Infiltrado celular e lesões cutâneas na orelha de cães naturalmente infectados

por Leishmania infantum

Cellular infiltrate and cutaneous lesions in the ear of dogs naturally infected with

Leishmania infantum

Társsila Mara Vieira FERREIRA1, Stephanie Caroline Bezerra SOUZA2, Emmanuel

Teles SALES1, Camila Goersh BARROSO1, Belarmino Eugênio LOPES-NETO1,

Virgínia Cláudia Carneiro GIRÃO3, Diana Célia Sousa NUNES-PINHEIRO4

1 Médico Veterinário e Pós-graduando do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV). Faculdade de Veterinária (FAVET), Universidade Estadual do Ceará (UECE). 2Graduando em Medicina Veterinária / FAVET/ UECE, stephaniebezerra12@hotmail.com. 3Professora do Programa de Pós-graduação em Ciências Morfofuncionais. Universidade Federal do Ceará (UFC). 4 Professora do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias e Graduação em Medicina Veterinária. FAVET/ UECE. Av.Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza-CE. CEP:60.714-903.

RESUMO

A pele é o sítio de entrada de muitos patógenos, dentre eles o protozoário

Leishmania infantum, que é inoculado por meio da picada de vetores flebotomíneos

infectados. A infecção induz a uma resposta imune cutânea, resultando no

recrutamento de células imunes e liberação de mediadores inflamatórios o que pode

levar ao desenvolvimento de alterações na pele. O objetivo desse estudo foi

caracterizar o padrão celular inflamatório e as lesões cutâneas presentes na orelha

de cães naturalmente infectados por L. infantum. Para tanto, cães (n=18)

naturalmente infectados por L. infantum foram subdivididos, com base na presença

ou ausência de lesões cutâneas na orelha, em grupo sintomático (SD, n = 12) e

grupo assintomático (AD, n = 6), respectivamente. Cinco cães não infectados (CD)

foram incluídos como controle. As amostras de biópsias de pele foram coletadas do

terço superior da orelha e processadas por histologia de rotina, coradas por HE e

azul de toluidina, e imunoistoquímica. A dermatite ulcerativa e alopecia foram as

dermatopatias mais frequentes nos cães. A maioria dos fragmentos apresentou

intensidade inflamatória discreta a moderada com distribuição multifocal do infiltrado

celular na derme superficial e profunda, composto principalmente por macrófagos,

plasmócitos e linfócitos. Observaram-se correlações e influências positivas

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moderadas do processo inflamatório sobre a alopecia e dermatite ulcerativa,

respectivamente. Presença discreta dos mastócitos foi observada nos cães

naturalmente infectados, havendo maior expressão de mastócitos em SD com

infiltrado intenso e AD sem infiltrado celular. Nesse contexto, concluiu-se que na

leishmaniose canina, o infiltrado celular inflamatório influencia diretamente no

aparecimento de lesões cutâneas na pele, tais como dermatite ulcerativa e alopecia,

contudo não foi observada associação entre os mastócitos e a evolução clínica

dessa enfermidade.

Palavras-chave: Leishmaniose visceral canina, aspectos dermatológicos, pele da

orelha, sistema imunológico cutâneo, inflamação.

Keywords: Canine visceral leishmaniasis, dermatological aspects, ear skin,

cutaneous immune system, inflammation.

1. Introdução

A pele corresponde a primeira barreira de defesa física e imunológica à

entrada de substâncias ambientais e microorganismos potencialmente prejudicais

ao organismo. A epiderme e a derme estão relacionadas com o sistema imune

cutâneo através das células imunes especializadas presentes, que são

responsáveis por iniciar e regular a resposta imunológica a fim de restaurar e manter

a homeostase da pele (NESTLE et al., 2009; PASPARAKIS et al., 2014).

Esse tecido está em constante agressão pelos antígenos exógenos que

podem desregular a resposta imunológica e levar ao desenvolvimento de reações

inflamatórias. A invasão dos antígenos na pele causa dano tecidual, promovendo a

ativação das células residentes na epiderme, como os queratinócitos e as células de

Langerhans, através do reconhecimento de padrões moleculares associados ao

dano (DAMPs) e proteínas moleculares associadas aos patógenos (PAMPs). A

interação entre os PAMPs e os receptores toll-like (TLRs) expressos nessas células

estimulam a liberação de citocinas, incluindo o fator de necrose tumoral (TNF-ɑ ) e

quimiocinas pró-inflamatórias, as quais promovem a ativação e o recrutamento de

células efetoras, como as células dendríticas, os mastócitos, os macrófagos, os

monócitos e as células linfóides, para o sítio da infecção. Então, um processo

inflamatório se estabelece no local promovendo alterações teciduais (NESTLE et al.,

2009; PASPARAKIS et al., 2014; BELKAID & TAMOUTOUNOUR, 2016).

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Na leishmaniose canina, o envolvimento cutâneo possui grande importância

uma vez que a infecção inicia-se nesse órgão através da picada de vetores

flebotomíneos. Esses agentes transmissores promovem dano à barreira cutânea por

meio da injeção intradérmica da probóscide a fim de inocular as formas

promastigotas correspondente ao estágio infectante do protozoário L. infantum, cujo

é parasita intracelular do sistema fagocítico mononuclear (PAPADOGIANNAKIS &

KOUTINAS, 2015; SCOTT & NOVAIS, 2016).

Tendo em vista a importância da pele como porta de entrada de patógenos e

as manifestações clínicas dermatológicas nos cães com leishmaniose, esse estudo

visa caracterizar o padrão celular inflamatório e as lesões cutâneas presentes na

orelha de cães naturalmente infectados por L. infantum.

2. Metodologia

Cães adultos (n=23) capturados pelo Centro de Controle de Zoonoses em

Fortaleza (Ceará, Brasil), foram incluídos nesse estudo. O diagnóstico de

Leishmaniose Visceral Canina (LVC) foi baseado no teste rápido DPP LVC Bio-

Manguinhos® associado ao teste sorológico ELISA. Dezoito cães naturalmente

infectados por Leishmania infantum foram subdivididos, com base na presença ou

ausência de alterações clinico-dermatológicas na orelha, em: grupo assintomático

(AD, n = 5), sem lesões cutâneas; e grupo sintomático (SD, n = 13), com lesões

cutâneas, incluindo alopecia, descamação, eritema, edema, despigmentação,

hiperqueratose, liquenificação, úlceras e crostas. Cães sem manifestações clínico-

dermatológicas e que apresentaram resultados negativos nesses testes foram

considerados não infectados e incluídos como o grupo controle (CD, n = 5).

Os cães foram anestesiados e eutanasiados, em seguida amostras de tecido

da pele foram colhidas do terço superior da orelha, íntegra ou com lesões. Quanto

aos cães do grupo controle, o local biopsiado foi anestesiado com lidocaína a 2% e

realizada a colheita do fragmento da orelha.

As amostras coletadas foram fixadas em formalina tamponada a 10%, e

posteriormente submetidas ao processamento histológico e imunohistoquímico. Os

cortes histológicos foram corados pelas técnicas rotineiras de Hematoxilina e Eosina

(HE) para análise das alterações histológicas e Azul de Toluidina para identificação

dos mastócitos. Foram avaliados o grau de infiltração celular (ausente, discreta,

moderada e intensa) na derme e o tipo do infiltrado, bem como a intensidade de

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coloração de mastócitos (ausente, discreta, moderada e intensa). Secções cutâneas

foram imunomarcadas para formas amastigotas de L. infantum cuja intensidade de

coloração foram classificadas em nenhuma, leve, moderada e intensa. As análises

foram realizadas sob um microscópio óptico com aumento de 200x.

As análises foram realizadas no programa estatístico computacional

GraphPadPrism 5.0. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão,

adotando um nível de significância de p < 0,05. As alterações clínicas foram

expressas em percentagem. O infiltrado inflamatório e as alterações dermatológicas

foram classificados em escores: 0 (ausente), 1 (discreto), 2 (moderado) e 3

(intenso), para aplicação do teste de correlação de Spearman (ρ).

O protocolo experimental foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em

Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual do Ceará (UECE) sob protocolo

nº6459434/2015.

3. Resultados e Discussão

Os achados clínicos dermatológicos na orelha são mostrados nas Figuras 1

e 2. Entre as lesões cutâneas, dermatite ulcerativa e alopecia foram as

dermatopatias mais frequentes nos cães, observadas em 44,4% (8/18) e 61,1%

(11/18) dos animais respectivamente (Fig. 2). Todos os sinais clínicos

dermatológicos observados para SD foram relatados para cães infectados por L.

infantum (REIS et al., 2009; SARIDOMICHELAKIS & KOUTINAS, 2014).

A maioria dos fragmentos de orelha dos cães SD apresentou intensidade

inflamatória moderada a intensa (Fig.3C e 3A). A reação inflamatória foi

caracterizada por um infiltrado celular com distribuição multifocal na derme

superficial e profunda composto por células mononucleares como macrófagos,

plasmócitos e linfócitos. Neutrófilos e hemácias extravasculares também foram

observados nesse cenário. Foram detectadas amastigostas de L. infantum

imunomarcadas em SD e AD (Fig. 4). Esses achados consistem com estudos

realizados previamente associando o parasitismo cutâneo e o padrão inflamatório na

derme da orelha de cães com leishmaniose visceral (DOS-SANTOS et al., 2004;

GIUNCHETTI et al., 2006; FIGUEIREDO et al., 2010; MENEZES-SOUZA et al.

2012).

Também verificamos correlações (ρ = 0.31 e ρ = 0.33) e influências positivas

moderadas (y = 0.57 + 0.4x e y = 0.34 + 0.24x) do processo inflamatório sobre a

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alopecia e dermatite ulcerativa, respectivamente (Fig. 5). A infecção da pele por L.

infantum promove o recrutamento de células inflamatórias, que por sua vez liberam

mediadores que podem estar envolvidos com o desenvolvimento das alterações

cutâneas. Desse modo, a infiltração celular dérmica pode ser identificada em maior

intensidade em cães com infecção clínica, ou seja, que apresentam lesões

dermatológicas em decorrência do progresso da infecção (GIUNCHETTI et al., 2006;

MOREIRA et al. 2013, PAPADOGIANNAKIS & KOUTINAS, 2015).

Quanto à presença de mastócitos, foi observada uma intensidade de

coloração discreta nos cães naturalmente infectados (Fig. 3) quando comparado ao

CD (dado não mostrado) (MENEZES-SOUZA et al., 2012). Por outro lado, SD com

infiltrado intenso (Fig. 3B) e AD sem infiltrado celular (Fig. 3H) apresentaram uma

maior expressão de mastócitos em relação aos outros animais (Fig. D e F).

Resultado contraditório evidenciando uma maior expressão dessas células foi

relatado em outro estudo (CALABRESE et al.,2010).

Os mastócitos estão localizados ao redor dos pequenos vasos na pele e

atuam como células sentinelas contribuindo efetivamente na resposta imune inata à

parasitas. Na leishmaniose cutânea, a expressão tecidual dos mastócitos pode

variar em detrimento do perfil de citocinas no microambiente da infecção e espécies

diferentes de Leishmania spp. (TUON et al., 2008; ROMÃO et al., 2009; MENEZES-

SOUZA et al., 2012). Eles estão entre as primeiras células que interagem com o

protozoário Leishmania spp., liberando mediadores inflamatórios que estimulam a

inflamação e citocinas que modulam a imunidade mediada por células específica ao

patógeno. Nesse contexto, os padrões de citocinas liberados pelos mastócitos

variam de acordo com o seu estímulo de ativação (Kritas et al., 2013; Rodríguez &

Wilson, 2014).

4. Conclusão

Na leishmaniose canina, o infiltrado celular inflamatório influencia

diretamente no aparecimento de lesões cutâneas na pele, tais como dermatite

ulcerativa e alopecia, contudo não foi observada associação entre mastócitos e a

evolução clínica dessa enfermidade. Desse modo, faz-se necessário estudar a

participação dos mediadores liberados pelos mastócitos no microambiente avaliado.

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Figura 1. Lesões macroscópicas na orelha de cães com leishmaniose visceral. A,

orelha sem lesões; B, C, E e F, alopecia; B e D, úlceras; C, eritema e crostas; E,

liquenificação; F, úlceras, hiperpigmentação e crostas.

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Figura 2. Aspectos clínicos e dermatológicos da pele de orelha de cães naturalmente

infectados por Leishmania infantum .

33,3

44,4

11,1

5,6

61,1

5,6

5,6

5,6

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0

Dermatite crostosa

Dermatite ulcerativa

Dermatite esfoliativa seca

Deratite eritematosa

Alopecia

Hiperpigmentação

Liquenificação

Edema

Porcentagem (%)

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Figura 3. Imagens histológicas da pele da orelha de cães com leishmaniose visceral.

A e B, cães sintomáticos (SD) com infiltrado inflamatório intenso (I.I.); C e D, cães

sintomáticos (SD) com infiltrado inflamatório moderado (I.M); E e F, cães

sintomáticos (SD) com infiltrado inflamatório discreto (I.D.); G e H, cães

assintomáticos (AD) sem infiltrado celular infalmatório (I.C). HE 200x, A,C, E e G; AT

(Azul de Toluidina) 200x B, D, F e H.

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Figura 4. Imunohistoquímica da pele da orelha de cães com leishmaniose. A e C,

fotomicrografia dos cães assintomáticos (AD) sem infiltrado celular (I.C.) e discreta

coloração para Leishmania infantum+, respectivamente; B e D, fotomicrografia dos

cães sintomáticos (SD) com infiltrado inflamatório moderado (I.M) e moderada

coloração para L.infantum +, respectivamente. HE 200x, A e B; Estreptoavidina-

peroxidase contra-corada com Hematoxilina de Mayer, 200x, C e D.

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Figura 5. Alterações clínicas dermatológicas, alopecia (A) e dermatite ulcerative (B),

e o infiltrado celular inflamatório. Os índices de correlação de Spearman (valores ρ)

são mostrados nos gráficos.

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