Imunohometerapia Prática

Reagentes: Bormelina (Dilunet 1) - É uma enzima proteolítica, que induz uma redução na carga

electrolítica da superfície dos glóbulos vermelhos, possibilitando a aglutinação. É utilizada nas preparações de suspensões de eritrócitos para determinação do grupo sanguíneo e como aditivo em testes enzimáticos com eritrócitos não tratados para detecção de anticorpos e provas reversas.

Reagente de Liss (Diluent 2) – Solução de baixa força iónica que ajuda a melhorar as reacções antigénio-anticorpo. Princípio do teste – Este método baseia-se na porosidade do gel, isto é quando há formação de complexos antigénio-anticorpo, ocorre a situação de formação de precipitado no topo do gel, sendo o teste positivo. Quando não ocorre formação de imuno complexos os eritrócitos formam um botão e depositam-se no fundo do poço, considerando-se a prova negativa.

1º Passo na chegada ao laboratório: - Retirar do frigorífico as células comercialmente disponíveis e os reagentes 1 e 2. Preparação das suspensões: Tubo 1 – 500 μl de diluente 1 + 25 μl de concentrado de eritrócitos Tubo 2 – 1000 μl de diluente 2 + 10 μl de concentrado de eritrócitos Tubo 3 – soro do paciente

Como efectuar a leitura dos tubos:

Teste positivo Teste negativo

Numeração no fundo do card – refere-se á intensidade da positividade do teste vai de 1 a 4.

Para transfusões – 1ª Opção é sangue isogrupal - 2ª Opção é sangue O neg. Do pequeno saco que está colocado antes do saco de transfusão, que contém cerca de 20 ml são retirados quatro tubos piloto para as seguintes análises: - ABO/Rh - Ácidos Nucléicos - Serologia - Seroteca

Quando falamos de antigénio D falamos de factor Rh, sendo o fenótipo do Rh descrito pelas letras DCE.

Prova celular – Vamos pesquisar anticorpos pois o gel possui antigénios. Prova sérica (Card reverse) – Vamos pesquisar anticorpos porque as células que vamos pôr nos microtubos são “antigénios” conhecidos. Células + Bromelina – Pesquisa de anticorpos, logo o tubo tem antigénios. Antigénio K - É o antigénio mais imunogénico a seguir ao Rh. - Causa reacções de hemólise. - Só ± 9% da população é K+. Cards de Liss –Sempre que é utilizado o reagente de liss temos que incubar o

card, para haver ligação antigénio – anticorpo, pois os 37C simulam a temperatura corporal. 1 gota = ± 50 μl nos frascos de reagente. Card ABO/Rh - Pretende-se determinar o grupo sanguíneo ABO e Rh através da pesquisa de antigénios respectivos no sangue. TAD ou Coombs Directa - Consiste em fazer reagir eritrócitos com o soro de antiglobulina humana. - Anticorpos fixados aos eritrócitos. PAI ou Coombs Indirecta - Consiste na pesquisa de anticorpos no soro do doente.

Determinação grupo ABO/RH 1 -Colocar 50 μl do tubo 1 em cada microtubo. 2 -Centrifugar durante 10 minutos em centrifuga própria. 3 -Ler o resultado

Prova reversa (ou prova sérica) + Coombs Directa 1 - Colocar nos microtubos identificados com A1, A2, B e O, 50 μl (1 gota) de células comercialmente disponíveis + 50 μl do tubo 3 em cada um dos mesmos. 2 -Nos microtubos identificados com I e II colocar 50 μl do tubo 2

3 - Levar a o card a encubar durante 15 minutos a 37º. 4- Centrifugar durante 10 minutos 5 – Ler resultados

Determinação do Fenótipo RH 1 – 10 μl do tubo 1 em cada micro tubo 2 - Centrifugar durante 10 minutos 3 – Ler resultados

Coombs Indirecta

1 – Colocar para o P1 as células comercialmente disponíveis identificadas como 1, 2 e 3, 50 μl das mesmas células (1 gota) + 25 μl do tubo 3. 2 – Repetir o mesmo processo para o paciente dois (P2 e respectivo soro) ou então confirmar a prova do paciente 1. 3- Incubar 15 minutos a 37º.

4- Centrifugar durante 10 minutos. 5 – Ler resultados.

Prova de Coombs directa Positiva

Prova de Coombs directa é utilizada em: - Preparação de transfusões ao doente que a irá receber; - Doença Homolítica do recém-nascido; - Reacções transfusionais; - Anemias hemolíticas auto-imunes.

Coombs directa “à antiga”

Colocar nos microtubos I; II; III e IV, 50µl (1 gota) de células comercialmente disponíveis.

Nos microtubos identificados com VP e VIP deitar 50µl de células do doente suspensas em diluente 2.

50 µl do soro do doente

Incubar 15’ a 37°C.

Centrifugar 10’

Ler os resultados

Complete Cross Match Amostra: Suspensão a 0,8% de células com diluente 2 E soro ou plasma do recetor Card ID Complete Crossmatch

Além de tudo isto fazer ainda para o recetor: ABO; Rh; Fenótipo Rh; C.I.; C.D.; Reversa (as amostras devem ser centrifugadas a 3500 rpm 5/10 minutos)

Na ausência doCard Complete Crossmatch fazer: Para doente e dador:

ABO; Reversa; Rh; Fenótipo Rh; C.D.; C.I.

Card Liss; Card Enz. Suspensão em D2 – Para as transfusões

Dispensar 50 µl para card Liss e para card Enz. + 25 µl de soro do doente - Deste modo não temos confirmação do ABO.

Dador

Recetor

NaCl/ Enz

AHG AHG

1 2 3 4 5 6

Auto-controlo C.D.

50µl suspensão do daodr em diluente 2 nos tubos 1, 2, 3, 4 e 5

+ 50 µl suspensão do recetor em diluente 2 nos tubos 1, 2, 3 e 6

+ 25 µl de soro do recetor nos tubos 4, 5 e 6

+ 25 µl de diluente 1 nos tubos 1, 2, 3 e 4

Incubar 10 - 15 minutos a 37°C. Centrifugar

Ler resultados

O Card tem de dar um resultado

negativo

Mães e Filhos Para a Mãe fazer: Cards: ABO/Rh e Coombs directa Para os Filhos fazer: Car Newborn

Quando não há o Card Newborns para o filho fazer: Card ABO normal e Coombs directa também normal.

Coombs indirecta positiva (PAI) Pesquisa de Anticorpos

Card Liss/Coombs

Card Enzymes

Em seguida deve fazer-se o painel de 11 células em Liss/Coombs e Card Enzyme.

Colocar 25µl do tubo 3 + 1 gota de células comercialmente disponíveis . Incubar 15 minutos a 37°C. Centrifugar e ler resultados.

50 µl (1 gota) tubo 2 + Nos microtubos 1, 2, 3, 4 e 5 – 25 µl de diluente 1

1 2 3 4 5 6

Incubar 10 minutos a temperatura ambiente

Centrifugar e ler resultados

Serve para aumentar a adesão

50 µl do tubo 3 + 1 gota células comercialmente disponíveis Incubar 15 minutos a 37°C. Centrifugar e ler resultados