INFLUÊNCIA DO TRATAMENTO COM ÁCIDO LIPOICO SOBRE … · APÊNDICE A – Ficha Clínica de Triagem...

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

INFLUÊNCIA DO TRATAMENTO COM ÁCIDO LIPOICO SOBRE O

METABOLISMO ÓSSEO E PERFIL ANTIOXIDANTE DE MULHERES

NA PERIMENOPAUSA

Aluno: Francisco Paulo Freire Neto

Orientadora: Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende

Co-orientadora: Profa. Dra. Maria das Graças Almeida

Natal-RN 2010

Francisco Paulo Freire Neto

INFLUÊNCIA DO TRATAMENTO COM ÁCIDO LIPOICO SOBRE

METABOLISMO ÓSSEO E PERFIL ANTIOXIDANTE EM MULHERES

NA PERIMENOPAUSA

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas

da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte na Área de Concentração Bioanálises

e Medicamentos

NATAL-RN 2010

DEDICATÓRIA

Á minha família

que sempre me apoiou em todos os momentos da minha vida sem nunca

pedir nada em troca. E graças a eles consegui cumprir mais essa etapa da

minha vida. A todos vocês avós, tios, primos, especialmente meus PAIS, pelo

amor, vida e educação, e minha IRMÃ. Com todo amor e carinho quero

agradecer por tudo que proporcionaram para que eu chegasse até aqui.

A minha namorada Ticiana, que tanto tem me apoiado em todos os passos que tenho trilhado. Você

apareceu na minha vida e me deu o companheirismo que eu precisava para

tornar essa etapa mais fácil. Queria apenas te dizer que te amo.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra.. Adriana Augusto de Rezende e Profa. Dra. Maria das Graças

Almeida que durante quase 10 anos tem me ajudado e orientado não só no âmbito

acadêmico, mas em todos os aspectos da vida.

À médica ginecologista Maria do Socorro Medeiros Morais que desde o inicio não

poupou esforços para que este trabalho fosse concluído.

À todos os professores colaboradores pela valiosa contribuição, que sem este apoio

jamais seria possível o desenvolvimento e conclusão deste trabalho:

Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão

Profa. Dina Maria de Araújo

Profa. Dra. Fernada Nervo Raffin

Prof. Dr. José Brandão Neto

Prof. Msc Júlio Fernandes Maia Neto

Profa. Dra. Lúcia de Fátima Pedrosa

Prof. Dr. Mario Hiroyuki Hirata

Profa. Dra. Rosário Dominguez Crespo Hirata

Prof. Dr. Túlio Flávio Accioly de Moura

À todos os amigo do Laboratório Multidisciplinar Álamo, Brunno, Clélio, Diana,

Felipe, Gustavo, Heglaine, Karine, Karla, Karol, Leandro, Leila, Luciana, Marcela,

Melina, Paula, Rand, Raul, Rodrigo, Tatiane, Yonara que ajudaram desde a fase mais

complexa até uma simples palavra e que assim conseguiram dar sua parcela de

contribuição nessa minha jornada e procuraram na amizade o termo comum de diálogo, o

meu sincero obrigado.

Aos funcionários da Faculdade de Farmácia-UFRN, Aureliana, Fábia, Selma e

Washington, bem como ao funcionário Fábio, UNp, pela ajuda, carinho e dedicação.

À todos do LABMAD que sempre estiveram dispostos a nos ajudar sempre que

recorremos a eles.

A todos os funcionários do LIATEC pela disponibilidade e contribuição.

As amigas e companheiras de trabalho Profa. Tereza Neuma de Sousa Brito,

Profa. Maria Goretti do Nascimento Santos e Profa. Telma Maria Araújo Moura Lemos

que souberam compreender as ausências quando precisava estar na pesquisa e pelas

palavras de incentivo nas horas difíceis.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 15

1.1 METABOLISMO ÓSSEO ........................................................................................ 15

1.1.1 CÉLULAS E SISTEMA IMUNOMODULADOR.................................................... 15

1.1.2 FATORES ASSOCIADOS A PERDA ÓSSEA..................................................... 18

1.2 MENOPAUSA ......................................................................................................... 23

1.2.1 TRANSIÇÃO MENOPAUSAL E EFEITO SOBRE O METABOLISMO ÓSSEO ... 23

1.2.2 TERAPIA CLÁSSICA E ALTERNATIVA COM ÁCIDO LIPOICO......................... 29

2 OBJETIVOS ................................................................................................................. 33

2.1 Objetivo Geral ........................................................................................................ 33

2.2 Objetivos Específicos ........................................................................................... 33

3 METODOLOGIA .......................................................................................................... 34

3.1 Aspectos Éticos do Projeto e Financiamento ..................................................... 34

3.2 Casuística .............................................................................................................. 34

3.3 Parâmetros Antropométricos ............................................................................... 36

3.3.1 ÍNDICE DE MASSA CORPÓREA – IMC ............................................................ 36

3.3.2 CIRCUNFERÊNCIA CINTURA QUADRIL .......................................................... 37

3.4 Amostras Biológicas ............................................................................................. 38

3.5 Avaliação Laboratorial .......................................................................................... 39

3.6 Avaliação do Perfil Oxidante ................................................................................ 39

3.6.1 OBTENÇÃO DO CONCENTRADO DE HEMÁCIAS ........................................... 39

3.6.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD) ...... 39

3.6.3 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA GLUTATIONA PEROXIDASE (GPX) ..... 40

3.6.4 DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE SRAT EM PLASMA .............................. 40

3.6.5 DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE GSH EM SANGUE TOTAL .................. 41

3.7 Análise da Expressão Gênica ............................................................................... 41

3.7.1 EXTRAÇÃO E AVALIAÇÃO DO RNA TOTAL .................................................... 41

3.7.2 ANALISE DE EXPRESSÃO DE mRNA PELA QT-PCR EM TEMPO REAL ........ 42

3.8 Avaliação Estatística ............................................................................................. 45

4 RESULTADOS ............................................................................................................. 46

5 DISCUSSÃO ................................................................................................................ 57

5 CONCLUSÕES ............................................................................................................ 70

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 71

APÊNDICE A – Ficha Clínica de Triagem ....................................................................... 92

APÊNDICE B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ........................................ 94

APÊNDICE C – Ficha Clínica de Avaliação Ginecológica ............................................... 97

ANEXO 1 – Certificado final da avaliação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa do

Hospital Universitário Onofre Lopes – CEP-HUOL ......................................................... 102

ANEXO 2 – Termo de Concessão e Aceitação de Apoio Financeiro à Projeto de Pesquisa

........................................................................................................................................ 103

ANEXO 3 – Resumos Apresentados em Congressos ..................................................... 104

ANEXO 4 – Valores de referência para as determinações

bioquímicas no sangue.................................................................................................... 106

ARTIGO .......................................................................................................................... 107

LISTA DE ABREVIATURAS

AL – Ácido Lipoico

ALT – Alanina Aminotransferase

AMR – Atividade Metabólica de Repouso

AST – Aspartato Aminotransferase

BMP-6 – Proteína óssea morfogênica

CC – Circunferência Cintura

CCPar – Centro Clínico de Especialidades Médicas de Parnamirim

DHL – Ácido dihidrolipoico

DNA – Ácido desoxirribonucléico

ERO’s – Espécies Reativas de Oxigênio

FAL – Fosfatase Alcalina

FSH – Hormônio Folículo Estimulante

GGT – Gama Glutamil Transferase

GH – Hormônio do crescimento

GPx – Glutationa Peroxidase

GSH – Glutationa Reduzida

HDL – Lipoproteína de alta densidade

HIV – Human immunodeficiency virus

IGF-I – Fator de crescimento semelhante a insulina tipo I

IL – Interleucina

IMC – Índice de Massa Corpórea

LDL – Lipoproteína de baixa densidade

LH – Hormônio Luteinizante

M-CSF – Fator estimulador de colônia de macrófago

MDA – Malonildialdeído

mRNA – Ácido ribonucléico mensageiro

NAMS – The North American Menopause Society

OMS – Organização Mundial de Saúde

OPG – Osteoprotegerina

PTH – Paratormônio

RANK – Receptor Ativador de NFκB

RANKL – Ligante do Receptor Ativador de NFκB

RCQ – Relação Cintura Quadril

SOD – Superóxido Dismutase

SRAT’s – Substâncias Reativas ao Ácido tiobarbitúrico

TCLE – Termo de Conscentimento Livre e Esclarecido

TFN-ɑ – Fator de necrose tumoral alfa

TGF-β – fator de crescimento beta de transformação

TRH – Terapia Hormonal

TRAP – Fosfatase Ácida Tartarato-Resistente

VLDL – Lipoproteína de muito baixa densidade

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1: Estado nutricional e antropométrico, de acordo com o IMC,

para adultos. 36

QUADRO 2: Valores de classificação para circunferência da cintura de

acordo com o gênero. 37

QUADRO 3: Valores de classificação para a RCQ, de acordo com o

gênero. 37

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Iniciadores e sondas marcadas utilizadas nas PCRs em

Tempo real 42

TABELA 2. Valores de inclinação da curva e eficiência da qT-PCR em

tempo real. 43

TABELA 3 – Características das mulheres na perimenopausa 44

TABELA 4 – Distribuição das características Antropométricas e

adiposidade das mulheres na perimenopausa 45

TABELA 5 – Perfil Lipídico das mulheres na perimenopausa. 48

TABELA 6 – Perfil de segurança quanto ao uso de Ácido Lipoico e

Placebo das mulheres estudadas 49

TABELA 7 - Avaliação do metabolismo mineral e ósseo das pacientes na

perimenopausa. 50

TABELA 8 – Avaliação do Perfil Oxidativo das pacientes na

perimenopausa 50

TABELA 9 – Avaliação da expressão de mRNA dos genes RANK,

RANKL, IL-6 e TNF-α 51

TABELA 10 – Análise da correlação entre expressão de RANK, RANKL,

IL-6 e TNF-ɑ em LTSP e parâmetros pró e antioxidantes, antes do

tratamento com Ácido Lipoico em mulheres na perimenopausa.

52

TABELA 11 – Análise da correlação entre expressão de RANK, RANKL,

IL-6 e TNF-ɑ em LTSP e os parâmetros bioquímicos, após do tratamento

com Ácido Lipoico em mulheres na perimenopausa.

53

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Resumo esquemático da diferenciação celular óssea. As

células mesenquimais que originam mioblastos, adipócitos, condrócitos

e células estromais, diferenciam-se em preosteoblastos e depois se

tornam osteoblastos na superfície óssea. Os osteoblastos também

podem se incorporar ao osso como osteócitos. Os precursores da

linhagem mielóide que originam macrófagos e células dendríticas, se

transformam em preosteoclastos, fundem-se e originam osteoclastos

multinucleados. Adaptado de: WALSH et al, 2006.

16

FIGURA 2 – Via de sinalização mostrando a interação entre o sistema

imune as células do tecido ósseo na osteoimunologia. Adaptado de

Takayanagi, 2005.

17

FIGURA 3. Mecanismo esquemático da via de regulação da massa

óssea pelo estrógeno. Adaptado de Imai et al 2009. 27

FIGURA 4 – Representação da ação do Ácido Lipoico sobre a produção

de ERO’s com possível ação sobre o metabolismo ósseo. 61

FIGURA 5 – Esquema mostrando alterações provocadas pela perimenopausa associada à possível ação do ácido lipoico sobre a produção de ERO’s.

63

RESUMO

O osso é um tecido dinâmico que está em constante processo de remodelação em resposta

ao estresse mecânico e mudanças hormonais. O presente trabalho teve por objetivo

entender a relação entre as alterações bioquímicas, oxidativas e moleculares em mulheres

em transição menopausal e a influência do uso do ácido lipoico (AL) nessas alterações. O

estudo do tipo duplo-cego, foi realizado com mulheres em perimenopausa submetidas à um

tratamento de 3 meses com 600 mg de AL administrados por via oral em duas doses diárias,

comparadas com um outro grupo que recebeu placebo durante o mesmo período. O

presente trabalho mostrou que as mulheres apresentaram uma circunferência de cintura

(CC) e um índice de massa corporal, em média, acima dos valores preconizados pela OMS

(CC ≥ 80 cm; IMC > 25kg/m2). Além disso, essas mulheres apresentaram aumento nas

concentrações de colesterol total e triglicerídeos, além de valores de LDL próximos do

limítrofe (Colesterol Total > 200mg/dL; Triglicerídeos > 150mg/dL; LDL >130mg/dL). Essas

alterações não sofreram influência do tratamento com AL. Não foram encontradas

alterações no perfil hepático (ALT, AST e GGT) e renal (Uréia, Creatinina, Proteínas Totais e

Albumina) das mulheres após o tratamento com AL, bem como no perfil mineral (Cálcio

Total, Cálcio Ionizado, Fósforo e Magnésio) e ósseo (Osteocalcina, Fosfatase Alcalina Total

e Fosfatase Ácida Tartarato Resistente). Os resultados do perfil oxidativo mostraram que o

tratamento com AL diminuiu a atividade da enzimática da Glutationa Peroxidase (GPx) (p <

0,01), enquanto para os parâmetros Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúricos

(SRAT’s), Glutationa Reduzida (GSH) e Superóxido Dismutase (SOD) não houve diferenças.

A SOD apesentou-se elevada no grupo placebo após os 3 meses de estudo (p<0,05). A

expressão do mRNA do RANKL em leucócitos totais mostrou-se diminuída (p < 0,05) e do

RANK aumentada (p<0,001), após o tratamento com AL, enquanto a expressão dos genes

IL-6 e TNF-ɑ não apresentou alteração. Podemos concluir que as mulheres em estágio de

perimenopausa, inicial de deficiência estrogênica, apresentam alteração no perfil lipídico e

composição corporal, e que essas alterações poderiam estar induzindo alterações no perfil

oxidativo e do metabolismo ósseo. Entretanto, o tratamento com AL se mostrou eficaz para

o perfil oxidativo, bem como ósseo já que marcadores precoces como a atividade da GPx e

a expressão do mRNA do RANKL, respectivamente, foram reduzidos associada a não

alteração na atividade da SOD. Estes resultados sugerem o efeito benéfico e protetor do AL,

indicando-o como uma alternativa para tratamento auxiliar nas complicações associadas à

deficiência estrogênica.

Palavras-chave: Perimenopausa, metabolismo ósseo, estresse oxidativo, ácido lipoico.

ABSTRACT

Bone is a dynamic tissue that is in constant process of remodeling in response to mechanical

stress and hormonal changes. This study aimed to understand the relationship between the

biochemical changes, which women in the menopausal transition are subject to, and how the

use of an alternative therapy with lipoic acid (LA) could influence these changes. The study

of double-blind, was carried out in perimenopausal women that underwent a three month

treatment with 600 mg of AL compared with another group that received placebo during the

same period. This study showed that women had a waist circunference and body mass index

above the values recommended by WHO (WC ≥ 80 cm; BMI > 25kg/m2). Associated with

this, these women had increased concentrations of total cholesterol and triglycerides, and

borderline LDL (Total Cholesterol > 200mg/dL; Triglycerides > 150mg/dL; LDL >130mg/dL).

These changes were not affected by treatment with AL. There were no shifts in liver profile

(ALT, AST and GGT), kidney profile (urea, creatinine, total protein and albumin), mineral

profile (Total Calcium, Ionized Calcium, Phosphorus and Magnesium) as well in bone

markers (osteocalcin, Total Alkaline Phosphatase and Tartrate Resistant Acid Phosphatase)

after treatment with LA. The results of the oxidative profile showed that treatment with LA

decreased GPx activity (p < 0,01), while for the TBARS, GSH and SOD activity there were no

differences. With regard to SOD, this enzyme will submit to be high in the placebo group

after 3 months of study (p<0,05). The expression of RANKL mRNA was reduced (p < 0,05)

and of RANK increased (p <0.001), after treatment with LA, while the expression of IL-6 and

TNF-ɑ genes were no changed. We conclude that women already in the perimenopause

stage have changes in lipid profile and body composition that could induce shifts in oxidative

and bone metabolism. However, LA treatment has provided an effective effect in the

oxidative and bone profile since the earliest markers such as GPx activity and mRNA

expression of RANKL, respectively, were reduced associated with no change in SOD activity.

These results suggest a beneficial and protective effect of LA, indicating it potential as an

alternative treatment to help the to prevent the complications associated with estrogen

deficiency.

Keywords: Perimenopause, bone metabolism, oxidative stress, lipoic acid.

15 1. INTRODUÇÃO

1.1 METABOLISMO ÓSSEO

1.1.1 CÉLULAS E SISTEMA IMUNOMODULADOR

O osso é um tecido dinâmico que está em constante processo de

remodelação em resposta ao estresse mecânico e mudanças hormonais. A

remodelagem óssea ocorre em discretas unidades no esqueleto, chamados

unidades de remodelagem óssea, e envolvem um equilíbrio dinâmico entre as

células de reabsorção óssea, osteoclastos, e as de formação óssea, osteoblastos.

(OZGOCMEN, 2007).

A matriz óssea é formada por material orgânico e inorgânico. A matriz

orgânica inclui uma camada de proteoglicano e colágeno tipo I, enquanto que a

matriz inorgânica apresenta uma camada de hidroxiapatita (cristais de fosfato de

cálcio) sendo o principal reservatório de cálcio. Nos adultos, 10% da massa óssea é

reconstruída todo ano através da ação das células ósseas de formação e

reabsorção (RHO et al, 2004; LI et al, 2006).

Os osteoblastos são células de origem mesenquimal (Figura 1), responsáveis

por secretar a matriz orgânica e induzir a calcificação através do processo de

formação óssea. Os osteoblastos são células cubóides que formam uma camada

continua localizada na superfície externa do tecido ósseo onde o novo osso é criado.

A atividade de formação óssea pelos osteoblastos é lenta e ocorre continuamente

em todos os ossos, dessa maneira o novo osso é constantemente formado. A

diferenciação e função destas células são reguladas por fatores de crescimento e

citocinas (WALSH et al, 2006).

Os osteoclastos são derivados das células hematopoiéticas da linhagem

monócito/macrófago (Figura 1). A sua principal função é destruir a superfície do

osso velho ou fraturado durante o processo de reconstrução. Estas células estão

localizadas na superfície do osso, apresentam um formato discóide que compreende

a borda ondulada (ruffled zone) e zona fechada (sealing zone). A borda ondulada

contém elementos que reabsorvem os componentes orgânicos e inorgânicos do

osso. Os osteoclastos através da borda ondulada secretam enzimas como a

fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP) que ocasionam a descalcificação óssea

16 e a cathepsina K que digere a matriz protéica óssea (WALSH et al, 2006). A

ativação dos osteoclastos dissolve a matriz óssea, liberando cálcio ionizado no fluido

extracelular alterando a homeostase do cálcio (LI et al, 2006).

FIGURA 1. Resumo esquemático da diferenciação celular óssea. As células mesenquimais que originam mioblastos, adipócitos, condrócitos e células estromais, diferenciam-se em preosteoblastos e depois se tornam osteoblastos na superfície óssea. Os osteoblastos também podem se incorporar ao osso como osteócitos. Os precursores da linhagem mielóide que originam macrófagos e células dendríticas, se transformam em preosteoclastos, fundem-se e originam osteoclastos multinucleados. Adaptado de: WALSH et al, 2006.

Estudos têm mostrado que a homeostase óssea é influenciada por

componentes do sistema imune, através de efeitos diretos e indiretos dos linfócitos T

sobre os osteoclastos. Um campo emergente nesta área é a osteoimunologia, uma

vez que a reabsorção óssea patológica é observada em condições inflamatórias,

associada aos efeitos diretos e indiretos das células T nos osteoclastos (NANES,

2003; RHO et al., 2004; FOUQUE-AUBERT, CHAPULART, 2007). O papel das

células T na biologia óssea tem sido mais aceito desde a descoberta do sistema

RANK/RANKL/OPG (Receptor Ativador de NFκB/ Ligante do Receptor Ativador de

NFκB/Osteoprotegerina) em meados de 1997 e 1998, por estes serem membros da

família do TNF (Fator de necrose tumoral). O RANK, inicialmente identificado nas

células T, e em seguida em osteoclastos, é reconhecido como fator essencial para a

osteoclatogênese, o que reforça a interrelação entre os sistemas: ósseo e imune

(RHO et al., 2004, FOUQUE-AUBERT, CHAPULART 2007; BOYCE, XING, 2008).

Adipócito

Célula do estroma

Célula tronco mesenquimal

Precursor Mielóide Célula

Dendrítica

Pré-osteoblasto Pré-osteoclasto

Osteoclasto Osteoblasto

Osteócito Osso

Macrófago

17 As células T parecem promover a reabsorção óssea diretamente via expressão de

RANKL, e indiretamente via expressão de citocinas pró-inflamatórias que irão mediar

a expressão de RANKL em células não T, como osteoblastos. Já o seu receptor

RANK, é expresso pelos osteoclastos e progenitores hematopoiéticos. Esta

interação é necessária e, juntamente com Fator estimulador de colônia de

macrófago (M-CSF) suficiente para a formação de osteoclastos. A OPG por sua vez,

é produzida pelos osteoblastos, e atua como um receptor solúvel antagonista para o

ligante RANKL, impedindo que este último se ligue ao RANK presente nos

osteoclastos e ative a osteoclastogênese (Figura 2) (MACKIE, 2003; THEOLEYRE

et al, 2004; WADA et al. 2006; BLAIR; ZHENG; DUSTAN. 2007).

FIGURA 2 – Via de sinalização mostrando a interação entre o sistema imune as células do tecido

ósseo na osteoimunologia. Adaptado de Takayanagi, 2005.

A OPG é uma glicoproteína que pertence à superfamília de receptores dos

fatores de necrose tumoral (TNFRSF11B) (MORINGA et al, 1998). O gene humano

OPG está localizado no cromossomo 8 (8q24.1), tem 29 kb de tamanho e contém 5

exons que codificam uma proteína com 401 aminoácidos. É expresso em vários

tecidos, incluindo o sistema cardiovascular, pulmão, rins, intestino, osso

INFLAMAÇÃO Macrófagos

Células T

OSTEOBLASTOS

Fibroblastos

Autoamplificação do NFATc1

Imuno- receptores

Diferenciação Osteoclástica TRAP Receptor de calcitonina

Calcineurina

Sinalização pelo Ca2*

OSTEOCLASTOS

18 (osteoblastos), células hematopoiéticas e imunológicas (SCHOPPET et al, 2002;

WADA et al, 2006; KEARNS et al, 2008). A sua principal função no metabolismo

ósseo é inibir a atividade e a diferenciação dos osteoclastos. Estudos in vitro e in

vivo, demonstraram que a expressão aumentada de OPG estava relacionada com o

aumento da massa óssea em associação com o número diminuído de osteoclastos

(KEARNS et al, 2008).

O RANKL pertence à família dos ligantes dos fatores de necrose tumoral

(TNFSF11) (LACEY et al, 1998). O gene RANKL está localizado no cromossomo 13

(13q14), tem 58 kb de tamanho e contém 8 exons que codificam para uma proteína

com 316 aminoácidos. É expresso em células de linfonodos, timo, pulmão, baço,

medula óssea, sangue periférico e osteoblastos (SCHOPPET et al, 2002; WADA et

al, 2005; KEARNS et al, 2008). A sua principal função no metabolismo ósseo é a

estimulação da diferenciação e da atividade dos osteoclastos e inibição da apoptose

dos osteoclastos (KEARNS et al, 2008).

O RANK pertencente á família dos receptores dos fatores de necrose tumoral

(TNFRSF11A). O gene RANK tem 61 kb de tamanho está localizado no cromossomo

18 (18q22.1), contém 12 exons que codificam uma proteína de 616 aminoácidos

(ANDERSON et al, 1997). Este gene é expresso nas células dendríticas, endoteliais,

fibroblastos, linfócitos T e B e nos osteoclastos (SCHOPPET et al, 2002; WADA et

al, 2005; KEARNS et al, 2008).

Com a descoberta do sistema OPG/RANKL/RANK foi possível o melhor

entendimento da regulação dos osteoblastos e dos osteoclastos na

osteoclastogênese, favorecendo a compreensão de mecanismos fundamentais na

fisiologia óssea, identificando um novo grupo de fatores candidatos que podem estar

envolvidos na patogênese de várias doenças ósseas (KEARNS et al, 2008).

1.1.2 FATORES ASSOCIADOS À PERDA OSSEA

A taxa de reconstrução óssea e o número de sítios de reconstrução

aumentam em várias condições patológicas afetando o metabolismo ósseo, como

osteoporose pós-menopausal, hiperparatireoidismo, artrite reumatóide, Diabetes

mellitus entre outras, na qual alterações locais e sistêmicas em nível de hormônios

ou citocinas pró-inflamatórias estimulam a reabsorção óssea. Muito dos fatores que

induzem a reabsorção óssea atuam predominantemente por mecanismos indiretos

19 que envolvem a regulação positiva da expressão de RANKL pelos osteoblastos,

células T e outras células (BOYCE & XING, 2008).

A ligação entre RANK e RANKL fornece sinais que direcionam o

desenvolvimento dos osteoclastos nas células hematopoiéticas progenitoras e

ativação dos osteoclastos maduros (THEOLEYRE et al, 2004; KEARNS et al, 2008).

Essa ligação entre RANKL e RANK resulta no recrutamento de uma proteína

denominada de TRAF6 (receptor de TNF associado ao fator 6) aos sítios específicos

no domínio intracelular de RANK. O TRAF6 atua como um segundo mensageiro

ativando várias proteínas kinases assim como fatores de transcrição como fator

nuclear-κB (NF-κB). O NF-κB ativado transloca-se para o núcleo ocasionando a

regulação positiva de c-fos, o qual interage com o fator nuclear ativado de células T

(NFAT)-c1 que induz a transcrição dos genes osteoclastogênicos (KEARNS et al,

2008).

Poubelle et al. (2007) evidenciaram a expressão de OPG, RANK e RANKL

nos neutrófilos do fluido sinovial de pacientes com artrite reumatóite, entretanto nos

neutrófilos do sangue periférico houve somente a expressão de RANKL. Os autores

sugeriram que os neutrófilos podem contribuir para a reconstrução óssea nos sítios

inflamatórios.

A ação inibitória da OPG sobre o RANKL não apresenta efeito na inflamação,

mas previne completamente a perda óssea e protege a cartilagem. Estes dados

foram confirmados em estudos realizados com camundongos deficientes em

RANKL, nos quais havia ausência de produção de osteoclastos, que era recuperada

com reposição de RANKL e M-CSF exógenos (GRIMAUD et al.,2003; MACKIE,

2003; UELAND, 2004). Estudos em camundongos transgênicos demonstraram que

a super expressão de OPG levou ao desenvolvimento de osteopetrose grave e

redução do número de osteoclastos. Ao contrário, camundongos knockout para OPG

apresentavam osteoporose (BUCAY et al., 1998). O efeito biológico da OPG nas

células ósseas inclui a inibição do estágio terminal da diferenciação de osteoclastos,

supressão da ativação de osteoclastos maduros e indução de apoptose (PIVONKA

et al. 2008).

A possibilidade de participação das Espécies Reativas de Oxigênio (ERO’s)

na diferenciação dos osteoclastos foi levantada baseando-se na correlação entre a

produção de ERO’s e a formação dos osteoclastos nas superfícies ósseas in vivo, e

em cultura in vitro de células de medula óssea. O TNF-α (fator de necrose tumoral-

alfa) tem se mostrado como o principal candidato na indução da linhagem de células

20 osteoclásticas através de uma ação das ERO’s, uma vez que exerce fortes efeitos

na diferenciação dos osteoclastos e tem sido mostrado ser a causa da geração de

ERO’s em outros tipos celulares (KIM et al. 2006).

Tem sido mostrado que no osso, o H2O2 seria responsável pela oxidação das

proteínas envolvidas na diferenciação celular e modulação de sua atividade, através

tanto de sua estimulação quanto de sua inibição. Entre as vias de sinalização

sensíveis ao estado redox envolvidas na diferenciação óssea, a via do NF-kB tem

sido a mais estudada já que a interação RANKL/RANK induz a ativação do mesmo

com conseqüente diferenciação, maturação e ativação dos osteoclastos (BAI et al.

2005).

Em 1990, Garret et al. foram os primeiros a descrever uma relação entre

ERO’s, particularmente o ânion superóxido, e a formação e ativação de

osteoclastos. Esses achados foram confirmados por Lee et al. em 2005. Eles

demonstraram que a osteoclastogênese induzida pelo RANKL requer uma produção

de EROs, usando precursores celulares da medula óssea como modelo de

diferenciação de osteoclastos (LEE at al. 2005). Similarmente, a glutationa

peroxidase 1 (GPx1) é a enzima antioxidante mais expressa pelos osteoclastos e é

responsável pela degradação do peróxido de hidrogênio. Esta enzima tem mostrado

uma expressão elevada na linhagem celular osteoclástica RAW264.7 prevenindo a

osteoclastogênese induzida pelo RANKL (LEAN at al. 2005), sugerindo um papel

crucial do peróxido de hidrogênio na formação dos osteoclastos. Estes autores

demonstraram que o 17β-estradiol estimula a expressão de GPx1 em osteoclastos

derivados da medula óssea e que a deficiência de estrógeno foi o passo chave na

estimulação da expressão de TNF-α mediada pelas ERO’s, levando à

osteoclastogênese e conseqüente reabsorção óssea (LEAN et al 2003).

Na linhagem celular de osteoblastos humano MG63, células primárias

estromais de medula óssea de ratos e osteoblastos da região calvarial, o aumento

dos níveis de ERO’s intracelular (H2O2 ou ânions superóxidos gerados pelo sistema

xantina/xantina oxidase) tem mostrado uma estimulação de mRNA do RANKL e uma

expressão protéica. Esses dados suportam fortemente o envolvimento das ERO’s,

como H2O2 ou o ânion superóxido na perda óssea relacionada a doenças pela

estimulação e diferenciação dos osteoclastos e conseqüente reabsorção óssea (BAI

et al. 2005).

Em ratos ooforectomizados, o aumento na produção de TNF-α, uma citocina

que promove a diferenciação dos osteoclastos, foi observado em medula óssea em

21 resposta ao estresse oxidativo e ativação de células T. Este efeito contribui para o

entendimento do mecanismo de perda óssea durante a menopausa (GRASSI et al.

2007).

A perda óssea pode ser resultado, além de um aumento nos osteoclastos

com conseqüente reabsorção óssea, de uma diminuição na atividade dos

osteoblastos e assim diminuição na formação óssea. Ao invés da influência na

expressão do RANKL nos osteoblastos, recentes estudos sobre o papel do H2O2 na

atividade dos osteoblastos têm mostrado uma inibição na sua diferenciação celular.

Em 2004, Liu et al. mostraram que o peróxido de hidrogênio induziu o estado de

estresse oxidativo e suprimiu o processo de diferenciação osteblástica em células

primárias estromais de medula óssea de ratos. Esta inibição na diferenciação celular

foi caracterizada pela redução na atividade da fosfatase alcalina, uma enzima chave

na deposição mineral óssea. A presença de metalotioneína, um inibidor de ERO’s,

re-estabeleceu a diferenciação celular, sugerindo um papel crucial do estresse

oxidativo na inibição da diferenciação osteoblástica (LIU et al. 2004). Em outro

estudo, Bai et al. (2004) confirmaram que H2O2 induziu estresse oxidativo e suprimiu

a diferenciação osteoblástica em células primárias estromais de medula óssea de

coelhos. Nesse estudo osteoblastos tratados com H2O2 exibiram diminuição em

marcadores como fosfatase alcalina, colágeno tipo 1, unidade formadora de colônia

osteoprogenitora (CFU-O) e fosforilação nuclear do fator de transcrição Runx2.

Recentemente, a relação entre o sistema antioxidante e a formação óssea foi

examinada em células MC3T3-E1. Quando incubadas com H2O2, os níveis de

mineralização foram diminuídos juntamente com a expressão gênica de marcadores

osteogênicos Runx2, ALP e sialoproteína óssea (ARAI et al 2007).

Além de afetar o processo de diferenciação, as ERO’s também influenciam

sobre a meia-vida dos osteoblastos. A glutaredoxina 5 (Grx5) é uma enzima

altamente expressa no osso que tem um papel importante na proteção contra

ERO’s. Quando apresenta um aumento na sua expressão, a Grx5 previne a

produção de ERO’s e protege os osteoblastos do processo de apoptose induzido

pelas ERO’s, através de um mecanismo dependente da atividade da manganês

superóxido dismutase (MnSOD) (LINARES et al. 2009). Convencionalmente,

acredita-se que as ERO’s estão envolvidas na hipertrofia dos condrócitos, um passo

crucial para o crescimento longitudinal e desenvolvimento de ossos longos. Esta

hipótese é suportada por experimentos in vivo e in vitro, demonstrando que

tratamento com NAC aumentou os níveis de antioxidantes endógenos e protegeu as

22 células frente ao estresse oxidativo, dessa forma promovendo a proliferação dos

condrócitos assim inibindo a hipertrofia (MORITA et al. 2007). Dessa forma em

contraste com o que é observado com os osteoblastos, as ERO’s tem mostrado

estimular a diferenciação terminal dos condrócitos e promovem a ossificação

endoncondral.

Em conjunto, esses dados demonstram que as ERO’s não somente tem um

efeito direto promovendo a osteoclastogênese, mas também mostram que a perda

óssea pode ser induzida pela apoptose, diminuição na diferenciação e atividade dos

osteoblastos o qual estimula a formação de osteoclastos induzida pelo RANKL.

Os estudos de Jagger et al. (2005) e Almeida et al. (2007) confirmaram que a

deficiência de estrógeno levou uma diminuição nas defesas antioxidantes tióis no

tecido ósseo de roedores, levando a uma acelerada perda óssea com a idade. Esta

falha no sistema de defesas antioxidantes contra o aumento do estresse oxidativo,

tem mostrado induzir a perda óssea através da via de sinalização dependente do

TNF-α (JAGGER et al. 2005). Associado a isso, o nível plasmático e atividade da

Superóxido Dismutase (SOD), uma enzima que converte o anion superóxido em

peróxido de hidrogênio, foi negativamente associada com a densidade mineral

óssea em humanos (OZGOCMEN et al. 2007; JAGGER et al. 2005; SANCHEZ-

RODRIGUEZ et al. 2007).

Bashir et al. (2005) demonstraram relação entre a diminuição da expressão

dos genes OPG, RANK e RANKL em sangue periférico em mulheres em tratamento

com estrógeno e a diminuição das concentrações séricas de Propetídeo carboxil-

terminal do colágeno tipo 1 (serum c-terminal telopeptide) e de OPG e o aumento

da densidade mineral óssea. Os autores sugeriram que a expressão desses genes

estaria respondendo ao remodelamento ósseo associado ao tratamento com

estrógeno.

1.2 MENOPAUSA

1.2.1 TRANSIÇÃO MENOPAUSAL E EFEITO SOBRE O

METABOLISMO ÓSSEO

A Organização Mundial de Saúde (OMS) define a menopausa como a

permanente cessação da menstruação resultante da perda da atividade ovariana

folicular que é reconhecido como tendo ocorrido após 12 meses consecutivos de

23 amenorréia sem causa patológica. Mais do que um evento isolado, a diminuição nas

concentrações de estrógeno é um processo universal que toma parte de muitas

mudanças fisiológicas e metabólicas, não afetando apenas o sistema reprodutor,

mas também outros tecidos das mulheres. Além disso, a menopausa pode implicar

mudanças importantes nos aspectos sociais e psicológicos da vida das mulheres,

onde tem mostrado afetar cada mulher de forma exclusiva. Para algumas mulheres

o fim da fertilidade se apresenta também como o fim das preocupações com a

contracepção e os períodos menstruais, o que para elas traz uma sensação de

liberdade. Entretanto, para a grande maioria das mulheres, “enfrentar” a pós-

menopausa com crises emocionais e sociais, podem contribuir para sérios

problemas de saúde (WHO, 1996; MOHAMMAD et al. 2004; COSTA & GUARDA

2008; MORIYAMA et al., 2008).

No mundo ocidental, a menopausa ocorre em uma idade mediana de 51,4

anos, com uma distribuição gaussiana variando de 40 a 58 anos. Algumas mulheres

atingem a menopausa na terceira década de vida, e algumas aos 60 anos. Embora

tenha havido um aumento da expectativa de vida ao longo dos anos, a idade da

menopausa não mudou ao longo dos últimos séculos. Hoje, especialmente no

mundo desenvolvido, as mulheres gastam um terço a metade de suas vidas no

período de pós-menopausa. A menopausa precoce faz com que as mulheres

passem mais anos após a menopausa, o que certamente é uma conseqüência

adversa. (KOK et al. 2004; BLUMEL et al. 2006; SHUSTER et al. 2009)

Segundo o Council of Affiliated Menopause Societies – CAMS, menopausa

prematura é definida como a menopausa que ocorre em uma idade inferior a dois

desvios-padrão abaixo da média de idade estimada para a população de referência.

Na ausência de estimativas confiáveis da distribuição da idade da menopausa

natural da população dos países em desenvolvimento, a idade de 40 anos é

freqüentemente usada como um ponto arbitrário de corte, abaixo do qual a

menopausa é dita ser prematura (SHUSTER et al. 2009).

A menopausa é precedida pela chamada “transição menopausal”,

popularmente referida como perimenopausa, uma fase durante a qual mudanças

menstruais e sintomas menopausais são comumente relatados. Durante a

perimenopausa mudanças nas concentrações hormonais como, por exemplo, o

hormônio folículo estimulante (FSH) que apresenta um aumento gradual,

característico dessa fase da vida das mulheres. (BLAKE, 2006)

24

A perimenopausa é clinicamente definida como um intervalo antes da

menopausa, caracterizada por uma atividade periódica de irregularidades

menstruais ou um prolongado período de amenorréia < 12 meses. A mediana da

idade de início tem sido relatada como entre 45,5 e 47,5 anos com duração média

de 4 anos. É altamente recomendado que o termo perimenopausa seja utilizado

como indicado aqui e não aplicado às mulheres na faixa dos 40 e início dos anos 50

que continuam a ter ciclos menstruais regulares e não os sintomas da aproximação

da menopausa. Estudos das alterações hormonais durante a perimenopausa, foram

baseados em vários modelos experimentais e definições. O Massachusetts’

Women’s Health Study (MWHS), um estudo longitudinal de 5 anos iniciado em 1981

com 2570 mulheres do estado de Massachusetts, com idades entre 45 e 55 anos,

indicou que os melhores itens para indicar que as mulheres estariam no período de

perimenopausa seriam: amenorréia presente de 3 a 11 meses e aumento de

irregularidades menstruais para aquelas que não possuíam amenorréia, as mulheres

desse estudo apresentavam esses sintomas com uma idade média de 47,5 anos

com uma média de duração de 4 anos. Um outro estudo, Seattle Midlife Women’s

Health Project, realizado em 2000 na cidade de Seattle, relatou o tempo de duração

dos ciclos menstruais, bem como o fluxo desses ciclos, como predeterminantes para

que as mulheres sejam consideradas como em perimenopausa. (BRAMBBILLA et

al. 1994; MITCHELL et al. 2000; BASTIAN; SMITH; NANDA, 2003; HALE; BURGER,

2008).

A deficiência do estrógeno leva a repercussões nos órgãos-alvo de forma

sistêmica e profunda, em vista da ampla distribuição de seus receptores no

organismo (IMANOV et al., 2005; DEROO; KORACH, 2006). Este fenômeno

determina o aparecimento de um conjunto de sinais e sintomas que caracterizam o

climatério, denominada de “síndrome do climatério ou síndrome menopausal”

(ALMEIDA, 2004; SAMSIOE; DÖREN; LOBO, 2006). Outro fator que pode favorecer

esse quadro é o incremento dos processos oxidativos, que é típico na diminuição da

síntese de estrógeno como mostrado em alguns estudos (TREVISAN et al. 2001;

BEDNAREK-TUPIKOWASKA et al. 2004).

Na síndrome climatérica a paciente apresenta uma grande variedade de

queixas que vão desde sintomas vasomotores como fogachos, acompanhados de

sudorese, distúrbios do sono, palpitação, vertigem, diminuição da memória, atrofia

urogenital, dispareunia, vaginites e incontinência urinária de esforço (SWHARZ,

2007) até o desenvolvimento de doenças crônico degenerativas como diabetes

25 mellitus, hipertensão arterial sistêmica, doenças cardiovasculares (PICHÉ et al.

2005), depressão (LORENZI et al. 2005), Alzheimer, osteoporose (LORENZI et al.

2006; OLIVEIRA et al., 2007) dentre outras que comprometem muito a qualidade de

vida das mulheres (VAN DER SCHOUW; GROBBEE, 2005; ZOLI et al. 2006).

Vários estudos têm sido realizados nos diferentes períodos de vida das

mulheres, desde a pré-menopausa até a pós-menopausa (MAZZUOLI et al. 2000;

PELAYO et al. 2008; MORIYAMA et al. 2008; ROGERS et al. 2009). Entretanto

baixo número de estudos relacionados à perimenopausa (FINKELSTEIN et al.

2008), fase da vida da mulher que começam a surgir alterações hormonais

significativas que podem comprometer a qualidade de vida das mulheres.

(SANTORO, 2003, LORENZI et al. 2006; HALE & BURGER, 2008)

A base biológica da síndrome climatérica são mudanças que incidem na

estrutura e função do ovário. Nesse período, ocorre uma diminuição progressiva do

número de folículos ovarianos, ocasionando uma menor produção de estrogênio por

estes e interrompendo os mecanismos de feedback necessários à manutenção do

ciclo menstrual (BASTOS et al. 2006).

Esses mecanismos estão sob o controle de um sistema de retroalimentação,

em que o hipotálamo, através do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH),

regula a síntese e liberação das gonadotrofinas hipofisárias. Por sua vez, os

hormônios luteinizante (LH) e FSH regulam a produção ovariana de progesterona e

estrogênios, recebendo destes uma retroalimentação negativa. O FSH também é

influenciado pela inibina, um hormônio responsável por inibir sua síntese e secreção

por ação direta na hipófise (SOARES; ALMEIDA, 2000).

Com a transição menopausal, ocorre um desequilíbrio nesse sistema

hormonal, consequente à diminuição do número de folículos ovarianos e da síntese

da inibina ovariana, além da menor resposta ao LH e FSH. Dessa maneira, ocorrem

ciclos menstruais irregulares, devido ao desenvolvimento folicular errático

(FERNANDES et. al., 2003; HALE & BURGER, 2008).

Logo, há o encurtamento das fases folicular e lútea, além da queda do pico

de estrogênio, que acarretam a diminuição da concentração sérica deste hormônio.

Por conseguinte, há uma progressiva elevação nas concentrações séricas de FSH,

podendo estes chegar a ser de 10 a 15 vezes maiores do que no período

reprodutivo (HALE & BURGER, 2008). Essa elevação induz o crescimento rápido de

folículos ovarianos, podendo ser a causa do encurtamento dos ciclos e que podem

26 representar a primeira evidência clinica da aproximação da menopausa. Com esse

crescimento, há consequente secreção de estrogênio, aumentando as

concentrações circulantes. Dessa forma, apesar da diminuição global de folículos

ovarianos em pacientes na perimenopausa, o aumento de FSH nessa fase age de

modo a manter as concentrações de estrogênio normais no período que antecede a

menopausa (SHAABAN, 1996).

É somente após a depleção absoluta dos folículos ovarianos que esses não

conseguem responder ao aumento de FSH e dessa forma começa a haver uma

intensa diminuição do estrogênio (HALE & BURGER, 2008; LUND, 2008).

Esse hormônio é de grande importância para a saúde da mulher, sendo suas

ações envolvidas no controle da ovulação, regulação neuroendócrina, do sistema

cíclico reprodutor, na implantação do óvulo e na estimulação das características

sexuais secundárias, juntamente aos seus efeitos sistêmicos como o crescimento,

maturação dos ossos longos (GIESE, 2003) e a redução das concentrações séricas

de colesterol (MITCHELL; WOODS; MARIELLA, 2004).

Nas mulheres na pré-menopausa, com metabolismo normal, o estrogênio é

secretado em quantidades significativas pelos ovários, com utilização do colesterol

como precursor. Entretanto, o estrógeno pode ser sintetizado localmente, tal como

no fígado, tecido adiposo, cérebro e pelo córtex adrenal (TAPIERO; BA; TEW,

2002). Com a aproximação da menopausa, há uma progressiva diminuição da

concentração sérica desse hormônio, determinando alterações na função de

diversos órgãos-alvo. Em 70 a 80% das mulheres na perimenopausa essa

diminuição determina o aparecimento dos sinais e sintomas característicos da

transição menopausal. Assim, o hipoestrogenismo pode ser considerado como um

dos principais fatores causadores desses sinais e sintomas (BAKSU et al. 2005).

Em relação ao metabolismo ósseo, o estrógeno tem uma influência nos

osteoblastos e osteoclastos através de seus receptores no tecido ósseo. Nos

osteoblastos, o estrógeno estimula a síntese e diferenciação de fatores de

crescimento beta de transformação (TGF- β), proteína óssea morfogênica – 6 (BMP-

6), fator de crescimento semelhante a insulina I (IGF-I) e aumento na expressão dos

receptores da 1,25(OH)2 vitamina D3, hormônio do crescimento (GH) e

progesterona. O estrógeno age ainda, inibindo a síntese de citocinas pró-

reabsortivas como: interleucina (IL)-1α, IL-1β, IL-6, M-CSF, TNF- α, além de

aumentar a expressão gênica de OPG. Seus efeitos nos osteoclastos incluem

27 apoptose e inibição nos estágios de formação e estimulação dos osteoclastos, além

da inibição na atividade de enzimas lisossomais dessas células (Figura 3)

(STANOSZ et al., 2009).

FIGURA 3. Mecanismo esquemático da via de regulação da massa óssea pelo estrógeno. Adaptado de Imai et al 2009.

Além da ação sobre o sistema OPG/RANK/RANKL, o estrógeno, pode ainda

afetar a geração, a meia vida e a atividade dos osteoclastos e osteoblastos em nível

celular, agindo como supressor da produção de várias citocinas pró-inflamatórias,

como a IL-1 e a IL-6. Concentrações aumentadas destes mediadores, que ocorre na

deficiência de estrógeno observada na pós-menopausa, estão associados com o

aumento da osteoclastogênese e um balanço negativo de remodelação óssea

(UELAND, 2004; PACIFICI, 2007). Outras citocinas como o TNF-α e a IL-1β

também atuam no sentido de aumentar a reabsorção óssea, estimulando a atividade

e proliferação osteoclástica (VURAL; AKGUL; CANBAZ, 2006).

Diante destes dados, propusemos o presente estudo considerando-o de

extrema importância para que os estagios mais precoces de deficiência de

estrógeno, como a perimenopausa, sejam avaliados e uma vez identificadas as

Células Hematopoiéticas

Osteoclastos Morte Celular

Osteoclastogênese Osteoclasto Maduro

Osteoblasto Estrógeno

Estrógeno

Estrógeno

Ovário

Cérebro

Células Imunológicas

Estrógeno

28 alterações e fatores associados à perda óssea estes possam ser indicadores de

intervenção terapêutica preventiva.

1.2.2 TERAPIA CLÁSSICA E ALTERNATIVA COM ÁCIDO LIPOICO

A administração de estrógenos sintéticos associados ou não a progesterona,

conhecida como terapia de reposição hormonal (TRH), constitui um importante

recurso na diminuição dos sintomas do climatério segundo consenso publicado em

2007 pela Sociedade Norte-americana de menopausa (The North American

Menopause Society - NAMS), além de prevenir doenças em mulheres na peri e pós

menopausa (NAMS, 2007).

Estudo realizado por Ji et al. (2006), demonstrou que a similaridade estrutural

da classe estrogênica com a vitamina E seria responsável pela interrupção da

peroxidação lipídica, diminuindo a degradação de membranas biológicas, que seria

um indício na diminuição dos processos oxidativos. Os estrógenos também seriam

capazes de preservar a integridade do endotélio vascular via mecanismo

antioxidante. Alguns estudos mostram o estradiol como redutor da lipoperoxidação

em humanas (UNFER et al., 2006, ALTINDAG et al., 2008) e em modelos animais

de hipercolesteroleremia (KEANEY; SHWAERY; XU, 2004).

Estes efeitos benéficos da TRH na diminuição dos desconfortos e prevenção

de doenças teriam, entre outras atribuições, o aumento nas defesas antioxidantes

com conseqüente diminuição das ERO’s. Pode-se esperar uma ação antioxidante de

mesma natureza também no osteoclasto o qual, com a deficiência estrogênica,

tende a diminuir acarretando aumento da concentração de ERO´s provocando vários

danos nos constituintes celulares e afetando consideravelmente a sinalização de

proteínas. (GARCIA-SEGURA; AZCOITIA; DONCARLOS, 2001).

Ainda citando o consenso norte-americano (NAMS, 2007), o uso da TRH

abrangeria não só o período após o evento menopausa, mas também aponta seus

benefícios, quando em doses mínimas, na melhora da qualidade de vida de

mulheres perimenopausadas. Outras terapias hormonais eficazes na prevenção e

no tratamento da menopausa tem sido de interesse clínico como aquela instituída

com a tibolona, derivado do 19-nortestosterone, útil no alívio de sintomas

climatéricos e prevenção da osteoporose na pós-menopausa (NAMS, 2007; PENG-

HUI et al., 2007).

29

A TRH tem mostrado claramente benefícios na saúde óssea em mulheres

com osteoporose pós-menopausal. Experimentos in vitro têm indicado possíveis

mecanismos subjacentes. Um pré-tratamento de células da linhagem dos osteócitos

com 17β-estradiol resultou na inibição da apoptose induzida por H2O2 associada a

uma diminuição na produção de ERO’s intracelular (MANN et al. 2007). Em

mulheres em pós-menopausa, foi observada uma diminuição na atividade da

catalase após o tratamento com Raloxifeno, um modulador seletivo do receptor do

estrógeno (SERM), o qual mostrou uma redução no estado oxidativo (OZGOCMEN

et al. 2007), observado pela diminuição das concentrações de carbonil protéico no

soro (KORUCULOGLO et al. 2006). Entretanto, um aumento na prevalência de

eventos tromboembólicos, câncer uterino e de mama também tem sido relatada

após a TRH (VALVERDE et al. 2008).

Além da TRH, dentro da prevenção ou redução dos efeitos causados pelo

estresse oxidativo gerado pelo estado de pós-menopausa, ressalta-se o papel da

suplementação com substâncias como a vitamina E, vitamina C, β-caroteno e, mais

recentemente, o ácido lipoico (KRIS-ETHERTON et al. 2004; BILSKA; WłODEK,

2005). Na linha destas observações, a vitamina C tem mostrado efeitos benéficos na

densidade mineral crescente do osso nas mulheres e, mais recentemente, NAC e a

vitamina C inibiram a perda óssea induzida por ooforectomia em um modelo de

osteoporose experimental (MORTON; BARRETT-CONNOR; SCHNEIDER, 2001;

LEAN et al., 2003).

O ácido lipoico vem sendo apontado como uma substância promissora na

defesa antioxidante. O AL e sua forma oxidada tem sido denominados na literatura

como “antioxidante universal” devido as suas habilidades em inativar a ação e inibir

a produção de uma grande variedade de ERO´s, como também regenerar outros

antioxidantes (PACKER et al., 2000). Conseqüentemente, a administração dos

antioxidantes acima mencionados na dieta pode ter efeitos favoráveis na saúde e na

qualidade de vida das mulheres, especialmente daquelas que não podem sofrer

níveis elevados do estresse oxidativo.

O AL, que também é conhecido como ácido R(+)-α- lipoico é um cofator

natural importante no metabolismo energético mitocondrial (TEICHERT; HERMANN;

RUUS, 2003). Nas ultimas décadas, a dupla redox ácido α-lipoico/ácido

dihidrolipoico receberam considerável atenção pela sua variedade de efeitos. A

redução celular de ácido α- lipoico a ácido dihidrolipóico (DHL) foi descrita em vários

organismos mamíferos (HARAMAKI et a., 1997).

30

Embora exista uma quantidade muito pequena de AL livre no organismo

humano sem suplementação, o AL livre tem a habilidade de capturar radicais

superóxido, peróxido de hidrogênio, radicais hidroxil e peroxinitrito. Além disso, ele

pode interagir com outros antioxidantes como ascorbato, vitamina E e GSH,

contribuindo para a sua regeneração (WOLLIN & JONES 2003). Devido à sua

atividade antioxidante, o uso do AL tem se mostrado benéfico em várias formas de

estresse oxidativo, e um interesse como agente terapêutico nos processos de

isquemia e reperfusão, complicações diabéticas, formação de catarata, infecção por

HIV (Human immunodeficiency vírus), doenças neurodegenerativas, e lesões

radiação. (ALLEVA et al., 2005).

A capacidade antioxidante do AL está localizada no grupamento tiol, que

reage diretamente com os radicais oxidantes. É considerado um importante

antioxidante que pode ser de valor terapêutico em patologias relacionadas à

superprodução de radicais livres (PEREZ & CASTANEDA, 2006).

Nutricionalmente, o AL é encontrado no germe de trigo, no levedo de cerveja

e na carne vermelha. Contudo, a dieta dos mamíferos não prevê quantidades

suficientes de AL para uma significativa ação antioxidante (MORIKAWA et al. 2001).

O AL apresenta uma alta tolerância à suplementação bem documentada em

muitos estudos in vivo, com modelos animais e em humanos (HERMANN et al.

1996; BIEWENGA et al. 1997; TEICHERT et al. 1998; MARANGON et al. 1999;

RELJANOVIC et al. 1999; RUHNAU et al. 1999; ZIEGLER et al. 1999).

Cremer et al. (2006) avaliaram a toxicidade e carcinogenicidade do AL em

ratos suplementados durante 2 anos com doses de 20 a 180 mg/Kg/dia. Mesmo no

grupo que ingeriu 180mg/Kg, o AL não apresentou potencial carcinogênico ou

toxicidade a algum dos órgãos avaliados, entre eles: coração, fígado, baço, rins,

tireóide e cérebro.

Mais de 93% de uma dose de AL, administrada oralmente, é absorvida pelo

epitélio intestinal; contudo, apenas 20-30% escapa da metabolização hepática. Após

a absorção, o AL é reduzido intracelularmente para formar a ácido dihidrolipóico

(DHLA) que pode subseqüentemente sofrer S-metilação. AL e DHLA também estão

sujeitos à β-oxidação. AL é excretado pela urina na forma de metabólitos como o

4,6-bismetilmercapto-hexanóico que é o composto predominante. Em ratos, e

excreção urinária é responsável por aproximadamente 80% da eliminação do AL

(CREMER et al 2006).

31

Este composto também mostrado melhora no balanço glicolítico em pacientes

com diabetes mellitus tipo 2 além de ter efeitos antiobesidade (KONRAD et al.,

1999; KIM et al., 2004). Recentemente, o interesse nas aplicações clínicas do AL em

muitas doenças crônicas tem sido extremamente elevada, talvez devido a sua

segurança clínica relativa e às propriedades antioxidantes potentes (SMITH et al.,

2004).

Em estudos desenvolvidos por Alleva et al. (2005) e Borcea et al. (1999) em

pacientes submetidos a condições de estresse oxidativo, seja por uso de terapia

hiperbárica ou por pelo Diabetes mellitus, respectivamente, o uso de 600mg ao dia

de AL, mostrou uma melhora no quadro de estresse oxidativo. Entretanto, o efeito

deste antioxidante na prevenção de perda óssea e em células ósseas não tem sido

muito investigado.

Em outros estudos, ratos com artrite induzida por colágeno mostrou estar

associada com um aumento na produção de ERO’s intracelular em linfócitos dos

linfonodos inguinais, juntamente com um aumento de citocinas pró-inflamatórias. O

tratamento com AL diminuiu a produção de ERO’s bem como as propriedades

inflamatórias, sugerindo um papel do AL como antioxidante preventivo nas doenças

inflamatórias das articulações (LEE et al. 2007).

Dessa forma o uso de AL representaria uma possível alternativa clínica no

desconforto climatérico e no entendimento dos mecanismos osteoimunológicos

associados à falência ovariana. Vale ressaltar a carência de estudos voltados para a

perimenopausa, já que a maioria dos trabalhos que abordam a suplementação

antioxidante na deficiência estrogênica são voltados para a pós-menopausa. Logo, o

estudo apoiado na responsabilidade e ética, possibilitaria maiores subsídios para a

melhora da qualidade de vida desta parcela da população.

32 2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar a influência do tratamento com ácido lipoico sobre o metabolismo

ósseo, através de marcadores bioquímicos e moleculares, bem como sobre o perfil

antioxidante, através de marcadores pró e antioxidantes, em mulheres na

perimenopausa.

2.2 Objetivos Específicos

o Avaliar os parâmetros antropométricos como IMC, CC e RCQ além do perfil

lipídico através da determinação da concentração sérica de colesterol total,

HDL, VLDL, LDL e triglicerídeos das mulheres na perimenpausa, e a

resposta a suplementação com ácido lipoico;

o Avaliar as mulheres na perimenopausa quanto ao perfil hepático e renal

através da determinação da atividade sérica das enzimas ALT, AST, GGT e

da concentração sérica de uréia, creatinina, proteínas totais e albumina,

usadas como perfil de segurança, afim de, verificarmos possíveis alterações

provocadas pela suplementação com ácido lipoico;

o Determinar a atividade da fosfatase alcalina total, fosfatase acida tartarato-

resistente e a concentração de osteocalcina, marcadores de formação

óssea, e a concentração sérica dos minerais: fósforo, magnésio, cálcio total

e ionizado, antes e após a suplementação com ácido lipoico;

o Determinar a concentração de GSH e SRAT’s (Substâncias Reativas ao

Ácido tiobarbitúrico) e a atividade das enzimas antioxidantes GPx, SOD,

antes e após a suplementação com ácido lipoico;

o Estudar a expressão do mRNA do genes RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ em

leucócitos totais de sangue periférico, antes e após a suplementação com

ácido lipoico;

o Avaliar as alterações de todos os parâmetros estudados frente uma

suplementação com ácido lipoico, e verificar o possível efeito benéfico deste

potente antioxidante na saúde óssea das mulheres que estão na

perimenopausa, condições iniciais de deficiência de estrógeno.

33 3 MÉTODOS

O estudo realizado é do tipo ensaio clínico aleatorizado e controlado duplo

cego no qual foi avaliado o efeito da suplementação com ácido lipoico sobre a

condição de estresse oxidativo e metabolismo ósseo em mulheres na

perimenopausa, onde pesquisadores de áreas distintas estão trabalhando

conjuntamente com a perspectiva de uma visão multidisciplinar.

3.1 Aspectos Éticos do Projeto e Financiamento

O estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do

Hospital Universitário Onofre Lopes - UFRN, obedecendo às diretrizes

regulamentadas da pesquisa envolvendo seres humanos, que constam na

Resolução do CNS nº 196/96. A pesquisa foi aprovada sob parecer consubstanciado

nº 178/08 (anexo 1).

O presente projeto teve financiamento aprovado pelo Edital CNPq Universal

2007, Processo 481011/2007-2, onde recebeu financiamento para execução do

mesmo.

3.2 Casuística

As mulheres com idade entre 40 e 60 anos que procuraram as 10 Unidades

Básicas de Saúde (Parque das Orquídeas, Parque Industrial, Passagem de Areia,

Centro, Cohabinal, Rosa dos Ventos, Santos Reis, Monte Castelo, COOPHAB e

Emaús) da Rede Municipal de Saúde do Município de Parnamirim/RN, foram

convidadas a participar do estudo onde as mesmas foram entrevistadas conforme

Ficha Clínica de Triagem (Apêndice A).

Foram selecionadas 600 mulheres e encaminhadas para o Centro Clínico de

Especialidades Médicas de Parnamirim (CCPar) onde foram atendidas pela equipe

multidisciplinar e submetidas aos critérios de inclusão ou exclusão, conforme

listados a seguir. Desse total, para 50 mulheres que atenderam aos critérios de

inclusão e exclusão, foram agendadas consultas com a ginecologista do grupo de

pesquisa, Dra. Maria do Socorro Medeiros de Morais, para serem avaliadas

conforme Ficha Clínica de Avaliação Ginecológica (Apêndice C). Aquelas que

cumpriram os critérios clínicos de inclusão e exclusão e assinaram o Termo de

34 Conscentimento Livre e Esclarecido (TCLE) estiveram aptas a participar da

pesquisa.

As mulheres foram informadas a respeito de sua participação voluntária por

meio do TCLE (Apêndice B), constando dados sobre a pesquisa, assim como os

riscos e benefícios.

Este grupo de 50 mulheres foi dividido aleatoriamente em 02 grupos de

preferência quantitativamente iguais, conforme delineado abaixo, que foram

acompanhados ao mesmo tempo. Devido ao fato do estudo ser do tipo duplo cego,

os pesquisadores responsáveis não tiveram acesso à divisão dos grupos.

Grupo 1 - Grupo Placebo (n=25) que receberam placebo como estratégia de

estímulo de adesão ao tratamento;

Grupo 2 – Grupo Ácido Lipoico (n=25), que receberam suplementação oral

diária com ácido α-lipoico na dose de 600mg/dia dividas em duas doses de 300mg

cada, durante um período de 3 meses; a administração foi realizada 30 minutos

após as refeições para evitar o desconforto gástrico associado a natureza da droga.

As cápsulas usadas no estudo forma manufaturadas na Farmácia Escola da

Faculdade de Farmácia – UFRN, sob orientação da profa. Dina Maria de Araújo.

Essas cápsulas passaram por um controle de qualidade prévio, a fim de avaliar o

teor de ácido lipoico nas cápsulas e assim validar o processo de manufaturamento

das mesmas. Esse procedimento foi realizado no Laboratório de Controle de

Qualidade da Faculdade de Farmácia sob a supervisão do prof. Dr. Cícero Flávio

Soares Aragão. Durante o processo de manipulação das cápsulas o controle de

qualidade consistia na análise do peso médio das mesmas. Os frascos que

continham as cápsulas (frascos branco), quanto as casulas (cápsulas 00, cor vinho),

eram idênticos, para que não houvesse viés na analise dos resultados.

As mulheres incluídas no Projeto foram semanalmente visitadas pelos

agentes comunitários de saúde para garantir a permanência no estudo e evitar

desistências, supervisionar o uso adequado da medicação e o aparecimento de

alguma intercorrência ou efeito colateral, como desconforto gástrico, relacionada à

suplementação com ácido lipoico.

Do total de 50 mulheres incluídas no estudo ocorreram 11 perdas as quais

não seguiram de forma correta as orientações quanto ao uso do medicamento (3) ou

não compareceram na data marcada para a segunda coleta (8). Dessa forma

restaram 39 mulheres participantes do estudo, sendo 22 no Grupo Ácido Lipoico e

17 no Grupo Placebo.

35

Critérios de inclusão

A Inclusão no estudo segue os critérios clínicos e laboratoriais para

perimenopausa adotados pela North American Menopause Society (2007):

• História de Irregularidade nos últimos 6 meses e/ou amenorréia há no máximo

12 meses;

• Idade entre 40 e 60 anos;

• Presença de um ou mais sintomas como sintomas vasomotores (fogachos,

sudorese noturna), somáticos (fadiga, artralgia, mialgia e alterações da pele),

urogenitais (ressecamento vaginal, sangramento vaginal irregular, polaciúria,

nictúria, urgência miccional, vaginites atróficas e incontinência urinária de

esforço), afetivos (como irritabilidade, tensão, ansiedade e apatia) e sintomas

relacionados à atividade sexual (alterações de libido e dispareunia).

• Nível sérico do FSH igual ou superior a 25UI/L;

• Obter escore maior que 14 pontos no Índice Menopausal de Kupperman

(KUPPERMAN, 1959).

Critérios de exclusão

• Apresentam menopausa precoce (antes dos 40 anos) e/ou menopausa

cirúrgica;

• Estiverem utilizando de forma regular medicações hormonais (incluindo

estrogênios, progestagênio e anticoncepcionais);

• Mulheres com história de fumo e consumo de álcool;

• Doenças ou disfunções psiquiátricas que alterem as funções cognitivas;

• Portadora de doenças clínicas tireoideanas, hepáticas, renais e pancreáticas;

• Apresenta alguma contra-indicação a terapêutica de reposição hormonal

estrogênica, ou seja, antecedentes pessoais de neoplasia de mama e/ou

útero, cardiopatia grave, atual ou recente, tromboembolismo, e hepatopatia

grave;

• Presença de nódulo mamário, hiperplasia endometrial a esclarecer ou outras

condições ginecológicas que à critério clínico se julgue prudente não fazer

TH.

• Amenorréia a mais de 12 meses

• Condições clínicas não citadas, mas que podem interferir com o climatério;

36

• Medos, queixas reais ou esperadas para o tratamento que possa interferir

com os objetivos do estudo;

• Participação simultânea em outro ensaio clínico.

3.3 Parâmetros Antropométricos

3.3.1 Índice de Massa Corpórea – IMC

A avaliação antropométrica foi realizada por meio da mensuração do peso

corporal e estatura das pacientes, para cálculo do Índice de Massa Corpórea (IMC),

que corresponde à razão do peso pela altura ao quadrado (Peso/Altura²),

recomendado pela Organização Mundial de Saúde (WHO, 1998). Para mensuração

da massa corporal, foi utilizada balança digital Tanita®, modelo MEA-03140, com

capacidade para 150 kg e precisão de 100 gramas, estando os indivíduos descalços

e com o mínimo possível de roupa e adereços.

A estatura foi aferida uma vez em centímetros, com auxílio de estadiômetro,

da marca Sanny® com comprimento de 2,20m. As mulheres foram medidas

descalças em posição ortostática, com os olhos no plano Frankfört, com as costas e

a parte posterior dos joelhos encostados à parede. O valor do IMC é dado pelo

quociente do peso, em kilogramas, pelo quadrado da altura, em cm (IMC = Peso

(Kg)/Altura (cm)2). O estado nutricional antropométrico das participantes do estudo

foi avaliado conforme Quadro 1.

QUADRO 1: Estado nutricional e antropométrico, de acordo com o IMC, para adultos.

Índice de Massa Corporal (IMC)

kg/m²

Diagnóstico do Estado Nutricional

Antropométrico

≥ 40,0 Obesidade grau III

35,0 – 39,9 Obesidade grau II

30,0 – 34,9 Obesidade grau I

25,0 – 29,9 Pré-obeso ou sobrepeso

18,5 – 24,9 Eutrofia

17,0 – 18,4 Magreza grau I

16,0 – 16,9 Magreza grau II

< 16,0 Magreza grau III

FONTE: WHO, 1998. (Traduzido)

37 3.3.2 Circunferência da Cintura e do Quadril

As circunferências da cintura e quadril foram aferidas com o auxílio de uma

fita métrica inelástica, com 150 cm de comprimento.

Para medida da circunferência da cintura foi solicitado à entrevistada para

que ela levante a blusa e deixe os braços estirados sobre o corpo e em seguida foi

aferida a circunferência da cintura na região mais estreita do abdômen (em alguns

casos se localiza dois dedos acima da cicatriz umbilical). A aferição foi realizada em

triplicata e o valor médio de ambas será considerado para efeito de análise.

Os valores obtidos na circunferência da cintura foram classificados de acordo

com o Quadro 2.

QUADRO 2: Valores de classificação para circunferência da cintura de acordo com o

gênero.

Risco de complicações metabólicas Circunferência cintura (cm)

Homens Mulheres

Aumentado ≥ 94 ≥ 80

Substancialmente aumentado ≥ 102 ≥ 88

FONTE: WHO, 2004 (Traduzido).

Na medida da circunferência do quadril o avaliador se posicionou na lateral

do entrevistado para facilitar a tomada da medida, a fita foi posicionada na região de

maior perímetro entre a cintura e a coxa (maior protuberância glútea).

A Relação Cintura Quadril (RCQ) identifica a distribuição da gordura corporal,

sendo o indicador mais freqüente utilizado para identificar o tipo de distribuição da

gordura (andróide ou ginóide), obtida pela razão entre circunferência da cintura e a

circunferência do quadril (CC/CQ). Os valores obtidos na RCQ foram classificados

de acordo com o Quadro 3.

QUADRO 3: Valores de classificação para a RCQ, de acordo com o gênero.

Gênero Risco de complicações metabólicas associadas à Obesidade

Masculino > 1,0

Feminino > 0,85

FONTE: WHO, 1998 (Traduzido)

38 3.4 Amostras Biológicas

Foram coletados cerca de 30 mL de sangue por punção venosa, utilizando-se

sistema de coleta a vácuo, após jejum de no mínimo 12 horas, de todas as mulheres

para a realização de determinações bioquímicas, hormonais e imunológicas, RNA

total e avaliação do perfil antioxidante. O sangue foi fracionado em três alíquotas,

sendo uma sem anticoagulante (dosagens bioquímicas), outra com heparina

(osteocalcina) e outra com EDTA (biologia molecular e perfil antioxidante).

3.5 Avaliação Laboratorial

A avaliação laboratorial consistiu de hemograma completo, determinações de

concentrações séricas de colesterol total e frações, triglicérides, glicemia de jejum,

transaminases hepáticas (ALT e AST), gama-glutamil transferase (GGT), fosfatase

alcalina total, fosfatase ácida tartarato-resistente, fósforo, magnésio, creatinina,

uréia, proteínas totais, albumina. Esses parâmetros foram determinados no auto-

analisador Dimension AR® (Dade Behring, Newark, USA) utilizando-se kits de

reagentes e protocolos do fabricante, sendo realizados no Laboratório de Análises

Toxicológicas e Clínicas - LIATEC (Natal-RN). Também foram realizadas as

dosagens de hormônio folículo-estimulante (FSH) através da técnica de

quimioluminescencia, utilizando-se o Sistema Immullite (SIEMENS, Los Angels,

USA).

3.6 Avaliação do Perfil Oxidante

3.6.1 Obtenção do Concentrado de Hemácias

O sangue total coletado com EDTA foi centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos

a uma temperatura de 4ºC em centrífuga refrigerada Sigma 2k15 (Sigma

Laborzentrifugen, Germany) para a separação dos eritrócitos e dos demais

constituintes por processos de centrifugação e lavagem com solução tampão

fosfato/NaCl de pH 7,4. A concentração de glutationa foi determinada em amostras

de sangue total. O plasma foi utilizado para a determinação das substâncias reativas

ao ácido tiobarbitúrico (SRAT). O concentrado de hemácias foi acondicionado em

39 microtubos e armazenados em freezer -80ºC para posterior determinação da

atividade de superóxido dismutase e glutationa peroxidase.

Os resultados da atividade das enzimas SOD e GPx são expressos em U/gHb,

dessa forma foi realizada a analisa da concentração de hemoglobina. Essa análise

foi realizada em sangue total em equipamento hematológico automatizado MICROS

60 OS (ABX, France)

3.6.2 Determinação da Atividade da Superóxido Dismutase (SOD) (E.C.

1.1.15.1.1)

A atividade da SOD foi determinada através de kit RANSOD (RANDOX

LABORATORIES, United Kingdom). Este método emprega xantina e xantina oxidase

(XOD) para gerar radicais superóxido os quais irão reagir com 2-(4-iodofenil)-3-(4

nitrofenol)-5-cloreto de feniltetrazol (I.N.T) para formar o composto vermelho de

formazan . A atividade do superóxido dismutase foi medida através do grau de

inibição desta reação determinado a 505 nm UV-1650 PC Spectrophotometer UV-

Visible (Shimadzu, Tokio, Japan). A atividade da enzima é expressa em U/gHb.

XOD

Xantina Ácido Úrico + O2-

O

2-

I.N.T. Corante Formazan ou

SOD O2

- + O2- + 2H- O2 + H2O2

3.6.3 Determinação da Atividade da Glutationa Peroxidase (GPX) (E.C.

1.6.4.2)

A atividade da GPx foi determinada utilizando kit RANSEL (RANDOX

LABORATORIES, United Kingdom). A Glutationa Peroxidase (GPX) catalisa a

oxidação da Glutationa (GSH) pelo Hidroperóxido de Cumeno. Na presença da

Glutationa Redutase (GR) e NADPH a Glutationa oxidase (GSSG) é imediatamente

convertida na forma reduzida como uma oxidação concomitante da NADPH a

NADP+. A diminuição na absorbância a 340nm foi determinada em

espectrofotômetro UV-1650 PC Spectrophotometer UV-Visible; (Shimadzu, Tokio,

Japan). A atividade da enzima é expressa em U/gHb.

40 3.6.4 Determinação da Produção de SRAT em Plasma

A técnica fundamenta-se na determinação colorimétrica do produto de

substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico (TBA) em meio ácido à 95oC.

Uma dessas substâncias é o malonildialdeído (MDA) o qual é produzido durante a

quebra de peróxidos lipídicos (YAGI, 1982). A leitura espectofotométrica foi

realizada a 535 nm (UV-1650 PC Spectrophotometer UV-Visible; Shimadzu, Tokio,

Japan). A concentração foi expressa em µmol/mL.

3.6.5 Determinação do Conteúdo de Glutationa (GSH) em Sangue Total

A glutationa foi determinada em sangue total conforme o descrito por Beutler

et al. (1963). O método baseia-se na reação de redução do 5,5'ditiobis,ácido 2 –

nitrobenzóico (DTNB) com a glutationa (GSH) , gerando o ânion tiolato (TNB) de cor

amarela e estável sob refrigeração. A concentração de glutationa foi expressa em

mmol/L e calculada a partir da absorbância em 412 nm (UV-1650 PC

Spectrophotometer UV-Visible; Shimadzu, Tokio, Japan) utilizando o coeficiente de

extinção de 14,1.

3.7 Análise da Expressão Gênica

3.7.1 Extração e Análise do RNA Total

O RNA total foi obtido a partir de sangue total periférico, colhido com EDTA

utilizando o kit de extração QiAamp RNA Blood Mini® (Qiagen, Alemanha)

imediatamente após a colheita do sangue. Este método utiliza o sistema de colunas

associa as propriedades de ligação seletiva da membrana sílica gel com

propriedades de centrifugação. Esse sistema utiliza tampões concentrados,

permitindo que RNAs maiores que 200 bases se liguem a membrana. Durante o

procedimento de purificação do RNA no sangue, os eritrócitos foram seletivamente

lisados e os leucócitos foram recuperados pela centrifugação. Posteriormente os

leucócitos foram lisados através de condições altamente desnaturantes, que

imediatamente inativam RNases, permitindo o isolamento do RNA intacto. Após a

homogeneização do lisado, através de uma breve centrifugação, adicionou-se etanol

na coluna para ajustar as condições de ligação. Logo após, a amostra foi aplicada

em outra coluna. O RNA ligou-se na membrana sílica durante o passo de

centrifugação. Os contaminantes foram eliminados na lavagem e o RNA total foi

41 eluído em 30µL em água livre de RNases (QIAamp RNA Blood Mini Handbook). O

material obtido foi armazenado no freezer - 80°C até a sua análise.

O RNA total extraído foi quantificado por espectrofotometria através da

absorbância a 260nm e o grau de pureza do RNA foi determinado pela relação

A260nm/A280nm utilizando o espectrofotômetro CIRRUS MB 80 (FEMTO, São

Paulo, Brasil) (SAMBROOK & RUSSEL, 2001).

3.7.2 Analise de Expressão de mRNA pela qT-PCR em Tempo Real

A medida quantitativa da expressão do mRNA em sangue total periférico foi

realizada pela RT-PCR em tempo real utilizando o sistema de amplificação

TaqMan® RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O sinal de

fluorescência emitido pelo fluoróforo da sonda TaqMan® foi detectado em tempo

real no equipamento ABI Prism 7500 FAST (Applied Biosystems, Foster City, CA,

EUA). A análise da expressão gênica foi realizada por método de quantificação

relativa utilizando o gene GAPDH como controle endógeno.

Para a amplificação pela PCR em tempo real foram selecionados iniciadores

e sondas marcadas com fluoróforo para os genes RANK, RANKL, IL-6, TNF-ɑ e

GAPD. A escolha foi possível com o auxílio do programa Primer Express® (Applied

Biosystems, Foster City, CA, EUA) com base nas seqüências gênicas disponíveis no

banco de dados do NIH (www.ncbi.nlm.nih.gov) e estão descritos na Tabela 1.

42 TABELA 1. Iniciadores e sondas marcadas utilizadas nas PCRs em Tempo real

Genes QT-PCR Iniciadores Fragmento

RANK Tempo Real 5’ TTGCCTTGCAGGCTACTTCTC3’ 96 pb

5’TGATGTTCTACTCTCTTTCCAAGGAA3’

5’FAM TTCCTCCACGGACAAATGCAGACCC TAMRA3’

RANKL Tempo Real 5’GCCTTTTGCTCATCTCACTATTAATG3’ 78 pb

5’TGGTACCAAGAGGACAGACTCACTT3’

5’FAM CACCGACATCCCATCTGGTTCCCA TAMRA3’

IL-6 Tempo Real 5’CGGGAACGAAAGAGAAGCTCTA3’ 68 pb

5’GGCGCTTGTGGAGAAGGA3’

5’FAM CGCCTCCAGGAGCCCAGCTATGA TAMRA3’

TNF-ɑ Tempo Real 5’CCTGCCCCAATCCCTTTATT3’ 71 pb

5’CCAATTCTCTTTTTGAGCCAGAA3’

5’FAM CCCCCTCCTTCAGACACCCTCAACC TAMRA3’

GAPDH Tempo Real 5’GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCA3’ 229 pb

5’CTGGAAGATGGTGATGGGATTTC3’

5’VIC TCAGCCTTGAGGGTGC TAMRA3’

Nota: RANK: Receptor Ativador de NFκB; RANKL: Ligante do Receptor Ativador de NFκB; IL-6: Interleucina-6; TNF-ɑ: Fator de Necrose Tumoral – alfa; GAPDH: Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase

A síntese do cDNA a partir do RNA total foi realizada utilizando-se o kit High

Capacity cDNA Reverse Transcription Kit da Applied Biosystems, de acordo com a

metologia descrita pelo fabricante (Foster City, CA, EUA) em termociclador em

termociclador MyCycler (BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA, USA). O cDNA obtido

foi armazenado a –20°C até a realização da PCR em tempo real.

Na etapa seguinte o cDNA foi amplificado pela PCR em tempo real,

utilizando-se iniciadores a 10 µM e sonda de detecção marcadas com FAM a 5 µM

para RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ. Para o GAPDH, utilizou-se a sonda de detecção

marcada com VIC a 5 µM e os iniciadores a 10 µM. Os demais reagentes foram

fornecidos em solução 2x concentrada denominada Master Mix contendo dNTPs

com dUTP, AmpErase® Uracil N-glicosilase (UNG), enzima AmpliTaq Gold® DNA

Polimerase, uma referência passiva e tampão de reação Gold PCR (Applied

Biosystems, Foster City, CA, EUA). Foi utilizado volume final de 10 µL por reação

em duplicata.

43

O programa da PCR em tempo real utilizado foi constituído de: (1) um ciclo

2min a 50ºC, (ativação da UNG); (2) um ciclo de 10min a 95ºC, (inativação da UNG);

(3) 40 ciclos de 15s a 95ºC (desnaturação) e 1min a 60ºC (hibridização e extensão).

Os sinais de fluorescência emitidos pelos fluoróforos das sondas TaqMan® foram

detectados pelo equipamento ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA,

EUA). Os dados foram analisados utilizando-se o programa Sequence Detection

Software v1.2.3 (Applied Biosystems, Foster City, CA EUA) que gera curvas semi-

logarítmicas dos sinais de amplificação.

Esse programa fornece o parâmetro ciclo em que o sinal de fluorescência é

significativo, denominado cycle treshold (Ct) (BUSTIN, 2000; LIVAK &

SCHMITTGEN 2001). Para cada amostra, o Ct de cada gene é registrado e

comparado com o gene GAPDH que é utilizado com controle endógeno.

A quantidade de cDNA utilizada nos ensaios foi otimizada a partir de uma

curva-padrão, realizada com diferentes concentrações de amostra. A curva-padrão

permite avaliar a linearidade da amplificação bem como a eficiência da mesma. Para

essa finalidade foram utilizadas diluições seriadas de cDNA de amostras usadas

somente para a avaliação da PCR em tempo real. Com as diluições de cDNA e os

respectivos valores de Ct construiu-se um gráfico que permitiu verificar a relação

entre essas duas variáveis (Ct x log da diluição de cDNA).

A eficiência da reação foi calculada de acordo com a inclinação da curva

gerada pela seguinte fórmula: E =10-1/á -1 x 100, onde á é a inclinação da curva

(PFAFFL, 2001). Segundo Livak & Schmittgen (2001), para a PCR em tempo real ter

alta eficiência, a inclinação da curva-padrão deve ser próximo de -3,3.

Na Tabela 2, são apresentados os resultados de inclinações (slopes) das

curvas e as respectivas eficiências dos ensaios. Para os genes RANK, RANKL, IL-6,

TNF-ɑ e GAPDH os valores de eficiência mostraram-se adequados.

TABELA 2. Valores de inclinação da curva e eficiência da qT-PCR em tempo real.

Gene Inclinação da curva Eficiência

RANK -3,2 103%

RANKL -3,1 109%

IL-6 -2,79 128%

TNF-ɑ -2,83 125%

GAPDH -3,2 103%

44

Os valores de Ct obtidos nesses ensaios foram utilizados para o cálculo da

expressão relativa de mRNA de cada gene alvo em relação à do GAPDH (controle

endógeno). Essa relação é denominada Delta Ct (DCt) e é calculada pela fórmula:

∆Ct = (Ct gene alvo – Ct controle endógeno)

Com objetivo de avaliar a variação de expressão após o tratamento com

Ácido Lipoico ou com o Placebo, foi utilizado o parâmetro Delta Delta Ct (DDCt) que

é calculado pela fórmula:

∆∆Ct = (∆Ct amostra – ∆Ct calibrador)

Foi considerado como calibrador a média dos ∆Ct’s basais. Os dados de

∆∆Ct foram transformados em escala logarítmica (2-∆∆Ct) para comparar dados de

expressão entre as fases de tratamento farmacológico. A expressão é interpretada

pelo seu aumento ou diminuição após o tratamento.

3.8 Avaliação Estatística

Para o tratamento dos dados foi elaborado um banco de dados para devidas

analise e tabulação das variáveis, utilizando o programa Microsoft Excel for Windows

versão Vista e para a analise estatística, o programa GraphPaf Prism 5.

Primeiramente foi realizado o teste de Kolmogorov-Smirnov, afim de avaliar a

distribuição dos dados. Para as comparações de variáveis quantitativas, foram

utilizados os testes paramétricos teste-t pareado, para amostras paramétricas, e o

teste de Mann-Withney para amostras não paramétricas. Foi realizado também o

teste de correlação bivariada de Pearson ou de Sperman, entre algumas variáveis,

com uma regressão linear simples. Para estas analises foi estabelecido o nível de

significância de p<0,05.

45 4 RESULTADOS

O estudo foi constituído por uma amostra de 39 pacientes (um total de 50

previstos), as quais foram selecionadas a partir de entrevista estruturada e realizada

pela médica ginecologista do projeto, de acordo com a ficha clínica ginecológica

(Apêndice C). Essas pacientes foram selecionadas a partir de mulheres que

procuraram as Unidades Básicas de Saúde (UBS) do município de Parnamirim/RN.

As principais características dessas mulheres são mostradas na Tabela 3.

Os dados foram coletados do período de outubro de 2008 a maio de 2009 e

refletem o estado inicial das mulheres estudadas. É importante essa caracterização,

uma vez que fazia parte dos critérios de inclusão: a idade entre 40-60 anos, histórico

de irregularidades menstruais, glicemia menor do que 100mg/dL e concentração de

FSH acima 25mUI/mL. Esse histórico de irregularidades menstruais associada às

altas concentrações de FSH, o que caracteriza o estado de perimenopausa das

mulheres do nosso estudo. Como pode ser observado não houve diferenças

significativas entre os grupos estudados.

TABELA 3 – Características das mulheres na perimenopausa Variáveis Placebo (17) Ácido Lipoico (22) p valor

Idade (anos) 48,7 ± 3,4 47,5 ± 4,2 0,3437c

Menarca (anos) 13,5 ± 1,4 13 ± 1,3 0,2567c

Irregularidade Menstrual (meses) 15,3 ± 9,3 17,5 ± 17,6 0,6435c

Pressão Sistólica (mmHg) 128 ± 15 125 ± 11 0,4754c

Pressão Diastólica (mmHg) 78 ± 7 76 ± 11 0,5176c

Glicose (mg/dL) 88 ± 8 86,6 ± 5,7 0,527 c

FSH (mUI/mL) 61 ± 24,7 78,8 ± 29,5 0,0526c

Nota: Número de indivíduos em parênteses. FSH: hormônio folículos estimulante. Valores mostrados em média ± desvio padrão e comparados por Teste-tc. A Tabela 4 mostra os resultados referentes à avaliação antropométrica realizadas

nas pacientes participantes do estudo.

46 TABELA 4 – Distribuição das características Antropométricas das mulheres na

perimenopausa

Variáveis Placebo (17) Ácido Lipoico (22)

Antes Depois p Valor Antes Depois p valor

Altura (cm) 1,53 ± 0,08 1,54 ± 0,06

Peso (kg) 61 ± 10 61 ± 9 0,6976ª 64 ± 9 64 ± 9 0,5682ª

CC (cm) 80 ± 8 79 ± 9 0,2234ª 83 ± 8 83 ± 8 0,6567ª

≥ 80 cm 35% 30% 0,7851c

45% 13% 0,0658c

≥ 88 cm 23% 18% 22% 41%

RCQ 0,81 ± 0,04 0,80 ± 0,06 0,3263ª 0,81 ± 0,04 0,81 ± 0,04 0,7245ª

≥ 0,85 12% 24% 0,3683c 27% 23% 0,7277c

IMC (kg/m2) 26,0 ± 3,8 25,9 ± 3,5 0,7445ª 26,8 ± 3,3 26,9 ± 3,4 0,5171ª

<25 kg/m2 41% 41%

0,8219c

32% 27%

0,9416c 25,0 – 29,9 kg/m2 47% 53% 50% 54%

≥ 30 kg/m2 12% 6% 18% 19%

Nota: Número de indivíduos em parênteses. CC: circunferência de cintura, CC ≥ 80cm = risco aumentado de complicações metabólicas; CC ≥ 88cm = risco substancialmente aumentado de complicações metabólicas; RCQ: relação cintura quadril, RCQ ≥ 0,85 risco de complicações metabólicas associadas à obesidade; IMC: índice de massa corporal, IMC <25 kg/m2 = eutrófico; IMC 25,0 – 29,9 kg/m2 =pré-obeso; IMC ≥ 30 kg/m2 = obeso. Valores mostrados em média ± desvio padrão ou porcentagem antes e depois tanto para o grupo Placebo quanto para grupo tratado com Ácido Lipoico, e comparados por teste t de studenta e teste qui-quadradoc.

De acordo com os resultados obtidos podemos observar que as pacientes

apresentaram, em média, valores de circunferência de cintura elevados quando

comparados a valores estabelecidos pela OMS (1998) e que não houve alteração ao

longo do período de estudo comparando tanto o grupo placebo, quanto o tratado

com ácido lipoico. Com relação ao IMC foram encontrados resultados que indicaram

que as mulheres na perimenopausa apresentaram resultados que indicam pré-

obesidade. Não houve diferenças significativas após o tratamento com ácido lipoico.

A relação cintura quadril não apresentou valores, em média, alterados em nenhum

dos grupos estudados embora algumas pacientes apresentassem valores de RCQ

elevados.

Para avaliar o perfil lipídico das pacientes em estudo foi determinada a

concentração sérica de colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL e

triglicerídeos. Os resultados obtidos, mostrados na Figura 1, revelam que as

mesmas apresentaram hipercolesterolemia (VR – desejável < 200 mg/dL), com

valores de colesterol LDL aproximando-se do limite superior aceitável (VR – limítrofe

alto 130 – 159 mg/dL), bem como uma concentração aumentada para os

47 triglicerídeos (VR – normal < 150 mg/dL). Com relação ao HDL não foram

encontradas alteração significativas (VR – baixo = 40 mg/dL).

Quando avaliados as pacientes após o tratamento por 3 meses com acido

lipoico, podemos notar que as mesmas não apresentaram alterações significativas

no perfil lipídico.

TABELA 5 – Perfil Lipídico das mulheres na perimenopausa

Placebo (17) Ácido Lipoico (22)

Antes Depois p Valor Antes Depois p Valor

Colesterol Total

(mg/dL)

212,3 ± 44,2 217,8 ± 22,8 0,5328 209,7 ± 45,3 220,5 ± 44,7 0,2309

LDL (mg/dL) 139,7 ± 44,3 147,5 ± 19,24 0,4113 133,0 ± 35,8 141,2 ± 34,1 0,3445

Triglicerídeos

(mg/dL)

137,9 ± 39,8 135,2 ± 32,76 0,7918 170,3 ± 82,9 190,0 ± 111,8 0,5713

HDL (mg/dL) 44,8 ± 10,1 43,7 ± 7,7 0,4989 42,5 ± 8,6 40,8 ± 7,8 0,4270

VLDL (mg/dL) 27,1 ± 7,9 26,5 ± 6,7 0,7538 34,1 ± 16,6 38,0 ± 22,4 0,2483

Nota: Número de indivíduos em parênteses. Lipoproteína de baixa densidade (LDL), Lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL), Lipoproteína de alta densidade (HDL) Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão antes e depois tanto para o grupo Placebo quanto para grupo tratado com Ácido Lipoico, comparados por teste t de student.

Considerando que o presente trabalho faz uso de uma suplementação com

ácido lipoico, a avaliação da função hepática, renal e metabolica foi realizada como

controle metabólico para avaliar a segurança no uso desse suplemento, para assim

verificar a possível presença de efeitos adversos, como por exemplo, eventos

epigástricos. A Tabela 6 mostra os resultados referentes à avaliação da função

hepática e renal, mostrando que as pacientes não apresentavam comprometimento

nesses órgãos durante o período do presente estudo.

48 TABELA 6 – Perfil de segurança quanto ao uso de Ácido Lipoico e Placebo das mulheres estudadas.


Antes Depois P valor Antes Depois p Valor

TGO/AST (U/L) 24 ± 7,6 24 ± 4,8 0,9596 23 ± 5,7 28 ± 9 0,1426

TGP/ALT (U/L) 44 ± 15 44 ± 10 0,9418 44 ± 11 47 ± 13 0,5098

GGT (U/L) 32 ± 14 33 ± 21 0,5365 23 ± 7 25 ± 9 0,5961

Uréia (mg/dL) 24 ± 6 26 ± 4,4 0,3658 24 ± 5,8 27 ± 7,2 0,0551

Creatinina

(mg/dL)

0,7 ± 0,1 0,7 ± 0,15 0,4113 0,7 ± 0,1 0,7 ± 0,1 0,4879

Proteínas Totais (mg/dL)

7,3 ± 0,4 7,1 ± 0,4 0,1514 7,1 ± 0,5 7,2 ± 0,5 0,3270

Albumina

(mg/dL)

3,9 ± 0,2 4,0 ± 0,6 0,2988 3,8 ± 0,3 3,9 ± 0,45 0,2133

Nota: Número de indivíduos em parênteses. TGO/AST: transaminase glutâmica oxalacética/asparto amino transferase; TGP/ALT: transaminase glutâmico pirúvica/alanina amino transferase; GGT: gama glutamil transferase; VR: valores de referência. Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão antes e depois tanto para o grupo Placebo quanto para grupo tratado com Ácido Lipoico, comparados por teste t de student.

Com finalidade de avaliar o metabolismo mineral e ósseo foi medidas as

concentrações séricas de osteocalcina e a atividade de fosfatase alcalina total, como

marcadores de formação óssea e atividade de fosfatase ácida tartarato-resistente

como marcador de reabsorção óssea. Foram ainda determinadas as concentrações

séricas de cálcio total e ionizado, fósforo e magnésio. Esses resultados são

mostrados na Tabela 7.

Como pode ser observado foram encontradas alterações com relação ao

fósforo sérico, que se elevou após os três meses de tratamento, tanto para o grupo

placebo quanto para o grupo suplementado com ácido lipoico. Para os demais

analitos não foram observadas alterações significativas.

49 TABELA 7 - Avaliação do metabolismo mineral e ósseo das pacientes na perimenopausa.



Osteocalcina

(ng/mL)

6,8 ± 6,4 8,6 ± 5,4 0,4138 6,7 ± 3,5 5,0 ± 1,7 0,2684

FAL (U/L) 82 ± 19,5 70 ± 19,7 0,0923 81 ± 22,6 85 ± 21,2 0,3504

TRAP (U/L) 0,25 ± 0,10 0,26 ± 0,09 0,2218 0,31 ± 0,09 0,30 ± 0,22 0,8166

Cálcio (mg/dL) 9,3 ± 0,60 9,1 ± 0,88 0,3144 9,3 ± 0,72 9,2 ± 0,91 0,7214

Cálcio Ionizado

(mmol/dL)

1,13 ± 0,07 1,10 ± 0,08 0,2700 1,09 ± 0,1 1,08 ± 0,08 0,3539

Fósforo (mg/dL) 3,41 ± 0,50 3,70 ± 0,74 0,0213 3,48 ± 0,50 4,01 ± 0,87 0,0152

Magnésio (mg/dL) 2,01 ± 0,31 2,04 ± 0,32 0,8448 1,96 ± 0,27 1,96 ± 0,26 0,9805

Nota: Número de indivíduos em parênteses. FAL: fosfatase alcalina; TRAP: fosfatase ácida tartarato-resistente. Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão antes e depois tanto para o grupo Placebo quanto para grupo tratado com Ácido Lipoico, e comparados por: teste t de student.

A avaliação do estresse oxidativo foi realizada através da avaliação da

atividade enzimática da SOD e da GPx, enzimas antioxidantes, e medidas das

concentrações de GSH, molécula antioxidante, e SRAT, marcador pró-oxidante.

Esses resultados são mostrados na.

Como pode ser observado a SOD mostrou-se elevada após os três meses de

estudo no grupo placebo, elevação essa que não foi demonstrada no grupo que foi

submetido à terapia com ácido lipoico. A enzima GPx mostrou-se diminuída

significativamente após a terapia com ácido lipoico. Para os demais parâmetros não

houve diferenças estatisticamente significativa.

TABELA 8 – Avaliação do Perfil Oxidativo das pacientes na perimenopausa



SOD U/g Hb 2,68 ± 1,17 3,24 ± 1,65 0,0336 3,28 ± 1,34 2,81 ± 1,39 0,1797

GPx U/g Hb 56,8 ± 10,37 50,4 ± 13,41 0,0813 51,3 ± 8,35 43,4 ± 11,87a 0,0041

GSH mmol/L 0,75 ± 0,175 0,76 ± 0,267 0,7754 0,76 ± 0,176 0,79 ± 0,148 0,3908

SRAT µmol/L 3,57 ± 1,16 2,73 ± 1,25 0,3921 3,66 ± 2,22 3,88 ± 1,15 0,9580

NOTA: Número de indivíduos em parênteses. SOD: superóxido dismutase; GPx: glutationa peroxidase; GSH: glutationa reduzida; SRAT: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão antes e depois tanto para o grupo Placebo quanto para grupo tratado com Ácido Lipoico, e comparados por teste t de student.a: p< 0,01 vs ácido lipoico antes.

50

A expressão dos genes RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ em leucócitos totais do

sangue periférico (LTSP) foram analisados em 22 mulheres do grupo que

concluíram o tratamento de 3 meses com ácido lipoico e 17 mulheres que

receberam o placebo.

A Tabela 9 mostra a variação de expressão do mRNA dos genes RANK,

RANKL, IL-6 e TNF-ɑ em LTSP tanto para o grupo placebo bem como para o grupo

tratado com ácido lipoico. Essa avaliação da expressão do mRNA foi realizada tanto

no período basal, quanto após os 3 meses do estudo.

TABELA 9 – Avaliação da expressão de mRNA dos genes RANK, RANKL, IL-6 e TNF-α



RANK 0,97 ± 0,28 1,12 ± 0,43 0,0947 0,82 ± 0,29 1,18 ± 0,25b P<0.0001

RANKL 1,04 ± 0,27 1,29 ± 0,57a 0,0427 0,85 ± 0,10 0,82 ± 0,11a 0,0241

IL-6 1,01 ± 0,29 0,73 ± 0,36a 0,0031 1,16 ± 0,54 1,00 ± 0,27 0,1074

TNF-ɑ 1,17 ± 0,76 0,79 ± 0,37 0,0675 1,01 ± 0,36 1,10 ± 0,27 0,4136

NOTA: Número de indivíduos em parênteses. RANK: Receptor Ativador de NF-κB; RANKL: Ligante do Receptor Ativador de NF-κB; IL-6: Interleucina-6; TNF- ɑ: Fator de Necrose Tumoral-alfa. Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão antes e depois tanto para o grupo Placebo quanto para grupo tratado com Ácido Lipoico, e comparados por: t de student,a e teste Mann-Whitney. .

Ao avaliar a expressão do mRNA do RANK, observou-se um aumento

significativo da expressão após o tratamento com ácido lipoico no período de três

meses, aumento este não observado no grupo placebo. Com relação ao RANKL,

esse mostrou aumento após três meses no grupo placebo, em contra partida o

grupo que recebeu o tratamento com ácido lipoico mostrou diminuição na expressão

deste gene. Com relação à expressão das citocinas IL-6 e TNF-ɑ, houve diminuição

na expressão destas no grupo placebo, entretanto o tratamento com ácido lipoico

não modificou a expressão de mRNA das citocinas estudadas.

Houve correlações positivas na expressão de mRNA entre os genes RANK e

RANKL (rp=0,958; p=0,000), RANKL e IL-6 (rp=0,689; p=0,003), IL-6 e RANK

(rp=0,498; p=0,049), RANK e TNF-ɑ (rp=0,832; p=0,000), TNF-ɑ e RANKL

(rp=0,875; p=0,001), TNF-ɑ e IL-6 (rp=0,653; p=0,006) quando avaliadas as

expressão de mRNA das mulheres que receberam o placebo após o período de três

meses. Quando avaliada a correlação entre a expressão de mRNA nas mulheres em

perimenopausa que foram submetidas ao tratamento com ácido lipoico, encontrou-

51 se uma correlação positiva entre os gene RANK e RANKL (rp=0,851; p=0,000),

RANKL e IL-6 (rp=0,770; p=0,000), IL-6 e RANK (rp=0,874; p=0,000), RANK e TNF-

ɑ (rp=0,653; p=0,0013), TNF-ɑ e RANKL (rp=0,747; p=0,0001), TNF-ɑ e IL-6

(rp=0,702; p=0,0003).

A análise da correlação entre os parâmetros bioquímicos e os valores da

expressão de mRNA basal dos genes RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ no grupo ácido

lipoico estão representados na Tabela 10. Observou-se correlações positivas entre a

expressão gênica basal de RANK e RANKL e a atividade da SOD (rp 0,593; p=0,005

e rp 0,698; p<0,001, respectivamente) e entre a expressão gênica basal do TNF-ɑ e

a atividade da GPx (rp 0,505; p=0,020).

TABELA 10 – Análise da correlação entre expressão de RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ em

LTSP e parâmetros pró e antioxidantes, antes do tratamento com Ácido Lipoico em

mulheres na perimenopausa.

PARÂMETROS RANK (22) RANKL (22) IL6 (22) TNF-ɑ (22) SOD U/g Hb rp 0,593 rp 0,698 rp 0,017 rp 0,123

p 0,005 p 0,000 p 0,941 p 0,596

GSH (mmol/L) rp 0,103 rp 0,332 rp -0,233 rp -0,171 p 0,655 p 0,141 p 0,309 p 0,459

SRAT (µmol/L) rp -0,149 rp -0,371 rp -0,043 rp -0,092 p 0,275 p 0,097 p 0,854 p 0,691

GPx U/g Hb rp 0,312 rp -0,092 rp 0,403 rp 0,505 p 0,169 p 0,691 p 0,070 p 0,020

Nota: Número de indivíduos em parênteses. SOD: superóxido dismutase; GSH: glutationa reduzida; SRAT, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico; GPx: glutationa peroxidase. A significância da correlação foi calculada por coeficiente de correlação de Pearson (rp).

A análise da correlação entre os parâmetros bioquímicos e os valores da

expressão de mRNA dos genes RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ após o tratamento com

ácido lipoico estão representados na Tabela 11. Observou-se uma correlação

positiva entre a expressão gênica de RANK, RANKL e IL-6 e a atividade da SOD (rp

0,694; p=0,000; rp 0,577; p=0,007; rp 0,552; p=0,007, respectivamente) e uma

correlação negativa entre a expressão gênica de RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ e a

atividade da GPx (rp -0,476; p=0,029; rp -0,628; p=0,002; rp -0,513; p=0,002; rp -

0,689; p=0,001, respectivamente).

52 TABELA 11 – Análise da correlação entre expressão de RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ em

LTSP e os parâmetros bioquímicos, após do tratamento com Ácido Lipoico em mulheres na

perimenopausa.

PARÂMETROS RANK (22) RANKL (22) IL6 (22) TNF-ɑ (22) SOD U/g Hb

rp 0,694 rp 0,577 rp 0,552 rp 0,386 p 0,000 p 0,007 p 0,007 p 0,093

GSH (mmol/L) rp 0,093 rp 0,299 rp 0,084 rp 0,133 p 0,687 p 0,187 p 0,187 p 0,565

SRAT (µmol/L) rp 0,017 rp -0,021 rp -0,035 rp 0,009 p 0,945 p 0,934 p 0,934 p 0,970

GPx U/g Hb rp -0,476 rp -0,628 rp -0,513 rp -0,689

p 0,029 p 0,002 p 0,002 p 0,001 Nota: Número de indivíduos em parênteses. FSH: hormônio folículos estimulante; LDL: lipoproteína de baixa densidade; HDL: lipoproteína de alta densidade; VLDL: lipoproteína de muito baixa densidade; IMC: índice de massa corporal; CC: circunferência da cintura; RCQ: relação cintura quadril;TGP/ALT: transaminase glutâmico pirúvica/alanina amino transferase; TGO/AST: trasaminase glutâmico pirúvica/aspartato amino transferase; GGT: gama glutamil transferase; SOD: superóxido dismutase; GSH: glutationa reduzida; SRAT, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico; GPx: glutationa peroxidase. A significância da correlação foi calculada por coeficiente de correlação de Pearson (rp).

53 5 DISCUSSÃO

No presente trabalho, foram avaliados inicialmente os fatores envolvidos no

ganho de peso corporal, considerando que as mulheres estão vulneráveis a um

rápido ganho de peso em todo o período da menopausa. Nossos resultados

indicaram que 60-70% das mulheres apresentaram uma média de circunferência de

cintura acima da meta preconizada pela OMS (1998), CC < 80cm, indicando um

risco aumentado às complicações metabólicas. Alem disso, de 30-40% das

mulheres apresentaram a CC ≥ 88cm, o que indica um risco substancialmente

aumentado às complicações metabólicas. No que consiste a RCQ, em média as

mulheres apresentaram valores adequados aos preconizados pela OMS, (RCQ <

0,85), embora de 20-40% das mulheres estivessem com valores superiores à meta

da OMS. Por outro lado IMC das mulheres estudadas indicou que em media estas

apresentaram sobrepeso, embora cerca de 60% das mulheres apresentaram IMC

eutrófico e cerca de 40% apresentaram valores de IMC que indicavem sobrepeso ou

obesidade. Não foi observada nenhum correlação entre os índices antroométricoas

apresentados e as outras variáveis do estudo. Considerando que as mulheres do

presente estudo revelaram que não realizam atividade física, estas alterações de

peso tornam-se mais preocupantes principalmente para os estágios mais avancados

da menopausa. Esse dados corroboram Donato et al (2006) cujos resultados para

mulheres na perimenopausa indicaram excesso de peso, (IMC = 27,97±5,89), e para

a circunferência de cintura (85,61±12,53 cm) e relação cintura/quadril (0,83±0,07) os

valores foram semelhante aos encontrados em nosso estudo.

No que diz respeito à distribuição de gordura corporal em mulheres, tem sido

relatado que, em particular os estrogênios, parecem promover diminuição no

acúmulo de gordura corporal (glúteo-femoral), enquanto andrógenos têm sido

associados com um máximo de distribuição de gordura corporal. Entretanto na

transição menopausal há uma mudança na relação de andrógenos a estrógenos, a

produção estrogênica ovariana diminui progressivamente enquanto a produção de

andrógenos pelas adrenais continua, o que pode estar relacionado às alterações na

distribuição de gordura que ocorre neste momento. Considerando-se que nos

estágios iniciais de transição menopausal ainda existe produção de estrógeno estes

efeitos ainda são de menor impacto. O mecanismo para este efeito foi proposto por

Rebuffé-Scrive, Eldh e Hafstrom (1986), que mostraram alterações na atividade

lipase lipoprotéica em diferentes depósitos de gordura de mulheres pré-

54 menopausadas quando comparadas com mulheres pós-menopausadas.

Especificamente, após a menopausa, há diminuição na atividade lipase lipoprotéica

nos adipócitos femurais combinada com uma diminuição da responsividade lipolítica

dos adipócitos abdominais e mamários observada em mulheres na pré-menopausa,

ambos predispondo para o acúmulo de gordura corporal central e abdominal

(LOVEJOY, 2003).

Neste sentido, estudos realizados em mulheres menopausadas tem mostrado

que a atividade física está diminuída e que estas têm uma ligeira diminuição da

atividade metabólica de repouso (AMR). Esta diminuição da AMR pode ser devido a

uma diminuição de massa magra e perda do gasto energético durante a fase lútea, o

que contribuiria para um balanço energético positivo e conseqüente ganho de peso

em mulheres menopáusicas (MILEWICZ; JEDRZEJUK, 2007). O comportamento

alimentar desempenha também um importante papel no desenvolvimento da

obesidade na menopausa. Em um estudo longitudinal, realizado com mulheres

desde a pré até a pós-menopausa, mostrou a ingestão alimentar foi aumentada

como resultado da menopausa (POEHLMAN; TOTH; GARDNER, 1995).

Em relação à mulheres na fase da perimenopausa, os resultados presentes já

demonstram um ganho de peso corporal sugerindo que é nessa fase inicial que os

cuidados já devem ser iniciados para que a mulher possa chegar aos estágios de

menopausa e pós-menopausa com uma melhor qualidade de vida e sem as

complicações associadas a deficiência de estrógeno, entre eles o de

desenvolvimento de doenças cardiovasculares.

Em nosso estudo, além das alterações no perfil antropométrico das mulheres

na perimenopausa, foram observadas alterações no que diz respeito ao perfil

lipídico. Observou-se aumentos no colesterol total, LDL-c e triglicerídeos, onde cerca

de 70% das mulheres, independentemente do grupo, apresentaram valores

superiores à 200mg/dL de colesterol total e cerca de 50% das mulheres

apresentaram valores de LDL-c e triglicerídeos superiores à 130mg/dL e 150mg/dL,

respectivamente, não havendo alterações com relação ao tratamento com AL as

quais essas mulheres foram submetidas.

Embora a suplementação com AL não tenha promovido redução no perfil

lipídico no período estudado, é importante considerar que a suplementação com

uma substância antioxidante, como o ácido lipoico, poderia minimizar os efeitos

advindos do aumento da lipoproteína LDL, podendo diminuir a probabilidade da

mesma ser oxidada e por conseguinte promover a formação da placa de ateroma.

55

Em um estudo realizado em animais experimentais submetidos à

hipercolesterolemia, Amom et al. (2008), encontraram diminuição na concentração

de colesterol total e LDL após tratamento com AL, sugerindo que em condições mais

extremas o AL apresenta um efeito protetor.

Recentemente Graff-Iversen, Thelle e Hammar (2008), estudaram mulheres

em transição menopausal e demonstraram aumento concentração de colesterol e

triglicerideos superior a mulheres em pré-menopausa. Fukami et. al. (1995)

mostraram, em um estudo longitudinal com 7 anos de acompanhamento de

mulheres, que as mesmas apresentaram uma mudança na concentração dos lípides

séricos e lipoproteínas em função da menopausa. Os seus resultados indicaram um

aumento na concentração de colesterol total e de colesterol LDL. Segundo Welty

(2001), a menopausa está associada à elevação significativa na concentração do

colesterol, aumentando três vezes o risco cardiovascular na mulher. Neste sentido,

vários autores justificam que a perda da proteção relativa às doenças coronárias nas

mulheres na pós-menopausa ocorre devido às modificações no perfil lipídico,

conseqüência da deficiência estrogênica (STEFÁNSKA, et al. 2005, MATURAMA et

al. 2008).

Portanto o aumento na concentração de colesterol pode estar relacionada

com a diminuição estrogênica e ainda com o aumento na deposição de gordura na

região abdominal. Segundo relatos de Piché (2008) adipócitos do tecido adiposo

visceral são mais sensíveis a atividade lipolítica e mais resistentes a supressão da

lipólise pela insulina do que os adipócitos da região femural/gluteal. Em

contrapartida o tecido adiposo femoral/gluteal tem um baixo turnover de ácidos

graxos. Por esse motivo a região das coxas armazenam mais facilmente ácidos

graxos livres da circulação, protegendo outros órgãos como fígado, tecido

esquelético e pâncreas, do excesso de ácidos graxos livres. Em adição, o tecido

adiposo produz muitos peptídeos como IL-6, TNF-α, ativador do inibidor de

plasminogêneo-I (PAI-I), leptina e adiponectina, que exercem ação sobre o

metabolismo. As diferenças nas regiões de secreção potencialmente desses

peptídeos poderiam explicar os efeitos diretos e opostos desses depósitos de tecido

adiposo sobre o perfil lipídico.

Um fator importante a ser considerado é que o aumento na concentração de

lipídeos circulantes pode contribuir para o desenvolvimento da osteoporose. Nesse

sentido, os lípides oxidados poderiam atuar como inibidores da atividade e

diferenciação dos osteoblastos, além de induzirem a expressão endotelial de fatores

56 quimiotáticos de monócitos e M-CSF, que são potentes indutores da diferenciação

de células da linhagem osteoclástica (TANKÓ et al., 2005). Dessa forma, o aumento

de colesterol e triglicerídeos, também observados em nossos resultados,

representam fatores de risco que poderiam estar associado à perda óssea através

da inibição da formação óssea e da ativação da reabsorção. Vale ressaltar que em

nosso estudo não encontramos correlação entre os lipídeos circulantes com os

marcadores ósseos, provavelmente pelo fato desses últimos não terem apresentado

alteração na sua concentração.

Em nosso estudo foram estudados alguns marcadores do perfil ósseo e

constatou-se que não houve variação nos grupos. O presente estudo é composto de

mulheres entre 40 e 60 anos em fase de perimenopausa, período este onde não

haveria um comprometimento total da função ovariana, e dessa forma não havendo

uma deficiência estrogênica total. Portanto, considerando-se que no estágio de

perimenopausa as mulheres podem apresentar estrógeno circulante, o qual oferece

um efeito protetor quanto à perda de massa óssea, provavelmente este efeito

protetor, mesmo que reduzido, estaria ainda sendo suficiente a ponto de não ser

detectado qualquer nível de perda óssea, e que pudesse ser indicada por

marcadores circulantes.

Estudos tem mostrado que mesmo com elevação do FSH, como apresentado

no nosso estudo, as mulheres em perimenopausa ainda apresentam concentrações

significativas de estradiol (EBERLING et al. 1996; LUKACS et al. 2000). Associado a

isso, o excesso de tecido adiposo pode servir como local de síntese de estradiol.

Dessa forma, o estradiol ainda presente na circulação pode servir como defesa

frente uma diminuição da massa óssea (FINKELSTEIN et al .2008). Além disso,

resultados de densitometria óssea de algumas das participantes do presente estudo

indicaram que as mesmas não apresentavam comprometimento da DMO (resultado

não mostrados). Considerando que os indicadores clínicos do metabolismo ósseo

tambem não estão alterados, é possível sugerir que nesta fase de perimenopausa

as mulheres não apresentam um processo de perda óssea avançado.

No presente trabalho a resposta de redução da atividade da GPx pela

suplementação com AL, bem como de manutenção da atividade da SOD, poderia

ser uma resposta antioxidante direta deste agente considerado potente e

provavelmente suficiente nos estágios iniciais da transição menopausal. Deve ser

lembrado que a atividade da SOD aumentou no grupo placebo.

57

Esta resposta envolveria uma ação antioxidante direta do AL na H2O2 que

uma vez destruída pelo AL não levaria ao aumento da atividade da GPx e da SOD,

que por sua vez tem a função de controlar a atividade osteoclastica. Alem disso,

como no estagio da perimenopausa ainda existe estrógeno circulante e a presença

de H2O2 ainda não é exarcebada, o AL atuaria de forma eficiente. Estudos

relacionados com a expressão de mRNA da GPx e da SOD, bem como dos demais

parâmetros antioxidantes, poderão esclarecer mais a etse respeito.

Resultados de vários estudos utilizando animais revelaram que a

diferenciação e função dos osteoclastos são estimuladas pelas ERO’s,

particularmente o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o anion superóxido (GARRETT et

al 1990; LEAN et al. 2003; LEAN et al. 2005; BAI et al. 2004; MUTHUSAMI et al.

2005). Os osteoclastos expressam NADPAH oxidase e geram uma grande

quantidade e ERO’s durante a reabsorção óssea (STEINBECK et al. 1994).

Muthusami et al. (2005) mostraram que os níveis de peroxidação lipídica e H2O2

estavam aumentados e as enzimas antioxidantes como SOD, GPx e glutationa S-

transferase estavam diminuídas em ratos ooforectomizados quando comparados

com ratos controle e assume que o H2O2 foi essencial na diferenciação

osteoclásticas. Similarmente, Lane et al. (2003) encontraram que a ooforectomia

causa diminuição nos níveis de glutationa e tioredoxin e atividade das enzimas

glutationa e tioredoxin redutase em roedores. Mais ainda, eles mostraram que esses

antioxidantes e suas enzimas regenerativas foi rapidamente normalizado por uma

simples dose de 17-β- estradiol e antioxidantres (NAC e ascorbato) os quais

preveniram a perda óssea pela deficiência estrogênica.

Em outro estudo recente, um grupo mostrou que a expressão de GPx, a

enzima responsável pela maior depleção de H2O2 intracelular, estava aumentada em

osteoclastos quando comparados com macrófagos e novamente a atividade

enzimática foi aumentada pela administração de 17-β-estradiol. A deficiência

estrogênica também tem sido associada com a diminuição das defesas

antioxidantes tióis em células ósseas e induz a expressão de TNF-ɑ, o qual tem um

papel importante na perda óssea (LEAN et al. 2005; JAGGER et al. 2005).

Associada a isso um recente estudo publicado promoveu evidências do papel das

ERO’s na diferenciação osteoclástica através da regulação pelo NF-κB (KIM et al

2006).

Apesar do grande de estudos realizados em animais ou em cultura de células,

estudos in vivo em humanos avaliando o papel do estresse oxidativo ou sistemas

58 antioxidantes na osteoporose são escassos. Melhus et al. (1999) investigaram o

papel das vitaminas antioxidantes no desenvolvimento de fraturas em fumantes.

Eles concluíram que uma diminuição na ingestão de vitaminas E e C aumenta o

risco relativo no desenvolvimento de fraturas em quase 5 vezes depois do ajuste

pela idade, peso e outros fatores de risco osteoporóticos e uma mais adequada

ingestão dessas vitaminas parece ter um efeito protetor efeitos adversos do fumo.

Maggio et al. (2003) investigaram a possível interação entre antioxidantes e DMO

em um grupo de 75 mulheres idosas osteoporóticas e comparando-as com controles

não osteoporóticas. Os autores investigaram níveis plasmáticos de vitaminas C, E e

A ácido úrico e MDA além da atividade eritrocitária e plasmática de SOD e a

plasmática de GPx. O grupo osteoporótico apresentou uma redução significativa nos

níveis das vitaminas, e atividade de SOD e GPx, entretanto não foi encontrada

nenhuma diferença nos níveis de MDA entre o grupo com osteoporose e o controle.

Eles também relataram que as vitaminas A e C e a atividade da GPx estavam

positivamente correlacionados com a DMO femural nas mulheres com osteoporose.

Wolf et al. (2005) mostraram que não houve nenhuma associação entre ingestão ou

concentração sérica antioxidante e a DMO em mulheres participantes de um grande

estudo transversal.

No presente trabalho foram encontradas concentrações de GSH em sangue

total que variaram de 0,75 a 0,79mmol/L, não havendo diferenças entre as mulheres

do grupo placebo e tratadas com AL. Com relação às SRAT’s foram encontrados

valores que variaram de 2,73 a 3,88µmol/L, os quais não apresentaram diferenças

entre os grupos estudados.

A glutationa reduzida tem sido amplamente reconhecida como uma

importante molécula antioxidante intracelular. Lang et al. (2002) observaram que

níveis de GSH em sangue total, estão relacionados com o bem estar físico,

independente da idade, e ainda ele detectou que o bem-estar de mulheres

saudáveis com 60 anos de idade pode ser previsto pela concentração de GSH.

Maggio et. al (2003) encontraram valores de malonildialdeído (MDA)

plasmático muito próximos aos encontrados no nosso estudo, onde em seu estudo

não houve diferença entre pacientes com osteoporose e seus respectivos controles.

Entretanto, os autores observaram uma diminuição das defesas antioxidantes,

através da redução da atividade da GPx e SOD em pacientes osteoporóticos quando

comparados com controles.

59

Resultados controversos têm sido encontrados na literatura, onde

Karolkiewicz et. al. (2008), estudando mulheres pós-menopausadas encontraram

valores de SRAT’s semelhantes aos mostrados no presente estudo. Entretanto

Unfer et. al (2006) encontraram valores superiores aos encontrados em nosso

estudo, estudando mulheres em pré e pós-menopausa, todavia, não existiram

diferenças entre os grupos estudados. Nossos resultados mostram que não houve

alterações no conteúdo de GSH, nas mulheres perimenopausadas quando as

mesmas foram submetidas à suplementação com AL. O fato de não haver essa

alteração pode ser devido ao AL ter sido consumido mantendo o GSH livre na

circulação.

Dessa forma quando analisados os dados de forma conjunta, podemos notar

que a não alteração nas concentrações de SRAT’s e GSH pode ter ocorrido pelo

fato das mulheres na perimenopausa ainda estarem produzindo estrógeno, mesmo

que em pequenas quantidades, e esse estrógeno estaria ainda atuando como

protetor antioxidante. Com relação a GPx e a SOD, marcadores de estresse mais

precoce e mais sensíveis, a manutenção de suas atividades e até mesmo a

diminuição, pelo AL sugere que este antioxidante poderá estar promovendo um

controle de possíveis ERO’s já presentes não sendo necessária a resposta de

aumento na atividade dessas enzimas. Este comportamento sugere que o controle

das ERO’s pelo AL estaria sendo determinante para o controle da diferenciação e

função dos osteoclastos, retardando assim o processo de perda óssea associada à

deficiência inicial de estrógeno (Figura 4). Consequentemente, estes resultados

suportam a ausência de mudança do perfil ósseo e da DMO das mulheres em

perimenopausa suplementadas com AL. Adicionalmente, alguns estudos tem

mostrado que o ácido lipoico, como um antioxidante potente, tem um potencial

terapêutico nas doenças ósseas erosivas (KIM et al. 2006).

60

FIGURA 4 Representação da ação do Ácido Lipoico sobre a produção de ERO’s com possível ação

sobre o metabolismo ósseo.

O aumento anormal na diferenciação osteoclástica é o principal fator

associado na erosão óssea patológica associada com a osteoporose e doença

inflamatória. Baseado em evidências sobre a produção de ERO’s em condições

inflamatórias e associação das ERO’s na osteoporose (MAGGIO et al. 2003; LEAN

et al. 2003), a diferenciação osteoclástica pode requerer a intermediação das ERO’s

e que a reabsorção óssea in vivo poderia ser controlada pelo uso de antioxidantes.

Tem sido relatado que agentes antioxidantes usados na clínica como AL tem um

potencial bloqueio na diferenciação osteoclástica induzida por RANKL (KOH et al.

2005). No nosso estudo encontramos diminuição na expressão de mRNA de RANKL

quando as mulheres foram suplementadas com ácido lipoico, o que mostra que

mesmo no quadro de perimenopausa, onde não se observa um comprometimento

acentuado do tecido ósseo, a suplementação antioxidante promoveu uma defesa

frente a um possível inicio na reabsorção óssea, o qual seria observado apenas em

quadros mais avançados de deficiência estrogênica. A redução da expressão de

RANKL associada à redução da atividade da GPx e manutenção do perfil ósseo,

sugere que o antioxidante AL estaria suportando um controle de possíveis ERO’s

presentes, não desencadeando assim nesta fase de perimenopausa uma ativação

de osteoclastos e o processo de perda óssea. Entretanto, considerando que o AL

revelou uma ação de proteção a perda óssea, a resposta do RANK poderia estar

relacionada não aos osteoclastos e sim as demais células que o expressam como

nas células dendríticas, endoteliais, fibroblastos, linfócitos T e B.

61

No estudo realizado in vitro, Kim et al. (2006) os autores mostraram que

células precursoras osteoclásticas, tratadas com RANKL, apresentaram um aumento

na produção ERO’s de maneira dependente de NADPH oxidase. Similarmente, as

ERO’s mediaram sinais de transdução intracelulares para o RANKL. E ainda eles

mostraram que o AL bloqueou a indução do RANKL pelas ERO’s e atenuaram a

ativação do NF-κB em precursores osteoclásticos. A associação das ERO’s na

sinalização do RANKL também tem sido associada com a ativação de osteoclastos

maduros diferenciados (HA et al. 2004). Isso demonstra que a participação das

ERO’s na ativação do NF-κB descrito para outros tipos celulares e outras condições

de estimulação (DROGE et al. 2002; SCHRECK et al. 1991) também é demonstrada

em células precursoras osteoclásticas em resposta ao estímulo osteoclastogênico.

Resultados anteriores mostraram que a presença NF-κB na diferenciação

osteoclástica (IOTSOVA et al. 1997) suporta a importância do papel das ERO’s na

ativação do NF-κB na osteoclastogênese.

Em outro estudo realizado com cultura de osteoclastos, Mendez-Dávila et al.

(2004), concluíram que o efeito do estrógeno sobre o metabolismo ósseo não seria

por ação sobre a IL-6, uma vez que não foi visto aumento na expressão de mRNA

dessa interleucina quando a cultura foi incubada com estrógeno. Outro estudo

realizado em animais, mostrou que um agonista estrogênico diminuiu a expressão

de mRNA de TNF-α, o que sugere uma ação protetora do estrógeno pelo bloqueio

da ativação do NF-κB (KANG et al. 2005). Um outro achado importante foi no

trabalho de Seck et al. (2002). onde não encontraram diferença na expressão de

mRNA de IL-6 em biopsias ósseas de mulheres em pré e pós-menopausa os

mesmos não encontraram correlação entre a expressão da citocina no tecido ósseo

e sua concentração sérica. O autor sugere que o aumento do receptor solúvel para

IL-6 teria um efeito protetor na menopausa, uma vez que o mesmo iria impedir que a

citocina se ligasse ao seu receptor no tecido ósseo.

Novamente, o fato das mulheres do nosso estudo estarem no período de

perimenopausa, fase essa que ainda se tem uma produção de estrógeno poderia

estar relacionado a ausência de alterações. Entretanto a redução na expressão de

mRNA de RANKL, principal fator desencadeador da diferenciação e ativação

osteoclásticas, torna-se representativa em um estagio menopausal considerado

inicial e de poucas alterações frente a reduções ainda menores de estrógeno.

Demonstra ainda que para estágios mais avançados da menopausa, cuja deficiência

de estrógeno já encontra-se instalada, o AL poderá ter efeito benéficos e

62 importantes para o combate a presença de ERO’s e consequentemente ao processo

de osteoporose. Entretanto, é importante ressaltar que a suplementação seja

realizada em estágios que antecedam os estágios iniciais da transição menopausal.

Em conclusão, as alterações significativas encontradas para o perfil lipídico e

antropométrico de mulheres na perimenopausa, parecem já ser um reflexo das

alterações hormonais iniciais neste estagio, sendo portanto as primeiras a serem

notadas. Entretanto, como discutido anteriormente, tanto as alterações no perfil

lipídico quanto na composição corporal podem refletir no metabolismo ósseo e no

perfil oxidativo, levando progressivamente a complicações precoces como

cardiovascular e óssea. Um outro ponto muito importante mostrado no presente

trabalho é o fato de que a suplementação com ácido lipoico revelou minimizar as

possíveis alterações nas mulheres em perimenopausa, uma vez que marcadores

precoces como a atividade da SOD não mostrou-se elevada como observado para

as mulheres que receberam placebo, e mesmo a atividade da GPx e da expressão

do mRNA do RANKL foram reduzidas (Figura 5).

FIGURA 5 – Esquema mostrando alterações provocadas pela perimenopausa associada à possível ação do ácido lipoico sobre a produção de ERO’s.

Finalmente, o tratamento com ácido lipoico, como terapia auxiliar, se mostra

como uma importante alternativa para mulheres que estão em transição

menopausal, e mesmo ainda em estágio de pós-menopausa, podendo representar

uma importante ferramenta em função do seu efeito protetor contra as doenças

associadas à deficiência de estrógeno.

63

6 CONCLUSÕES

- A elevação da concentração de FSH das pacientes, associada as irregularidades

menstruais, indica um início de falência ovariana, característico de um período de

transição menopausal;

- A associação dos parâmetros antropométricos com o perfil lipídico alterado indica

que alterações no metabolismo dos lipídeos já tem inicio na fase de perimenopausa,

se mostrando como a primeira alteração detectada;

- A redução na atividade enzimantica da GPx e da expressão gênica do RANKL

após o tratamento com ácido lipoico, sugere que este antioxidante apresentou um

efeito de controle sobre a presenca de EROs, e conseqüente efeito protetor sobre a

reabsorção óssea na fase de perimenopausa;

- O tratamento com ácido lipoico indicou que este antioxidante pode ser uma

alternativa auxiliar e benéfica para mulheres na perimenopausa, abrindo ainda

perspectivas para o tratamento em fases mais avançadas de deficiência estrogênica

como na pós-menopausa.

64 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALLEVA, R.; NASOLE, E.; DI DONATO, F.; BORGHI, B.; NEUZIL, J.;

TOMASETTI, M. α-Lipoic acid supplementation inhibits oxidative damage,

accelerating chronic wound healing in patients undergoing hyperbaric oxygen

therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. v. 333,

p. 404-410, 2005.

ALMEIDA, A. B. Reavaliando o climatério: enfoque atual e multidisciplinar. São

Paulo: Atheneu, 2004.

ALMEIDA, M.; Martin-Millan M, Plotkin LI, Stewart SA, Roberson PK, Kousteni

S, O'Brien CA, Bellido T, Parfitt AM, Weinstein RS, Jilka RL, Manolagas SC.

Skeletal involution by age-associated oxidative stress and its acceleration by

loss of sex steroids. Journal of Biological Chemistry. v. 282, p. 27285–27297,

2007.

ALTINDAG, O.; EREL, O.; SORAN, N.; CELIK, H. SELEK, S. Total

oxidative/anti-oxidative status and relation to bone mineral density in

osteoporosis. Rheumatology International. v. 28, p. 317-321, 2008.

ANDERSON, D.M.; MARASKOVSKY, E.; BILLINGSLEY, W.L,; DOUGALL,

W.C.; TOMETSKO, M.E.; ROUX, E. R.; TEEPE, M.C.; DUBOSE, R.F.;

COSMAN, D. GALIBERT, L. A homologue of the TNF receptor and its ligand

enhance T-cell growth and dendritic-cell function. Nature. v. 390, p. 175–179,

1997.

ARAI, M.; SHIBATA, Y.; PUGDEE, K.; ABIKO, Y.; OGATA, Y. Effects of

reactive oxygen species (ROS) on antioxidant system and osteoblastic

differentiation in MC3T3-E1 cells. IUBMB Life. v. 59, p. 27–33, 2007.

BAI, X.; LU, D.; BAI, J.; ZHENG, H.; KE, Z.; LI, X.; LUO, S. Oxidative stress

inhibits osteoblastic differentiation of bone cells by ERK and NF-κB.

Biochemical and Biophysical Research Communications. v. 314, p. 197-

207, 2004.

65

BAKSU, A.; AYAS, B.; CITAK, B.; KALAN, A.; BAKSU, B.; GOKER, N., Efficacy

of tibolone and transdermal estrogen therapy on phychological symptoms in

women following surgical menopause, International Journal of Gynecology

and Obstetrics. v. 91, p. 58-62, 2005.

BASHIR, A.; MAK, Y.T.; SANKARALINGAM, S.; CHEUNG, J.; McGOWAN, N.

W. A.; GRIGORIADIS, A. E.; FOGELMAN, I.; HAMPSON, G. Changes in

RANKL/OPG/RANK gene expression in peripheral mononuclear cells following

treatment with estrogen or raloxifene. Steroids. v. 70, p. 847-855, 2005.

BASTOS, C. A.; OPPERMANNA, K.; FUCHS, S. C.; DONATO, G. B.;

SPRITZER, P. M. Determinants of ovarian volume in pre-, menopausal

transition, and post-menopausal women: A population-based study. Maturitas.

v. 53, p. 405-412, 2006.

BASU, S.; MICHAELSSON, K.; OLOFSSON, H.; JOHANSSON, S.; MELHUS,

H. Association between oxidative stress and bone mineral density. Biochemical

and Biophysical Research Communications. v. 288, p. 275–279, 2001.

BAX, B. E.; ALAM, A. S. T. M.; BANERJI, B.; et al. Stimulation of osteoclastic

bone resorption by hydrogen peroxide (H2O2). Biochemical and Biophysical

Research Communications. v. 183, p. 1153–1158, 1992.

BEDNAREK-TUPIKOWASKA, G.; TUPIKOWSKI K.; BIDZINKA B.; et. al. Serum

lipid peroxides and total antioxidant status in postmenopausal women on

hormone replacement therapy. Gynecol Endocrinol. v. 19, p. 57-63, 2004.

BEUTLER, E.; DURON, O.; KELLY, B. M. Improved method for the

determination of blood glutathione. The Journal of Laboratory and Clinical

Medicine. v. 61, p. 882-890, 1963.

BIEWENGA, G. P.; HAENEN, G. R.; BAST, A. The pharmacology of the

antioxidant lipoic acid, General Pharmacolog. v. 29 p. 315–331, 1997.

66

BILSKA, A.; WłODEK, L. Lipoic acid – the drug of the future. Pharmacological

Reports, v. 57, p. 570-577, 2005.

BLAIR, J. M.; ZHENG, Y.; DUNSTAN, C. R. Rank ligand. The International

Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 39, p. 1077–1081, 2007.

BLAKE, J. Menopause: evidence-based practice. Best Practice & Research

Clinical Obstetrics and Gynaecology, v. 20, n. 6, p. 799-839, 2006.

BLÜMEL, J.E.; CHEDRAUI, P.; CALLE, A.; BOCANERA, R.; DEPIANO, E.;

CASAS, P.F.; GONZALEZ, C.; MARTINO, M.; ROYER, M.; ZUÑIGA, C.;

DULON, A.; ESPINOZA, M.T.; FUTCHNER, C.; MOSTAJO, D.; SOTO, E.;

MARCO, A.A.; ARAVENA, H.; BUSQUETS, M.; CAMPODONICO, I.;

GERMAIN, A.; ALBA, A.; BARON, G.; GOMEZ, G.; MONTERROSA, A.;

ONATRA, W.; BROUTIN, G.; MANZANO, B.; GABRIELA, A.; HIDALGO, L.;

LEON, P.; ORBEA, M.; SANCHEZ, H.; VALLEJO, S.; VALLECILLO, G.;

BUENO, J.A.H.; MOTTA, E.; ANDRADE, R.; TSEROTAS, K.; GONZALEZ,

C.M.; BENITEZ, Z.; CALLE, E.; DANCKERS, L.; CASTILLO, A.D.; IZAGUIRRE,

H.; OJEDA, E.; ROJAS, J.; BENCOSME, A.; LIMA, S. Age at menopause in

Latin America. Menopause: The Journal of The North American Menopause

Society, v. 13, p. 706-712, 2006.

BORCEA, V.; NOUROOZ-ZADEH, J.; WOLFF, S. P.; KLEVESATH, M.;

HOFMANN, M.; URICH, U.; WAHL, P.; ZIEGLER, R.; TRITSCHLER, H.;

HALLIWELL, B.; NAWROTH, P. P. α-lipoic acid decreases oxidative stress even

in diabetic patients with poor glycemic control and albuminuria. Free Radical

Biology & Medicine, v. 22, p. 1495-1500, 1999.

BOYCE, B. F.; XING, L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and

remodeling, Archives of Biochesmistry and Biophysics, v. 437, p. 139-146,

2008.

BRICKLEY, M.; RACHEL, I. Background to Bone Biology and Mineral

67 Metabolism. In: BRICKLEY, M.; RACHEL, I. The Bioarchaeology of Metabolic

Bone Disease. First edition. San Diego: Academic Press. p. 21-40, 2008.

BUCAY N.; SAROSI, I.; DUNSTAN, C.R.; MORONY, S.; TARPLEY, J.;

CAPPARELLI, C.; SCULLY, S.; TAN, H.L.; XU, W.; LACEY, D.L.; BOYLE, W.J.;

SIMONET, W.S. Osteoprotegerin-deficient mice develop early onset

osteoporosis and arterial calcification. Genes & Development. v. 12, p. 1260-

1268, 1998.

BURTIS, C. A.; ASHWOOD, E. R.; BRUNS, D. E. Tiets Fundamentos de

Química Clínica. 6. ed. [S.I.]: Elsevier, p. 992, 2008.

CHEN, J.R.; SHANKAR, K.; NAGARAJAN, S.; BADGER T. M.; RONIS, M. J. J.

Protective effects of estradiol on ethanol-induced bone loss involve inhibition of

reactive oxygen species generation in osteoblasts and downstream activation of

the extracellular signal-regulated kinase/signal transducer and activator of

transcription 3/receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand signalling

cascade. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. v.324,

p. 50–59, 2008.

CREMER, D.R.; RABELER, R.; ROBERTS, A.; LYNCH, B. Safety evaluation of

α-lipoic acid (ALA). Regulatory Toxicology and Pharmacology, v. 46 p. 29-

41, 2006.

DATTA, H. K.; MANNING, P.; RATHOD, H.; MCNEIL, C. Effect of calcitonin,

elevated calcium and extracellular matrices on superoxide anion production by

rat osteoclasts. Experimental Physiology. v. 80, p. 713–719, 1995.

DATTA, H. K.; RATHOD, H.; MANNING, P.; TURNBULL, Y.; MCNEIL, C. J.

Parathyroid hormone induces superoxide anion burst in the osteoclast: evidence

for the direct instantaneous activation of the osteoclast by the hormone. Journal

of Endocrinology. v. 149, p. 269–75, 1996.

DEROO, B. J.; KORACH, S. K. Estrogen receptor and human disease. The

68 Journal of Clincal Investigation. v. 116, n. 3, 2006.

DONATO, G. B.; FUCHS, S.C.; OPPERMANN, K.; BASTOS, C.; SPRITZER, P.

M. Association between menopause status and central adiposity measured at

different cutoffs of waist circumference and waist-to-hip ratio. Menopause: The

Journal of The North American Menopause Society. v. 13, n. 2, p. 280-285,

2006.

DROGE, W. Free radicals in the physiological control of cell function.

Physiological Reviews. v. 82, p. 47–95; 2002.

FERNANDES, C. E.; PINTO NETO, A. M.; PEREIRA FILHO, A. S.;

URBANETZ, A. A.; ZAITZ, C.; PARDINI, D.; BARACAT, E. C.; PIMENTEL, F. H.

B.; LOPES, G. P.; PINHO NETO, J. S. L.; RENO JÚNIOR, J.; FERREIRA, J. A.

S.; MACHADO, L. V.; GEBRIM, L. H.; GIRÃO, M. J. B. C.; MANCINI, M. C.; SÁ,

M. F. S.; OSÓRIO-WENDER, M. C.; MELO, N. R.; GIAVINA-VIANCHI, P.;

MARINHO, R. M.; BOSSEMEYER, R. P.; FERRIANI, R. A.; SZEJNFELD, V. L.,

Consenso Brasileiro Multidisciplinar de Assistência à Saúde da Mulher

Climatérica. SOBRAC. Editora Segmento. p. 219-270, 2003.

FINKELSTEIN, J. S.; BROCKWELL, S. E.; MEHTA, V.; GREENDALE, G. A.;

SOWERS, M. R.; ETTINGER, B.; LO, J. C.; JOHNSTON, J. M.; CAULEY, J. A.;

MICHELLE E. DANIELSON, M. E.; ROBERT M. NEER, R. M. Bone Mineral

Density Changes during the Menopause Transition in a Multiethnic Cohort of

Women. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. v. 93, p. 861-868,

2008.

FOUQUE-AUBERT, A.; CHAPURLAT, R. Influence of RANKL inhibition on

immune system in the treatment of bone diseases, Joint Bone Spine in press,

2007.

FUCHS O. Effects of intracellular chelatable iron and oxidative stress on

transcription of classical cellular glutathione peroxidase in murine

erythroleucemia cells. Neoplasma. v. 44, p. 184–191, 1997.

69 GAMBACCIANI, M.; SPINETTI, A.; TAPONECO, F. et al. Bone loss n

perimenopausal women: a longitudinal study. Maturitas. v. 18, p. 191–7, 1994.

GARCIA-SEGURA, L. M.; AZCOITIA, I.; DONCARLOS, L. L. Neuroprotection

by estradiol. Progress in Neurobiology, v. 63 p. 29-60, 2001.

FUKAMI, K.; KOIKE, K.; HIROTA, K.; YOSHIKAWA, H.; MIYAKE, A.

Perimenopausal changes in serum lipids and lipoproteins: a 7-year longitudinal

study. Maturitas. v. 22, n. 3, p. 193-197, 1995.

GARRETT, I. R., BOYCE, B. F., OREFFO, R. O., BONEWALD, L., POSER, J.,

AND MUNDY, G. R. Oxygen-derived free radicals stimulate osteoclastic bone

resorption in rodent bone in vitro and in vivo. The Journal of Clinical

Investigation. v. 85, p. 632–639, 1990.

GIESE, R. W. Measurement of endogenous estrogens: analytical challenges

and recent advances, Journal of Chromatography. v. 1000, p. 401–412, 2003.

GONZALEZ-PEREZ, O.; GONZALEZ-CASTANEDA, R. E. Therapeutic

perspectives on the combination of ɑ-lipoic acid and vitamin E. Nutrition

Research. v. 26 p. 1– 5, 2006.

GRAFF-IVERSEN, S.; THELLE, D. S.; HAMMAR, K. Serum lipids, blood

pressure and body weight around the age of the menopause. European

Journal of Cardiovascular Prevention and Rehabilitation. v. 15, p. 83-88,

2008.

GRASSI , F. , TELL , G. , ROBBIE-RYAN , M. , GAO , Y. , TERAUCHI , M. ,

YANG , X. , ROMANELLO , M. , JONES , D. P. , WEITZMANN , M. N. ,

PACIFICI , R. Oxidative stress causes bone loss in estrogen-deficient mice

through enhanced bone marrow dendritic cell activation . Proceedings of the

National Academy of Sciences. v. 104, p. 15087–15092, 2007.

GRIMAUD, E.; SOUBIGOU, L.; SEVERINE, C.; COIPEAU, P.; MOREAU, A.;

70 PASSUTI, N.; GOUIN, F.; REDINI, F.; HEYMANN, D. Receptor activator of

nuclear factor kB ligand RANKL/OPG ratio is increased in severe osteolysis.

American Journal of Patology. v. 163, p. 2021-2030, 2003.

HA, H.; KWAK, H. B.; LEE, S. W.; JIN, H. M.; KIM, H. M.; KIM, H. H.; LEE, Z. H.

Reactive oxygen species mediate RANK signaling in osteoclasts. Experimental

Cell Research. v. 301, p. 119-127, 2004.

HALE, G. E.; BURGER, H. G. Hormonal changes and biomarkers in late

reproductive age, menopausal transition and menopause, Best Practice &

Research Clinical Obstetrics and Gynaecology.

doi:10.1016/j.bpobgyn.2008.10.001(2008).

HARAMAKI, N.; HAN, D.; HANDELMAN, G. J.; TRITSCHLER, H. J.; PACKER,

L. Cytosolic and mitochondrial systems for NADH- and NADHdependent

reduction of alpha-lipoic acid. Free Radical Biology & Medicine. v. 22, p. 535-

542, 1997.

HERMANN, R.; NIEBCH, G.; BORBE, H. O.; FIEGER, B. H.; RUUS, P.;

NOWAK, H.; RIETHMULLER, W. H.; PEUKERT, M.; BLUME, H.

Enantioselective pharmacokinetics and bioavailability of different racemic ɑ-

lipoic acid formulations in healthy volunteers. European Journal of

Pharmaceutical Sciences. v. 4, p. 167-174, 1996.

HO, S. C.; CHAN, S. G.; YIP, Y. B.; CHAN, C. S. Y.; WOO, J. L. F.; SHAM, A.

Change in bone mineral density and its determinants in pre- and

perimenopausal Chinese women: the Hong Kong perimenopausal women

osteoporosis study. Osteoporosis International. v. 19, p. 1785-1796, 2008.

IMAI, Y.; KONDOH, S.; KOUZMENKO, A.; KATO, S. Regulation of bone

metabolism by nuclear receptors. Molecular and Cellular Endocrinology. v.

310, p. 3-10, 2009.

IMAMOV, O.; SHIM, G.; WARNER, M.; GUSTAFSSON, J.; Estrogen Receptor

beta in Health and Disease. Biology of reproduction. v. 73, p. 866–871, 2005.

71

IOTSOVA, V.; CAAMANO, J.; LOY, J.; YANG, Y.; LEWIN, A.; BRAVO, R.

Osteopetrosis in mice lacking NF-kappaB1 and NF-kappaB2. Nature Medicine.

v. 3, p. 1285–1289, 1997.

JAGGER, C. J.; LEAN, J. M.; DAVIES, J. T.; CHAMBERS, T. J. Tumor necrosis

factormediates osteopenia caused by depletion of antioxidants. Endocrinology.

v. 146, p. 113–118, 2005.

JI, L. L. Exercise, oxidative stress, and antioxidants. The American Journal of

Sports Medicine. v. 24, p. 20-24, 2006.

KANG, J. S.; YOON, Y. D.; HAN, M. H.; HAN, S.; LEE, K.; KANG, M. R.;

MOON, E.; JEON, Y. J. PARK, S.; KIM, H. M. Estrogen receptor-independent

inhibition of tumor necrosis factor-a gene expression by phytoestrogen equol is

mediated by blocking nuclear factor-kB activation in mouse macrophages,

Biochemical Pharmacology. v. 71, p. 136-143, 2005.

KAROLKIEWICZ, J.; MICHALAK, E.; POSPIESZNA, B.; DESKUR-

SMIELECKA, E.; NOWAK, A.; PILACZYNSKA-SZCZESNIAK, L. Response of

oxidative stress markers and antioxidant parameters to an 8-week aerobic

physical activity program in healthy, postmenopausal women, 2008.

KEANEY, J.F; SHWAERY, G. T.; XU, A. 17 b-Estradiol preserves endothelial

vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in

hypercholesterolemic swine. Circulation. v. 89, p. 2251-2259, 2004.

KEARNS, A.E.; KHOSLA, S.; KOSTENUIK, P.J. Receptor Activator of Nuclear

Factor B Ligand and Osteoprotegerin Regulation of Bone Remodeling in Health

and Disease. Endocrine Reviews. v. 29, n. 2, p.155-192, 2008.

KIM, H. J.; CHANG, E.; KIM, H.; LEE, S. B.; KIM, H.; KIM, G. S. KIM, H.

Antioxidant α-lipoic acid inhibits osteoclast differentiation by reducing nuclear

factor-κB DNA binding and prevents in vivo bone resorption induced by receptor

72 activator of nuclear factor-κB ligand and tumor necrosis factor-α. Free Radical

Biology & Medicine. v. 40 p. 1483-1493, 2006.

KIM, M. S.; PARK, J. Y.; NAMKOONG, C.; JANG, P. G.; RYU, J.W.; SONG, H.

S.;M YUN, J. Y.; NAMGOONG, I. S.; HA, J.; PARK, I. S.; LEE, I. K.; VIOLLET,

B.; YOUN, J. H.; LEE, H. K.; LEE, K. U. Anti-obesity effects of alpha-lipoic acid

mediated by suppression of hypothalamic AMP-activated protein kinase. Nature

Medicine. v. 10, p. 727-733, 2004.

KOH, J. M.; LEE, Y. S.; BYUN, C. H.; CHANG, E. J.; KIM, H.; KIM, Y. H.; KIM,

H. H.; KIM, G. S. Alpha-lipoic acid suppresses osteoclastogenesis despite

increasing the receptor activator of nuclear factor kappaB ligand/

osteoprotegerin ratio in human bone marrow stromal cells. Journal of

Endocrinology. v. 185, p. 401–413; 2005.

KOK, H. S.; VAN ASSELT, K. M.; PEETERS, P. H. M.; VAN DER SCHOUW, Y.

T.; GROBBEE, D. E.;PEARSON, P. L.; WIJMENGA, C. Age at natural

menopause is not linked with the follicle-stimulating hormone receptor region: a

sib-pair study. Fertility and Sterility. v. 81, p 661-616, 2004.

KONRAD, T.; VICINI, P.; KUSTERER, K.; HOFLICH, A.; ASSADKHANI, A.;

BOHLES, H. J.; SEWELL, A.; TRITSCHLER, H. J.; COBELLI, C.; USADEL, K.

H. Alpha-Lipoic acid treatment decreases serum lactate and pyruvate

concentrations and improves glucose effectiveness in lean and obese patients

with type 2 diabetes. Diabetes Care. v. 22, p. 280-287, 1999.

KONTOGIANNI, M. D.; PANAGIOTAKOS, D. B.; SKOPOULI, F. N. Does body

mass index reflect adequately the body fat content in perimenopausal women.

Maturitas. v. 51 p. 307-313, 2005.

KORUCUOGLU, U.; CIFTCI, B.; GÜLBAHAR, Ö.; BIRI, A.; NAS, T.;

GÜRSOY, R.; ARICIOGLU, A. Assessment of protein oxidation in women

using raloxifene. Molecular and Cellular Biochemistry. v. 290, p. 97–101,

2006.

73

KRIS-ETHERTON, P. M.; LICHTENSTEIN, A. H.; HOWARD, B. V.;

STEINBERG, D.; WITZTUM, J. L. Antioxidant Vitamin Supplements and

Cardiovascular Disease. Circulation. v. 110, p. 637-641, 2004.

KUPPERMAN, H. S.; WETCHLER, B.B.; BLATT, M.H.G. Contemporary therapy

of the menopausal syndrome. The Journal Of the American Medical

Association. v. 171, p. 1627-1637, 1959.

LACEY DL, TIMMS E, TAN HL, KELLEY MJ, DUNSTAN CR, BURGESS T, et

al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation

and activation. Cell. v. 93, p. 165–76, 1998.

LANG, C. A.; MILLS, B. J.; LANG, H. L.; LIU, M. C.; USUI, W. M.; RICHE JR.,

J.; MASTROPAOLO, W.; MURRELL, S. A. High blood glutathione levels

accompany excellent physical and mental health in women ages 60–103 years.

Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 140, p. 413–417, 2002.

LEAN, J. M.; DAVIES, J. T.; FULLER, K.; JAGGER, C. J.; KIRSTEIN, B.;

PARTINGTON, G. A.; URRY, Z. L.; CHAMBERS, T. J. A crucial role for thiol

antioxidants in estrogen-deficiency bone loss. The Journal of Clinical

Investigation. v. 112, p. 915-923; 2003.

LEAN, J. M.; JAGGER, C. J.; KIRSTEIN, B.; FULLER, K.; CHAMBERS, T. J.

Hydrogen Peroxide Is Essential for Estrogen-Deficiency Bone Loss and

Osteoclast Formation. Endocrinology. v. 146, n. 2, p. 728-735, 2006.

LEE, E. Y.; LEE, C. K.; LEE, K. U.; PARK, J. Y.; CHO, K. J.; CHO, Y.S.; LEE,

H.R.; MOON, S.H.; MOON, H.B.; YOO, B. Alpha-lipoic acid suppresses the

development of collagen-induced arthritis and protects against bone destruction

in mice, Rheumatology International. v. 27 p. 225–233, 2007.

LEE, N.K. Choi, Y.G.; Baik, J.Y.; Han, S.Y.; Jeong, D.; Bae, Y.S.; Kim, N.; Lee,

S.Y. A crucial role for reactive oxygen species in RANKL-induced osteoclast

74 differentiation. Blood. v. 106, p. 852–859, 2005.

LI, Z.; KONG, K.; QI, W. Osteoclast and its roles in calcium metabolism and

bone

development and remodeling. Biochemical and Biophysical Research

Communications. v. 343, p. 345–350, 2006.

LINARES, G.R.; XING, W.; GOVONI, K.; CHEN, S.; MOHAN, S. Glutaredoxin 5

regulates osteoblast apoptosis by protecting against oxidative stress. Bone. v.

44, p. 795–804, 2009.

LIU, A.L. ZHANG, Z.; ZHU, B.; LIAO, Z.; LIU, Z. Metallothionein protects bone

marrow stromal cells against hydrogen peroxide-induced inhibition of

osteoblastic differentiation. Cell Biology International. v. 28, p. 905–911, 2004.

LIVAK, K.J.; SCHMITTGEN, T.D. Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-Ct Method. Methods. v. 25, p.

402-408, 2001.

LORENZI, D. R. S.; BARACAT, E. C.; SACILOTO, B.; PADILHA JÚNIOR, I.

Fatores associados à qualidade de vida após menopausa. Revista da

Associação Médica Brasileira. v. 52, n. 5, p. 312-317, 2006.

LORENZI, D. R. S.; DANELON, C.; SACILOTO, B.; PADILHA JÚNIOR, I.

Fatores indicadores da sintomatologia climatérica. Revista Brasileira de

Ginecologia e Obstetrícia. v. 27, n. 1, p. 12-19, 2005.

LOVEJOY, J. C. The menopause and obesity. Primary Care: Clinics in Office

Practice. v. 30, p. 317- 325, 2003.

LUND, K. J. Menopause and the Menopausal Transition. The Medical Clinics

of North America. v. 92, p. 1253-1271, 2008.

75 MACKIE, E. J. Osteoblasts: novel roles in orchestration of skeletal architecture.

The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. v. 35, p. 1301-

1305, 2003.

MAGGIO, D.; BARABANI, M.; PIERANDREI, M.; POLIDORI, M. C.; CATANI,

M.; MECOCCI, P.; SENIN, U.; PACIFICI, R.; CHERUBINI, A. Marked Decrease

in Plasma Antioxidants in Aged Osteoporotic Women: Results of a Cross-

Sectional Study. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. v.

88, n. 4, p. 1523-1527, 2003.

MANN, V.; HUBER, C.; KOGIANNI, G.; COLLINS, F.; NOBLE, B.S. The

antioxidant effect of oestrogen and Selective Oestrogen Receptor Modulators in

the inhibition of osteocyte apoptosis in vitro. Bone, v. 40, p. 674–684, 2007.

MARANGON, K.; DEVARAJ, S.; TIROSHI, O.; PACKER, L.; JIALAL, I.

Comparison of the effect of a-lipoic acid and a-tocopherol supplementation on

measures of oxidative stress. Free Radical Biology & Medicine. v. 27, p.

1114–21, 1999.

MATURAMA, M. A.; BREDA, V.; LHULLIER, F.; SPRITZER, P. M. Relationship

between endogenous testosterone and cardiovascular risk in early

postmenopausal women. Metabolism Clinical and Experimental. v. 57, p.

961-965, 2008.

MAZZUOLI, G.; ACCA, M.; PISANI, D.; DIACINTI, D.; SCARDA, A.;

SCARNECCHIA,L.; PACITTI, M. T.; D’ERASMO, E.; MINISOLA, S.; BIANCHI,

G.; MANFREDI G. Annual Skeletal Balance and Metabolic Bone Marker

Changes in Healthy Early Postmenopausal Women: Results of a Prospective

Study. Bone. v. 26, p. 381-386, 2000.

MELHUS, H.; MICHAELSSON, K.; HOLMBERG, L.; WOLK, A.; LJUNGHALL,

S. Smoking, antioxidant vitamins and risk of hip fracture. The Journal of Bone

and Mineral Research. v. 14, p. 129–135, 1999.

76 MENDEZ-DAVILLA, C.; GARCIA-MORENO, C.; TURBI, C.; DE LA PIEDRA, C.

Effects of 17beta-estradiol, tamoxifen and raloxifene on the protein and mRNA

expression of interleukin-6, transforming growth factor-beta1 and insulin-like

growth factor-1 in primary human osteoblast cultures, Journal of

Endocrinology Investigation. v. 27, n. 10, p. 904-912, 2004.

MILEWICZ, A,; JEDRZEJUK, D. Clinical aspects of obesity in the gynecological

endocrinologicaly practice. Maturitas. v. 56, p 113-121, 2007.

MITCHELL, E. S.; WOODS, N. F.; MARIELLA, A. Three stages of the

menopausal transition from the Seattle Midlife Women’s Health Study: toward a

more precise definition. Menopause. v. 7, p. 334–349, 2000.

MOHAMMAD, K.; HASHEMI, S. M. S.; FARAHANI, F. K. A. Age at natural

menopause in Iran. Maturitas. v. 49, p. 321-326, 2004.

MORIKAWA, T.; YASUNO, R.; WADA, H. Do mammalian cells synthesize lipoic

acid Identification of a mouse cDNA encoding a lipoic acid synthase located in

mitochondria. FEBS Lett. v. 498 p. 16–21, 2001.

MORINGA, T.; NAKAGAWA, N.; YASUDA, H.; TSUDA, E.; HIGASHIO, K.

Cloning and characterization of the gene encoding human

osteoprotegerin/osteoclastos genesis inhibitory factor. European Journal of

Biochemistry. v. 254, p. 685-691, 1998.

MORITA, K.; MIYAMOTO, T.; FUJITA, N.; KUBOTA, Y.; ITO, K.; TAKUBO, K.;

MIYAMOTO, K.; NINOMIYA, K.; SUZUKI, T.; IWASAKI, R.; YAGI, M.;

TAKAISHI, H.; TOYAMA, Y.; SUDA, T. Reactive oxygen species induce

chondrocyte hypertrophy in endochondral ossification. The Journal of

Experimental Medicine. v. 204, p. 1613–1623, 2007.

MORIYAMA, C. K.; ONEDA, B.; BERNARDO, F. R.; CARDOSO-JUNIOR, C.

G.; FORJAZ, C. L. M.; ABRAHAO, S. B.; MION-JUNIOR, D.; FONSECA, A. M.;

TINUCCI, T. A randomized, placebo-controlled trial of the effects of physical

77 exercises and estrogen therapy on health-related quality of life in

postmenopausal women. Menopause. v. 15, n. 4, p. 613-618, 2008.

MORTON, D. J.; BARRETT-CONNOR, E. L.; SCHNEIDER, D. L. Vitamin C

supplement use and bone mineral density in postmenopausal women. The

Journal of Bone and Mineral Research. v. 16, p. 135–140, 2001.

MORTON, D. J.; BARRETT-CONNOR, E. L.; SCHNEIDER, D. L. Vitamin C

supplement use and bone mineral density in postmenopausal women. The

Journal of Bone and Mineral Research. 16, p 135–140; 2001.

MUTHUSAMI, S.; RAMACHANDRAN, I.; MUTHUSAMY, B.; VASUDEVAN, G.;

PRABHU, V.; SUBRAMANIAM, V.; JAGADEESAN, A.; NARASIMHAN, S.

Ovariectomy induces oxidative stress and impairs bone antioxidant system in

adult rats. Clinica Chimica Acta. v. 360, p. 81-86, 2005.

NAMS. Estrogen e and progestogen use in peri- and postmenopausal women:

march 2007 position statement of the North American Menopause Society.

Menopause. v. 14, n. 2, p. 168-182, 2007.

NANES, M. S. Tumor necrosis factor-α: molecular and cellular mechanisms in

skeletal pathology. Gene. v. 321 p. 1-15, 2003.

ÖZDEN, S.; DILDAR, K.; KADIR, Y. H.; GÜLIZAR, K. The effects of hormone

replacement therapy on lipid peroxidation and antioxidant status. Maturitas. v.

38, p.165–170, 2001.

OZGOCMEN, S.; KAYA, H.; FADILLIOGLU, E.; AYDOGAN, R.; YILMAZ, Z.;

Role of antioxidant systems, lipid peroxidation, and nitric oxide in

postmenopausal osteoporosis. Molecular and Cellular Biochemistry. v. 295,

p. 45-52, 2007.

PACIFICI, R. T cells and post menopausal osteoporosis in murine models,

Arthritis Research & Therapy. v. 9, p. 102-105, 2007.

78

PACKER, L.; WITT, E.H.; TRITSCHLER, H.J. Alpha lipoic acid as a biological

antioxidant. Free Radical Biology & Medicine. v. 27, p. 356-362, 2000.

PELAYO, I.; JAVIER HAYA, J.; DE LA CRUZ, J. J.; SECO, C.; BUGELLA, J. I.;

JOSE L. DIAZ, J. L.; BAJO, J. M.; REPOLLES, M. Raloxifene plus ossein-

hydroxyapatite compound versus raloxifene plus calcium carbonate to control

bone loss in postmenopausal women: A randomized trial. Menopause. v. 15,

2008.

PENG-HUI, W.; CHENG, M.; CHAO, H.; CHAO, K. Effects of Tibolone on the

breast of postmenopausal women. Taiwanese Journal of Obstetrics and

Gynecology. v. 46, n. 2, p.121 – 126, 2007.

PFAFFL, M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time

RT-PCR. Nucleic Acids Research. v. 29, p. 2002-07, 2001.

PICHÉ, M.; LAPOINTE, A.; WEISNAGEL, S. J.; CORNEAUA, L.;, NADEAU, A.;

BERGERON, J.; LEMIEUX, S. Regional body fat distribution and metabolic

profile in postmenopausal women. Metabolism Clinical and Experimental. v.

57, p. 1101-1107, 2008.

PIVONKA, P.; ZIMAK, J.; SMITH, D. W.; GARDINER, B. S.; DUNSTAN, C. R.;

SIMS, N. A.; MARTIN, T. J.; MUNDY, G. R. Model structure and control of bone

remodeling: A theoretical study. Bone. v. 42, p. 249-263, 2008.

POEHLMAN, E. T.; TOTH, M. J.; GARDNER, A. W. Changes in energy balance

and body composition at menopause: a controlled, longitudinal study. Annals of

Internal Medicine. v. 123, p. 673-675, 1995.

POUBELLE, P.E.; CHAKRAVARTI, A.; FERNANDES, M.J.; DORION K.;

MARCEAU, AA. Differential expression of, RANK, RANK-L, and osteoprotegerin

by synovial fluid neutrophils patients with rheumatoid arthritis and by healthy

human blood neutrophils. Arthritis Research & Therapy. v. 9, n. 2, p. 1-12,

79 2007.

REBUFFE-SCRIVE, M.; ELDH, J.; HAFSTROM, L. O.; BJORNTORP, P.

Metabolism of mammary, abdominal and femoral adipocytes in women before

and after menopause. Metabolism. v.35, p. 792-797, 1986.

RELJANOVIC, M.; REICHEL, G.; RETT, K.; LOBISCH, M.; SCHUETTE, K.;

MOLLER, W.; TRITSCHLER, H.J.; MEHNERT, H. Treatment of diabetic

polyneuropathy with the antioxidant thioctic acid (alpha-lipoic acid): a two year

multicenter randomized double-blind placebo-controlled trial (ALADIN II). Alpha

Lipoic Acid in Diabetic Neuropathy, Free Radical Research. v. 31, p. 171–179,

1999.

RETH,M. Hydrogen peroxide as secondmessenger in lymphocyte activation.

Nature Immunology. v. 3, p. 1129–1134, 2002.

RHO, J.; TAKAMI, M.; CHOI, Y. Osteoimmunology: interections of the immune

and skeletal systems. Molecular Cells, v. 17, p. 1-9, 2004.

ROGERS A., GLOVER, S.J.; EASTELL, R. A randomised, double-blinded,

placebo-controlled, trial to determine the individual response in bone turnover

markers to lasofoxifene therapy, Bone, 2009.

RUHNAU, K.J.; MEISSNER, H.P.; FINN, J.R.; RELJANOVIC, M.; LOBISCH, M.

SCHUTTE, K. NEHRDICH, D.; TRITSCHLER, H.J.; MEHNERT, H.; ZIEGLER,

D. Effects of 3-week oral treatment with the antioxidant thioctic acid (alpha-

lipoic acid) in symptomatic diabetic polyneuropathy, Diabetic Medicine. v. 16,

p. 1040–1043, 1999.

SAMBROOK, J. RUSSEL, D.W. Agarose gel electrophoresis. In: Molecular

cloning: a laboratory manual. 3a. ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor

Laboratory Press, cap. 7, p. 7.9-7.12 e 7.43-7.45. 2001.

SAMSIOE, G.; DÖREN, M.; LOBO, R. A. Acute symptoms of the menopause

Women's Health Medicine. v. 3, n. 6, p. 282-286, 2006.

80

SANCHEZ-RODRIGUEZ, M.A.; Ruiz-Ramos, M.; Correa-

Muñoz, E.; Mendoza-Núñez, V.M. Oxidative stress as a risk factor for

osteoporosis in elderly Mexicans as characterised by antioxidant enzymes.

BMC Musculoskeletal Disorders. v. 8, p. 124, 2007.

SANTORO N. Mechanisms of premature ovarian failure. Ann Endocrinol, v.

64, p. 87–92, 2003.

SCHOPPET, M.; PREISSNER, K.T.; HOFBAUER, L.C. Rank ligand and

Osteoprotegerin paracrine regulators of bone metabolism and vascular function.

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. v. 22, p. 549-553,

2002.

SECK, T.; DIEL, I.; BISMAR, H.; ZIEGLER, R.; PFEILSCHIFTER, J.

Expression of Interleukin-6 (IL-6) and IL-6 Receptor mRNA in Human Bone

Samples From Pre- and Postmenopausal Women. Bone. v. 30, p. 217-222,

2002.

SEIFERT-KLAUSS, V..; MUELLER, J. E.;LUPPA, P.; PROBST, R.; WILKER, J.;

HÖß, C.; TREUMANN, T.;KASTNER, C.;ULM, K. Bone metabolism during the

perimenopausal transition: a prospective study. Maturitas. v. 41, p. 23-33,

2002.

SEIFERT-KLAUSS, V.; LINK, T.; HEUMANN, C.; LUPPA, P.; HASEITL, M.;

LAAKMANN, J.; RATTENHUBER, J.; KIECHLE, M. Influence of pattern of

menopausal transition on the amount of trabecular bone loss Results from a 6-

year prospective longitudinal study. Maturitas. v. 55, p. 317-324.

SHAABAN, M. M., The perimenopause and contraception, Journal of The

Climacteric & Postmenopause, 1996, vol. 23, pp. 181-192.

SHUSTER L.T.; RHODES, D.J.; GOSTOUT, B.S.; GROSSARDT, B.R.;

ROCCA, W.A. Premature menopause or early menopause: Longterm health

consequences. Maturitas. 2009.

81

SILVA, C. M. L.; GIGANTE, D. P.; MINTEN, G. C. Descrição de sintomas e

síndrome pré-menstrual conforme a idade da menarca em mulheres nascidas

em 1982, no Sul do Brasil. Cadernos de Saúde Pública. v.. 24, n.. 4, p.. 835-

844. 2008.

SMITH, A. R.; SHENVI, S. V.;WIDLANSKY, M.; SUH, J. H.; HAGEN, T. M.

Lipoic acid as a potential therapy for chronic diseases associated with oxidative

stress. Current Medicinal Chemistry. v. 11, p.1135-1146, 2004.

SOARES, C. N.; ALMEIDA, O P. Associação entre depressão na

perimenopausa e níveis séricos de estradiol e hormônio folículo-estimulante.

Revista Brasileira de Psiquiatria. v. 22, n.1, p. 17-21, 2000.

SONTAKKE, A. N.; TARE, R. S. A duality in the roles of reactive oxygen

species with respect to bone metabolism. Clinica Chimica Acta. v. 318, p.

145–148, 2002.

STANOSZ, S.; ŻOCHOWSKA, E.; SAFRANOW, K.; SIEJA, K.; STANOSZ, M.

Influence of modified transdermal hormone replacement therapy on the

concentrations of hormones, growth factors, and bone mineral density in women

with osteopenia. Metabolism Clinical and Experimental. v. 58, n. 1-7, 2009.

STEFÁSNKA, A.; YPNIEWSKA, G.; SENTERKIEWICZ, L. Inflammatory

Markers and Cardiovascular Risk in Healthy Polish Women across the

Menopausal Transition. Clinical Chemistry. v. 51, n. 10, p. 1893-1895, 2005.

STEINBECK, M. J.; APPEL, W. H. JR.; VERHOEVEN, A. J.; KARNOVSKY, M.

J. NADPHoxidase expression and in situ production of superoxide by

osteoclastos actively resorbing bone. The Journal of Cell Biology. v. 126, p.

765–772, 1994.

TAKAYANAGI, H. Inflammatory bone destruction and osteoimmunology.

Journal of Periodontal Research. v. 40, p. 287–293, 2005.

82

TANKO´, L. B.; BAGGER, Y. Z.; NIELSEN, S. B.; CHRISTIANSEN, C. Does

serum cholesterol contribute to vertebral bone loss in postmenopausal women?

Maturitas. v. 51, p. 307-313, 2005.

TAPIERO, H.; BA, G. N; TEW, K. D., Estrogens and environmental estrogens,

Biomed Pharmacother. v. 56, p. 36-44, 2002.

TEICHERT, J.; HERMANN, R.; RUUS, P. Plasma Kinetics, Metabolism, and

Urinary Excretion of Alpha-Lipoic Acid following Oral Administration in Healthy

Volunteers. Journal of Clinical Pharmacology, v. 43, p. 1257-1267, 2003.

TEICHERT, J.; KERN, J.; TRITSCHLER, H. J.; ULRICH, H.; PREISS, R.

Investigations on the pharmacokinetics of alpha-lipoic acid in healthy volunteers,

International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy, & Toxicology. v.

36, p. 625–628, 1998.

THEOLEYRE, S.; WITTRANT, Y.; TAT, S. K.; FORTUN, Y.; REDINI, F.;

HEYMANN, D. The molecular triad OPG/RANK/RANKL: involvement in the

orchestration of pathophysiological bone remodeling. Cytokine & Growth

Factor Reviews. v. 15, p. 457-475, 2004.

TREVISAN, M.; BROWNE, R.; MALATI, R.; MUTI, R.; FREUNDEHEIM, J.;

CAROSSELA, A.M.; ARMSTRONG, D. Correlates of markers of oxidative status

in general population. American Journal of Epidemiology. v. 154, n. 4, p. 348-

356, 2001.

UELAND, T. Bone metabolism in relation to alterations in systemic growth

hormone. Growth Hormone & IGF Research. v. 14, n. 6, p. 404-417, 2004.

UNFER, T. C.; CONTERATO, G. M. M.; SILVA, J. C. N.; DUARTE, M. M. M. F.;

EMANUELLI, T. Influence of hormone replacement therapy on blood antioxidant

enzymes in menopausal women. Clinica Chimica Acta. v. 369, p. 73-77, 2006.

83 VALVERDE, P. Pharmacotherapies to manage bone loss-associated diseases:

a quest for the perfect benefit-to-risk ratio. Current Medicinal Chemistry. v. 15,

284–304, 2008.

VAN DER SCHOUW, Y. T.; GROBBEE, D. E.; Menopausal complaints,

oestrogens, and heart disease risk: an explanation for discrepant findings on the

benefits of post-menopausal hormone therapy. European Heart Journal. v.

26, p. 1358–1361, 2005.

VURAL, P.; AKGUL, C.; CANBAZ, M. Effects of hormone replacement therapy

on plasma pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines and some bone

turnover markers in postmenopausal women. Pharmacological Research. v.

54, p. 298–302, 2006.

WADA, T.; NAKASHIMA, T.; HIROSHI, N.; PENNINGER, J. M. RANKL–RANK

signaling in osteoclastogenesis and bone disease, TRENDS in: Molecular

Medicine. v. 12, n.1, 2006.

WALSH, M.C.; KIM, Y.K.; RHO, J.; LEE, S.Y.;LORENZO, J.; CHOI, Y.

Osteoimmunology: Interplay Between the Immune System and Bone

Metabolism. Annual Review of Immunology. v. 24, p. 33-63, 2006.

WELTY, F. K. Women and cardiovascular risk. The American Journal of

Cardiology. v. 88, p. 48-52, 2001.

WHO Scientific Group on Research on the Menopause in the 1990s. WHO

Technical Report Series. Geneva, Switzerland: WHO, 1996:86.

WHO. Obesity: Preventing and managing the global epidemic. Report of a

WHO consulation. WHO Technical Report Series 894. cap. 2, p.6-15, Geneva,

2004.

WHO. Obesity: preventing and managing the global epidemic. Report of the

WHO Consultation on Obesity. Geneva, 1998.

84

WOLF, R. L.; CAULEY, J. A.; PETTINGER, M.; JACKSON, R.; LACROIX, A.;

LEBOFF, M. S.; LEWIS, C. E.; NEVITT, M. C.; SIMON, J. A.; STONE, K. L.;

WACTAWSKI-WENDE, J. Lack of a relation between vitamin and mineral

antioxidants and bone mineral density: results from the Women’s Health

Initiative. American Journal of Clinical Nutrition. v. 82, p. 581–588, 2005.

WOLLIN, S. D.; JONES, P. J. Alpha-lipoic acid and cardiovascular disease,

Journal of Nutrition. v. 133, p. 3327–3330, 2003.

YAGI, K. Lipid peroxides in biology and medicine. New York (NY): Academic

Press; 1982.

ZIEGLER, D.; HANEFELD, M.; RUHNAU, K.J.; HASCHE, H.; LOBISCH, M.

SCHUTTE, K. KERUM, G. MALESSA, R. Treatment of symptomatic diabetic

polyneuropathy with the antioxidant alpha-lipoic acid: a 7-month multicenter

randomized controlled trial (ALADIN III study). ALADIN III Study Group. Alpha-

Lipoic Acid in Diabetic Neuropathy, Diabetes Care. v. 22, p. 1296–1301, 1999.

ZOLI A.; LIZZIO, M. M.; CAPUANO, A.; MASSAFRA, U.; BARINI, A.,

FERRACCIOLI, G., Osteoporosis and bone metabolism in postmenopausal

women with osteoarthritis of the hand. Menopause: The Journal of the North

American Menopause Society. v. 13, n. 3, p 462-466, 2006.

85

APÊNDICE A – FICHA CLÍNICA DE TRIAGEM

Ficha Clínica de Triagem Nº _______ Data: __/__/__

PARTE I - IDENTIFICAÇÃO (a ser preenchida apenas na primeira consulta)

Nome:_________________________________________________Prontuário:_______

Endereço:______________________________________________________________

Ponto de Referência: _____________________________________________________

Telefone para contato_______________________ ACS da área: _________________

Data de Nascimento:___/___/19___ Idade: ___anos (40 a 55 anos)

Profissão: (0) do lar (1) trabalha fora_______________________________

Situação conjugal: (0) Casada ou União Estável; (1) Solteira, Separada ou Viúva

Você tem parceiro fixo? (0) Sim; (1) Não. Número atual de parceiros: _________

Tempo de vida conjugal com atual parceiro (meses ou anos):______________________

Escolaridade: ( ) Sem Escolaridade ( ) 1ºGrau incompleto ( ) 1ºGrau completo

( ) 2ºGrau incompleto ( ) 2ºGrau completo ( ) Nível superior

Anos de estudo completos: ______ anos

Renda familiar mensal: R$ _______ Número de pessoas da família: ______

PARTE II – DADOS RELEVANTES

2.1 – Menstruação: ( ) Normal ( ) Irregular – Há quanto tempo(meses)?_________

( ) Menopausa – Há quanto tempo(meses)? ___________________________________

2.2 – Fumante: ( ) S ( ) N – Nº de cigarros/dia:_______________________________

2.3 – Uso de Medicações Hormonais nas últimas 8 semanas: ( )S ( ) N – Qual?

_____________________________________________________________________

Índice Menopáusico de Blatt e Kupperman: SINTOMAS Peso Escore obtido Ondas de Calor 4 Parestesia 2 Insônia 2 Nervosismo 2 Depressão 1 Vertigens 1 Fadiga 1 Artralgia/Mialgia 1 Cefaléia 1 Palpitação 1 Zumbido 1

86 Índice Menopáusico ----- Escore dos sintomas: Ausentes( 0) Leves(1) Moderados(2) Intensos(3) Exame Físico Geral:

Peso: ___________ Altura: ________IMC:_______CA: _______PA:________________

OBS.:Critérios importantes para triagem: 1) Idade: entre 40 e 55 anos de idade; 2)

Irregularidade Menstrual nos últimos 06 meses e/ou parada da menstruação há até 12 meses;

3) Índice Menopáusico de Blatt e Kupperman maior ou igual a 14.

Consulta para avaliação com ginecologista do projeto marcada para ___/___/___ às ____ Local:

______________________________

Ficha de Investigação do Conhecimento sobre Climatério/Menopausa/TH

1 – Conhece o significado dos termos “Perimenopausa” e/ou “Climatério”?

( )Conhece bem ( ) Conhece parcialmente ( ) Não conhece

Tem interesse em conhecer? ( )S ( )N

2 – Conhece o significado do termo “ Menopausa”?

( )Conhece Bem ( ) Conhece parcialmente ( )Não Conhece


3 – Conhece o significado do termo “TH”?

( ) Conhece bem ( )Conhece parcialmente ( ) Não conhece


4 – As informações sobre Perimenopausa, Menopausa, TH foram obtidas com/no(a):

( ) Ginecologista ( ) Outros profissionais da saúde ( )TV ( )Rádios ( ) Internet

( )Publicações leigas ( )Publicações especializados

( )Outras fontes: ________________________________________

5 – Já utilizou TH para tratamento de sintomas climatéricos?

( )Nunca usou ( ) Sim – Tempo_______ Nome: _______________________________

Identifica benefícios: ( ) N( )S - Quais? _____________________________________

Parou o uso por: ( ) Decisão Médica ( ) Abandonou o tratamento

Motivo do abandono: ( ) Preço ( )Efeitos Indesejáveis_________________( ) Medo(

)Outros:_______________________________________________________

6 – Conhece Terapias Alternativas para Perimenopausa/Menopausa? ( )Não conhece

( )Conhece – Quais?___________________________________________________

7 – Já Utilizou alguma terapia alternativa para Perimenopausa/Menopausa? ( )N

( )S – Quais? ____________________________ Quem Prescreveu ou

Recomendou?_________________________________________________________

8 – Desejaria fazer algum tratamento para a Perimenopausa/Menopausa? ( ) N ( )S

Tem preferência por algum tratamento que já conhece? ( )N ( )S – Qual?__________

_____________________________________________________________________

87 APÊNDICE B – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

ESCLARECIMENTOS Este é um convite para você participar da pesquisa “Suplementação com Ácido

Lipoico e Terapia Hormonal com Tibolona: Impacto sobre o estresse oxidativo e a

reabsorção óssea” que é coordenada pela professora doutora Maria das Graças Almeida e

conduzida clinicamente pela ginecologista Maria Socorro Medeiros de Morais.

Sua participação é voluntária, o que significa que você poderá desistir a qualquer

momento de continuar participando sem que isso lhe traga nenhum prejuízo ou penalidade.

Esta pesquisa procura avaliar a influência de um medicamento (Tibolona), associada

ou não com um suplemento (Ácido Lipoico) para ajudar você melhorar sua qualidade de

vida.

Caso decida aceitar o convite, você será submetido(a) ao(s) seguinte(s)

procedimentos:

1- Exame ginecológico completo com colheita de preventivo, realização de

ultrassonografia transvaginal, avaliação da densidade mineral óssea, através da

densitometria óssea, exame de mamografia, além de responder um questionário sócio-

econômico e também uma ficha clínica ginecológica.

2- Em seguida será realizada uma coleta de 40mL de sangue por punção venosa à

vácuo para realização de vários exames para avaliação da saúde geral, além de alguns

exames específicos relacionados a pesquisa. O material genético também será obtido das

amostras de sangue e será armazenado no Laboratório de Biologia Molecular – LABIOMOL

do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, da Faculdade de Farmácia da

UFRN sob a responsabilidade da Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende, onde o RNA

será usado para avaliar a saúde do osso e o DNA será guardado para posteriores estudos.

Caso haja interesse de realizarmos futuras pesquisas entraremos em contato com você, e

somente com sua autorização e aprovação dos novos projetos no Comitê de Ética em

Pesquisa realizaremos os estudos.

As análises do seu RNA que podem estar relacionados a ocorrência de problemas

ósseos será realizada no Laboratório de Biologia Molecular Aplicado ao Diagnóstico –

LABMAD da Faculdade de Farmácia da USP em São Paulo sob responsabilidade do Porf

Tit. Mario Hiroyuki Hirata. As amostras de RNA serão enviadas ao responsável do estudo

para São Paulo para realização das análises genéticas relacionados ao projeto, sendo que a

mesma retornará ao local de armazenamento inicial na UFRN, ficando armazenada na USP

somente durante a realização das análises. Durante o período de permanência das

amostras em São Paulo a relização do procesamento, análise e armazenamento das

88 mesmas ficarão sob a responsabilidade do Prof Tit. Mario Hiroyuki Hirata. O transporte da

mesma será realizado por via aérea em condições ótimas de transporte para esse tipo de

amostra biológica, devidamente identificada.

3- Em seguida você será submetida a uma suplementação (ácido lipóico 600mg)

e/ou uso do medicamento (Tibolona 2,5 mg) durante 3 meses. Você poderá estar inserida

em um dos grupos seguintes: pacientes que receberão substância sem nenhum efeito,

pacientes que receberão comprimidos contendo medicamento, pacientes que receberão

cápsulas contendo suplemento alimentar ou pacientes que receberão cápsulas contendo

suplemento alimentar e o medicamento. Você só será informada sobre o que foi

administrado ao final da pesquisa. Após esse período, será realizada nova coleta de sangue

para a realização dos mesmos exames, repetido a Ultrassonografia Transvaginal, bem como

uma nova avaliação ginecológica através da ficha Clínica de Avaliação Ginecológica.

O risco a saúde será mínimo, por causa da coleta de sangue que pode formar uma

mancha roxa (hematoma) no local da picada da agulha além do risco do aparecimento de

reações adversas devido ao uso do medicamento e/ou suplementação. Riscos esses que

serão minimizados através de procedimentos de coleta cuidadosos, além do

acompanhamento das pacientes para que as reações adversas possam ser avaliadas e, se

necessário, a suspensão do uso do medicamento. Você responderá a algumas perguntas

sobre doenças existentes nas pessoas de sua família, hábitos alimentares e uso de

medicamentos. Além de você outras mulheres também participarão do estudo.

Ao participar dessa pesquisa você realizará uma avaliação da saúde geral e

ginecológica, e também fará exames que não são feitos pelo Sistema Único de Saúde

(SUS) e terá a oportunidade de participar de reuniões de educação em saúde.

Caso seja de seu interesse, entregarei todos os resultados dos exames laboratoriais

necessários sem qualquer custo, que são: hemograma completo, determinações de

concentrações séricas de colesterol total e frações, triglicérides, glicemia de jejum,

transaminases hepáticas (ALT e AST), gama-glutamil transferase (GGT), fosfatase alcalina,

fosfatase ácida tartarato-resistente, fósforo, magnésio, ferro, creatinina, uréia, proteínas

totais, albumina e proteína C-reativa, estradiol, osteocalcina, IL-1β, IL-6, IL-10 e TNF-α.

Também disponibilizarei os resultados da análise dos demais exames da pesquisa. Você

não receberá qualquer pagamento por sua participação.

Em qualquer momento, se você tiver algum problema de saúde decorrente da

pesquisa, será garantido atendimento médico na instituição.

Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será identificado em

nenhum momento. Os dados serão guardados em local seguro e a divulgação dos

resultados será feita de forma a não identificar os voluntários.

Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a respeito

desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para Dra. Maria das Graças Almeida, no

89 endereço General Cordeiro de Faria, S/N; Petrópolis, Natal/RN ou pelo telefone 32154377.

Você também poderá tirar dúvidas com os demais pesquisadores envolvidos na pesquisa:

Adriana Augusto de Resende (Professora – tel: 88746161) Socorro de Medeiros Morais

(médica ginecologista – tel: 99816134) ou Francisco Paulo Freire Neto (bioquímico – tel:

94012147).

CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os

riscos e benefícios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa

“Suplementação com Ácido Lipoico e Terapia Hormonal com Tibolona: Impacto sobre

o estresse oxidativo e a reabsorção óssea”.

Foram garantidos esclarecimentos sobre a pesquisa e o direito de desistir da

participação dela em qualquer momento, sem que essa desistência implique em qualquer

prejuízo a minha pessoa ou de minha família, além do anonimato e o sigilo dos dados

referentes à minha identificação.

Participante da pesquisa: ___________________________________________

Assinatura:_______________________________________________________

COMPROMISSO DO INVESTIGADOR

Eu discuti as questões acima apresentadas com os responsáveis dos participantes.

É de minha opinião que o indivíduo entende os riscos, benefícios e obrigações relacionadas

a este projeto.

Pesquisador Responsável

90

APÊNDICE C – FICHA CLÍNICA DE AVALIAÇÃO GINECOLÓGICA

Parte 1 - IDENTIFICAÇÃO: Data: ____/____/_____ Ficha Triagem nº: _________ Nome: ______________________________________________Data Nasc:____/___/___ PARTE 2 - INVENTÁRIO GINECOLÓGICO/OBSTÉTRICO Menarca : ____ anos Gesta:______ Para:______ Abortos______ Ciclos menstruais: ____/____ ( )Normal ( )Irregular, há________ DUM:___/___/___ (há menos de 12 meses?) Método Anticoncepcional: _______________________(se pílula e há menos de 8 semanas, excluída) Já fez TH? ( ) Nunca; ( ) Estou usando atualmente(Excluída); ( )Já usei há mais de 8 semanas PARTE 3 – DOENÇAS ASSOCIADAS • Hipertensão arterial: (0 ) Não; ( 1 ) Sim – Qual medicamento? __________________ • Diabetes tipo 2: ( 0 ) Não; (1 ) Sim – Qual medicamento? ______________________ • Dislipidemia: (0 ) Não; (1 ) Sim – Medicamento? ____________________________ • Osteoporose: (0) Não; (1) Sim – Medicamento? _____________________________ Critérios de exclusão (*se presente qualquer um desses estiver presente, circule e exclua a paciente): distúrbios tromboembólicos, IAM, AVC, neoplasia estrógeno-dependente, tireopatia, sangramento genital, doença hepática, má absorção, IRC, hepatopatia, distúrbios da coagulação, uso de drogas que sabidamente interfiram na avaliação do sistema hemostático (antiinflamatórios, etc) uso de drogas que interferem com densidade mineral óssea

PARTE 4 – HÁBITOS DE VIDA Tabagismo: (0) Nunca fumou (1 ) Fumante atual – Quantos cig/dia?____ (2) Ex-fumante OBS: Fumantes são pessoas que fizeram uso de mais de três cigarros por dia por mais de seis meses até o momento da pesquisa, e ex-fumantes são aqueles que não fumam mais, porém já fumaram em algum momento da vida por um período > seis meses

Você ingere bebida alcoólica? (0 ) Não (1 ) Sim Freqüência por mês:_______vezes Você pratica exercícios físicos regularmente ? (0 ) Não (1) Sim Qual ____________ Freqüência por semana: ______ vezes OBS: atividade física regular é caracterizada como três ou mais vezes por semana (40 minutos/vez)

PARTE 5 – Exames de rastreamento • Citologia cérvico-vaginal:

- Já realizou alguma vez na vida: (0) Não (1) Sim - Atualizada (<1 ano)? (0) Não (1) Sim – Resultado________________ (Se NÃO, agendar ou encaminhar para realização de preventivo)

• Mamografia: - Já realizou alguma vez na vida: (0) Não (1) Sim Atualizada (< 1 a 2 anos)? (0) Não (1) Sim - Resultado(Birads) ________________________ (se houver lesão – EXCLUÍDA)

• Ultra-sonografia transvaginal: - Já realizou alguma vez na vida: (0) Não (1) Sim - Atualizada (< 1 a 2 anos)? (0) Não (1) Sim Espessura endometrial_______________

• Densitometria óssea: - Já realizou alguma vez na vida: (0) Não (1) Sim Atualizada (últimos 2 anos)?

(0) Não (1) Sim, resultado

91

DADOS ANTROPOMÉTRICOS

DADOS ANTROPOMÉTRICOS – Triagem (____/____/_____)

Peso: _____Kg; Estatura: ______ m;

PA: 1a Medição _____ x _____ mmHg 2a Medição: _____x_____mmHg

Circunferência da cintura: 1a medição= _____ cm; 2a medição= _____ cm

Circunferência do quadril: 1a medição= _____ cm; 2a medição= _____ cm

OBS: Para medir o perímetro da cintura, a fita métrica deve ser posicionada na menor curvatura localizada entre as costelas e a crista ilíaca. Para aferição do perímetro do quadril, a fita métrica deve ser posicionada na área de maior protuberância glútea.

Circunferência muscular do braço (CMB): _____ cm

DADOS ANTROPOMÉTRICOS – 4 semanas (____/____/_____)







DADOS ANTROPOMÉTRICOS – 8 semanas (____/____/_____)







92 AVALIAÇÃO DOS SINAIS E SINTOMAS DA MENOPAUSA A – Inventário de sintomas relacionados ao climatério -Apresenta ondas de calor?

(0 ) Não (1 ) Sim, mas que não interferem em minha qualidade de vida (2 ) Sim, e que atrapalham significativamente minha qualidade de vida # Como você classifica a intensidade de seus sintomas, de acordo com a seguinte escala de intensidade?

0 ausência de

sintomas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 intensidade

máxima

-Apresenta secura vaginal?

(0 ) Não (1 ) Sim, mas que não interferem em minha qualidade de vida (2 ) Sim, e que atrapalham significativamente minha qualidade de vida # Como você classifica a intensidade de seus sintomas, de acordo com a seguinte escala de intensidade?

0 ausência de

sintomas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 intensidade

máxima

B – Índice menopausal de Kupperman e Blatt.

SINTOMAS

ESCORES

AUSENTE

(0)

LEVES

(1)

MODERADOS

(2)

INTENSOS

(3)

PESOS RESULTADO

PARCIAL

Ondas de calor 4

Parestesia 2

Insônia 2

Nervosismo 2

Depressão 1

Vertigens 1

Fadiga 1

Artralgia/mialgia 1

Cefaléia 1

Palpitações 1

Zumbido 1

Total

Índice menopáusico:

93 AVALIAÇÃO DOS SINAIS E SINTOMAS DA MENOPAUSA – Escala climatérica de Greene.

SINTOMAS

ESCORE

NUNCA

(0)

LEVE

(1)

MODERADO

(2)

INTENSO

(3)

ESCORE

(0 - 3)

1. Coração batendo rápido ou fortemente

2. Sentindo tensão ou nervosismo

3. Dificuldade para dormir

4. Excitabilidade

5. Ataques de pânico

6. Dificuldade de concentração

7. Sentindo cansaço ou falta de energia

8. Perda de interesse em muitas coisas

9. Sentindo-se infeliz ou deprimida

10. Crises de choro

11. Irritabilidade

12. Sentindo tonturas

13. Pressão ou peso na cabeça ou corpo

14. Formigamento em partes do corpo

15. Dores de cabeça

16. Dores nos músculos e juntas

17. Perda de sensibilidade nas mãos ou

pés

18. Dificuldade para respirar

19. Ondas de calor

20. Suores noturnos

21. Perda de interesse sexual

Psicológicos (1-11) = Ansiedade (1- 6) = Depressão (7-11) = Somáticos (12-18) = Vasomotores (19-20) = Sexual (21) =

94 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE VIDA A - Utian QOL - Menopausa

Utian Quality of Life – Menopausa

Por gentileza, avalie o grau com que você concorda com as seguintes afirmações, conforme elas se aplicam a você no último mês. Circule sua resposta usando a tabela abaixo:

1 2 3 4 5

Muito Falso Falso Moderadamente verdadeiro Verdadeiro Muito verdadeiro

Por favor responda todas as questões:

1 Sou capaz de controlar coisas na minha vida que são importantes para mim.

1 2 3 4 5

2 Eu me sinto motivada pelo meu trabalho. 1 2 3 4 5

3 Acredito que meu trabalho traz benefícios para a sociedade. 1 2 3 4 5

4 Eu não estou satisfeita com minha vida sexual. 5 4 3 2 5

5 Eu estou satisfeita com minha vida amorosa. 1 2 3 4 5

6 Tenho recebido reconhecimento pessoal na minha comunidade ou no meu trabalho.

1 2 3 4 5

7 Estou infeliz com minha aparência (física e estética). 5 4 3 2 1

8 A minha dieta não está equilibrada nutricionalmente. 5 4 3 2 1

9 Tenho controle sobre meus hábitos alimentares. 1 2 3 4 5

10 Eu pratico atividade física três ou mais vezes na semana,

rotineiramente. 1 2 3 4 5

11 Eu geralmente estou depressiva. 5 4 3 2 1

12 Eu tenho ansiedade freqüentemente. 5 4 3 2 1

13 Sinto que a maioria das coisas que acontecem comigo estão fora do meu controle.

5 4 3 2 1

14 Estou satisfeita com a freqüência de minhas relações sexuais. 1 2 3 4 5

15 Atualmente, eu sinto desconforto físico ou dor durante a relação sexual.

5 4 3 2 1

16 Acredito que não tenho controle sobre minha saúde física e corporal. 5 4 3 2 1

17 Tenho orgulho das minhas realizações profissionais 1 2 3 4 5

18 Considero minha vida estimulante. 1 2 3 4 5

19 Continuo a estabelecer novos objetivos pessoais para minha vida. 1 2 3 4 5

20 Tenho esperança de que coisas boas acontecerão na minha vida. 1 2 3 4 5

21 Eu me sinto fisicamente bem (saudável). 1 2 3 4 5

22 Eu me sinto em boa forma física. 1 2 3 4 5

23 Continuo a estabelecer novos objetivos profissionais para mim. 1 2 3 4 5

95 ANEXO 1 – CERTIFICADO FINAL DA AVALIAÇÃO DO PROJETO PELO COMITÊ

DE ÉTICA EM PESQUISA DO HOSPITAL UNIVERSITÁRIO ONOFRE LOPES –

CEP-HUOL

96 ANEXO 2 – TERMO DE CONCESSÃO E ACEITAÇÃO DE APOIO FINANCEIRO À

PROJETO DE PESQUISA

97

ANEXO 3 – RESUMOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS

RESUMOS SUBMETIDOS AO I SIMPÓSIO NACIONAL EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS BÁSICAS E APLICADAS: FRONTEIRAS DO CONHECIMENTO E

POLÍTICAS DE INOVAÇÃO

99

ANEXO 4 – VALORES DE REFERÊNCIA PARA AS DETERMINAÇÕES

BIOQUÍMICAS NO SANGUE

PARÂMETROS

VALOR DE REFERÊNCIA

Alanina aminotransferase (ALT) 30 –65U/L

Albumina 3,5 – 5,2 g/dL

Aspartato aminotransferase (AST) 15 –37U/L

Cálcio Ionizado (CaI) 4,6 – 5,3 mg/dL

Cálcio Total 8,6 – 10,2 mg/dL

Colesterol Desejável < 200 mg/dL

Limítrofe Alto – 200 – 239 mg/dL

Alto > 239 mg/dL

Creatinina Mulher – 0,6 - 1,1 mg/dL

Fosfatase alcalina Mulher 20-50 anos – 42 - 98 U/L

Fósforo 2,5 a 4,5 mg/dL

Gama Glutamil Transferase 05 –55U/L

Glicose 74 – 100 mg/dL

Hormônio Folículo Estimulante (FSH) Mulher

Fase Folicular – 1,4 – 9,9 mUI/dL

Pico no meio do ciclo – 0,2 – 17,2 mUI/mL

Fase Lútea – 1,1 – 9,2 mUI/mL

Pós-menopausa – 19,3 – 100,6 mUl/mL

LDL-c Ótimo < 100 mg/dL

Próximo/acima do ótimo – 100 - 129 mg/dL

Limítrofe alto – 130 – 159 mg/dL

Alto – 160 – 189 mg/dL

Muito Alto > 189 mg/dL

Magnésio 1,6 – 2,1 mg/dL

Proteínas totais 6,4 – 8,3 g/dL

Triglicerídeos Normal < 150 mg/dL

Alto – 150 – 199 mg/dL

Hitrigliceridemia - 200 – 499 mg/dL

Muito Alto > 499 mg/dL

Uréia 15 – 40 mg/dL

FONTE: BURTIS, 2008.

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