Relatório de BioquímicaFOTOCOLORIMETRIA E ESPECTROCOLORIMETRIA:

FRACIONAMENTO DAS PROTEÍNAS DO LEITE E SUA DOSAGEM PELO MÉTODO DO BIURETO

Discentes: Gabriela Bitto de OliveiraJosé Carlos de Oliveira JuniorTamara Murisugi de Oliveira

Docente: Profa. Dra. Maria de Lourdes Corradi C. Da SilvaDisciplina: BioquímicaCurso: Engenharia Ambiental

2° ano

Presidente Prudente, 31 de março de 2010

UNESPFACULDADE DE CIÊNCIA E TECNOLOGIAFCT – Campus de Presidente Prudente

Unesp

Índice

1. Introdução ..........................................................................................................................2

1.1. Métodos Fotocolorímetros ................................................................................................2

1.2.Curva padrão ......................................................................................................................4

1.3. Procedimento para montagem de uma curva padrão ........................................................4

1.4. Métodos para quantificação de proteínas totais ................................................................4

1.5.Método do Biureto para determinação de proteínas ..........................................................5

1.6. Proteínas presente no leite ................................................................................................5

2. Objetivos .............................................................................................................................6

3. Matérias Utilizados ............................................................................................................7

3.1.Precipitação Isoelétrica da

Caseína ...................................................................................7

3.2. Diluição do leite para a dosagem de proteínas .................................................................7

4. Metodologias ......................................................................................................................7

4.1. Precipitação Isoelétrica da Caseína ..................................................................................7

4.2. Diluição do leite para a dosagem das proteínas totais ......................................................8

4.3. Curva de calibração e dosagem de proteína .....................................................................8

5. Resultados e Discussões ...................................................................................................11

6. Conclusão ..........................................................................................................................12

7. Bibliografia ......................................................................................................................13

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Métodos Fotocolorímetros

A fotocolorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento

analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a absorção de

energia radiante (luz).

A fotocolorimetria é um método biofísico de análise de substâncias largamente utilizado em

laboratórios de análises clínicas e em laboratórios de pesquisa, tendo como principal objetivo a

determinação da concentração de soluções. Esse método baseia-se na relação existente entre a

absorção de radiações eletromagnéticas e a concentração da substância em questão. O equipamento

utilizado para a realização da prática de fotocolorimetria, o fotocolorímetro, é composto pelos

seguintes itens: fonte de luz, filtro, cubeta, fotocélula e miliamperímetro. O aspecto externo do

fotocolorímetro é bastante característico e composto por: seletor de filtro, que serve para a escolha

do comprimento de onda do feixe de luz que incidirá sobre a cubeta, sendo o aparelho dotado de

cinco filtros (410nm, 480nm,520nm,580nm e 660nm); porta-cubetas, que é o local onde se coloca a

cubeta;botões de calibração; mostrador de leitura, que apresenta as duas grandezas que podem ser

medidas pelo fotocolorímetro: a absorbância e a transmitância.

Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação

electromagnética por muitas moléculas, quando os seus electrões se movimentam entre níveis

energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda

entre o ultravioleta e o infravermelho. Um espectrofotômetro é um aparelho que faz passar um feixe

de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por

essa solução. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de

onda (tal como acontece no arco-íris com a separação das cores da luz branca). Pode-se assim fazer

passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um único comprimento de onda, ou

quase). O espectrofotômetro permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida a cada

comprimento de onda.

Fotometria é uma técnica de análise quantitativa que envolve a medida de intensidade de

absorção de luz monocromática de um composto químico em solução. Ou seja, analisa a

absorvância (capacidade que tem uma solução de absorver uma certa quantidade de energia do feixe

de luz incidente)

Serve para identificar o comprimento de onda característico para cada composto e para

quantificação do composto através de 1) absorção direta e 2) através de método colorimétrico. Essa

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intensidade de absorção depende:

1) do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o λ máx - onde o composto

absorve mais luz),

2) do percurso que o feixe de luz percorrerá na solução e

3) da concentração do composto nessa solução.

A lei de Lambert-Beer estabelece que a absorbância é diretamente proporcional á

concentração da espécie absorvente. A fração de luz que passa por uma amostra (a transmitância =

It/I0) está relacionada logaritmicamente, e não linearmente, com a concentração da amostra.

A lei de Lambert-Beer relaciona esses três fatores e estabelece que:

A = ε.l.c

onde:

A = absorbância é definida pela reação seguinte: A = - log It/I0, que por ser uma razão, não

possui unidade (Io é intensidade de luz incidente; It é intensidade de luz transmitida);

ε = absortividade molar (característico de cada substância), em L.(mol.cm)-1;

l = caminho óptico (percurso da luz monocromática na solução), em cm;

c = concentração da substância em mol/L.

Onde:

T= tranmissão ou transmitância;

Io= intensiadade do feixe luminoso incidente;

It= intensidade de feixe luminoso transmitido ou emergente;

a= coeficiente decádico de absorção ou extinção;

c= concentração da solução;

I= espessuara da solução.

Desta forma, mantendo-se o caminho óptico constante, a absorbância torna-se diretamente

proporcional à concentração da substância no respectivo λmáx.

Nestas condições, podemos utilizar uma solução de concentração conhecida do composto a

ser analisado (ou outra substância de características químicas semelhantes) para construir um

diagrama de absorbância em função da concentração da substância em questão. Com este diagrama,

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denominada curva padrão, podemos medir a quantidade do composto em amostras de concentração

desconhecida, pela simples medida de suas absorbâncias desde que, estas estejam nas mesmas

condições utilizadas para a construção da curva padrão (mesmos reagentes, mesma temperatura,

etc).

1.2. Curva padrão

Devido à existência de uma proporcionalidade direta entre a concentração das soluções e a

quantidade de luz absorvida em comprimentos de onda específicos, a espectrofotometria e a

fotocolorimetria podem ser usadas como um método quantitativo de identificação de substâncias.

Contudo, faz se necessário, a obtenção de uma relação entre absorbâncias registradas em

experimentos para diferentes concentrações de soluções, elaborando-se retas de calibração, ou seja,

curvas padrões .

Experimentalmente é possível conhecer os valores de absorbância de soluções conhecidas e

assim, utilizando-se as curvas padrões, podem-se determinar matematicamente as concentrações

destas.

1.3. Procedimento para montagem de uma curva padrão (Lehninger, 1984).

Quando escolhido um método de dosagem, prepara-se uma solução padrão de concentração

rigorosamente conhecida. Mede-se então com pipetas de precisão, diferentes volumes desta solução,

completando-se com solvente a um volume final determinado. É calculado e anotado a

concentração de cada uma das amostras e então são feitas duplicatas destas amostras e estas são

então processadas pelo método de dosagem. Um volume igual de solvente é processado pelo

mesmo método, para servir de branco nesta dosagem (eliminado da leitura o erro causado pela

absorção de luz pela cuba, solvente, reagente e impurezas).

1.4. Métodos para quantificação de proteínas totais

As proteínas desempenham papéis extremamente importantes, na maioria dos processos

biológicos, por isso, o desenvolvimento de metodologias para determinar esses compostos tem,

cada vez mais, se tornado de fundamental relevância em várias áreas do conhecimento (Zaia, 1998).

São encontrados na literatura, diferentes métodos para a quantificação de proteínas. A

maioria desses métodos tem como base: a) na propriedade intrínseca das proteínas para absorver

luz no UV, b) na formação de derivados químicos, e c) na capacidade que as proteínas têm de se

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unir a certos corantes.

Os métodos para a determinação da concentração de proteínas totais são muito variados, no

entanto, as metodologias mais utilizadas são as espectrofotométricas no ultravioleta e no visível. Ao

longo dos anos, muitos métodos espectrofotométricos, têm sido propostos para a determinação de

proteínas totais, porém não existe uma metodologia considerada de uso universal para todos os

meios. Os métodos geralmente mais utilizados são o do Biureto, de Lowry, de Bradford, de Smith e

de absorção de proteínas no ultravioleta (Zaia, 1998):

1.5. Método do Biureto para determinação de proteínas

Um dos métodos utilizados para dosagem de proteína é chamado de método do Biureto.

Esse método faz uso da propriedade de íons Cu2+ em meio alcalino de formar ligações com o

nitrogênio das ligações peptídicas., que reage de modo quantitativo com as proteínas. Desta reação

(reação de biureto) resulta uma coloração púrpura intensa, que absorve fortemente a radiação a 540

nm. Este fato pode ser explorado para se determinar por colorimetria a quantidade de proteína de

uma solução. A cor desenvolvida numa reação de íons de Cu2+ em meio alcalino com estas

proteínas deve-se exclusivamente às ligações peptídicas e a sua intensidade é proporcional a

quantidade de tais ligações. A absorbância é detectada no espectrofotômetro ou fotocolorímeto.

1.6. Proteínas presente no leite

O leite é essencial numa dieta bem balanceada e composto de diversos nutrientes e

substâncias fisiologicamente ativas. O leite é composto por 87,5% de água, 3,6% de gordura, 4,5%

de lactose, 0,8% de sais minerais e 3,6% de proteínas, há três tipos de proteínas diferentes: 7-12%

de α-Lactoalbumina, 2-5% de β- Lactoglobulina e o restante de caseína.

O ponto isoelétrico da caseina é 4.6. É o ponto de pH em que ela precipita (coagulação

ácida). A proteína purificada é insolúvel em água. Enquanto é insolúvel em soluções salinas neutras,

prontamente se dispersa em meio alcalino diluído e em soluções salinas tais como oxalato de sódio

e acetato de sódio. Além disso, a caseína faz muito bem à saúde.

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2. OBJETIVOS

• Elaborar curvas de calibração e estabelecer a sensibilidade de um método fotocolorimétrico.

• Relacionar os métodos fotocolorimétricos às situações onde poderão ser aplicados, tendo como

exemplo a dosagem de proteínas do leite pelo método da reação do biureto.

• Resolver problemas específicos: cálculos das diluições e de concentrações.

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3. MATERIAIS

3.1. Precipitação Isoelétrica da Caseína

a) Solução padrão de proteína a 5,0mg/mL;

b)HCl a 2% v/v;

c) reagente do biureto: sulfato de cobre cristalizado (pentaidratado) 1,5g; tartarato duplo de sódio e

potássio 6,0g; 500mL de água destilada. Adicionar 300 mL de NaOH a 10g% (p/v) com constante

agitação e completar para 1 litro com água destilada;

d) papel indicador de pH;

e) leite desnatado longa vida (0% gordura).

3.2. Diluição do leite para a dosagem de proteínas

a) leite desnatado;

b) água destilada.

4. METODOLOGIA

4.1. Precipitação Isoelétrica da Caseína

a) Colocou-se 10mL de leite com 10mL de água destilada morna em um béquer de 50mL;

b) foram acrescentados 2mL de solução de ácido clorídrico a 2%, gota a gota, com constante

agitação até atingir o ponto isoelétrico da caseína, que corresponde ao pH 4.6, no qual o leite

coagula;

c) o pH foi medido com o auxílio de um papel indicador universal;

d) anotou-se o volume de HCl 2% gasto;

e) após sedimentação do precipitado, filtrou-se o material por papel;

f) o filtrado foi utilizado para a dosagem de proteína que não precipitaram nas condições acima

descritas.

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4.2. Diluição do leite para a dosagem das proteínas totais

a) Diluiu-se 0,5mL de leite em 9,5mL de água destilada à temperatura ambiente (proporção 1:20);

OBS.: Neste trabalho PF refere-se a proteínas do filtrado; PT, proteínas totais e (PT-PF) à

quantidade de caseína.

4.3. Curva de calibração e dosagem de proteína

a)

Curva de calibração PF PTTubos n° 1 2 3 4 5 6 7 8Padrão de proteína

5 m/ml (ml)0 0,2 (1mg) 0,4 (2mg) 0,6 (3mg) 0,8 (4mg) 1,0 (5mg) -- --

Amostra

(PF ou PT) (ml)-- -- -- -- -- -- 1,0 1,0

Água destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -- -- --Reagente do

BiuretoAdicionar em todos os tubos 5 ml

b) Agitou-se todos os tubos, deixando-os em repouso durante 10 minutos;

c) a absorbância dos tubos foi analisada no fotocolorímetro 540 nm, sendo o aparelho zerado com o

tubo nº 1 (branco = concentração zero de proteínas).

d) Utilizou-se duas cubetas em que umas delas continha o material do tubo 1 e a outra para as

demais soluções.

Obs.: É necessária a limpeza externa da cubeta que recebe as soluções do tubo 2 ao tubo 8 usando

papel higiênico, a fim de não afetar o valor da absorbância registrada pelo fotocolorímetro. A partir

do tubo 6 é necessário lavar as cubetas. Além disso, a troca das cubetas deve ser instantânea para o

aparelho não se descalibrar.

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Tabela 4.1- Dosagens para curva de calibração

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Misturando-se o ácido clorídrico à solução de leite formou-se um precipitado branco após a

adição de 2mL do ácido. Segundo a análise feita com o papel indicador, o pH da amostra ficou entre

4 e 5. Tal precipitado corresponde à caseína, proteína do leite. Enquanto que a parte superior é

composta pelas outras duas proteínas também importantes ao leite: lactoalbumina e lactoglobulina.

O ácido clorídrico foi adicionado ao leite com o intuito de diminuir o pH da solução e,

consequentemente, atingir o ponto isoelétrico da caseína (pI=4,6). A amostra foi filtrada para obter-

se o PF: líquido translúcido levemente amarelado.

Em seguida, diluiu-se 0,5mL de leite em 9,5mL de água destilada para diminuir a

concentração do leite já que lei de Beer-Lambert é válida somente para soluções relativamente

diluídas, uma vez que acima de certas concentrações a relação entre a absorvância e a concentração

deixa de ser linear. Tornando viável a análise da absorbância das PTs no fotocolorímetro (tubo 8).

O tubo 1(branco), contendo apenas água e a solução do biureto, possuía uma coloração

azulada e foi utilizado para calibrar o fotocolorímetro. Do tubo 2 ao 6, o aumento da concentração

de proteínas, fez com que a coloração tendesse gradativamente ao violeta.

Os tubos 7 e 8 apresentaram coloração violeta intermediária às colorações dos tubos 2 ao 6.

Analisando as Densidades Ópticas obtidas, mostradas no Gráfico 5.1 e na Tabela 5.1, foi

possível observar uma certa relação entra a absorbância e a concentração de proteínas de acordo

com o esperado, ou seja, uma relação diretamente proporcional.

Tubo mg/ml 1 2 3 4 5 6 7 8Luz absorvida 0,0 0,04 0,07 0,10 0,14 0,18 0,09 0,09

Lembrando que o tubo 7 contém o material solúvel restante após a precipitação da caseína e

que primeiramente o leite foi diluído para 20mL (o dobro do volume inicial), a concentração

encontrada para esta amostra ( Tabela 5.1 ) deve ser multiplicada por 2 para se ter a quantidade real.

Cmg/mL = 2 x C7 → Cmg/mL = 2 x 2.7 → Cmg/mL = 5.4 mg/mL.

Onde: Cmg/ml = Concentração real das PFs;

C7 = Concentração do tubo 7.

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Tabela 5.1- resultados obtidos no fotocolorímetro

Com o tubo 8 também houve um processo de diluição. No entanto, a proporção de diluição

não foi de 1:2 como no tubo 7, e sim de 1:20. Portanto o valor obtido na Tabela 5.1 deverá ser

multiplicado por 20. Logo

C'mg/mL = 20 x C8 → C'mg/mL = 20 x 2.7 → C'mg/mL = 54mg/mL.

Onde: C'mg/mL = Concentração real das PTs;

C8 = concentração no tubo 8.

Enfim, a concentração da caseína é a subtração da C'mg/ml menos a Cmg/mL

Ccaseína = C'mg/mL – Cmg/mL → Ccaseína = 54.0 – 5.4 → Ccaseína = 48.6 mg/mL.

Sendo assim, encontra-se facilmente a porcentagem de caseína no leite fazendo a razão da

concentração da caseína com a concentração PTs real, multiplicando esse valor por 100

%Caseína = (Caseína / C'mg/mL ) x 100 → %Caseina = (48.6 / 54.0) x 100 →

→ %Caseína = 90%

Esperava-se obter um resultado entorno de 85% de caseína, como está escrito na literatura.

Supõe-se que o esperado não ocorreu devido a um erro de pipetagem, onde, ao se adicionar o ácido

HCl 2% em excesso, o pH ficou mais ácido do que o necessário, fazendo com que o ponto

isoelétrico da lactoalbumina que é entre 4,2 e 4,5, fosse atingido também, e esta, então, estaria

presente no precipitado juntamente com a caseína que possui seu ponto isoelétrico muito próximo

(pI = 4,6). O mesmo já não ocorre com a lactoglobulina que contém o pI aproximadamente igual a

5,2.

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Gráfico 5.1 - Gráfico obtido através da curva de calibração

6. CONCLUSÃO

Visto que a fotocolorimetria e a espectrofotometria são técnicas analíticas que permitem

determinar a concentração das soluções através da medida da intensidade de luz absorvida ou

transmitida pelas mesmas, percebeu-se que com uma maior concentração de proteínas, há o

aumento no valor da absorbância (medida no fotocolorímetro) e, portanto, a quantidade de luz

transmitida (medida no espectrofotômetro) tende a reduzir/diminuir.

As curvas de calibração são determinadas através dos resultados obtidos por esses aparelhos.

Onde inicialmente há sempre um solução, considerada o branco, onde não está diluído nele o

material em estudo, no caso as proteínas, e as demais soluções aumentam gradativamente a

concentração deste material, gerando assim um gráfico de conc. (mg/ml) X absorvância, formado

por uma reta, já que é diretamente proporcional o aumento das variáveis.

Os cálculos apresentados tem como objetivo final mostrar a concentração de caseína

presente no material de estudo que foi retirada inicialmente na forma de um precipitado, que ocorre

devido à adição de ácido. Tal calculo se baseia em uma relação entre as proteínas totais presente no

tubo 8 menos as proteínas filtradas presente no tubo 7.

Por tratar-se de um experimento que inclui ou aborda métodos quantitativos, a mensuração

de cada material a ser utilizado tem influência direta nos resultados obtidos. Por exemplo, segundo

a literatura, “quando se realiza a dosagem de proteínas do leite, a porcentagem de caseína

encontrada é de 85%” – não coincidindo com/ contrariando, de certo modo, o observado nessa

(aula) prática, em que se obteve, algebricamente, uma porcentagem de 90% de caseína. Tal

desigualdade pode ter ocorrido em função de erros grosseiros na dosagem dos materiais, variando

assim, suas concentrações.

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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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redutores, açúcares solúveis totais, proteínas e aminoácidos. Universidade Federal de Lavras,

departamento de biologia. Lavras MG, agosto de 2007.

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Teoria e Prática da espectrofotometria quantitativa. "Photographic Chemistry 2076-302

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