FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)

Fluorescent porque se usam sondas marcadas com fluorescncia

In Situ porque h mesmo uma ligao no stio

Hybridization porque a sonda liga-se por hibridao (forma um hbrido) no local de ligao

Pode ser em DNA ou RNA (cidos nucleicos, mais frequente em DNA) precisa porque s emparelha com zona homologa.

Vantagens:ResoluoContrasteRapidez SeguranaMulti-localizao (um sonda uma localizao, 2 sondas 2 localizaes...)

ALVO (Target segment in chromossome) a sequencia que queremos identificar no genoma total

SONDA (probe) a nossa sequencia de interesse e corresponde a uma parte pequena de interesse

Mtodo:

Depois de se dar a hibridao conseguimos identificar no cromossoma a localizao exata da nossa sequencia de interesse no cromossoma.

Reao de FISH em mais detalhe

Tipos de sondas de FISH:

a) Sondas Pan ( significa tudo ou todas)[como caracterstica geral no so informativas ligam-se a zonas que esto repetidas pelo genoma]

Centromricas vo se ligar aos centrmerosTelomricas - vo se ligar a telmerosNOR ligam-se a regio NOR, 13,15,21,22ALU ligam-se em repeties ALU.

b) Sondas especficas para sequencias

[ligam-se a zonas que esto repetidas pelo genoma]

Ligam-se a um cromossoma inteiroApenas a um brao do cromossomaNuma bandaOu numa sequencia especfica pr-determinada

Visualizao de cores

Ao microscpio precisamos sempre de ter uma cor para podermos distinguir a sonda do restante.

Corante: elemento que se liga ao DNA, agente intercalante da cadeia dupla, e que tambm emite fluorescncia, o mais usado o DAPI e d cor azul .

Sonda: ter de emitir noutro espectro ou seja ter uma cor diferente.

Tipos de sondas que se podem usar:

DNA genomicoDNA clonado de cromossomas artificiais em bactrias (BAC)DNA amplificado por PCRDNA obtido por restrio enzimtica ou centrifugao Oligonucleotdeos sintticosCromossomas inteiros por flow-sortingRegies cromossmicas obtidas por microdissecoSondas comerciais

Passos para FISH

1.Marcao de sondas2.Preparao material alvo3.Pr-tratamento alvos cromossmicos4.Desnaturao de sondas e alvos5.Hibridao da sonda com o alvo cromossmico (a 37C num hibridizador) e que pode demorar de 1 a 5 dias6.Montagem das lminas

Tipos de alvos para FISH

Cromossomas metafasicos ou prometafsicos (mais usado!) [estrutural]:

Nucleos inteiros de clulas em interfase (muito usado em diagnostico) [numrico]:

Em fibras de cromatina completamente estendidas (resoluo muito alta):Neste caso como a resoluoo alta conseguimos tirar muito mais informao, poderamos ver rearranjos, mapear genes e at procurar uma microdeleco.

Tipos de sondas para FISH

Obteno por FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)Esta tcnica ideal para se quisermos obter cromossomas inteiros. Marcao de todos os cromossomas com agentes intercalantes e que lhes do cargas diferentes (Hoechst (DAPI) marca adeninas e timinas; cromomicina marca guaninas e citidinas) . Diferentes tamanhos vo corresponder a diferentes cargas. Quando o DNA marcado passa em frente ao detector pelo seu contedo GC/AT da para se fazer uma previso do tamanho e o cell sorter faz a excluso do que est a passar no detector. Conseguimos assim isolar um cromossoma. Depois de se isolar o cromossoma s vamos precisar agora de marcar o seu dna e com o hibridizarmos contra outro cromossoma homologo ele vai se ligar. i.e. se isolamos o cromossoma 1, depois de o prepararmos ele vai reconhecer o cromossoma 1 e ligar-se a ele. Seguidamente a se obter este material s amplifica-lo, usando por exemplo o DOP-PCR

DOP-PCRDegenerated Oligonucleotide Primed Polimerase Chain Reaction. [6MW primer mais usado] um PCR em que o primer que se usa no especifico (tem temperatura de anealing baixa). Esta falta de especificidade permite que se ligue a vrias zonas e como tal ha uma alplificao muito inespecifica que leva amplificao de todo o genoma. Com este primer inespecifico poderamos amplificar o cromossoma inteira que extramos no cell sorter. O produto so amplices de 300 bps a 8000 bps (pares de bases).

MicrodissecoNeste caso h mesmo uma recolha fsica (agulha ou laser) de um brao de um cromossoma especfico ou uma banda especfica. Uma vez mais torna-se necessrio amplificar o material recolhido (DOP-PCR).

Sequencias repetitivas

3 mtodos para isolamento de sequencias repetitivas: amplificao por PCR de zona j conhecida, restrio do DNA com enzimas de restrio e microdisseco.

Enz. RestrioA enzima usadas para cortar o DNA em zonas de sequencia repetitiva .Este amplificado e purificado.

PCRSe conhecermos a zona com a repetio podemos amplifica-la com primers. Variam muito entre espcies.

MicrodissecoExtrair uma zona conhecida que composta por repeties, por exemplo a zona telomrica dos cromossomas.

Marcao de sondas: necessrio ter uma maneira que nos permita depois identificar o que ns selecionamos como sonda, o truque: Fluorescncia ou algo que se liga e tambm fluorescente! Sendo assim temos 2 tipos de marcao de sondas: direta e indireta. Na marcao direta (A)o fluorocromo associado diretamente sonda.Na marcao indireta (B) a sonda no est marcada com fluorescncia mas com um hapteno que tem afinidade por uma molcula que est marcada com fluorescncia.

Princpio da marcao direta e indireta

A marcao no radioactiva tornou-se muito atraente na tcnica de FISH.Um exemplo o caso da molcula de biotina-dUTP (a biotina o nosso hapteno).

Geralmente, para a deteco da molcula de biotina-dUTP presente na sonda, usamos uma molcula de Avidina conjugada com o fluorocromos que cobrem todo o espectro visvel da luz,

Uma vez que a sonda marcada com um hapteno, que em si no fluorescente este procedimento chamado marcao "Indireta" (Figura abaixo).

Outros marcadores "indiretos" incluem haptenos tais como dinitrofenol, digoxigenina, ou estradiol, que pode ser detectada por anticorpos marcados com fluorocromos.

Uma vez mais , os anticorpos contra estes haptenos esto agora disponveis que so acoplados a vrios corantes fluorescentes diferentes.

Na marcao "direta" so os dUTPs que esto diretamente acoplados a fluorocromos. Aps a incorporao na sonda e seguindo a hibridizao in situ, a sonda torna-se logo visvel, sem mais necessidade de procedimentos de deteco. Assim, uma sonda marcada, por exemplo com Cy3-dUTP imediatamente visvel aps a hibridizao como a fluorescncia vermelha do microscpio (Figura abaixo).

Existe uma gama completa de dUTPs marcados "diretamente"

Qual a vantagem de usar um mtodo direto ou indireto?

Em muitos casos, a intensidade da fluorescncia no to forte como se consegue com os sistemas "indiretos". Porque? Porque os haptenos muitas vezes so molculas com muita afinidade, o sistema avidina biotina (tipo antignio-anticorpo) consegue que em cada biotina se liguem muitas avidinas, pelo que se d amplificao de sinal. Outra vantagem, o facto de se poder fazer diferentes combinaes com os anticorpos que permitem assim diferentes alvos ao mesmo tempo.

Tipo de marcao das sondas e ncleos:

Marcao de DNA (ncleos): DAPI ou iodeto de propdeo (so ambos agentes intercalantes. DAPI azul; IP: vermelho.

Fluorocromos

Os corantes usados mais frequentemente para a deteco dos sinais de FISH so o FITC (isotiocianato de fluorescena) que emite uma fluorescncia e resulta numa cor verde. Existem outros resumidos na tabela abaixo:

AzulTurquesaVerdeAmareloLaranjaVermelhoNear InfraredInfrared

CorantesDAPIDEACFITC/R110R6GTAMRA/Cy3TexRed/Cy3.5Cy5Cy5.5

ExMax.358426494/500524552/550590/581649675

Emmax.461480517/525550575/570612/596670694

RestringnciaAs sondas marcadas podem hibridar no especificamente com as outras sequncias que so em parte mas no totalmente homloga sequncia da sonda.A extenso em que a ltima ocorre podem ser manipulados em certa medida pela variao do rigor da reao de hibridao.Esses hbridos so menos estveis do que os hbridos que so perfeitamente combinados.A restringncia pois ento a tentativa de se tentar eliminar hibridao no especfica. Esta manipulao pode ser obtida pela variao das lavagens.Factores que podem influenciar: concentrao de formamida concentrao de sal temperatura

Combinao boliana

Diferentes sondas podem ser visualizadas com diferentes fluorocromo numa nica experiencia de FISH. Por exemplo, 5 sondas marcadas com 5 fluorocromos e visualizadas com diferentes filtros. Quando as sondas so marcadas no com um fluorocromo mas com vrios, torna-se ainda possvel diferencia-las. Na combinao boliana as sondas so marcadas com vrios fluorocromos de maneira a se puderem fazer combinaes. Ex: uma sonda pode estar marcada com verde, a outra com vermelho e uma outra com vermelho e verde que d amarelo (Combinao=2^(N)-1, no exemplo dado C=2^2-1=3). Esta configurao pode ser pensada para se distinguir rearranjos cromossmicos

M-FISH e SKY-FISH

De acordo com a formula C=2^(N)-1, sabemos que para 4 fluorocromos temos 15 combinaes e para 5 fluorocromos temos 31 combinaes. Para distinguir os 24 cromossomas humanos precisamos de pelo menos de 5 sondas para os poder visualizar numa experiencia nica de FISH. Existem dois mtodos publicados para se pintarem os 24 cromossomas em combinaes nicas tambm conhecido como cariotipagem de cor.

1.Multiplex FISH ou M-FISHNesta abordagem cada fluorocromo adquirido no filtro respectivo e no final faz-se uma composio da imagem.

2.Spectral Karyotyping-FISH ou SKY-FISHNesta outra abordagem usado um interfermetro para medir o espectro de emisso de fluorescncia de cada pixel na imagem obtida e classifica a combinao do fluorocromo em cada cromossoma. Uma vez que o computador classifica cada cromossoma estes podem ser dispostos artificialmente por uma classificao de cor (pseudo cor) para uma melhor discriminao entre fluorocromos com uma combinao semelhante.

A cariotipagem de cor especialmente importante em citogentica de tumores, em que foi demonstrado o seu valor em casos onde a analise de bandas de cromossomas por si s no conseguia decifrar mudanas complexas em caritipos inteiros.

tambm usada para o estudo comparativo de alteraes complexas de cromossomas que ocorreram entre espcies no processo evolutivo.

Na imagem abaixo temos exemplo de M-FISH: A) Caritipo de cores usando M-FISH ou SKY. uma pintura 24 cores para os cromossomas humanos.

b) imagem de SKY usando sondas de pintura em cromossomas humanos metafsicos de orangotango. Note-se que no h rearranjos inter-cromossmicas exceto para o homlogo ao cromossoma humano 2, que tem dois homlogos em macacos (2p e 2q). Como evidente a partir da posio do centrmero alguns cromossomas tambm mostram rearranjos intra-cromossmicas, que, no entanto, no so possveis de serem analisados por caritipo de cor.

c) M-FISH de 21 cromossomas do rato. Note-se que dois cromossomas (cromossomas 8 e 11, flechas e setas, respectivamente) so trissmicos.

FISH chromosome bar coding A marcao dos cromossomas apenas permite marcar cromossomas inteiros e e nao da totalidade assim fica limitado apenas a identificao de translocaes. Delinear alteraes intra-cromossmicas (inverses, duplicaes, transposies e outras) necessita da definio de reas sug-regionais dentro dos cromossomas. Para tal foi criado um sistema de sondas que cria um padro de bandas em formato multicolor que se chama bar coding ou cdigo de barras.Existem dois tipos de barcoding:

Cross-species color segmentation ou RxFISH (gibbon)Os caritipos do primatas hominoides (gibbon) foram altamente fragmentados por translocaes durante o processo evolutivo. As sondas criadas a partir do caritipo deste primata server para delinear mais de 100 diferentes segmentos no caritipo humano. Figura A.

Bar codes from fragmented hybridsOutra tcnica para se fazer o bar coding usar cromossomas fragmentados clulas de humanos e ratinhos. Neste caso o DNA humano separado usando primers especificios para as zonas ALU (alu repeats s esto presentes em primatas). Usando esta abordagem foram criadas a partir destas linhagens mais de 300 fragmentos cromossmicos que conseguem identificar 110 pontos em cromossomas humanas.

Ambos os barcodes podem ser co-hibridizados em cromossomas humanos com 6 diferentes fluorocromos. Juntos cobrem 160 alvos que em termos de analise de bandas correspondem a 400 bandas na citogentica clssica.

Multi color banding (MCB)

Foi uma outra abordagem para se introduzir um padro de cores nos cromossomas por FISH. A microdisseco de partes de cromossomas permitiu individualizar marcaes em cromossomas. No serve para caritipos inteiros. Usado muito para o usto de rearranjos cromossmicos.

Comparative Genome Hybridization (CGH)

Neste caso usamos o DNA genmico como uma sonda para compararmos genomas. Esta tcnica til para se procurar diferenas (inbalances) entre os dois genomas a serem estudados. Vrios tumores so caraterizados por perdas e ganhos em cromossomas especficos ou segmentos. Adicionalmente alguns genes so amplificados ou perdidos. No CGH o DNA do tumor e normal hibridizado contra cromossomas normais diploides. A avaliao do rcio entre normal e tumor diz-nos se houve perda ou ganho.