IDENTIFICAÇÃO E ASPECTOS DE BIOCONTROLE DE ISOLADOS DE ... · Raposo por ser Jon Snow e a...

UNIVERSIDADECEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA

RONILDSON LIMA LUZ

SÃO LUÍS

2012

IDENTIFICAÇÃO E ASPECTOS DE BIOCONTROLE

DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. ORIUNDOS DE

SOLOS AGRÍCOLAS DO NORTE DO MARANHÃO

v

RONILDSON LIMA LUZ

Identificação e aspectos de biocontrole de isolados de Trichoderma spp.

oriundos de solos agrícolas do Norte do Maranhão.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Parasitária como parte

dos requisitos para a realização da defesa.

Orientador: Prof. Dr. Flávio Henrique Reis

Moraes

SÃO LUÍS

2012

vi

Ronildson Lima Luz

Identificação e aspectos de biocontrole de isolados de Trichoderma spp.

oriundos de solos agrícolas do Norte do Maranhão.

A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado

em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / ,

considerou o(a) candidato(a)

( ) APROVADA ( ) REPROVADA

1) Examinador __________________________________

2) Examinador ___________________________________

3) Examinador ___________________________________

4) Presidente (Orientador)__________________________________

vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus que plantou em mim um sonho que hoje se materializa. Aos

meus pais, Francisco Rodrigues e Maria Goreth, que foram o instrumento para

concretizar o precioso dom que recebi do universo: “a vida”.

A cada nova amizade que apareceu durante este percurso, estas verdadeiras

estrelas que iluminaram o céu e ajudaram a caminhar mesmo a noite,ou nas

palavras de Yusei Fudo: “um conjunto de estrelas vão criar uma nova força, que se

tornaram o caminho para o qual as luzes brilham”.

Agradeço ao prof. Flávio Henrique Reis Moraes, pela orientação e auxilio, não

conheceria os caminhos adjacentes do conhecimento sem sua presença.

A Márcio Fernandes Alves Leite, por ser um grande amigo, companheiro de

ideias, Conjurador Andarilho e Criador de mundos nas horas vagas. A André Luis

Raposo por ser Jon Snow e a Ashirogi Muto por mostrar o significado de seguir um

sonhos.

A minha namorada Monique, que vivenciou comigo passo a passo a etapa

final deste trabalho e por todos os momentos de muito carinho e companheirismo.

Juntos aprendemos coisas que os professores não ensinam.

A Jink, Andrian, Mark, Waldezil, Aramis, etc. que aos finais de semana na

casa do Gabriel me trouxeram alegria e descontração.

A todos aqueles que de alguma forma estiveram e estão próximos de mim,

fazendo esta vida valer cada vez mais a pena.

viii

RESUMO

Fungos do gênero Trichoderma são conhecidos agentes de biocontrole queatuam na solubilização de nutrientes, ativação do sistema de defesa vegetal, indução na produção de hormônios vegetais e no micoparasitismo. O presente trabalho realizou a caracterização morfofisiológica e molecular dos isolados de Trichoderma spp., provenientes de amostras de solos de 11 municípios: São Luís, Lago dos Rodrigues, Raposa, Humberto de Campos, Bacabal, Nova Olinda, Boa Vista do Gurupi, Miranda do Norte, São José de Ribamar, Buriti e Carutapera localizados no norte do Estado do Maranhão para isto utilizou-se técnicas convencionais e o sequenciamento da região ITS além de avaliar sua capacidade como agente de biocontrole em testes in vitro. As amostras foram diluidas em placa onde as colônias foram isoladas, quantificadas e purificadas. Os parâmetros químicos de pH e matéria das amostras de solo foram analisados afim de verificar sua relação com a presença do gênero no norte do Estado. A caracterização morfológica foi realizada utilizando chaves de classificação morfológicas nos meios de cultura Batata Dextrose e Agar e Extrato de Malte Agar. O Teste do pareamento e metabólitos foi realizado contra o isolado Fusarium oxysporum f. sp. passiflorae e os resultados foram avaliados através do teste de turkey a 5%. DNA total foi extraído utilizando kit DNeasy Plant da Qiagen, em seguida o produto foi amplificado utilizando os “primers”ITS 1 e 4, e por fim sequenciados.No total, 38 isolados foram caracterizados através de sua morfologia, dentre estes, 29 foram identificados como T. asperellum, três T. harzianum, um T. aggressivum, um T. konilangbra, um T. fertile, dois T. ghanense e um T. atroviride. Quantos as características químicas do solo, observou-se que os valores de pH (4-5,6) encontrados nos municípios foram favoráveis ao desenvolvimento do gênero, enquanto os valores de matéria orgânica foram considerados baixos em todos os municípios.Através dos testes in vitro observou-se que todos os isolados foram capazes de inibir o fitopatógeno através dos ensaios de parasitismo direto e metabólitos voláteis. Dentre os 38 isolados, 11 foram escolhidos aleatoriamente para identificação molecular e análise filogenética, estes foramː nove T. asperellum, um T. harzianum e um T. konilangbra. A análise filogenética mostrou que os isolados de T. asperellum formaram um agrupamento único quando analisado com os isolados do Brasil, China, Republica dos Camarões e Vietnam. As espécies de T. konilangbra formaram dois grupos, reunindo a espécie maranhense com as variações norte americanas, colocando em outro ramo a espécie proveniente de Uganda. T. harzianum agrupou-se com as espécies provenientes dos Estados Unidos, Colômbia e Peru, formando um subgrupo quando comparado com o isolado brasileiro, indicando um provável evento de especiação. Destaca-se que esta é a primeira ocorrência da espécie T. konilangbra relatada em solos brasileiros, ressaltando a importância de realizar pesquisas quanto a sua presença em regiões ainda não estudada, fornecendo base para futuras pesquisas biogeográficas. Palavra chaves: Biogeografia, Hypocrea, Brasil.

ix

ABSTRACT

Fungi of genus Trichoderma are known biocontrol agents that act in solubilization of nutrients, activation of the plant defense system, inducing the production of plant hormones and mycoparasitism. The present work aimed to characterize molecular and morphophysiological of Trichoderma spp from the soil samples from 11 districts: São Luís (neighborhood Bom Jardim, Itapera, Cinturão Verde e Quebra Pote), Lago dos Rodrigues, Raposa, Humberto de Campos, Bacabal, Nova Olinda, Boa Vista do Gurupi, Miranda do Norte, São José de Ribamar, Buriti e Carutapera located in the northern state of Maranháo (Brazil) with the aid of conventional and molecular techniques using the ITS region. . This work also aimed to verify the phylogenetic relationships of Trichoderma obtained between species and species belonging to others countries and evaluate your capacity as a biocontrol agent in vitro assays. The samples passed the dilution step on board where the colonies were isolated, purified and quantified. The chemical parameters pH and the matter of the soil samples were analysed in order to verify your relationship with the presence of the genus in the northern state. Morphological characterization was performed using morphological classification keys in the middle Potato Dextrose Agar and Malt Extract Agar and. The pairing assay and metabolites was performed isolated against Fusarium oxysporum f. sp. passiflorae and the results were evaluated by testing tukey to 5%. Total DNA was extracted using Qiagen DNeasy Plant Kit, and the product was amplified using primers ITS1 and 4, and finally, sequenced. In total 38 isolates were characterized by the morphology, among these, 29 were identified as T. asperellum, three T. harzianum, one T aggressivum, one T. konilangbra, one T. fertile, two T ghanense and one T. atroviride. The chemical characteristicsof the soilshowed which the valuesofpH(4 to 5.6) werefavorable in thecountiesto the developmentof the genre, while the values oforganic matterwere lowin all counties. Among the 38 isolates, eleven isolates were randomly selected for molecular identification and phylogenetic analisys, these were: nine T. asperellum, one T. harziaum and one T. konilangbra. Phylogenetic analisys showed the isolates of T. asperellum formed a single group when analyzed with the isolates from Brazil, China, Cameroon and Vietnam. The species of T. konilangbra formed two groups, bringing together species maranhensewith variations Americans, putting in another branch the species from Uganda. T. harzianum teamed up with the species form the United States, Colombia and Peru, forming a subgroup when compared with the Brazilian isolate, indicating a probable speciation event. Highlight which this is the first occurrence of T. konilangbra reported in Brazilian soils, emphasizing the importance of conducting research involving neglected regions, providing a basis for future research biogeographic. Keywords: Biogeography, Hypocrea, Brazil.

x

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Mapa do Estado do Maranhão indicando os 11 pontos de coleta das

amostras de solo. ............................................................................................... 24

Quadro 1 - Isolados de Trichoderma spp. provenientes das amostras povenientes

dos solos localizados nos municípios do norte Estado do Maranhão e análise

dos parâmetros químicos ................................................................................... 25

Figura 2 - Características morfológicas dos isolados de T. asperellum. (a)

Crescimento radial em 72 horas (BDA) Crescimento linear em 1 semana (BDA),

(b) Reverso (BDA), (c) Crescimento linear em 1 semana (EMA), (d) Reverso

(EMA), (f) Reverso, (g) Conídios e (h) Fiálides. ................................................. 27

Figura 3 - Características morfológicas dos isolados de T. aggressivum. (a)




Figura 4 - Características morfológicas dos isolados de T. harzianum. (a)



(EMA), (f) Reverso, (g) Conídios e(h) Fiálides. .................................................. 28

Figura 5 - Características morfológicas dos isolados de T. atroviride. (a) Crescimento

radial em 72 horas (BDA) Crescimento linear em 1 semana (BDA), (b) Reverso

(BDA), (c) Crescimento linear em 1 semana (EMA), (d) Reverso (EMA), (f)

Reverso,(g) Conídios e (h) Fiálides. ................................................................... 29

Figura 6 - Características morfológicas dos isolados de T. fertile. (a) Crescimento



Reverso, (g) Conídios e (h) Fiálides. .................................................................. 30

Figura 7-Características morfológicas dos isolados de T. ghanense. (a) Crescimento



Reverso, (g) Conídios e (h) Fiálides. .................................................................. 30

xi

Figura 8 - Características morfológicas dos isolados de T. konilangbra. (a)




Figura9 - Inibição do crescimento micelial de Fop4 por isolados de: (a) T. asperellum

(b) T. aggressivum, (c) T. harzianum, (d) T. atroviride, (e) T. fertile, (f) T.

ghanense, (g) T. konilangbra. ............................................................................ 34

Figura10 - Inibição do crescimento micelial de Fop4 por compostos voláteis

produzidos pelos isolados: (a) T. asperellum, (b) T. aggressivum, (c) T.

harzianum, (d) T. atroviride, (e) T. fertile, (f) T. ghanense, (g) T. konilangbra. ... 35

Figura11 - Corrida em gel de agarose 1,2% com produtos da PCR obtidos com os

“primers” da região ITS dos isolados de Trichoderma (da esquerda para direita

os dez isolados representam a espécie T. asperellum: TA, TQ2, TZ2, TA3, TE3,

TF3, TH3, TI3 e TJ3. A penúltima banda corresponde a espécie T. harzianum/H.

lixii TL3e a ultima a T. konilangbra TQ2).. ......................................................... 35

Figura -12 - Relacionamento filogenético entre os isolados de T. asperellum (TA,

TZ2, TI3, TE3, TO3, TF3, TA3, TJ3, TH3), T. harzianum (TL3) e T. konilangbra

(TQ2) sequenciados neste estudoutilizando o método “Neighbor-Joining”. ....... 37

Figura - 13 - Relacionamento filogenético dos isolados de Trichoderma utilizando o

método Neighbot-Joining. O percentual de replicagem da árvore no qual os

táxon associados aos grupos no valor do bootstrap (10000 replicatas) são

mostrados nos ramos. A distância foram computadas utilizando o Kimura 2-

parâmetro. As espécies localizadas dentro dos retângulos indicam os isolados

maranhenses estudados neste trabalho. ........................................................... 40

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Origem e cultura dos isolados de Trichoderma obtidos a partir de amostras

de solo de diferentes municípios do Maranhão. ................................................. 18

Tabela 2. Características morfológicas em meio BDA e EMA dos isolados de

Trichoderma spp. obtidos de solos de municípios do norte do Maranhão ......... 26

Tabela 3. Avaliação do potencial antagonista dos isolados de Trichoderma contra o

crescimento micelial de Fusarium oxysporum f.sp. passiflorae (Fop4). ............. 32

Tabela 4. Identificação, espécie, origem, valores de confiabilidade do Trichokey e

Número de acesso do Genbank, utilizando as regiões ITS1, 5.8S e ITS2

programa Trichokey ........................................................................................... 36

Tabela 5. Sequências dos isolados de Trichoderma obtidas do Genbank ................ 38

xiii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1

2 REFERENCIAL TEÓRICO ....................................................................................... 3

2.1TAXONOMIA, SISTEMÁTICA E REPRODUÇÃO NOS FUNGOS. ........................ 3

2.2 TÉCNICAS DE CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR EM FUNGOS ...................... 5

2.3 Trichoderma: HISTÓRICO E AGENTE DE BIOCONTROLE ................................ 7

2.4 GENE ITS ............................................................................................................ 13

2.5 ISOLAMENTO E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DO GÊNERO ....................... 15

3HIPÓTESE .............................................................................................................. 16

4OBJETIVOS ............................................................................................................ 17

4.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................... 17

5 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................... 18

5.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS E ANÁLISE QUÍMICA. ...................................... 18

5.2 IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES ..................................................................... 19

5.3 CARACTERÍSTICAS DE ANTAGONISMO ......................................................... 20

5.3.1 MICOPARASITISMO........................................................................................ 20

5.3.2 PRODUÇÃO DE METABÓLITOS VOLÁTEIS .................................................. 20

5.4 ANÁLISE MOLECULAR ...................................................................................... 21

5.4.1 EXTRAÇÃO E AMPLIFICAÇÃO DO DNA GENÔMICO ................................... 21

5.4.1.1 ANÁLISE DOS PRODUTOS OBTIDOS NA PCR..........................................21

5.4.2 PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO ........................................................... 22

5.4.3 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E FILOGENIA ............................................... 22

6 RESULTADOS ....................................................................................................... 23

6.1 ISOLAMENTO E QUANTIFICAÇÃO ................................................................... 23

6.2 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA................................................................ 26

6.3 CARACTERÍSTICAS DE ANTAGONISMO ......................................................... 31

6.3.1 MICOPARASITISMO........................................................................................ 31

6.3.2 PRODUÇÃO DE METABÓLITOS VOLÁTEIS .................................................. 34

6.4 ANÁLISE MOLECULAR ...................................................................................... 35

6.4.1 EXTRAÇÃO E AMPLIFICAÇÃO DO DNA GENÔMICO ................................... 35

6.4.2 PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO ........................................................... 36

6.4.3 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E FILOGENIA ............................................... 36

7DISCUSSÃO ........................................................................................................... 40

8 CONCLUSÃO ......................................................................................................... 49

9 BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 51

APÊNDICE A ............................................................................................................. 64

APÊNDICEB .............................................................................................................. 67

APÊNDICE C ............................................................................................................ 68

CONFIRMAÇÃO DE ENVIO DO ARTIGO ................................................................ 73

NORMAS E INTRUÇÕES PARA OS AUTORES ...................................................... 74

ARTIGO..................................................................................................................... 79

1

1 INTRODUÇÃO

Os fungos são organismos que apresentam capacidade de adaptação a

diferentes ambientes devido a variações nutricionais, formas de reprodução e

mecanismos de resistência permitindosua viabilidade por longos períodos (MONTE,

2001; BENÍTEZ et al., 2004; BUENO et al., 2007).

Os fungos do gênero Trichoderma são ascomicetos, cosmopolitas e

saprófitas, possuem complexos níveis de interação com o meio em que se

desenvolvem e com os organismos presentes, atuando na solubilização de

nutrientes, sistema de defesa vegetal, indução na produção de hormônios vegetais e

micoparasitismo (produção de metabolitos voláteis e não-voláteis, entrelaçamento

direto de hifas, competição por espaço e nutrientes). São referenciados por possuir

espécies produtoras de enzimas extracelulares, ex. xylanase e celulase, utilizadas

na indústria de papel, produção de alimentos e ração animal. Devido a estas

aplicações torna-se importante a sua identificação para o uso efetivo de suas

propriedades(BENÍTEZ et al., 2004; BUTT et al., 2008; SCHMOLL et al., 2009).

Abordagens clássicas baseadas em Reconhecimento Morfológico de

Espécies (MSR), sozinha são insuficientes devido à plasticidade das suas

características, enquanto o Reconhecimento Biológico de Espécies (BSR) é

impraticável, uma vez que, muitos indivíduos dentro do gênero perderam a

capacidade de reproduzir sexuadamente, sendo então necessária a união de

técnicas moleculares e a adoção de diversos parâmetrospara a correta identificação

(DRUZHININA; KUBICEK, 2005).

Através de marcadores moleculares é possível realizar comparações

filogenéticas baseadas nas sequências alvo e através destas, determinar com

acurácia o grau de relação entre isolados de diferentes regiões geográficas, formas

sexuadas ou espécies desconhecidas. Para isso a Concordância Genealógica de

Reconhecimento de Espécie Filogenética (GCPSR), se apresenta como uma

alternativa para identificação, além de possibilitar a compreensão de outras

informações que poderão estar correlacionadas como tipo de reprodução, ciclo de

vida e diferenciação genetica(TAYLOR et al., 1999).

Para que esta associação seja feita é necessário a utilização de mais de um

gene. Dentre estes os genes conhecidos como “housekeeping” são os mais

2

indicados por conterem tanto regiões conservadas como de variabilidade, essas

sequências permitem a identificação de novas espécies além de promoverem a

diferenciação entre estas (DRUZHININA; KUBICEK, 2005).

Como estes genes são condicionados a fatores ambientais (interação com

outros microrganismos, fatores físico-químico, clima e temperatura), é natural que

sua expressão seja diferenciada em cada organismo. Tais fatores geram

particularidades que os individualizam, sendo esta uma característica importante

para o reconhecimento de novas espécies (SHENOY et al., 2007). Neste sentido a

identificação de isolados de Trichoderma spp. de diferentes localidades do norte do

Estado do Maranhão, faz-se necessário, uma vez que o Estado reflete aspectos

transicionais de clima e suas condições edáficas que resultam em variados

ecossistemas, desde ambientes salinos com presença de manguezais, campos

inundáveis, cerrados e babaçuais, até vegetação de grande porte com

características amazônicas (TAYLOR et al., 1999; MUNIZ, 2006).

Neste cenário é possível encontrar variações entre espécies de Trichoderma

e diversidade genética de isolados característicos desta região. Portanto, objetiva-se

coletar amostras de solos de diferentes regiões no norte do estado do Maranhão e

identificar as espéciesde Trichoderma que possuamimportância ecológica e

econômica através de técnicas morfológicas emoleculares.

3

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 TAXONOMIA, SISTEMÁTICA E REPRODUÇÃO NOS FUNGOS

A sistemática visa classificar e identificar os fungos objetivando os seguintes

critérios: elucidar as diferentes relações filogenéticas, documentar todas as

mudanças ocorridas na evolução e descrever todas as espécies (JUDD et al., 2002).

O processo inicia-se com identificação, seguido da comparação com as outras

espécies conhecidas em grupos semelhantes (TALBOT, 1971).

Talbot (1971) aindadefiniu quatro critérios no conceito de espécies fúngicas, o

primeiro deles é o conceito morfológico de espécie, que busca a comparação da

morfologia entre diferentes fungos, o segundo é o conceito de ecologia e fisiologia

que leva em consideração a distância e a distribuição geográfica entre diferentes

linhagens, o terceiro é o conceito biológico de espécie que leva em consideração a

capacidade dos indivíduos de reproduzirem entre si, e por fim, o conceito

evolucionário e filogenético de espécie que analisa características compartilhadas

entre indivíduos derivados de um ancestral comum.

Os fungos são organismos multicelulados heterotróficos que se alimentam por

absorção de compostos orgânicos, se desenvolvem de maneira difusa em um

micélio septado ou contínuo e reproduzem-se por meio de esporosque podem ser

sexuado e assexuado, possuindo uma ou várias camadas de parede celular

(ALEXOPOULOS et al., 1996). Não possuem plastos ou pigmentos fotossintéticos

(ALEXOPOULOS et al., 1996). São divididos em duas categorias: Myxomycota e

Eumycota, na primeira é caracterizado por possui forma gelatinosa, e o segundopor

produzir filamentos (AINSWORTH et al., 1973). O crescimento dos fungos

normalmente é indeterminado. Não apresentam mobilidade com exceção de certos

tipos de esporos que sofrem ação de diferentes agentes ambientais (WORRAL,

1999). Acredita-se que existam cerca de 75.000 espécies, porém estima-se que

ainda deva existir cerca de 1.5 milhões de espécies a serem descobertas

(HAWKSWORTH; KALIN-ARROYO, 1995).

A hifa dos fungos filamentosos normalmente se desenvolve a partir do

crescimento celular apical, onde a parede celular vai aos poucos se enrijecendo com

substâncias que em geral são glucanas ou quitinas. Normalmente o septo delimita

4

compartimentos que em algumas subdivisões formam ganchos (ou grampos). Em

fungos gelatinosos o desenvolvimento ocorre por brotação. O agrupamento das hifas

formam um tecido que passa a se chamar micélio (WORRAL, 1999).

Apesar de terem sido inicialmente colocados dentro do reino Plantae, os

fungos atualmente possuem seu próprio reino, chamado Fungi, que compartilha

características com o reino Animalia, sendo estes três reinos derivados de diferentes

linhagens de protistas (WHITTAKER, 1969; BALDAUF; PALMER, 1993; CARLILE;

WATKINSON, 1994; CAVALIER-SMITH, 1998; WORRAL, 1999). Cavalier-smith

(1987) propôs em seu trabalho que animais e fungos estão mais relacionados do

que vegetais, tendo mais proximidade com o ancestral comum (coanoflagelados).

Análises do RNA ribossômico confirmaram suas suposições e colocaram os animais

como um grupo próximo dos fungos (CAVALIER-SMITH, 1987; LANG et al., 2002).

Por conta da sua capacidade de propagação e dos seus diferentes modos de

reprodução a classificação dos fungos tem sido uma tarefa complicada (SUTTON,

1973; KENDRICK, 1979; WERESUB; HENNEBERT, 1979). Antes do século 18, os

fungos eram caracterizados sem levar em consideração suas estruturas de

reprodução sexuada, neste período, fungos do gênero Aspergillus e

Botrytisreceberam nomes genéricos por conta destas limitações taxonômicas, sendo

esse sistema nitidamente insatisfatório (SHENOY et al., 2007).

Após a descoberta do ciclo sexual em Syzites e do ciclo de vida do

Aspergillus glaucus(Aspergillus glaucusLink), os estudos que envolviam a taxonomia

passaram a focar-se mais na história de vida do fungo, e na análise das

características plesiomórficas.Os fungos passaram então a ser vistos sobre uma

nova ótica, onde então nasceu o termo “fungos imperfeitos”, seguido pela criação do

sistema de classificação Saccardo (deuteromiceto), que se baseou na morfologia do

conídio e do conidióforo (SHENOY et al., 2007).

Hughes (1953) utilizou da ontogenia do crescimento conidial nas suas

caracterizações, ressaltando a natureza pleomórfica do fungo e sua importância na

classificação. Poucos anos depois Weresub e Hennebert (1979), seguido por

Reynolds e Taylor (1993) desenvolveram e definiram o termo holomorfo para

conceituar as diferentes fases do ciclo de vida do mesmo fungo.

Alguns fungos possuem duas principais etapas no seu ciclo de vida, a

primeira é chamada de teleomórfica, ou sexual, onde ocorre o desenvolvimento de

estruturas distintas que aparecem unicamente neste período. A segunda é a

5

anamórfica, marcada pela ausência de estruturas sexuais, onde apresentam

somente desenvolvimento vegetativo por mitose. Neste sistema de classificação, as

formas teleomórficas e anamórficas são classificadas e nomeadas separadamente,

caracterizando duas espécies distintas (KENDRICK, 1979; WERESUB;

HENNEBERT, 1979; HENNEBERT, 1987; SUGIYAMA, 1987; REYNOLDS;

TAYLOR, 1993; SEIFERT et al., 2000; KIRK et al., 2001). O relacionamento entre a

forma sexuada e assexuada, na maioria dos casos, não chega a ser relacionada.

Estima-se que cerca de um quinto dos fungos conhecidos não possuem suas

estruturas sexuais conhecidas (KENDRICK, 1979; REYNOLDS; TAYLOR, 1993).

No geral, o Conceito Filogenético de Espécies associado a caracteres

moleculares é considerado a melhor abordagem para identificação dos fungos.

Dados moleculares podem fornecer informações de caracteres discretos além de

possibilitarem uma análise estatística para induzir relações filogenéticas, sendo

desta forma mais vantajoso que dados morfológicos (JUDD et al., 2002; SHENOY et

al., 2007).

A caracterização correta de um determinado organismo não está somente

ligada a sua identidade. Informações sobre suas propriedades são o principal alvo

de estudo na atual sistemática para desta maneira compreender sua biologia (papel

ecológico, fisiologia e propriedades bioquímicas) (SEIFERT et al., 2000). Porém, a

obtenção destas informações nem sempre é possível, devido à complexidade

inerente ao próprio organismo que apresenta diversos fatores, tais como:

plasticidade da morfologia e variabilidade dos caracteres genéticos, dificuldades em

diferenciar possíveis espécies criptas e identificação incoerentes de organismos

pleomórficos baseados em ciclos de vidas pouco conhecidos (HEBERT et al., 2002).

2.2 TÉCNICAS DE CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR EM FUNGOS

Durante séculos o processo de identificação dos fungos tem sido realizado a

partir de métodos convencionais, utilizando como base caracteres fenotípicos

determinados pela morfologia da colônia e das suas microestruturas. Embora estas

metodologias sejam o alicerce dos estudos na micologia, podem levar a uma

interpretação errada dos resultados, sendo dependentes da experiência do

pesquisador, da viabilidade do organismo a ser cultivado, além de exigir muito

6

tempo, resultando em alguns casos, baixo nível de acurácia (ATKINS; CLARK,

2004).

Com o intuito de otimizar o processo de reconhecimento, pesquisadores

rotineiramente utilizam a informação genética em diversas linhas de pesquisa,

possibilitando estudar aspectos comportamentais, história de vida, modelos de

transmissão de genes, morfologia comparada, sistemática e os diferentes níveis de

relacionamentos entre os organismos (AVISE, 1994; ATKINS; CLARK, 2004).

A PCR é uma técnica dependente da metodologia de extração, podendo ser

utilizada rotineiramente fornecendo informações para controle biológico, sendo

constantemente aprimorada a medida que o conhecimento sobre as regiões de DNA

utilizadas para amplificação aumentam, desta forma, muitas da interações sobre a

ecologia dos fungos e sua interação com os outros organismos, vem se tornando

cada vez mais disponível (ATKINS; CLARK, 2004). É uma das mais importantes

ferramentas para identificação de fungos, desde sua introdução nos anos 80, onde

vem servindo de base para o desenvolvimento de uma série de outras tecnologias

associadas. A PCR é uma amplificação enzimática exponencial que atua sobre uma

região específica chamada “primer”, gerando múltiplas cópias desta. Por conta da

sua simplicidade, especificidade e sensibilidade têm diferentes aplicações em vários

ramos da micologia (LUO; MITCHELL, 2002; ATKINS; CLARK, 2004).

As técnicas que envolvem amplificação de DNA utilizando PCR não se limitam

unicamente a análises qualitativas. Devido a necessidade de quantificar as

sequências de ácidos nucléicos e analisar a expressão de genes, desenvolveu-se a

PCR em tempo real (qPCR). Trata-se de uma técnica que combina tanto

amplificação como detecção em uma única etapa. O procedimento consiste em

calcular o processo de amplificação do produto da PCR durante cada ciclo quando a

sequência alvo é detectada, gerando valores conhecidos como limite de ciclo (Ct),

onde são detectados por corantes fluorescentes e sequências específicas de sondas

(HEID et al., 1996; ATKINS; CLARK, 2004; WONG; MEDRANO, 2005).

Com intuito de desenvolver uma ferramentaprática para facilitar o trabalho de

identificação a nível de espécie e aumentar a compreensão sobre o relacionamento

de diferentes organismos entre si, o projeto “DNA barcode” foi introduzido no ramo

da sistemática. A caracterização utiliza, no geral, regiões curtas já conhecidas e

padronizadas por conta da sua baixa variabilidade genética (HEBERT; GREGORY,

2005).A proposta iniciou-se com o trabalho de Hebert et al. (2002) que sugeriu um

7

sistema de identificação utilizando informações contidas em um gene de 648 bp, o

“Cytochrome Oxydase Subunit I” (COI), por apresentar baixa quantidade de íntrons e

baixa exposição a recombinação (SACCONE et al., 1999). Logo em seguida, regiões

específicas para organismos dos diferentes reinos já estavam disponíveis

(SAUNDERS, 2005; WARD et al., 2005; HAJIBABAEI et al., 2006). Para estimular e

organizar o depósito de regiões importantes o projeto “Barcode of Life”

(www.barcoding.si.edu) foi consolidado, funcionando como uma biblioteca universal

para que comparações de táxons não identificados pudessem ser realizadas

(KRESS et al., 2005).

Apesar de inicialmente ter mostrado alta capacidade de distinção em nível de

espécie, Kress et al. (2005) comprovaram que as cópias do gene COI no genoma de

vegetais superiores evoluíam a um nível muito baixo quando comparado ao dos

animais, concluindo sua ineficácia como marcador molecular universal. Outras

regiões como Espaçadora Transcrita Interna (ITS), e o plasmídeo trnH-psbA

espaçador intergênico foram selecionados como marcador molecular para vegetais.

Diferentes genes tem sido escolhidos para a identificação a nível de espécie,

no reino Fungi, trabalhos posteriores indicaram os lócus com maior capacidade para

distinção de organismos dentro do reino, dentre eles destacam-se: a grande

subunidade ribossomal (mtSSU), a ITS, regiões da β-tubulina e Fator de

Alongamento 1-alpha (EF-1), sendo a região ITS mais utilizada pelos micologistas

no geral (BERCH et al., 2002; CUNNINGTON et al., 2003; GEISER et al., 2004;

SAMSON et al., 2004; DRUZHININA; KUBICEK, 2005).

2.3 Trichoderma: HISTÓRICO E AGENTE DE BIOCONTROLE

O gênero Trichoderma foi originalmente descrito por Persoon em 1794

descreveu-o como gasteromiceto, no seu trabalho propôs quatro espécies

diferentes, destas somente Trichoderma viride(Trichoderma viride Rifai)permaneceu

inalterada. Em 1865 os irmãos Tuslane estabeleceram a ligação entre T.viride e

Hypocrea rufa (Hypocrea rufa Pers.), seu equivalente teleomorfo, utilizando como

base o formato da hifa estromática e comparando com o conidióforo do Trichoderma,

este trabalho mostrou os principais padrões de identificação para o holomorfo

(SAMUELS et al., 2006).

8

Abbdott em 1927 conseguiu classificar quatro grupos distintos, porém, somente três

foram adicionados na chave de classificação. Em 1939 o pesquisador Bisby após

fazer observações nas espécies de Hypocrea rufa (produtor de ascósporos

incolores) e Hypocrea gelatinosa(Hypocrea gelatinosa Tode:Fr.)(produtor de

ascósporos coloridos) não conseguiu diferenciá-las, acreditando que H. gelatinosa é

somente uma forma de crescimento ou condição imatura de H. rufa, desde então

passou a atribui várias características morfológicas a uma única espécie. (GAMS;

BISSET, 1998; CHAVERRI; SAMUELS, 2003; SAMUELS, 2006). Em 1956 Dingley

caracterizou várias espécies de Hypocrea na Nova Zelândia, relacionando estas com

o seu anamorfo T. viride (DINGLEY, 1956). Poucos anos depois Rifai (1969) utilizou

características da forma sexuada para distinguir as espécies de Trichoderma,

dividindo-os em nove grupos chamados de “agregados" (grupos de espécies

morfologicamente semelhantes), estes são respectivamente: T. aureoviride Rifai, T.

hamatum (Bonord.) Bain., T. harzianum Rifai, T. koningii Oudem., T. longibrachiatum

Rifai. T.piluliferum Rifai , T. polysporum (Link : Fr.) Rifai, T. pseudokoningii Rifai, e T.

viride. (ABBDOTT, 1926; RIFAI, 1969; SAMUELS, 1996).

No Japão, Doi (1973) descreve o ciclo de vida de espécies tropicais do

gênero Hypocrea, em seguida, propõe subdivisões baseadas na sua anatomia e na

sua forma assexuada. Nos anos de 1984 a 1992 Bisset revisa a chave de

classificação do gênero utilizando o trabalho de Rifai como referência, neste observa

que cinco dos agregados de Rifai (T. harzianum, T. longibrachiatum, T. piluliferum, T.

polysporum, e T. pseudokoningii) são na realidade espécies, enquanto que os

agregados restantes seriam grupos contendo numerosos indivíduos. Bisset então os

separa em cinco seções (DOI, 1973; BISSETT, 1991)

O gênero Trichoderma é formado por fungos ascomicetos produtores de

esporos assexuais com formato elipsoidal, oblongo e globoso, gerado por fiálides

hialinas formadas sobre ramos estéreis de conidióforos verticiliados. Seus conídios

apresentam semelhanças com Verticillum e Gliocladium variando em tamanho e tons

que vão do branco nos primeiros dias, ao verde e amarelo após a maturação

(GAMS; BISSET, 1998; CHAVERRI; SAMUELS, 2003; SAMUELS, 2006).

Determinadas espécies produzem elevada quantidade de clamidósporos

conspícuos de parede espessa difusos na massa miceliar, estes têm formato

globoso ou subgloboso formados dentro ou no topo das hifas (CHAVERRI et al.,

2003; SAMUELS, 2006).

9

As colônias, na maioria das espécies, são formadas por massas de micélio

com aparência flocosa exibindocrescimento rápido entre 25-30° (em algumas

seções, espécies conseguem esporular a 40°), estas apresentam cor branca ao

primeiro dia, sendo, posteriormente, substituído por diversos tons de verde, e em

alguns casos, entretons de amarelo, seu reverso é geralmente

incolor,amarelo,amareloâmbarouverde-amarelo. Em algumas espécies os

conidióforos se desenvolvem apresentando anéis formados por zonas concêntricas,

sobre substratos lenhosos suas colônia apresenta crescimento discreto e moderado

(GAMS; BISSET, 1998). Além destas características, determinadas espécies exibem

outras peculiaridades como o “odor adocicado de coco” e capacidade de difusão de

pigmentos no meio (GAMS; BISSET, 1998; SAMUELS, 2006).

O gênero ostenta no total cinco divisões conhecidas como “seções”, estas

são:seção Hypocreanum, seção Longibrachiatum,seção Pachybasium, seção

Saturnisporium e seção Trichoderma(GAMS; BISSET, 1998; SAMUELS, 2006).

Seção Hypocreanum possui como principal característica fiálides solitárias com

formato cilíndrico que apresentam padrões semelhante a Verticilium ou Acremonium,

este modelo é caracterizado por ramos primários que se desenvolvem uma ou várias

vezes, terminando em longos verticilos (CHAVERRI; SAMUELS, 2003). O

crescimento das suas colônias varia nas diferentes espécies indo de 3 a 6 cm, sendo

seu reverso normalmente descolorido ou amarelo. Apresenta conídio incolor, liso

que varia em forma e tamanho, neste grupo as forma assexuadas na seção

Hypocreanum foram obtidas a parti de ascósporos das espécies de Hypocrea, uma

vez que, estes são raramente observados individualmente (GAMS; BISSET, 1998;

CHAVERRI; SAMUELS, 2003).

Espécies da seção Longibrachiatumapresentam conidióforos agregados

formando pústulas que exibem longos ramos primariamente, possuindo

desenvolvimento secundário curto, suas colônias demonstram crescimento rápido

que varia entre 4,5 a 7,5 cm. Suas fiálides são irregularmente dispostas

frequentemente solitárias, apresentam formato ampuliforme ou cilíndricas, sendo

estas também encontradas em alguns outros grupos, porém, sua frequência não é

tão alta quanto na seção Longibrachiatum(GAMS; BISSET, 1998; CHAVERRI;

SAMUELS, 2003).

Os indivíduos da seção Pachybasiumcontém espécies capazes de produzir

padrões de ramificação piramidal, apresentando conidióforos alongados podendo

10

ser férteis ou estéreis, frequentemente formam agregados compactos com cores que

vão do branco ao cinza e do verde ao marrom, onde nestes são inseridas fiálides

com formas curtas e largas produzidas em grupos que vão de 2 a 7. Colônias variam

em tamanho entre 2 e 9 cm, seu reverso apresenta tons de amarelo, âmbar e

algumas vezes avermelhado (GAMS; BISSET, 1998; CHAVERRI; SAMUELS, 2003).

Na seção Saturnisporium o Trichodermaapresenta fiálides desagrupadas

semelhante ao arranjo encontrado na seção Longibrachiatum, porém, diferencia-se

desta por possuir fiálides largas(GAMS; BISSET, 1998; CHAVERRI; SAMUELS,

2003).

Aseção Trichoderma difere dos outros grupos por apresentar conidióforos

estreitos e sinuosos com ramos primários que resultam de intervalos regulares,

nestes, 2 a 3 fiálides brotam por verticilo ligados ao conidióforo com conídios

regulares ou ornamentados, apresentam crescimento rápido e lento dependendo da

espécie, possuem aspecto contonoso com tons que variam do branco nos primeiros

dias, ao verde após total maturação, nesta seção algumas espécies apresentam o

doce odor de coco e produção de clamidósporos (GAMS; BISSET, 1998;

CHAVERRI; SAMUELS, 2003).Seu equivalente teleomorfo é reconhecido

taxonomicamente como membro da divisão Ascomycota do gênero Hypocrea,

estecompartilha uma série de características morfológica com o gênero

Trichoderma, porém, difere-se deste no modo de reprodução.

Membros da ordem Hypocreales são frequentemente encontrados em todos

os tipos de florestas com elevada umidade, colonizando cascas de árvores, plantas

herbáceas e parasitando outros fungos, espécies de Hypocrea são usualmente

encontradas em florestas tropicais úmidas (CHAVERRI; SAMUELS, 2003; HARMAN

et al., 2004).Seus esporos são mantidos dentro de estruturas denominadas ascos,

destas a mais comum é o peritécio, que apresenta-se como forma de almofada. As

paredes que compõem este corpo de frutificação variam no tipo de textura podendo

ser carnosa, ou membranosa com uma brilhante coloração que varia entre as

espécies sendo facilmente identificada (DINGLEY, 1950; KUHLS et al., 1996;

CHAVERRI; SAMUELS, 2003; SAMUELS, 2006)

A competição por nutrientes é um dos elementos chaves para o

desenvolvimento dos microrganismos, sendo este, um dos fatores responsáveis pela

seleção de espécies. Por exemplo, no solo, a maioria dos fungos filamentosos

utilizam de sideróforos para captação de ferro (ex. Aspergillus fumigatus, A.nidulans

11

e Ustilago maydis) (CHET; INBAR, 1994; MONTE, 2001; BENÍTEZ et al., 2004;

EISENDLE et al., 2004). Trabalhos realizados por Chet e Inbar (1994)relataram que

algumas estirpes de Trichoderma possuem alta capacidade de produzir sideróforos,

mobilizando este íon e impedindo sua captura por outros fungos, a absorção de

nutrientes na rizosfera também já foi evidenciada em Fusarium oxysporum, ao

competir com a espécie T.harzianum,em outras espécies como B.cinerea essa forma

de antagonismo ainda é mais efetiva, uma vez que, este fitopatógeno é sensível a

falta de nutrientes.

No ambiente o Trichoderma apresenta alta velocidade de desenvolvimento,

ao fazer essa afirmativa não só é considerado seu rápido desenvolvimento no solo

como também seu valor como antagonista, uma vez que, é necessário que vença as

adversidades contidas no próprio substrato como efeitos fungistáticos de outros

fungos, vegetais e organismos que venham competir como ele no local onde foi

inserido, além de levar em consideração sua capacidade de reprodução e sua

eficiência na obtenção de nutrientes (BENÍTEZ et al., 2004).

A habilidade de obter nutrientes do solo é superior a da maioria dos

microrganismos, seus mecanismos baseiam-se na capacidade de metabolizar

diferentes tipos de açúcares tais como: celuloses, glucanas e quitinas, sendo estes

processos mediados pela assimilação de enzimas e permeases (CHET; INBAR,

1994; DELGADO-JARANA et al., 2003).

Espécies de Trichoderma são por alguns autores, definidas como oportunistas

simbiontes avirulentos capazes de colonizar a raiz utilizando mecanismos similares

aos fungos micorrizos, além de beneficiar seu hospedeiro produzindo compostos

que estimularão sua defesa e proteção (HARMAN et al., 2004). Alguns isolados de

Trichoderma ao se estabelecerem na rizosfera e penetrar a epiderme do vegetal

iniciam a produção e liberação de compostos, resultando em liberação de

fitoalexinas, flavoides e terpenoides, além de derivados fenólicos, aglycones e outros

compostos antimicrobianos. Como Trichoderma é mais tolerante a estes compostos

que a maioria dos fungos, consegue se desenvolver a medida em que que confere

resistência ao vegetal (HARMAN et al., 2004).

Outro sistema utilizado no processo de controle biológico envolve a utilização

de moléculas de baixo peso molecular, metabólitos voláteis, não-volateis ou

antibióticos, produzido pelas estirpes de Trichoderma. Entre estes metabólitos estão

os ácidos harzianico, alameticinas, tricholina, peptaibols, 6-penthyl--pyrone,

12

massoilactone, viridina, gliovirina, glisoprenina, ácido heptelidico e outros (VEY et al.,

2001).

O micoparasitismo corresponde ao mecanismo de biocontrole que envolve:

reconhecimento, penetração e subsequentemente morte do hospedeiro. O

Trichoderma pode exercer diretamente sobre outro fungo este mecanismo de

parasitismo, que essencialmente inicia-se com liberação de Enzimas de Degradação

de Parede Celular (CWDE), variando entre as diferentes espécies, sendo a maioria

destas substâncias, enzimas como: quitinases, glucanases e proteases (HARMAN et

al., 2004). O micoparasitismo envolve inicialmente mudanças morfológicas que

resultam em alterações das estruturas que formam osapressórios e se prendem ao

hospedeiro. A hifa do Trichodermase fixa e então enrola-se, passando a liberar

enzimas degradadoras de parede celular e peptaibols(MONTE, 2001; HOWELL,

2003).

Em 1995 as técnicas de sequenciamento de DNA passaram a ser utilizadas

com fins taxonômicos, neste mesmo período algumas relações entreTrichoderma e

Gliocladium começaram a ficar mais elucidadas através de técnicas moleculares

(REHNER; SAMUELS, 1994), pouco tempo depois outros trabalhos foram

publicados envolvendo regiões pertencentes ao DNA ribossômico (rDNA), e em

seguida, a utilização de múltiplos genes (KINDERMANN et al., 1998; KULLNIG-

GRADINGER et al., 2002). Neste mesmo período as pesquisas filogenéticas

também são iniciadas, assim, análises das sequências de bases começam a

fornecer resultados para a montagem de esquemas filogenéticos (SAMUELS;

SEIFERT, 1995).No empenho de ampliar o conhecimento sobre a sistemática, e

desenvolver um sistema taxonômico natural para melhor entender à história

evolutiva do gênero interligando a forma anamórfica com a telemórfica foi de grande

importância realizar estudos envolvendo as espécies de Trichoderma e relacioná-las

com as de Hypocrea (CHAVERRI et al., 2003; SAMUELS, 2006).

13

2.4 GENE ITS

Segundo White et al. (1990) sequências de nucleotídeos contidas no RNA

ribossomal (rRNA) fornecem meios para analisar relações filogenéticas em todos os

níveis taxonômicos, estes por estarem presente em todos os organismos e por

apresentarem um alto número de cópias (este gene esta presente em número

superior a 90 cópias por genoma) são indicados para estudos que relacionam

distância filogenética entre os organismos. Estas regiões são responsáveis pela

produção primária de rRNA separadas por uma ou mais sequências conhecidas

como espaçadoras intergênicas (IGS) que podem variar na posição e direção no

processo de transcrição entre diferentes grupos de fungos, sendo considerada por

alguns autores a região mais utilizada na micologia (HILLIS; DIXON, 1991;

HIBBETT, 1992).

A região que compõem o DNA nuclear ribossomal é dividida em três genes, o

primeiro deles, a pequena unidade (SSU) fica localizada na posição 17-18S, possui

um nível evolutivo relativamente lento, sendo útil em estudos que avaliam o grau de

parentesco entre os organismos, a segunda região, a maior subunidade (LSU), fica

localizada na posição 25-28S possuindo regiões variantes nos seus 900 primeiros

pares de bases, sendo esta área inicial, a mais utilizada dentro do LSU, todo o resto

da sua extensão, no entanto, é invariante (WHITE et al., 1990).

A terceira região “ITS” fica localizada entre os genes da região 18S e 28S,

que por ser uma sequência pequena de fácil amplificação e possuir regiões

conservadas, tem sido amplamente utilizada na identificação de fungos a nível de

espécie e mesmo entre espécies. O ITS ainda é dividido em duas partes, o ITS-1

posicionado entre o gene 18S, o 5.8S, e o ITS2, separando o 5.8S e 28S (WHITE et

al., 1990; SCHLOTTERER et al., 1994; ATKINS; CLARK, 2004).

No gênero Trichoderma, a região ITS tem grande importância na sua

caracterização molecular, cada uma das 83 espécies de Trichoderma já possui

sequências depositadas deste gene no Genbank (DRUZHININA et al., 2005). Por ser

uma região já amplamente estudada e espécie específica, tem sido a mais utilizada

na identificação do gênero, porém, alguns cuidados devem ser tomados, pois, em

espécies muito próximas, pode não ocorrer distinção entre indivíduos analisados

(DRUZHININA et al., 2005). Na seção Trichoderma, por exemplo, diferentes

14

espécies compartilham as mesmas sequências ITS (LIECKFELDT et al., 1999;

SAMUELS, 2006). Entretanto graças a utilização dessa sequência como marcador

molecular, Kinderman et al. (1998) conseguiram analisar a filogenia de todo o

gênero, posicionando a seção Pachybasiume identificando como parafilético,

resolvendo um impasse entre esta seção e a seção Trichoderma(KULLNIG-

GRADINGER et al., 2002; CHAVERRI et al., 2003; DRUZHININA; KUBICEK, 2005;

KUBICEK et al., 2008). No gênero Hypocrea a importância do gene ITS foi

demostrada por Kindermann et al. (1998), que durante muito tempo foi utilizado

sozinho para esclarecer algumas relações filogenéticas dentro do

gênero(CHAVERRI; SAMUELS, 2003).

Em algumas espécies do gênero Fusarium e em alguns vegetais a região ITS

tem sido desacreditada, pois determinados grupos tem apresentado cópias

parálogas localizadas dentro do rDNA. No gênero Trichoderma há também relatos

de divergência associada a esta sequência em T.strictipile(T.strictipile null)e

T.crassum (T.crassum null)(BUCKLER et al., 1997; O'DONNELL; CIGELNIK, 1997;

DRUZHININA; KUBICEK, 2005).

Ferramentas „„on-lines‟‟ e bancos de dados genéticos com frequência são

utilizados para identificação em nível de espécie no gênero Trichoderma, porém,

rotineiramente o pesquisador se baseia em resultados que indicam maior

porcentagem de similaridade (98% ou „„best hit‟‟), porém, por descuido e pela falta de

um controle de qualidade, sequências tem sido depositadas com nome de outras

espécies (DRUZHININA; KOPCHINSKIY, 2006).

Em seu trabalho, Druzhinina et al. (2005) desenvolveu o projeto DNA

„„barcode‟‟ para o gênero Trichoderma com intuito de facilitar o processo de

identificação e reduzir os problemas ocasionados por ambiguidade, empregando a

região ITS para identificar as espécies. As regiões compostas por íntrons, segundo

Druzhinina et al.(2005), são as preferenciais para determinar espécie específica na

utilização do „„barcode‟‟. Diferentes estudos realizados por mais de 10 anos

utilizando o gene identificaram corretamente mais de 1500 espécies, justificando sua

escolha (DRUZHININA; KUBICEK, 2005).

Com a finalidade de tornar o processo de identificação mais simples e

eficiente, desenvolveu-se então, baseado na região ITS, o programa Trichokey,

tendo como alvo as sequências especificas do gênero (DRUZHININA; KUBICEK,

2005; DRUZHININA et al., 2005). O programa atua como banco de dados contendo

15

sequências de 88 espécies do gênero que através do „„hallmarks‟‟ característico,

fornece a identificação das espécies, dependendo assim, basicamente, da qualidade

da sequência utilizada (KUHLS et al., 1996; KINDERMANN et al., 1998; KUBICEK et

al., 2003; DRUZHININA; KUBICEK, 2005).

2.5 ISOLAMENTO E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DO GÊNERO

O gênero Trichoderma é comumente isolado do solo onde apresenta

frequência de 101 a 103 propágulos por grama, seu teleomorfo, Hypocrea, é

usualmente encontrado colonizando cascas de árvores e plantas herbáceas, sendo

considerado colonizador secundário por preferir matéria em decomposição

(HARMAN et al., 2004). Atua sobre uma variedade de substratos, onde concorre

com outros fungos por nutrientes e exudatos (DANIELSON; DAVEY, 1973;

SAMUELS, 1996; HARMAN et al., 2004; HANADA et al., 2008). Devido a seu rápido

crescimento e conidiação, espécies são facilmente obtidas do solo utilizando

técnicas convencionais.Alguns anamorfos, já relacionados ao gênero Hypocrea,

podem ser obtidos a partir de inoculação direta do ascósporo, ou do tecido

estromatal (GAMS; BISSET, 1998).

Determinados agregados (ou complexos) de espécies possuem localização

geográfica limitada, embora a maioria dos representantes deste gênero já tenha sido

isolada de diferentes regiões e altitudes, como exemplo, T. polysporum (T.

polysporum null)e T.minutisporum (T.minutisporum null)são espécies conhecidas

pela sua limitação a regiões frias, enquanto T. hamatum(T. hamatum null)e

T.pseudokoningii (Trichoderma pseudokoningii Rifai)são mais habituadas a regiões

de umidade excessiva (DAVET, 1979; SAMUELS, 2006). Estudos realizados na

Rússia, Sibéria e no Himalaia não detectaram presença dos indivíduos pertencentes

a seção Longibrachiatum, sendo considerados inexistentes ou com baixa ocorrência

nestas localizações (KULLNIG et al., 2000).

O gênero, porém, possui representantes já isolados de vários ecossistemas como:

campos agrícolas, pradarias, florestas, pântanos e desertos, incidindo em diferentes

zonas climáticas (DANIELSON; DAVEY, 1973; ROIGER et al., 1991; WARDLE et al.,

1993; SMITH, 1995). Das espécies de Trichoderma que são consideradas

verdadeiramente cosmopolitas, podemos citar: T. asperelum(Trichoderma

16

asperellum Samuels, Liechfeldt & Nirenberg), T. hamatum (T. hamatum Rifai), T.

koningii (T. koningiiOudem) e T. harzianum, sendo este ultimo encontrado mais

comumente em temperaturas mais elevadas (DAVET, 1979; CHAVERRI; SAMUELS,

2003).

A realização das análises quantitativas e da distribuição do gênero são, no

geral, dificultada em regiões onde há altas temperaturas, ou onde as condições do

solo são mantidas secas por um período de tempo muito longo, outros entraves

estão relacionadas às limitações metodológicas e a imprecisão taxonômica (DAVET,

1979).

Estudos envolvendo a distribuição do gênero foram inicialmente restritos a

América do Norte e a Europa central (BISSETT, 1991; KULLNIG et al., 2000). A

buscaem regiões negligenciadas como: Sibéria, Himalaia, sudeste da Ásia, Egito,

América do Sul e Central resultou na identificação de novas espécies (KULLNIG et

al., 2000; BISSETT et al., 2003; KRAUS et al., 2004; DRUZHININA; KUBICEK,

2005). Naturalmente, análises envolvendo a distribuição geográfica do gênero

tendem a se complementar. Na região do leste da China, Turner et al. (1996) não

detectaram nenhuma espécie da seção Longibrachiatum, no entanto, estudos

posteriores realizados por Zhang et al. (2005), confirmaram a presença de

T.longibrachiatum, relacionando este com a presença de H.orientalis, seu

equivalente teleomorfo (TURNER et al., 1996; ZHANG et al., 2005).

Estudos envolvendo determinadas regiões contidas na molécula de DNA

podem determinar sua origem e dispersão, possibilitando assim conhecer melhor

sua localização, população e possíveis formas de dispersão (ZHANG et al., 2005;

SAMUELS, 2006).

3 HIPÓTESE

Há diversidade entre os isolados de Trichoderma spp. oriundos de solos

agrícolas localizados no norte do Maranhão.

17

4 OBJETIVOS

Realizar identificação morfológica e molecular dos isolados de Trichoderma

spp. provenientes do norte do Maranhão, com auxilio de técnicas convencionais e

moleculares utilizando a região ITS (Internal transcribed spacer).

4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Identificar os isolados de Trichoderma, quanto às propriedades morfológicas.

Avaliar quais isolados que melhor atuam como agente de biocontrole nos teste

“in vitro”.

Realizar a caracterização molecular dosisolados utilizando a região ITS.

Avaliar a confiabilidade da região ITS nos estudos filogenéticos de isolados do

gênero Trichoderma.

18

5 MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRASE ANÁLISE QUÍMICA

Amostras de solos foram obtidas in locoe através do Laboratório de Análise

de Solos da UEMA, oriundas dos municípios de: São Luís (Bairros do Bom jardim,

Itapera,Quebra pote, Cinturão verde), Lago dos Rodrigues, Raposa, Humberto de

Campos, Bacabal, Nova Olinda, Boa Vista do Gurupi, Miranda do Norte, São José

de Ribamar, Buriti e Carutapera. Todos pertencentes à região norte do

Maranhão.(Tabela 1)

Tabela 1.Origem e cultura dos isolados de Trichoderma obtidos a partir de amostras de solo de diferentes municípios do Maranhão.

Identificação das amostras

Origem Cultura Nª de Isolados. Obtidos

TA, TV, TC1, TF1, TG1

Bom Jardim Cultura do maracuja 5

TB, TT, TZ, TH1 Itapera Cultura do maracujá 4 TC, TD, TB1, TL1 Quebra pote Cultura do maracujá 4

TU Cinturão verde Cultura do maracujá 1 TJ Lago dos Rodrigues Amostra de solo 1

TM2 Raposa Horticultura 1 TN2, TQ2, TV2 Humberto de campos Amostra de solo 3 TO2, TZ2, TA3, TC3, TM3, TN3

Bacabal Amostra de solo 6

TB3 Nova Olinda Horta comunitária 1 TD3 Boa Vista do Gurupi Área queimada 1

TE3, TF3, TG3, TH3, TI3, TJ3

Miranda do Norte Amostra de solo 6

TL3, TO3 São José de Ribamar Amostra de solo 2 TP3 Buriti Amostra de solo 1

TQ3 e TR3 Carutapera Amostra de solo 2

As características químicas do solo foram avaliadas através das análises de

rotina no laboratório de solos do Mestrado em Agroecologia da Universidade

Estadual do Maranhão (IAC, 2001). O pH foi quantificado em água destilada,

enquanto a matéria orgânica foi analisada a partir do fracionamento físico utilizando

o método de Machado (2002).

As amostras foram submetidas ao método de diluição em placas estabelecido

por Menezes e Assis(2004) onde uma massa de 10 g de solo foi transferida para 90

ml de água destilada permanecendo sobre agitação por 30 minutos, alíquotas de 10

19

ml foram transferidas para outros tubos através de sucessivas diluições até uma

fração final de 10-3, e semeadas em meio Batata Dextrose Agar (BDA)

contendoClorafenicol, Sulfato de Estreptomicina e Rosa de Bengala (BDAm)

(VARGAS GIL et al., 2009) e incubadas em condições laboratoriais (25-28°). As

colônias resultantes foram então submetidas ao processo de purificação através da

técnica do cultivo monospórico em ágar-água (MENEZES; ASSIS, 2004). O número

de isolados no solo foi determinado por meio de unidades formadoras de colônias

(UFC), para isso utilizou-se a fórmula (número de colônias x 10-n/gr de solo).

5.2 IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES

A identificação foi realizada através das chaves de classificação de Gams e

Bisset (1998), Rifai (1969) e Samuels et al. (2012). Percentual de crescimento e

características morfológicas foram analisadas em meio Batata Dextrose (BDA) e

Extrato de Malte Agar (EMA) (Himedia). Após o crescimento das colônias purificadas

um disco de micélio (5 milímetros) foi retirado e colocado a aproximadamente 1,5 cm

da borda da placa de petri (9 centímetros) contendo 20 ml de meio de cultura onde

ficaram incubados por uma semana nas condições laboratoriais de luz e temperatura

(28±1ºC). Ainda para analisar suas características macroscópicas os isolados

também foram inseridos no centro da placa para verificar seu desenvolvimento radial

por três dias. Para avaliar sua velocidade de crescimento os isolados foram

incubados no escuro em meio BDA nos intervalos de 24, 48 e 72 horas. Os

caracteres microscópicos foram analisados segundo a morfologia, dimensão e

disposição dos conídios e fiálides, utilizando lâminas preparadas através da técnica

de microcultivo em EMA (Himedia), o material foi então visualizado com corante azul

de algodão. A dimensão dos conídios, das fiálides e a análise da velocidade de

crescimento foram descritos como valor mínimo e máximo de todas as medições

colocadas entre parêntesis separados pela média do desvio padrão. Outras

características como difusão através do meio e odor adocicado de coco também

foram levados em consideração

20

5.3 CARACTERÍSTICAS DE ANTAGONISMO

5.3.1 MICOPARASITISMO

Para analisar o potencial antagônico dos isolados de Trichoderma utilizou-se

a técnica de pareamento de cultura em placas de petri contra o isolado Fusarium

oxysporum f.sp. passifloraePurss (Fop4) proveniente da micoteca da Universidade

Estadual do Maranhão – Mestrado em Agroecologia. Discos de micélio contendo o

fungo hospedeiro e o antagonista (5 mm de diâmetro) foram retirados das colônias e

colocados simultaneamente em bordas opostas a 7 cm de distância entre os

isolados em condições de laboratório (28±1ºC). O delineamento foi inteiramente

casualidado com cinco repetições. O nível de antagonismo foi avaliado após sete

dias através da mensuração do crescimento linear tanto do hospedeiro quanto do

antagonista (DENNIS; WEBSTER, 1971b).Placas contendo somente o fungo

fitopatógeno foram utilizadas como controle. Para a análise dos dados utilizou-se a

escala proposta por Linhares (LINHARES et al., 1995) que avalia a inibição do

crescimento do patógeno através de porcentagem classificando o isolado em três

níveis diferentes: E (Eficiente 80 a 100%), M (Moderadamente eficiente 51 a 79%) e

I (Ineficiente menos de 50%). A análise do crescimento micelial foi realizada

utilizando o teste de Turkey a 5% de probabilidade.

5.3.2 PRODUÇÃO DE METABÓLITOS VOLÁTEIS

O efeito dos metabolitos voláteis dos isolados de Trichoderma sobre o

crescimento micelial deFop4 foi avaliado utilizando a técnica desenvolvida por

Bharat et al. (1980). Discos de micélio de 5 mm do patógeno e do antagonista foram

posicionados no centro da placa e depois sobrepostos um sobre o outro com placas

contendo meio BDA. O disco contendo o fitopatógeno foi posicionado na placa

superior e o antagonista na inferior. Em seguida os isolados foram incubados em

condições laboratoriais (28±1ºC) por sete dias. O delineamento foi inteiramente

casualidado com cinco repetições. A testemunha consistiu somente de Fop4 tanto

na parte superior quanto na inferior da placa. Os isolados foram igualmente

21

analisados através do teste de tukey 5% e avaliados através da escala de Linhares

(LINHARES et al., 1995).

5.4 ANÁLISE MOLECULAR

5.4.1 EXTRAÇÃO E AMPLIFICAÇÃO DO DNA GENÔMICO

Do total 11 isolados foram selecionados aleatoriamente para identificação

molecular e análise filogenética. O DNA foi extraído com o DNeasy Plant mini kit

seguindo o protocolo do fabricante (Qiagen, Hilden, Germany), toda a etapa de

extração foi realizada no laboratório de genética e biologia molecular na UEMA e no

laboratório de biologia molecular da Universidade Ceuma. O processo de

amplificação e sequenciamento foi realizado na Universidade Federal do Recôncavo

Baiano (UFRB) através da parceria com o laboratório de Microbiologia Aplicada

coordenado pelo professor Jorge Teodoro de Souza. Os “primers” utilizados para

amplificaçãoforam ITS1 (5‟-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‟) e ITS4 (5‟-

TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‟) contendo as regiões ITS1,2 e 5,8S com fragmento

de cerca de 600 bp (WHITE et al., 1990). Para a realização da PCR em 25 µL

utilizou- se 2,5 µL de tampão (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KCl); 2,0 μL de

dNTPs (2,5 mM); 1 μL de cada “primer” (10 pmol/μL); 2,0 μL MgCl2 (50 mM), 0,3 μL

Taq DNA polymerase (5 U/μL), 2 μL DNA (5 ng/μL) e 14,2 μL de água miliQ

autoclavada. As amplificações foram feitas em termociclador (peqSTAR universal

gradiente), empregando-se o programa com ciclo inicial de 94 oC por 3 min, seguido

de 30 ciclos de 30 s a 94 oC, 1 min a 58 oC, e 2 min a 72 oC; e uma extensão final a

72 0C por 5 min (NITSCHKE et al., 2009).

5.4.1.1. ANÁLISE DOS PRODUTOS OBTIDOS NA PCR.

Para verificar a eficiência da PCR especifica em amplificar a região de

interesse, 8μL do produto obtido em cada reação, foi acrescido de 2μL do corante

(Blue 6x loading dye da promega, EUA). Os fragmentos foram separados por

eletroforese em gel de agarose 1,2% em tampão TBE 0,5x (Tris-borato-EDTA

[100mM Tris base e 2,0 mM da solução de EDTA pH 8.0) e 50 mM de ácido bórico a

22

eletroforese ocorreu a 100v por um período de 40 a 60 minutos. Após a corrida is

géis foram corados em brometo de etidio (1,5 μg/mL) durante 15 minutos , em

seguida foram visualizados em transluminador com luz ultra-violeta e fotografados

para documentação (SAMBROOK et al., 1989).

5.4.2 PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO

Os produtos da PCR foram purificados utilizando o QIAquick PCR Purification

Kit (Qiagen), sendo em seguida sequenciados através do método de Sanger et al.

(1977) utilizando-se dos mesmos “primers”

já descritos para a obtenção dos respectivos fragmentos. As reações foram

feitas em um volume final de 10 μL, contendo 2,5 μL de DNA da amostra (5 ng/μL),

0,4 μL de cada“primer” (10 pM/μL) e 1,0 μL de BigDye® Terminator v3.1 Cycle

Sequencing Kit (Applied biosystems), 2,0 μl do tampão de sequenciamento 5X

(Applied biosystems) e 4,1 μL de água ultrapura. As amplificações foram realizadas

em termociclador programado para uma desnaturação inicial a 96 °C por 1 min,

seguida de 35 ciclos de três etapas: desnaturação (96 oC, 10 seg), anelamento (50

oC, 5 seg) e extensão (65 oC, 4 min). Após a amplificação, a precipitação foi

realizada com 40 μl de isopropanol 65 %, centrifugado a 4.000 rpm por 40 min. Após

a precipitação o DNA foi lavado com 200 μl de etanol 60%. O DNA foi ressuspendido

em 10 μL de formamida e aquecido a 93 °C por 3 min e resfriado rapidamente. Em

seguida, foi submetido à eletroforese em seqüenciador ABI prism 310 Genetic

Analiser (Applied Biosystem). A condição de injeção das amostras foi de 2 Kv por 30

seg. A condição de eletroforese foi de 12 Kv por 120 min, a correção das sequências

foi realizada utilizando o programa BioEdit.

5.4.3 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E FILOGENIA

A identificação molecular foi realizada utilizando a ferramenta de identificação

online Trichokey (http://www.isth.info/tools/molkey/index.php), classificando as

sequências em três níveis de confiabilidade: baixo, padrão e alto. O alinhamento e

construção da árvore filogenética foi realizada com o programa Mega 5.0 utilizando

as sequências disponíveis no Genbank. Para a construção da árvore filogenética

somente sequências empregadas em trabalhos publicados, com „„score‟‟ alto (1000)

http://www.isth.info/tools/molkey/index.php

23

e „„e-value‟‟ igual a zero foram utilizadas. O método estatístico utilizado foi o

„„Neighbor-Joining‟‟ (NJ) com o modelo de Kimura 2 parâmetro a 10.000 replicatas

(KIMURA, 1980; SAITOU; NEI, 1987).

6 RESULTADOS

6.1 ISOLAMENTO E QUANTIFICAÇÃO

Um total de 38 isolados de Trichoderma foram obtidos dos 11 municípios

localizados no norte do Estado do Maranhão (Figura 1). Para obtenção dos isolados

foram identificadas colônias com características típicas de Trichoderma.

As amostras que apresentaram maior concentração de unidade formadora de

colônia por grama de solo (UFC/g) foram as provenientes de Miranda do Norte (6 x

104 UFC/g), seguido por Bacabal (5 x 104 UFC/g), e duas amostras provenientes de

São Luís com com 4 x 104 e 4 x 104 UFC/g (Quadro1).

Quanto às características químicas do solo, as amostras que apresentaram

níveis de pH muito forte (4.0 – 4.9) foram provenientes dos municípios de: Nova

Olinda, Boa Vista do Gurupi, Miranda do Norte e Buriti. Os municípios de: São Luís,

Lago dos Rodrigues, Humberto de Campos, e São José de Ribamar exibiram níveis

forte de pH (5.0 – 5.6) (Quadro1). Com relação à matéria orgânicaos municípios de

Buriti (24 g/dm3), Boa Vista do Gurupi (22 g/dm3) e Itapera (21 g/dm3) apresentaram

os mais altos níveis de matéria orgânica dentre as amostras, enquanto os municípios

de São José de Ribamar e Humberto de Campos exibiram os menores (13g/dm3), no

entanto, nenhuma das amostras alcançou valores considerados médios (25 a 50

g/dm3) (Embrapa Trigos, 2009) (Quadro1).

24

Figura 1 - Mapa do Estado do Maranhão indicando os 11 pontos de coleta das amostras de solo.

Fonte: geographicguide 2012. Modificado pelo autor.

25

Quadro1. Isolados de Trichodermaspp. provenientes das amostras povenientes dos solos localizados nos municípiosdo norte Estado do Maranhão e análise dos parâmetros químicos.

Fonte: Luz, 2012 aM.O.: Matéria orgânica

bUFC/g: Unidades formadoras de colônias por grama de solo

cDetalhes da espécie na tabela 2

Origem Substrato pH M.O

a

g/dm3

UFC/gb Espécie Identificação

c

São Luís

Polo agrícola (Bom Jardim) – cultura de

maracujá 5.6 19

4 x 104 T. asperellum

TA TC1 TF1 TG1

1 x 104 T. atroviride TV

Polo agrícola (Itapera) – cultura de maracujá

5.0 21

2 x 104

T. asperellum TB

TH1

2 x 104 T. harzianum

TT TZ

Polo agrícola (Quebra Pote) – cultura de

maracujá 5.5 19 4 x 10

4 T. asperellum

TC TD TB1 TL1

Polo agrícola (Cinturão Verde) – cultura de

maracujá 5.0 19 1 x 10

4 T. asperellum TU

Lago dos Rodrigues

Pastagem 5.1 16 1 x 104 T. aggressivum TJ

Humberto de Campos

Amostra de solo com cultura não identificada

5.0 13 2 x 10

4 T. asperellum

TN2 TV2

1 x 104 T. konilangbra TQ2

Bacabal Capim monbaça 5.3 15 5 x 10

4 T. asperellum

TZ2 TA3 TC3 TM3 TN3

1 x 104 T. fertile TO2

Nova Olinda Horta comunitária 4.1 18 1 x 104 T. asperellum TB3

Raposa Polo agrícola (Cumbique) – horticultura

- - 1 x 104 T. asperellum TM2

Boa Vista do Gurupi

Área queimada (Banana e Quiabo)

4.3 22 1 x 104 T. ghanense TD3

Miranda do Norte


4.1 15 6 x 104 T. asperellum

TE3 TF3 TG3 TH3 TI3 TJ3

São José de Ribamar


5.1 13 1 x 10

4

1 x 104

T. harzianum T. asperellum

TL3 TO3

Buriti Amostra de solo com

cultura não identificada 4.8 24 1 x 10

4 T. ghanense TP3

Carutapera Amostra de solo com

cultura não identificada - - 2 x 10

4 T. asperellum

TQ3 TR3

26

6.2 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA

Com base nas características morfológicas sete espécies diferentes foram identificadas: T.asperellum, T. aggressivum, T.

harzianum, T. atroviride, T. fertile,T. ghanense. e T. konilangbra(Tabela 2)

Tabela 2. Características morfológicas em meio BDA e EMA das espécies de Trichoderma spp. obtidos de solos de municípios do norte do Maranhão

Características /Iso. T. asperellum T. aggressivum T. harzianum T. atroviride T. fertile T. ghanense T. konilangbra

Cresc. Micelial 72 hrs (50-) 54 mm (-60) 70 mm (57-) 58mm (-60) 39 mm 70 mm 70 mm 70 mm

Cor da colônia BDA

EMA

Verde e amarelo

Verde e branco

Verde e branco

Verde e branco

Verde escuro

Verde escuro

Verde amarelo

Verde branco

Branco

Verde

Verde e Amarelo

Verde

Verde

Verde

Cor do reverso BDA

EMA

Creme

Verde

Incolor

Branco

Incolor

Incolor

Incolor

Incolor

Pálido

Verde

Verde

Verde

Pálido

Verde

Conidiação BDA

EMA

Anel

Anel

Contínuo

Contínuo

Anel

Anel

Anel

Anel

Continuo

Anel

Anel

Anel

Anel

Anel

Odor Adocicado de coco

+ +

Formato da fiálide Ampuliforme Formato de frasco Ampuliforme Formato de frasco

Linear Linear Cilíndrico

Tamanho das fiálides (μm)

(9,8-)10(-12) x (1-)2 (6-) 10 x 2 6 (-7) x (1-) 2 (8-)10 x (2-) 2,3

(-5) 6,5 (-10) x 2 (7-) 7 (-10) x 2 (4-) 5,2-8,2(-10)

Formato do Conídio Globosos –Subglobosos

Subglobulosos –Ovais

Globosos Subglobosos –Ovais

Elipsoidais Elipsoidais Elipsoidais

Tamanho do Conídio (μm)

(2-)3,2(-4) x (2-)2,6(-4)

(2-) 2,7(-3) x (-2)2,7(-2)

2 x 2 3 x 3 2 x 2 5 x (1-)2 3-2

27

Em meio BDA os isolados deT. asperellum(Trichoderma asperellum Samuels,

Liechfeldt & Nirenberg)formaram colônias regulares com o centro verde escuro e

com margens brancas após 72 horas de crescimento (Figura 2a e 2b).Após uma

semana de desenvolvimento apresentou padrões alternados de cor verde e amarelo

(Figura 2c e 2d). Em EMA anéis concêntricos de cor verde e branco se formaram,

com cor creme no reverso (Figura 2e e 2f). No escuro as colônias apresentaram

crescimento rápido de(50-) 54 mm (-60) em meio BDA. Duas a quatro fiálides se

formaram na ponta e nos ramos dos conidióforos com formato ampuliforme de (9,8-

)10(-12) x (1-)2 μm de onde brotaram fialiósporos que originaram conídios verde

escuro e globosos a subglobosos de (2-)3,2(-4) x (2-)2,6(-4) (Figura 2g e 2h).

O isolado T. aggressivum (Trichoderma aggressivum Samuels & W.

Gams),apresentou cor branca após 72 horas (Figura 3a e 3b) e cor branca com

pigmentos verdes após sete dias em BDA nas condições de laboratório (Figura 3c e

3d). Em EMA desenvolveu micélio branco com um único anel verde sem pigmento e

difusão através do meio. Crescimento rápido (70 mm) em meio BDA foi observado

(Figura 3e e 3f). Fiálides apresentaram tamanho de (6-) 10 x 2 μm com formato de

garrafa,alargada no meio e constrita na base. No geral, conídios apresentaram

formato subglobuloso a oval de (2-) 2,7(-3) x (-2)2,7(-2)μm(Figura 3g e 3h).

Figura 2 - Características morfológicas dos isolados de T.asperellum. (a) Crescimento radial em 72 horas (BDA) Crescimento linear em 1 semana (BDA), (b) Reverso (BDA), (c) Crescimento linear em 1 semana (EMA), (d) Reverso (EMA), (e) Reverso, (f) Conídios e (g) Fiálides.

Fonte: Luz, 2012.

28

As colônias dos isoladosT.harzianum(Trichoderma harzianum

Rifai)apresentaram micélio branco nas 72 horas (Figura 4a e 4b). Durante os sete

dias de crescimento as colônias exibiram inicialmente cor amarela, passando para o

verde escuro no final, com presença do odor adocicado de coco (Figura 4c e 4d). Em

EMA as colônias foram caracterizadas pela cor verde escuro (Figura 4e e 4f).

Colônias com crescimento rápidode (57-) 58mm (-60) foram observadas nas 72

horas.Fiálidesde 6 (-7) x (1-) 2 μm com formato ampulifome se desenvolveram com

tamanho que variavam originando conídios de 2 x 2 μm (Figura 4g e 4h).

Figura 4 -Características morfológicas dos isolados de T. harzianum. (a) Crescimento radial em 72 horas (BDA) Crescimento linear em 1 semana (BDA), (b) Reverso (BDA), (c) Crescimento linear em 1 semana (EMA), (d) Reverso (EMA), (e) Reverso, (f) Conídios e(g) Fiálides.

Fonte: Luz, 2012.

Figura 3 - Características morfológicas dos isolados de T. aggressivum. (a) Crescimento radial em 72 horas (BDA) Crescimento linear em 1 semana (BDA), (b) Reverso (BDA), (c) Crescimento linear em 1 semana (EMA), (d) Reverso (EMA), (e) Reverso,(f) Conídios e (g) Fiálides.

Fonte: Luz, 2012.

29

Em meio BDA o isolado T. atroviride (Hypocrea atroviride Dodd, Lieckfeldt &

Samuels)formaram colônias de cor verde nas 72 horas em condições laboratoriais

(Figura 5a e 5b). Após uma semana formou três a quatro anéis concêntricos com

massas de conídios verdes, amarelos com a margem branca (Figura 5c e 5d). Em

EMA apresentou centro verde escuro com margens brancas além do odor de coco

presente no meio (Figura 5e e 5f). No escuro em BDA exibiu crescimento baixo (39

mm). Através da microscopia foi possível observar fiálides com tamanho de (8-)10 x

(2-) 2,3 μm, brotando em linha reta com formato de frasco. Conídios de 3 x 3 μm de

dimensão se desenvolveram com formato subglobosos e ovoides (Figura 5g e 5h).

Colônias de T.fertile(Trichoderma fertile Bissett)formaram micélio denso com

pigmentação branca após 72 horas (Figura 6a e 6b).Depois de uma semana de

desenvolvimento em BDA os isolados produziram extenso micélio aéreo de cor

branca (Figura 6c e 6d). Em EMA após uma semana exibiu inicialmente cor verde

passando para o verde escuro (Figura 6e e 6f). No escuro em meio BDA apresentou

crescimento rápido (70 mm). Fiálides terminais se desenvolveram linearmente com

formato de gancho cilíndrico, ligeiramente alargado em alguns casos com (-5) 6,5 (-

10) x 2 de comprimento onde brotaram conídios elipsoidais de 2 x 2 μm (Figura 6g e

6h).

Figura 5 -Características morfológicas dos isolados de T. atroviride. (a) Crescimento radial em 72 horas (BDA) Crescimento linear em 1 semana (BDA), (b) Reverso (BDA), (c) Crescimento linear em 1 semana (EMA), (d) Reverso (EMA), (e) Reverso,(f) Conídios e (g) Fiálides.

Fonte: Luz, 2012.

30

Os isolados de T.ghanense (Trichoderma ghanense Doi, Abe & J.

Sugiyama)formaram anéis concêntricos com centro verde e margem branca (Figura

7a e 7b). Quando o disco foi colocado na borda da placa apresentou também anéis

que iam da cor verde e amarelo ao verde escuroem uma semana (Figura 7c e 7d).

Em EMA apresentaram micélio de cor verde escuro (Figura 7e e 7f). Crescimento

rápido (70 mm) foi observado após 72 horas no escuro. Fiálides cilíndricas ou

ligeiramente alargadas no meio com formato de gancho apresentaram média de (7-)

7 (-10) x 2 μm produzindo conídios elipsoidais de 5 x (1-)2 μm (Figura 7g e 7h).

Figura 7 -Características morfológicas dos isolados de T. ghanense. (a) Crescimento radial em 72 horas (BDA) Crescimento linear em 1 semana (BDA), (b) Reverso (BDA), (c) Crescimento linear em 1 semana (EMA), (d) Reverso (EMA), (e) Reverso,(f) Conídios e (g) Fiálides.

Fonte Luz, 2012.

Figura 6 -Características morfológicas dos isolados de T. fertile. (a) Crescimento radial em 72 horas (BDA) Crescimento linear em 1 semana (BDA), (b) Reverso (BDA), (c) Crescimento linear em 1 semana (EMA), (d) Reverso (EMA), (e) Reverso e (f) Conídios, (g) Fiálides.

Fonte: Luz, 2012.

31

Em BDA colônias apresentaram cor verde no centro ficando branco na

medida em que se desenvolviam em direção as margens (Figura 8a e 8b). Na borda

da placa após sete dias T. konilangbra(Trichoderma. konilangbra Samuels, O. Petrini

& Kubicek, sp. nov.) exibiu colônias brancas formando uma superfície contínua de

micélio branco (Figura 8c e 8d). Em EMA conidióforos formaram anéis concêntricos

de cor verde escura. Crescimento rápido também foi observado (70 mm) após 72

horas em BDA (Figura 8e e 8f). Fiálides compridas tendendo a ser cilíndricas de (4-)

5,2-8,2(-10) μm, comconídios elipsoidais 3-2(Figura 8g e 8h).

6.3 CARACTERÍSTICAS DE ANTAGONISMO.

6.3.1 MICOPARASITISMO.

Os resultados dos testes de pareamento verificados na tabela 3, figura 9

demonstraram que todos os isolados avaliados diferiram estatisticamente da

testemunha pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade,exibindo potencial

capacidade para a inibição do crescimento de Fop4.

Figura 8 -Características morfológicas dos isolados de T. konilangbra. (a) Crescimento radial em 72 horas (BDA) Crescimento linear em 1 semana (BDA), (b) Reverso (BDA), (c) Crescimento linear em 1 semana (EMA), (d) Reverso (EMA), (e) Reverso, (f) Conídios e (g) Fiálides.

Fonte: Luz, 2012.

32

Dentre todos os isoladosTG3,TM3, TN3 (T. asperellum) e TT (T. harzianum)

exibiram o maior potencial de inibição (100%), TG1, TH1, TN2, TA3, TF3, TH3, TJ3

(T. asperellum) também obtiveram níveis eficientes, no entanto, não inibiram

completamente o patógeno. Os isolados: TA, TB, TC, TD, TU, TB1, TC1, TF1, TL1,

TM2, TV2, TZ2, TB3, TC3, TE3, TI3, TO3, TQ3, TR3 (T. asperellum), TJ (T.

aggressivum), TV (T. atroviride), TZ, TL3 (T. harzianum), TO2 (T.fertile), TQ2 (T.

konilangbra), TD3 e TP3 (T. ghanense) apresentaram níveis moderados de inibição.

Tabela 3. Avaliação do potencial antagonista dos isolados de Trichoderma contra o crescimento micelial de Fusarium oxysporum f.sp. passiflorae (Fop4).

Pareamento Metabólitos Volatéis

Identificação Cresc.

Fop4 (cm)1

Percentual de

inibição

Reação2 Identificação. Cresc.

Fop4 (cm)1

Percentual

de inibição

Reação2

TA 1,42 bcde 71% M TA 4,62 abc 12% I

TB 1,12 bcdef 77% M TB 3,85 bcd 26% I

TC 1,05 bcdef 78% M TC 4 abcd 23% I

TD 1,12 bcdef 68% M TD 4,86 ab 7% I

TJ 1,4 bcd 71% M TJ 4,86 abc 8% I

TT 0 f 100% E TT 4,77 abc 10% I

TU 1,42 bcd 71% M TU 4,1 bcd 22% I

TV 1,66 bc 66% M TV 3,9 bcd 25% I

TZ 1,1 bcdef 77% M TZ 4,43 abc 15% I

TB1 1,76 bc 64% M TB1 3,87 bcd 26% I

TC1 1,27 bcdef 74% M TC1 4,67 abc 11% I

TF1 1,22 bcdef 75% M TF1 2,68 d 49% I

TG1 0,93 bcdef 81% E TG1 4,16 abcd 20% I

TH1 0,43 cdef 91% E TH1 4,66 abc 11% I

TL1 1,32 bcdef 73% M TL1 4,56 abc 13% I

TM2 1,52 bc 69% M TM2 4,06 bcd 22% I

TN2 0,2 def 95% E TN2 4,32 abc 17% I

TO2 1,3 bcde 73% M TO2 4,24 abc 19% I

TQ2 2,16 b 56% M TQ2 4,45 abc 15% I

TV2 1,04 bcdef 79% M TV2 4,7 abc 10% I

33

1As médias da coluna seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de

Tukey a 5% de probabilidade 2 As letras significam respectivamente (E) Eficiente, (M) Moderadamente eficiente (I) Ineficiente

Tabela 3 continuação.

TZ2 1,2 bcdef 75% M TZ2 4,46 abc 15% I

TA3 0,54 cdef 89% E TA3 4,7 abc 10% I

TB3 1,62 bc 67% M TB3 4,54 abc 13% I

TC3 1,48 bcd 70% M TC3 4,68 abc 11% I

TD3 1,48 bcd 70% M TD3 4,34 abc 17% I

TE3 1,4 bcd 71% M TE3 4,12 abcd 21% I

TF3 0,22 def 95% E TF3 3,86 abcd 26% I

TG3 0 ef 100% E TG3 4,08 bcd 22% I

TH3 0,58 cdef 88% E TH3 3,9 bcd 25% I

TI3 2,22 b 55% E TI3 3,34 cd 36% I

TJ3 0,6 cdef 87% E TJ3 4,36 abcd 17% I

TL3 2,22 b 55% M TL3 4,7 abc 10% I

TM3 0 ef 100% E TM3 4,58 abc 12% I

TN3 0 ef 100% E TN3 4,68 abc 11% I

TO3 1,52 bc 69% M TO3 4,7 abc 10% I

TP3 1,78 bc 64% M TP3 4,3 abc 18% I

TQ3 1,5 bc 69% M TQ3 4,83 abc 1% I

TR3 1,68bc 66% M TR3 4,84 ab 1% I

F4 4,97 - - - 5,26 - -

34

O crescimento de Fop4 foi sempre suprimido quando entrou em contato com

os isolados de Trichoderma, mostrando uma zona de inibição entre os dois

organismos, contendo o patógeno e ocupando a área anteriormente colonizada

(Figura 9).

Destaca-se que todos os isolados classificados como eficientes apresentaram

capacidade de antagonismo, ou seja, suas colônias foram capazes de crescer sobre

os patógenos, não apenas impedindo seu desenvolvimento micelial por nutriente e

espaço, mas efetivamente demonstrando a capacidade de interagir com o patógeno

(GRUBER; SEIDL-SEIBOTH, 2012).

6.3.2 PRODUÇÃO DE METABÓLITOS VOLÁTEIS.

Todos os isolados diferiram da testemunha (Fop4) a 5% de probabilidade pelo

teste de tukey, contudo, nenhum deles apresentou valores elevados de inibição

através do teste de antibiose como mostra a tabela 3 e a figura 10, sendo todos

classificados como ineficientes.

Figura 9 - Inibição do crescimento micelial de Fop4 por isolados de:(a) T. asperellum (b) T. aggressivum, (c) T. harzianum, (d) T. atroviride, (e) T. fertile, (f) T. ghanense, (g) T. konilangbra.

Fonte: o autor.

35

6.4 ANÁLISE MOLECULAR

6.4.1 EXTRAÇÃO E AMPLIFICAÇÃO DO DNA GENÔMICO

Dos 38 isolados11 foram escolhidos aleatoriamente para identificação

molecular, estes foram amplificados resultando em um produto de 600 pares de

base observado através do gel de agarose (Figura 11).

Figura 10 - Inibição do crescimento micelial de Fop4 por compostos voláteis produzidos pelos isolados:(a)T. asperellum, (b) T. aggressivum, (c)T. harzianum, (d) T. atroviride, (e) T. fertile, (f) T. ghanense, (g) T. konilangbra.

Fonte: o autor.

Figura 11 - Corrida em gel de agarose 1,2% com produtos da PCR obtidos com os “primers” da região ITS dos isolados de Trichoderma (da esquerda para direita os dez isolados representam a espécie T. asperellum: TA, TQ2, TZ2, TA3, TE3, TF3, TH3, TI3 e TJ3. A penúltima banda corresponde a espécie T. harzianum/H.lixii TL3e a ultima a T. konilangbraTQ2).

Fonte: o autor.

36

6.4.2 PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO

As regiões ITS1, 5.8S e ITS2 foram sequenciadas e editadas gerando

seguimentos de 543 a 587pb. Estas sequências foram então submetidas a busca no

„„Basic Local Alignment Search Tool‟‟ (BLAST) e depositadas no “National Center for

„„Biotechnology Information” (NCBI). O código de acesso de depósito do Genbank

das sequências está inserido na tabela 4.

6.4.3 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E FILOGENIA

A identificação através do Trichokey apresentou valores altos de confiabidade

para todas as sequências, com exceção do isolado TQ2 (T.konilangbra) que obteve

índice padrão (Tabela 4).Inicialmente realizou-se o alinhamento múltiplo com a

ferramenta Clustaw entre os 11 isolados sequenciados neste estudo, gerando uma

matriz de similaridade (Anexo A).

Tabela 4.Identificação, espécie, origem, valores de confiabilidade do Trichokey e Número de acesso do Genbank, utilizando as regiões ITS1, 5.8S e ITS2 programa Trichokey

Id. Espécie Origem TrichOKey Genbank

TA T. asperellum São Luís Alto JX443531

TZ2 T. asperellum Bacabal Alto JX515277

TA3 T. asperellum Bacabal Alto JX515282

TE3 T. asperellum Miranda do Norte Alto JX515279

TF3 T. asperellum Miranda do Norte Alto JX515281

TH3 T. asperellum Miranda do Norte Alto JX515284

TI3 T. asperellum Miranda do Norte Alto JX515278

TJ3 T. asperellum Miranda do Norte Alto JX515283

TO3

TL3

T. asperellum

T. harzianum/H. lixii



Alto

Alto

JX515280

JX515285

TQ2 T. konilangbra Humberto de Campos Padrão JX524175

A árvore formada dividiu os isolados em dois grupos. No primeiro

posicionaram-se os nove isolados de T. asperellum (TA, TZ2, TA3, TE3, TF3, TH3,

37

TI3, TJ3 e TO3), que por conta da similaridade entre as sequências e por

constituírem a mesma espécie formaram um agrupamento com valor máximo de

„„bootstrap‟‟ (100%) (Figura 12).

Embora T. harzianum(TL3) e T. konilangbra(TQ2) não estejam na mesma

seção e não constituam a mesma espécie, posicionaram-se dentro do mesmo ramo,

sem valor de „„bootstrap‟‟. Este resultado esta relacionado a ausência de outras

sequências pertencentes as duas espécies, atrapalhando a distinção filogenética

(Figura 12).

Em seguida as sequências foram submetidas a busca no BLASTN, onde

somente resultados publicados, com „„score‟‟ alto (1000) e „„e-value‟‟ igual a zero

foram utilizadas.(Tabela 5).

Após a busca no BLASTN, observou-se que T.asperellum e T. harzianum

mostraram altos valores de similaridade („„score‟‟ 1000 e „„evalue‟‟=0), com exceção

de T.konilangra que apresentou como resultado outros integrantes do clado

Longibrachiatum como: T.longibrachiatum, H. jecorina eH. orientalis (teleomorfo de

longibrachiatum) (Anexo B), tendo maior importância os resultados apontado pelo

Trichokey (Tabela 4).

Figura 12 -Relacionamento filogenético entre os isolados deT. asperellum (TA, TZ2, TI3, TE3, TO3, TF3, TA3, TJ3, TH3), T. harzianum (TL3) e T. konilangbra(TQ2) sequenciados neste estudoutilizando o método “Neighbor-Joining”.

38

Tabela 5. Sequências dos isolados de Trichoderma obtidas do Genbank

A análise das sequências após o alinhamento (Anexo C), gerou uma árvore

parcimoniosa formando três principais grupos correspondentes as seções

Trichoderma, Longibrachiatum e Pachybasium que apresentaram ramificações entre

os indivíduos dos outros clados, como verificado na figura 13. A espécie escolhida

como grupo externo foi Hypocre aureoviride, pois apesar de encontrar-se dentro do

gênero possui uma sequência de nucleotídeos que diverge nos integrantes dos

outros clados, ocupando uma posição basal diferindo dos outros agrupamentos

(LEE; TAYLOR, 1992; HERMOSA et al., 2004).

Na seção Trichoderma os isolados de T. asperellum (TA, TZ2, TA3, TE3, TF3,

TH3, TI3, TJ3 e TO3) formaram um clado com valores de „„bootstrap‟‟ igual a 75%

quando relacionado com os isolados da China, Republica dos Camarõese

VietnamEntretanto, o isolado de T. koningii (F50) e T. intricatum (GJS 90-7)

Espécies Isolados Origem Genbank Referência

T. asperellum D21 China GQ131398.1 Xia et al. (2011)

T. asperellum GJS 05-328 Republica dos

Camarões

GU198318.1 Samuels et al. (2010)

T. asperellum GJS 06-292 Republica dos

Camarões

GU198304.1 Samuels et al. (2010)

T. asperellum GJS 90-7 Vietnam GU198317.1 Samuels et al. (2010)

T. asperellum GJS 91-24 Brasil AJ230668.1 Lieckfeldt et al. (1999)

T. asperellum TUB F-756 Brasil AY857218.1 Druzhinina et al. (2005)

H. koningii F50 China JF439478.1 Han et al. (2011)

H. intricatum GJS 02-78 Sri Lanka EU264002.1 Hanada et al. (2008)

H. lixii 397/01 Brasil HQ857108.1 Lopes et al. (2012)

H. lixii MUCL 29707 USA FR848364.1 De Jaeger et al.(2011)

H. lixii CY216 USA HQ608036.1 Rodrigues et al.(2011)

H. lixii CIB T44 Colômbia EU280077.1 Hoyos-Carvajal et al. (2009)

H. lixii DAOM234005 Peru EU280091.1 Hoyos-Carvajal et al. (2009)

H. virens TR039 USA HQ608079.1 Rodrigues et al. (2011)

H. crassa DAOM 233775 Guatemala EU280084.1 Hoyos-Carvajal et al. (2009)

T. konilangbra CY161 USA HQ607999.1 Rodrigues et al.(2011)

T. konilangbra CY215 USA HQ608035.1 Rodrigues et al. (2011)

T. konilangbra GJS 96-147 Uganda DQ083021.1 Samuels (2006)

T. longibrachiatum JH-8 China HQ717798.1 Ma et al. (2011)

H. aureoviride CBS 245.63 Reino Unido AF399219.1 Kuhls et al. (1997)

39

formaram um grupo dentro da seção separado pela diferença dos caracteres

genéticos existentes entre os clados (57%) (Figura 13).

A seção Longibrachiatum incluiu as espécies de T. konilangbra TQ2, CY161 e

CY215, provenientes da América do Norte, GJS 96-147 de Uganda e T.

longibrachiatum JH-8 da China, estes formaram um agrupamento inicial separado

por um alto valor de „„bootstrap‟‟ (99%) dividindo os isoladosT. konilangbra (TQ2,

CY161, CY215 e GJS 96-147) deT. longibrachiatum (JH-8), permanecendo dentro

da mesma seção. As quatro espécies de T. konilangbra formaram dois subgrupos,

onde no primeiro ficou reunida a espécie maranhense (TQ2) com as variações

americanas (CY161 e CY215) restando, no outro subgrupo, a espécie proveniente

de Uganda (GJS 96-147), separado por valores de „„bootstrap‟‟ igual a 79% (Figura

13).

O terceiro grupo corresponde a seção Pachybasium, neste os clados

Harzianum e Virens foram delimitados por um valor de bootstrap igual a 95%. T.

harzianum (TL3) agrupou-se com os isolados de H. lixii MUCL 29707 e CY216

provenientes dos Estados Unidos, CIB T44 oriunda da Colômbia e DAOM 234005 do

Peru, porém, o clado formou um subgrupo (68%) quando comparado com o isolado

proveniente da região do Cerrado do estado de Brasília 397/01, indicando um

provável evento de especiação entre estas duas espécies brasileiras. H. virens e H.

crassa provenientes do clado Virens formaram um agrupamento consistente dentro

da seção, separado do clado Harzianum pelas suas características genéticas (Figura

13).

40

Figura 13 -Relacionamento filogenético dos isolados de Trichoderma utilizando o método Neighbot-Joining. O percentual de replicagem da árvore no qual os táxon associados aos grupos no valor do bootstrap (10000 replicatas) são mostrados nos ramos. A distância foram computadas utilizando o Kimura 2-parâmetro. As espécies localizadas dentro dos retângulos indicam os isolados maranhenses estudados neste trabalho.

7 DISCUSSÃO

O Norte do Estado do Maranhão é uma região que sofre influência do oceano

atlântico, caracterizada pela intersecção entre o bioma amazônico (oeste

maranhense), o cerrado brasileiro (sul maranhense), o semi-árido nordestino (leste

maranhense), classificada como uma zona de ecótonos (MOURA, 2006). Em seu

trabalho, Moura (2006) ressalta a grande variabilidade espacial da pluviosidade

média da região e as características do solo, que no geral, derivam de rochas

sedimentares com baixa capacidade de retenção de cátions e teores de nutrientes

41

também baixos, além da elevada taxa de insolação equatorial que acelera a

decomposição da matéria orgânica do solo.

Em solos tropicais, colônias de Trichoderma são normalmente isoladas na

frequência de 101-103 propágulos por grama de solo. Sua germinação depende,

entretanto, de uma série de fatores como pH, temperatura, umidade e teor de

matéria orgânica em solo natural ou colonizado (HARMAN et al., 2004).

Ao avaliar a presença de Trichoderma em amostras de solos com diferentes

níveis de pH, Chet e Baker (1981) observaram uma maior presença de propágulos

por grama (8 x 105) em pH 5.1, enquanto em outras amostras obtidas de regiões

onde o pH estava alcalino (8.1) obtiveram apenas 1 x 101 propágulo por gramade

solo. Fritze e Baath (1993) em seus estudos de impacto sobre o efeito de pó alcalino

na microbiota, também constatou que o aumento do pH reduziu o número de

Trichoderma no sudeste da Finlândia.

No presente estudo correlações semelhantes às apontadas pelos trabalhos

acima foram observadas. Em todas as amostras o pH permaneceu dentro do limite

considerado próprio para o desenvolvimento do gênero (CHET; BAKER, 1981;

FRITZE; BAATH, 1993). Por exemplo, nas amostras obtidas de Mirando do Norte

onde o valor do pH foi igual a 4,1, o número de colônia por grama de solo

correspondeu a quantidade de 6 x 104, enquanto que em Bacabal e em São Luís nos

pólos agrícolas do Bom Jardim, Quebra Pote e Cinturão Verde, onde o nível de pH

foi considerado forte (5,3 a 5,6) quantidades elevadas de unidades formadoras de

colônia por grama de solo também foram encontradas (4 x 104)(Quadro2),

semelhante a relação observada entre o pH e a presença do gênero feita por Fritze

e Baath (1993). Jackson et al. (1991) concluíram que os níveis ideais de pH para

produção de biomassa em três espécies de Trichodermase encontram entre 4,6 a

6,0. Bernítez et al. (2004), ressaltam que na rizosfera, ao ser inserido, é capaz de

alterar o pH ocasionando a sua diminuição, dificultando assim o desenvolvimento de

patógenos, ao mesmo tempo que cria um ambiente ideal para sua dispersão

(FRITZE; BAATH, 1993).

As amostras de solo do norte maranhense foram compostas pela formação

Itapecuru nos municípios de São Luís, Lago dos Rodrigues, Raposa, Bacabal, Nova

Olinda, Boa Vista do Gurupi, Miranda do Norte, São José de Ribamar e Buriti, de

Aluviões em Carutapera e Barreiras em Humberto de Campos, dentre a principal

característica encontrada em comum nestas formações, podemos citar o pH, um dos

42

fatores responsáveis pela frequência do gêneronos solos maranhense (MOURA,

2006).

Os níveis de matéria orgânica apresentaram valores baixos (13-24 g/dm3)

(Quadro 1), sendo estes resultados, segundo Moura (2006), inerentes ao aspecto do

solo eda incidência luminosa, fator responsável pela sua rápida degradação.

As amostras provenientes de Miranda do Norte, Bacabal, Nova Olinda, Buriti,

Boa Vista do Gurupi e nos pólos de Itapera e Cinturão Verde não apresentaram

correspondência entre a população de Trichoderma e a matéria orgânica, esta

relação fica evidente, por exemplo, no município de Miranda do Norte que

apresentou um dos valores mais altos de propágulos por grama de solo (6 x 104

UFC/g), no entanto, exibiu um dos valores mais baixos de matéria orgânica (15

g/dm3) (Quadro1).

Estes resultados divergem dos apresentados por Lewis e Papavizas (1984),

que observaram valores crescentes de colôniado gênero no solo após a utilização

de substratos orgânicos.

Entretanto a relação entre a população de Trichoderma e o substrato orgânico

foi positiva nas amostras provenientes dos pólos agrícolas do Bom Jardim e Quebra

Pote, nestes locais os valores de matéria orgânica foram elevados (19 g/dm3),

mostrando um número maior de unidades formadoras de colônia (4 x 104 UFC/g).

Enquanto níveis mais baixos (13-16 g/dm3) nas amostras provenientes dos

municípios de Lago dos Rodrigues, Humberto de Campos e São José de Ribamar

foram acompanhados por baixas quantidades de propágulos por grama de solo (1-2

x 104 UFC/g). O crescente aumento populacional do gênero relacionado com o

aumento de matéria orgânica já havia sido observado por Liu et al. (2008) e Bulluck

e Ristaino (2002),sendo considerado o melhor insumo para o crescimento

populacional do gênero. Liu et al. (2008) e Wilberforce et al. (2003) enfatizam que

mais estudos devem ser realizados para entender como este, e outros fatores,

afetam a dinâmica do Trichoderma e sua distribuição em diferentes tipos de solos.

Neste trabalho sete espécies foram identificadas morfologicamente nos solos

maranhenses (Tabela 2), sendo sua presença no País já anteriormente descrita em

outros trabalhos. Em São Paulo, Brasília e Bahia a ocorrência de T.asperellumfoi

registrada em estudos realizados por Corabi-Adell et al. (2002), Tocafundo et al.

(2008) e Marcello et al. (2008). A presença de T.harzianum já foi relatada

anteriormente no Estado de São Paulo, Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Paraná e

43

Bahia (CORABI-ADELL et al., 2002; REZENDE et al., 2002; TOCAFUNDO, 2008).

T.atroviride,T. ghanense,T. aggressivum,T.fertile,também já tiveram sua presença

relatada em trabalhos realizados nos Estados de São Paulo e Brasília (CORABI-

ADELL et al., 2002; MARTINS et al., 2007; FILHO et al., 2008). A espécie T.

konilangbraintegrante do clado Longibrachiatum já foi anteriormente isolada em

Uganda (SAMUELS et al., 1998) e nos Estados Unidos (HOYOS-CARVAJAL et al.,

2009; RODRIGUES et al., 2011), porém, até o momento, sua presença em solos

brasileiros não foi registrada em nenhum trabalho até então publicado (SAMUELS et

al., 2012).

Com relação as características morfológicas os isolados puderam ser

identificados em nível de espécie através dos aspectos apresentados pelas colônias

nos diferentes meios, e através do estudo morfométrico das suas microestruturas

(Tabela 2, Figura 2-8), destaca-se assim, a importância da utilização de outros meios

de cultura no processo de identificação, uma vez que, o gênero compartilha uma

serie de características, sendo de fundamental importância o desenvolvimento dos

isolados em meio BDA e EMA, além de posicionar o disco de micélio em locais

diferentes da placa de petri (borda e centro) (CORABI-ADELL et al., 2002), como

exemplo, no presente trabalho as espécies de T.asperellum apresentaram

características coloniais extremamente próximas da espécie T.ghanense, sendo sua

identificação inicial só possível graças a utilização de uma segunda fonte de

nutriente, o meio Extrato de Malte Agar (Figura 2 e 7), o crescimento radial ainda foi

uma segunda opção para diferenciação entre as espécies, pesquisadores atentam

sobre a semelhança neste aspecto entre T.asperellum e T.viride, que tem causado

dificuldade de distinção entre os taxonomistas, tendo permanecido como um

impasse durante muito tempo (SAMUELS et al., 1999; CORABI-ADELL et al., 2002;

SAMUELS, 2006).

Para Rifai (1969) a classificação das espécies no gênero dependeria apenas

da sua ligação com o seu equivalente teleomorfo o gênero Hypocrea, porém, vale a

pena ressaltar que várias espécies utilizadas na sua obra originaram-se de

ascósporos. Alguns outros gêneros são frequentemente confundidos com o

Trichoderma, dentre eles temos o GliocladiumCorda(GliocladiumCorda Corda);

Vertcillium spp e Acremonium sp., que de fato, chegam a se enquadrar devido a uma

série de outras características que compartilham com o gênero (RIFAI, 1969).

44

Problemas taxonômicos baseados na morfologia levam determinadas

espécies a serem redescobertas, uma vez que, em alguns casos, diferentes

espécies partilham quase todas as características em comum, por exemplo, T.

martiale é morfologicamente idêntico a T.viride, mas difere deste pela produção de

pústulas em Extrato de Malte Agar e pelo seu crescimento que é um pouco mais

rápido (HANADA et al., 2008).

Neste mesmo caso, fatores como suas características biológicas (endófito

isolado no alburno) e localização biogeográfica (Ex. T. viride é encontrado com

frequência em regiões de clima temperado, sua presença fora da América do Norte e

da Europa é considerada rara) reforçaram a sua definição como espécie

(JAKLITSCH et al., 2006; HANADA et al., 2008).

Com relação às chaves de classificação, ainda observa-se a dificuldade na

padronização dos critérios utilizados para a caracterização, as chaves, de um modo

geral, quando não são antigas, são desatualizadas, restando ao pesquisador a

busca de artigos onde as espécies estão descritas isoladamente. Nas chaves ainda

é comum os autores não incluírem o local de semeadura das colônias (alguns

colocam no centro da placa outros na borda), descrevendo apenas o crescimento

micelial. Ainda com relação às chaves, a ausência de imagens constitui um

problema critico, pois as características morfológicas são apresentadas unicamente

através da descrição, sem imagens, gerando margem para erros subjetivos (ex.

espécies normalmente são descritas como verde, verde escuro ao verde oliva com

tons de amarelo puvurulentas ou granular) (GAMS; BISSET, 1998; CORABI-ADELL

et al., 2002).

O mesmo problema frequentemente ocorre com as medidas das

características microscópicas, que no geral, apresentam intervalos muito grande

entre seu tamanho (a maioria das espécies apresentam microestruturas que variam

de 3 μm a 24 μm) (Figura 2-8) (GAMS; BISSET, 1998). Dentre outros entraves

podemos citar também a conidiogênese, que na maioria dos casos apresentou-se de

maneira rápida e irregular, resultando em fiálides que ficavam sobrecarregadas de

conídios atrapalhando a microscopia e danificando as estruturas dos verticilos

(Figura 2-8) (CORABI-ADELL et al., 2002).

Por conta dos fatores apresentados acima é comum nas chaves de

classificação o emprego de expressões como “frequentemente”, “usualmente” e

45

“raramente” configurando um problema para a atividade taxonômica (GAMS;

BISSET, 1998; CORABI-ADELL et al., 2002).

No ambiente Trichoderma atua parasitando uma série de outros fungos,

incluindo espécies que são estreitamente próximas como integrantes do gênero

Fusarium spp. e Botrytis cinerea(Botrytis cinereaPers)(GRUBER; SEIDL-SEIBOTH,

2012). Nos testes “in vitro” Três isolados de T.asperellum apresentaram total inibição

do patógeno (TG3, TM3, TN3), enquanto os outros (TG1, TH1, TN2, TA3, TF3, TH3,

TI3, TJ3) obtiveram valores moderados. Em seu trabalho Silva (2010),avaliou a

capacidade antagonista de seus isolados, e encontrou valores moderados para

todas as espécies de T.asperellum (62,9%-64,1%), enquanto Haggag e Mohamed

(2011) encontraram níveis eficientes de inibição do patógeno. T.harzianum(TL3),

obteve potencial moderado de inibição (61%), enquanto o outro T. harzianum (TT)

alcançou valor máximo de parasitismo (Tabela 3 e Figura 9), indo de encontro com

os resultados de Louzada (2009), que em seu estudo utilizando T.harzianum

observou valores eficientes e moderados.

Valores altos também foram encontrados por Filho et al. (2008) e Carvalho et

al. (2011) para T. harzianumque em todos os casos conseguiu inibir o fitopatógeno

Fusarium oxyporum, encontrando valores eficientes e moderados (FILHO et al.,

2008; LOUZADA et al., 2009; CARVALHO et al., 2011).

Os isolados de T.aggressivum (TJ) e T.atroviride(TV) obtiveram notas

moderadas (Tabela 3 e Figura 9), indo de encontro aos resultados apresentados por

Boureghda e Bouznad (2009) que tiveram notas de inibição semelhantes. A relação

entre o gênero Fusarium e o antagonista T.atroviride foi descrita por Lutz et al (2003)

que reportou uma associação entre a biossíntese da toxina produzida pelo fungo e a

ativação de genes do antagonista na produção de quitinase, caracterizando um

sistema de defesa para impedir a ação da enzima de degradação de parede celular.

Durante o processo de micoparasitismo a produção destas enzimas é apontada

como fator principal para a ação antagônica de T.aggressivum sobre outros fungos

(GUTHRIE; CASTLE, 2006).

Através dos resultados apresentados na tabela 3 foi possível observar uma

capacidade de inibição moderada para T.fertile(TO2) corroborando com o trabalho

realizado por Martins et al.(2007) que encontraram resultados semelhantes contra o

fitopatógeno Colletotrichum gloeosporiodes (Penzig). Valores moderados e eficientes

de inibição foram expressos pelas espécies de T. ghanense, estes resultados foram

46

semelhantes aos de Castillo et al. (2011) contra o fitopatógeno Sclerotinia

slerotiorum(Lib). A espécie T. konilangbratambémconseguiu inibir o patógeno

quando comparado com a testemunha obtendo valores moderados de inibição.

Enquanto se desenvolve ou interage com outros microrganismos a maioria

das espécies de Trichoderma produz mais de 100 compostos antibióticos que

podem se difundir através do ar, dentre estes podemos citar: ácido harzianico,

alameticina, tricholina, antibióticos peptabolico (BENÍTEZ et al., 2004; HARMAN et

al., 2004). Os isolados utilizados neste trabalho foram capazes de inibir o

crescimento do patógeno quando comparados em relação a testemunha, porém,

não houve diferença significativa quando comparados entre eles (Tabela 3 e Figura

10). Segundo Dennis e Webster (1971a) determinadas espécies de Trichoderma são

eficientes produtores de metabólitos voláteis in vitro, porém, essa forma de atuação

é mais eficiente se for empregada em associação ao micoparasitismo.

Sem dúvida desde o trabalho apresentado por Weindling (1932),

Trichodermaé apontado pela literatura como um agente de biocontrole, sendo

conhecido por ser parasita de muitas espécies de fungos. Contudo, vale ressaltar

que o nível de controle pode variar entre os isolados e sua adaptação aos fatores

ambientais (WEINDLING, 1932; DENNIS; WEBSTER, 1971b; HOWELL, 2003;

HARMAN et al., 2004). A atividade de micoparasitismo pode ser o resultado

somatório de todos os recursos que o gênero possui para inibição do outro fungo

(micoparasitismo, produção de enzimas de degradação de parede celular e

metabólitos) ou simples competição por espaço e nutrientes (PERELLÓ et al., 2003).

Por apresentar os entraves característicos da sua morfologia, a

caracterização molecular tornou-se uma ferramenta mais confiável para identificação

da diversidade de Hypocrea/Trichoderma (KUBICEK et al., 2008). A caracterização

utilizando o Trichokeyse baseia no emprego das regiões localizadas dentro da

sequência ITS, esta ferramenta foi desenvolvida com a finalidade de auxiliar

taxonomistas a identificar as espécies de Trichodermade maneira mais rápida e

segura (DRUZHININA et al., 2005).

O barcode foi desenvolvido com base em 979 sequências de 88 espécies de

Trichoderma possibilitando identificar cerca de 95% das espécies conhecidas e

ainda reconhecer novas (DRUZHININA et al., 2005). Para sua utilização é

necessário que a sequência seja de alta qualidade e a amplificação da região ITS1-

47

5.8S, rRNA e ITS2 deve estar completa (DRUZHININA et al., 2005; KUBICEK et al.,

2008).

No presente estudo as espécies apontadas pelo Trichokey foram confirmadas

a partir dos resultados mostrados pelo Genbank, este atua realizando uma análise

baseada nos algoritmos de similaridade através de outras sequências depositadas

por diferentes autores, é um sistema dinâmico e integrado, dependente das

informações inseridas (CORABI-ADELL et al., 2002; DRUZHININA et al., 2005).

Santos (2010) em seu trabalho ressaltam que o Trichokey, porém, pode apresentar

alguns problemas para discriminar determinados isolados dentro do complexo

koningiie rufa, além de não diferenciar T.longibrachiatum – H.orientalis,

T.tomentosum e T.cerinum.

Dentro do gênero a ligação entre as características moleculares e as

morfológicas ainda não estão completamente compreendidas (SAMUELS, 2006).

Mesmo com a existência de determinadas regiões gênicas com capacidade de

correlacionar diferentes expressões fenotípicas, possíveis problemas relacionados a

estes genes podem ocorrer devido a sua forma de atuação, podendo depender de

mecanismos regulatórios paralelos e ainda não compreendidos, sendo estes

padrões passíveis de mudança (CORABI-ADELL et al., 2002; SAMUELS, 2006). As

regiões muito conservadas, porém, possibilitam uma melhor identificação a nível de

espécie, entretanto, por conta da baixa variabilidade, podem não ser capazes de se

correlacionarem com a morfologia dificultando o agrupamento em classes distintas

(CORABI-ADELL et al., 2002).

Neste cenário a caracterização taxonômica a partir de informações

moleculares apresentam certas limitações, outros fatores como o depósito de

sequências incorretas no Genbank (apenas o preenchimento do questionário é

requerido para o depósito das sequências, ficando de responsabilidade do próprio

autor fazer eventual correção/atualização), tornam o processo de identificação mais

difícil (CORABI-ADELL et al., 2002; DRUZHININA; KUBICEK, 2005). A ausência de

sequências para determinadas espécies também constituíram um entrave, como é o

caso de T.konilangbra, onde somente seis sequências foram encontradas para o

gene ITS.

A árvore filogenética gerada pelo método Neighbor-joining (Figura 13)

mostrou que os isolados foram identificadoscorretamente, uma vez que, os grupos

resultaram em ramos contendo indivíduos pertencentes a suas respectivas seções.

48

As espécies de T. asperellum formaram um clado único, suportando valores de

bootstrap maior que 70%,seu posicionamento em clados distintos dentro da seção

Trichoderma e seu relacionamento filogenético com a espécie T. koningii, já

foradetectado por Hermosa et al. (2004). Atualmente a espécie T. asperellum se

encontra dentro da seção Hamatum, pois durante muito tempo acreditava-se ser

uma das duas variações da espécie T. viride, porém, após uma abordagem

associada com os caracteres morfológicos e moleculares foi possível observar que a

espécie T. viride formava na realidade um grupo parafilético, definindo variação I de

T. viride como o verdadeiro T. viride anamórfico de H. rufa (LIECKFELDT et al.,

1999) e a variação II de T. viride como T. asperellum (LIECKFELDT et al., 1999;

SAMUELS et al., 1999; SAMUELS et al., 2010)

Neste estudo observou-se que os isoladosT. harzianum (397/01, MUCL

29707, CY216, CIB T44, DAOM234005) não formaram um único grupo,

posicionando os isolados em ramos separados da espécie brasileira (397/01),

demonstrando um forte indício de especiação, pois como visto por Druzhinina et al.

(2010) e Kullnig et al. (2000) esta é uma das espécies com maior variabilidade,

representada atualmente como um complexo.

Em seu trabalho Kuhls et al. (1999) constataram um evento parafilético no

grupo, uma vez que, a proximidade genética entre os isolados de outras espécies

como T.stromataticum e T.virens já havia sido confirmada.

Neste estudo a sequência de H. virensposicionou-se em um grupo separado,

suportando altos valores de bootstrap, confirmando sua posição dentro da seção. A

proximidade com T. harzianum já havia sido observada inicialmente por Bisset

(1991) que colocou a espécie H. virens junto com o agregado de T. harzianum. Em

outro estudo Lieckfeldt et al. (1998) ressaltam a proximidade entre estas espécies

através da região ITS, constituindo grupos separados por valores acima de 89%.

Chaverri e Samuels (2003) observaram posicionamentos semelhantes dentro do

clado Virens, quando utilizaram T. virens junto com T. crassum/H. crassa,

empregando a região Fator de alongamento 1.

Samuels et al. (2000) atentam que a identificação molecular das espécies de

T. harzianum deve ser feita com cuidado. Segundo Druzhinina et al. (2010) a

presença dominante na maioria dos ecossistemas e sua capacidade de ocupar

diferentes nichos resultou na complexa estrutura de sua população, estes fatores

49

aliado ao isolamento reprodutivo, eventos simpátricos e alopátricos, resultaram no

aparecimento de agamoespecies e numerosas linhagens relíquias com posições

filogenéticas ainda não definidas (DRUZHININA et al., 2012).

A espécie T.konilangbra formou agrupamentos consistentes como os

observados por Samuels et al. (2012) demonstrando afinidade genética entre os

isolados do mesmo continente. Os dois subgrupos formados com as espécies de T.

konilangbra foram possivelmente separados devido a sua origem geográfica,

indicando maior proximidade entre o isolado maranhense TQ2 com as espécies

americanas (CY215 e CY161), do que com as variações africanas (GJS 96-147).

Sua presença ainda é pouco relatada no continente Americano, formando um

clado com T.flagellatum,T.sinense e uma espécie recentemente descoberta

T.gillessi, sendo T. konilangbra mais frequente em países Paleotropicais (SAMUELS

et al., 1998).

Samuels et al. (1998) atenta sobre o uso de caracteres morfológicos para

identificação desta espécie, pois T. konilangbra é fenotipicamente semelhante a T.

citronoviride e T. longibrachiatum, porém, sua principal diferença encontra-se na sua

velocidade de crescimento, que é inferior a das espécies citadas. Neste estudo

quando analisado filogeneticamente junto com T. longibrachiatum os isolados de T.

konilangbraformaram um agrupamento em outro ramo, segundo Samuels et al.

(1998) este evento é devido a diferença de seis pares de bases na região ITS-1 que

difere a espécie T. konilangbra das demais localizadas dentro da seção

Longibrachiatum, outro fator que ainda deve ser ressaltado é o baixo número (12

isolados) de depósitos de sequências desta espécie, sendo considerado por Kullnig

te al. (2000) como reflexo da ausência de estudos em regiões ainda negligenciadas,

o que leva a uma ausência ou escassez de exemplares em culturas de coleção.

8 CONCLUSÃO

Dentre os 38 isolados de Trichodermasete espécies foram identificadas: T.

aggressivum, T. harzianum, T. atroviride, T. fertile,T. ghanense. T.konilangbra

eT.asperellum, sendo esta última a que apresentou maior incidência nos solos do

Estado. Estes resultados estão possivelmente relacionados as características dos

solos da região, que em geral, é pobre em nutrientes em um ambiente de ciclos de

50

alta e baixa intensidade pluviométrica e temperaturas elevadas características dos

trópicos úmidos.

As informações contidas nas chaves de classificação morfológica continuam

imprecisas, sendo a metodologia variante muitas vezes entre os diferentes trabalhos

publicados.

A análise molecular, diferentemente da morfológica, já possui um maior

número de recursos que possibilitam uma identificação com maior confiabilidade,

dentre estes fatores, ressalta-se a importância de um produto de amplificação da

PCR com boa qualidade. A análise através do Trichokey por ser simples e rápida

apresenta uma alternativa segura a análise das regiões ITS1, 5.8S e ITS2.

A presença da espécie T. konilangbra, até então não relatada em solos

brasileiros mostrou a importância do estudo do gênero em regiões negligenciadas,

uma vez que, análises como as apresentadas neste trabalho fornecem base para

futuras pesquisas biogeográficas, enriquecendo a taxonomia do gênero.

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64

APÊNDICE A - Sequência da região ITS1-5,8S-ITS2 do rDNA alinhadas, dos isolados de Trichoderma spp. obtidos neste estudo

Continuação

65

Continuação

Continuação

66

Continuação

67

APÊNDICEB -Análise comparativa das sequências obtidas pelo programa BLASTN,

indicando o número de depósito, score e o e-value.

68

APÊNDICEC

Sequência da região ITS1-5,8S-ITS2 do rDNA alinhaoas, dos isolados de Trichoderma spp. utilizandos neste estudos e obtidos através

do Genbank.

69

Continuação.

70

Continuação.

71

Continuação.

72

Continuação.

73

CONFIRMAÇÃO DE ENVIO DO ARTIGO

Dear Mr. Luz,

Your submission entitled "Identification of Trichoderma spp. from agricultural

soils in northeastern periphery of Amazonia, Brasil." has been received by

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Thank you for submitting your work to this journal.

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74

1 NORMAS E INTRUÇÕES PARA OS AUTORES 2

GENERAL GUIDELINES 3 Scope of the Journal The Journal of Microbiology (JM) publishes papers that deal with 4

research on microorganisms, including archaea, bacteria, yeasts, fungi, microalgae, protozoa, 5 and simple eukaryotic microorganisms. Topics considered for publication include biochemistry, 6 physiology, molecular biology, genetics, genomics, molecular biotechnology, virology, 7 immunology, microbial pathogenesis, ecology, environmental microbiology, molecular 8 systematics, bioinformatics, chemical or physical characterization of microbial structures or 9 products and basic biological properties of organisms. Manuscripts dealing with simple 10 identification of microorganism(s), cloning of a known gene and its expression in a microbial 11 host, and clinical statistics will not be considered for publication by JM. 12

The environmental microbiology and ecology section expects authors to deposit 13 important strains in publicly accessible culture collections and to refer to the collections and 14 strain numbers in the text. Since the authenticity of subcultures of culture collection specimens 15 that are distributed by individuals cannot be ensured, authors should indicate laboratory strain 16 designations and donor sources as well as original culture collection identification numbers. 17 Furthermore, it is a requirement of the Journal of Microbiology and the ICSP (International 18 Committee on Systematics of Prokar- yotes) that authors of new names and new combinations 19 provide evidence that types are deposited in two recognized culture collections in two different 20 countries (i.e. documents certifying deposition and availability of type strains). Papers will not 21 be accepted until such documentation has been received by the Editor. 22

The molecular biology, genetics, and biochemistry section does not consider 23 manuscripts describing mainly the followings: cloning and sequencing of cDNAs or genes that 24 have previously been reported for other species; purification of proteins that have been 25 previously been reported for other species; conventionally achieved expression of proteins; 26 incomplete NMR or other spectroscopic assignments; conventionally achieved crystallization of 27 proteins; or negative observations. In most cases, methodological papers are not published 28 unless they are novel and significant. 29

Submission of Papers All submissions to JM must be made electronically via the web- 30 enabled online manuscript submission and review system : www. editorialmanager.com/tjom (E-31 mail submissions will not be accepted). Information regarding acceptable types of files for sub- 32 mission can be found on the On-line Submission page of the Journal Homepage. It is 33 recommended that all tables and figures be assembled into a single file together with the main 34 text when submitted. The manuscript must be accompanied by a cover letter stating the title of 35 the manuscript, names of each author, and complete mailing address(es), telephone and fax 36 number(s) of the corresponding author, electronic mail address(es) if available. Manuscripts 37 should be double-spaced and all pages, including the abstract, figures, and tables, should be 38 numbered in sequence. Manuscript pages must have margins of at least 2.5 cm on all four 39 sides. Authors who are not confident of their English writing should have checked their 40 manuscripts by an English proofreader. All queries regarding the submission should be directed 41 to the Editorial Office. 42

Editorial Office The Microbiological Society of Korea Rm. 810 (New Bldg.), The Korea 43 Science & Technology Center 635-4, Yeoksam-dong, Gangnam-gu, Seoul 135-703, Republic of 44 Korea E-mail: [email protected] Tel: +82-2-3453-3386 Fax: +82-2-3453-3322 45

EDITORIAL POLICY 46 Originality Only papers that report novel and significant scientific findings in 47

microbiology will be considered and accepted for publication. Manuscripts submitted to JM must 48 represent reports of original research. A manuscript will be accepted on the conditions that the 49 presented work was not published previously, and is not under consideration for publication 50 elsewhere. 51

Authorship Anyone who made a substantial contribution to the work may be included in 52 the author list. All authors of each manuscript are responsible for the entire paper and must 53 have agreed that the corresponding author has the authority to act on their behalf on all 54 matters pertaining to publication of the manuscript. To avoid any possible dispute during 55 processing, authorship changes including the order of authors‟ names during revision must be 56 agreed upon by all of the authors and brought to the editor‟s attention in the cover letter 57 submitted with the revised version. 58

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Copyright JM requires the corresponding author to sign a copyright transfer agreement 59 on behalf of all the authors. This agreement form is sent to the corresponding author when the 60 manuscript is accepted and scheduled for publication. Unless the signed agreement form is 61 received, JM will not publish the manuscript. 62

Ethical Aspects Manuscripts dealing with any experimental work on human or animal 63 materials should meet the relevant regulations or requirements imposed by institutional or 64 governmental authorities, and this should be clearly stated in the manuscript. Copies of these 65 regulations and guidelines must be available for review by the editor if necessary. The editor 66 reserves the right to reject papers if ethical aspects are in doubt. 67 Page Charges Page charges are currently 40,000 Korean won (35 US dollars) per page. A 68 page charge form is sent along with page proofs and a reprint order form to the corresponding 69 author prior to publication. Invited minireviews are not subject to page charges. 70 Availability of Materials By publishing in JM, the authors agree that any microbial 71 strains, plasmids, viruses, or other materials such as prions or cell lines newly described in the 72 articles be available in a timely fashion to members of the scientific community for 73 noncommercial purposes. JM strongly encourages the authors to deposit important strains in 74 publicly accessible culture collections and to refer to these collections and strain numbers in 75 the manuscript. The authors should indicate laboratory strain designations and donor source 76 when individuals distribute the culture or subculture specimen. 77

Nucleotide and Amino Acid Sequences Any novel nucleotide or amino acid 78 sequences described should be deposited in a public database, such as GenBank, EMBL or 79 DDBJ, and the accession numbers should be included in a separate paragraph in the 80 Materials and Methods section. It is expected that the sequence data will be publicly available 81 no later than the publication of the article. 82

Supplementary Material Supplementary material may consist of information that cannot 83 readily be displayed in printed version because of space or technical limitations. Such material 84 may include data from microarray, structural, biochemical, or video image analysis. It is 85 reviewed along with the paper and must be approved by the editors and referees. Instead of 86 appearing in the printed version of the journal, it will be published in SpringerLink 87 (http://www.springerlink.com/ content/120956) at the time of publication. 88

Review Process All manuscripts are reviewed confidentially by members of the editorial 89 board or qualified reviewers. When a manuscript is submitted to JM, it is given a manuscript 90 number and assigned to one of the members of the board for review. The manuscript number 91 should be referred to in any subsequent communications between the corresponding author 92 and the editor or the Editorial Office. The reviewers operate under the Guidelines for Reviewers 93 and are expected to complete their reviews as soon as possible. The corresponding author is 94 generally notified of the reviewers‟ decision to accept, reject, or require modification or revision 95 from the editor or the Editorial Office within 4 weeks of submission. When a manuscript is 96 returned to the corresponding author for modification or revision, it should be returned to the 97 editor within 3 months, or it may be considered withdrawn. The authors should supply the 98 Authors‟ Checklist and Response to the editor along with the modified or revised manuscript. 99 Manuscripts that have been rejected or withdrawn may be resubmitted if the major criti- cisms 100 have been properly addressed. As with the initial submission, resubmitted manuscripts should 101 be accompanied by a cover letter stating that the manuscript is a resubmission and describing 102 in detail what changes have been made. The same editor that han- dled the original submission 103 will normally handle the resubmitted manuscript. 104

Notification of Acceptance When an editor has decided that a manuscript is acceptable 105 for publication, the corresponding author and the editorial office will be notified. The Editorial 106 Office will check if the manuscript was prepared according to the guidelines, however the 107 authors are primarily responsible for the format and quality of the paper. The editor of JM will 108 complete the assignment of editing after the manuscript is considered to meet the prescribed 109 standards. 110

Page Proofs The Editorial Office sends printed page proofs and a page charge/ 111 reprint order form to the corresponding author. Page proofs should be corrected, signed by the 112 corresponding author and mailed back to the editorial office within 48 hours, however extensive 113 corrections, additions, or deletions should not be made during the proof stage. Important new 114 information or references of unpublished data or personal communications that have become 115 available in the time between acceptance of the manuscript and receipt of the proofs may be 116 inserted with the permission of the editor. Otherwise, changes are limited to correction of 117

76

spelling errors, incorrect data, grammatical errors and updated information regarding 118 references. 119 Reprints Reprint charge is currently 50,000 Korean won (45 USD) for the initial 50 copies. Extra 120 copies are available for 30,000 Korean won (25 USD) per additional 50 copies. It can be 121 ordered and pur- chased through the page charge/reprint order form that is sent to the 122 corresponding author prior to publication. 123

ORGANIZATION AND FORMAT 124 Regular Papers Regular papers are considered the usual format of JM. Each 125

manuscript should present the results of an independent and co- hesive study. Thus, numbered 126 series titles are not allowed. Avoid the main title/subtitle arrangement, complete sentences, and 127 un- necessary articles. A regular paper should include all of the elements described in this 128 section. The entire manuscript, including the figure legends, table legends, and References, 129 should be double spaced and pages should be numbered. Manuscript pages should have line 130 numbers. The font size should not be larger than 12. JM strongly recommends using the past 131 tense to narrate particular events in the past, including procedures, observations, and data 132 pertaining to the study that you are reporting. Use the present tense for your own general 133 conclusions, conclusions of previous researchers, and generally accepted facts. Thus, most of 134 the Abstract, Materials and Methods, and Results sections will be in the past tense, and most of 135 the Introduction and Discussion sections will be in the present tense. Manuscripts may be 136 editorially rejected on the basis of poor English or lack of format conformity to the Instructions. 137 Title Page On the title page, include the title, running title (not to exceed 10 words), name of 138 each author, address(es) of the institution(s) where the work was performed, each author‟s 139 affiliation, and a footnote indicating the present address of any author no longer at the institution 140 where the work was performed. Place an asterisk after the name of the corresponding author. 141

Abstract The abstract should not exceed 250 words, and should concisely summarize 142 the basic content of the paper. Experimental details should not be presented in the abstract. 143 Avoid abbreviations and do not include references or diagrams. Provide less than six key words 144 at the bottom of the Abstract. 145 Introduction The introduction should supply sufficient background information to allow the 146 reader to understand and evaluate the results of the present study without referring to previous 147 publications on the topic. The introduction should also provide the rationale for the present 148 study. Use only those references required to provide the iv most salient background rather than 149 an extensive review of the topic. 150

Materials and Methods The Materials and Methods section should include sufficient 151 technical information to allow the experiments to be repeated. Give enough information about 152 the maker and model of instru- ment, operating conditions and other details of the experimental 153 procedures. For commonly used materials and methods (media and protein determinations for 154 example), a simple reference is sufficient. Enzyme purifications or procedures should be 155 described as briefly as possible. If several alternative methods are commonly used, it is helpful 156 to identify the method briefly as well as to cite the reference. Describe new methods or 157 techniques in detail and give sources of unusual chemicals, equipment, or microbial strains so 158 that another investigator can repeat the same procedure. When a large number of microbial 159 strains, mutants, bacteriophages, or plasmids are used, include tables identifying their sources 160 and properties. 161

Results The Results section should include results of the experiments. Extensive 162 interpretation of the results should be reserved for the Discussion section. Present the results 163 as concisely as possible in one of the following: text, table(s), or figure(s). Avoid extensive use 164 of graphs to present data that might be more concisely presented in the text or tables. Limit 165 photographs, particularly photomicro- graphs and electron micrographs, to those that are 166 absolutely necessary to show the experimental findings. Number figures and tables in order 167 and be sure to cite all figures and tables in the text. 168 Discussion The Discussion section should provide an interpretation of the results in relation to 169 previously published works and should not contain extensive repetition of the Results section or 170 reiteration of the Introduction. In short papers, the Results and Discussion sections may be 171 combined. 172

Acknowledgements Acknowledgements of financial and personal assistance are to be 173 given in a separate paragraph(s) as briefly as possible. 174

References The References section should include all journal articles, books, patents, 175 and theses cited in the text, tables or figures. Arrange the citations in alphabetical order based 176

77

on the first authors‟ name. Abbreviate journal names, according to BIOSIS Serial Sources, in 177 italic letters. Cite the references in the text by author name(s) with the publication year. Single- 178 and double-authored papers are cited by both authors‟ last names, whereas papers with more 179 than three authors are cited by the first author‟s last name followed by et al. in italic. Other 180 relevant sources, such as articles submitted for publication, unpublished data, or personal 181 communication, should not be listed in this section, but can be cited in the text. Follow the 182 styles shown in the examples below. 183 Anagnostopoulos, C. and Spizizen, J. 1961. Requirements for transforma- tion in Bacillus 184 subtilis. J. Bacteriol. 81, 741–746. Berry, L.J., Moore, R.N., Goodrum, K.J., and Couch, R.E. Jr. 185 1977. Cellular requirements for enzyme inhibition by endotoxin in mice, pp. 321–325.In D. 186 Schlessinger (ed.), Microbiology-1977.American Society for Microbiology, Washington, D.C., 187 USA.Dhole, A., Ortega, I., and Berauer, C. 1989.Effect of oxygen on in vitro growth of 188 Mycobacterium leprae.Abstr. U-82, pp. 168. Abstr.89th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 189 Leadbetter, E.R. 1974. Order II. Cytophagales nomen novum, pp. 99. In R.E. Buchanan and 190 N.E. Gibbons (eds.), Bergey‟s Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed. The Williams & 191 Wilkins Co., Baltimore, Maryland, USA. Miller, J.H. 1972. Experiments in molecular genetics, 192 pp. 352–355.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, N.Y., USA. 193 Na, J.U., Youn, H., and Kang, S.O. 1993. Physicochemical characterization of chlorosome 194 isolated from Chlorobium limicola NCIB 8327. Kor. J. Microbiol. 32, 9–16. Powers, R.D., Dotson, 195 W.M.Jr., and Hayden, F.G. 1982. Program Abstr.22nd Intersci. Conf. Antimicrob. Agents 196 Chemother., iv Abstr. 448. Sigma Chemical Co. 1989. Sigma manual. Sigma Chemical Co., St 197 Louis, Missouri, USA. Smyth, D.R. 1972. Ph. D. thesis.University of California, Los Angeles, 198 California, USA. 199

Notes The note format is intended for the presentation of brief observations that do not 200 warrant full-length papers. Submit Notes in the same way as regular papers. They receive the 201 same review and are not considered preliminary communications. Notes should be prepared 202 according to the following guidelines. The abstract should not exceed 100 words. Section 203 headings (Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion etc.) should not be used in 204 the body of Note. Text should not exceed 2,000 words, excluding the Title page and 205 References, and the number of figures and tables should also be kept to a minimum. Present 206 acknowledgments in a separate paragraph, but do not use a heading. The References section 207 is identical to that of Regular Papers. 208

Minireviews Minireviews are brief summaries of developments in fast moving areas. 209 They must be based on published articles, and may address any subject within the scope of JM. 210 Minireviews are invited by the editors, not solicited, and are not subject to editorial review. 211 Anyone, wishing to submit minireviews, should provide a potential title and subject of the 212 review article to the editors to seek permission. 213 Errata The Erratum section includes correcting errors that occurred during typing, editing, or 214 printing (like as a misspelling, a dropped word) of a published article. Send Errata to the JM 215 editorial office by e-mail ([email protected]). 216

Author‟s Correction The Author‟s Correction section is for correcting errors of a sci- 217 entific nature or omission that do not affect the original results of a published article. Send the 218 Corrections of a scientific nature to the JM editorial office by e-mail ([email protected]). 219

Fast-track Publication (Accelerated Publication) A fast-track process is available for 220 authors who desire quick publication of their papers. Authors should contact the Editorial 221 Office (fax: +82-2-3453-3322, e-mail: [email protected]) for fast-track submission. Authors must 222 submit a cover letter stating the novel and significant results of the research and the need for 223 fast-track publication. The review process will be conducted as rapidly as possible, usually 224 within 7-10 working days of receipt, and publication of accepted papers in an issue will follow 225 within 2 months of the date of acceptance. Manuscripts requiring major revisions will not be 226 accepted, but can be considered for normal-track review. Authors will be charged 100,000 KRW 227 per printed page of fast-track publication. Additionally, 100,000 KRW will be charged for the 228 initiation of fast-track review. 229 v 230

ILLUSTRATIONS AND TABLES 231 Photographs Photographs must be of sufficient contrast to withstand the in- evitable 232

loss of contrast and detail inherent in the printing process. Submit one photograph of each 233 figure in the manuscript. Photocopies are not acceptable. If possible, figures submitted should 234 be the size they will appear when published so that no reduction is necessary. If they must be 235

78

reduced, make sure that all elements, including labeling, can withstand reduction and remain 236 legible. Electron and light micrographs must be direct copies of the original negative. Indicate 237 the magnification with a scale marker on each micrograph. 238

Computer-Generated Images Computer-generated images should be the highest-239 quality and simplest reproduction of illustration(s). 240

Color Photographs Color photographs are usually discouraged. However, if neces- 241 sary, include an extra copy at the time of manuscript submission so that a cost estimate for 242 printing may be obtained. The cost of printing color photographs must be paid by the author. 243 Drawings Submit graphs, charts, sequences, complicated chemical or math- ematical formulas, 244 diagrams, and other drawings as glossy photographs made from finished drawings not 245 requiring additional art- work or typesetting. Computer-generated graphics produced on high-246 quality laser printers are also acceptable. No part of the graph or drawing should be 247 handwritten. In figure ordinate and abscissa scales as well as table column headings, avoid 248 ambiguous use of numbers with exponents. For example, representation of 10,000 cpm on a 249 figure ordinate should be written as 10 kcpm. Likewise, the preferred designation for an enzyme 250 activity of 0.06 U/ml would be 60 mU/ml (milliunits per milliliter). 251 Presentation of Nucleic Acid Sequences Nucleic acid sequences of limited length that are the 252 primary subject of a study may be presented freestyle in the most effective format. Submit the 253 sequence as a camera-ready copy of dimen- sions in standard orientation. 254

Figure Legends Legends should provide enough information so that figures are 255 understandable without frequent reference to the text. However, detailed experimental methods 256 must be described in the Materials and Methods section, not in a figure legend. Define all 257 symbols and abbreviations used in the figure. 258

Tables Type each table on a separate page. The headings should be suffi- ciently clear 259 so that the meaning of the data will be understandable without reference to the text. Explanatory 260 footnotes should not include detailed descriptions of the experiment. Tables must include 261 enough information to warrant table format. 262

USE OF ABBREVIATIONS 263 Abbreviations should be used as an aid to the reader, rather than as a convenience to 264

the author, and therefore their use should be limited. Abbreviations other than those 265 recommended by the IUPAC-IUB (Biochemical Nomenclature and Related Documents, 266 1978) should be used only when a case can be made for their ne- cessity, such as in tables and 267 figures. Standard chemical symbols and trivial names or their symbols may normally be used. It 268 is strongly recommended that all abbreviations, except those listed below, be defined and 269 introduced in parentheses the first time they are used. 270

Common Abbreviations The following abbreviations can be used without definition or 271 introduction: bp, kb, Da, DNA, cDNA, RNA, cRNA, DNase, RNase, rRNA, mRNA, tRNA, AMP, 272 ADP, ATP, dAMP, ddATP, and GTP, etc. (for the respective 5′ phosphates of adenosine and 273 other nucleotides: add 2′-, 3′-,or 5′-when needed), ATPase, dGTPase, etc., NAD, NAD+, NADH, 274 NADP, NADPH, NADP+, poly(A), poly (dT), etc., oligo (dT), etc., Pi, PPi, UV, PFU, CFU, MIC, 275 Tris, DEAE, A260, EDTA, PCR, SDS, AIDS. Abbreviations for cell lines also need not be 276 defined. The following abbreviations should be used without definition in tables: amt (amount) 277 approx (approximately) avg (average) concn (concentration) diam (diameter) expt (experiment) 278 exptl (experimental) h (hour) ht (height) min (minute) mo (month) mol wt (molecular weight) no. 279 (number) prepn (preparation) SD (standard deviation) SE (standard error) sec (second) SEM 280 (standard error of the mean) sp act (specific activity) sp gr (specific gravity) temp (temperature) 281 vol (volume) vs (versus) wt (weight) yr (year) 282 Reporting Numerical Data Standard metric units are used for reporting length, weight, and 283 volume. For these units and for molarity, use the prefixes m, m, n, and p for 10-3, 10-6, 10-9, 284 and 10-12, respectively. Likewise, use the prefix k for 103. Avoid compound prefixes such as 285 mm or mm. Use mg/ml or mg/g in place of the ambiguous ppm. Units of temperature are 286 presented as follows: 37°C or 310 K. When fractions are used to express units such as 287 enzymatic activities, it is preferable to use whole units. For example, 1.0 “pmol/min” would be 288 preferable to 0.001 “mmol/min.” It is also preferable that an un- ambiguous form, such as 289 exponential notation, be used. For example, “mmol g-1 min-1” is preferable to “mmol/g/min.” 290

Isotopically Labeled Compounds For simple molecules, isotopic labeling is indicated in 291 the chemical formula. Brackets are not used when the isotopic symbol is at- tached to the name 292 of a compound that does not contain the ele- ment in its natural state (e.g., 35S-ATP) or to a 293 word that is not a specific chemical name (e.g., 125I-labeled protein, 14C-amino acids, 3H-294

79

ligands, etc.) For specific chemicals, the symbol for the isotope introduced is placed in square 295 brackets directly preceding the part of the name that describes the labeled entity. Note that 296 configuration symbols and modifiers precede theisotopic symbol. The following examples 297 illustrate correct usage: [14C]urea, L-[methyl-14C]methionine, [2,3-3H]serine, [a-14C] lysine, [g-298 32P]ATP, UDP-[U-14C] glucose, E. coli [32P]DNA, and fructose 1,5-[1-32P]bisphosphate. JM 299 follows the same conventions for isotopic labeling as the Journal of Biological Chemistry, and 300 more detailed information can be found in the instructions to authors of that journal. 301 http://www.springer.com/journal/12275. 302 303

80

Title: Identification of Trichoderma spp. from agricultural soils in northeastern 304

periphery of Amazonia, Brasil. 305

306

Short title: Identification of Trichoderma spp. from agricultural soils 307

308

Ronildson Lima Luz1, Márcio Fernandes Alves Leite2, Carla Sandriely de 309

Oliveira Sousa1, Flávio Henrique Reis Moraes1* 310

311

1Present address:Laboratory of EnvironmentalMicrobilogy, Ceuma University, 312

Josué Montello street 1, Resnacença II, Sâo Luís (Maranhão), Brazil. 313

314

2Present address: Laboratory of Soils, State University of Maranhão, City 315

University of Paulo IV, São Luís (Maranhão), Brazil. 316

317

* Corresponding author 318

TEL. 0021559888314014 319

Fax. 0021559832358600 320

Email: [email protected] 321

322

This work aimed realize the characterization morphophysiological, antagonism 323

capacity antagonism (hyperparasitism and volatile metabolites) against 324

Fusarium oxysporum f. sp. passiflorae, and molecular identification in the ITS 325

region of Trichoderma isolates originating from agricultural soils of 11 counties 326

in the northern state of Maranhão. A total of 38 isolates were collected and 327

81

classified in seven species:T. asperellum, T. harzianum, T. aggressivum, T. 328

konilangbra, T. fertile, T. ghanense and T. atroviride. After that we selected 11 329

isolates for sequencing followed by analises using Trichokey. The chemical 330

parameters of the soil showed acid pH values, which probably were favorable 331

for the fungal development, although the values of organic matter were 332

considered low in all the soil samples counties. The results of hyperparasitism 333

and volatile metabolites evidenced that all isolates were capable of inhibiting the 334

mycelial growth of Fusarium oxysporum f. sp. passiflorae. The phylogenetic 335

analysis reveals which the isolates of T. asperellum formed a single grouping. 336

The specie T. konilangbra was grouped with the north american variations, 337

while T. harzianum was grouped with USA isolates. Highlight which is the first 338

occurrence of specie of T. konilangbra in Brazil, emphasizing the importance of 339

performing research in neglected regions for studies involving your presence. 340

341

Keywords: Biogeography, Hypocrea, Brazil 342

343

82

Introduction 344

Fungi are organisms which exhibit capacity of adaptation in different 345

environments due the variated nutrition, reproduction forms and mechanism of 346

resistance allowing remain in the soil for long time. So it is natural that such 347

organisms has a key ecological role, once they can through of a summation of 348

metabolic process modify the substratum which adhere, acting through of 349

numerous adaptations which are targets of studies like model analysis genetic, 350

metabolic bias and exploration of industrial areas, medical and Biotech 351

(Garraway and Evans, 1984; Zhadanova et al., 2000). 352

The fungi of genus Trichoderma areanamorphic deuteromycetes and 353

cosmopolitan saprophytic, exhibiting complex levels of interaction with the 354

environment which develops and mainly with organisms (Benítez et al., 2004). 355

Act in the solubilization of nutrients, activation of the plant self-defense system, 356

inducing the production of plant hormones and mycoparasitism (production of 357

metabolites volatile and non-volatile, the direct intertwining of hyphae, 358

competition for space and nutrients). Some of their species are producers of 359

extracellular enzymes, eg. xylanase and cellulose used in the paper industry, 360

food production and animal feeding(Benítez et al., 2004; Butt et al., 2008; 361

Purvis et al., 2004; Schmoll et al., 2009). 362

This genus has about 100 species and despite their ecological importance 363

and the role as a biocontrol agent, information about your population, 364

reproductive strategies, biological diversity and geography still remain scarce 365

(Benítez et al., 2004; Druzhinina and Kopchinskiy, 2006; Druzhinina et al., 366

2010; Harman et al., 2004, Howell 2006). Therefore, due to lack of information 367

about the diversity of gender and for being a neglected region, this study aimed 368

83

to characterize the isolates of Trichoderma natives of the northern Maranhão 369

state using the morphological characteristics and molecular analysis of the ITS 370

region (Internal Transcript Spacer), in addition to assessing their potential as a 371

biological control agent (biological action through mycoparasitism and 372

production of volatile metabolites in vitro). 373

374

Materials and Methods 375

Samples and chemical analysis 376

Samples of soils were obtained in loco or through to the Laboratory of Soil 377

Analysis of Maranhão State University), originated from counties of: São Luís, 378

Lago dos Rodrigues, Raposa, Humberto de Campos, Bacabal, Nova Olinda, 379

Boa Vista do Gurupi, Miranda do Norte, São José de Ribamar, Buriti e 380

Carutapera. All this counties belonging to north of Maranhão (Table 1). 381

382

84

Table 1. Origin, chemical parameters, and quantification values of antagonism of Trichoderma spp. 383

Obtained from soil samples. 384

aM.O.: Matéria orgânica 385

bCFU/g: Colony forming unitsper gram ofsoil 386

c Efficient (E), Moderately Efficient (ME) 387

dNot analyzed 388

389

Origin Substratum (soil) Ph O M

a

g/dm3

CFU/gb Species Identification Confronting

c

São Luís

Farm polo of Bom Jardim – passion fruit culture

5,6 19 4 x 10

4 T. asperellum

TA TC1 TF1 TG1

ME ME ME E

1 x 104 T. atroviride TV ME

Farm polo of Itapera – passion fruit culture

5,0 21

2 x 104

T. asperellum TB

TH1 ME E

2 x 104 T. harzianum

TT TZ

E ME

Farm polo of Quebra Pote –passion fruit culture

5,5 19 4 x 104 T. asperellum

TC TD TB1 TL1

ME ME ME ME

Farm polo of Cinturão Verde –passion fruit

culture 5,0 19 1 x 10

4 T. asperellum TU ME

Lago dos Rodrigues

Pasture 5,1 16 1 x 104 T. aggressivum TJ ME

Humberto de campos

Soil sample with culture unidentified

5,0 13 2 x 10

4 T. asperellum

TN2 TV2

E ME

1 x 104 T. konilangbra TQ2 ME

Bacabal Grassmombasa 5,3 15 5 x 10

4 T. asperellum

TZ2 TA3 TC3 TM3 TN3

ME E

ME E E

1 x 104 T. fertile TO2 ME

Nova Olinda Association garden 4,1 18 1 x 104 T. asperellum TB3 ME

Raposa Farm polo of horticulture

Cumbique NA

d NA 1 x 10

4 T. asperellum TM2 ME

Boa Vista do Gurupi

Burning area (Banana and okra)

4,3 22 1 x 104 T. ghanense TD3 ME

Miranda do Norte

Soil sample with culture unidentified

4,1 15 6 x 104 T. asperellum

TE3 TF3 TG3 TH3 TI3 TJ3

ME E E E E E


Soil sample with culture unidentified 5,1 13

1 x 104

1 x 104

T. harzianum T. asperellum

TL3 TO3

ME ME

Buriti Soil sample with culture

unidentified 4,8 24 1 x 104 T. ghanense TP3 ME

Carutapera Soil sample with culture

unidentified NA NA 2 x 104 T. asperellum

TQ3 TR3

ME ME

85

The soil chemical characteristics were evaluated in soil laboratory at the 390

Maranhão State University, in accordance with standard procedures (IAC, 391

2001). 392

For quantification and isolation of Trichoderma, the samples were 393

subjected to serial dilution (Menezes and Silva – Hanlin, 1997), and fractions of 394

10-3were sown in petri dishes containing Potato Dextrose Agar media (PDA) 395

with chloramphenicol, streptomycin sulfate and pink stick (Vargas Gil et al., 396

2009). Then, all isolates were purified using the technique monosporic 397

cultivation (Menezes and Assis, 2004). 398

399

Morphological characterization 400

Morphological characterization was carried out using the classification 401

keys of Gams and Bisset,(1998), Rifai (1969) and Samuels et al.,(2012). 402

Micelium disks of 5 mm were placed on 1,5 cm from edge of petri dishes (90 403

mm) with PDA media for one week in laboratory conditions of light and 404

temperature (28±1ºC). For the analysis of macroscopic morphological 405

characteristics and radial growth, the isolates were inserted in the center of 406

plates containing the media PDA and MEA (Malt Extract Agar) and incubated 407

for three days. To evaluate the growth rate the strains were incubated in the 408

dark on PDA media and evaluated after 72 hours. The microscopic characters 409

were analyzed according to the morphology and size of microstructure(conidia 410

and phialides) visualized with methylene blue dye. The dimension of conidia, 411

the phialides and analysis of growth velocity were described as minimum and 412

maximum value from all measurements Other characteristics such as diffusion 413

through the middle and coconut sweetish odor were also considered. 414

86

415

Inhibition of pathogenic fungi: dual culture technique and volatile 416

compounds 417

To analyze the antagonistic potential of Trichoderma was used the 418

technique of dual culture in petri dishes described by Dennis and 419

Webster,(1971) against the pathogen Fusarium oxysporum f.sp. Passiflorae 420

(Fop4) from the mycology collection ofMaranhão State University. 421

The level of antagonism was evaluated after seven days. Plates 422

containing only Fop4 were used as controls. For data analysis was utilized the 423

scale proposed by Linhares et al., (1995) which assesses the growth inhibition 424

of the pathogen through the antagonist percentage classifying into three levels: 425

effectively (E), moderately efficient (ME) and inefficient (I). 426

Effect of volatile metabolites of Trichoderma on the growth of mycelial 427

Fop4 was assessed using the technique developed by Bharat et al., (1980). 428

Then they were incubated in laboratory conditions for seven days. The data of 429

both analyses analyzed by Kolmogorov-Smirnov‟s normality test and means 430

were compared by Tukey‟s test at level of 5% and evaluated using the scale of 431

Linhares et al., (1995). 432

433

Molecular characterization and sequencing 434

Among 38 isolates 11 were subjected to phylogenetic analysis. The DNA 435

was extracted with the DNeasy Plant mini kit following the manufacturer's 436

protocol (Qiagen, Hilden, Germany). Primers used for amplification and 437

sequencing ITS were ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') and ITS4 (5'-438

87

TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') (1990). For the PCR reaction was used the 439

protocol described by Nitschke et al.,(2009). 440

The PCR products were sequenced by the method of Sanger et al., 441

(1977), correction of sequences was performed using the program BioEdit. For 442

molecular identification was used Trichokey 443

(http://www.isth.info/tools/molkey/index.php). 444

For the multiple alignments and construction of phylogenetic trees was 445

used the program Mega 5.0 with sequences available in GenBank, considering 446

only those employed in published studies, with high score (1000) and e-value 447

equal to zero. The statistical method used was the neighbor-joining (NJ) with 448

the Kimura 2 parameter model replicates 10.000 (Kimura, 1980). 449

450

Results 451

A total of 38 colonies of Trichoderma were identified, quantified and 452

isolated, according to the typical characteristics of Trichoderma (Table 1 and 2). 453

The samples with the highest amounts of colony forming units per gram of soil 454

(CFU/g) were from Miranda do Norte (6 x 104 CFU/g), followed by Bacabal (5 x 455

104 CFU/g), and samples from neighborhoods Quebra Pote (4 x 104 CFU/g) 456

and Bom Jardim (4 x 104 CFU/g) in São Luís (Table 1). 457

The soil samples which showed the pH level very acid (4.0 – 4.9) were 458

originated from soil samples of Nova Olinda, Boa Vista do Gurupi, Miranda do 459

Norte and Buriti. The another soil samples from São. Luís, Lago dos Rodrigues, 460

Humberto de Campos, and São José de Ribamar exhibited strong acid (5.0 - 461

5.6) (Table 1). 462

http://www.isth.info/tools/molkey/index.php

88

Concerning to organic matter, the samplesfrom Buriti (24 g/dm3), Boa 463

Vista do Gurupi (22 g/dm3) and Itapera (21 g/dm3) showed the highest values of 464

organic matter, while those from São José de Ribamar and Humberto de 465

Campos exhibited the lowest values of organic matter (13 g/dm3), however, 466

none of the samples reached the average values (25 to 50 g/dm3) (Embrapa 467

wheats, 2009) (Table 1). 468

Based on the morphological characteristics seven different species were 469

identified: T. asperellum, T. aggressivum, T. harzianum, T. atroviride, T. fertile, 470

T. ghanense and T. konilangbra (Table 2). 471

Five types of phialides were observed among isolates, T. asperellum and 472

T. harzianum showedampuliform format as seen by Gams and Bisset,(1998) 473

and Samuels et al., (1999). T. atroviride exhibited phialides solitary and in some 474

cases curved, T. aggressivum developed their structures bottle-shaped, while 475

the T. koninlanbra presented patterns cylindrical, T. fertile and T. 476

ghanenseshowed phialides linearly increased (Gams and Bisset, 1998, 477

Samuels et al., 1998). 478

The conidia round shaped ranged from subglobosesto globose and oval 479

for the species: T. asperellum, T. aggressivum, T. harzianum and T. atroviride, 480

and ellipsoidal forT. fertile, T. ghanense and T. konilangbra (Gams and Bisset, 481

1998, Samuels et al., 2012, Samuels et al., 1999) (Table 2). 482

Colonies of T. asperellum and T. ghanense in the two media became dark 483

green with yellow pigments, differentiating in the middle MEA T. asperellum 484

which produced a high amount of white conidia. T. aggressivum developed in 485

the PDA colony of white color with green pigments, in MEA exhibited similar 486

89

patterns, with a single ring of green growth. Isolates of T. harzianum showed 487

dark green spores and growth of concentric rings in both media after one week 488

T. atroviride formed masses of green conidia in the center became white 489

on the edge in the two media. Colonies of T. fertile in BDA formed dense white 490

90

Table 2. Morphological characteristics on PDA and MEA of Trichoderma spp. obtained from municipalities soil in the northern state of Maranhão

Features/Species. T. asperellum T. aggressivum T. harzianum T. atroviride T. fertile T. ghanense T. konilangba

Mycelial growth 72 hrs in dark

(50-) 54 mm (-60) 70 mm (57-) 58mm (-60) 39 mm 70 mm 70 mm 70 mm

Color of colony PDA

MEA

Green and yellow

Green and yellow

Green and yellow

Green and yellow

Dark green

Dark green

Green and yellow

Green and white

White

Green

Green and yellow

Green

Green

Green

Color of reverse PDA

MEA

Cream

Green

Colorless

White

Colorless

Colorless

Colorless

Colorless

Pale

Green

Green

Green

Pale

Green

Conidiation PDA

MEA

Ring

Ring

Continue

Continue

Ring

Ring

Ring

Ring

Continue

Ring

Ring

Ring

Ring

Ring

Odor Sweetened

Coconut

- - + + - - -

Phiálide format Ampuliform Bottle shaped Ampuliform Bottle shaped Linear Linear Cylindrical

Size of phiálides (μm) (9,8-) 10 (-12) x (1-) 2 (6-) 10 x 2 6 (-7) x (1-) 2 (8-) 10 x (2-) 2,3 (-5) 6,5 (-10) x 2 (7-) 7 (-10) x 2 (4-) 5,2-8,2(-

10)

Format of Conídia Globose –

Subglobose

Subglobose –

Oval

Globose Subglobose –

Oval

Ellipsoidal Ellipsoidal Ellipsoidal

Size of Conídia (μm) (2-) 3,2 (-4) x (2-) 2,6 (-

4)

(2-) 2,7 (-3) x (-

2)2,7 (-2)

2 x 2 3 x 3 2 x 2 5 x (1-) 2 3-2

91

mycelium without pigment, in MEA high dark green conidia production was

observed. T. koninglanbra showed dark green conidia, forming distinct

concentric rings, developing a continuous surface of mycelium in EMA

conidiophores formed concentric rings of dark green (Table 2).

Isolates of T. ghanense and T. koninlanbra had highest growth

percentage (90mm). The species T. harzianum, T. fertile and T. aggressivum

showed moderate growth (approximately 60 to 7.8 mm) in 72 hours. The isolate

of T. atroviride was which showed the lowest percentage (40 cm). The sweet

scent of coconut was identified in isolates of T. harzianum and T. atroviride

(Table 2).

The results of tests to evaluate the capability of biocontrol through dual

culture technique verified inFigure 1 demonstrated that all isolates differed

statistically from control by Tukey test at 5% probability, displaying the potential

ability to inhibit growth of Fop4 and classified into two categories: effective and

moderately effective (Separated by a continuous line in Figure 1).

Figure 1 - Analysis of the inhibitory potential of Trichoderma spp. Against isolated Fop4, Media

followed by the same letter in the column do not differ statistically from one another. We applied

the Tukey test at 5% probability. The solid line marks the boundary between the isolates

classified as efficient (mycelial growth of Fop. <1 cm)

93

In the test of pairing the isolates TG3, TM3, TN3 (T. asperellum) and TT

(T. harzianum) exhibited the greatest potential inhibition (100%), TG1, TH1,

TN2, TA3, TF3, TH3, TJ3 (T. asperellum) were also effective, however, does

not completely inhibited the pathogen. All other isolates showed moderate

levels of inhibition.

It is noteworthy that all isolates classified as efficient exhibited

mycoparasitism capacity. Their colony was able to grow on the pathogens, not

only preventing their mycelial growth by competing for nutrients and space, but

effectively demonstrating the ability to interact with pathogen, in a phenomenon

known as hiperparasitism (Gruber and Seidl-Seiboth, 2012).

In tests of volatile metabolites all the isolates differed the control according

to theTurkey‟s test (p<0,05), however, none of them showed high levels of

inhibition through antibiosis test (Figure 2), being all classified as inefficient. We

emphasize which the rapid development of Trichoderma is not necessarily

related to the production of volatile metabolites.

Figure 2 - Analysis of the inhibitory potential of volatile metabolites produced by Trichoderma

spp. Against isolated Fop4, Means followed by the same letter in the column do not differ

statistically from one another. We applied the Tukey test at 5% probability.

94

Because of problems in the amplification and sequencing, only eleven

isolates were identified using molecular techniques, these were: 8 isolates of T.

asperellum (TA, TZ2, TA3, TE3, TF3, TH3, TI3, TJ3 e TO3),1 of T. harzianum

(TL3) and 1 of T. konilangbra (TQ2). After the editing and sequencing of the

species, T. asperellum presented fragments of 543-544 bp, T. harzianum with

587 bp and T. konilangbra with 547 bp, which were identified by Trichokey 2.0.

The alignment of the ITS region was performed with 19 sequences

deposited in Genbank, the analysis performed using the neighbor-joining

method divided the isolates into three distinct groups, based on their bootstrap

values, forming a tree containing individual sections of: Trichoderma,

Longibrachiatum and Pachybasium. The specie chosen as outgroup was

Hypocrea aureoviride(Hermosa et al., 2004, Lee and Hseu, 2002) (Figure 3)

(Table 3).

95

Table 3. Information and reference of Trichoderma used in this study obtained from Genbank.

Species Isolates Source Genbank Reference

T. asperellum TA Brazil JX443531 Current study

T. asperellum TZ2 Brazil JX515277 Current study

T. asperellum TA3 Brazil JX515282 Current study

T. asperellum TE3 Brazil JX515279 Current study

T. asperellum TF3 Brazil JX515281 Current study

T. asperellum TH3 Brazil JX515284 Current study

T. asperellum TI3 Brazil JX515278 Current study

T. asperellum TJ3 Brazil JX515283 Current study

T. asperellum TO3 Brazil JX515280 Current study

T. asperellum D21 China GQ131398.1 Xia et al., (2011)

T. asperellum GJS 05-328 Cameroon GU198318.1 Samuels et al.,(2010)

T. asperellum GJS 06-292 Cameroon GU198304.1 Samuels et al.,(2010)

T. asperellum GJS 90-7 Vietnam GU198317.1 Samuels et al., (2010)

T. asperellum GJS 91-24 Brazil AJ230668.1 Lieckfeldt et al.,(1999)

T. asperellum TUB F-756 Brazil AY857218.1 Druzhinina et al., (2005)

H. koningii F50 China JF439478.1 Han et al.,(2011)

H. Intricatum GJS 02-78 Sri Lanka EU264002.1 Hanada et al., (2008)

T. harzianum/H. lixii TL3 Brazil JX515285 Current study

H. lixii 397/01 Brazil HQ857108.1 Lopes et al., (2012)

H. lixii MUCL 29707 USA FR848364.1 De Jaeger et al.,(2011)

H. lixii CY216 USA HQ608036.1 Rodrigues et al., (2011)

H. lixii CIB T44 Colômbia EU280077.1 Hoyos-Carvajal et al.,(2009)

H. lixii DAOM 234005 Peru EU280091.1 Hoyos-Carvajal et al.,(2009)

H. virens TR039 USA HQ608079.1 Rodrigues et al.,(2011)

H. crassa DAOM 233775 Guatemala EU280084.1 Hoyos-Carvajal et al.,(2009)

T. konilangbra TQ2 Brasil JX524175 Current study

T. konilangbra CY161 USA HQ607999.1 Rodrigues et al., (2011)

T. konilangbra CY215 USA HQ608035.1 Rodrigues et al.,(2011)

T. konilangbra GJS 96-147 Uganda DQ083021.1 Samuels (2006)

T. longibrachiatum JH-8 China HQ717798.1 Ma et al., (2011)

H. aureoviride CBS 245.63 United Kingdom

AF399219.1 Kuhls et al., (1997)

96

In the first section were In the first section were located Maranhenses

isolates of T. asperellum (TA, TZ2, TA3, NT3, TF3, TH3, TI3, TJ3 and TO3)

which formed a clade with bootstrap values equal to 75% when related to the

isolates from China, Cameroon and Vietnam (Figure 3). However, the isolated

T. koningii (F50) and T. intricatum (GJS 90-7) formed a group within the section

separated by differences genetic existent between the clades (57%).

The section Longibrachiatum included the four T. konilangbra TQ2, T.

konilangbra CY161 and CY215 from North America, GJS 96-147 Uganda and

T. longibrachiatum JH-8 China, these formed a cluster separated by a high

initial value of the bootstrap (99%) separating the species T. konilangbra and T.

longibrachiatum remaining within the same section.

The four isolates of T. konilangbra formed two distinct subgroups (78%),

remaining in the the first group, the isolated from Maranhão (TQ2) with

variations sourthamericans (CY161 and CY215), leaving in another subgroup

the isolate from Uganda (GJS 96-147), these groupings were supported by

bootstrap values greater than 79% (Figure 3).

97

Figure 3 - Phylogenetic Relationships of Trichoderma using the method Neighbot-joining. The percentage of replicagem trees in which the toxin associated with the groups in the amount of bootstrap (10,000 replicates) are shown on the branches. The distance was computed using the Kimura 2-parameter.

The third group corresponds to Pachybasium section. The clades

Harzianum and Virens were delimited by a bootstrap value equal to 95%. The

isolated T. harzianum (TL3) grouped with the isolates of H. lixii MUCL 29707

and CY216 from the United States, CIB T44 from Colômbia and DAOM 234005

from Peru, however, the clade formed a subgroup (68%) when compared to the

isolated from Cerrado region of the Brasilian state 397/01. H. virens e H. crassa

from virens clade formed a group supporting high bootstrap values (99%) within

the section, separating the Harzianum clade by differences between their

sequences base pairs (Figure 3).

98

Discussion

The northern state of Maranhão is a region which is influenced by the

Atlantic Ocean to the north, Amazon biome to west, Brazilian Cerrado to south

and semi-arid to east, those areas are described by Moura (2006) as a zone of

ecotones, which shows a great variability in the spatial distribution of rainfall,

soil characteristics, which in general, derived from sedimentary rocks with low

capacity retention of cations and also low nutrient content, even as the high rate

of equatorial sunlight which accelerates the decomposition of soil organic

matter.

In tropical soils Trichoderma colonies are usually isolated at a frequency of

101-103 seedlings per gram of soil. Its germination depends, however, on a

number of factors such as pH, temperature, moisture and organic matter

content in natural soil or colonized, depending on the availability of organic

matter (Harman et al., 2004).

In assessing the presence of Trichoderma in soil samples with different

pH levels, Chet and Baker, (1981) observed a higher presence of propagules

per gram (8 x 105) at pH 5.1, while in other samples obtained from regions

where the pH was 8.1 (alkaline), obtained only 1 x 101 propagules per gram of

soil. Fritze and Baath, (1993) in their impact studies on the effect of alkaline

dust in the microbiota, also found that increasing the pH reduced the number of

Trichoderma

In the present study similar correlations to those indicated by the work

described above were found. Among the samples, the pH remained within the

99

limits considered suitable for the development of the genus (Chet and Baker

1981, Fritze and Baath, 1993). In samples from Miranda do Norte, for example,

the pH (4.1) corresponded with the number of colonies of Trichoderma (6 x

104CFU/g). In Bacabal and São Luís at the agricultural centers of Bom Jardim,

Quebra Pote and Cinturão Verde the pH level was considered strong (5,3 a 5,6)

showing high values of propagules per gram of soil (Table 1), similar

relationship was observed by Fritze and Baath, (1993). Jackson et al.,(1991)

concluded that the optimal levels of pH for biomass production in three

Trichoderma species varied from 4.6 to 6.0. Bernítez et al., (2004), highlights

which in the rhizosphere, when the fungus is inserted, it is capable of decrease

the pH, difficulting the development of pathogens at the same time while create

an ideal environment for their own dispersal (Fritze and Baath, 1993).

The samples from northern Maranhão are originated from the domain soil

geological formation called Itapecuru in the counties of São Luís, Lago dos

Rodrigues, Raposa, Bacabal, Nova Olinda, Boa Vista do Gurupi, Miranda do

Norte, São José de Ribamar, Buriti, Aluviões in Carutapera and Barreiras in

Humberto de Campos. Among the most common characteristics of these

formations, we highlight the acidity, one of the possible factors responsible for

the frequency of Trichoderma in soil samples on these regions in northern

Maranhão (Garraway and Evans, 1984, Moura, 2006).

The organic matter levels showed low values (13-24 g/dm3) (Table 1),

these results according to Moura (2008) are inherent to aspect of soil and the

amount of sunlight, the factor responsible for your rapid degradation.

Among the samples there a large number of colonies of the genus in the

counties of Miranda do Norte (6 x 104 CFU/g), showing, however, low levels of

100

organic matter (15 g/dm3), while in the counties of Buriti and Boa Vista do

Gurupi showed a higher content of organic matter (24 g/dm3 and 22 g/dm3

respectively) (Table 1), in relation to the other counties, had only 1 x 104 CFU/g

in both samples (Table 1). These results differ from those presented by Lewis

and Papavizas, (1984), which observed increasing in the values of propagules

per gram of soil every week after the use of organic substrates.

In studies involving different types of managements Elmholt and

Labouriau, (2005) observed no increase in the amount of colony when the

organic matter was used as substrate, however, contrary results were observed

for Liu et al.,(2008) and Bulluck and Ristaino, (2002) being the organic matter

considered the best organic input in the population growth of the genre. Liu et

al., (2008) and Wilberforce et al., (2003) emphasize that further studies should

be conducted to understand how thisand others factor, could affect the

dynamics of the genus Trichoderma and their distribution in different soil types.

Patterns of color, shape and size of the isolates of T. asperellum were

similar to those presented by Samuels et al., (1999). The patterns of T.

harzianum at certain times during development (colony shape and color)

resembled to the species T. viride, attribute already reported by Shah et al.,

(2012).The characteristics of T. aggressivum, T. fertile, T. atroviride showed

similar patterns found in Gams and Bisset, (1998) and Samuels et al.,(2012).

The colony of T. koninlagbra exhibited appearance and growth similar to that

observed by Samuels et al.,(2012).

The analysis revealed by Trichokey showed ambiguity in the sequences of

T. asperellum, patterns observed in some species according to Zhang et

al.,(2005),which emphasize the use of another approach in the identification

101

process, however, the use of this tool still remains recommended for quick

identification (Druzhinina, et al., 2005, Zhang et al., 2005).

The phylogenetic tree generated by the Neighbor-Joining method (Figure

3) showed which the isolates were correctly identified, since the groups resulted

in branches containing individuals from their respective section. The species of

T. asperellum formed a single clade, supporting bootstrap values greater than

70%, its position in distinct clades within the session Trichoderma and its

phylogenetic relationship with the species T. koningii had already been detected

by Hermosa et al.,(2004).

In the figure 3 the isolates of T. harzianum (397/01 29 707 MUCL, CY216,

CIB T44, DAOM 234 005) did not form a single group, separating the Brazilian

variation (397/01) of the others isolates. Previous research showed which the

high variability within the complex has resulted from the presence of

innumerable subgroups with characteristics paraphyletic, making T. harzianum

a species with greater variability within the genus (Druzhinina and Kubicek,

2005, Grondona et al., 1997, Hermosa et al., 2004, Kullnig et al., 2000).

In the figure 3, the sequence of H. virenswere clustered separately,

supporting high bootstrap values (99%), confirming its position within the

section. The proximity to T. harzianum, had already been observed by Bisset

(1991), which placed the species H. virens together with the aggregate T.

harzianum. Lieckfeldt et al. (1998), underscore the closeness between these

species through the ITS region, constituting separate groups for values above

89%.

Hermosa et al.,(2004) also detected similar division between branches

when examined several sequences of T. harzianum in association with H.

102

virens. Other authors also emphasize which the complex relationships between

T. harzianum has better resolution when analyzed by gene TEF1 (Hermosa et

al., 2004, Kullnig-Gradinger et al., 2002, Samuels et al., 2002) Chaverri and

Samuels (2003) observed similar positions with those observed in this study,

within the clade Virens when used H. virens with T. crassum / H. crassa, using

the region TEF1.

Samuels et al.,(2000) highlights which the molecular identification of

species T. harzianum must be done carefully, and according Druzhinina et

al.,(2010) T. harzianum is dominant in the most ecosystems and their

occupation in different niches from the complex structure of its population,

coupled with reproductive isolation, sympatric and allopatric events, and finally

the appearance of lineage and numerous relics agamoespecies with

phylogenetic positions not yet defined, being these facts pointed by the authors

for explaining the genetic diversity of this species (Druzhinina et al., 2005,

Druzhinina et al., 2010).

The isolates of T. konilangbra formed well-defined clusters, demonstrating

a genetic affinity among isolates from same continent. The two subgroups with

the species T. konilangbra were possibly formed due to your geographical origin

being the isolates from Maranhão TQ2 which showed greater proximity to the

North american species (CY215 e CY161), than withAfrican variations (GJS 96-

147).

In this study the isolates of T. konilangbra formed a group separated of T.

longibrachiatum. According to Samuels et al., (1998), this event occurs because

the difference in six base pairs in the ITS-1 region which differs from the others

species within the section Longibrachiatum. It‟s also important to emphasize the

103

small amount of deposits of the sequences from this species (twelve isolates),

are considered by Kullnig et al.,(2000) reflexion of the lack of studies in the

humid tropical region which leads to a scarcity of specimens in cultures of

collection.

In the environment,Trichoderma acts parasitizing other fungi, including

species that are closely near as members of the genus Fusarium spp. and

Botrytis(Gruber and Seidl-Seiboth, 2012).In our study the inhibitory activity of T.

harzianum and T. asperellum were similar to the results of Lopes et al., (2012),

Haggag and Mohamed, (2011) presenting excellent and moderate levels for

both species in the process of mycoparasitism against fungi of genus Fusarium

and Sclerotinia. Similarly inhibition values for T. atroviride were found by

Boureghda and Bouznad,(2009).

The relationship with the pathogen Fusarium is further described by Lutz

et al., (2003), which reported the biosynthesis of substances produced by the

pathogen, and the activation of the production of enzymes responsible for cell

wall degradation of the antagonist. The production mechanisms of enzymes are

also considered key factors in the antagonistic action of T. aggressivum on

different classes of fungi (Guthrie and Castle, 2006).

The species T. fertile (TO2) showed moderate inhibition ability against the

pathogen, likewise Ratnakumari et al., (2011) observed that T. fertile proved

effective against the pathogen Sclerotium rolfsii. Moderate and excellent values

were demonstrated by species T. ghanense, which had similar results with the

work done by Castillo et al., (2011) against the pathogen Sclerotinia

slerotiorum.

104

The species T. konilangbra also were able to inhibit growth of the

pathogen. Research expressing his activity in vitro tests of dual culture and

volatile compounds was not found, information related to this type of activity still

scarce in the literature for this species.

While developing or interaction with other microorganisms most

Trichoderma species produces more than 100antibiotic compounds that can be

spread through the air, among them we can mention: harzianicoacid,

alamethicin, tricholina, peptabolicoantibiotics (Lewis and Papavizas, 1984,

Lieckfeldt et al., 1998). According to Dennis and Webster, (1971) certain

species of Trichodermaare efficient producers of volatile metabolites in vitro,

however, this form of action is most effective if used in combination with

mycoparasitism. Six isolates used in this study were able to inhibit pathogen

growth when compared against the control,this results could be explained for

the environmental conditions of the soil. We could hypothesize which the

amount of organic matter natural in the humid tropics could make the ability of

fast growing more efficient adaptation then the production of antibiotic

compounds, what have the main function to avoid other organisms to grow near

the fungus, so the strains of Trichoderma from the humid tropics are probably

conditioned to grow fastly to compete for resources, furthermore the

hyperparasitism capacity is another approach that could make more efficient for

ecological competition.

The genus Trichoderma comprised a group already known for his

performance as a biocontrol agent. Nevertheless, aspects related to their life

cycle, metabolic behavior, taxonomic and phylogenetic in tropical countries still

require further deepening. The presence of T. konilangbra, at the moment was

105

not reported in Brazilian soils, this study shows the importance of this genre in

the northern of Brazilian humid tropic, while as the analyzes presented in this

study provide a basis for future research biographies, enriching the taxonomy of

the genus.

106

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