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Texto traduzido e impresso com a autorizaçao do Elsevier Science de Biomaterials (anteriormente Clinical Materials), 7, (3), 1986: 221-224

Formaldeído residual em materiais esterilizados por vapor de formaldeído

P. Vink Plastics and Rubber Research Institute, TNO, Caixa Postal 71, 2600 AB DELFT, Holanda (Recebido em 12 de novembro de 1984, revisado em 15 de julho de 1985) Foram determinadas as quantidades de formaldeído e paraformaldeído presentes nos materiais poliméricos, após a esterilização por formaldeído em vapor em um esterilizador comercial. As quantidades consideráveis de resíduos foram detectadas em copolímero de álcool de vinila etileno (EVOH), poliamida-6 (PA-6) e borracha natural (NR). Todos esses polímeros possuem um ângulo relativamente pequeno de contato com a água, mostrando que a capacidade de umedecimento de um material é um importante parâmetro para determinar a quantidade de resíduos. No teste de HFL (um teste de determinação de toxicidade aguda), o resíduo presente nos filtros de EVOH e PA-6,6 mostrou ser tóxico. Isso foi uma indicação de que é necessária uma investigação mais completa sobre as possíveis conseqüências toxicológicas do uso de materiais esterilizados por formaldeído em vapor. Palavras-chave: Esterilização, formaldeído em vapor, EVOH, poliamida-6, formaldeído residual, toxicidade, borracha natural, ângulo de contato. Em vários países, os produtos para aplicação médica, que contêm materiais sensíveis ao calor, são esterilizados por formaldeído em vapor em vez de óxido de etilieno. Esse método de esterilização é o escolhido, porque comparado com o óxido de etileno, esse processo de esterilização é mais seguro, pois algumas misturas de ar/óxido de etileno explodem com facilidade. Além disso, o nível de detecção do formaldeído, através do olfato, é muito menor que o do óxido de etileno, por isso as irregularidades de processo serão detectadas com maior antecedência. Na literatura, vários acidentes também foram registrados com o uso de produtos esterilizados com óxido de etileno. Esses materiais obviamente foram aerados por um período de tempo muito curto1-5. De acordo com Handlos,6 nenhum acidente dessa natureza foi registrado nos últimos 20 anos, quando o processo de formaldeído em vapor foi utilizado para a esterilização de produtos. Contudo, os resíduos de formaldeído foram observados em produtos após a esterilização6-12; as quantidades, entretanto, dependeram do tipo de material. Por exemplo, uma quantidade considerável foi encontrada em fibras de poliéster, papel de filtro e poliamidas. De acordo com Handlos6-9, a quantidade de resíduos também depende muito dos parâmetros de processo. É de especial importância o fato de a limpeza a vapor ser realizada ou não para purificar as amostras esterilizadas.

Ficou demonstrado7 que o formaldeído residual ocorreu como um formaldeído monomérico absorbido e também como paraformaldeído absorbido. A presença desse último explica os altos níveis de resíduos observados após vários meses de armazenamento12. O paraformaldeído pode se formar em superfícies úmidas, pois o formaldeído se dissolve na água absorbida, produzindo o hidrato polimérico. Após a desidratação, conforme a água evapora na fase de vácuo subsequente, o paraformaldeído se precipita. Se essa explicação estiver correta, os polímeros hidrofílicos se tornam materiais hidrofóbicos. Isso significa que a capacidade de umedecimento de um material, que é uma medição de sua natureza hidrofóbica/hidrofílica, será um parâmetro importante na determinação da quantidade de resíduos. Realizamos um amplo estudo sobre os efeitos do óxido de etileno-γ, formaldeído em vapor e esterilização por vapor sobre as propriedades de um grande número de materiais poliméricos. Nesse documento, serão discutidos os resultados da investigação sobre a relação entre a quantidade de resíduos de formaldeído e o ângulo de contato com água. O ângulo de contato pode ser considerado uma medição da capacidade de umedecimento. Além disso, são fornecidos os resultados da determinação

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de toxicidade aguda dos resíduos encontrados. As conseqüências toxicológicas, causadas pela presença dos resíduos de formaldeído nos produtos usados para as aplicações biomédicas, ainda não foram solidamente estabelecidas. Muitos trabalhos foram realizados sobre os efeitos na saúde causados pelo formaldeído transportado pelo ar, resultando na determinação de limites de exposição ocupacional em vários países.13 Entretanto, ainda não foi estabelecido nenhum limite para o formaldeído residual nos materiais esterilizados por formaldeído em vapor. EXPERIMENTAL Esterilização por formaldeído em vapor A esterilização por formaldeído em vapor foi realizada em uma autoclave comercial, tipo Motoclave SDA-PPK (British Sterilizer Company Ltd), no Central Sterilization Department do Hospital Universitário de Leiden, Holanda. O processo iniciou com a remoção do ar da câmara de esterilização (700 I), com uma evacuação de 6,7 a 10,7 kPa (50 a 80 mmHg), enquanto que ao mesmo tempo o vapor era injetado. Uma quantidade medida (70 ml de CH2O a 40%) de formalina foi, então, introduzida no tubo de vaporização. O vapor foi admitido na câmara através do tubo de vaporização até atingir a temperatura de operação (cerca de 73 ºC). A pressão da câmara foi, então, reduzida para um valor mais baixo do alcançado no estágio de remoção do ar, porque a descompressão foi feita sem o fluxo de vapor. Após a descompressão, foi realizada outra introdução de formalina e, dessa forma, a seqüência dos eventos foram repetidas. Foram introduzidas, no mínimo, 8 ondas de pressão. Todas as ondas de pressão foram completadas (ou seja, com a total descompressão e a indução final de formalina) antes do inicio do estágio da esterilização real. Durante o tempo de esterilização (30 minutos), a válvula de admissão de vapor foi regulada por um controlador de temperatura, para garantir uma constante temperatura na câmara. Ao final do estágio de esterilização, o material condensado, que tinha permanecido na câmara, foi removido por evacuação. Um fluxo de vapor foi novamente admitido na câmara por 20 minutos, enquanto que, ao mesmo tempo, a pressão era reduzida para cerca de 8 kPa (60 mmHg). Então, o ar estéril foi admitido na câmara por 2 minutos a um índice que a temperatura da câmara pudesse atingir a pressão atmosférica. Após a

interrupção da entrada de ar, o vapor foi admitido por 6 minutos, enquanto que a pressão foi reduzida para 8 kPa. Os processos de admissão de ar, descompressão e injeção de vapor foram repetidos por 5 vezes. Finalmente, o ar foi admitido na câmara até que atingisse a pressão atmosférica. As amostras foram embaladas separadamente em sacos de papel laminado de PE/PP (DRG Hospital Supplies). Análise do formaldeído residual O formaldeído foi determinado como 2,4-dinitrofenilidrazona pela cromatografia líquida de alta performance (HPLC), de acordo com o método descrito para a separação e qualificação de misturas de composto de carbonila alifática14, 15. Uma amostra esterilizada foi separada com 25 ml de uma solução de NaOH 0.2M em etanol, por 18 horas à temperatura ambiente. Sob essas condições, os resíduos de formaldeído foram determinados como a concentração total de formaldeído monomérico e paraformaldeído.9 Após a separação, 10 ml da solução de 1 g de 2,4-dinitrofenilidrazona em HCI 1l 2N foram adicionados, e a mistura foi aquecida a 60 ºC por cerca de 5 minutos. Após ser resfriada para a temperatura ambiente, a solução foi decantada em um balão volumétrico de 50 ml e acetonitrila foi adicionada para completar o volume. Dessa solução, 8µl foram injetados em uma coluna de HPLC. Condições cromatográficas. Aparelho: Perkin-Elmer Série 3B; coluna: Perkin-Elmer/HS-3 C18, 10 cm de comprimento com diâmetro de 4,6 mm; solvente: acetonitrila/água (70/30); índice de fluxo: 2 ml/min.; injeção: 8 µl em loop de injeção de 6 µl; detecção: detector u.v. LC-85 a 340 nm. Sob essas condições, o tempo de retenção da 2,4-dinitrofenilidrazona do formaldeído foi de 0,91 minutos. Para fins de calibração foram usadas soluções-padrão de formaldeído e paraformaldeído. Sob as condições usadas, a hidrazona não se formou quantitativamente, mas cerca de 72%, sim. Essa conclusão está em conformidade com os resultados de Selim14. Medições do ângulo de contato O ângulo de contato dos materiais poliméricos com a água foi determinado pela técnica de bolhas presas, de acordo com o método descrito por Hamilton16.

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As amostras foram colocadas sobre uma base de teflon e presas por meio de graxa de silicone. Essa montagem foi colocada de cabeça para baixo em uma cubeta, e a água, adicionada em dupla destilação. As bolhas de ar foram introduzidas na superfície do material imerso, usando uma seringa de microlitro equipada com uma agulha em forma de U. As bolhas foram observadas através de um microscópio equipado com um retículo de fios cruzados. O diâmetro e a altura das bolhas de ar, que eram de aproximadamente 0,2 µl de volume para evitar os efeitos de flutuação, foram medidos em um micrômetro, o qual manipulou o estágio de suspensão da cubeta. A partir dessas dimensões, o ângulo de contato foi calculado16. Teste de determinação de toxicidade✝ A toxicidade aguda das amostras esterilizadas foi determinada por um teste, no qual foram usados fibroblastos de pulmões de feto humano (células de HFL). Nesse teste, o qual será descrito com mais detalhes em outra parte do documento17, as células de HFL foram incubadas em bandejas de microtitulação em um meio, no qual foram adicionadas amostras, medindo cerca de 1 x 2 x 2 mm. O meio foi o Meio Essencial Mínimo de Eagle com sais de Earle, complementado com soro fetal de bezerro a 10%, 2 mm de glutamina, aminoácido não-essencial a 1%, 50 mg/1 de estreptomicina e 50 mg/1 de penicilina G. Os componentes tóxicos lixiviáveis alteram a morfologia do crescimento das células de HFL. O estado das monocamadas celulares foi visualmente analisado a 24, 48 e 72 horas após o início da incubação; as monocamadas foram observadas sob um microscópio invertido em ampliações de 40 x e 100 x. A condição das células foi registrada da seguinte maneira: pontuação 0, nenhum efeito tóxico observável, morfologia normal dos fibroblastos, células alongadas com o processo; pontuação 1, estado intermediário; pontuação 2, claro efeito de toxicidade, células arredondadas ou com lise. Os resultados das três observações foram reunidos para dar uma pontuação na faixa de 0 (nenhum efeito de toxicidade observável) a 6 (efeito máximo observável). O índice de toxicidade é a média das pontuações das cinco repetições. Um controle negativo (um meio no qual não é adicionada nenhuma amostra) estava presente em cada série de experimento; um controle positivo foi usado, ou seja, um meio que continha uma amostra de borracha natural.

✝ Este teste foi desenvolvido pelo Dr. R. N. P. Berkovits e P. Wildervanck de Blécourt, ambos associados do Hospital Universitário de Roterdã. O teste foi posteriormente desenvolvido e realizado pelo Sr. P. B. Davis, Division of Technology for Society TNO.

Materiais pesquisados As pesquisas foram realizadas com os seguintes materiais: (i) Copolímero de álcool de vinila etileno (EVOH,

Kuraray EVAL EP-E: teor de álcool vinílico: 65%), película de 50 µm de espessura;

(ii) Borracha natural (NR, FM 114), conector de 1,7

mm de espessura; (iii) Poliamida-6 (PA-6, Akulon K 136), película de 50

µm de espessura; (iv) Poliamida-6,6 (PA 6,6), material de filtro fibroso; (v) Polietileno (PEAD , Stamylan 8109), lâmina de 500

µm de espessura; (vi) Tereftalato de polietileno (PETP, Arnite A04-302),

película de 50 µm de espessura; (vii) Poli(vinil cloreto) plastificado (PVC WE 8576 VN),

plastificante; ftalato de di-2-etilexil a 25%, película de 450 µm de espessura;

(viii) Poli(vinilideno cloreto) (PVDC, IXAN WV 377),

película de 52 µm de espessura. RESULTADOS E DISCUSSÕES As quantidades totais de formaldeído monomérico e paraformaldeído, que foram determinadas nas pesquisas de materiais, encontram-se na Tabela 1. Por ser esperado que a maioria dos resíduos ocorra como paraformaldeído na superfície do material, a quantidade de resíduos é dada com relação à superfície das amostras pesquisadas. A maior concentração de formaldeído residual foi encontrada no EVOH - cerca de 2,9 µg/cm2. Quantidades menores, porém ainda consideráveis foram detectadas no NR e PA-6. Pequenas ou nenhuma quantidade foi detectada no PEAD, PETP, PVC e PVDC. Os resultados das medições do ângulo de contato também encontram-se na Tabela 1. Pequenos ângulos de contato de cerca de 44 a 45° foram medidos para o EVOH e PA-6. Para o NR, o ângulo de contato pareceu ser inicialmente de 90°, porém 10 minutos após o material ter entrado em contato com a água, o ângulo de contato diminuiu para cerca de 30°. Para os outros materiais, o ângulo de contato pareceu ser consideravelmente maior. Com isso, os materiais que tiveram um ângulo de contato relativamente pequeno parecem conter uma considerável quantidade de formaldeído residual. Portanto, nossas conclusões apoiam a idéia de que o paraformaldeído é formado durante a esterilização em superfícies úmidas,

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indicando que os materiais hidrofílicos conterão paraformaldeído residual. Ao contrário de nossas conclusões, Handlos8-9 detectou uma quantidade relativamente alta de resíduos no PETP, porém, na verdade, ele pesquisou um material fibroso, enquanto nós estudamos materiais em filme. O ângulo de contato de cerca de 65° para o PETP é um pouco pequeno, mas não tão pequeno quanto o de materiais como o EVOH e PA-6. Esses resultados sugerem que, em materiais com tal ângulo de contato intermediário, quantidades consideráveis de paraformaldeído somente se formarão se a superfície específica for muito grande. Isso será compreensível, se a dissolução do formaldeído na água absorbida for decisiva para a formação de formaldeído residual. Em geral, essa conclusão indica que a quantidade de resíduos formada dependerá não somente da capacidade de umedecimento da amostra esterilizada, como também de seu formato. Essa conclusão é reforçada pelo resultado dos testes de toxicidade, que também podem ser encontrados na Tabela 1. Isso demonstra que um efeito tóxico foi observado para o EVOH, que continha uma quantidade de resíduos de formaldeído de 2,94 µg/cm2, enquanto que nenhum efeito tóxico foi observado para o PA-6, que continha 0,37 µg/cm2. Tabela 1. Resíduos de formaldeído e índice de toxicidade dos

materiais após a esterilização por formaldeído em vapor.

Índice de

toxicidadea após

aeração para:

Material Espessura da

amostra (µm)

Ângulo de contato

antes da esterilização

(*)

Formaldeído residual 13 dias após a esterilização

(µg/cm2)

1 d 13 dEVOH 50 43,8 2,94 6 6 NR 1700 90 - 30 0,74 - -b PA-6 50 45,5 0,37 0 - PA-6,6 Fibra - - 6 0 PEAD 500 85,2 0,00 0 - PETP 50 65,5 0,09 0 0 PVC 700 94,9 0,02 0 0 PVDC 52 63,6 0,07 0 -

a Pontuação 0: nenhum efeito tóxico observável; pontuação 6: máximo observável, claro efeito tóxico.

b A presença de resíduos tóxicos na amostra NR esterilizada não pode ser determinada dessa maneira, pois a borracha natural por si só já apresenta um claro efeito tóxico.

Tabela 2. Mudança do ângulo de contato dos materiais após esterilização de 2,5 e 5 Mrada.

Material

Ângulo de

contato

Não-Esterilizado Esterilizado po γ 2,5 Mrad 5 Mrad EVOH 43,8 45,2 43,6 PA-6 45,5 37,4 38,9 PEAD 85,2 67,5 58,6 PETP 65,5 54,2 52,8 PVC 94,9 79,4 81,8 PVDC 63,6 41,2 41,3 a A esterilização por γ foi realizada em uma planta de esterilização comercial, com uma fonte de Co 60: um índice de dosagem de cerca de 0,4 Mrad.h-1 foi utilizado.

Por outro lado, o material de filtro PA-6 pareceu ser tóxico 1 d (um dia) após a esterilização, indicando a presença de uma quantidade muito alta de resíduos. Infelizmente, essa quantidade não foi determinada. Como podemos considerar que os ângulos de contato do PA-6 e PA-6,6 não diferirão muito, esses resultados sugerem, novamente, que a quantidade de resíduos depende do formato da amostra esterilizada. A conclusão de que o EVOH, após ser armazenado por 13 dias, ainda era tóxico, enquanto que o PA-6,6 não era, indica que o índice de aeração também depende do formato da amostra. É muito difícil estimar as conseqüências toxicológicas causadas pelo uso nas aplicações biomédicas de materiais esterilizados por formaldeído em vapor, com uma pontuação altamente positiva (ou seja, 6), nos testes de HFL para a determinação de toxicidade aguda. Por outro lado, nesse estudo, a esterilização foi realizada com aparelhos comerciais, sob condições normalmente usadas na prática. Portanto, a conclusão de que alguns materiais, após a esterilização, apresentaram resíduos que causam reações tóxicas indica que é justificável realizar pesquisas mais completas sobre as possíveis conseqüências, embora até agora nenhum efeito adverso causado pelo uso de produtos esterilizados por formaldeído em vapor tenha sido registrado. Finalmente, conforme ilustrado pelos resultados apresentados na Tabela 2, a esterilização por radiação para muitos materiais poliméricos resulta em uma diminuição considerável do ângulo de contato, devido à ocorrência de reações de degradação.

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Portanto, a conclusão de que a quantidade de resíduos de formaldeído depende do ângulo de contato de um material pode indicar que, após a esterilização por formaldeído em vapor de produtos anteriormente esterilizados por γ, serão encontrados mais resíduos do que nos produtos que não foram anteriormente esterilizados por γ. É esperado que, especialmente os materiais como o PETP e o PVDC, que apresentam um ângulo de contato intermediário, talvez apresentem esse efeito. Mais pesquisas são necessárias para investigar a precisão dessa suposição e determinar em qual extensão o resíduo é formado, após a esterilização por formaldeído em vapor de produtos anteriormente esterilizados por γ. AGRADECIMENTOS Agradecemos o apoio financeiro para esse estudo dado pelas seguintes companhias: Akzo Plastics, Duphar, DSM, General Electric Plastics, Grace Italiana, Medica, Mitsui and Mitsui Petrochemical Industries, Solvay & Cie. Sulzer, Travenol Laboratories e Vifor. Muito obrigado ao Sr. R.T. Rotteveel, Sr. P. Snuverink e Dr. J. Olijeslager por suas contribuições a este trabalho. REFERÊNCIAS 1. White, J.D., Standard aeration for gas-sterilized

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