiacutecie e adicionou-se o gel de concentraccedilatildeo com 5 de

acrilamida constituiacutedo por 03 mL de soluccedilatildeo de stock acrilamida 045 mL de tampatildeo de

concentraccedilatildeo13

094 mL de aacutegua destilada 18 L de SDS 10 135 L de PSA 10 e 2L de

TEMED 99 Colocou-se o pente sobre o gel e deixou-se polimerizar durante cerca de 45

minutos

As amostras para aplicaccedilatildeo no gel de electroforese foram preparadas para uma concentraccedilatildeo de

proteiacutena de 1 mgmL num volume final de 100 L dos quais 25 L correspondem ao tampatildeo da

amostra14

As amostras foram aquecidas a 100ordmC durante 5 minutos Antes da aplicaccedilatildeo das

amostras transferiu-se a cassette para a tina de electroforese agrave qual se adicionou a soluccedilatildeo

tampatildeo de electroforese da tina superior15

e tampatildeo de electroforese da tina inferior16

Aplicaram-

se 10 L das soluccedilotildees de marcadores de peso molecular e 20 L das amostras proteicas

preparadas anteriormente A electroforese decorreu durante cerca de 3h30 min a uma voltagem

de 80 V De seguida transferiu-se o gel para uma tina corando as proteiacutenas durante 1h com

soluccedilatildeo corante17

Descorou-se o gel com soluccedilatildeo descorante18

tendo-se mudado esta soluccedilatildeo ateacute

as bandas se encontrarem bem definidas

Determinou-se a mobilidade relativa das bandas correspondentes aos marcadores de elevado peso

molecular e traccedilou-se a recta de calibraccedilatildeo ndash log(PM) vs log(Rf) onde Rf corresponde agrave

mobilidade relativa Por interpolaccedilatildeo determina-se o PM das proteiacutenas isoladas sabendo a sua

mobilidade relativa Por comparaccedilatildeo com os valores descritos na literatura pode concluir-se

acerca do grau de purificaccedilatildeo





13

tampatildeo de concentraccedilatildeo 05 M Tris-HCl pH 68 14

tampatildeo de amostra 320 mM Tris-HCl pH 68 04 M szlig-mercaptoetanol SDS 8 glicerol 15 (vv) e roxo de m-

cresol 0024 15

tampatildeo de electroforese da tina superior 25 mM Tris pH 83 192 mM glicina 01 (mv) SDS 16

tampatildeo de electroforese da tina inferior 25 mM Tris pH 83 192 mM glicina 01 (mv) SDS acetato de soacutedio

01 M 17

soluccedilatildeo corante ldquoCoomassie Blue R-250rdquo contendo metanol 45 (vv) e aacutecido aceacutetico glacial 10 (vv) 18

soluccedilatildeo descorante metanol 10 (vv) e aacutecido aceacutetico glacial 10 vv)

45

O meacutetodo de Fiske-Subarow modificado consiste na reacccedilatildeo do molibdato de amoacutenio com o

fosfato inorgacircnico em soluccedilatildeo aacutecida com formaccedilatildeo do aacutecido fosfomoliacutebdico Seguidamente daacute-

se a adiccedilatildeo de um agente redutor que provoca a reduccedilatildeo do composto a fosfomolibdato que forma

um complexo de cor azulada cuja absorvacircncia maacutexima ocorre para um comprimento de onda de

660 nm tornando possiacutevel a sua detecccedilatildeo por meacutetodos espectrofotomeacutetricos As actividades Ca2+

-

ATPaacutesica e K+EDTA-ATPaacutesica de S1 foram determinadas atraveacutes deste meacutetodo de acordo com

o descrito por Taussky e Shorr (1953) com mediccedilatildeo da quantidade de fosfato (Pi) libertado

atraveacutes da hidroacutelise de ATP

Para tal obteve-se primeiramente a recta de calibraccedilatildeo com as amostras presentes na Tabela 3II

utilizando uma soluccedilatildeo stock de 5 mM KH2PO4

Tabela 3II ndash Composiccedilatildeo das diferentes amostras utilizadas para determinar a recta de calibraccedilatildeo atraveacutes do meacutetodo

de Fiske-Subbarow modificado

KH2PO4 (L)

([KH2PO4]stock= 5mM)

PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680

A cada tubo de Eppendorf adicionaram-se seguidamente 200 L de soluccedilatildeo J19

e 20 L de agente

redutor20

homogeneizando no voacutertex apoacutes cada adiccedilatildeo Incubou-se durante 10 minutos e mediu-

se a Abs660 nm num espectrofotoacutemetro com intervalos de tempo iguais entre cada amostra Traccedilou-

se a recta de calibraccedilatildeo (Abs660 nmvs nmol PO43-

) a partir dos valores obtidos

Para determinar a actividade Ca2+

-ATPaacutesica de S1 prepararam-se tubos de Eppendorf com 400

L de meio de reacccedilatildeo21

25 L CaCl2 ([CaCl2]stock= 100 mM) 25 L ATP ([ATP]stock= 100 mM)

com [S1]ensaios=01 mgmL Perfez-se se necessaacuterio com H2O MilliQ ateacute perfazer um volume de 1

mL Para determinar a actividade K+EDTA-ATPaacutesica utilizou-se uma concentraccedilatildeo idecircntica de

19

Soluccedilatildeo J 5 N H2SO4 25 molibdato de amoacutenio 20

Agente redutor 5 mg aacutecido 1-amino-2-naftol-4-sulfoacutenico 30 mg bissulfito de soacutedio 30 mg sulfito de soacutedio em 26

mL H2O 21

meio de reacccedilatildeo 125 mM Tris-HCl pH 80 0575 M KCl

46

proteiacutena nos ensaios (01 mgmL) e o mesmo meio de reacccedilatildeo Aos tubos de Eppendorf

adicionou-se ainda 123 L de KCl ([KCl]stock = 3M) 25 L de ATP 10 L de EDTA

([EDTA]stock= 100 mM )e o volume de H2O MilliQ necessaacuterio para perfazer 1 mL Em ambas as

situaccedilotildees o uacuteltimo reagente adicionado foi o ATP uma vez que se trata do substrato da reacccedilatildeo

enzimaacutetica

A cineacutetica decorreu a 25ordmC durante 5 minutos para a actividade Ca2+

-ATPaacutesica e durante 3

minutos para a actividade K+EDTA-ATPaacutesica Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo transferiu-se 150

L de amostra para tubos de Eppendorf contendo igual volume de TCA 10 Colocou-se no gelo

e homogeneizou-se no voacutertex Seguidamente centrifugou-se a 1500 g durante 10 minutos e

recolheu-se 200 L de sobrenadante para novos tubos de Eppendorf Adicionou-se a estes 158

mL de H2O MilliQ e 200 L de soluccedilatildeo J Homogeneizou-se no voacutertex e adicionou-se 20 L de

reagente redutor repetindo-se a homogeneizaccedilatildeo Incubou-se durante 10 minutos e mediu-se a

Abs660 nm com o mesmo intervalo de tempo de leitura para cada amostra Por intrapolaccedilatildeo a partir

da recta de calibraccedilatildeo obtida anteriormente determinou-se a quantidade de Pi libertado em cada

ensaio A partir destes resultados determinaram-se as actividades Ca2+

-ATPaacutesica e K+EDTA-

ATPaacutesica do S1 em nmol PO43-

minmg proteiacutena e em s-1



enzimas acopladas

Da actividade Mg2+

-ATPaacutesica de S1 resulta a formaccedilatildeo dos produtos da reacccedilatildeo de

hidroacutelise do ATP - ADP e Pi Na presenccedila de ADP fosfoenolpiruvato (PEP) e da enzima piruvato

cinase (PK) os produtos resultantes satildeo ATP e piruvato Por acccedilatildeo da enzima lactato

desidrogenase (LDH) este uacuteltimo eacute convertido em lactato ocorrendo simultaneamente a oxidaccedilatildeo

do NADH a NAD+ monitorizada atraveacutes da Abs340 nm Quando o S1 de miosina se encontra no

meio reaccional o ATP eacute hidrolisado formando-se novamente ADP e Pi o que permite a

formaccedilatildeo de um ciclo (fig 21) Se as enzimas se encontrarem em excesso a velocidade de

conversatildeo do NADH eacute limitada pela produccedilatildeo de ADP e Pi Como o ATP eacute regenerado em cada

ciclo a sua concentraccedilatildeo inicial eacute sempre mantida (Bagshaw 1982)

Figura 33ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica do meacutetodo de enzimas acopladas

47

O protocolo utilizado e seguidamente descrito foi adaptado de Cuenda et al (1990 ndash Ver Refordf) A

uma cuvette de 1 mL adicionou-se S1 para uma concentraccedilatildeo final de 005 mgmL 800 L de

meio de reacccedilatildeo22

10 L de PEP ([PEP]stock = 42 mM) 10 L de PK+LDH 11 ([PK+LDH]stock =

1 mgmL) e 15 L de NADH ([NADH]stock=25 mM) Iniciou-se a monitorizaccedilatildeo da reacccedilatildeo

atraveacutes da leitura de Abs340 nm apoacutes a adiccedilatildeo de 20 L de ATP ([ATP]stock=100 mM) A

actividade Mg2+

-ATPaacutesica eacute obtida atraveacutes do declive correspondente agrave oxidaccedilatildeo do NADH Para

a mediccedilatildeo da Mg2+

-ATPase de S1 estimulada por actina adicionou-se F-actina para uma

concentraccedilatildeo final de 2 microM sendo a actividade obtida tambeacutem atraveacutes do declive correspondente

agrave oxidaccedilatildeo do NADH apoacutes a adiccedilatildeo da proteiacutena

35 Interaccedilatildeo entre vanaacutedio e subfragmento-1 de miosina

351 Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de vanaacutedio

As soluccedilotildees de vanadato foram preparadas em aacutegua MilliQ a partir de metavanadato de amoacutenio

(NH4VO3) numa concentraccedilatildeo stock de 50 mM com agitaccedilatildeo magneacutetica e aquecimento (~30 ordmC)

Esta soluccedilatildeo com um valor compreendido entre 6 e 7 designa-se por ldquometavanadatordquo e eacute

constituiacuteda pelas esspeacutecies V1 V2 V4 e V5 (Ref) Acidificando a soluccedilatildeo de metavanadato por

adiccedilatildeo de HCl ateacute um valor de pH proacuteximo de 4 observa-se uma mudanccedila de cor de amarelo

claro para laranja indicativa da formaccedilatildeo da espeacutecie decameacuterica de vanadato De seguida e

imediatamente antes da realizaccedilatildeo dos ensaios descritos o valor do pH da soluccedilatildeo de

decavanadato foi aumentado para cerca de 75 por adiccedilatildeo de NaOH A soluccedilatildeo (2) designada

por ldquometavanadatordquo natildeo foi posteriormente alterada ateacute agrave sua adiccedilatildeo para a realizaccedilatildeo dos ensaios

As soluccedilotildees foram armazenadas a 4ordmC e mantidas em gelo aquando da sua utilizaccedilatildeo

A soluccedilatildeo de V(IV) foi preparada em condiccedilotildees anaeroacutebias por diluiccedilatildeo de sulfato de vanadil

(VOSO4) para uma concentraccedilatildeo final de 5 mM em H2O MilliQ saturada com N2 gasoso

352Anaacutelise por espectroscopia de UV-Vis

A concentraccedilatildeo da espeacutecie decameacuterica em soluccedilatildeo depende do periacuteodo de tempo apoacutes a diluiccedilatildeo

no meio de reacccedilatildeo apropriado (Ref) A velocidade de desoligomerizaccedilatildeo da espeacutecie decameacuterica

pode ser analisada por espectroscopia de absorccedilatildeo na regiatildeo UVVis uma vez que esta espeacutecie

apresenta duas bandas caracteriacutesticas na regiatildeo do visiacutevel (a 358 e 400 nm) que natildeo se verifica

em quaisquer outras espeacutecies oligomeacutericas As bandas supramencionada sapresentam-se bem

22

Meio de reacccedilatildeo 3125 mM Tris-HCl pH 71 375 mM MgCl2

48

resolvidas atraveacutes da obtenccedilatildeo da derivada de 2ordf ordem do espectro apresentando a forma de 2

vales com miacutenimos centrados nos comprimentos de onda supracitados com dependecircncia linear

relativamente agrave concentraccedilatildeo de decavanadato total (Ramos et al 2006)

Assim a estabilidade da espeacutecie decameacuterica apoacutes diluiccedilatildeo da soluccedilatildeo de decavanadato no meio de

reacccedilatildeo dos ensaios (tampatildeo D) para uma concentraccedilatildeo final de 1 mM em vanadato total foi

caracterizada atraveacutes da leitura da Abs400 em funccedilatildeo do tempo tendo-se determinado qual a

ordem de reacccedilatildeo e o tempo de meia-vida da mesma Com base em estudos anteriores acerca da

estabilidade do V10 na presenccedila de diferentes proteiacutenas (Ramos et al 2006) determinou-se

igualmente o tempo de meia vida apoacutes a adiccedilatildeo de 20 microM de S1 de miosina ao meio reaccional


Os espectros de RMN do isoacutetopo 51

V foram realizados num espectroacutemetro Bruker AM-400 MHz

equipado com uma sonda multinuclear inversa de 5 mm Em tubos de RMN de 5 mm de diacircmetro

preparou-se soluccedilotildees de 500 L de deca- ou metavanadato correspondentes a um intervalo de

concentraccedilotildees de 1 a 10 mM suplementadas com 10 D2O Os espectros foram adquiridos agrave

temperatura ambiente com uma largura espectral de 23 923 Hz um tempo de aquisiccedilatildeo de 0086

s tempo de relaxaccedilatildeo de 001 s e uma sequecircncia de pulsos a 90ordm Utilizou-se a transformada de

Fourier com alargamento das bandas de 20Hz para o processamento dos espectros Os desvios

quiacutemicos das ressonacircncias de 51

V foram obtidos em relaccedilatildeo agrave espeacutecie VOCl3cuja frequecircncia de

ressonacircncia eacute considerada o padratildeo sendo todas as outras referenciadas a partir desta em ppm

As aacutereas dos sinais do RMN correspondentes agraves espeacutecies oligomeacutericas presentes foram obtidas

por integraccedilatildeo dos sinais As concentraccedilotildees relativas das espeacutecies foram calculadas com recurso agrave

equaccedilatildeo

onde A[Vx] corresponde agrave aacuterea referente agrave ressonacircncia da espeacutecie Vx com nordm de agregaccedilatildeo x

A[V]total agrave soma total das aacutereas medidas e [V] a concentraccedilatildeo total de vanaacutedio no ensaio

A teacutecnica de 51

V-RMN foi anteriormente aplicada em estudos de ligaccedilatildeo com S1 de miosina

(Ref) tendo sido demostrado que entre as espeacutecies V1 V2 V4 e V5 a espeacutecie tetrameacuterica possui a

maior afinidade para a miosina (Cremo et al) O desaparecimento ou alargamento dos sinais pode

implicar a ligaccedilatildeo de um dos oxovanadatos laacutebeis agrave miosina sem indicaccedilatildeo de qual uma vez que

49

se processa um equiliacutebrio entre eles (Crans 1990) Assim e tendo em conta as indicaccedilotildees de que

a espeacutecie V10 eacute distinta das restantes no que diz respeito agrave magnitude da interacccedilatildeo com a miosina

e inibiccedilatildeo da actividade ATPaacutesica estimulada por actina (Aureliano 2000 Tiago et al 2002)

torna-se fundamental investigar a interacccedilatildeo das diferentes espeacutecies de vanadato com o S1 de

miosina atraveacutes da teacutecnica de 51

V-RMN

Para tal obtiveram-se espectros de 51

V-RMN resultantes da titulaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo 5 mM de

decavanadato total com concentraccedilotildees crescentes de S1 de miosina (0 5 10 15 e 20 microM) em

tampatildeo D Realizou-se ainda ensaios na presenccedila de 2 mM de decavanadato e 2 mM de ATP na

presenccedila e na ausecircncia de S1 de miosina de modo a verificar o efeito que estes ligandos naturais

da enzima teria na interacccedilatildeo das vaacuterias espeacutecies de vanadato com o subfragmento-1



Os grupos sulfidrilo (-SH) das cisteiacutenas satildeo resiacuteduos de aminoaacutecidos extremamente sensiacuteveis agrave

oxidaccedilatildeo resultando na sua oxidaccedilatildeo (Dalle-Donne et al 1999) Logo a quantificaccedilatildeo destes

resiacuteduos eacute bastante importante nos estudos de interacccedilatildeo com vanaacutedio jaacute que os resiacuteduos de Cys

com ecircnfase para o SH1 e o SH2 satildeo bastante importantes na monitorizaccedilatildeo das modificaccedilotildees

funcionais da regiatildeo da cabeccedila

O procedimento seguidamente apresentado foi originalmente descrito por Gutieacuterrez-Merino

(1987)) Consiste na reacccedilatildeo entre os grupos ndashSH natildeo oxidados das proteiacutenas e o reagente de

Ellman (DTNB -55rsquo-ditiobis(2-aacutecido nitrobenzoacuteico)) - formando-se o aniatildeo CNT (aniatildeo 3-

carboxilato-4-nitrotiofenolato) numa estequiometria de 11 Este apresenta um maacuteximo de

absorvecircncia a 412 nm (Robyt 1990) Assim apoacutes a incubaccedilatildeo da proteiacutena na presenccedila do metal

a quantidade de cisteiacutenas reduzidas por proteiacutena determina-se atraveacutes dos valores de Abs412

Deste modo colocou-se num tubo de Eppendorf o volume apropriado de S1 dialisado para que a

concentraccedilatildeo no ensaio fosse de 1 mgmL Adicionou-se o volume apropriado de decavanadato

para que a sua concentraccedilatildeo fosse de 0 10 50 100 250 500 ou 1000 M Perfez-se com soluccedilatildeo

D ateacute um volume final de 1 mL e incubou-se a 25ordmC por 20 minutos Apoacutes este periacuteodo colocou-

se 780 L da mistura reaccional numa cuvette de quartzo e adicionou-se 220 L de soluccedilatildeo K23

23

Tampatildeo K Tampatildeo fosfatohidrogenofosfato de soacutedio 025 M pH 72

50

Adicionou-se 15 L de DTNB (em soluccedilatildeo K [DTNB]stock=100 mM) ao meio reaccional e

registou-se o valor de absorvecircncia medido equivalente agraves cisteiacutenas ldquoraacutepidasrdquo (SH1 e SH2

expostos ao solvente) Adicionou-se 001 g de SDS que provoca a desnaturaccedilatildeo da proteiacutena e

consequentemente a exposiccedilatildeo de todos os resiacuteduos de cisteiacutenas que se encontravam ateacute aiacute

inacessiacuteveis no interior da proteiacutena (cisteiacutenas totais) Estes resiacuteduos podem assim reagir com o

DTNB

Estimou-se o nuacutemero de resiacuteduos de cisteiacutenas em todas as amostras com recurso ao coeficiente de

extinccedilatildeo molar () do DTNB (ver ponto 3 dos Anexos) que foi determinado atraveacutes da titulaccedilatildeo

de L-Cisteiacutena com intervalo de concentraccedilotildees compreendidos entre 0 e 50 microM na presenccedila de

25microM de DTNB em tampatildeo D Os valores de absorvecircncia foram obtidos para um comprimento de

onda de 412 nm


3621 Anaacutelise por Ressonacircncia Paramagneacutetica Electroacutenica

A teacutecnica mais eficiente de anaacutelise da interacccedilatildeo entre o iatildeo vanadilo e proteiacutenas como a

calmodulina e a transferrina entre outras permite a obtenccedilatildeo raacutepida de informaccedilatildeo no que toca agrave

conformaccedilatildeo e amplitude da referida interacccedilatildeo

Os espectros de Ressonacircncia Paramagneacutetica Electroacutenica (RPE) da espeacutecie paramagneacutetica V(IV)

foram realizados a 70K num espectroacutemetro Bruker EMX-300 X-band Todas as soluccedilotildees

utilizadas e amostras foram preparadas em anaerobiose numa cacircmara de luvas de modo a evitar a

reduccedilatildeo de V(IV) a V(V) Em tubos capilares com 02 mL de amostra manteve-se a concentraccedilatildeo

de S1 a 20 M e variou-se a concentraccedilatildeo de vanadilo (0 25 5 10 15 25 50 75 100 150

200 500 e 1000 M [VOSO4]stock=5 mM) em tampatildeo D Apoacutes obtenccedilatildeo dos espectros estes

foram tratados atraveacutes do software SimFonia e WinEPR tendo-se obtido um graacutefico com a

variaccedilatildeo da intensidade do sinal de RPE em funccedilatildeo da concentraccedilatildeo de sulfato de vanadilo

presente Realizaram-se ainda simulaccedilotildees de espectros obtidos com 20 microM de S1 e 1000 microM de

V(IV) com vista agrave obtenccedilatildeo dos ligandos provaacuteveis do vanadilo atraveacutes da anaacutelise da constante

de acoplamento hiperfina (A) e do factor g (g)


Apesar de jaacute ter sido demonstrado que o vanaacutedio inibe a Na+K

+-ATPase da miosina a funccedilatildeo

deste elemento no tecido muacutesculo esqueleacutetico continua largamente incompreendida A enorme

complexidade quiacutemica deste metal especialmente no que concerne agrave oligomerizaccedilatildeo e reacccedilotildees

51

redox constitui um obstaacuteculo agrave compreensatildeo do comportamento do vanaacutedio nos organismos

vivos Assim a caracterizaccedilatildeo da quiacutemica deste elemento eacute de grande utilidade antes de iniciar o

estudo da sua interacccedilatildeo com o presente sistema

A anaacutelise por espectroscopias de 51

V-RMN e de UV-Vis de soluccedilotildees de vanadato diluiacutedas nos

meios de reacccedilatildeo utilizados no presente relatoacuterio (10 mM HEPES pH 70 25 mM KCl) mostrou

claramente que a espeacutecie decameacuterica (V10) possui um tempo de vida suficientemente longo para a

determinaccedilatildeo do seu efeito isolado ao contraacuterio do que se verifica com as espeacutecies mono- di-

tetra- e pentameacutericas (V1 V2 V4 e V5) Por outro lado a anaacutelise verificou ainda que apoacutes diluiccedilatildeo

das soluccedilotildees de decavanadato no meio de reacccedilatildeo coexistem as espeacutecies V10 e V1 pelo que os

efeitos putativos desta uacuteltima deveratildeo ser subtraiacutedos aquando da monitorizaccedilatildeo dos efeitos da

espeacutecie decameacuterica

O vanaacutedio (V) (vanadato) inibe as enzimas que catalizam reacccedilotildees de transferecircncia de grupos

fosfato como a ATPase da miosina [Goodno 1979] devido agrave sua analogia estrutural com o iatildeo

fosfato Na sua utilizaccedilatildeo como inibidor enzimaacutetico natildeo eacute tida em conta a contribuiccedilatildeo individual

das espeacutecies oligomeacutericas considerando-se normalmente a espeacutecie V1 como inibidora efectiva

[Goodno e Taylor 1982] No presente relatoacuterio verificou-se por espectroscopia de 51

V-RMN que

outros oligoacutemeros de vanadato interagem com o S1 de miosina tendo as espeacutecies V10 e V4 os

maiores niacuteveis de afinidade A sua interacccedilatildeo envolve forccedilas electrostaacuteticas e eacute afectada

negativamente por ligandos naturais de enzima como eacute o caso do ATP

A exposiccedilatildeo do S1 de miosina (005 mgmL) a decavanadato conduz agrave inibiccedilatildeo do capacidade da

proteiacutena de estimular a actividade Mg2+

-ATPaacutesica com um valor de IC50 de 266 plusmn 07 M

decavanadato sendo o maacuteximo de inibiccedilatildeo da estimulaccedilatildeo atingido para cerca de 250 microM

decavanadato (80) Na presenccedila de actina o valor de IC50 eacute de 28 plusmn 1 microM decavanadato sendo

o maacuteximo de inibiccedilatildeo da estimulaccedilatildeo atingido para cerca de 250 microM decavanadato (60)

exercendo um efeito de impedimento agrave ligaccedilatildeo entre o vanaacutedio e o S1

A uma concentraccedilatildeo de 27 microM decavanadato verifica-se a oxidaccedilatildeo de um dos resiacuteduos de Cys

de S1 de miosina seguida pela oxidaccedilatildeo gradual de outro resiacuteduo de Cys ateacute agrave concentraccedilatildeo de

1000 microM Ambos os resiacuteduos oxidados natildeo se encontravam expostos ao solvente utilizado A

oxidaccedilatildeo dos resiacuteduos permite sugerir que esta modificaccedilatildeo oxidativa sofrida pelo S1 contribui

para a diminuiccedilatildeo da sua actividade de ATPase

52

Por espectroscopia de RPE revelaram-se os possiacuteveis ligandos equatoriais do vanaacutedio aquando da

sua interacccedilatildeo com o S1 de miosina como sendo duas moleacuteculas de aacutegua um ligando contendo o

grupo R-OH e outro contendo o grupo R=NR

Globalmente os resultados obtidos sugerem um efeito significativo do vanaacutedio nos estados de

oxidaccedilatildeo (IV) e (V) no S1 de miosina para concentraccedilotildees facilmente alcanccedilaacuteveis no ambiente

terrestre

53

5 Estudos futuros

No sentido do melhor esclarecimento das alteraccedilotildees moleculares e estruturais que ocorrem no

subfragmento 1 quando exposta ao vanaacutedio que conduzem a uma diminuiccedilatildeo da sua funccedilatildeo

sugere-se

- Quantificaccedilatildeo das cisteiacutenas reduzidas de S1 na presenccedila de metavanadato

- Determinaccedilatildeo das actividades Ca2+

- e K+-ATPaacutesica do S1 de miosina na presenccedila de

decavanadato

- Determinaccedilatildeo da actividade Mg2+

-ATPaacutesica basal do S1 de miosina estimulada por actina


-ATPaacutesica basal do S1 de miosina na presenccedila de

metavanadato

- Realizaccedilatildeo de RMN 2D com variaccedilatildeo das concentraccedilotildees das soluccedilotildees de decavanadato e

metavanadato na presenccedila de S1

-Mutageacutenese dos resiacuteduos de Cys doS1 de miosina de modo a verificar quais os resiacuteduos que

sofrem oxidaccedilatildeo na presenccedila de decavanadato

- Determinaccedilatildeo por calorimetria (DSC Differential Scanning Calorimetry) da variaccedilatildeo da

entalpia (∆H) e da temperatura de desnaturaccedilatildeo do S1 de miosina na presenccedila de vanaacutedio uma

vez que estas propriedades caracteriacutesticas de cada proteiacutena satildeo alteradas apoacutes ocorrecircncia de

modificaccedilotildees estruturais

- Anaacutelise por SDS-PAGE de S1 de miosina apoacutes tratamento com vanaacutedio de modo a determinar

quais os polipeacuteptidos eventualmente formados apoacutes clivagem da proteiacutena

54


- Sellers J Myosins 2nd Edition Oxford University Press 1999

- L Stryer inBiochemistry (Ed WH Freeman 2005 pp

Refordfas Materiais e Meacutetodos

[A] S S Margossian SLowey Methods Enzymol1982 85 55-71

[B] JD Pardue JA Spudich Methods Enzymol 1982 85 164-181

[C] M Bradford Anal Biochem1976 72 248-254

[D] H H Taussky E Shorr J Biol Chem 1953 202 675-685

[E] C R Bagshaw in Outline Studies in Biology ndash Muscle Contraction Chapman and Hall Ed

1982

[F] A Cuenda et al Eur J Biochem1990 194 663-670

55

Anexos

1 Determinaccedilatildeo da recta de calibraccedilatildeo meacutetodo de Bradford

Figura1ndashRepresentaccedilatildeo graacutefica da recta de calibraccedilatildeo (Abs595 nm vs [BSA]) utilizada para o meacutetodo de Bradford

2 Determinaccedilatildeo da recta calibraccedilatildeo para a electroforese em condiccedilotildees desnaturantes

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo graacutefica da recta de calibraccedilatildeo (log(Peso Molecular) vs Rf dos marcadores de peso

molecular) onde Rf indica determinada atraveacutes do padratildeo de peso molecular

(poccedilo (a))

3Caacutelculo do coeficiente de extinccedilatildeo molar () para a quantificaccedilatildeo de cisteiacutenas reduzidas

atraveacutes do meacutetodo de Ellman

Traccedilou-se a recta de Abs412 nm meacutedia vs [L-Cisteiacutena] de modo a determinar o valor do coeficiente

de extinccedilatildeo molar definido como o declive daquela recta Assim =8400 M-1

cm-1

como

podemos verificar na Fig 3

A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM

Mobilidade relativa (Rf)

56

Tabela 3III ndash Amostras utilizadas para a obtenccedilatildeo da recta de determinaccedilatildeo de

[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo graacutefica da Abs412 nm vs a concentraccedilatildeo de L-Cisteiacutenas (microM) utilizado na determinaccedilatildeo

de com vista na quantificaccedilatildeo de cisteiacutenas reduzidas

Abs412 nm = 00084[L-Cisteiacutena]

Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m

[L-Cisteiacutena] (microM)

57

4 Espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear consideraccedilotildees gerais

A teacutecnica de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) permite a monitorizaccedilatildeo da absorccedilatildeo de

radiaccedilatildeo associada a transiccedilotildees de nuacutecleos atoacutemicos entre niacuteveis adjacentes de energia magneacutetica

A energia da radiaccedilatildeo eacute medida como funccedilatildeo do campo magneacutetico aplicado obtendo-se um

espectro de absorccedilatildeo em funccedilatildeo da forccedila do campo magneacutetico

As caracteriacutesticas do nuacutecleo constituinte de uma determinada moleacutecula iratildeo influenciar os sinais

obtidos no espectro de RMN permitindo-nos a obtenccedilatildeo de informaccedilotildees de variadas amplitudes

a estrutura da moleacutecula em anaacutelise a sua interacccedilatildeo intermolecular no sistema em estudo bem

como a sua participaccedilatildeo em processos dinacircmicos em soluccedilatildeo O espectro de RMN eacute constituiacutedo

por diversas bandas de ressonacircncia

Os paracircmetros espectrais de um espectro de RMN com mais interesse para o estudo em curso satildeo

o desvio quiacutemico () que se refere agrave posiccedilatildeo de cada banda em relaccedilatildeo a uma referecircncia

previamente escolhida (0) a amplitude da banda que se define como a altura relativa da banda a

intensidade definida pela aacuterea da banda a largura a meia altura a constante de acoplamento de

spin (J)

Todos os paracircmetros anteriormente referidos podem contribuir para a obtenccedilatildeo de informaccedilotildees

sobre o ambiente quiacutemico estrutura concentraccedilatildeo e interacccedilatildeo intermolecular com ecircnfase para

estudos cineacuteticos entre outros

O desvio quiacutemico evidencia as alteraccedilotildees do ambiente quiacutemico em redor do nuacutecleo observado e eacute

normalmente expresso em ppm que o torna um valor adimensional

O nuacutecleo de 51

V apresenta propriedades magneacuteticas que o tornam adequado para estudos atraveacutes

desta teacutecnica Este isoacutetopo apresenta uma abundacircncia natural de 9975 spin nuclear de 72 e

sensibilidade de 39 relativamente ao protatildeo (1H) As bandas dos vanadatos com configuraccedilatildeo

tetraeacutedrica ou aproximada apresentam largura a meia altura meacutedia (60-100 MHz) Assim a

realizaccedilatildeo de estudos com espeacutecies diamagneacuteticas (como eacute o caso do V(V))

Cada espeacutecie de vanadato (V(V)) estaacute caracterizada por ressonacircncias bem resolvidas no espectro

de RMN O tempo de relaxaccedilatildeo das diversas espeacutecies em estudo eacute semelhante pelo que a

integraccedilatildeo dos seus sinais fornece-nos a fracccedilatildeo molar e consequentemente a concentraccedilatildeo de

cada oligoacutemero

1

Agradecimentos

Ao meu orientador Doutor Rui O Duarte pela oportunidade dada para estudar este sistema tatildeo

fascinante e pelos preciosos conselhos em relaccedilatildeo agrave espectroscopia de Ressonacircncia

Paramagneacutetica Electroacutenica

Agrave Susana Ramos pela orientaccedilatildeo equilibrada paciecircncia dedicaccedilatildeo conselhos preciosos humor e

amizade sem os quais natildeo teria sido possiacutevel realizar este trabalho Obrigada por me teres

desafiado a ser a melhor aprendiz de cientista que conseguisse ndash com planeamento e

determinaccedilatildeo tudo se consegue

Ao Professor Doutor Manuel Aureliano (supervisor) da Faculdade de Ciecircncias e Tecnologia da

Universidade do Algarve pela recepccedilatildeo calorosa disponibilidade das suas instalaccedilotildees para a

obtenccedilatildeo da actina e pela gentil cedecircncia do subfragmento-1 de miosina imprescindiacutevel para o

estudo que realizei

Ao Rui Almeida pelos preciosos conselhos e colaboraccedilatildeo que estimularam o meu fasciacutenio pela

ciecircncia A disponibilidade que mostraste para me esclarecer sempre com clareza e simpatia

tornaram o meu trabalho de todos os dias mais agradaacutevel

Ao Ameacuterico Duarte pela indispensaacutevel ajuda para a realizaccedilatildeo da electroforese em condiccedilotildees

desnaturantes e pela amizade demonstrada nos momentos em que o nervosismo tomou conta de

mim

Agrave Dra Maria do Rosaacuterio Caras-Altas pela disponibilidade concedida no uso do espectroacutemetro de

RMN equipamento crucial na realizaccedilatildeo deste trabalho

A todos os meus colegas dos laboratoacuterios 407 e 613 cujo bom-humor e entreajuda tornaram os

meus dias mais agradaacuteveis

2

















h ndash Horas






Met - Metionina








3



















Tyr ndash tirosina



4

Resumo

















Summary















5

Iacutendice



111 Miosina

112 Actina



12 Vanaacutedio












2122 Actina




Subarow modificado



enzimas acopladas







242 Actividade Mg2+






31 Reagentes

32 Meacutetodos



miosina








6






Subarow modificado



enzimas acopladas












5 Estudos futuros


7






















8















de troponina [2]

111 Miosina








celular e tecidular

9






























10










ponte dissulfureto






MgATP)








[A]





11

112 Actina























contraacutectil



12



















13




finos de actina [P]

















no muacutesculo em



-

10-3

M)







14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

van

aacutedio

] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

nad

ato

(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

2

















h ndash Horas






Met - Metionina








3



















Tyr ndash tirosina



4

Resumo

















Summary















5

Iacutendice



111 Miosina

112 Actina



12 Vanaacutedio












2122 Actina




Subarow modificado



enzimas acopladas







242 Actividade Mg2+






31 Reagentes

32 Meacutetodos



miosina








6






Subarow modificado



enzimas acopladas












5 Estudos futuros


7






















8















de troponina [2]

111 Miosina








celular e tecidular

9






























10










ponte dissulfureto






MgATP)








[A]





11

112 Actina























contraacutectil



12



















13




finos de actina [P]

















no muacutesculo em



-

10-3

M)







14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

van

aacutedio

] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

nad

ato

(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

3



















Tyr ndash tirosina



4

Resumo

















Summary















5

Iacutendice



111 Miosina

112 Actina



12 Vanaacutedio












2122 Actina




Subarow modificado



enzimas acopladas







242 Actividade Mg2+






31 Reagentes

32 Meacutetodos



miosina








6






Subarow modificado



enzimas acopladas












5 Estudos futuros


7






















8















de troponina [2]

111 Miosina








celular e tecidular

9






























10










ponte dissulfureto






MgATP)








[A]





11

112 Actina























contraacutectil



12



















13




finos de actina [P]

















no muacutesculo em



-

10-3

M)







14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

van

aacutedio

] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

nad

ato

(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

4

Resumo

















Summary















5

Iacutendice



111 Miosina

112 Actina



12 Vanaacutedio












2122 Actina




Subarow modificado



enzimas acopladas







242 Actividade Mg2+






31 Reagentes

32 Meacutetodos



miosina








6






Subarow modificado



enzimas acopladas












5 Estudos futuros


7






















8















de troponina [2]

111 Miosina








celular e tecidular

9






























10










ponte dissulfureto






MgATP)








[A]





11

112 Actina























contraacutectil



12



















13




finos de actina [P]

















no muacutesculo em



-

10-3

M)







14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

van

aacutedio

] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

nad

ato

(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

5

Iacutendice



111 Miosina

112 Actina



12 Vanaacutedio












2122 Actina




Subarow modificado



enzimas acopladas







242 Actividade Mg2+






31 Reagentes

32 Meacutetodos



miosina








6






Subarow modificado



enzimas acopladas












5 Estudos futuros


7






















8















de troponina [2]

111 Miosina








celular e tecidular

9






























10










ponte dissulfureto






MgATP)








[A]





11

112 Actina























contraacutectil



12



















13




finos de actina [P]

















no muacutesculo em



-

10-3

M)







14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

van

aacutedio

] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

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e o

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va

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ato

(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

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RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

6






Subarow modificado



enzimas acopladas












5 Estudos futuros


7






















8















de troponina [2]

111 Miosina








celular e tecidular

9






























10










ponte dissulfureto






MgATP)








[A]





11

112 Actina























contraacutectil



12



















13




finos de actina [P]

















no muacutesculo em



-

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M)







14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

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] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

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(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

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Mg

2+-A

TP

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a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

7






















8















de troponina [2]

111 Miosina








celular e tecidular

9






























10










ponte dissulfureto






MgATP)








[A]





11

112 Actina























contraacutectil



12



















13




finos de actina [P]

















no muacutesculo em



-

10-3

M)







14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

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van

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] (m

M)


V10

V1

V4

27































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Esp

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e o

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rica

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(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

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31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

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Mg

2+-A

TP

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a d

e S

1 d

e

Mio

sin

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33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

8















de troponina [2]

111 Miosina








celular e tecidular

9






























10










ponte dissulfureto






MgATP)








[A]





11

112 Actina























contraacutectil



12



















13




finos de actina [P]

















no muacutesculo em



-

10-3

M)







14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

van

aacutedio

] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

nad

ato

(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

9






























10










ponte dissulfureto






MgATP)








[A]





11

112 Actina























contraacutectil



12



















13




finos de actina [P]

















no muacutesculo em



-

10-3

M)







14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

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V10

V1

V4

27































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V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

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ala

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en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








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242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

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ade

Mg

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TP

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e

Mio

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33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

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inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

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e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

10










ponte dissulfureto






MgATP)








[A]





11

112 Actina























contraacutectil



12



















13




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no muacutesculo em



-

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14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


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16





2 ndash que




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17




como

inibidor [W]






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3-) dependem


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O VO43-



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outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





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V

















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22













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24




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Actividade


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S1

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dependente de Ca2+




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K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













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Actividade (nmol


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V-RMN








sistema em estudo






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V1

V2

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28




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UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

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ala

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31








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242 Actividade Mg2+











32



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-ATPaacutesica












Act

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33



















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34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




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Rsup2 = 092992759

Inte

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RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

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sinai

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e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

11

112 Actina























contraacutectil



12



















13




finos de actina [P]

















no muacutesculo em



-

10-3

M)







14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



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18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




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V1

V2

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V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

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ala

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31








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-






















-ATPaacutesica












Act

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TP

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Mio

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33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

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inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

12



















13




finos de actina [P]

















no muacutesculo em



-

10-3

M)







14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



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) cuja



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18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





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20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

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23

















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24




modificado (n=2)

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Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




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(Ca2+

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K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

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rica

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M)


V10

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27































V-RMN observadas na



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V1

V2

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28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

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00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

13




finos de actina [P]

















no muacutesculo em



-

10-3

M)







14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

van

aacutedio

] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

nad

ato

(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

14
















(Refordf)

12 Vanaacutedio







da miosina



V e 51


15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

van

aacutedio

] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

nad

ato

(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

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a d

e S

1 d

e

Mio

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a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

15


































16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

van

aacutedio

] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

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va

nad

ato

(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

16





2 ndash que




conhecidos [AC]




















17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

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van

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] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

nad

ato

(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

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a d

e S

1 d

e

Mio

sin

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33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

17




como

inibidor [W]






2- e VO4

3-) dependem


[AEAFAGAHAI]

O VO43-



(PO43-



- V2) que apresenta







) cuja



-V10)(Refordf) a









18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

van

aacutedio

] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

nad

ato

(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

18
















outros [W Y AB]








19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

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] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



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Esp

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e o

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rica

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M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

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ala

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en

to

[S1] (microM)

31








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242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












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1 d

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Mio

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33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




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Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

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RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

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sinai

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PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

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57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

19





















-ATPaacutesica





-ATPaacutesica











20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















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24




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Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

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27































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e o

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V1

V2

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V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

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31








V contendo 2








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242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

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1 d

e

Mio

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a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

20















ADP






V

















21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




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27































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eacuteci

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V1

V2

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V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

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00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

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31








V contendo 2








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242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

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a d

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1 d

e

Mio

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33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















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42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

21





as espeacutecies

















V e

Pi eacute















22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

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M)


V10

V1

V4

27































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Esp

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V1

V2

V4

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28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

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00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

22













peso molecular












23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

van

aacutedio

] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

nad

ato

(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

23

















2122Actina

















24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

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V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



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e o

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rica

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M)


V1

V2

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V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

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inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

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e d

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sinai

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e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

24




modificado (n=2)

Proteiacutena

Actividade


fisioloacutegica

Actividade (nmol


S1

Ca2+








dependente de Ca2+




dependente de Ca2+




(Ca2+

-ATPase=21 s-1

K+EDTA-ATPase= 35 s


















25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

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M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



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eacuteci

e o

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meacute

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M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

25













acopladas

Actividade (nmol


-1)









V-RMN








sistema em estudo






26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

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aacutedio

] (m

M)


V10

V1

V4

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

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meacute

rica

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(m

M)


V1

V2

V4

V5

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

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a d

e S

1 d

e

Mio

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a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

26












V de














part (ppm) -5162 -5003 -4255 -5616 -5748









V-




eacuteci

e o

ligo

meacute

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V10

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27































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V1

V2

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28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

rgam

en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

ivid

ade

Mg

2+-A

TP

aacutesic

a d

e S

1 d

e

Mio

sin

a





33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

27































V-RMN observadas na



respectivamente

Esp

eacuteci

e o

ligo

meacute

rica

de

va

nad

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(m

M)


V1

V2

V4

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28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

s (4

00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

Fact

or

de

ala

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en

to

[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












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ivid

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Mg

2+-A

TP

aacutesic

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e S

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Mio

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a





33



















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34















quais












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35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

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RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

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PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

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40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

28




part (ppm) -5615 -5748 -5789 -5869















UVVis




(segundos) (Fig26 )






Ln

(Ab

s 400 n

m)

tempo (s)

29



Ln(Abs400 nm) = -436E-5






(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









Ln

(Ab

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00

nm

))

tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

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or

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[S1] (microM)

31








V contendo 2








part (ppm) -5613 -5747 -5789





242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












Act

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Mg

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33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

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y = 016786x + 122435

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36













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37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


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(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

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40 200 1740

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e 20 L de agente

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mL H2O 21


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enzimaacutetica

















enzimas acopladas

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47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








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V-RMN

























23


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DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

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decavanadato





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54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

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[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

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30 02465

40 0324

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Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

29



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(segundos) (Fig27)




microM (n= 2)







relatoacuterio









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tempo (s)

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






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242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












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reversiacutevel
















34















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microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

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RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

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PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

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5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



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-








KH2PO4 (L)


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(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

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100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

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m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

30





alargamento A





5 10 e 15 microM





V-RMN




V contendo 2










part (ppm) -5161 -5002 -4254 -5614






F = 00591[S1] - 00157 Rsup2 = 0998

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or

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V contendo 2








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-ATPaacutesica












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reversiacutevel
















34















quais












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y = 016786x + 122435

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Inte

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RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

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PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

31








V contendo 2








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242 Actividade Mg2+











32



-






















-ATPaacutesica












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[S1] (microM)

36













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37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















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42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

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5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


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0 0 1780

5 25 1775

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20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

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m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

32



-






















-ATPaacutesica












Act

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Mio

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33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

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RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

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PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

33



















reversiacutevel
















34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

34















quais












V o que

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

35

















microM VOSO4




y = 016786x + 122435

Rsup2 = 092992759

Inte

nsi

dad

e d

o s

inal

de

RP

E

[S1] (microM)

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

36













Inte

nsi

dad

e d

os

sinai

s d

e R

PE

[Vanadilo] (microM)




37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

37


31 Reagentes












MgATP (Sigma) Na








propanodiol Sigma)

32 Meacutetodos



da miosina





38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

38

















39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

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10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

39













40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

40























41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

41


















sendo a



















42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

42


















voacutertex



0 0 800 200

125 125 79875 200

25 25 7975 200

5 5 795 200

10 10 790 200

15 15 785 200




43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

43
































11



44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

44










minutos



amostra14





Aplicaram-

















13



cresol 0024 15



01 M 17



45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

45






-








KH2PO4 (L)


PO43-

(nmole) H2O (uL)

0 0 1780

5 25 1775

10 50 1770

20 100 1760

40 200 1740

100 500 1680


e 20 L de agente

redutor20











19



mL H2O 21


46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

46





enzimaacutetica

















enzimas acopladas

Da actividade Mg2+











47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

47







actividade Mg2+


























22


48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

48
























equaccedilatildeo








49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

49






V-RMN

























23


50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

50






DTNB





onda de 412 nm






















51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

51


















V-RMN que
















52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

52






terrestre

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

53

5 Estudos futuros



sugere-se




decavanadato





metavanadato











54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

54










1982


55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

55

Anexos






(poccedilo (a))





cm-1

como


A595 nm = 00546[BSA] + 00209 Rsup2 = 099051

Ab

s 59

5 n

m

[BSA] (mgmL)

log PM = -1177 Rf + 2247 Rsup2 = 098957

log

PM


56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

56


[L-Cisteiacutena]

(M)

A412 meacutedia

0 0

2 00115

4 0039

6 0069

8 0102

10 0137

20 0187

30 02465

40 0324

50 04045




Rsup2 = 09692

Ab

s 412 n

m


57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

57















spin (J)






O nuacutecleo de 51









cada oligoacutemero

Interacção do vanádio com a miosina de músculo esquelético ... · A todos os meus colegas dos...

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