HEMOSTASIA E REAÇÃO TECIDUAL AO IMPLANTE DE …A todos os meus companheiros de trabalho,...
83
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL HEMOSTASIA E REAÇÃO TECIDUAL AO IMPLANTE DE ESPONJA DE QUITOSANA EM LESÃO HEPÁTICA DE CAMUNDONGOS Flávia Resende Martins da Costa Orientador: Prof. Dr. Eugênio Gonçalves Araújo GOIÂNIA 2015
Transcript of HEMOSTASIA E REAÇÃO TECIDUAL AO IMPLANTE DE …A todos os meus companheiros de trabalho,...
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
HEMOSTASIA E REAÇÃO TECIDUAL AO IMPLANTE DE ESPONJA
DE QUITOSANA EM LESÃO HEPÁTICA DE CAMUNDONGOS
Flávia Resende Martins da Costa
Orientador: Prof. Dr. Eugênio Gonçalves Araújo
GOIÂNIA
2015
ii
FLÁVIA RESENDE MARTINS DA COSTA
HEMOSTASIA E REAÇÃO TECIDUAL AO IMPLANTE DE ESPONJA
DE QUITOSANA EM LESÃO HEPÁTICA DE CAMUNDONGOS
Tese apresentada para obtenção do título de
Doutor em Ciência Animal junto à Escola de
Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal
de Goiás
Área de Concentração:
Patologia, clínica e cirurgia animal
Orientador:
Prof. Dr. Eugênio Gonçalves Araújo – EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Prof ª. Dra. Letícia de Souza Castro Filice -
FAMED/UFU
Prof ª. Dra. Maria Clorinda Soares Fioravanti -
EVZ/UFG
GOIÂNIA
2015
i
iii
FOLHA DE APROVAÇÃO
iv
A Deus, por minha vida e por tudo e todos que a
tornam tão especial... meu esposo, meus filhos,
avós, pais e irmãos. À Izzy (in memorian), Amèlie,
Meggy, Kitty e Matilda.
Aos animais.
v
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Eugênio Gonçalves Araújo, eterna gratidão por seus ensinamentos,
exemplo de postura e trabalho e pela orientação essencial ao desenvolvimento deste estudo.
Ao Prof. Dr. Marcelo Emílio Beletti e à Profa. Dra. Letícia de Souza Castro
Filice, pela amizade, orientação e auxílio imprescindível à execução desta Tese.
À Profa. Dra. Maria Clorinda Soares Fioravanti, pela orientação e apoio.
À Dra. Vilma Ferreira de Oliveira, pela amizade e companheirismo, desde o
princípio desta Tese.
Ao Prof. Dr. Ednaldo Carvalho Guimarães e ao MSc. Matheus Matioli
Mantovani, pela atenção, disponibilidade e orientação na análise estatística.
Ao Professor Dr. Adilson Donizeti Damasceno, pelo apoio, auxílio,
compreensão e amizade.
Ao Prof. Dr. Juan Carlos Duque Moreno e à Profa. Dra. Neusa Margarida Paulo,
pela colaboração.
À Universidade Federal de Goiás, Escola de Veterinária e Zootecnia, Programa
de Pós-Graduação em Ciência Animal e seus docentes, pela oportunidade de aperfeiçoamento.
À Universidade Federal de Uberlândia, Hospital Veterinário, Laboratório de
Cirurgia e Anestesiologia Experimental da Faculdade de Medicina Veterinária, Laboratório de
Histologia do ICBIM da UFU e seus funcionários, em especial à Rosiane e ao Fabrício, pelo
processamento do material histopatológico e disponibilização dos equipamentos necessários
para sua análise e captura de imagens.
À FAPEMIG, pela manutenção do microscópio eletrônico utilizado.
À Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP) e à Profa. Dra. Ângela Maria Morais, pela disponibilização das esponjas de
quitosana testadas.
Ao serpentário Pentapharm© de Uberlândia, pelo fornecimento dos
camundongos utilizados no experimento.
Ao Diretor do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Uberlândia, Sr.
Amado da Silva Nunes Júnior e aos professores MSc. Marco Antônio Ribeiro de Faria, Dr.
Cirilo Antônio de Paula Lima, Dr. André Luiz Quagliatto Santos, Dr. Frederico Ozanam
Carneiro e Silva, Dr. Fábio de Oliveira, Dr. Alcimar Barbosa Soares, Dr. Alfredo Júlio
Fernandes Neto, Dr. Arquimedes Diógenes Ciloni, pelo apoio, amizade e estímulo profissional.
vi
A todos os meus companheiros de trabalho, funcionários do Hospital Veterinário
da Universidade Federal de Uberlândia, especialmente à Gerente Administrativa Vânia Amaral
da Rocha e aos Médicos Veterinários Administrativos e Residentes, pelo auxílio, compreensão
e amizade.
À MSc. Ana Flávia Delben Pereira Arruda, pela amizade e auxílio em todas as
etapas deste estudo.
À Profa. Dra. Jussara de Souza Carneiro, Profa. Dra. Liliane Aparecida Tanus
Benatti e Profa. MSc. Suzana Akemi Tsuruta.
A todos os colegas do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, pela
amizade, convivência agradável, companheirismo e colaboração.
Aos secretários do Programa de Pós-Graduação, pela atenção e auxílio.
Aos professores convidados a compor as bancas de qualificação e defesa, pelo
enriquecimento deste estudo.
A todas as pessoas não nomeadas aqui, mas que, de alguma maneira, me
incentivaram ou participaram da minha formação.
vii
"Nada é tão nosso quanto nossos sonhos."
Nietzsche
viii
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS
Introdução ................................................................................................................................... 1
Estrutura e caracterização da quitosana ..................................................................................... 2
Aplicações da quitosana ............................................................................................................. 4
Quitosana na hemostasia ........................................................................................................... 5
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 10
CAPÍTULO 2 – ESPONJAS DE QUITOSANA PROMOVEM HEMOSTASIA
EFICIENTE EM FÍGADO DE CAMUNDONGO
RESUMO ................................................................................................................................. 18
ABSTRACT ............................................................................................................................ 18
INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 19
METODOLOGIA .................................................................................................................... 20
Local da pesquisa...................................................................................................................... 20
Animais de experimentação ..................................................................................................... 20
Manejo dos animais .................................................................................................................. 21
Tratamentos ............................................................................................................................. 21
Materiais utilizados .................................................................................................................. 22
Procedimentos pré-cirúrgicos, cirúrgicos e pós-cirúrgicos ..................................................... 23
Eutanásia .................................................................................................................................. 25
Estudo histológico e análise de imagens ................................................................................. 25
Análise estatística .................................................................................................................... 26
RESULTADOS ....................................................................................................................... 26
Avaliação macroscópica .......................................................................................................... 26
Hemostasia................................................................................................................................ 26
Avaliação microscópica ........................................................................................................... 27
DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 29
ix
CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 32
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 32
CAPÍTULO 3 – ESPONJAS DE QUITOSANA SÃO BIOCOMPATÍVEIS E
ESTIMULAM SÍNTESE DE COLÁGENO EM FÍGADO DE CAMUNDONGO
RESUMO ................................................................................................................................. 34
ABSTRACT ............................................................................................................................ 34
INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 35
METODOLOGIA .................................................................................................................... 37
Local da pesquisa...................................................................................................................... 37
Animais de experimentação ..................................................................................................... 37
Manejo dos animais .................................................................................................................. 37
Tratamentos ............................................................................................................................. 38
Materiais utilizados .................................................................................................................. 39
Procedimentos pré-cirúrgicos, cirúrgicos e pós-cirúrgicos ..................................................... 39
Eutanásia .................................................................................................................................. 41
Estudo histopatológico e análise de imagens .......................................................................... 41
Análise estatística .................................................................................................................... 43
RESULTADOS ....................................................................................................................... 44
Avaliação macroscópica .......................................................................................................... 44
Avaliação microscópica ........................................................................................................... 44
Avaliação ultramicroscópica ................................................................................................... 53
DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 54
CONCLUSÃO ......................................................................................................................... 58
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 58
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................... 60
ANEXOS ................................................................................................................................. 63
x
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 2
FIGURA 1 – Esponjas utilizadas nos tratamentos hemostáticos.(A) Esponja de quitosana
alginato; (B) Esponja de colágeno hidrolisado liofilizada......................................
22
FIGURA 2 – Fotografias de fígado de camundongo. Incisão circular através da cápsula
hepática realizada com um punch de 5,0 mm (setas)..............................................
24
FIGURA 3 – Fotografias de fígados de camundongos submetidos a tratamento hemostático.
(A) Esponja de quitosana-alginato durante tratamento hemostático em fígado de
camundongo (área demarcada por círculo); (B) Esponja de colágeno hidrolisado
durante tratamento hemostático em fígado de camundongo (área demarcada por
círculo). Nota-se maior embebição de sangue pela esponja de
colágeno..................................................................................................................
27
FIGURA 4 – Fotomicrografias de fígados de camundongos. Ausência de alterações
histológicas e inflamatórias significativas nas áreas adjacentes às lesões após
hemostasia compressiva com esponja de gaze, quitosana e colágeno. Grupos: G
= gaze, Q = quitosana, C = colágeno. (A) G0; (B) Q0; (C) C0; (D) G7; (E) Q7; (F)
C7; (G) G14; (H) Q14; (I) C14. Setas: sinusóides. Asteriscos: hepatócitos. Estrelas:
degeneração granular. Cabeças de seta: necrose. Coloração: HE. Barras:
50μm.......................................................................................................................
28
FIGURA 5 – Fotomicrografias de fígados de camundongos. Áreas correspondentes às lesões
induzidas por punch após hemostasia compressiva com esponja de gaze,
quitosana e colágeno, no pós-operatório imediato e aos 7 e 14 dias pós-
operatórios, demonstrando processo de reparação tecidual. Grupos: G = gaze, Q
= quitosana, C = colágeno. (A) G0; (B) G7; (C) G14; (D) Q0; (E) Q7; (F) Q14; (G)
C0; (H) C7 e (I) C14. Estrelas: fibras colágenas. Coloração: Picrosirius. Barras:
50μm.......................................................................................................................
29
Capítulo 3
FIGURA 1 – Esponjas utilizadas nos tratamentos hemostáticos. (A)Esponja de quitosana-
alginato; (B) Esponja de colágeno hidrolisado liofilizada...................................
38
FIGURA 2 –
Fotografias de fígados de camundongos. A - Incisão circular através da cápsula
hepática realizada com um punch de 5,0 mm (seta). B - Remoção do segmento
hepático (seta) e detalhe do aspecto e dimensão do segmento após remoção
(cabeça de seta). C - Implante de esponja de quitosana-alginato em defeito
hepático (seta). D - Implante de esponja de colágeno hidrolisado liofilizada em
defeito hepático (seta)...................................................................
41
FIGURA 3 – Fotomicrografias de fígados de camundongos. Áreas de implantação de esponja
de quitosana (A) e de colágeno (B) em lesão induzida por punch 7 dias após o
procedimento cirúrgico e áreas de implantação de esponja de quitosana (C) e de
colágeno (D) em lesão induzida por punch 14 dias após o procedimento
cirúrgico. Parênquima hepático normal (asterisco verde); área de necrose
(asterisco azul); fragmentos da esponja de quitosana (estrela amarela);
fragmentos da esponja de colágeno (estrela laranja); reação inflamatória (estrela
branca). Coloração: HE. Barras: 200μm..................................................
46
xi
FIGURA 4 – Fotomicrografias de fígados de camundongos. Áreas de implantação de esponja
de quitosana (A) e de colágeno (B) em lesão induzida por punch 7 dias após o
procedimento cirúrgico e áreas de implantação de esponja de quitosana (C) e de
colágeno (D) em lesão induzida por punch 14 dias após o procedimento
cirúrgico. Parênquima hepático (asterisco verde); fragmentos da esponja de
quitosana (estrela amarela); fragmentos da esponja de colágeno (estrela laranja);
fibras colágenas entre parênquima e esponja (estrela azul). Nota-se a presença
de fibras colágenas mais maduras no 14ºdia, em ambos os grupos (Q e C).
Coloração: Picrosirius. Barras: 200μm.......................................
47
FIGURA 5 – Fotomicrografias de fígados de camundongos. Áreas de implantação de esponja
de quitosana (A) e de colágeno (B) em lesão induzida por punch 7 dias após o
procedimento cirúrgico e áreas de implantação de esponja de quitosana (C) e de
colágeno (D) em lesão induzida por punch 14 dias após o procedimento
cirúrgico. Parênquima hepático (asterisco verde); área de necrose (asterisco
azul); fragmentos da esponja de quitosana (estrela amarela); fragmentos da
esponja de colágeno (estrela laranja); fibras reticulares entre parênquima e
esponja (estrela azul). Coloração: Reticulina. Barras:
200μm...................................................................................................................
48
FIGURA 6 – Comparação da intensidade da reação inflamatória entre os tempos pós-
operatórios do grupo Q (relação asterisco/barra). Aumento dos infiltrados
mononucleares (p=0,0022) e polimorfonucleares (p=0,0026) entre controles
(T0) e 7 dias após o implante (A e B). Aumento do número de células gigantes
entre controles (T0) e 7º dia pós-operatório, com ausência das mesmas 14 dias
após o implante (p=0,0078) (C). Aumento de tecido de granulação entre
controles (T0) e 7 dias e entre controles (T0) e 14 dias após o implante
(p=0,0002) (D). Teste de Kruskal-Wallis.............................................................
49
FIGURA 7 – Comparação da percentagem média de colágeno entre os tempos pós-
operatórios do grupo Q (relação asterisco/barra). Maior quantidade de fibras
colágenas entre controles (T0) e 14 dias após o implante (p=0,001), pelo teste
de Kruskal-Wallis.................................................................................................
49
FIGURA 8 – Comparação da intensidade da reação inflamatória entre os tempos pós-
operatórios do grupo C (relação asterisco/barra). Aumento dos infiltrados
mononucleares (p=0,0022) (A), polimorfonucleares (p=0,0010) (B), de células
gigantes (p=0,0049) (C) e de tecido de granulação (p=0,0002) (D) entre
controles (T0) e 7 dias e entre controles (T0) e 14 dias após o implante, pelo teste
de Kruskal-Wallis.........................................................................................
50
FIGURA 9 – Comparação da percentagem média de colágeno entre os tempos pós-
operatórios do grupo C (relação asterisco/barra). Maior quantidade de fibras
colágenas entre controles (T0) e 14 dias após o implante (p=0,001), pelo teste
de Kruskal-Wallis.................................................................................................
50
FIGURA 10 – Comparação da intensidade da reação inflamatória entre os grupos Q e C nos
momentos experimentais 7 e 14 dias. Não há diferenças de infiltrados
mononucleares (controles T0: p=0,699; 7 dias: p=0,180; 14 dias: p=1) (A),
infiltrados polimorfonucleares (controles T0: p=1; 7 dias: p=0,394; 14 dias:
p=0,24) (B) e tecido de granulação (controles T0: p=1; 7 dias: p=1; 14 dias: p=1)
(D). Há diferença de células gigantes em 7 dias (p=0,699) e em 14 dias
(p=0,015) (controles T0: p=1) (asterisco) (C), pelo teste U de Mann-
Whitney................................................................................................................
52
xii
FIGURA 11 – Eletromicrografias de fígados de camundongos. Áreas adjacentes aos implantes
de esponjas de quitosana (A, B e C). A - Grupo Q7: fibrilas colágenas
desorganizadas (estrela). B - Grupo Q21
: fibrilas colágenas em processo de
organização (estrela). C - Grupo Q21
: fibrilas colágenas desorganizadas
(estrela). Áreas adjacentes aos implantes de esponjas de colágeno (D, E e F). D
- Grupo C7: fibrilas colágenas organizadas em feixe (corte transversal) (estrela).
E - Grupo C21
: fibrilas colágenas desorganizadas (estrela). F - Grupo C21
: maior
densidade de fibrilas colágenas em processo de organização (estrela). Nota-se
prolongamento citoplasmático de fibroblasto (cabeça de seta). Barras: A e B -
1μm, C, D e E - 2μm. F - 1μm. Magnificação: A, B e F - 20.000X, C – 7.000X.
D e E - 12.000X............................................
54
xiii
LISTA DE TABELAS
Capítulo 3
TABELA 1 – Graduação da intensidade das características histológicas do parênquima
hepático de camundongos controle (N) e após implante de esponjas de quitosana
(Q) e colágeno (C)................................................................................
51
TABELA 2 – Percentagens médias de colágeno das áreas submetidas ao implante de esponjas
de quitosana e colágeno aos 7 e 14 dias após implantação....................
52
xiv
LISTA DE QUADROS
Capítulo 2
QUADRO 1 – Distribuição dos grupos de camundongos conforme o tratamento hemostático e
o período para análise histológica.....................................................................
22
QUADRO 2 – Graduação da intensidade das características histológicas do parênquima
hepático de camundongos após tratamento hemostático compressivo com
esponjas de gaze, quitosana e colágeno hidrolisado, adaptada de
Schreinemacher8 ..................................................................................................
25
Capítulo 3
QUADRO 1 – Distribuição dos grupos conforme o implante e o período para análise
histológica em microscopia de luz ......................................................................
38
QUADRO 2 – Distribuição dos grupos conforme o implante e o período para análise
microscópica ultraestrutural ................................................................................
39
QUADRO 3 – Graduação da intensidade das características histológicas do parênquima
hepático de camundongos após implante de biomaterial, adaptada de
Schreinemacher13..................................................................................................
43
xv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ABS - Ankaferd Blood Stop®
ABTO - Associação Brasileira de Transplante de Órgãos
°C - grau Celsius
C - colágeno
cm - centímetro
FC - frequência cardíaca
FR - frequência respiratória
G - grama
G - gaze
HE - hematoxilina eosina
ICBIM - Instituto de Ciências Biomédicas
IM - intramuscular
hm-quitosana - quitosana hidrofobicamente modificada
HV/UFU - Hospital Veterinário Universidade Federal de Uberlândia
kg - quilograma
mg - miligrama
mm - milímetros
µm - micrômetro
N - controle
nm - nanômetro
NaCl - Cloreto de sódio
NaOH - Hidróxido de sódio
Na5P3O10 - Tripolifosfato de sódio
Q - quitosana
SBCAL - Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório
UV - ultravioleta
UFU - Universidade Federal de Uberlândia
UFG - Universidade Federal de Goiás
UNICAMP - Universidade Estadual de Campinas
xvi
RESUMO
A quitosana é um polissacarídeo amino derivado da quitina. Constitui a maior parte dos
exoesqueletos dos insetos, crustáceos e parede celular de fungos, sendo um produto
natural, de baixo custo, renovável e biodegradável. Características como
biocompatibilidade e biodegradabilidade possibilitam diversas utilizações deste
biomaterial na área da saúde. Com o presente estudo objetivou-se avaliar o efeito
hemostático ao contato e a reação tecidual ao implante de esponja de quitosana-alginato
em lesão hepática em camundongos (linhagem Swiss) saudáveis, comparando-os aos de
esponjas de colágeno hidrolisado liofilizadas. As lesões foram induzidas cirurgicamente.
O acesso à cavidade abdominal foi feito por meio de incisão longitudinal mediana pré-
retro-umbilical, seguida de localização e exposição do lobo hepático esquerdo. O defeito
hepático foi realizado por incisão circular através da cápsula hepática com punch
dermatológico de 5,0mm, centralizado na região exposta do lobo esquerdo. Os efeitos
hemostáticos de contato das esponjas de quitosana e colágeno hidrolisado foram
avaliados por meio de sua compressão sobre as lesões hemorrágicas, enquanto os efeitos
de seu implante foram observados a partir da incorporação de fragmentos das referidas
esponjas nos defeitos hepáticos produzidos. Esponjas de gaze foram usadas como
controle para o estudo de contato. Para a avaliação dos implantes, os segmentos hepáticos
retirados para a produção da falha hepática foram utilizados como controles. Os tempos
médios para hemostasia nos tratamentos com quitosana e colágeno foram de 49 segundos
e, nos tratamentos com gaze, um minuto e 28 segundos. À macroscopia observaram-se
aderências omentais sobre os implantes e integração mais rápida da esponja de colágeno
ao tecido receptor. A avaliação microscópica evidenciou reação inflamatória aos dois
materiais implantados e estímulo à síntese de colágeno. A percentagem média de
colágeno dos segmentos hepáticos receptores dos implantes de esponja de quitosana-
alginato e de esponja de colágeno hidrolisado apresentou elevação significativa entre 7 e
14 dias pós-operatórios, permitindo inferir efeito estimulante exercido pelas esponjas de
quitosana sobre a reparação tissular. Concluiu-se que esponjas de quitosana apresentam
ação hemostática e efeito estimulante sobre a síntese de fibras colágenas hepáticas.
Palavras-chave: biomateriais, hemostáticos, fígado, quitosana-alginato, roedores.
xvii
ABSTRACT
Chitosan is a polysaccharide amino derivative of chitin, and constitutes most of the insects
and crustaceans exoskeletons and fungal cell wall, thus being a low-cost, renewable and
abundant, biodegradable natural product. Biological characteristics, biocompatibility and
biodegradability allows various uses of this biomaterial in healthcare. The present study
aimed to evaluate the hemostatic contact effect and tissue response to the implant of
chitosan-alginate sponge in hepatic lesion in Swiss mice, comparing to freeze-dried
hydrolyzed collagen sponges. The lesions were surgically induced. The hemostatic
contact effects of chitosan and hydrolyzed collagen sponges were evaluated through its
mechanical compression on hemorrhagic lesions, while the effects of his implants were
observed from the incorporation of fragments of those sponges in liver failures. Gauze
sponges were used as control for contact study. For the implants evaluation, liver
segments removed to produce hepatic injury were used as controls. Average hemostasis
times for chitosan and collagen treatments were 49 seconds, and one minute and 28
seconds for gauze treatments. Grossly, omental adhesions were observed on the implants
and faster integration of collagen sponge at receiver tissue. Microscopic evaluation
showed inflammatory reaction to both implanted materials and collagen synthesis
stimulation. Average percentage of collagen from hepatic recipients segments of the
chitosan-alginate sponge implant, and collagen hydrolyzate sponge implant increased
significantly between 7 and 14 days postoperatively, pointing to a stimulating effect
exerted by chitosan sponges for tissue repair. In conclusion, chitosan sponges have
hemostatic action and stimulating effect on the synthesis of hepatic collagen fibers.
Keywords: biomaterials, chitosan-alginate, hemostatic, liver, rodents.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS
Introdução
A prática da Medicina, bem como da Medicina Veterinária, exige atualização
constante no que concerne a procedimentos e produtos utilizados, visando atingir uma
relação entre custos e benefícios cada vez mais satisfatória.
Estudos têm sido realizados a fim de determinar a eficácia de polímeros em
diferentes aplicações biológicas, inclusive como agentes hemostáticos e na medicina
regenerativa1-7. Quitina e quitosana são polímeros atóxicos, biodegradáveis,
biocompatíveis e produzidos por fontes naturais renováveis, cujas propriedades e
versatilidade vêm sendo exploradas em aplicações tecnológicas há aproximadamente
setenta anos8-11.
Apesar dos substanciais avanços tecnológicos em relação à hemostasia
obtidos ao longo das duas últimas décadas, a hemorragia continua sendo uma das
principais causas de morte em pacientes traumatizados e importante complicação
cirúrgica6,12-14.
Atualmente existem diversos agentes hemostáticos à disposição do cirurgião,
com diferentes mecanismos de ação e custos. O emprego responsável destes agentes para
uso tópico e intracavitário envolve o conhecimento do tipo de sangramento, presença de
diáteses hemorrágicas e estado do sistema de coagulação do paciente. Também é
importante ter consciência da eficácia, propriedades biológicas e interação dos produtos
com o meio, visto que, colocados em contato direto com os tecidos podem suscitar
reações locais ou sistêmicas adversas e comprometer o prognóstico do procedimento15-17.
Em paralelo, a insuficiência hepática grave continua apresentando elevada
taxa de mortalidade, aumentando os custos médicos a cada ano, mundialmente. No Brasil
atual, pacientes em estágio avançado de doença hepática têm como principal opção
terapêutica o transplante de fígado, cuja prática não atinge 50% da necessidade estimada,
devido ao baixo número de doadores, além de apresentar taxa de sobrevida e eficácia
limitadas18-20.
A medicina regenerativa surgiu como uma nova abordagem para o
tratamento de hepatopatias severas e para diminuir a necessidade de transplantes de
órgãos. A terapia celular e a liberação controlada de fármacos são alternativas ao
transplante, ao estimular a regeneração hepática ou atuar como uma terapia paliativa até
a realização do transplante hepático21-22.
2
Biomateriais são definidos como materiais sintéticos ou naturais utilizados
em dispositivos médicos que ficam em contato com sistemas biológicos, com o intuito de
tratamento ou substituição de tecidos individuais, órgãos inteiros ou algumas funções
exercidas por eles23, ou ainda como materiais não vivos utilizados na área médica ou
biomédica, objetivando a interação com o sistema biológico24.
Outros conceitos de biomateriais envolvem: substâncias sistemática e
farmacologicamente inertes projetadas para implantação ou incorporação em sistemas
vivos; materiais de origem sintética ou natural em contato com tecido, sangue e líquidos
biológicos e destinados para uso em aplicações protéticas, diagnósticas, terapêuticas e de
armazenamento, sem afetar o organismo vivo e seus componentes; toda a substância (à
exceção de fármacos) ou combinação de substâncias, sintéticas ou naturais, que podem
ser usadas por qualquer período de tempo, no conjunto ou como parte de um sistema que
trate, aumente ou substitua tecidos, órgãos ou funções do corpo25.
Uma variedade de materiais vem sendo estudada objetivando aplicações
biológicas; sua seleção baseia-se principalmente na aplicação a que se destinam. Trata-se
de polímeros sintéticos, metais, cerâmicas, macromoléculas naturais (biopolímeros) e
compósitos, manufaturados ou processados para utilização em dispositivos médicos, onde
entram em contato direto com proteínas, células, tecidos, órgãos e sistemas orgânicos26.
Dentre os biopolímeros naturais mais estudados podem ser citados: alginato,
colágeno, ácido hialurônico, dextrana, celulose, fibrina, quitina e quitosana. Os
biopolímeros estruturais mais importantes são os polissacarídeos, como quitina e
quitosana. O interesse por polímeros naturais se justifica por sua biocompatibilidade,
facilidade de processamento e relativa abundância, traduzida por boa relação custo-
benefício e disponibilidade comercial27.
A quitosana vem sendo avaliada como agente hemostático e na engenharia de
tecidos, em sistemas implantáveis de liberação de células e fármacos devido a sua
biocompatibilidade, baixa toxicidade e efeitos imunoestimulantes, antibacterianos e
antifúngicos28,29.
Estrutura e caracterização da quitosana
A quitosana é um biopolímero cuja história inicia-se em 1859, quando Rouget
discutiu seu isolamento pelo aquecimento da quitina em solução concentrada de
hidróxido de potássio30,31. Em 1935 foi publicada sua fórmula original1,32.
A quitosana deriva do processo de desacetilação parcial da quitina (termo
3
derivado da palavra grega Khitón, que significa carapaça, casca ou caixa de
revestimento)24, principal componente dos exoesqueletos dos insetos (ex.: gafanhotos,
libélulas) e crustáceos (ex.: caranguejos, camarões), parede celular de bactérias e fungos
como Flammulina velutipes, Lentinus edodes33, Zygomicetes (gênero Mucor)34 e gênero
Mycelia35, bem como de algas36.
A estrutura química da quitina assemelha-se à da celulose; todavia, apresenta
propriedades diferenciadas pela presença dos grupos amínicos funcionais 31,37. Em termos
de disponibilidade, a quitina é o segundo polissacarídeo mais abundante na natureza
depois da celulose. Ambas são disponíveis na natureza numa quantidade de mais de 10
gigatoneladas anualmente11,38.
Quitina e quitosana são produzidas comercialmente em larga escala, a partir
de carapaças de crustáceos37, resíduos abundantes rejeitados pela indústria pesqueira e
frequentemente considerados poluentes38,39. Tratam-se de produtos naturais, de baixo
custo, renováveis e biodegradáveis, de grande importância econômica e ecológica, pois
sua utilização reduz o impacto ambiental causado por seu acúmulo nos locais onde é
gerado ou estocado11,34.
A quitosana consiste em um biopolímero do tipo polissacarídeo amino com
uma estrutura química única, formando um policátion linear hidrofílico, com elevada
densidade de carga e de grupos reativos, bem como inúmeras ligações de hidrogênio,
facilitando seu processamento e biocompatibilidade36. A quitosana, copolímero de N-
acetilglucosamina e glucosamina é exatamente o derivado N-desacetilado da quitina, ou
seja, o produto da desacetilação parcial da quitina, visto que esta N-desacetilação quase
nunca é concluída40. O correto grau de desacetilação para diferenciar quitina de quitosana
não está totalmente definido, sendo aceitos como quitosana materiais obtidos a partir da
quitina com 50% a 95% de unidades desacetiladas (dependendo da origem do polímero e
da metodologia utilizada) e solúveis em meios ácidos diluídos (ácido acético e
fórmico)24,27,35,39.
Em suma, a quitosana caracteriza-se por apresentar uma estrutura química
que permite modificações e à qual podem ser introduzidos determinados grupamentos
para o desenvolvimento de polímeros destinados a aplicações específicas27, o que se
traduz, por exemplo, em capacidade de geleificação com poliânions, produção de
soluções viscosas, solubilização em misturas de água (dependendo de seu peso molecular)
e álcool, com subsequentes benefícios associados à saúde30,31,41-44.
4
Aplicações da quitosana
A quitosana tem sido produzida comercialmente em larga escala em vários
países (Japão, Estados Unidos da América, Polônia, Itália, Rússia, Noruega e Índia), em
consequência do aumento da sua utilização em diferentes aplicações. Seus grupos aminos
permitem reações químicas com sistemas aniônicos, possibilitando diversas combinações
e, consequentemente, um vasto potencial de formulações35,45.
O potencial de aplicação da quitosana é multidimensional. É utilizada na
agricultura (defensivos e adubos), em proteção ambiental e no tratamento de água
(floculante, removedor de íons, redutor de odores). Também possui funções na indústria
têxtil (fixador de cor), na indústria de alimentos (alimento funcional redutor de colesterol,
fibra dietética, conservante, fungicida e bactericida, recobrimento de frutas) e na indústria
de cosméticos (esfoliante, hidratante capilar, creme dental)11,30,35,46-48.
Adicionalmente, características como bio e histocompatibilidade,
biodegradabilidade e o diferencial de ser reabsorvível a tornam uma substância muito
atrativa como biomaterial na área biomédica e biotecnológica, em suturas cirúrgicas,
curativos para feridas e queimaduras, materiais odontológicos (implantes dentários),
lentes de contato, sistemas de liberação local e sistêmica de fármacos, genes, vacinas e
células tronco, encapsulamento de enzimas, engenharia de tecidos, com fabricação de
biomembranas artificiais (pele), membranas para hemodiálise, dentre muitas outras10,11,35-
37,42,43,45,49-56.
Atualmente, é reconhecida por seus efeitos benéficos à saúde. Apresenta
propriedades estimulantes sobre o sistema imune, a proliferação e a reorganização
celular43,47,50,57. A quitosana impulsiona o recrutamento de células, a angiogênese, a
remodelação óssea e a reparação cartilaginosa34,57-59, favorecendo a penetrabilidade
osteoblástica e a cicatrização60-63. Propriedades analgésicas, hemostáticas, antioxidantes,
antivirais, bactericidas, bacteriostáticas, fungicidas, fungistáticas, antineoplásicas,
antiácidas e hipocolesterolêmicas também são atribuídas à quitosana9,64-67.
A expansão do interesse nas aplicações biomédicas da quitosana impulsiona
a produção de biomateriais especializados, modificados química e fisicamente visando
novos efeitos biológicos para fins específicos na medicina regenerativa. Com o advento
da nanotecnologia, a versatilidade química e tecnológica da quitosana permite sua
combinação com outros polímeros e partículas bioativas, gerando vários
bionanocompósitos50,53,57,68.
Considerando suas propriedades farmacológicas, a quitosana tem sido
5
utilizada por diferentes vias de administração: oral, parenteral, nasal, ocular, transdérmica
ou transepitelial e implantes30,33,34. Várias apresentações podem ser empregadas, como
soluções, suspensões, tabletes, cápsulas, géis, filmes, membranas, esponjas, colmeias,
pós, flocos, fibras, grânulos, nanopartículas, microcápsulas / microesferas, microesferas
entrecruzadas (com polissacarídeos ou lipídeos), sistemas de liberação, suportes,
arcabouços ou matrizes extracelulares69-73.
A quitosana é empregada como matriz em sistemas de liberação controlada
devido à sua propriedade mucoadesiva, facilitando o transporte de drogas sistêmicas ou
locais, proporcionando taxas de liberação controladas e prolongadas e ainda otimizando
o efeito de vários fármacos24,30,45,64, sendo decomposta por enzimas e apresentando
produtos de degradação não tóxicos74.
Dependendo das condições do meio em que a quitosana se encontra e do seu
grau de desacetilação, pode se ligar a lipídeos; tal propriedade justifica uma de suas
indicações, como alimento funcional auxiliar no controle de excesso de gordura das
dietas75.
Estudos realizados não evidenciaram efeito tóxico agudo significativo da
quitosana quando injetada em camundongos, tampouco sinais de irritação ao ser aplicada
na pele e olhos de cobaias e coelhos, respectivamente. Também não ocorreram danos
devido a seu implante no tecido subcutâneo de coelhos76.
O potencial de aplicações da quitosana é reconhecido em diversos aspectos
na Medicina Veterinária, inclusive em sistemas de liberação de quimioterápicos, como
antibióticos, antiparasitários, anestésicos, analgésicos e promotores de crescimento de
epitélio, passíveis de administração por via oral, nasal, conjuntival, mamária, vaginal,
retal e transdermal37.
Quitosana na hemostasia
Em condições fisiológicas, a coagulação do sangue envolve várias proteínas
do plasma e ocorre por meio da cascata de coagulação, culminando na conversão de
fibrinogênio em polímeros de fibrina. Estes polímeros formam tramas que prendem os
leucócitos e as hemácias, as plaquetas e o plasma, formando um coágulo. Subsequentes
interações de miosina e actina nas plaquetas aprisionadas fazem com que o coágulo se
retraia formando um tampão e estancando a hemorragia7.
6
A hemostasia adequada é imprescindível para minimizar a morbidade e a
mortalidade decorrente de hemorragias. Por intermédio de técnicas hemostáticas, é
possível reduzir o tempo cirúrgico, facilitar a visualização das estruturas afetadas,
prevenir deiscências de suturas, infecções, hematomas e coleções de sangue em cavidades
pré-formadas do organismo17,77.
Frente a uma hemorragia, a agilidade da hemostasia é essencial para a
sobrevivência e qualidade de recuperação do paciente. Mesmo com o controle do
sangramento, o volume de sangue perdido pode ser suficiente para determinar hipotermia,
coagulopatia, infecção, acidose e falência múltipla de órgãos78-80.
A prática corrente requer do cirurgião conhecimento e atualização frente à
tecnologia da hemostasia e suas diversas aplicações durante os procedimentos cirúrgicos
eletivos, cirurgias de controles de danos ou uso pré-hospitalar emergencial em
hemorragias traumáticas65,76,81,82. Em situações nas quais o sangramento não pode ser
controlado por métodos tradicionais como compressão local, ligaduras ou eletro-
cauterização, técnicas alternativas podem ser empregadas, como a cauterização por
radiofrequência, ultrassom, laser e aplicação de agentes hemostáticos locais e
sistêmicos5,15,83,84.
Sangramentos exagerados, particularmente em pacientes com perfis
hemostáticos complexos como os portadores de doença hepática grave ou diáteses
hemorrágicas hereditárias ou adquiridas, exigem protocolos terapêuticos baseados no
conhecimento de sua patogênese. A administração de agentes hemostáticos cujos
mecanismos de ação envolvam basicamente a cascata da coagulação não serão efetivos
nestes casos16,85.
Por não apresentar correlação direta com os mecanismos fisiológicos de
coagulação sanguínea, a quitosana, dependendo de sua concentração, é capaz de estimular
a coagulação em poucos segundos, mesmo na ausência de fatores de coagulação e de
plaquetas (sangue heparinizado e desfibrinado). Não foram observadas reações com
albumina ou globulina e o coágulo formado não apresentou retração, (diferente do que
ocorre durante o processo de coagulação na ausência de quitosana), sugerindo
repolimerização da quitosana ou entrecruzamento por contato com os elementos celulares
do sangue1.
As propriedades químicas da quitosana relacionadas à hemostasia
provavelmente incluem peso molecular, extensão de ionização, número de íons, grau de
desacetilação e grau de cristalinidade86. Em função de suas propriedades mucoadesivas,
7
a quitosana apresenta grande potencial como agente hemostático6. Pode ser aplicada
diretamente sobre o local da hemorragia por meio de variadas formas físicas, tais como
pós, soluções, revestimentos, filmes, hidrogéis e filamentos compostos86.
Solução e bandagem de quitosana hidrofobicamente modificada, quando em
contato com o sangue humano heparinizado, apresentam a capacidade de gelificá-lo
rapidamente. A gelificação ocorre devido à ligação dos hidrófobos às membranas das
células sanguíneas, promovendo uma forte ligação entre elas, ao invés de apenas
aprisioná-las em uma trama, como ocorre com a quitosana natural. A reação pode ser
revertida com a adição de α-ciclodextrina, substância capaz de sequestrar os polímeros
hidrofóbicos. Este diferencial permite a reversão do coágulo em casos de embolia de
vasos periféricos à lesão7.
É importante mencionar que a aplicação tópica de soluções de quitosana foi
bastante eficaz na hemostasia de incisões linguais de coelhos normais, coelhos com
alteração plaquetária promovida por epoprosterol e coelhos com comprometimento da
coagulação sanguínea promovida pela heparina. A observação dos coágulos formados
pela quitosana à microscopia eletrônica de varredura mostrou que os eritrócitos haviam
perdido seu formato bicôncavo característico e estavam fortemente agregados, indicando
efeito da quitosana sobre a interação entre os mesmos e estabelecimento de um “plugue”
hemostático2-4.
A propriedade policatiônica da quitosana e sua ligação inespecífica a
membranas celulares estão, provavelmente, relacionadas a seu potencial hemostático. A
quitosana possui carga elétrica positiva e se liga prontamente à superfície celular
carregada negativamente das hemácias, formando um complexo adesivo independente
dos fatores de coagulação sanguínea76,80.
O comportamento pró-coagulante de filmes de quitosana foi comprovado pela
observação de ligações de fibrinogênio e outras proteínas plasmáticas à quitosana, porém
não à quitosana acetilada. A ativação do sistema complemento e da cascata de coagulação
ocorreram em intensidades dependentes do grau de acetilação da quitosana42.
A aplicação de quitosana estimula significante vasoconstrição, em parte via
mecanismo endotélio-dependente (efeito direto da quitosana) e em parte pelo estímulo às
células endoteliais para expressão de endotelina-165,87. A aglutinação de hemácias e
ativação plaquetária para a formação de rede de fibrina também são efeitos de fibras de
quitosana88.
8
Outro relato interessante de utilização deste composto descreveu o emprego
de solução de quitosana como agente hemostático em enxertos vasculares porosos
preveniu hemorragias em estudo envolvendo clampeamento e lesões aórticas infrarenais
em cães heparinizados. As lesões foram preenchidas com segmentos de telas “Dacron”
embebidas em solução de quitosana ou salina e o sangramento foi monitorado logo após
a remoção dos clampes e após 24 horas do procedimento cirúrgico. Os enxertos de tela,
avaliados macroscopicamente, por microscopia de luz comum e eletrônica, após 30, 60,
90 e 120 dias, integraram-se ao músculo liso vascularizado, promovendo suporte ao
endotélio luminal1.
Foram realizados estudos sobre polímeros surfactantes de quitosana,
utilizados para melhorar a compatibilidade dos biomateriais já existentes com os
componentes sanguíneos. Como a quitosana é um polímero policatiônico e trombogênico,
suas cargas de superfície foram modificadas a fim de se determinar o efeito destas sobre
a adesão plaquetária. Observou-se aumento da adesão plaquetária frente às cargas
positivas, bem como redução da superfície de indução à coagulação ativada em resposta
ao surfactante carregado negativamente, indicando a possibilidade de produção de
superfícies adequadas para aplicações cardiovasculares52.
Um estudo comparativo entre os agentes hemostáticos Celox® (quitosana) e
TraumaDex® (polissacarídeo derivado de fécula de batata) foi realizado em suínos. Após
transecção de artéria e veia femoral, os produtos foram introduzidos na lesão,
permanecendo em compressão durante 35 minutos. Celox® e TraumaDex® foram
considerados agentes hemostáticos efetivos, bem como não foram registradas diferenças
estatísticas significativas entre ambos80.
Esferas de quitosana macroporosas recobertas por xerogel de sílica
mesoporoso foram desenvolvidas para hemostasia. As esferas foram aplicadas sobre a
hemorragia provocada por transecção completa da artéria femoral de coelhos, enquanto
o grupo controle foi tratado com compressas de gaze; os animais foram acompanhados
durante 180 minutos. As esferas aceleraram significativamente a via de ativação por
contato da cascata de coagulação, agregaram eritrócitos para a promoção de coágulo
sanguíneo e demonstraram potencial para imobilização de enzimas e antibióticos,
característica interessante para o desenvolvimento futuro de agentes hemostáticos e
cicatrizantes89.
Em humanos, o uso de tampões de quitosana revelou-se eficaz no tratamento
de epistaxes intratáveis convencionalmente, produzindo hemostasia imediata em 95% dos
9
pacientes, mesmo em indivíduos medicados com inibidores de plaquetas e
anticoagulantes84.
Os efeitos de três agentes hemostáticos tópicos foram estudados em ratos
parcialmente nefrectomizados: grânulos de quitosana Celox®, celulose oxidada
Surgicel® e extrato vegetal Ankaferd Blood Stop® (ABS). A quitosana e o extrato
medicinal foram tão efetivos quanto a sutura convencional em promover hemostasia,
contudo, o emprego da quitosana provocou aumento significativo de aderências
intestinais e peritoneais91.
A quitosana natural vem sendo utilizada como material hemostático devido à
sua natureza catiônica e antimicrobiana1,7,86, apesar de demonstrar falhas na manutenção
de coágulos estáveis a longo prazo e, portanto, ineficácia como agente hemostático em
lesões graves, quando utilizado como bandagem / curativo92,93.
A fim de avaliar o desempenho de Omni-Stat® (quitosana) como agente
hemostático em presença de disfunção da coagulação por heparinização, foi realizado um
estudo em suínos. Após a excisão de um segmento circular da artéria femoral, produzido
por um punch vascular, grânulos de quitosana foram depositados e comprimidos no
interior da lesão; o grupo controle recebeu manobras compressivas com gaze e ambos os
grupos foram acompanhados durante 30 minutos. A hemostasia falhou aos sete minutos
nos cinco animais controle e foi obtida em nove dos 12 casos quitosana em cinco minutos,
com manutenção de coágulo estável até 30 minutos após o tratamento94.
A eficácia da membrana de quitosana-alginato hidrofobicamente modificada
(hm-quitosana) como curativo hemostático foi comparada à membrana de quitosana-
alginato não-modificada e curativos de gaze, em modelo de injúria arterial letal em suínos.
A compressão com gaze mostrou-se ineficaz em conter a hemorragia provocada por
transecção da artéria femoral, enquanto as taxas de sucesso da membrana de quitosana-
alginato e da hm-quitosana foram, respectivamente, 75% e 100%. Todavia, os curativos
de quitosana demonstraram, após 44 minutos em média, incapacidade na manutenção da
hemostasia, enquanto a hm-quitosana produziu hemostasia segura durante as três horas
do experimento13.
Em relação à hemostasia, a quitosana demonstrou capacidade de induzir
coalescência de eritrócitos para a formação do coágulo sanguíneo, enquanto o colágeno
depende da clássica cascata da coagulação. Em comparação com o colágeno animal, o
polissacarídeo natural quitosana de alto peso molecular apresenta como importante
diferencial o seu baixo custo95.
10
A quitosana atuou na hemostasia independentemente das vias clássicas de
coagulação e os coágulos ocorreram mesmo frente aos anticoagulantes. Entretanto,
estudos não comprovaram a estabilidade do coágulo a longo prazo. Assim, o produto foi
efetivo em produzir hemostasia em situações emergenciais, porém não deve ser
considerado como tratamento definitivo, e sim como adjuvante às terapias cirúrgicas
convencionais94.
Diante do exposto objetivou-se, com este estudo, avaliar o efeito da esponja
de quitosana-alginato e compará-la à esponja de colágeno hidrolisado liofilizada na
hemostasia e reparação hepática em camundongos saudáveis. Com este propósito foram
observados os seguintes aspectos: tempo para hemostasia nos diferentes tratamentos,
efeito do contato da esponja sobre a lesão hepática e efeito do implante da esponja em
defeito hepático.
REFERÊNCIAS
1. Malette WG, Quigley HJ, Gainess RD. Chitosan: a new hemostatic. Ann Thorac
Surg. 1983;36:55-8.
2. Klokkevold PR, Lew DS, Ellis DG, Bertolami CN. Effect of chitosan on lingual
hemostasis in rabbits. J Oral Maxillofac Surg. 1991;49:856-63.
3. Klokkevold PR, Subar P, Fukayama H, Bertolami CN. Effect of chitosan on lingual
hemostasis in rabbits with platelet dysfunction induced by epoprostenol. J Oral
Maxillofac Surg. 1992;50(1):41-5.
4. Klokkevold PR, Fukayama H, Sun EC, Bertolami CN. Effect of chitosan poly-N-
acetyl glucosamine on lingual hemostasis in heparinized rabbits. J Oral Maxillofac
Surg. 1999;57:49-52.
5. Cole DJ, Conolly RJ, Chan MW, Schwaitzberg SD, Byrne TK, Adams DB, Baron
PL, O’brien PH, Metcalf JS, Demcheva M, Vournakis JA. Pilot study evaluating
the efficacy of a fully acetylated poly-N-acetyl glucosamine membrane formulation
as a topical hemostatic agent. Surg. 1999;126:510-17.
6. Pusateri AE, MacCarthy SJ, Gregory KW, Harris RA, Cardenas L, Macnaus AT,
Goodwin CW. Effect of a chitosan-based hemostatic dressing on blood loss and
survival in a model of severe venous hemorrhage and hepatic injury in swine. J
Trauma. 2003;54(1):177-82.
7. Dowling MB, Kumar R, Keibler MA, Hess JR, Bochicchio GV, Raghavan SR. A
self-assembling hydrophobically modified chitosan capable of reversible
hemostatic action. Biomaterials. 2011;32:3351-7.
8. Campana Filho SP, Signini R. Efeitos de aditivos da desacetilação de quitina.
Polímeros: Ciência e Tecnologia. 2001;11(4):169-73.
11
9. Bae K, Jun EJ, Lee SM, Paik DI, Kim JB. Effect of water-soluble reduced chitosan
on Streptococcus mutans, plaque regrowth and biofilm vitality. Clin Oral Invest.
2006;10:102-7.
10. Akincibay H, Senel S, Ay ZY. Application of chitosan gel in the treatment of
chronic periodontitis. J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater. 2007;80(2):290-
6.
11. Azevedo VVC, Chaves AS, Bezerra DC, Lia Fook MV, Costa ACF. Quitina e
Quitosana: aplicações como biomateriais. REMAP. 2007;2(3):27-34.
12. Arnaud F, Teranishi K, Tomori T, Carr, W, McCarron R. Comparision of 10
hemostatic dressings in a groin puncture model in swine. J Vasc Surg. 2009;
50(3):632-9.
13. De Castro GP, Dowling MB, Kilbourne M, Keledjian K, Driscoll IR, Raghavan SR,
Hess JR, Scalea TM, Bochicchio GV. Determination of efficacy of novel modified
chitosan sponge dressing in a lethal arterial injury model in swine. J Trauma.
2011;72(4):899-907.
14. Xie X, Tian JK, Lv FQ, Wu R, Tang WB, Luo YK, Huang YQ, Tang J. A novel
hemostatic sealant composed of gelatin, transglutaminase and thrombin effectively
controls liver trauma-induced bleeding in dogs. Acta Pharmacol Sin.
2013;34(7):983-8.
15. Achneck HE, Sileshi B, Jamiolkowski RM, Albala DM, Shapiro ML, Lawson JH.
A comprehensive review of topical hemostatic agents: efficacy and
recommendations for use. Ann Surg. 2010;251(2):217-28.
16. Turgut M, Tutkun F, Celebi N, Muglali M, Haznedaroglu IC, Goker H. Topical
Ankaferd Bloodstopper in the Management of Critical Bleedings due to
Hemorrhagic Diathesis. Int J Hematol. 2011;21(3):160-5.
17. Jang Y, Kim H, Roh BD, Kim E. Biologic response of local hemostatic agents used
in endodontic microsurgery. Restor Dent Endod. 2014;39(2):79-88.
18. Kazemnejad S. Hepatic Tissue Engineering Using Scaffolds: State of the Art.
Avicenna J Med Biotech. 2009;1(3):135-45.
19. Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos. Dimensionamento dos
transplantes no Brasil e em cada estado. RBT. 2014;4:01.
20. Sacerdote LCF. Complicações anatomo-patológicas e sobrevida de pacientes
submetidos a transplante hepático (Estado da Bahia, Brasil). [Monografia].
Salvador: Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Medicina da Bahia; 2014.
21. Zhang W, Tucker-Kellogg L, Narmada BC, Venkatraman L, Chang S, Lu Y, Tan
N, White JK, Jia R, Bhowmick SS, Shen S, Forbes Dewey Jr C, Yu H. Cell-delivery
therapeutics for liver regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 2010;62(7-8):814-26.
22. Sousa PF, Preto AS, Leão D, Madureira AM, Paquete J, Costa-Maia J, Vilares-
Morgado P. Quimioembolização arterial transcatéter com partículas carregadas
12
com doxorrubicina no tratamento do carcinoma hepatocelular. Acta Med Port.
2011; 24(1):029-36.
23. Agrawal CM. Reconstructing the human body using biomaterials. J Mater.1998;31-
5.
24. Spin-Neto R, Pavone C, Freitas RM, Marcantonio RAC, Marcantonio-Júnior E.
Biomateriais à base de quitosana com aplicação Médica e odontológica: revisão de
literatura. Rev Odontol UNESP. 2008;37(2):155-61.
25. Park JB, Bronzino JD. Biomaterials: Principles and Applications. Boca Raton: CRC
Press; 2002. 250p.
26. De Souza KC, Mohallem NDS, Sousa EMB. Nanocompósitos magnéticos:
Potencialidades de aplicações em biomedicina. Quim Nova. 2011;34(10):1692-
703.
27. Rinaudo M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog Polym Sci.
2006;31(7):603-32.
28. Wang X, Yu X, Yan Y, Zhang RJ. Liver tissue responses to gelatin and
gelatin/chitosan gels. Biomed Mater Res A. 2007;87(1):62-8.
29. Vosough M, Moslem M, Pournasr B, Baharvand H. Cell-based therapeutics for
liver disorders. Br med bull. 2011;110:157-72.
30. Dodane V, Villivalam VD. Pharmaceutical applications of chitosan. Pharma sci
technol. 1998;1:246-53.
31. Damian C, Beirão LH, Francisco A, Espírito Santo MLP, Teixeira E. Quitosana:
um amino polissacarídeo com características funcionais. Alim e Nutr.
2005;16(2):195-205.
32. Schorigin P, Makarowa-Semljanskaja NN. [Über die desaminierung von chitin ud
glucosamine]. Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft A/B (Eur JIC).
1935;68(5):965-9. Alemão
33. Wong TW. Chitosan and its use in design of insulin delivery system. Recent Pat
Drug Deliv Formul. 2009;3(1):8-25.
34. Costa Silva HSR, Santos KSCR, Ferreira EI. Quitosana: derivados hidrossolúveis,
aplicações farmacêuticas e avanços. Quim Nova. 2006;29(4):776-85.
35. Kumar MNVR. A review of chitin and chitosan applications. Reative and
Functional Polymers. 2000;46:1-27.
36. Tavaria FK, Costa EM, Pina-Vaz I, Carvalho MF, Pintado MMA. Quitosana como
biomaterial odontológico: estado da arte. Rev Bras Eng Bioméd. 2013;29(1):110-
20.
37. Senel S, McClure SJ. Potential applications of chitosan in veterinary medicine. Adv
Drug Deliv Rev. 2004;56(10):1467-80.
13
38. Je J, Kim SK. Antimicrobial action of novel chitin derivative. Biochim Biophys
Acta. 2006;1760:104-9.
39. Goy RC, Assis OBG, Campana Filho SP. Produção de esferas de quitosana.
Biotecnologia cienc desenvolv. 2004;33.
40. López-Lacomba JL, Garcia-Cantalejo JM, Sanz Casado JV, Abarrategui A, Correas
Magana V, Ramos V. Use of rhBMP-2 activated chitosan films to improve
osseointegration. Biomacromolecules. 2006;7:792-8.
41. Kubota N, Eguchi Y. Facile preparation of water-soluble N-acetylated chitosan and
molecular weight dependence of its water-solubility. Polimer
Journal.1997;29(2):123-7.
42. Benesch J, Tengvall P. Blood protein adsorption onto chitosan. Biomaterials.
2002;23:2561-8.
43. Niekraszewicz A. Chitosan Medical Dressings. Fib Text East Eur. 2005;13(6),(54):16-8.
44. Kang PL, Shwu JEN, Chang SJ, Manousakas I, Lee CW, Yao CH, Lin FH, Kuo
SM. Development and assessment of hemostasis chitosan dressings. Carbpol.
2011;85(3):565-70.
45. Singla AK, Chawla M. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects - an
update. J Pharm Pharmacol. 2001;53(8):1047-67.
46. Cartier N, Domard A, Chanzy H. Single crystals of chitosan. Int J Biol Macromol.
1990;12(5):289-94.
47. Chatelet C, Damour O, Domard A. Influence of the degree of acetylation on some
biological properties of chitosan films. Biomaterials. 2001;22(3):261-8.
48. Devlieghere F, Vermeulen A, Debevere J. Chitosan: antimicrobial activity,
interactions with food components and applicability as a coating on fruit and
vegetables. Food Microbiol. 2004;21:703–14.
49. Needleman IG, Martin GP, Smales FC. Characterization of bioadhesives for
periodontal and oral mucosal drug delivery. J Clin Periodontol. 1998;25(1):74-82.
50. Muzzarelli C, Muzzarelli RA. Natural and artificial chitosan-inorganic composites.
J Inorg Biochem. 2002;11;92(2):89-94.
51. Guggi D, Kast CE, Bernkop-Schnürch A. In vivo evaluation of an oral salmon
calcitonin-delivery system based on a thiolated chitosan carrier matrix. Pharm Res.
2003;20(12):1989-94.
52. Sagnella S, Mai-Ngam K. Chitosan based surfactant polymers designed to improve
blood compatibility on biomaterials. Colloids Surf B Biointerfaces.
2005;10;42(2):147-55.
14
53. Hein S, Wang K, Stevens WF, Kjems J. Chitosan composites for biomedical
applications: status, challenges and perspectives. J Mater Sci Technol.
2008;24(9):1053-61.
54. Altman AM, Yan Y, Matthias N, Bai X, Rios C, Mathur AB, Song YH, Alt EU.
IFATS Collection: Human Adipose-Derived Stem Cells Seeded on a Silk Fibroin-
Chitosan Scaffold Enhance Wound Repair in a Murine Soft Tissue Injury Model.
Stem Cells. 2009;27:250-8.
55. Silva RL. Sistema de liberação controlada de quitosana contendo antígeno capsular
Vi de Salmonella Typhi. [Dissertação]. Belém: Universidade Federal do Pará,
Instituto de Ciências da Saúde; 2012.
56. Listoni AJ. Estudo do potencial de diferenciação de células tronco mesenquimais
equinas oriundas do sangue da medula óssea cultivadas sobre um filme
multicamadas de biopolímeros: quitosana, HA E CMC. [Dissertação]. Botucatu:
Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociência; 2013.
57. Muzzarelli, RAA. Chitosan composites with inorganics, morphogenetic proteins
and stem cells, for bone regeneration. Cabr Polym. 2011;83:1433-45.
58. Chevrier A, Hoemann CD, Sun J, Buschmann MD. Chitosan-glycerol
phosphate/blood implants increase cell recruitment, transient vascularization and
subchondral bone remodeling in drilled cartilage defects. Osteoarthritis Cartilage.
2007;15(3):316-27.
59. Laranjeira MCM, Fávere VT. Quitosana: biopolímero funcional com potencial
industrial biomédico. Quím. Nova. 2009;32(3):672-8.
60. Ueno H, Yamada H, Tanaka I, Kaba N, Matsuura M, Okumura M, Kadosawa T,
Fujinaga T. Accelerating effects of chitosan for healing at early phase of
experimental open wound in dogs. Biomaterials. 1999;20(15):1407-14.
61. Yusof NL, Lim LY, Khor E. Preparation and characterization of chitin beads as a
wound dressing precursor. J Biomed Mater Res. 2001;54(1):59-68.
62. Bernabeu E, Sánchez-Brea, LM, Larena A, Cáceres DA, De La Piedra C, Montero,
M, Vicario C, Fuentes A, Ibarzábal A. [Análisis por micrometria óptica directa e
confocal de quitosano em médio de cultivo de osteoblastos]. Patologia Del Aparato
Locomotor. 2005;3(2):144-51. Espanhol.
63. Filgueira FGF. Hidroxiapatita associada à quitosana na reparação óssea. X
Congresso Brasileiro de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária; 2012; Búzios,
Brasil. Jornal Brasileiro de Ciência Animal – JBCA (Campos dos Goytacazes);
2012. 5(10). p.31.
64. Senel S, Ikinci G, Kaş S, Yousefi-Rad A, Sargon MF, Hincal AA. Chitosan films
and hydrogels of chlorhexidine gluconate for oral mucosal delivery. Int J Pharm.
2000;193(2):197-203.
65. Garner JP, Brown RFR. Recent advances in topical agents for prehospital
haemostasis. Trauma. 2002;4(4):203-9.
15
66. Deng C, He L, Zhao M, Yang D, Liu Y. Biological properties of the chitosan-gelatin
sponge wound dressing. Carbpol. 2007;69:583–9.
67. Goy RC, Britto D, Assis OBG. A review of the antimicrobial activity of chitosan.
Polímeros: Ciência e Tecnologia. 2009;19(3):241-7.
68. Mertins O. Estudos físico-químicos e estruturais de lipossomas compósitos de
fosfatidilcolina e quitosana. [Tese] Porto Alegre: (Universidade Federal do Rio
Grande do Sul), Instituto de Química; 2008.
69. Liu DZ, Chen WP, Lee CP, Wu SL, Wang YC, Chung TW. Effects of alginate
coated on PLGA microspheres for delivery tetracycline hydrochloride to
periodontal pockets. J Microencapsul. 2004;21(6):643-52.
70. Zhang Y, Cheng X, Wang J, Wang Y, Shi B, Huang C, Yang X, Liu T. Novel
chitosan/collagen scaffold containing transforming growth factor-beta1 DNA for
periodontal tissue engineering. Biochem Biophys Res Commun.
2006;26;344(1):362-9.
71. Siqueira NM. Desenvolvimento tecnológico e avaliação de penetração cutânea de
benzofenona-3 a partir de nanocápsulas revestidas com quitosana. [Monografia]
Porto Alegre: (Universidade Federal do Rio Grande do Sul), Faculdade de
Farmácia; 2008.
72. Vitali L, Laranjeira MC, Gonçalves NS, Fávere. Spray-dried chitosan microspheres
containing 8-hydroxyquinoline -5 sulphonic acid as a new adsorbent for Cd(II) and
Zn(II) ions. Int J Biol Macromol. 2008;42(2):152-7.
73. Rangel MLSS. Nanomagnetitas revestidas com biopolímero quitosana para
aplicação na remediação ambiental. [Monografia] Rio de Janeiro: (Centro
Universitário de Estadual da Zona Oeste), Curso de Ciências Biológicas; 2012.
74. Muzzarelli RAA. Chitosan based dietary foods. Carbpol. 1996;29:309-16.
75. Mathur NK, Narang CK. Chitin and chitosan, versatile polysaccharides from
marine animals. J Chem Educ. 1990;67(11):938-42.
76. Rao SB, Sharma CP. Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and
hemostatic potential. J Biomed Mater Res. 1997 Jan;34(1):21-8.
77. Lewis KM, Atlee HD, Mannone AJ, Dwyer , Lin L, Goppelt A, Redl H.
Comparison of Two Gelatin and Thrombin Combination Hemostats in a Porcine
Liver Abrasion Model. J Invest Surg. 2013;26:141-8.
78. Cosgriff N, Moore EE, Sauaia A, Kenny-Moynihan M, Burch JM, Galloway B.
Predicting life-threatening coagulopathy in the massively transfused trauma patient:
hypotemia and acidoses revisited. J Trauma. 1997;42(5):857-61.
79. Heckbert SR, Vedder NB, Hoffman W, Winn RK, Hudson LD, Jurkovich GJ,
Copass MK, Harlan JM, Rice CL, Maier RV. Outcome after hemorrhagic shock in
trauma patients. J Trauma. 1998;45(3):545-9.
16
80. Gegel BT, Burgert JM, Lockhart C, Austin R 3rd, Davila A, Deeds J, Hodges L,
Hover A, Roy J, Simpson G, Weaver S, Wolfe W, Johnson D. Effects of Celox and
TraumaDEX on hemorrhage control in a porcine model. AANA J. 2010;78(2):115-
20.
81. Holcomb JB, Pusateri AE, Hess JR, Hetz SP, Harris RA, Tock BB, Drohan WN,
MacPhee MJ. Implications of new dry fibrin sealant technology for trauma surgery.
Surg Clin North Am. 1997;77(4):943-52.
82. Bochicchio GV, Kilbourne MJ, Keledjian K, Hess J, Scalea T. Evaluation of a new
hemostatic agent in a porcine grade V liver injury model. Am Surg.
2010;76(3):317-20.
83. Ereth MH, Schaff M, Ericson EF, Wetjen NM, Nuttall GA, Oliver WC Jr.
Comparative safety and efficacy of topical hemostatic agents in a rat neurosurgical
model. Neurosurgery. 2008;63(4 Suppl 2):369-72.
84. Petroianu A. Hemostasis of the liver, spleen, and bone achieved by electrocautery
greased with lidocaine gel. Surg Today. 2011;41(2):300-2.
85. Weeder PD, Porte RJ, Lisman T. Hemostasis in Liver Disease: Implications of New
Concepts for Perioperative Management. Transfus Med. 2014;28(3):107-113.
86. Whang HS, Kirsch W, Zhu YH, Yang CZ, Hudson SM. Hemostatic agents derived
from chitin and chitosan. J Macromol Sci Polym Rev. 2005;45(4):309-23.
87. Ikeda Y, Young LH, Vournakis JN, Lefer AM. Vascular effects of poly-N-
acetylglucosamine in isolated rat aortic rings. J Surg Res. 2002;102(2):215-20.
88. Fischer TH, Thatte HS, Nichols TC, Bender-Neal DE, Bellinger AD, Vournakis JN.
Synergistic platelet integrin signaling and factor XII activation in poly-N-acetyl
glucosamine fiber-mediated hemostasis. Biomaterials. 2005;26(27):5433-43.
89. Dai C, Liu C, Wei J, Hong H, Zhao Q. Molecular imprinted macroporous chitosan
coated mesoporous silica xerogels for hemorrhage control. Biomaterials.
2010;31(30):7620-30.
90. Shikani AH, Chahine KA, Alqudah MA. Endoscopically guided chitosan nasal
packing for intractable epistaxis. Am J Rhinol Allergy. 2011;25(1):61-3.
91. Tokgöz H, Bektas S, Hancic V, Erol B, Akdumana B, Karakaya K, Hakimolu S,
Mungan NA. Postoperative adhesions after application of topical hemostatic
agents: outcomes in a rat partial nephrectomy model. Urology. 2011;78(4):970.e9-
14.
92. Kheirabadi BS, Acheson EM, Deguzman R, Sondeen JL, Ryan KL, Delgado A,
Dick EJ Jr, Holcomb JB. Hemostatic efficacy of two dressings in an aortic
hemorrhage model swine. J Trauma. 2005;59(1):25-35.
93. Ward K, Tiba MH, Holbert WH. Comparison of a new hemostatic agent to current
combat hemostatic agents in a swine model of lethal extremity arterial hemorrhage.
J Trauma. 2007;63(2):276-84.
17
94. Millner RWJ, lockhart AS, Marr R, Jones K. Omni-Stat (chitosan) arrests bleeding
in heparinized subjects in vivo: an experimental study in a model of major
peripheral vascular injury. Eur J Cardiothorac Surg. 2011;39(6):952-4.
95. Wang X, Yan Y, Zhang R. Comparision of chitosan and collagen sponges as
hemostatic dressings. J bioact compat polym.2006;21(1):39-54.
CAPÍTULO 2 – ESPONJAS DE QUITOSANA PROMOVEM HEMOSTASIA
EFICIENTE EM FÍGADO DE CAMUNDONGO
RESUMO
Colágeno e quitosana tem sido estudados como agentes hemostáticos, demonstrando
mecanismos diferentes para a produção da hemostasia. O colágeno depende da clássica
cascata da coagulação, enquanto o efeito pró-coagulante da quitosana relaciona-se à sua
capacidade de interação com a membrana celular dos eritrócitos, adsorção de fibrinogênio
e outras proteínas plasmáticas, agregação plaquetária e estímulo à liberação de fatores de
crescimento pelas plaquetas. O intuito do presente estudo foi avaliar, por meio de
compressão sobre lesões hemorrágicas, o efeito hemostático de contato e o estímulo à
reação inflamatória das esponjas de quitosana-alginato, comparando-os aos de esponjas
de colágeno hidrolisado liofilizadas. Esponjas de gaze foram usadas como controle.
Foram provocadas cirurgicamente hemorragias hepáticas em camundongos saudáveis. O
acesso à cavidade abdominal se deu por meio de incisão longitudinal mediana pré-retro-
umbilical, seguida de localização e exposição do lobo hepático esquerdo. O defeito
hepático foi realizado por incisão circular através da cápsula hepática com punch
dermatológico de 5,0mm, centralizado na região exposta do lobo esquerdo. Foi permitido
que o ferimento sangrasse por três segundos e removido o excesso de sangue com
esponjas de gaze, antes da aplicação do tratamento hemostático a cada grupo. Os tempos
médios dos tratamentos hemostáticos com gaze, quitosana e colágeno, foram,
respectivamente, um minuto e 28 segundos, 49 segundos e 49 segundos, demonstrando
estatisticamente a capacidade hemostática elevada das esponjas de quitosana e de
colágeno, com diminuição do tempo de hemostasia em 94,32% em relação à gaze
utilizada como controle. Os segmentos hepáticos submetidos ao contato com as esponjas
de gaze, quitosana e colágeno não apresentaram reação inflamatória significativa.
Palavras-chave: biomateriais, coagulação sanguínea, fígado, polímeros, reação
inflamatória, trauma.
CHAPTER 2 - CHITOSAN SPONGES PROMOTE EFFICIENT HEMOSTASIS
IN MOUSE LIVER
ABSTRACT
Collagen and chitosan have been studied as hemostatic agents, promoting hemostasis
through different mechanisms. Collagen depends on the classical coagulation cascade,
while the procoagulant effect of chitosan relates to its ability to interact with the cell
membrane of erythrocytes, fibrinogen adsorption and other plasma proteins, platelet
aggregation and by stimulating platelet release of growth factors. The aim of this study
was evaluate by mechanical compression, the hemostatic contact effects of gauze,
chitosan-alginate and hydrolyzate lyophilized collagen sponges. Gauze sponges were
used as control. Liver hemorrhage in healthy mice was surgically induced. Access to the
abdominal cavity was through pre-retro-umbilical median longitudinal incision, followed
by location and exposure of the left hepatic lobe. Liver defect was performed by circular
incision through the liver capsule with a 5.0 mm dermatological punch centered on the
19
exposed region of the left lobe. The wound was allowed to bleed for three seconds, and
excess blood removed with gauze prior to application of hemostatic treatment for each
group. The average times of treatments with gauze, chitosan and collagen sponges were,
respectively, one minute and 28 seconds, 49 seconds and 49 seconds, statistically
demonstrating the high hemostatic capacity of chitosan and collagen sponges, with
reduction of hemostasis time in 94,32% as compared to gauze used as control. The liver
segments subjected to contact with the gauze, chitosan and collagen sponges presented
no significant inflammatory reaction.
Keywords: blood clotting, chitosan-alginate, hydrolyzate collagen, inflammatory
reaction, liver, trauma.
INTRODUÇÃO
A hemostasia depende do equilíbrio entre cascata da coagulação e sistemas
complemento e fibrinolítico, com complexas interações envolvendo proteínas
plasmáticas, células sanguíneas, endotélio vascular, fluxo e viscosidade sanguínea1.
Tanto filmes de colágeno quanto de quitosana apresentam capacidade de indução à adesão
e agregação plaquetárias, bem como de ativação da via intrínseca da cascata de
coagulação2,3.
Entretanto, os mecanismos utilizados pelo colágeno e pela quitosana para a
hemostasia não são idênticos. Diferente do colágeno, o qual é dependente da clássica
cascata da coagulação, indução plaquetária e fatores de coagulação solúveis, a quitosana
pode induzir hemostasia por coalescência de eritrócitos, formando um coágulo
sanguíneo4. Diante de uma hemorragia no fígado, principalmente quando associada a um
quadro de insuficiência hepática e distúrbios da coagulação sanguínea, um mecanismo
hemostático independente da cascata de coagulação torna-se bastante oportuno. A
localização anatômica do fígado e sua consistência friável frequentemente restringem o
acesso cirúrgico à lesão, dificultando a utilização das técnicas hemostáticas por
compressão local, ligaduras e eletro-cauterização5.
Nesse sentido, a avaliação do agente hemostático à base de hm-quitosana,
por meio de compressão em injúria venosa hepática central de suínos, demonstrou sua
capacidade de redução do tempo para hemostasia em relação às esponjas de gaze6. Ainda,
o efeito da esponja de hidrogel de quitosana foto-polimerizável sobre a hemostasia
hepática de ratos (heparinizados ou não) foi comparado ao da esponja de colágeno
revestida de fibrina em lesões penetrantes produzidas por punch dermatológico no lobo
hepático esquerdo foram preenchidas pelo fragmento do material a ser avaliado, enquanto
20
os animais do grupo controle foram tratados por compressão com hastes de algodão.
Apesar do efeito hemostático dos materiais testados ter sido idêntico nos ratos não-
heparinizados, o tratamento com a membrana de quitosana-alginato foto-polimerizável
por meio de irradiação ultravioleta (UV) foi o mais efetivo para os heparinizados7.
Ampliando as possibilidades de uso desse biomaterial, a técnica utilizada para
o desenvolvimento das esponjas CS-B, curativos hemostáticos de quitosana tratados com
hidróxido de sódio (NaOH) e/ou tripolifosfato de sódio (Na5P3O10), permitiu o
aperfeiçoamento dos quesitos elasticidade, flexibilidade, capacidade de recuperação da
conformação original após compressão e hemostasia, velocidade de absorção sanguínea
e formação de coágulo e adesividade das células sanguíneas8.
Assim, objetivou-se, com este estudo, comparar o efeito das esponjas de
quitosana-alginato e colágeno hidrolisado liofilizada na hemostasia hepática de
camundongos saudáveis, avaliando o tempo para se atingir a hemostasia por meio de
compressão mecânica nos diferentes tratamentos, bem como quantificar e comparar a
reação inflamatória dos segmentos hepáticos submetidos ao contato com as referidas
esponjas, ao término do procedimento cirúrgico e após sete e 14 dias de pós-operatório.
METODOLOGIA
Local da pesquisa
Após aprovação pela Comissão de Ética na Utilização de Animais da
Universidade Federal de Uberlândia (UFU) (nº 138/11 e 219/11) (ANEXO A), o presente
estudo foi desenvolvido no Laboratório de Cirurgia e Anestesiologia Experimental da
Faculdade de Medicina Veterinária e Laboratório de Histologia da UFU, com a
colaboração da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás
(UFG), da Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP) e do serpentário Pentapharm©, de Uberlândia, Minas Gerais.
Animais de experimentação
Foram utilizados 54 camundongos (linhagem Swiss) machos com dez
semanas de idade e peso médio de 35g, considerados hígidos após exames clínicos
(observação do estado de alerta, padrão respiratório, presença de secreções nasais ou
oculares e diarreia).
21
Manejo dos animais
Todos os procedimentos de manejo dos animais foram conduzidos conforme
orientação e normas estabelecidas pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de
Laboratório (SBCAL).
Os camundongos foram alojados em caixas de polipropileno medindo
34x41x16cm (largura, comprimento, altura), com tampa em arame galvanizado e
bebedouro em polipropileno, com capacidade para 250ml, no biotério do Hospital
Veterinário (HV/UFU), que possui ambiente climatizado com temperatura média de 24°C
± 2°C e período de claro / escuro de 12 horas.
Foram colocados seis camundongos por gaiola. Todas as gaiolas possuíam
cama de maravalha. A alimentação foi constituída de ração específica para a espécie
(Presence® Ratos e Camundongos, Evialis, Paulínia, SP) fornecida ad libitum. Água
limpa permaneceu disponível durante todo o período experimental. A higienização das
gaiolas, bebedouros e ambiente foi realizada diariamente.
Antecedendo à fase experimental, foi considerado um período de 15 dias para
adaptação ambiental dos animais. Para minimizar o estresse e desconforto dos
camundongos, o manejo do biotério e manipulação dos animais foram realizados por
equipe previamente treinada e em horário pré-determinado.
Tratamentos
Os 54 camundongos foram distribuídos igualmente e aleatoriamente em três
grupos de tratamento, com 18 animais cada: Tratamento G, grupo controle, cujos animais
receberam tratamento hemostático físico por meio de compressão com esponjas de gaze
estéril; tratamento Q, com o uso de esponjas de quitosana-alginato (Figura 1 - A); e
tratamento C, com o uso de esponjas de colágeno hidrolisado liofilizadas (Figura 1 - B).
Cada grupo foi dividido em três subgrupos de seis animais, de acordo com o
tempo experimental pré-determinado para análise histológica hepática pós-cirúrgica,
realizada no dia do procedimento, aos 7 e 14 dias pós-operatórios (Quadro 1).
A
22
QUADRO 1 – Distribuição dos grupos de camundongos conforme o tratamento hemostático e o
período para análise histológica
GRUPOS ANÁLISE HISTOLÓGICA
Dia 0 Dia 7 Dia 14
TOTAL DE
ANIMAIS
Controle (G) (G0)
6 animais
(G7)
6 animais
(G14)
6 animais
18
Quitosana (Q) (Q0)
6 animais
(Q7)
6 animais
(Q14)
6 animais
18
Colágeno (C) (C0)
6 animais
(C7)
6 animais
(C14)
6 animais
18
TOTAL 18 18 18 54
FIGURA 1 – Esponjas utilizadas nos tratamentos
hemostáticos. (A) Esponja de
quitosana-alginato; (B) Esponja de
colágeno hidrolisado liofilizada.
Materiais utilizados
As hemorragias hepáticas foram provocadas por um punch dermatológico
circular metálico de 5,0mm de diâmetro previamente autoclavado. As esponjas de
quitosana-alginato foram fornecidas pelo Departamento de Processos Biotecnológicos da
Faculdade de Engenharia Química da UNICAMP, São Paulo e esterilizadas em óxido de
etileno. Para os animais do tratamento C foi utilizado colágeno comercial (Hemospon®,
Technew©, Rio de Janeiro, RJ).
23
Procedimentos pré-cirúrgicos, cirúrgicos e pós-cirúrgicos
Os animais foram submetidos a jejum pré-operatório alimentar e hídrico de
uma hora. Posteriormente, foram contidos manualmente e pré-anestesiados com 1mg/kg
de cloridrato de tramadol (Cloridrato de tramadol®, União Química Farmacêutica, São
Paulo, SP) e 0,5mg/kg de acepromazina (Acepran®, Vetnil Indústria e Comércio de
Produtos Veterinários Ltda, Louveira, SP) por via intramuscular (IM), na região posterior
dos membros pélvicos.
A indução e manutenção anestésica foram realizadas por inalação de mistura
gasosa de oxigênio e isofluorano (Isofluorano®, Instituto BioChimico e Indústria
Farmacêutica Ltda, Itatiaia, RJ) por meio de máscara e a profundidade anestésica foi
avaliada pela presença ou ausência de reflexos (cauda, palpebral e corneal), alterações
das frequências cardíaca (FC) e respiratória (FR) e da temperatura corporal.
Toda a região ventral dos animais foi tricotomizada e preparada
assepticamente com álcool etílico 70%, iodopovidona tópico e álcool etílico 70%. Em
seguida, os panos de campo foram adequadamente posicionados.
O acesso à cavidade abdominal foi realizado por meio de uma incisão
longitudinal mediana pré-retro-umbilical, seguida da localização e exposição do lobo
hepático esquerdo. O defeito hepático foi provocado por uma incisão circular através da
cápsula hepática com um punch dermatológico de 5,0mm, centralizado na região exposta
do lobo esquerdo (Figura 2). Foi permitido que o ferimento sangrasse por três segundos
e então removido o excesso de sangue com esponjas de gaze, antes da aplicação do
tratamento hemostático a cada grupo.
Nos animais do grupo G, a hemostasia foi realizada apenas por compressão
utilizando esponjas de gaze. Nos animais do grupo Q, uma esponja de quitosana-alginato
de 5mm de diâmetro, previamente hidratada em solução fisiológica (Solução isotônica de
Cloreto de sódio 0,9% - Glicolabor Indústria Farmacêutica Ltda, Ribeirão Preto, SP)
durante 30 minutos, foi aplicada sobre a lesão de forma a cobri-la por inteiro, até cessar
o sangramento. Nos animais do grupo C, a hemostasia foi obtida por aplicação sobre a
ferida da esponja de colágeno hidrolisado liofilizada, também recobrindo toda a lesão.
24
FIGURA 2 – Fotografias de fígado de camundongo. Incisão circular através da
cápsula hepática (setas) realizada com um punch de 5,0 mm.
Para os três grupos o tempo de sangramento foi mensurado, por meio de
cronômetro, com tempo inicial correspondendo à aplicação do tratamento e tempo final
determinado pela observação visual de interrupção do sangramento, com ausência de
escape de sangue além das bordas do material. A esponja utilizada para hemostasia foi
retirada e a lesão foi observada durante um minuto para se certificar da sua não
reincidência. Caso a hemorragia persistisse, novas esponjas seriam aplicadas até a
obtenção da hemostasia.
Finalizando o procedimento, com exceção dos animais dos subgrupos G0, Q0,
C0, a musculatura abdominal foi suturada por pontos simples isolados com fio de náilon
4-0 agulhado (Shalon®, Shalon Fios Cirúrgicos, São Luis de Montes Belos, GO). O
tecido subcutâneo foi aproximado com o mesmo material de síntese, bem como a pele,
suturada por pontos simples isolados. Os animais dos subgrupos G0, Q0 e C0 foram
submetidos à eutanásia logo após a confirmação da hemostasia hepática, para retirada de
material e preparo histológico.
Ao término da cirurgia, os animais foram colocados isoladamente em caixas
para a recuperação anestésica, com mínima manipulação, em local silencioso, com pouca
luz e temperatura ambiente variando entre 27 e 30ºC. Os camundongos foram mantidos
em observação até que retomassem a consciência, para depois serem recolocados em suas
respectivas caixas.
A analgesia pós-operatória foi promovida pela administração de cloridrato de
tramadol na dose de 1mg/kg a cada 12 horas por via subcutânea na região da nuca, durante
três dias consecutivos. Iodopovidona tópica foi utilizada diariamente para curativo local,
até a total cicatrização da ferida. Todos os procedimentos descritos acima foram
realizados pelo mesmo cirurgião.
25
Eutanásia
Ao final de cada tratamento, os animais foram submetidos à eutanásia por
inalação profunda de isofluorano.
Estudo histológico e análise de imagens
Imediatamente após a eutanásia, os animais foram submetidos à necropsia
com colheita do segmento hepático tratado, localizado em região central do lobo hepático
esquerdo, para análise histológica do parênquima adjacente. O preparo das amostras para
análise histológica em microscopia de luz foi realizado utilizando-se, para fixação,
solução de formol tamponado a 10% em volume 20 vezes maior do que o volume da peça.
Cada frasco foi devidamente identificado. As peças foram mantidas no formol até o
momento do processamento histológico, quando foram desidratadas por uma série
crescente de álcool etílico, clarificadas em xilol e emblocadas em parafina. Os blocos de
parafina foram seccionados com auxílio de micrótomo em cortes de 4µm. Cada corte
histológico foi posicionado sobre uma lâmina de vidro e corado pela técnica de
hematoxilina eosina (HE) e picrosirius para análise morfológica dos tecidos.
Cada parâmetro foi avaliado às cegas, em cinco campos aleatórios por secção,
por meio de microscópio de luz, utilizando aumento de 40 vezes. As imagens foram
capturadas pelo fotomicroscópio DM500 (Leica Microsystems, Aotec Instrumentos
Científicos, São Paulo, SP, Brasil). Foi estabelecido um escore semiquantitativo para os
achados histológicos, de acordo com Schreinemacher8 (Quadro 2).
QUADRO 2 – Graduação da intensidade das características histológicas do parênquima
hepático de camundongos após tratamento hemostático com esponjas de
gaze, quitosana e colágeno hidrolisado (adaptado de Schreinemacher)8
Achados
Histológicos
Escore
Significado
Infiltrado
inflamatório
- mononuclear
- polimorfonuclear
- Ausência de alteração
+ Discreta
(presente em menos de 25% do campo)
++ Moderada
(presente em 26% a 50% do campo)
+++ Acentuada
(presente em 51% a 100% do campo)
Células gigantes
- Ausência de células gigantes
+ Discreta
(presença de 1 a 3 no campo)
++ Moderada
(presença de 3 a 4 no campo)
+++ Acentuada
(presença de 5 ou mais células no campo)
26
Análise estatística
Para a análise estatística dos tempos para se atingir a hemostasia por
compressão mecânica nos diferentes tratamentos foi utilizado delineamento inteiramente
casualizado com três tratamentos e seis repetições. Foi empregado o teste de Anderson
Darling para verificar a normalidade dos resíduos (com base nos resultados do referido
teste, se observada normalidade, optou-se pela análise de variância; se não, utilizou-se o
teste de Kruskal Wallis). Os procedimentos de análise foram feitos no programa Action10,
sistema de estatística desenvolvido sob plataforma R11.
RESULTADOS
Avaliação macroscópica
Não foram observadas complicações trans-operatórias, reincidências
hemorrágicas após os tratamentos realizados, infecções ou deiscência de suturas durante
o período pós-operatório, e tampouco óbitos no transcorrer de todo o estudo. À necropsia
dos camundongos após o tratamento hemostático compressivo, os segmentos hepáticos
submetidos ao contato com as esponjas de gaze, quitosana e colágeno não apresentaram
alterações anatômicas macroscópicas.
Hemostasia
Em todos os camundongos dos três grupos avaliados, a hemostasia hepática
foi obtida durante o primeiro ciclo de tratamentos, não sendo necessária a utilização de
esponjas adicionais, seja de gaze, quitosana ou colágeno. As esponjas de colágeno
demonstraram maior capacidade de absorção de sangue, com perda de consistência e
dissolução parcial, quando comparadas às de quitosana, mais resistentes e menos
flexíveis, em todos os animais do grupo C (Figura 3).
Os tempos médios de hemostasia hepática dos camundongos tratados por
compressão com esponjas de gaze (G), quitosana (Q) e colágeno (C), foram,
respectivamente, 88 segundos, 49 segundos e 49 segundos.
27
FIGURA 3 – Fotografias de fígados de camundongos submetidos aos tratamentos
hemostáticos. (A) Esponja de quitosana-alginato durante
tratamento hemostático em fígado de camundongo (área demarcada
por círculo); (B) Esponja de colágeno hidrolisado durante
tratamento hemostático em fígado de camundongo (área demarcada
por círculo). Nota-se maior embebição de sangue pela esponja de
colágeno.
Para a análise estatística dos dados, o resultado do teste de Anderson Darling
apresentou p-valor de 0,000049, portanto significativo, ou seja, os resíduos não
apresentaram distribuição normal. Assim, foi aplicado o teste de Kruskal Wallis. O p-
valor do referido teste foi de 0,0031 (menor que 5%). Desta forma, existiu diferença
significativa entre os grupos ou tratamentos. No teste de comparação dos grupos
verificou-se que a quitosana (Q) é estatisticamente igual ao colágeno (C), e a quitosana
(Q) e o colágeno (C) são estatisticamente diferentes da gaze (G).
Avaliação microscópica
A avaliação histológica do parênquima hepático dos segmentos adjacentes às
áreas tratadas com esponjas de gaze, quitosana e colágeno, embasada na graduação da
intensidade do infiltrado inflamatório mononuclear e polimorfonuclear, bem como de
células gigantes, não indicou alterações teciduais e presença de células gigantes em
intensidades dignas de nota. Em alguns segmentos hepáticos foram observadas áreas de
degeneração granular de hepatócitos e pequenos focos isolados de necrose. Porém, os
achados histológicos foram condizentes com parênquima hepático em processo de
reparação, conforme a análise comparativa dos períodos estudados (subgrupos G0, Q0 e
C0; subgrupos G7, Q7 e C7; subgrupos G14, Q14 e C14) representada pelas Figuras 4 e 5.
28
FIGURA 4 - Fotomicrografias de fígados de camundongos. Ausência de
alterações histológicas e inflamatórias significativas nas áreas
adjacentes às lesões após hemostasia compressiva com esponja
de gaze, quitosana e colágeno. Grupos: G = gaze, Q = quitosana,
C = colágeno. (A) G0; (B) Q0; (C) C0; (D) G7; (E) Q7; (F) C7; (G)
G14; (H) Q14; (I) C14. Setas: sinusóides. Asteriscos: hepatócitos.
Estrelas: degeneração granular. Cabeças de seta: necrose.
Coloração: HE. Barras: 50μm.
29
FIGURA 5 - Fotomicrografias de fígados de camundongos. Áreas correspondentes às
lesões induzidas por punch após hemostasia compressiva com esponja de
gaze, quitosana e colágeno, no pós-operatório imediato e aos 7 e 14 dias pós-
operatórios, demonstrando processo de reparação tecidual. Grupos: G =
gaze, Q = quitosana, C = colágeno. (A) G0; (B) G7; (C) G14; (D) Q0; (E) Q7;
(F) Q14; (G) C0; (H) C7 e (I) C14. Estrelas: fibras colágenas. Coloração:
Picrosirius. Barras: 50μm.
DISCUSSÃO
Ao longo de muitos anos, o controle de hemorragias baseou-se em
compressão com esponjas absorventes de gaze, não obstante o anseio por agentes mais
efetivos ser consenso absoluto. Inovações tecnológicas em hemostasia tornaram-se uma
necessidade constante na busca por mais presteza e eficácia no controle dos
sangramentos12. Originário de fontes naturais renováveis, o polímero avaliado no presente
estudo tem sido alvo de pesquisas pelo seu mérito como biomaterial em diversas
aplicações biológicas.
A hemostasia ocorreu em 100% das lesões hepáticas, não se observando
recidiva hemorrágica após a utilização de esponja de quitosana-alginato, contrariando
resultados da comparação de esponja de quitosana hidrofobicamente modificada (hm-
30
quitosana) com membrana de quitosana-alginato não modificada e gaze em lesão arterial
de suínos13. No referido estudo, os autores observaram, respectivamente, 75% e 100% de
hemostasia com o emprego de esponjas de quitosana e de hm-quitosana. Teria sido
constatada falha na manutenção da hemostasia pelos curativos de quitosana após o tempo
médio de 44 minutos.
As esponjas de quitosana-alginato e as esponjas de colágeno hidrolisado
apresentaram efeitos hemostáticos similares, porém diferentes capacidades de absorção,
após a hidratação das esponjas de quitosana-alginato em solução fisiológica. Apesar da
presença do alginato em sua constituição, utilizado para intensificar a absorção de fluidos,
as esponjas de quitosana-alginato demonstraram menos hidrofilicidade, flexibilidade e
adesividade ao fígado quando comparadas às esponjas de colágeno14. A quitosana
apresenta degradação lenta em meio aquoso, mesmo em presença de lisozimas, enquanto
o colágeno demonstra grande hidrofilicidade, baixa resistência a forças mecânicas de
compressão e degradação rápida15,16.
No presente estudo, o tempo para hemostasia no grupo quitosana apresentou-
se em torno de 94% menor quando comparado ao grupo esponjas de gaze. Estudando hm-
quitosana, reduções significativas no tempo de sangramento também foram observadas
por outros autores6,17. Em um estudo utilizando modelo de trauma hepático e hemorragia
venosa severa em suínos, foi relatada redução de aproximadamente 50% do tempo para
hemostasia no grupo hm-quitosana quando comparado ao grupo esponjas de gaze6. Em
outro estudo, constatou-se redução de 90% no tempo para aquisição do estado
hemostático em transecção de veia femoral de ratos, em relação aos controles salina e
quitosana nativa17.
Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que, apesar da hemostasia
ter sido efetiva em todas as lesões dos camundongos, independente do tratamento ao qual
tenham sido submetidos, foi mais rápida com a utilização de esponja de quitosana-
alginato e do hemostático comercial colágeno hidrolisado, comprovando a eficácia dos
polímeros quitosana-alginato como agentes hemostáticos17.
As esponjas de quitosana-alginato e de colágeno hidrolisado avaliadas
controlaram o sangramento hepático em camundongos em tempos similares, permitindo
inferir que, apesar dos diferentes mecanismos utilizados pela quitosana e pelo colágeno
para indução à hemostasia, o tempo necessário para a coalescência de eritrócitos
provocada pela esponja de quitosana-alginato foi equivalente ao de ativação plaquetária
da cascata da coagulação pelo colágeno, em indivíduos saudáveis4. Porém, frente a
31
diáteses hemorrágicas, a quitosana apresenta como diferencial sua propriedade
policatiônica e sua ligação inespecífica às membranas celulares das hemácias, produzindo
um complexo adesivo independente de ativação plaquetária e de fatores de coagulação
sanguínea19,20.
A esponja de quitosana utilizada como agente hemostático local no presente
estudo atingiu o objetivo em 49 segundos, em média. Tal desempenho traduz o que se
deseja de um agente hemostático frente a uma hemorragia hepática, considerando seu
reconhecido mecanismo de ação independente da cascata de coagulação. O controle
imediato e efetivo da hemorragia hepática está diretamente correlacionado à taxa de
sobrevida do paciente. A aplicação das técnicas convencionais de hemostasia, como
compressão local, ligaduras ou eletro-cauterização, torna-se naturalmente limitada pelo
difícil acesso cirúrgico e pela característica friável do fígado, sendo complicada por
distúrbios da coagulação quando existe doença hepática grave concomitante20.
O tempo de contato da esponja de quitosana-alginato com a lesão incisa no
fígado de camundongos foi suficiente para promover hemostasia durante os 14 dias de
estudo. O agente não estimulou reações adversas locais ou sistêmicas, demonstrando
estabilidade biológica essencial para sua utilização como hemostático tópico21.
A presença de áreas de degeneração granular e pequenos focos isolados de
necrose em alguns segmentos hepáticos foi atribuída à lesão incisa de cápsula e
parênquima produzida para o experimento. Dada a pequena espessura do lobo hepático
do camundongo, a incisão circular transfixou o órgão em alguns segmentos,
determinando considerável ruptura vascular e, consequentemente, privação do aporte de
oxigênio ao tecido circunjacente, causando injúria tecidual. Os achados histológicos
foram, assim, condizentes com processo de reparação em parênquima hepático22.
Foi necessário pouco tempo de contato das esponjas com as lesões
hemorrágicas para a aquisição da hemostasia. Esta variável pode ter contribuído para
menor taxa de despolimerização da quitosana no local, resultando na ausência de reação
inflamatória registrada pelo estudo. Durante a quantificação do infiltrado inflamatório em
lesões cutâneas de ratos tratadas com biomembranas de quitosana-alginato observou-se
estímulo ao recrutamento de neutrófilos e macrófagos no 2º dia de contato23.
Atualmente, novos compostos estão sendo desenvolvidos e avaliados em
busca de um agente hemostático ideal inserido em uma relação custo-benefício
satisfatória. Tanto a quitosana quanto o colágeno são polímeros naturais aptos à função
de hemostáticos tópicos e capazes de induzir hemostasia hepática em tempo similar,
32
porém, em comparação com a quitosana, o colágeno apresenta um elevado custo de
purificação, o que restringe sua utilização4,15.
CONCLUSÕES
O tempo para efeito hemostático da esponja de quitosana-alginato é similar
ao da esponja de colágeno hidrolisado liofilizada. Os curativos hemostáticos sob a forma
de esponjas de quitosana, assim como os de colágeno, não provocam reação inflamatória
no fígado.
REFERÊNCIAS
1. Mankad PS, Codispoti M. The role of fibrin sealants in hemostasis. Am J Surg.
2001;182(2 Suppl):218-85.
2. Benesch J, Tengvall P. Blood protein adsorption onto chitosan. Biomaterials.
2002;23(12):2561-8.
3. Wang XH, Li DP, Wang WJ, Feng QL, Cui FZ, Xu YX, Song XH, Van der Werf M.
Crosslinked collagen/chitosan matrix for artificial livers. Biomaterials.
2003;24(19):3213-20.
4. Wang X, Yan Y, Zhang R. Comparision of chitosan and collagen sponges as
hemostatic dressings. J bioact compat polym. 2006;21(1):39-54.
5. Agrawal CM. Reconstructing the human body using biomaterials. J Mater.1998;31-
5.
6. Bochicchio GV, Kilbourne MJ, Keledjian K, Hess J, Scalea T. Evaluation of a new
hemostatic agent in a porcine grade V liver injury model. Am Surg. 2010;76(3):317-
20.
7. Horio T, Ishihara M, Fujita M, Kishimoto S, Kanatani Y, Ishizuka T, Nogami Y,
Nakamura S, Tanaka Y, Morimoto Y, Maehara T. Effect of photocrosslinkable
chitosan hydrogel and its sponges to stop bleeding in a rat liver injury model. Artif
Organs. 2010;34(4):342-7.
8. Kang PL, Shwu JEN, Chang SJ, Manousakas I, Lee CW, Yao CH, Lin FH, Kuo SM.
Development and assessment of hemostasis chitosan dressings.
Carbpol.2011;85(3):565-70.
9. Schreinemacher MHF, Emans PJ, Gijbels MJJ, Greve JWM, Beets GI, Bouvy ND.
Degradation of mech coatings and intraperitoneal adhesion formation in an
experimental model. Br J Surg. 2009;96(3):305-13.
10. Estatcamp. Action 2.3 [on line], Estatcamp, 2013. Software de estatística. Disponível
em http://www.portalaction.com.br. Acesso em 04 set. 2013.
33
11. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical
computing, [on line], R Foundation for Statistical Computing, Vienna, 2013. Free
software environment for statistical computing and graphics. Disponível em:
http://www.r-project.org/. Acesso em 04 set. 2013.
12. Garner JP, Brown RFR. Recent advances in topical agents for prehospital
haemostasis. Trauma.2002;4(4):203-9.
13. De Castro GP, Dowling MB, Kilbourne M, Keledjian K, Driscoll IR, Raghavan SR,
Hess JR, Scalea TM, Bochicchio GV. Determination of efficacy of novel modified
chitosan sponge dressing in a lethal arterial injury model in swine. J Trauma.
2012;72(4):899-907.
14. Rodrigues AP. Preparação e caracterização de membranas de quitosana e alginato
para aplicação na terapia de lesões. [Tese]. Campinas: Universidade Estadual de
Campinas, Faculdade de Engenharia Química; 2008.
15. Santos Jr AR, Wada MLF. Polímeros biorreabsorvíveis como substrato para cultura
de células e engenharia tecidual. Polímeros. 2007;17(4):308-17.
16. Crusca JS, Oliveira ACB, Perussi JR, Plepis AMG. Avaliação citotóxica de esponja
de colágeno e quitosana. XXIV Congr Bras Eng Biom. 2014;1693-6.
17. Dowling MB, Kumar R, Keibler MA, Hess JR, Bochicchio GV, Raghavan SR. A
self-assembling hydrophobically modified chitosan capable of reversible hemostatic
action. Biomaterials. 2011;32:3351-7.
18. Rao SB, Sharma CP. Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and
hemostatic potential. J Biomed Mater Res. 1997 Jan;34(1):21-8.
19. Gegel BT, Burgert JM, Lockhart C, Austin R 3rd, Davila A, Deeds J, Hodges L,
Hover A, Roy J, Simpson G, Weaver S, Wolfe W, Johnson D. Effects of Celox and
TraumaDEX on hemorrhage control in a porcine model. AANA J. 2010;78(2):115-
20.
20. Xie X, Tian JK, Lv FQ, Wu R, Tang WB, Luo YK, Huang YQ, Tang J. A novel
hemostatic sealant composed of gelatin, transglutaminase and thrombin effectively
controls liver trauma-induced bleeding in dogs. Acta Pharmacol Sin.
2013;34(7):983-8.
21. Jang Y, Kim H, Roh BD, Kim E. Biologic response of local hemostatic agents used
in endodontic microsurgery. Restor Dent Endod. 2014;39(2):79-88.
22. Salomão LS, Young SB, Galhardo MA, Pereira LA, Pires ARC, Boaventura GT,
Ferreira AMR, Martinho JM. Avaliação da regeneração hepática com modulação
pelo pré-condicionamento isquêmico após isquemia e reperfusão e hepatectomia
parcial. Rev Col Bras Cir. 2012;39(3):211-5.
CAPÍTULO 3 – ESPONJAS DE QUITOSANA SÃO BIOCOMPATÍVEIS E
ESTIMULAM SÍNTESE DE COLÁGENO EM FÍGADO DE CAMUNDONGO
RESUMO
A terapia celular e a liberação controlada de fármacos são alternativas de tratamento para
pacientes com hepatopatias severas e para diminuir a necessidade de transplantes de
órgãos. A quitosana vem sendo utilizada na engenharia de tecidos, em sistemas de
liberação de células e fármacos devido a sua biocompatibilidade, baixa toxicidade e
efeitos imunoestimulantes, antibacterianos e antifúngicos. Visando aperfeiçoar sua
solubilidade, implantes de compósitos de quitosana tem sido alvo de pesquisas. O
presente estudo teve como propósito avaliar o efeito do implante de esponja de quitosana-
alginato, comparando-o ao de esponja de colágeno hidrolisado liofilizada, em defeito
hepático em camundongos saudáveis. Fragmentos de esponjas de quitosana e de colágeno
foram preparados a fim de assumirem dimensões idênticas as do defeito hepático a ser
produzido. A lesão consistiu de incisão circular de 5,0mm através da cápsula, realizada
com um punch. Após a remoção do segmento hepático, utilizado como controle, foi feito
o implante de um fragmento de esponja de quitosana nos animais do grupo Q e de
colágeno nos animais do grupo C. À macroscopia observaram-se aderências omentais
sobre os implantes nos momentos avaliados e integração mais precoce da esponja de
colágeno ao tecido receptor. A avaliação microscópica evidenciou reação inflamatória
aos dois materiais implantados e estímulo à síntese de colágeno, confirmada pela análise
submicroscópica. A percentagem média de colágeno dos segmentos hepáticos receptores
dos implantes de esponja de quitosana-alginato e de esponja de colágeno hidrolisado
apresentou elevação significativa entre 7 e 14 dias pós-operatórios, permitindo inferir
efeito estimulante exercido pelas esponjas de quitosana sobre a reparação tissular.
Palavras-chave: biomateriais, tecido, hepático, implantes, polímeros, roedores.
CHAPTER 3 - CHITOSAN SPONGES ARE BIOCOMPATIBLE AND
STIMULATE COLLAGEN SYNTHESIS IN MOUSE LIVER
ABSTRACT
Cell therapy and drug delivery systems are treatment options for patients with severe liver
diseases and to reduce the need for organ transplants. Chitosan has been used in tissue
engineering, in cells and drug delivery systems because of their biocompatibility, low
toxicity effects and immunostimulating, antibacterial and antifungal agents. In order to improve their solubility, chitosan composite implants has been the subject of research.
This study aimed to evaluate the effect of chitosan-alginate sponge implant, comparing it
to the lyophilized hydrolyzed collagen sponge in liver defect in healthy mice. Fragments
of chitosan and collagen sponges were prepared in order to assume the same dimensions
of hepatic defect to be produced. The lesion consisted of a circular incision of 5.0 mm
through the capsule, carried out with a punch. After removal of hepatic segment, used as
control, it was made implantation of a chitosan sponge fragment in the animals of group
35
Q and collagen in the animals of group C. Macroscopically omental adhesions were
observed on the implants in the evaluated time and early integration of collagen sponge
to the tissue receptor. Microscopic evaluation showed inflammatory reaction to the two
implanted materials and stimulating collagen synthesis confirmed by submicroscopic
analysis. The collagen average percentage of liver segments receptors of chitosan-
alginate sponge and lyophilized hydrolyzed collagen sponge implants increased
significantly between 7 and 14 postoperative days, allowing infer stimulating effect
exerted by chitosan sponges on tissue repair.
Keywords: biomaterials, tissue, liver, implants, polymers, rodents.
INTRODUÇÃO
Segundo a Associação Brasileira de Transplante de Órgãos (ABTO), o
número de transplantes hepáticos realizados no país em 2014 não alcançou 50% da
necessidade estimada. Entre 2003 e 2013, 15.139 transplantes hepáticos foram realizados,
porém aproximadamente 6.500 pacientes aguardam atualmente por um transplante de
fígado1,2. O índice de sobrevida após esse procedimento cirúrgico é de aproximadamente
85% em um ano e de 70% em cinco anos, nos Estados Unidos. Na atualidade, não existem
dados oficiais nacionais sobre a taxa de sobrevida dos pacientes transplantados,
estimando-se percentagens um pouco inferiores3.
A insuficiência hepática grave apresenta elevada taxa de mortalidade e
aumenta os custos médicos a cada ano, mundialmente. O transplante de fígado tem sido
a opção terapêutica mais indicada para pacientes acometidos por hepatopatias severas,
porém a taxa de óbito na fila de espera ainda é grande. Tais óbitos ocorrem devido à falta
de um método adequado para manter vivo o paciente com insuficiência hepática e ao
baixo número de doadores de órgãos4.
Frente à necessidade de aumentar a disponibilidade de órgãos para
transplante, iniciou-se a busca por alternativas ao transplante clássico proveniente de
enxerto total de doador falecido. Foram adotados critérios denominados expandidos para
a realização dos procedimentos, divisões anatômicas de fígado de doadores e transplantes
hepáticos intervivos, os quais vêm reduzindo gradualmente, principalmente devido ao
risco de complicações graves do doador3,5.
Como uma nova abordagem para o tratamento das doenças e alternativa ao
transplante hepático surgiram, então, a medicina regenerativa e a tecnologia de liberação
controlada de fármacos6. Terapias de transplantes de células e sistemas de liberação
terapêuticos tornaram-se opções para o tratamento de processos patológicos hepáticos
36
agudos, crônicos, hereditários ou neoplásicos, ao estimular a regeneração hepática ou
atuar como um tratamento paliativo até a realização do transplante de fígado7,8.
Dois componentes são complementares e essenciais à medicina regenerativa:
arcabouços (também designados como andaimes ou plataformas) biologicamente
compatíveis com os sistemas orgânicos e células adequadas, capazes de substituir
efetivamente os tecidos danificados sem efeitos adversos. Assim, a escolha do andaime,
a fonte de células e as barreiras imunológicas são decisivas para a regeneração hepática4.
Para aumentar a sobrevivência e a estabilidade funcional das células
transplantadas, os dispositivos implantáveis desenvolvidos com biomateriais e utilizados
como arcabouços devem proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e a
diferenciação celular9,10.
Nos últimos anos, buscando desenvolver substitutos hepáticos capazes de
restaurar, manter e melhorar as funções do fígado, diferentes arcabouços têm sido
estudados para engenharia de tecidos e sistemas de liberação controlada de fármacos4,11.
Arcabouços de quitosana utilizados como sistemas de liberação de células para a função
de recuperação estrutural e funcional do fígado vêm apresentando resultados promissores,
como melhora da taxa de sobrevivência e da funcionalidade das células transplantadas9.
Vários estudos6,11,12 demonstraram que biomateriais à base de quitosana,
isolada ou em compósitos, apresentam ação estimulante sobre a expressão de colágeno e
a regeneração tecidual. Tais efeitos são similares em diferentes espécies animais
(camundongos, ratos, coelhos, cães) e tecidos (subcutâneo, músculo, peritônio,
cartilagem, osso, fígado), indicando biocompatibilidade, porém com resposta
inflamatória variável ou ausente frente aos vários modelos experimentais.
Embora alguns estudos4 tenham demonstrado a aplicabilidade de andaimes
na recuperação estrutural e funcional hepática, o atual desafio à medicina regenerativa e
engenharia de tecidos consiste em explorar a versatilidade química da quitosana para o
desenvolvimento do compósito biologicamente compatível ideal para implantes
hepáticos, aplicável a transplantes celulares e à liberação de fármacos. Assim, objetivou-
se com este estudo avaliar o efeito do implante de esponjas de quitosana-alginato em
defeito hepático de camundongos saudáveis, quantificando a percentagem de colágeno
dos segmentos hepáticos receptores aos 7 e 14 dias pós-operatórios, a fim de verificar o
estímulo à síntese de colágeno, comparando-o ao de esponjas de colágeno hidrolisado
liofilizadas.
37
METODOLOGIA
Local da pesquisa
Após aprovação pela Comissão de Ética na Utilização de Animais da
Universidade Federal de Uberlândia (UFU) (nº 138/11 e 219/11) (ANEXO A), o presente
estudo foi desenvolvido no Laboratório de Cirurgia e Anestesiologia Experimental da
Faculdade de Medicina Veterinária e Laboratório de Histologia da UFU, com a
colaboração da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás
(UFG), da Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP) e do serpentário Pentapharm©, de Uberlândia, Minas Gerais.
Animais de experimentação
Foram utilizados 48 camundongos (linhagem Swiss) machos de dez semanas
de idade e peso médio de 35g, considerados hígidos após exames clínicos (observação do
estado de alerta, padrão respiratório, presença de secreções nasais ou oculares e diarreia),
sendo 24 para avaliação por microscopia de luz e o restante (24) para avaliação por
microscopia eletrônica de transmissão.
Manejo dos animais
Todos os procedimentos de manejo dos animais foram conduzidos conforme
orientação e normas estabelecidas pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de
Laboratório (SBCAL). Os camundongos foram alojados em caixas / gaiolas de
polipropileno medindo 34x41x16cm (largura, comprimento, altura), com tampa em
arame galvanizado e bebedouro em polipropileno, com capacidade para 250ml, no
biotério do HV/UFU, que possui ambiente climatizado com temperatura média de 24°C
± 2°C e período de claro / escuro de 12 horas.
Foram colocados seis camundongos por gaiola, perfazendo um total de quatro
gaiolas, todas com cama de maravalha. A alimentação foi constituída de ração específica
para a espécie (Presence® Ratos e Camundongos, Evialis, Paulínia, SP) fornecida ad
libitum. Água limpa permaneceu disponível durante todo o período experimental. A
higienização das gaiolas, bebedouros e ambiente foi realizada diariamente.
Antecedendo à fase experimental, foi considerado um período de 15 dias para
adaptação ambiental dos animais. Para minimizar o estresse e desconforto dos
camundongos, o manejo do biotério e manipulação dos animais foi realizado por equipe
38
previamente treinada e em horário pré-determinado. Foi utilizado o mesmo manejo tanto
para a primeira quanto para a segunda etapa do experimento.
Tratamentos
Para a análise por microscopia de luz, os 24 camundongos foram distribuídos
igualmente e aleatoriamente em dois grupos de tratamento, com 12 animais cada:
Tratamento Q, com o uso de esponjas de quitosana-alginato (Figura 1 - A) e Tratamento
C, com o uso de esponjas de colágeno hidrolisado liofilizadas (Figura 1 - B).
Cada grupo foi dividido em dois subgrupos de seis animais (Q7 e Q14; C7 e
C14). A distribuição dos animais ocorreu de acordo com o tempo experimental pré-
determinado para análise histológica hepática pós-cirúrgica, realizada no sétimo dia pós-
operatório (Q7 e C7) e 14 dias após a cirurgia (Q14 e C14) (Quadro 1).
FIGURA 1 – Esponjas utilizadas nos tratamentos hemostáticos.
(A) Esponja de quitosana-alginato; (B) Esponja de
colágeno hidrolisado liofilizada.
QUADRO 1 – Distribuição dos grupos de camundongos conforme o implante e o período para
análise histológica em microscopia de luz
GRUPOS ANÁLISE HISTOLÓGICA
Dia 7 Dia 14
TOTAL DE
ANIMAIS
Quitosana (Q) (Q7)
6 animais
(Q14)
6 animais
12
Colágeno (C) (C7)
6 animais
(C14)
6 animais
12
TOTAL 12 12 24
39
Para a etapa destinada à microscopia eletrônica cada grupo foi dividido da
mesma forma, porém em diferente período experimental. A distribuição dos animais foi
realizada em dois subgrupos de seis animais, em conformidade com o tempo experimental
pré-determinado para análise microscópica ultraestrutural hepática pós-cirúrgica,
realizada no sétimo dia pós-operatório (Q7 e C7) e 21 dias após a cirurgia (Q21 e C21)
(Quadro 2).
QUADRO 2 – Distribuição dos grupos de camundongos conforme o implante e o período para
análise microscópica ultraestrutural
GRUPOS ANÁLISE HISTOLÓGICA
Dia 7 Dia 21
TOTAL DE
ANIMAIS
Quitosana (Q) (Q7)
6 animais
(Q21)
6 animais
12
Colágeno (C) (C7)
6 animais
(C21)
6 animais
12
TOTAL 12 12 24
Materiais utilizados
Os defeitos hepáticos foram provocados por um punch dermatológico circular
metálico de 5,0mm de diâmetro previamente autoclavado. As esponjas de quitosana-
alginato foram fornecidas pelo Departamento de Processos Biotecnológicos da Faculdade
de Engenharia Química da UNICAMP, São Paulo e esterilizadas em óxido de etileno.
Para os animais do tratamento C foi utilizado colágeno comercial (Hemospon®,
Technew©, Rio de Janeiro, RJ).
Procedimentos pré-cirúrgicos, cirúrgicos e pós-cirúrgicos
Os animais foram submetidos a jejum pré-operatório alimentar e hídrico de
uma hora. Posteriormente, foram contidos manualmente e pré-anestesiados com 1mg/Kg
de cloridrato de tramadol (Cloridrato de tramadol®, União Química Farmacêutica, São
Paulo, SP) e 0,5mg/Kg de acepromazina (Acepran®, Vetnil Indústria e Comércio de
Produtos Veterinários Ltda, Louveira, SP) por via intramuscular (IM), na região posterior
dos membros pélvicos.
A indução e manutenção anestésica foram realizadas por inalação de mistura
gasosa de oxigênio e isofluorano (Isofluorano®, Instituto BioChimico e Indústria
Farmacêutica Ltda, Itatiaia, RJ) por meio de máscara e a profundidade anestésica foi
40
avaliada pela presença ou ausência de reflexos (cauda e pálpebra) e alterações das
frequências cardíaca (FC) e respiratória (FR).
Toda a região ventral dos animais foi tricotomizada e preparada
assepticamente com álcool etílico 70%, iodopovidona tópico e álcool etílico 70%. Em
seguida, os panos de campo foram adequadamente posicionados.
O acesso à cavidade abdominal foi realizado por meio de uma incisão
longitudinal mediana pré-retro-umbilical, seguida da localização e exposição do lobo
hepático esquerdo. O defeito hepático foi produzido por uma incisão circular através da
cápsula, por meio de um punch dermatológico de 5,0mm, centralizado na região exposta
do lobo esquerdo (Figura 2 - A). Após a remoção do segmento hepático, utilizado como
controle de cada camundongo (Figura 2 – B), foi feito o implante de um fragmento de
esponja de quitosana-alginato na lesão do grupo Q (Figura 2 - C) ou de colágeno
hidrolisado liofilizada, na lesão do grupo C (Figura 2 – D).
Os referidos fragmentos foram previamente recortados a fim de assumirem
dimensões idênticas as do defeito hepático produzido. O fragmento de esponja de
quitosana-alginato foi hidratado durante cinco minutos em solução fisiológica de NaCl
0,9% (Solução isotônica de Cloreto de sódio 0,9%, Glicolabor Indústria Farmacêutica
Ltda, Ribeirão Preto, SP) estéril, para então ser implantado.
Finalizando o procedimento, a musculatura abdominal foi suturada por pontos
simples isolados com fio de náilon 4-0 agulhado (Shalon®, Shalon Fios Cirúrgicos, São
Luis de Montes Belos, GO). O tecido subcutâneo foi aproximado com o mesmo material
de síntese, bem como a pele, suturada por pontos simples isolados.
Ao término da cirurgia, os animais foram colocados isoladamente em caixas
para a recuperação anestésica, com mínima manipulação, em local silencioso, com pouca
luz e temperatura ambiente variando entre 27 e 30ºC. Os camundongos foram mantidos
aquecidos e em observação até que retomassem a consciência, para depois serem
recolocados em suas respectivas gaiolas.
A analgesia pós-operatória foi promovida pela administração de cloridrato de
tramadol na dose de 1mg/Kg a cada 12 horas por via subcutânea na região da nuca,
durante três dias consecutivos. Os curativos locais foram realizados com iodopovidona
tópico diariamente, até a total cicatrização da ferida.
41
FIGURA 2 – Fotografias de fígados de camundongos. A - Incisão circular através da
cápsula hepática realizada com um punch de 5,0 mm (seta). B - Remoção
do segmento hepático (seta) e detalhe do aspecto e dimensão do
segmento após remoção (cabeça de seta). C - Implante de esponja de
quitosana-alginato em defeito hepático (seta). D - Implante de esponja de
colágeno hidrolisado liofilizada em defeito hepático (seta).
Eutanásia
Ao final do tempo experimental, os animais foram submetidos à eutanásia por
meio de inalação profunda de isofluorano em equipamento de anestesia inalatória.
Estudo histológico e análise de imagens
Os segmentos hepáticos obtidos durante a produção da lesão na região central
do lobo hepático esquerdo, utilizados como controle de cada camundongo, foram
imediatamente fixados em formol tamponado e preparados para microscopia de luz. Logo
após a eutanásia, os animais foram submetidos à necropsia com colheita do sítio hepático
A B
C D
42
de implantação das esponjas, localizado em região central do lobo hepático esquerdo,
para análise histológica do parênquima adjacente.
O preparo das amostras para análise histológica em microscopia de luz foi
iniciado pela fixação em solução de formol tamponado a 10% em volume 20 vezes maior
do que o volume da peça. Cada frasco foi devidamente identificado. As peças foram
mantidas no formol até o momento do processamento histológico, quando foram
desidratadas por uma série crescente de álcool etílico, clarificadas em xilol e emblocadas
em parafina. Os blocos de parafina foram seccionados com auxílio de micrótomo em
cortes de 4µm. Cada corte histológico foi posicionado sobre uma lâmina de vidro e corado
pela técnica de hematoxilina eosina (HE), reticulina e picrosirius para análise morfológica
dos tecidos.
Cada parâmetro foi avaliado às cegas, em cinco campos aleatórios por secção,
através de microscópio de luz, utilizando aumento de 40 vezes. As imagens foram
capturadas pelo fotomicroscópio DM500 (Leica Microsystems, Aotec Instrumentos
Científicos, São Paulo, SP, Brasil). Foi estabelecido um escore semiquantitativo para os
achados histopatológicos, de acordo com schreinemacher13 (Quadro 3).
A quantificação da percentagem de colágeno dos segmentos hepáticos
submetidos aos implantes foi efetuada por meio da análise de imagens de
fotomicrografias das lâminas coradas pelo picrosirius, utilizando software para
morfometria HL Image++97 (Leica Aplication Suite, LAS EZ versão 1.8.1 Build:277
copyright© 2003-2010, Leica Microsystems Switzerland Limited). Ao submeter a
imagem ao programa, as áreas não marcadas, correspondentes à ausência de colágeno,
são desconsideradas, enquanto as imagens coradas são convertidas em uma escala de
preto e branco, permitindo a quantificação de fibras colágenas em pixels e seu cálculo em
percentagem.
Para microscopia eletrônica de transmissão, o material foi fixado em
glutaraldeído a 3% em tampão fosfato pH 7,4 por uma a três horas. Posteriormente, foram
feitas três lavagens em tampão fosfato pH 7,4 por 12 horas e duas por 5 minutos cada.
Em seguida, foi realizada a pós-fixação em tetróxido de ósmio 1% por 30 minutos e mais
30 minutos em tetróxido de ósmio 1% com ferrocianeto de potássio 1,25%. Após esta
etapa, os fragmentos foram desidratados em soluções com concentração crescente de
acetona e incluídos em resina Epon 812. Os blocos de resina obtidos foram cortados em
ultra-micrótomo, obtendo-se cortes ultra-finos (60 a 90 nm), os quais foram contrastados
em acetato de uranila e citrato de chumbo. As avaliações dos cortes foram realizadas no
43
microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM 109 do Laboratório de Histologia do
Instituto de Ciências Biomédicas (ICBIM), UFU, sendo realizada documentação por
imagens digitais obtidas pelo equipamento Megaview14.
QUADRO 3 – Graduação da intensidade das características histológicas do parênquima
hepático de camundongos após implante de biomaterial, adaptada de
Schreinemacher13
Achados
Histológicos
Escore
Significado
Infiltrado
inflamatório
- mononuclear
- polimorfonuclear
0 Ausência de alteração
1 Discreta
(presente em menos de 25% do campo)
2 Moderada
(presente em 26% a 50% do campo)
3 Acentuada
(presente em 51% a 100% do campo)
Células gigantes
0 Ausência de células gigantes
1 Discreta
(presença de 1 a 3 no campo)
2 Moderada
(presença de 3 a 4 no campo)
3 Acentuada
(presença de 5 ou mais células no campo)
Tecido de granulação
0 Ausência de alteração
1 Discreta
(presente em menos de 25% do campo)
2 Moderada
(presente em 26% a 50% do campo)
3 Acentuada
(presente em 51% a 100% do campo)
Análise estatística
A normalidade de distribuição dos resíduos e homogeneidade das variâncias
foram avaliadas pelos testes de Shapiro-Wilk e Levene, respectivamente, sendo adotado
valor de significância igual a 5%.
A intensidade das características histológicas (infiltrado inflamatório
mononuclear, polimorfonuclear, células gigantes e tecido de granulação) nos diferentes
momentos dentro do mesmo tratamento (quitosana ou colágeno) foi comparada pelo teste
de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn. Para a comparação das referidas características
entre tratamentos dentro do mesmo tempo foi realizado o teste U de Mann-Whitney.
Valor de p<0,05 foi utilizado para significância estatística.
As medianas das percentagens de colágeno nos diferentes tempos de
avaliação dentro do mesmo tratamento (quitosana ou colágeno) foram comparadas pelo
44
teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn. A comparação entre os tratamentos no
mesmo intervalo de tempo foi realizada pelo teste U de Mann-Whitney. Um valor de
p<0,05 foi utilizado para significância estatística.
Os procedimentos de análise foram feitos nos programas SPSS15 e GraphPad
Prism16.
RESULTADOS
Avaliação macroscópica
Não foram observadas complicações como infecções, deiscência de suturas
ou óbitos durante ou após os procedimentos cirúrgicos. Aderências omentais aos
implantes ou locais de implantação de esponja de quitosana e colágeno hidrolisado e ao
tecido hepático adjacente estavam presentes em todos os camundongos, aos 7, 14 e 21
dias pós-operatórios.
Ao comparar-se a integração do implante ao parênquima hepático notou-se
integração mais precoce da esponja de colágeno ao tecido receptor, tanto no 7º como no
14º e 21º dia do experimento, em todos os animais do referido grupo.
Avaliação microscópica
A avaliação histológica das regiões de implantação das esponjas foi realizada
conforme a análise comparativa dos subgrupos estudados e respectivos controles, cuja
percentagem média de colágeno hepático foi de 0,66%.
Na coloração HE, a avaliação histológica hepática das áreas dos implantes de
quitosana e colágeno revelou, aos 7 dias pós-operatórios, padrão trabecular normal com
degeneração gordurosa discreta na região de veia terminal hepática e área de necrose
adjacente à incisão realizada pelo punch. Nas áreas dos implantes de quitosana foi
observada reação inflamatória principalmente ao tecido necrótico, com exsudato de
polimorfonucleares, mononucleares (linfócitos e plasmócitos), células gigantes tipo
corpo estranho e proliferação vascular em tecido de granulação, além de fragmentos da
esponja de quitosana (Figura 3).
Já nas áreas de implantes de colágeno, a reação inflamatória caracterizou-se
por exsudato predominantemente polimorfonuclear em torno da esponja e delimitando a
área de necrose. Foram observadas células gigantes tipo corpo estranho, proliferação
vascular em tecido de granulação e fragmentos da esponja de colágeno (Figura 3).
45
À coloração HE, 14 dias após o implante de quitosana não foram observadas
células gigantes. Os demais achados histológicos de 7 dias mantiveram-se presentes. No
grupo C verificou-se redução na intensidade da reação inflamatória e na concentração de
neutrófilos, permanência de células gigantes e presença de plasmócitos no exsudato. Os
outros achados histológicos de 7 dias continuaram presentes (Figura 3).
A coloração picrosirius evidenciou, 7 dias após a implantação, deposição de
fibras colágenas em torno da esponja de quitosana. A percentagem média de colágeno das
áreas correspondentes aos implantes foi de 25,57%. De maneira similar notou-se
deposição de fibras colágenas em torno da esponja de colágeno, assumindo aspecto de
cápsula. A percentagem média de colágeno nas áreas correspondentes aos implantes foi
de 23,36%. Observou-se, aos 14 dias pós-operatórios, aumento na deposição de fibras
colágenas envolvendo a esponja de quitosana, como uma cápsula. A percentagem média
de colágeno nestes segmentos foi de 40,55%. À semelhança do grupo Q, notou-se maior
deposição de fibras colágenas circundando a esponja de colágeno. A percentagem média
de colágeno nestes segmentos foi de 30,25% (Figura 4 e Tabela 2).
Na coloração reticulina notou-se, 7 dias após o implante, presença de fibras
reticulares entre o parênquima hepático e a esponja de quitosana. No grupo C fibras
reticulares circundando a esponja também foram evidenciadas. Aos 14 dias pós-
operatórios observou-se aumento na deposição de fibras reticulares encapsulando o
implante de quitosana e, da mesma forma, o de colágeno (Figura 5).
Os testes de Kruskal-Wallis para comparação da intensidade da reação
inflamatória entre os tempos pós-operatórios do grupo Q indicaram ápice da reação
inflamatória aos 7 dias após o implante, com aumento dos infiltrados mononucleares
(p=0,0022) e polimorfonucleares (p=0,0026) e de células gigantes, as quais não se
fizeram presentes aos 14 dias pós-operatórios (p=0,0078). Quanto ao tecido de granulação
notou-se aumento aos 7 dias, com manutenção até os 14 dias pós-operatórios (p=0,0002)
conforme a Figura 6.
Os testes de Kruskal-Wallis para comparação da intensidade da reação
inflamatória entre os tempos pós-operatórios do grupo C indicaram aumento dos
infiltrados mononucleares (p=0,0002), polimorfonucleares (p=0,0010), de células
gigantes (p=0,0049) e de tecido de granulação (p=0,0002) aos 7 dias, com manutenção
até os 14 dias pós-operatórios (Figura 8).
Os testes de Kruskal-Wallis para comparação da percentagem média de
colágeno entre os tempos pós-operatórios do grupo Q indicaram maior quantidade de
46
fibras colágenas no 14º dia após o implante (p=0,001) (Figura 7), bem como a
comparação da percentagem média de colágeno entre os tempos pós-operatórios do grupo
C (p=0,001) (Figura 9).
FIGURA 3 – Fotomicrografias de fígados de camundongos. Áreas de implantação de esponja de
quitosana (A) e de colágeno (B) em lesão induzida por punch 7 dias após o
procedimento cirúrgico e áreas de implantação de esponja de quitosana (C) e de
colágeno (D) em lesão induzida por punch 14 dias após o procedimento cirúrgico.
Parênquima hepático normal (asterisco verde); área de necrose (asterisco azul);
fragmentos da esponja de quitosana (estrela amarela); fragmentos da esponja de
colágeno (estrela laranja); reação inflamatória (estrela branca). Coloração: HE.
Barras: 200μm.
47
FIGURA 4 – Fotomicrografias de fígados de camundongos. Áreas de implantação de esponja
de quitosana (A) e de colágeno (B) em lesão induzida por punch 7 dias após o
procedimento cirúrgico e áreas de implantação de esponja de quitosana (C) e de
colágeno (D) em lesão induzida por punch 14 dias após o procedimento
cirúrgico. Parênquima hepático (asterisco verde); fragmentos da esponja de
quitosana (estrela amarela); fragmentos da esponja de colágeno (estrela laranja);
fibras colágenas entre parênquima e esponja (estrela azul). Nota-se a presença
de fibras colágenas mais maduras no 14ºdia, em ambos os grupos (Q e C).
Coloração: Picrosirius. Barras: 200μm.
48
FIGURA 5 – Fotomicrografias de fígados de camundongos. Áreas de implantação de esponja de
quitosana (A) e de colágeno (B) em lesão induzida por punch 7 dias após o
procedimento cirúrgico e áreas de implantação de esponja de quitosana (C) e de
colágeno (D) em lesão induzida por punch 14 dias após o procedimento cirúrgico.
Parênquima hepático (asterisco verde); área de necrose (asterisco azul); fragmentos
da esponja de quitosana (estrela amarela); fragmentos da esponja de colágeno
(estrela laranja); fibras reticulares entre parênquima e esponja (estrela azul).
Coloração: Reticulina. Barras: 200μm.
49
FIGURA 6 – Comparação da intensidade da reação inflamatória entre os tempos
pós-operatórios do grupo Q (relação asterisco/barra). Aumento dos
infiltrados mononucleares (p=0,0022) e polimorfonucleares
(p=0,0026) entre controles (T0) e 7 dias após o implante (A e B).
Aumento do número de células gigantes entre controles (T0) e 7º dia
pós-operatório, com ausência das mesmas 14 dias após o implante
(p=0,0078) (C). Aumento de tecido de granulação entre controles
(T0) e 7 dias e entre controles (T0) e 14 dias após o implante
(p=0,0002) (D). Teste de Kruskal-Wallis.
FIGURA 7 – Comparação da percentagem média de
colágeno entre os tempos pós-operatórios
do grupo Q (relação asterisco/barra).
Maior quantidade de fibras colágenas
entre controles (T0) e 14 dias após o
implante (p=0,001), pelo teste de Kruskal-
Wallis.
50
FIGURA 8 – Comparação da intensidade da reação inflamatória entre os tempos
pós-operatórios do grupo C (relação asterisco/barra). Aumento
dos infiltrados mononucleares (p=0,0022) (A),
polimorfonucleares (p=0,0010) (B), de células gigantes
(p=0,0049) (C) e de tecido de granulação (p=0,0002) (D) entre
controles (T0) e 7 dias e entre controles (T0) e 14 dias após o
implante, pelo teste de Kruskal-Wallis.
FIGURA 9 – Comparação da percentagem média de
colágeno entre os tempos pós-operatórios
do grupo C (relação asterisco/barra). Maior
quantidade de fibras colágenas entre
controles (T0) e 14 dias após o implante
(p=0,001), pelo teste de Kruskal-Wallis.
51
A avaliação histológica do parênquima hepático das áreas dos implantes de
quitosana e de colágeno, embasada na graduação da intensidade do tecido de granulação
e infiltrado inflamatório mononuclear, polimorfonuclear e de células gigantes, indicou
diferença entre o grupo Q e o grupo C apenas em relação ao maior teor de células gigantes
(7 dias: p=0,699; 14 dias: p=0,015) observadas aos implantes de colágeno, conforme a
análise comparativa dos subgrupos estudados e respectivos controles, pelo teste U de
Mann-Whitney (Tabela 1 e Figura 10).
TABELA 1 – Graduação da intensidade das características histológicas do parênquima
hepático de camundongos controle (N) e após implante de esponjas de quitosana
(Q) e colágeno (C)
Achados
Histológicos
Infiltrado
inflamatório
mononuclear
Infiltrado
inflamatório
polimorfonuclear
Células
gigantes
Tecido de
granulação
Grupos Escore (%) (%) (%) (%)
Controle N 0 0 0 0
Qu
ito
san
a (
Q)
Q7 0 - - 33,3 -
1 50 100 66,6 100
2 50 - - -
3 - - - -
Q14 0 - 33,3 100 -
1 100 66,6 - 100
2 - - - -
3 - - - -
Co
lág
eno
(C
)
C7 0 - - 16,6 -
1 100 66,6 83,3 100
2 - 33,3 - -
3 - - - -
C14 0 - - 16,6 -
1 100 83,3 83,3 100
2 - 16,6 - -
3 - - - -
* referência: 0 = ausência de alteração; 1= alteração discreta; 2 = alteração moderada; 3 =
alteração acentuada
52
FIGURA 10 – Comparação da intensidade da reação inflamatória entre os grupos Q e C nos
momentos experimentais 7 e 14 dias. Não há diferenças de infiltrados
mononucleares (controles T0: p=0,699; 7 dias: p=0,180; 14 dias: p=1) (A),
infiltrados polimorfonucleares (controles T0: p=1; 7 dias: p=0,394; 14 dias:
p=0,24) (B) e tecido de granulação (controles T0: p=1; 7 dias: p=1; 14 dias:
p=1) (D). Há diferença de células gigantes em 7 dias (p=0,699) e em 14 dias
(p=0,015) (controles T0: p=1) (asterisco) (C), pelo teste U de Mann-
Whitney.
A comparação das áreas de deposição do colágeno entre os grupos Q (Q7:
25,57%; Q14: 40,55%) e C (C7: 23,36%; C14: 30,25%) não indicou diferença estatística,
pelo teste U de Mann-Whitney (Tabela 2).
TABELA 2 - Percentagens médias de colágeno das áreas submetidas ao implante de esponjas
de quitosana e colágeno aos 7 e 14 dias após implantação
Tempo Quitosana (Q) A Colágeno (C) B
Q C
7 dias 25,57%Aa 23,36%Bb
14 dias 40,55%Aa 30,25%Bb
Teste U de Mann-Whitney (T0: p=0,699; T7: p=0,699; T14: p=0,695): AB não indicou diferença estatística entre grupos em relação aos diferentes tempos experimentais
Teste de Kruskal Wallis: Aacomparação da percentagem média de colágeno entre os tempos pós-operatórios do grupo Q
indicou diferenças estatísticas (p=0,001) Bbcomparação da percentagem média de colágeno entre os tempos pós-operatórios do grupo C
indicou diferenças estatísticas (p=0,001)
53
Avaliação ultramicroscópica
Ao microscópio eletrônico de transmissão, a outra etapa do presente estudo,
a avaliação do parênquima hepático das áreas dos implantes de esponjas de quitosana não
indicou a presença de alterações ultraestruturais significativas. Aos 7 dias pós-operatórios
notou-se a presença de fibras colágenas desorganizadas e aos 21 dias após o implante,
apesar da tendência à organização em feixes de fibras colágenas, indicando síntese de
colágeno tipo I, ainda se verificou áreas em que as fibras apresentam algum grau de
desorganização (Figura 11).
A análise ultramicroscópica do parênquima hepático dos segmentos
receptores de esponjas de colágeno também não indicou alterações ultraestruturais
significativas. Observou-se, 7 dias após o implante, presença de fibrilas colágenas
desorganizadas e em processo de organização para a formação de feixes. Aos 21 dias após
o implante, apesar da tendência à organização em feixes de fibras colágenas, indicando
síntese de colágeno tipo I, ainda se verificou áreas em que as fibras apresentam algum
grau de desorganização, conforme a análise comparativa dos períodos estudados
representada pela Figura 11.
54
FIGURA 11 - Eletromicrografias de fígados de camundongos. Áreas adjacentes aos
implantes de esponjas de quitosana (A, B e C). A - Grupo Q7: fibrilas
colágenas desorganizadas (estrela). B - Grupo Q21
: fibrilas colágenas
em processo de organização (estrela). C - Grupo Q21
: fibrilas
colágenas desorganizadas (estrela). Áreas adjacentes aos implantes
de esponjas de colágeno (D, E e F). D - Grupo C7: fibrilas colágenas
organizadas em feixe (corte transversal) (estrela). E - Grupo C21
:
fibrilas colágenas desorganizadas (estrela). F - Grupo C21
: maior
densidade de fibrilas colágenas em processo de organização (estrela).
Nota-se prolongamento citoplasmático de fibroblasto (cabeça de
seta). Barras: A e B - 1μm, C, D e E - 2μm. F - 1μm. Magnificação:
A, B e F - 20.000X, C – 7.000X. D e E - 12.000X.
DISCUSSÃO
A resposta orgânica a sistemas implantáveis vem sendo estudada em animais
de laboratório, dada a importância destes arcabouços para a engenharia de tecidos17,18.
Entretanto, a maioria destes sistemas é derivada de polímeros à base de poliéster,
55
geradores de subprodutos ácidos capazes de acelerar a degradação dos elementos por eles
transportados19. O presente estudo avaliou polímeros naturais, a base de proteínas
(colágeno) e polissacarídeos (quitosana) de crescente interesse como alternativas para a
medicina regenerativa.
A ausência de complicações trans-operatórias, infecções, deiscência de
suturas e óbitos durante o período pós-operatório, bem como a observação do aspecto
anatômico normal do fígado à necropsia, indicaram biocompatibilidade da esponja de
quitosana-alginato implantada em fígado de camundongos, em concordância com relatos
prévios frente a compostos de quitosana implantados em peritônio de camundongos e
fígado de ratos6,19-21.
As aderências omentais aos implantes de esponja de quitosana e de colágeno
e ao tecido hepático adjacente, observadas em todos os camundongos aos 7 e 14 dias pós-
operatórios, podem ter sido provocadas pela reação inflamatória local aos biomateriais.
Aderências peritoniais são frequentemente relatadas em cirurgias abdominais,
principalmente em seres humanos, equinos e animais de laboratório quando, a partir do
dano tecidual, diferentes mecanismos relacionados ao processo inflamatório e
desequilíbrio entre produção de fibrina e fibrinólise culminam com a transformação da
fibrina em tecido fibroso22.
Em implantes hepáticos de camundongos, a integração tecidual mais lenta das
esponjas de quitosana em relação às de colágeno, com presença de menor reação
inflamatória à quitosana que ao colágeno, pode ser atribuída à fagocitose precoce das
esponjas de colágeno pelos macrófagos (células gigantes) observados em maior
concentração frente a estes implantes. Também pode ser explicada pela combinação
biomaterial-tecido. Em meio aquoso, mesmo sob efeito de lisozimas, a degradação da
quitosana apresentou-se mais lenta quando comparada ao colágeno, justificada pela maior
hidrofilicidade e baixa resistência a forças mecânicas do mesmo em relação à
quitosana23,24. A velocidade de degradação de gel de gelatina/quitosana implantado em
fígado de camundongo foi mais lenta quando comparada à de gelatina isolada (proteína
obtida a partir do colágeno)11, e a degradação de membranas de quitosana/colágeno foi
diretamente proporcional ao teor de colágeno do compósito utilizado como sistema de
liberação de fármacos em cavidade abdominal de ratos25.
A degradação mais lenta dos implantes de quitosana associada a reação
inflamatória de menor intensidade constatada neste estudo confirma seu potencial como
plataforma para liberação controlada. A taxa de degradação da quitosana pode ser
56
administrada alterando-se sua composição polimérica (proporção de co-polimerização de
glucosamina para N-acetilglucosamina ou comprimento de cadeia lateral ácida em N-
acetilglucosamina) e/ou o seu peso molecular26. Tal característica permite adequar o
tempo de degradação do implante à duração do tratamento, prevenindo falha da terapia
por degradação precoce do arcabouço. Este diferencial tem sido bastante explorado na
produção de sistemas de liberação18. Uma grande vantagem dos sistemas de quitosana
reside em sua degradação por hidrólise ou reação enzima-específica, dispensando
técnicas invasivas, tais como cirurgias, para a sua remoção, ao término do período de
liberação necessário. Além disso, seus produtos de degradação são atóxicos, não
imunogênicos e não carcinogênicos. Adicionalmente, suas propriedades hidrofílicas
tornam possíveis reações químicas de entrecruzamentos para desenvolvimento de
compósitos que podem favorecer sua solubilidade6,26.
A resposta inflamatória de menor intensidade ao implante de quitosana
quando comparada ao de colágeno, observada no presente estudo em fígado de
camundongo, permite inferir elevado grau de biocompatibilidade à esponja de quitosana.
A implantação de arcabouços de quitosana no peritônio de camundongos resultou em
mínimos sinais de reação inflamatória durante acompanhamento de até 12 semanas27.
A observação de degeneração gordurosa discreta na região de veia terminal
hepática, bem como de área de necrose adjacente à incisão realizada pelo punch podem
ser atribuídas à hipóxia por lesão vascular iatrogênica, determinada pelo procedimento
cirúrgico promotor da falha hepática. O lobo hepático do camundongo é bastante delgado,
sendo transfixado em alguns segmentos pelo punch utilizado no experimento. A presença
de reação inflamatória ao tecido necrótico, com exsudato de polimorfonucleares,
mononucleares, células gigantes tipo corpo estranho e proliferação vascular em tecido de
granulação é justificável como evolução do processo de reparação tecidual6,13.
Para a implantação das esponjas estudadas, promoveu-se uma incisão circular
e ampla, dada à dimensão do lobo hepático do camundongo, comprometendo
consideravelmente a circulação sanguínea do segmento. Quando um biomaterial é
implantado, a lesão local ao tecido conjuntivo vascularizado é inevitável, suscitando uma
resposta inflamatória imediata6. A intensidade e duração do processo inflamatório
depende da composição química, energia livre de superfície, cargas de superfície,
porosidade e rugosidade do material, além do tamanho e forma do implante e extensão da
lesão criada durante sua inserção28.
57
A sequência de achados histológicos nos fígados dos camundongos do
presente estudo, aos 7 e 14 dias pós-operatórios, foi condizente com a dinâmica da reação
inflamatória a implantes. Tal resposta inflamatória pode ser caracterizada pela presença
de polimorfonucleares, linfócitos, plasmócitos, células gigantes tipo corpo estranho,
proliferação vascular em tecido de granulação e deposição de fibras reticulares e
colágenas em torno dos materiais implantados. Os eventos cicatriciais típicos da lesão
envolvem a formação de uma cápsula fibrótica em torno dos materiais, mesmo quando
ditos inertes, tais como os implantes de aço inoxidável6,20.
Formação de cápsula envolvendo implante de quitosana, conforme observada
nesta pesquisa, foi previamente relatada em diferentes estudos de biocompatibilidade: gel
de gelatina/quitosana implantado em fígado de camundongos11, formulação à base de
quitosana em cavidade peritoneal de camundongos6 e esponjas de quitosana em fígado de
ratos29.
A maior deposição de fibras colágenas circundando a esponja de quitosana,
quando comparada à de colágeno, sugere capacidade estimulante da quitosana sobre
regeneração tecidual e expressão de fibras colágenas tipo I e III em fígado de
camundongo. Compósitos de gelatina/quitosana implantados em fígado de camundongo
foram mais eficientes em induzir produção de fibrina e vascularização na interface
implante-fígado, quando comparados a implantes da proteína derivada do colágeno
isolada. Estudos vêm demonstrando que diferentes biomateriais podem modular funções
celulares e induzir o crescimento celular de formas distintas, e que a interação específica
de células com sua matriz extracelular é responsável por promover e regular o processo
de reparação tecidual. A quitosana tem sido utilizada para a regeneração de órgãos porque
facilita a adesão e a diferenciação celular, promovendo angiogênese e granulação durante
a cicatrização de lesões11.
O delineamento do presente estudo em 2 etapas possibilitou a observação dos
fenômenos da fase aguda da reação inflamatória aos 14 dias, em microscopia de luz, bem
como sua evolução, aos 21 dias, em microscopia eletrônica. A análise ultramicroscópica
indicou a presença de fibrilas colágenas desorganizadas e em processo de organização
para a formação de feixes aos 7 dias após o implante, evoluindo para uma apresentação
mais densa, caracterizando produção de colágeno tipo I em 21 dias. Após uma lesão
tecidual instaura-se um processo de reparação caracterizado por etapas interdependentes
e sobrepostas dinamicamente em relação ao tempo. Inicialmente ocorre a fibroplasia, com
formação de uma matriz frouxa de colágenos tipo I e II, fibronectina, ácido hialurônico,
58
macrófagos, fibroblastos e vasos recém-formados e exsudativos. O sítio de lesão vai
gradativamente sendo enriquecido com mais fibras de colágeno e surgem as fibras de
colágeno tipo I30.
Com o advento da medicina regenerativa, a pesquisa pelo biomaterial ou
compósito ideal para engenharia de tecidos e sistemas de liberação controlada de
terapêuticos visa aliar, além do diferencial de ser reabsorvível, biocompatibilidade,
facilidade de processamento e disponibilidade, a fim de obter uma boa relação custo-
benefício. A quitosana apresenta estrutura química passível de modificações, permitindo
a introdução de grupamentos químicos e o desenvolvimento de polímeros destinados a
aplicações específicas31-33.
CONCLUSÃO
Implantes de esponjas de quitosana-alginato são biocompatíveis, suscitam
reação inflamatória discreta e exercem efeito estimulante sobre a síntese de fibras
colágenas em fígado de camundongos.
REFERÊNCIAS
1. Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos. Dimensionamento dos transplantes
no Brasil e em cada estado. RBT. 2014;4:01.
2. Sacerdote LCF. Complicações anatomo-patológicas e sobrevida de pacientes
submetidos a transplante hepático (Estado da Bahia, Brasil). [Monografia]. Salvador:
Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Medicina da Bahia; 2014.
3. Ramos E, Coelho JCU. Transplante hepático no Brasil: situação atual. ABCD Arq
Bras Cir Dig. 2010;23(10):143.
4. Kazemnejad S. Hepatic tissue engineering using scaffolds: state of the art. Avicenna
J Med Biotech. 2009;1(3):135-45.
5. Cameron AM, Ghobrial RM, Yersiz H, Farmer DG, Lipshutz GS, Gordon SA,
Zimmerman M, Hong J, Collins TE, Gornbein J, Amersi F, Weaver M, Cao C, Chen
T, Hiatt JR, Busuttil RW. Optimal utilization of donor grafts with extended criteria:
a single-center experience in over 1000 liver transplants. Ann Surg.
2006;243(6):748-53
6. De Souza R, Zahedi P, Allen CJ, Miller MP. Biocompatibility of injectable chitosan-
phospholipid implant systems. Biomaterials. 2009;30:3818-24.
7. Zhang W, Tucker-Kellogg L, Narmada BC, Venkatraman L, Chang S, Lu Y, Tan N,
White JK, Jia R, Bhowmick SS, Shen S, Dewey CF Jr, Yu H. Cell-delivery therapeutics for liver regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 2010;15;62(7-8):814-26.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ghobrial%20RM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16772778
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lipshutz%20GS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16772778
59
8. Sousa PF, Preto AS, Leão D, Madureira AM, Paquete J, Costa-Maia J, Vilares-
Morgado P. Quimioembolização arterial transcatéter com partículas carregadas com
doxorrubicina no tratamento do carcinoma hepatocelular. Acta Med Port. 2011;
24(1):029-36.
9. Vosough M, Moslem M, Pournasr B, Baharvand H. Cell-based therapeutics for liver
disorders. Br med bull. 2011;110:157-72.
10. Palakkan AA, Hay DC, Anil Kumar PR, Kumary TV, Ross JA. Liver tissue
engineering and cell sources: issues and challenges. Liver Int. 2013;33(5):666-76.
11. Wang X, Yu X, Yan Y, Zhang R. Liver tissue responses to gelatin and
gelatin/chitosan gels. J Biomed Mater Res A. 2008;87(1):62-8.
12. Wiegand C, Hipler U. Polymer-baser Biomaterials as dressings for chonic stagnating
wounds. Macromol Symp. 2010;294(2):1-13.
13. Schreinemacher MH, Emans PJ, Gijbels MJ, Greve JW, Beets GL, Bouvy ND.
Degradation of mech coatings and intraperiotoneal adhesion formation in an
experimental model. Br J Surg. 2009;96(3):305-13.
14. Bozzola JJ, Russell LD. Electron microscopy: principles and techniques for
biologists. 2nd ed. Sudbury: Jones and Bartlett Publishers, 1998. 670p.
15. Statistical Package for the Social Sciences. Version 17.0. Chicago: Chicago
University, USA 2008. Software.
16. GraphPad Prism. versão 4.0 para Windows, da GraphPad Software, San Diego, USA,
2013. Software. Disponível em: www.graphpad.com.
17. Zhang Y, Cheng X, Wang J, Wang Y, Shi B, Huang C, Yang X, Liu T Novel
chitosan/collagen scaffold containing transforming growth factor-beta1 DNA for
periodontal tissue engineering. Biochem Biophys Res Commun.
2006;26;344(1):362-9.
18. Zhao J, Chen L, Yu K, Chen C, Dai Y, Qiao X, Yan Y. Biodegradation performance
of a chitosan coated magnesium-zinc-tricalcium phosphate composite as an implant.
Biointerphases. 2014;9(3):031004.
19. Zahedi P, De Souza R, Piquette-Miller M, Allen C. Chitosan-phospholipid blend for
sustained and localized delivery of docetaxel to the peritoneal cavity. Int J Pharm.
2009;30;377(1-2):76-84.
20. Ho EA, Vassileva V, Allen C, Piquette-Miller M. In vitro and in vivo characterization
of a novel biocompatible polymer-lipid implant system for the sustained delivery of
paclitaxel. J Control Release. 2005;104(1):181-915.
21. Wang X, Yan Y, Zhang R. Comparision of chitosan and collagen sponges as
hemostatic dressings. J Bioact Compat Polym. 2006;21(1):39-54.
60
22. Werner M, Galecio JS, Bustamante H. [Adherencias abdominals post quirúrgicas en
equinos: patofisiologia, prevención y tratamiento]. Arch Med Vet. 2009;41:1-15.
Espanhol.
23. Mori T, Murakami M, Okumura M, Kadosawa T, Uede T, Fujinaga T. Mechanism
of macrophage activation by chitin derivatives. J Vet Med Sci. 2005;67(1):51-6.
24. Niekraszewicz A. Chitosan Medical Dressings. Fib Text East Eur.
2005;13(6),(54):16-8.
25. Khor E, Lim LY. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials.
2003;24:2339-49.
26. Mi FL, Tan YC, Liang HF, Sung HW. In vivo biocompatibility and degradability of
a novel injectable-chitosan-based implant. Biomaterials. 2002;23(1):181-91.
27. Vandevord PJ, Matthew HW, DeSilva SP, Mayton L, Wu B, Wooley PH. Evaluation
of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res.
2002;5;59(3):585-90.
28. Mikos AG, McIntire LV, Anderson JM, Babensee JE. Host response to tissue
engineered devices. Adv Drug Deliv Rev. 1998;3;33(1-2):111-39.
29. Horio T, Ishihara M, Fujita M, Kishimoto S, Kanatani Y, Ishizuka T, Nogami Y,
Nakamura S, Tanaka Y, Morimoto Y, Maehara T. Effect of photocrosslinkable
chitosan hydrogel and its sponges to stop bleeding in a rat liver injury model. Artif
Organs. 2010;34(4):342-7.
30. Balbino CA, Pereira LM, Curi R. Mecanismos envolvidos na cicatrização: uma
revisão. RBCF. 2005;41(1):27-51.
31. Kumar MNVR. A review of chitin and chitosan applications. Reative and Functional
Polymers. 2000;46:1-27.
32. Singla AK, Chawla M. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects-an
update. J Pharm Pharmacol. 2001;53(8):1047-67.
33. Rinaudo M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog Polym Sci.
2006;31(7):603-32.
CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS
A literatura consultada, além de destacar a quitosana como biomaterial,
enfatiza sua versatilidade química e tecnológica, a qual permite sua combinação com
outros polímeros e partículas bioativas, gerando vários compósitos promissores para
utilização médica.
61
Em relação à hemostasia, os resultados obtidos neste modelo de hemorragia
ressaltaram o discrepante desempenho do tradicional tratamento por compressão com
gaze frente à eficácia hemostática das esponjas testadas, destacando a importância de uma
hemostasia mais eficiente para o paciente e também para o cirurgião, a fim de minimizar
riscos trans-cirúrgicos, complicações pós-operatórias, custos e tempos cirúrgicos e
hospitalares.
Diante de hemorragias hepáticas, o difícil acesso cirúrgico e a característica
friável do fígado naturalmente prejudicam a aplicação das técnicas convencionais de
hemostasia, como compressão local, ligaduras ou eletro-cauterização. A hemostasia
torna-se mais comprometida ainda quando existe doença hepática grave simultânea. Na
presença de diáteses hemorrágicas, a quitosana é capaz de produzir um complexo adesivo
independente de ativação plaquetária e de fatores de coagulação sanguínea, graças a sua
propriedade policatiônica e sua ligação inespecífica às membranas celulares das
hemácias. Sua utilização seria indicada neste caso, principalmente se seu efeito perdurar
o tempo necessário para evitar recidivas. Esta linha de pesquisa continua atual, dada a
importância prática de seus resultados, pois o controle imediato, efetivo e duradouro da
hemorragia hepática está diretamente correlacionado à taxa de sobrevida do paciente.
A estrutura química passível de modificações da quitosana permite a
introdução de grupamentos químicos e o controle de sua solubilidade, propiciando o
desenvolvimento de polímeros destinados a aplicações específicas. A resposta orgânica e
a velocidade de degradação dos implantes de quitosana-alginato em fígado de
camundongo indicaram biocompatibilidade, estímulo à colagênese e tempo de reabsorção
adequados para sua aplicação em nanomedicina. Estes resultados possibilitam a produção
de arcabouços com maior afinidade pelo tecido receptor, tanto para liberação de fármacos
como para crescimento de células e criação de órgãos artificiais, como fígado para
transplantes. Adicionalmente, seu efeito sobre a coagulação sanguínea auxilia
naturalmente o controle de sangramentos quando são implantados cirurgicamente.
Sistemas de carregamento e liberação à base de quitosana são capazes de
controlar a liberação do princípio ativo, protegendo fármacos e vacinas contra a
degradação prematura e diminuindo o risco de doses tóxicas ou subterapêuticas. Além
disso, viabilizam maior intervalo de administração, melhor aceitação do tratamento pelo
paciente, direcionamento do princípio ativo para seu alvo específico, utilização de menor
quantidade do princípio ativo e integram-se ao tecido receptor, eliminando a necessidade
de procedimentos invasivos para sua retirada e resultando em menor custo.
62
O delineamento do presente estudo não permitiu a verificação do tempo
necessário para a reabsorção total das esponjas de quitosana-alginato implantadas em
fígado de camundongo, as quais foram observadas nos segmentos hepáticos receptores
até o 21º dia após sua implantação. Esta informação é essencial para um melhor
aproveitamento dos diferenciais oferecidos pela quitosana para o desenvolvimento de
terapias personalizadas.
Estudos futuros utilizando biopolímeros de baixo custo, como a quitosana,
podem tornar possível e rotineiro o emprego de sistemas de liberação controlada de
fármacos para o tratamento de doenças que afetam populações de baixo poder aquisitivo,
visto que, para o mercado farmacêutico, o alto custo de medicamentos nanoestruturados
atualmente não justifica seu investimento.
63
ANEXO A
64
