Ferramentas para o estudo da expressão de genes de...

i

Agradecimentos

À Prof. Doutora Sílvia Coimbra e ao Prof. Doutor Luís Gustavo Pereira pelo apoio, segurança

e motivação transmitidos através da sua orientação e exigência. Por acreditarem desde o início na

minha capacidade e competência para realizar este trabalho.

À Doutora Stefanie Sprunck por todo o apoio, pela orientação e exigência, por me ensinar

que é preciso muita persistência para se fazer ciência, e pela motivação que me transmitiu.

À Lucija Soljic e à Doutora Stefanie Sprunck pela disponibilização dos resultados das

experiências de microarrays, ainda não publicados.

À minha família por todo o apoio, pela paciência, pelo mimo do bom e pela disponibilidade

nos momentos mais difíceis e de dúvidas, por sempre me terem dado forças para continuar e me

ensinarem a nunca desistir dos meus objectivos.

Aos amigos, por estarem sempre presentes, pela paciência e todo o apoio prestado, pelo

carinho e por me aturarem sempre, mesmo quando acabava a falar das minhas plantas, dos meus

PCRs azarados ou de transformações com resultados estranhos (ajudaram-me sempre a chegar à

conclusão de que não existem resultados estranhos ou azarados, mas sim resultados que nos

fazem pensar, tentar compreender, voltar atrás, rever passos, métodos… enfim, fazer ciência).

À Lucija, por todo o apoio que me deu, por tudo o que me ensinou no laboratório, pelas boas

conversas, pela boa disposição e o mais importante, pelos crepes com Nutella e gelado que

compensavam alguns dias intermináveis no laboratório. E, claro, pela amizade!

A todos os meus colegas e amigos de laboratório, do Porto e de Regensburg, por todo o

apoio que me deram, pela paciência para me aturar, mesmo quando queria pôr toda a gente a

limpar o laboratório, pelas boas conversas e discussões, por me ajudarem a compreender que para

se trabalhar em ciência é preciso saber lidar muito bem com as frustrações (as dos PCRs azarados)

e principalmente pela amizade.

ii

Ferramentas para o estudo da expressão de genes de proteínas arabinogalactânicas

em diferentes células e tecidos do pistilo de Arabidopsis thaliana

Sumário

Nas plantas com flor a fecundação requer o transporte dos gâmetas masculinos até aos

óvulos, que surgem profundamente envolvidos pelos tecidos esporofíticos da flor. Este transporte é

feito pelo tubo polínico que responde a sinais de direccionamento e cresce através dos diferentes

tecidos do pistilo até ao saco embrionário, conduzindo à dupla fecundação. As proteínas

arabinogalactânicas (AGPs) são proteínas altamente glicosiladas que poderão estar envolvidas no

direccionamento do tubo polínico até ao saco embrionário. Estudos prévios de imunocitoquímica,

feitos com diferentes espécies de plantas, mostraram que estas proteínas estão presentes nas

células gametofíticas, nas células do tegumento micropilar e nas células do nucelo micropilar. Estas

proteínas são óptimas candidatas a moléculas de atracção para o direccionamento do tubo polínico.

Neste trabalho foram construídas ferramentas moleculares que permitirão identificar os

epítopos destas proteínas previamente localizados por imunocitoquímica no pistilo de Arabidopsis

thaliana, determinando a localização celular das AGPs. Para a selecção das AGPs expressas nos

tecidos femininos foram analisados dados de experiências de microarrays relativos à expressão das

AGPs nas sinergídeas, na célula central e na oosfera. Foram também analisados dados de

microarrays de pólen e gâmetas masculinos. De acordo com o padrão de expressão de cada AGP

nas células gametofíticas masculinas e femininas e atendendo à similaridade entre as diferentes

proteínas, foram seleccionadas 7 AGPs (AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP 15, AGP20 e AGP23).

Foram obtidas plantas mutantes que expressam a GFP sob o controlo de sequências promotoras

destas AGPs para 6 das AGPs seleccionadas inicialmente: AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP 15 e

AGP23.

Estas ferramentas permitirão confirmar a informação obtida a partir das experiências de

microarrays bem como determinar que AGPs específicas estão presentes ao longo do trajecto

seguido pelo tubo polínico até ao saco embrionário, a nível celular. A partir deste estudo será mais

fácil analisar e determinar com uma maior precisão a função das AGPs presentes nos tecidos

femininos de Arabidopsis thaliana.

iii

Tools for the localization and characterization of AGP genes in Arabidopsis thaliana

pistil tissues

Abstract

Successful fertilization in flowering plants requires sperm cells guidance into the ovules,

deeply embedded in the female sporophytic tissues. The pollen tube carries the two sperm cells

trough the pistil tissues following guidance cues until it reaches the embryo sac to accomplish

double fertilization. Arabinogalactan proteins (AGPs) are highly glycosilated proteins that might be

related to pollen tube guidance into the embryo sac. Previous immunolocalization studies with

different plant species have shown a specific labelling of AGPs carbohydrate epitopes in the

gametophytic cells, the filiform apparatus of the synergids, the integument micropylar cells and the

micropylar nucellus. These proteins are excellent candidates for chemoattractants that guide pollen

tubes growth.

In this study molecular tools were developed, that will allow the specific identification of these

proteins epitopes previously identified by immunolocalization studies in Arabidopsis thaliana. Data

from microarray experiments using isolated synergids, egg cells and central cells were evaluated in

order to identify AGP genes that have the highest expression levels in these cells. These proteins’

expression was also checked in pollen and sperm cells using microarray data. According to the

expression pattern of individual AGPs in the female and male gametophytic cells, and to their

sequence similarity, 7 AGPs were selected for further analysis (AGP1, AGP9, AGP10, AGP12,

AGP15, AGP20 and AGP23). Arabidopsis transgenic plants were generated that express GFP under

the control of AGP promoter sequences for 6 (AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP15 and AGP23) of

the 7 AGPs initially identified.

The analysis of these plants will allow the verification of the data obtained from the microarray

experiments and the identification of the AGPs present along the pollen tube pathway, as well as will

permit the identification of their specific cellular location. The identification of the AGPs present in

the female reproductive tissues is of major importance to initiate future function analysis studies

regarding this large family of proteins.

iv

Índice

1. Introdução 1

1.1 Dupla fecundação nas plantas com flor 1

1.2. Direccionamento do tubo polínico para o saco embrionário 2

1.3. Pela estrada fora – interacções pólen–pistilo 4

1.4 AGPs – Proteínas Arabinogalactânicas 9

1.5 AGPs – moléculas de sinalização? 11

1.6 AGPs no trajecto do tubo polínico 12

1.7 Objectivos 13

2. Materiais e Métodos 15

2.1 Material vegetal e condições de crescimento 15

2.2 Alinhamento das sequências proteicas 15

2.3 Estirpes bacterianas e vectores 15

2.3.1 Meios e condições de crescimento 16

2.3.2 Preparação de células de E. coli DH5α competentes 16

2.3.3 Transformação de células de E.coli TOP10 e E. coli DH5 α 17

2.3.4 Preparação de células de A. tumefaciens gv3101::pMP90::pSOUP competentes 17

2.3.5 Transformação de A. tumefaciens 18

2.4 Técnicas de manipulação e análise de DNA 18

2.4.1 Extracção de DNA genómico de A. thaliana 18

2.4.2 Electroforese em gel de agarose 19

2.4.3 Reacção da polimerase em cadeia – PCR 19

2.4.4 Extracção de RNA de óvulos de A. thaliana 22

v

2.4.5 RT-PCR em tempo real 23

2.4.6 Recuperação de DNA a partir de géis de agarose 25

2.4.7 Minipreparação de DNA plasmídico 25

2.4.8 Digestão de DNA plasmídico 25

2.4.9 Sequenciação 25

2.5 Produção de linhas de A. thaliana transgénicas 26

2.5.1 Ligação dos fragmentos amplificados no vector pENTR/D-TOPO 26

2.5.2 Linearização dos vectores de entrada 27

2.5.3 Obtenção das construções pAGP::NLS:3xGFP 27

2.5.4 Transformação de A. thaliana pelo método de “floral dip” 28

3. Resultados 30

3.1 Selecção das AGPs 30

3.2 Análise dos alinhamentos proteicos 30

3.3 Expressão de genes de AGPs nos óvulos 32

3.4 Amplificação dos fragmentos das regiões promotoras 36

3.5 Obtenção dos vectores de entrada pENTR/D-TOPO/pAGP 37

3.6 Obtenção das construções pAGP::NLS:3xGFP 39

4. Discussão 43

4.1 Selecção das AGPs 44

4.2 Obtenção das construções pAGP::NLS:3xGFP 45

4.3 Considerações finais 46

5. Referências Bibliográficas 48

Anexos 53

Anexo I – Representação esquemática das reacções de recombinação BP e LR que

constituem a base da tecnologia gateway 53

vi

Anexo II – Curvas de dissociação dos genes em estudo nas experiências de RT-PCR em

tempo real 54

Anexo III – Curvas padrão dos genes em estudo nas experiências de RT-PCR em tempo

real para determinação da eficiência das reacções 58

Anexo IV – Representação esquemática do vector pENTR/D-TOPO 64

Anexo V – Resultado da sequenciação das construções obtidas após recombinação com o

vector pENTR/D-TOPO 65

Anexo VI – Resultado da sequenciação das construções obtidas após recombinação do

vector pENTR/D-TOPO, contendo a sequência promotora de cada AGP, com o vector

pNLS3xGFPnost-pGII 79

1

1. Introdução

1.1 Dupla fecundação nas plantas com flor

O ciclo de vida das plantas com flor alterna entre um organismo multicelular diplóide, o

esporófito, e um organismo multicelular haplóide, o gametófito. Os gametófitos e os esporófitos

diferem morfologicamente e funcionalmente. Após a meiose o esporófito origina 2 tipos de esporos

sexualmente diferenciados: os microsporos e os megasporos. Estes esporos dividem-se

mitoticamente e desenvolvem-se em gametófitos, cuja principal função é a produção de gâmetas. A

fusão dos gâmetas masculinos e dos gâmetas femininos (oosfera e célula central) estabelece a nova

geração esporofítica, completando assim o ciclo de vida (Drews et al., 1998; Raven et al., 2005).

Uma das características que define o desenvolvimento reprodutivo das Angiospérmicas é

exactamente esta dupla fecundação (Raghavan, 2003). Este é um processo biológico único, pelo

qual um gâmeta masculino se funde com a oosfera para produzir o embrião enquanto o outro

gâmeta se funde com a célula central para formar o endosperma, um tecido nutritivo fundamental

para o desenvolvimento do embrião (Russell, 1992). Esta forma de reprodução foi descrita pela

primeira vez nas Liliáceas Lilium martagon e Fritillaria tenella nos finais do século XIX por S.

Nawaschin em 1898. No ano seguinte L. Guinard confirmou o fenómeno observado por Nawaschin,

de forma independente, em Lilium martagon e Lilium pyrenaicum (Raghavan, 2003).

A dupla fecundação envolve uma série de interacções complexas entre o gametófito

masculino (GM), o esporófito e o gametófito feminino (GF). Os gametófitos feminino e masculino

desempenham um papel fundamental na dupla fecundação (Weterings e Russell, 2004).

O GM maduro, também designado por grão de pólen ou microgametófito, desenvolve-se no

interior do lóculo da antera e é constituído por duas ou três células haplóides: uma célula vegetativa

que transporta no seu interior uma células generativa (grão de pólen bicelular) ou dois gâmetas

masculinos (grão de pólen tricelular) (Lord e Russell, 2002; McCormick, 2004). A célula generativa

sofre uma mitose originando os dois gâmetas masculinos, esta mitose pode em algumas plantas

ocorrer no interior da antera (gramíneas e crucíferas), mas na maioria das plantas ocorre durante o

crescimento do tubo polínico (TP). A célula vegetativa é responsável pela formação do TP e pela

libertação dos dois gâmetas masculinos no GF (McCormick, 1993; McCormick, 2004).

O GF, também designado por saco embrionário ou megagametófito encontra-se

profundamente envolvido pelos tecidos do óvulo, localizado no interior do ovário. Existem cerca de

2

15 padrões diferentes de desenvolvimento do GF, sendo a forma mais comum designada por GF

tipo Polygonum, por ter sido pela primeira vez descrita em Polygonum divaricatum, sendo exibido

por espécies tão importantes como Arabidopsis thaliana ou Zea mays. O desenvolvimento do GF

tipo Polygonum ocorre em duas fases: megasporogénese (formação do megasporo) e

megagametogénese (desenvolvimento do saco embrionário). Na megasporogénese uma célula, o

megasporócito sofre uma meiose originando quatro megasporos haplóides. Os três megasporos

localizados na região do micrópilo sofrem morte celular programada e o megasporo localizado na

região da caláza torna-se o megasporo funcional. Este passa por três ciclos de mitoses originando

uma estrutura cenocítica constituída por oito núcleos. Após a 3ª mitose formam-se paredes

celulares em torno destes núcleos, e ao mesmo tempo um núcleo de cada pólo (os núcleos polares)

migra em direcção ao centro do GF e fundem-se antes ou durante a fecundação originando o núcleo

da célula central. Após todos estes eventos o GF maduro do tipo Polygonum é constituído por sete

células: três antípodas na região da caláza, uma célula central grande a ocupar toda a região central

do saco embrionário, duas sinergídeas e uma oosfera na região do micrópilo (Huang e Russell,

1992; Drews et al., 1998; Yadegari e Drews, 2004).

Todos os processos relacionados com a dupla fecundação ocorrem de forma coordenada

conduzindo ao desenvolvimento da semente. Estes processos podem ser organizados por ordem

temporal: atracção e crescimento do TP, libertação dos dois gâmetas masculinos numa sinergídea

degenerada, migração dos gâmetas masculinos até aos gâmetas femininos, reconhecimento e

fusão dos gâmetas, fusão do material genético parental durante a cariogamia e a reiniciação do

ciclo celular, transcrição e tradução conduzindo à formação e crescimento do zigoto (Berger, 2008;

Berger et al., 2008). O primeiro passo, de atracção e crescimento do TP, é um dos mais estudados

actualmente, embora ainda pouco se saiba sobre como ocorre este direccionamento do TP para o

saco embrionário.

1.2. Direccionamento do tubo polínico para o saco embrionário

O direccionamento do TP para o saco embrionário precede a dupla fecundação, sendo uma

etapa crítica para a sua ocorrência. Durante este direccionamento o TP atravessa diferentes tecidos

do pistilo (Figura 1.1a) (Johnson e Preuss, 2002). Após a adesão do grão de pólen à superfície

estigmática e sua posterior hidratação (Lord e Russell, 2002), o TP emerge e inicia o seu

crescimento através dos espaços intercelulares das células do estigma até atingir o tecido de

3

transmissão (Hülskamp et al., 1995; Johnson e Preuss, 2002; Lord e Russell, 2002). O tecido de

transmissão é um tecido especializado que faz a ligação entre o estigma, o estilete e os óvulos

suportando o crescimento do TP através de uma matriz extracelular até ao saco embrionário

(Hülskamp et al., 1995; Lennon et al., 1998; Lord, 2000).

Figura 1.1 – Representação esquemática da dupla fecundação. a) Germinação do TP à superfície do estigma e seu

crescimento ao longo do estilete e tecido de transmissão até atingir o GF. b) Entrada do TP no GF através da região

micropilar onde ocorrem interacções (setas vermelhas) entre o TP e as sinergídeas para atrair o TP até ao local de

entrada no saco embrionário. c) Libertação dos gâmetas masculinos na sinergídea receptiva, migração dos gâmetas e

fusão dos gâmetas masculinos com a oosfera e com a célula central. pe: papilas estigmáticas, e: estilete, tt: tecido de

transmissão (Adaptado a partir de Berger et al., 2008)

Em muitas espécies, como em A. thaliana, o tecido de transmissão prolonga-se através do

septo que divide o ovário em 2 compartimentos. Consequentemente nestas espécies, o TP tem de

atravessar a camada de células da placenta que envolve o tecido de transmissão, e crescer à

superfície do septo até atingir o funículo. Na região funicular o TP direcciona o seu crescimento para

a região micropilar do óvulo, crescendo à superfície das células do funiculo até entrar pelo micrópilo

e atingir o saco embrionário (Johnson e Preuss, 2002; Yadegari e Drews, 2004). Normalmente,

apenas um TP cresce em direcção a cada saco embrionário (Kandasamy et al., 1994). Uma vez na

região micropilar o TP entra no GF, mais especificamente numa das sinergídeas, entrando junto ao

aparelho filiforme (estrutura constituída por expansões da parede celular) num local de menor

resistência, rompe e aí liberta o seu conteúdo (Figura 1.1b e 1.1c). Esta sinergídea sofre morte

celular programada pouco antes da entrada do TP ou mesmo aquando a sua entrada (Faure et al.,

2002). Forma-se então uma pequena abertura na extremidade do TP ou na sua proximidade, e o

seu conteúdo é libertado para o interior do citoplasma da sinergídea degenerada de uma forma

mais ou menos explosiva (Russell, 1992). Daqui, os gâmetas masculinos migram de forma a

ocorrer fusão de um deles com a célula central, e do outro com a oosfera (Figura 1.1c), iniciando

4

assim o desenvolvimento do endosperma e do zigoto, respectivamente (Johnson e Preuss, 2002;

Weterings e Russell, 2004; Yadegari e Drews, 2004).

Todo o trajecto seguido pelo TP desde do estigma até ao saco embrionário é suportado por

uma rede molecular complexa responsável pela adesão e atracção do TP até ao seu alvo final, o

saco embrionário. Muitos destes mecanismos moleculares têm sido desvendados ao longo da

última década, permanecendo ainda várias questões por explicar (Higashiyama e Hamamura,

2008). A maioria das questões que permanece por responder diz respeito às moléculas

responsáveis pela comunicação entre o GF e o GM na região funicular e micropilar, bem como a

comunicação com os tecidos esporofíticos envolventes.

1.3. Pela estrada fora – interacções pólen–pistilo

De uma forma geral, e de acordo com os mecanismos moleculares que regulam o

crescimento e a atracção do TP, todo o processo de direccionamento do TP pode ser dividido em

duas fases: uma fase esporofítica, em que ocorre crescimento do TP inicialmente à superfície das

papilas estigmáticas e, posteriormente, crescimento intercelular ao longo do estilete, de um modo

independente do GF, e uma fase gametofítica, dependente de sinais produzidos pelo GF para

conduzir o TP até ao saco embrionário (Ray et al., 1997; Higashiyama et al., 2003).

Os dois gâmetas masculinos têm de ser transportados desde o estigma até ao saco

embrionário, que se encontra profundamente envolvido pelo nucelo e pelos tegumentos interno e

externo do óvulo, o qual, por sua vez, se encontra rodeado pelo tecido da placenta no interior do

ovário (Weterings e Russell, 2004). O TP cresce através dos diferentes tecidos do pistilo sem nunca

perder a orientação do seu crescimento e atingindo a região micropilar do saco embrionário de

forma bastante precisa (Higashyiama e Hamamura, 2008). Todo o processo de direccionamento do

TP é controlado por múltiplas interacções celulares que envolvem vários mecanismos de sinalização

quer para o reconhecimento do grão de pólen pelos tecidos da flor quer para o direccionamento do

crescimento do TP no interior do pistilo até ao GF (Sanchez et al., 2004; Dresselhaus, 2006). Estes

mecanismos têm sido, nos últimos anos, dos principais processos estudados no que diz respeito à

reprodução nas plantas com flor.

Foram estudadas mutações em Arabidopsis em que o saco embrionário e o tecido

esporofítico são afectados (bell, bel1 e short integuments1, sin1) e mutações que afectam apenas o

saco embrionário (54D12 e 47H4), verificando-se que todas estas mutações impedem o correcto

5

direccionamento do tubo polínico até ao óvulo, não afectando, no entanto, a fase anterior de

crescimento do tubo polínico, até à superfície da placenta, a fase esporofítica. Em todos estes

mutantes, após crescimento dos TPs no septo, estes não cresciam mais através do funículo em

direcção ao micrópilo do óvulo, crescendo ao acaso sobre qualquer superfície, como por exemplo as

paredes externas dos óvulos. Estes estudos indicam que diferentes sinais controlam a migração dos

tubos polínicos através do tecido de transmissão e a sua emergência deste tecido em direcção aos

óvulos (Hülskamp et al., 1995). Estudos semi in-vitro efectuados em Torenia fournieri utilizando

estiletes polinizados cortados e co-cultivados com óvulos, permitiram verificar que, quando alguns

dos óvulos eram danificados pelo calor, os tubos eram atraídos para outros óvulos viáveis

(Higashiyama et al., 1998). Neste estudo foram também feitas experiências apenas com TPs co-

cultivados com óvulos, verificando-se que os TPs apenas se direccionam para os óvulos quando

atravessam o estigma e o estilete. Isto demonstra a importância da passagem do TP por estes

tecidos de modo a adquirir competência para depois responder aos sinais de direccionamento para

o GF. Este estudo sugere que o GF não é necessário para o direccionamento do TP desde o estigma

até à base do estilete.

Assume-se que existem moléculas responsáveis pela atracção e crescimento do TP em todo o

seu trajecto até ao saco embrionário, tendo sido efectuados vários estudos para identificar estas

moléculas (Higashiyama e Hamamura, 2008). Inicialmente o direccionamento é controlado apenas

pelo tecido esporofítico do pistilo, sinais moleculares presentes no estigma e no estilete serão os

responsáveis por este direccionamento (McCormick e Yang, 2005).

Em Nicotiana tabacum certas proteínas arabinogalactânicas (AGPs) TTS (transmitting tissue-

specific), presentes na matriz extracelular do tecido de transmissão, foram relacionadas com o

direccionamento do tubo polínico para os óvulos. Estas proteínas estimulam o crescimento do tubo

polínico in vitro, atraem os tubos polínicos em sistemas de cultura semi-in vivo e são necessárias

para o crescimento óptimo do tubo polínico in vivo, funcionando como uma fonte de nutrientes e

moléculas de adesão para os tubos polínicos em crescimento (Cheung et al. 1995; Wu et al.,

2001). Outro estudo feito com Arabidopsis mostra que em mutantes no transmitting tract (ntt) que

apresentam um desenvolvimento anormal do tecido de trasmissão, este tecido é fundamental para

estimular o crescimento do TP. Os TP neste pistilo mutante crescem menos e mais devagar do que

nos pistilos da variedade selvagem, apresentando a planta mutante uma taxa de fecundação muito

reduzida (Crawford et al., 2007). Estes estudos comprovam que o tecido de transmissão é

fundamental para um rápido crescimento do TP ao longo do pistilo.

6

O GABA (ácido γ-aminobutírico) foi identificado como possível molécula de atracção produzida

pelos tecidos esporofíticos do pistilo de Arabidopsis. Esta molécula apresenta um gradiente de

concentração ao longo destes tecidos, com concentrações mais baixas no estigma e concentrações

mais elevadas no tegumento interno dos óvulos (Palanivelu et al., 2003). No mesmo estudo foi

verificado que o gene POP2 (pollen-pistil interaction) codifica uma transaminase que degrada o

GABA, contribuindo para o estabelecimento do gradiente de concentração desde o estigma até aos

tegumentos do óvulo. No entanto, a actividade do GABA como molécula de atracção do tubo

polínico nunca foi reproduzida in vitro, sugerindo que outras moléculas serão necessárias para

actuar em conjunto com o GABA. Na verdade, pensa-se que exista não uma molécula sinal, mas

sim várias moléculas componentes de um sistema de sinalização bastante complexo (McCormick e

Yang, 2005). Outras moléculas de atracção produzidas pelos tecidos esporofítico têm sido

descobertas tais como a quimiocianina, uma pequena proteína produzida pelos estigmas de Lilium

longiflorum (Kim et al., 2003). Glicoproteínas ricas em hidroxiprolina (HRGPs – hidroxyproline rich

glycoproteins) como as proteínas arabinogalactânicas (AGPs – arabinogalactan proteins) presentes

no pistilo foram também relacionadas com o processo de direccionamento do tubo polínico até ao

GF (Sanchez et al., 2004).

Nos estudos efectuados por Hülskamp (1995), referidos acima, os TPs não crescem em

direcção ao saco embrionário nos mutantes sin1 e 47H4, em que não se desenvolve saco

embrionário, indicando que o gametófito feminino poderá ser a fonte do sinal de atracção

responsável pelo seu direccionamento. Estudos efectuados com os mutantes magatama (maa1 e

maa3) de A. thaliana que apresentam um atraso no desenvolvimento do GF, mostram que os TPs

são direccionados para o GF, mas perdem a sua orientação imediatamente antes de entrarem no

micrópilo (Shimizu e Okada, 2000). Estes trabalhos mostram que a fase gametofítica, última fase

de direccionamento do TP, pode ser dividida em duas fases: uma fase de direccionamento funicular

e uma fase de direccionamento micropilar (Figura 1.2) (Shimizu e Okada, 2000; Higashiyama e

Hamamura, 2008).

O mecanismo de direccionamento funicular não é ainda conhecido, algumas moléculas de

atracção poderão ser libertadas directamente pelo GF maduro ou em desenvolvimento ou um sinal

do GF poderá conduzir, indirectamente, à produção de um sinal de atracção pelas células dos

tecidos esporofíticos do óvulo (Higashiyama e Hamamura, 2008).

Estes estudos não permitem relacionar estruturas específicas do saco embrionário com esta

capacidade de atracção. Mostram apenas que, durante o desenvolvimento do saco embrionário,

7

este adquire a competência para atrair o TP, sendo por isso provavelmente a fonte do sinal de

atracção para o TP.

Figura 1.2 – Fase gametofítica de direccionamento do TP em A. thaliana. As linhas azuis representam TPs a crescer a

partir dos grãos de pólen em direcção ao GF. Nas regiões rodeados por círculos a tracejado alguns TPs perdem a sua

orientação quando o GF não apresenta um desenvolvimento correcto, sugerindo que existem sinais produzidos pelo GF

responsáveis pelo direccionamento do TP nesta região. Nesta fase o direccionamento pode ser dividido numa fase

funicular e numa fase micropilar. GM: gametófito masculino, GF: fametófito feminino. (Adaptado a partir de Higashiyama

et. al., 2003).

Higashiyama e colaboradores (1998) fizeram estudos em Torenia fournieri, sugerindo que as

sinergídeas são as células responsáveis por esta atracção. Na maioria das espécies, o saco

embrionário está envolvido por várias camadas de tecido esporofítico, o que não facilita o acesso ao

saco embrionário, no entanto, Torenia apresenta um saco embrionário nu, que quando maduro, é

projectado para o exterior do óvulo através do micrópilo, permitindo assim o fácil acesso às células

do saco embrionário. Num sistema in vitro, estes autores observaram o crescimento dos TPs em

direcção a ovários dissecados, verificando que os tubos polínicos são atraídos directamente para o

saco embrionário nu, sendo que, uma vez atraídos, não mais abandonam a região micropilar do

saco embrionário. Verificaram ainda que, quando alguns dos óvulos eram danificados pelo calor, os

tubos eram atraídos para outros gametófitos femininos viáveis. Estes resultados sugerem

fortemente que o saco embrionário produz sinais de atracção para o TP. Seguidamente, os mesmos

autores (Higashiyama et al., 2001) efectuaram trabalhos de ablação com laser das diferentes

células gametofíticas, para determinar quais as células que poderiam produzir estes sinais,

8

verificando que a ablação da célula central e da oosfera não afectava o direccionamento normal do

TP, mas que a ablação das sinergídeas alterava este direccionamento. Quando as duas sinergídeas

eram eliminadas, nenhum saco embrionário atraía tubos polínicos. Se apenas uma sinergídea era

eliminada, a atracção diminuía mas não cessava, sugerindo que as duas sinergídeas são capazes

de atrair o TP e que uma sinergídea é suficiente para gerar um sinal de atracção, embora este seja

mais forte quando as duas células estão presentes. As sinergídeas foram assim identificadas como

sendo a fonte do sinal de atracção a curta distância para os tubos polínicos. O mesmo foi provado

em A. thaliana mas utilizando uma abordagem diferente. Kasahara e colaboradores (2005)

efectuaram estudos com o gene MYB98, que no óvulo é expresso exclusivamente nas sinergídeas.

O mutante myb98 apresenta um GF e sinergídeas aparentemente normais, no entanto, a estrutura

do aparelho filiforme é anormal, não possuindo as expansões da parede celular típicas desta

estrutura. Neste mutante os TPs crescem desde a placenta até ao funículo mas não daqui até ao

micrópilo. Tal como na Torenia fournieri em Arabidopsis o direccionamento micropilar do TP parece

ser controlado pelas sinegídeas (Kasahara et al., 2005; Punwani e Drews, 2008).

Até à data, os processos moleculares que regulam o desenvolvimento e as funções das

sinergídeas, tais como os sinais de atracção e factores que controlam o direccionamento do tubo

polínico até ao saco embrionário, e a libertação dos gâmetas nas sinergídeas, não são ainda

conhecidos (Punwani e Drews, 2008).

Uma das questões fundamentais acerca da reprodução nas plantas com flor é determinar

qual a base molecular para o direccionamento do tubo polínico até ao saco embrionário.

Recentemente Márton e colaboradores (2005) identificaram uma pequena proteína em Zea mays, a

ZmEA1 (Zea mays EGG APPARATUS1), produzida pelas sinergídeas e pela oosfera, necessária para

a atracção do tubo polínico até ao gametófito feminino. O gene ZmEA1 é expresso exclusivamente

nestas células antes da fecundação, após a qual a sua expressão diminui progressivamente até

desaparecer por completo nos embriões mais desenvolvidos, já com 10 dias. Esta proteína possui

um domínio transmembranar, e para determinar a sua localização foi utilizada uma proteína de

fusão ZmEA1:GFP C-terminal, observando-se expressão da ZmEA1 não só nas sinergídeas e oosfera

mas também no aparelho filiforme e nas células do nucelo micropilar, sugerindo estes resultados

que a região C-terminal do domínio transmembranar da proteína é clivada para funcionar como

molécula sinal nos tecidos circundantes. A ZmEA1 é uma proteína candidata para o sinal de

atracção produzido pelas sinergídeas em Zea mays.

9

Recentemente Okuda e colaboradores (2009) identificaram em Torenia fournieri polipéptdos

ricos em cisteína (CRPs - cysteine-rich polypeptides) pertencentes a um sub-grupo das proteínas tipo

defensinas: LURES, como moléculas de atracção produzidas pelas sinegídeas. Neste estudo foram

isoladas sinergídeas de T. fornieri e identificados transcritos que codificam proteínas candidatas a

moléculas de atracção. Foram encontradas duas CRPs abundantemente expressas nas sinergídeas,

e que são secretadas para a superfície do aparelho filiforme. Verificaram também que estas

moléculas são capazes de atrair TPs in vitro. Foi ainda demonstrado pela utilização de oligomeros

antisense para os LUREs que quando estes oligomeros são injectados no GF há uma diminuição da

atracção dos TPs para o GF. Este estudo sugere fortemente que as LUREs são as moléculas de

atracção produzidas pelas sinergídeas em T. fornieri.

Não se sabe no entanto, se existe apenas uma molécula de atracção produzida pelas

sinergídeas ou várias moléculas que poderão funcionar de forma redundante ou em conjunto

(Higashiyama e Hamamura, 2008). Será mais provável que existam várias moléculas, ou uma

complexa rede de sinalização uma vez que não há nenhum estudo em que a mutação de um gene

ou diminuição da sua expressão tenha conduzido a um bloqueio total do crescimento dos TPs para

o saco embrionário.

Até à data, nenhuma molécula sinal para o direccionamento do TP foi ainda identificada em

A. thaliana. Vários estudos apontam as proteínas arabinogalactânicas (AGPs) como candidatas a

moléculas de sinalização para o direccionamento do tubo polínico até ao saco embrionário (Coimbra

et al., 2007).

1.4 AGPs – Proteínas Arabinogalactânicas

As AGPs encontram-se amplamente distribuídas no reino das plantas, desde as Briófitas até

às Angiospérmicas, sendo particularmente abundantes nas paredes celulares, membranas

plasmáticas e secreções extracelulares (Majewska-Sawka e Nothnagel, 2000). As AGPs são uma

classe de glicoproteínas ricas em hidroxiprolina e altamente glicosiladas, estruturalmente bastante

complexas (Showalter, 2001; Johnson et al., 2003). Foram já identificados, em Arabidopsis, 47

genes que codificam as estruturas proteicas de AGPs (Schultz et al., 2000, 2002). Em Arabidopsis,

as AGPs podem ser divididas em 4 sub-famílias, de acordo com as características do seu núcleo

proteico: as AGPs clássicas, os péptidos AG, as AGPs ricas em lisina e as AGPs tipo fasciclina, FLAs

(fasciclin-like AGPs) (Johnson et al., 2003; Sun et al., 2005). As AGPs clássicas são constituídas por

10

um núcleo proteico rico em Pro, Ala, Ser e Thr, possuem uma sequência N-terminal, que é

removida da proteína madura, um domínio rico em resíduos de Prolina/Hidroxiprolina e um domínio

hidrofóbico C-terminal contendo uma sequência sinal para uma âncora lipídica

glicosilfosfotidilinositol (GPI). Os péptidos AG possuem um núcleo proteico curto, com cerca de 10 a

15 resíduos de aminoácidos. As AGPs ricas em lisina apresentam um pequeno domínio rico em

lisina, e as FLAs são AGPs que possuem um ou dois domínios de fasciclina, podendo ou não

apresentar uma âncora GPI (Schultz et al., 2000, 2002; Sun et al., 2005; Seifert e Roberts, 2007).

Figura 1.3 – Representação esquemática da estrutura das AGPs. a) AGPs clássicas. b) AGPs ricas em lisina. c)

Péptidos AG. d) FLAs. Lys: domínio rico em lisina.

Diversos estudos mostram que as AGPs desempenham funções importantes em diferentes

aspectos do desenvolvimento e crescimento das plantas. Estão envolvidas na proliferação celular,

na expansão celular, na diferenciação celular, no reconhecimento entre células, na embriogénese

somática, no crescimento do tubo polínico e na morte celular programada (Majewska-Sawka e

Nothnagel, 2000).

As AGPs podem ser localizadas nos tecidos e células através da utilização de anticorpos

monoclonais específicos (MAbs) que se ligam a epítopos de carbohidratos estruturalmente

complexos, típicos destas glicoproteínas (Knox, 1997). O uso extensivo dos MAbs anti-AGPs pela

11

comunidade científica mostra que as AGPs são alvo de uma regulação muito refinada e são

diferencialmente expressas durante o desenvolvimento da planta, mais precisamente durante a fase

de reprodução sexuada da planta (Coimbra e Salema, 1997; Coimbra e Duarte, 2003; Pereira et

al., 2006; Coimbra et al., 2007)

No entanto, os resultados obtidos recorrendo à utilização de MAbs dirigidos para a porção

glicosídica destas proteínas, identifica grupos de AGPs com o mesmo tipo de epítopos glicosídicos,

não permitindo identificar quais as AGPs específicas que se encontram presentes num determinado

tecido.

1.5 AGPs – moléculas de sinalização?

As AGPs foram sempre consideradas fortes candidatas a mediadoras de interacções celulares

e reguladoras do crescimento celular. No entanto, o mecanismo exacto, através do qual as AGPs

poderão mediar a sinalização entre células, permanece ainda desconhecido. Um possível

mecanismo que pode explicar o funcionamento das AGPs como moléculas de sinalização poderá

estar associado à clivagem da âncora GPI.

Pensa-se que a maioria das AGPs estejam ancoradas à membrana plasmática por âncoras

lipídicas glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Borner et al., 2002; Schultz et al., 2004). A presença desta

âncora proporciona um potencial mecanismo pelo qual as AGPs poderão estar envolvidas em

processos de sinalização e atracção polarizada, muito importante para muitas das funções

sugeridas para estas proteínas (Gaspar et al., 2001). Esta âncora poderá fornecer um mecanismo

de libertação das AGPs a partir da membrana citoplasmática, eventualmente por acção de enzimas

como as fosfolipases (C ou D), para o meio extracelular (Gaspar et al., 2001; Showalter, 2001).

Para além desta hipótese, vários outros modelos existem para explicar a possível função das AGPs

como moléculas sinal. Num outro modelo, o facto de as AGPs serem proteínas muito ricas em

carbohidratos e de muitos açúcares estarem envolvidos em diversas vias de transdução de sinal nas

plantas, sugere que as AGPs poderão ser processadas enzimaticamente para libertar

oligossacarídeos que funcionarão como sinais, que se ligam a receptores da membrana

citoplasmática relacionados com um sistema de transducção de sinal (Showalter, 2001). No

entanto, estudos mais aprofundados são necessários para compreender melhor como poderão

estas moléculas funcionar como sinais nas complexas interacções celulares. Em 2006, Lamport e

colaboradores propuseram um modelo para explicar o fluxo dinâmico de AGPs, em que a âncora

12

GPI seria clivada, permitindo que as AGPs passassem da membrana plasmática para o espaço

periplasmático, deste espaço para a parede celular e, por fim, para o espaço extracelular.

1.6 AGPs no trajecto do tubo polínico

Vários estudos identificam e sugerem o envolvimento de AGPs específicas na reprodução

sexuada das plantas. Estudos recentes de Acosta-García e Vielle-Calzada (2004) revelaram que uma

AGP clássica, a AGP18, é essencial para a iniciação da gametogénese feminina em A. thaliana. A

AGP18 é expressa não só nas células do tecido reprodutor feminino (célula mãe do megásporo,

células do nucelo adjacente, megásporo funcional e gametófito feminino), mas também no embrião

em desenvolvimento e no grão de pólen maduro. Em mutantes AGP18-RNAi, não ocorre

crescimento nem divisão mitótica do megásporo, não havendo formação do gametófito feminino,

indicando que esta AGP é fundamental para a iniciação da gametogénese feminina.

Estudos de RT-PCR mostraram que os genes de duas outras AGPs clássicas, AGP6 e AGP11,

são expressos especificamente nos grãos de pólen e tubos polínicos (Pereira et al., 2006), tendo

sido posteriormente verificado que de facto estão envolvidas no desenvolvimento do grão de pólen

(Coimbra et al., 2009) e no crescimento do tubo polínico em A. thaliana (Coimbra et al., 2009).

Em Nicotiana tabacum foram identificadas AGPs específicas do tecido de transmissão, as

proteínas TTS (transmitting tissue-specific), e relacionadas com o direccionamento do tubo polínico

para os óvulos. Este estudo mostrou que estas proteínas estimulam o crescimento do tubo polínico

in vitro, atraem os tubos polínicos em sistemas de cultura semi-in vivo e são necessárias para o

crescimento óptimo do tubo polínico in vivo, funcionando como uma fonte de nutrientes e moléculas

de adesão para os tubos polínicos em crescimento (Cheung et al., 1995).

Recentemente, Coimbra e colaboradores (2007), mostraram que as AGPs funcionam também

como marcadores moleculares durante o desenvolvimento do pistilo de Arabidopsis. A marcação

para estas proteínas surge nas células da região central do estigma e do tecido de transmissão do

estilete, ou seja, no trajecto seguido pelo tubo polínico na fase inicial do seu crescimento. O mesmo

tipo de marcação tinha sido anteriormente observado noutras espécies como Amaranthus

hypocondriacus (L.), Actinidia deliciosa (A. Chev.) (Coimbra e Duarte, 2003), Nicotiana alata (Wu et

al., 2001) e Nicotiana tabacum (Cheung et al., 1995). Ainda no mesmo estudo, Coimbra e

colaboradores (2007) observaram a presença selectiva e extremamente específica de epítopos de

AGPs nas células gametofíticas, nas células do tegumento micropilar, do nucelo micropilar e do

13

aparelho filiforme de Arabidopsis. Outros trabalhos de imunolocalização de AGPs realizados

anteriormente em A. hypochondriacus (Coimbra e Salema, 1997) e A. deliciosa (Coimbra e Duarte,

2003) revelaram um padrão de marcação dos epítopos das AGPs semelhante, ou seja, um padrão

de marcação que corresponde precisamente ao trajecto seguido pelo tubo polínico, na fase final do

seu processo de direccionamento até atingir o saco embrionário. Estes dados sugerem o possível

envolvimento das AGPs no processo de atracção e direccionamento do tubo polínico.

Em 2001, Higashiama e colaboradores identificaram as sinergídeas como fonte de moléculas

de atracção para o tubo polínico, mas nenhum estudo, até agora, identificou a natureza bioquímica

desta molécula de atracção em A. thaliana. Os resultados obtidos em Arabidospsis e noutras

espécies, e a possível função das AGPs como moléculas sinal, permitem levantar a hipótese do seu

envolvimento no processo de direccionamento do tubo polínico até ao saco embrionário. A forte

marcação, muito específica, com MAbs, da parede do saco embrionário e das sinergídeas, mais

precisamente do aparelho filiforme, é uma forte indicação de que as AGPs poderão ter alguma

função relacionada com as secreções destas células, através do micrópilo. A marcação dos

tegumentos que envolvem o micrópilo sugere que estas moléculas, ou os resíduos de açúcares por

elas libertados, poderão estar relacionados com o fenómeno de atracção do tubo polínico em

crescimento até ao saco embrionário. O mecanismo molecular de acção das AGPs é ainda

desconhecido, principalmente devido às dificuldades impostas pela estrutura bastante complexa

destas glicoproteínas. Mas, por outro lado, a estrutura complexa da sua porção glicosídica torna as

AGPs uma potencial fonte de pequenas moléculas de sinalização, como oligossacarídeos

biologicamente activos (Coimbra et al., 2007).

Será de enorme interesse determinar que sinais são percepcionados pelo tubo polínico

durante o seu direccionamento até ao saco embrionário, bem como determinar se estes sinais são

específicos para as diferentes espécies, e determinar se as AGPs ou fragmentos de AGPs estarão

entre os sinais responsáveis por este direccionamento, conforme os dados de imunocitoquímica

sugerem.

1.7 Objectivos

O objectivo central do presente trabalho é produzir ferramentas que permitam identificar os

genes de AGPs de A. thaliana que podem estar envolvidos nos mecanismos de sinalização que

14

ocorrem durante o processo de dupla fecundação, mais precisamente durante o direccionamento

do tubo polínico para o saco embrionário. Para tal:

(i) seleccionar-se-ão as AGPs expressas nos tecidos femininos por análise de dados de

experiências de microarrays relativos à expressão das AGPs nos carpelos, nas sinergídeas, na célula

central, na oosfera, no pólen e em gâmetas masculinos e atendendo-se à similaridade entre as

diferentes proteínas;

(ii) isolar-se-ão sequências da região promotora de 7 genes de AGPs previamente

seleccionadas em (i) (AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP 15, AGP20 e AGP23) e estas serão usadas

para a obtenção de construções com GFP;

(iii) por último, plantas que expressam a GFP sob o controlo de sequências dos promotores

endógenos das AGPs seleccionadas serão obtidas para futura localização destas proteínas nos

tecidos do pistilo.

15

2. Materiais e métodos

2.1 Material vegetal e condições de crescimento

Foram usadas plantas de Arabidopsis thaliana (L.) variedade selvagem (ecótipo Columbia 0

[Col 0]) (NASC, The European Arabidopsis Stock Center). As sementes foram colocadas

directamente em vasos com terra. Estes permaneceram na obscuridade, a 4ºC durante 3 dias, após

os quais foram transferidos para uma câmara de crescimento com um fotoperíodo de dias curtos

(9h de luz, 22ºC, 70% humidade relativa). Após 3 a 4 semanas, as plantas foram transferidas para

um fotoperíodo de dias longos (16h de luz, 22ºC, 70% humidade relativa).

2.2 Alinhamento de sequências proteicas

Todas as sequências proteicas foram obtidas a partir do NCBI (National Center for

Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Foi feito o alinhamento múltiplo das

sequências proteicas das diferentes AGPs de Arabidopsis thaliana, e obteve-se uma àrvore

filogenética utilizando o T-Coffee (http://www.igs.cnrs-mrs.fr/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi,

Notredame et al., 2000). Os alinhamentos daqui resultantes foram tratados utilizando o software

GeneDoc, versão 2.6 (http://www.nrbsc.org/downloads, Nicholas et al., 1997). A árvore filogenética

obtida no T-Coffe foi desenhada utilizando o software TreeView, versão 1.4

(http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html, Page, 1996).

2.3 Estirpes bacterianas e vectores

Neste estudo foram utilizadas as seguintes estirpes bacterianas: Escherichia coli estirpe

DH5α (Hanahan, 1983), Escherichia coli estirpe TOP10 (Invitrogen) e Agrobacterium tumefaciens

estirpe GV3101::pMP90::pSOUP (Koncz e Shell, 1986), e os seguintes vectores: pENTR/D-TOPO

(Invitrogen) e pNLS3xGFPnost-pGII (Shinobu Takada, Universidade de Tübingen, modificado por

Milly Ron, Universidade da California, Berkeley).

16

2.3.1 Meios e condições de crescimento

Para as culturas de células de E. coli foi utilizado o meio de Luria Bertani (LB) (bacto-triptona

1% [p/v], extracto de levedura 0,5% [p/v] e NaCl 1% [p/v] para os meios líquidos e com agar 1,5 %

[p/v] para os meios sólidos). Todas as culturas de E. coli foram incubadas a 37ºC, durante 12 - 16

h . Para as culturas de células de A. tumefaciens foi utilizado o meio YEP (bacto-peptona 1% [p/v],

extracto de levedura 1% e NaCl 0,5% [p/v] para os meios líquidos e com agar 1,5 % [p/v] para os

meios sólidos). Todas as culturas de A. tumefaciens foram incubadas a 28ºC, durante 2 dias. Todos

os meios de cultura foram esterilizados durante 20 min a 120ºC num autoclave. Os meios sólidos

foram armazenados a 4ºC e os meios líquidos à temperatura ambiente. Em todos os meios

suplementados com antibióticos, estes foram adicionados após esterilização do meio, e estes

conservados a 4ºC. Para a conservação das bactérias contendo os plasmídeos de interesse, as

culturas bacterianas foram armazenadas em stocks de glicerol 40% a -80ºC.

2.3.2 Preparação de células de E. coli DH5α competentes

Para a preparação de células de E. coli DH5α competentes foi utilizado um método descrito

por Inoue et al. (1990), com pequenas alterações. Foi inoculada uma colónia isolada de E. coli em

5 mL de meio LB líquido e esta cultura foi incubada a 37ºC, com agitação a 250 rpm, durante 12 -

16 h. Esta cultura foi adicionada a 250 mL de SOB (triptona 2% [p/v], extracto de levedura 0,5%

[p/v], NaCl 10mM e KCl 2,5 mM aos quais foram adicionados, após esterilização, 20 mL de SOC

50x [glucose 1M, MgCl2 0,5 M e MgSO4 0,5 M]) e foi incubada a 18ºC, com agitação a 250 rpm, até

que o valor de absorvância a 600 nm estivesse próximo de 0,6. Atingido este valor de absorvância a

cultura foi arrefecida em gelo, com agitação durante 10 min. A partir deste ponto todos os passos

seguintes foram efectuados em gelo. As células foram depois recolhidas por centrifugação a 3000

rpm (SORVALL Evolution, rotor SLA-1500) durante 15 min a 4ºC. O sobrenadante foi removido e o

sedimento ressuspendido em 80 mL de tampão TB a 4ºC (PIPES 10 mM, MnCl2 55 mM, CaCl2 15

mM e KCl 250 mM, pH 6,7 com KOH, armazenado a 4ºC). Esta suspensão celular foi mantida em

gelo durante 10 min após os quais foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 min a 4ºC. As células

foram ressuspendidas em 20 mL de tampão TB a 4ºC suplementado com DMSO a uma

17

concentração final de 7% (v/v). As células foram divididas por alíquotas de 150 µL, congeladas

imediatamente em azoto líquido e armazenadas a -80ºC.

2.3.3 Transformação de células de E.coli TOP10 e E.coli DH5α

A transformação de células de E. coli foi efectuada utilizando o método de choque térmico.

As células de E. coli foram descongeladas em gelo e foram adicionados 10 – 100 ng de DNA (1 - 5

µL) a uma alíquota de E. coli One Shot TOP10 (Invitrogen) ou a 150 µL de células de E. coli DH5α

competentes. Estas foram incubadas em gelo durante 30 min. De seguida foi provocado um choque

térmico transferindo as células rapidamente para um banho a 42ºC durante 30 segundos. Após o

choque térmico as células foram mantidas durante 5 minutos em gelo. Foram depois adicionados

250 µL de SOC (Invitrogen) e incubados a 37ºC durante 1 h com agitação a 150 – 200 rpm. As

células foram depois espalhadas em placas com meio LB sólido suplementado com canamicina 50

µg/mL e incubadas a 37ºC, durante 12 - 16 h.

2.3.4 Preparação de células de A. tumefaciens gv3101::pMP90::pSOUP competentes

Para a preparação de células de A. tumefaciens competentes foi inoculada uma colónia de A.

tumefaciens isolada em 5 mL de meio YEP líquido suplementado com rifampicina 50 µg/mL

(resistência cromossómica), gentamicina 25 µg/mL (resistência do plasmídeo Ti) e tetraciclina 2

µg/mL (resistência do pSOUP) e incubada a 28ºC durante 2 dias, com agitação a 150 rpm. Estes 5

mL foram inoculados em 200 mL de meio YEP líquido suplementado com rifampicina 10 µg/mL,

gentamicina 15 µg/mL e tetraciclina 2 µg/mL e incubados a 28ºC com agitação a 150 rpm até que

a absorvância a 600 nm se encontrasse entre 0,5 – 1. Após atingir a absorvância desejada a

cultura foi arrefecida em gelo durante 10 min. Esta cultura foi depois centrifugada a 5300 rpm

(rotor SLA 1500, SORVALL Evolution), durante 20 min a 4ºC. A partir deste passo as células foram

mantidas sempre em gelo. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em

200 mL de tampão TE (Tris-HCl 100mM e EDTA 10 mM, pH8), previamente arrefecido a 4ºC. As

células foram novamente centrifugadas a 5300 rpm (rotor SLA 1500, SORVALL Evolution), durante

20 min a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 15 mL de meio LB.

18

Estas foram divididas por alíquotas de 200 µL, congeladas imediatamente em azoto líquido e

posteriormente armazenadas a -80ºC.

2.3.5 Transformação de A. tumefaciens

A transformação de células de A. tumefaciens foi efectuada utilizando o método de freeze–

thaw (Weigel e Glazebrook, 2002). As células foram descongeladas em gelo e foram adicionados

0,5 – 10 µg (10 – 30 µL). Estas células foram mantidas 5 min em gelo e depois transferidas para

azoto líquido durante 5 min. Foram depois submetidas a choque térmico por incubação num banho

a 37ºC durante 5 minutos. Após este choque térmico foram adicionados 300 µL de meio YEP

líquido às células e estes foram incubados a 28ºC, durante 4 h com agitação a 150 rpm. De

seguida, a suspensão bacteriana foi espalhada sobre meio YEP sólido suplementado com

rifampicina 10 µg/mL, gentamicina 15 µg/mL, tetraciclina 2 µg/mL e canamicina (50 µg/mL). As

placas com as bactérias foram depois incubadas a 28ºC, durante 2 dias.

2.4 Técnicas de manipulação e análise de DNA

2.4.1 Extracção de DNA genómico de A. thaliana

O DNA genómico foi extraído de acordo com o método de Li e Chory (1998) com algumas

alterações. Cerca de 300 mg de tecido foliar foram congelados em azoto líquido e macerados com

um pilão e um almofariz, pré-arrefecidos (-80ºC). O material vegetal foi transferido para um tubo

tipo Falcon e após evaporação do azoto líquido foram adicionados 5 mL de tampão de extracção

(Tris–HCl 100 mM pH 7.5, NaCl 500 mM, EDTA 50 mM, β-mercaptoetanol 10 mM e SDS 1% [v/v])

pré-aquecido a 65ºC. Após agitação vigorosa esta suspensão foi incubada a 65ºC durante 10 min,

com agitação ocasional. De seguida foram adicionados 1,67 mL de acetato de potássio 5 M, e após

agitação vigorosa a suspensão foi incubada em gelo durante 20 min. O material foi depois

centrifugado a 30000g (SORVALL Evolution, rotor SLA-1500) durante 20 min, a 4ºC. O

sobrenadante foi transferido para um novo tubo e adicionou-se um volume de isopropanol

equivalente ao volume inicial da mistura, sendo o tubo depois incubado a -20ºC durante 30 min.

19

Para recuperação dos ácidos nucleicos a mistura foi novamente centrifugada a 20000g (SORVALL

Evolution, rotor SLA-1500) durante 15 min, a 4ºC. O sobrenadante foi removido e o DNA seco com

os tubos invertidos sobre papel absorvente durante c. de 40 min. O DNA foi ressuspendido em 500

µL de tampão TE (Tris-HCL 50 mM pH 8 e EDTA 10 mM pH8), transferido para um tubo Eppendorf

e centrifugado durante 10 min a 4500 rpm. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo ao

qual se adicionou RNAse 0,1 mg/mL, tendo esta mistura sido incubada a 37ºC durante 1 h. Foram

adicionados 500 µL de fenol:clorofórmio (1:1) e toda a solução foi centrifugada durante 10 min a

4500 rpm. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf e o passo de extracção

com fenol:clorofórmio foi repetido. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e foram

adicionados 50 µL de acetato de sódio 3 M, pH 4,8 e 350µL de isopropanol. Esta mistura foi

incubada a -20ºC durante 12 – 16 h. No dia seguinte o DNA foi centrifugado durante 10 min a

4500 rpm. Após remoção do sobrenadante foram adicionados 500 µL de etanol 75% a -20ºC. O

etanol foi removido e o DNA foi seco num Speed-Vac durante 5 min e ressuspendido em 100 µL de

tampão TE, sendo armazenado a 4ºC.

2.4.2 Electroforese em gel de agarose

Os géis de agarose (0,8 - 1% [p/v] em tampão TAE 1x [Trizma-base 40 mM, ácido acético

glacial 10% e EDTA 10 mM]) continham brometo de etídio 250 ng/mL. A separação electroforética

foi feita em tampão TAE 1x. Após electroforese os fragmentos de DNA foram visualizados utilizando

um transiluminador de UV e fotografados com o Gene Genius Bio Imaging System (Syngene). Como

marcadores de tamanhos moleculares foram utilizados o GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder

(Fermentas) e o Lambda DNA/Eco 471 (AvaII) - Marker13 (Fermentas).

2.4.3 Reacção da polimerase em cadeia – PCR

Todos os PCRs foram efectuados num UNO-Thermoblock Thermal Cycler ou no TGradient

Thermal Cycler (ambos da Biometra), quer para as reacções de PCR com Taq DNA polymerase

(Fermentas) quer para as reacções de PCR com Phusion High Fidelity DNA polymerase

(Finnzymes). Todos os testes de oligonucleótidos de iniciação e confirmação de bactérias que

contêm o plasmídeo recombinante por PCR de colónias foram efectuados com a Taq DNA

20

Polymerase. Para a amplificação dos fragmentos de regiões promotoras das diferentes AGPs foi

utilizada a Phusion High Fidelity DNA Polymerase, de forma a minimizar a incorporação de erros

nas sequências amplificadas. O gene da actina3 (ACT3) foi utilizado como gene de referência para

todos os PCRs. Os programas de PCR para a Taq DNA polymerase consistiram num primeiro passo

de desnaturação (2 min, 95ºC) seguido por 30 a 35 ciclos de desnaturação (45 segundo, 95ºC), de

emparelhamento (45 segundos, Ta do par de oligonucleótidos iniciadores) e de extensão (1 min por

1kb de amplificado, 72ºC) seguidos por um passo de extensão final (5 - 10 min, 72ºC) e um passo

de arrefecimento (4ºC). Foram utilizadas misturas de reacção de 25 µL cujos componentes estão

descritos na tabela 2.1.

Tabela 2.1: Componentes das reacções de PCR utilizadas para testes de oligonucleótidos de iniciação e

PCR de colónias de bactérias.

Reagentes Volume por 25 µL de reacção Concentração final

H2O estéril até 25 µL Vf -

Tampão 10x com KCl 2,5 µL 1 x

Mistura de nucleótidos (dNTPs) 10 mM 0,5 µL 0,2 mM

Oligonucleótido iniciador 5’ 10 µM 0,5 µL 0,2 µM


MgCl2 25 mM 2 µL 2 mM

DNA molde - -

Taq DNA polymerase 5 U/µL 0,15 µL 0,75 U

Vf – volume final

Para os testes de oligonucleótidos de iniciação foram usados c. de 0,5 - 1 µL de DNA molde que

correspondem a cerca de 50-100 ng de DNA. Para as reacções de PCR de colónias foi utilizada

uma pequena porção da colónia a testar. A temperatura de emparelhamento ou annealing (Ta) para

todos os oligonucleótidos de iniciação foi determinada por PCR com gradiente de temperatura. A

temperatura de cada par de oligonucleótidos de iniciação foi calculada com base na equação 2.1, e

em todos os PCR com gradiente de temperatura foram utilizadas temperaturas 5ºC acima e 5ºC

abaixo da Tm de cada oligonucleótido de iniciação:

TACGTm 24 (2.1)

21

Foram amplificados fragmentos das regiões promotoras de 7 AGPs: da AGP1, da AGP9, da

AGP10, da AGP12, da AGP15, da AGP20 e da AGP23 utilizando os oligonucleótidos de iniciação

descritos na tabela 2.2, a partir de DNA genómico extraído de folhas de A. thaliana (2.4.1). As

sequências promotoras foram isoladas, sempre que possível, desde o final da UTR do gene mais

próximo situado a montante, até ao codão de iniciação do gene de interesse. Para os genes que

apresentavam regiões promotoras com mais do que cerca de 3000 bp foram isoladas sequências

desde 3000 – 3200 bp a montante do codão de iniciação da tradução do gene de interesse até ao

respectivo codão de iniciação. A todos os oligonucleótidos de iniciação à direita foi adicionada uma

sequência CACC (ver oligonucleótidos representados a negrito na tabela 2.2) à extremidade 5’ de

modo a permitir a clonagem direccional destas sequências de DNA no vector pENTR/D-TOPO

(Invitrogen).

Tabela 2.2: Sequências dos oligonucleótidos de iniciação utilizados para amplificação dos fragmentos das regiões promotoras das AGPs (representados no sentido 5’→3’).

Nome Locus Sequências dos oligonucleótidos de iniciação

AGP1 At5g64310 F CACCGTCATATTGACTCTGAGCCATAAACTC

R CAAAAAAGAGAGAGATTCGAATTTAGC

AGP9 At2g14890 F CACCATTGGCCACAGTTCACCTGC R TTTTGCTTTTGCTTTTTCTCTCTG

AGP10 At4g09030 F CACCAAGTGGATAATCTGGCGCGA R GAAGGATCTTGTTTCGAGCAGAG

AGP12 At3g13520 F CACCGTTGGGGCCACATTTGTAGT

R CTTCTAAGTGCAAAAGAGGAG

AGP15 At5g11740 F CACCCCATTTTCTTTGATTGTAGCAAGTTAG

R TTCAAAGATTTTGTTGTGAGAGATAAAG

AGP20 At3g61640 F CACCGAGCAGTAGTAAGTGTTGGCACGT

R CTCAAGATTTTACGGAGGACAAAAT

AGP23 At3g57690 F CACCCATCGTGAATATTTATAGGACAAGTTTATG

R GAGACCTGAAAGGCTTTTCTTTTC

ACT3 At2g37620 F GATTTGGCATCACACTTTCTACAATG

R GTTCCACCACTGAGCACAATG

F – oligonucleótido de iniciação direito; R – oligonucleótido de iniciação esquerdo.

22

Os programas de PCR para a Phusion High Fidelity DNA Polymerase consistiram num

primeiro passo de desnaturação (30 segundos, 98ºC) seguido por 30 a 35 ciclos de desnaturação

(5 - 10 segundos, 98ºC), de emparelhamento (30 segundos, Ta do par de oligonucleótideos

iniciadores) e de extensão (15 - 30 segundos por 1kb de amplificado, 72ºC) seguidos por um passo

de extensão final (5 - 10 min, 72ºC) e um passo de arrefecimento (4ºC). Foram utilizadas misturas

de reacção de 50 µL cujos componentes estão descritos na tabela 2.3.

Tabela 2.3: Componentes das reacções de PCR utilizadas para a amplificação dos fragmentos de

regiões promotoras das diferentes AGPs.

Reagentes Volume por 50 µL de reacção Concentração final

H2O até 50 µL Vf -

Tampão Phusion HF 5x 10 µL 1 x

Mistura de nucleótidos (dNTPs) 10 mM 1 µL 0,2 mM



DNA molde 1,5 µL 100 – 150 ng

Phusion DNA polymerase 2 U/ µL 0,5 µL 0,02 U/ µL

Vf – volume final

Todos os produtos de PCR foram analisados por electroforese em gel de agarose (2.4.2). No

caso das reacções para a síntese dos fragmentos de DNA correspondentes às regiões promotoras,

todo o volume de reacção (50 µL) foi carregado no gel e as bandas de interesse foram excisadas o

mais rápido possível de modo a evitar a danificação dos fragmentos de DNA (2.4.6).

2.4.4 Extracção de RNA de óvulos de A. thaliana

Os óvulos foram isolados a partir de flores nos estados de desenvolvimento 12 e 13 (Smyth

et al., 1990). As flores foram cortadas pelo receptáculo e as sépalas, pétalas e estames foram

removidos. Os óvulos foram extraídos utilizando agulhas hipodérmicas e colocados imediatamente

em tampão de lise RLT do RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen), em gelo. Em cada novo processo de

extracção o material vegetal foi colocado em novo tampão de lise RLT. No final de cada extracção

todo o material foi armazenado a -20ºC. As amostras foram descongeladas apenas para a extracção

23

do RNA. O RNA de todas as amostras foi extraído utilizando o RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)

seguindo as instruções do fabricante. As amostras de RNA foram tratadas com DNaseI (Promega)

para evitar a contaminação com DNA. Para analisar a quantidade e a qualidade do RNA extraído

uma alíquota desta amostra, 5 µL, foi separada por electroforese em gel de agarose 1,5% (2.4.2).

2.4.5 RT-PCR em tempo real

As reacções de transcrição reversa foram feitas com o Reverse Transcription System

(Promega), a 42ºC (30 min), usando como oligonucleótido de iniciação oligo(dT)15. O cDNA dos

óvulos de A. thaliana foi amplificado utilizando o iQ™ SYBR® Green Supermix no termociclador iQ™

5 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). A expressão do gene da ubiquitin-conjugating enzyme

(UBC9) foi utilizada como controlo e para a normalização dos resultados. Foram efectuados

duplicados de todas as reacções de RT-PCR em tempo real para todos os genes. As misturas de

reacção foram feitas para 25 µL de volume total em placas de polipropileno para 96 reações

(Microseal Semi-Skirted 96-well PCR Plates, Bio-Rad) fechadas com adesivos para microplacas

(Optical Sealing Tape, Bio-RAd), contendo os componentes descritos na tabela 2.4. Os

oligonucleótidos de iniciação utilizados nesta experiência estão listados na tabela 2.5.

Tabela 2.4: Componentes das reacções de RT-PCR em tempo real utilizadas para amplificação do cDNA de óvulos de A. thaliana

Reagentes Volume por 25 µL de

reacção Concentração final

H2O estéril 10,5 µL -

iQ™ SYBR® Green Supermix 2x 12,5 µL 1 x



cDNA molde 1 µL -

Vf – volume final

Os programas de PCR utilizados consistiram num primeiro passo de desnaturação. Os

programas de PCR utilizados consistiram num primeiro passo (4 min, 94ºC), seguido por 40 ciclos

de desnaturação (30 segundos, 94ºC), de emparelhamento (30 segundos, Ta do par de

oligonucleótidos iniciadores) e de extensão (30 segundos, 72ºC). Obtiveram-se as curvas de

24

dissociação para cada gene, aquecendo as amostras de 55ºC até 95ºC para verificar a

especificidade da amplificação de forma a confirmar a ausência de formação de dímeros de

oligonucleótidos de iniciação ou de qualquer outro produto inespecífico. Foram obtidas curvas

padrão utilizando uma série de diluições (10-1, 10-2, 10-3) de cDNA de óvulos para todos os genes, em

duplicados, de modo a determinar a eficiência dos oligonucleótidos de iniciação. Foram obtidas as

curvas de amplificação e valores de CT (threshold cycle), número de ciclos em que se acumula uma

quantidade de produto amplificado suficiente para gerar um sinal de fluorescência detectável) para

cada gene. Os dados foram analisados utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical

System Software versão 2.0 (Biorad). Todos os valores de CT foram exportados para o MS Excel

(Microsoft) e analisados utilizando o método CT ( Livak e Schmittgen, 2001).

Tabela 2.5: Sequências dos oligonucleótidos de iniciação utilizados para amplificação do cDNA de óvulos de A. thaliana (representados no sentido 5’→3’).

Nome Locus Sequências dos oligonucleótidos de iniciação

AGP1 At5g64310 F AATCCTCTGCTTCACCAC R CTTCAGTCGGAGAATCGG

AGP9 At2g14890 F ATCTGTATCGTCCTCATCG R ATGTTGTGACTGGTGGTG

AGP10 At4g09030 F CTCGCTGCTGGATCTTTAG

R CGCTAACTCAATTCTTAATACAAC

AGP12 At3g13520 F CACAACTCATCATTCGCACCAAAG R CCACAATAGCCACCATCAACACC

AGP15 At5g11740 F CACCAGCACCAAGTCCTAC

R ACGAAATCACCATCACAGTAAC

AGP16 At2g46330 F TCATCATTTTCGTCGGATCA R ACCACCATTAGCAAATACGC

AGP20 At3g61640 F GGTTTTTGGTTGTCCGTGTC R AGCGAATAAAGCGATTACGG

AGP21 At1g55330 F TCATCACAACACAAATCAAAACA

R TGGTACAAACATGGCAGCAT

UBC9 At4g27960 F GTTTCACCACCCTTTCTTC

R AAATCCCACGATCAAATTCC

F – oligonucleótido de iniciação direito; R – oligonucleótido de iniciação esquerdo.

25

2.4.6 Recuperação de DNA a partir de géis de agarose

Todas as bandas contendo DNA de interesse foram rapidamente excisadas do gel de agarose

de forma a minimizar os danos causados pela exposição aos raios UV. O DNA foi recuperado

através do QIAquick Gel Extraction Kit (Quiagen), seguindo as normas do fabricante.

2.4.7 Minipreparação de DNA plasmídico

Todas as extracções de DNA plasmídico para rastreio de clones positivos e utilização nos

processos de sub-clonagem foram realizadas recorrendo ao High-Speed Plasmid Mini kit (Avegene)

seguindo as instruções do fabricante.

2.4.8 Digestão de DNA plasmídico

A digestão de DNA plasmídico para rastreio após clonagem e para clonagem no vector de

destino foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante das enzimas de restrição

utilizadas (Fermentas e New England BioLabs). Os resultados das restrições foram analisadas por

electroforese em gel de agarose (2.3.2), e no caso das clonagens, a banda que continha o

fragmento de DNA de interesse foi excisada e purificada conforme descrito acima (2.3.6).

2.4.9 Sequenciação

Todas as sequenciações foram efectuadas pela empresa 4 Base Lab (Alemanha). Todos os

dados provenientes das sequenciações foram analisados utilizando os programas Chromas versão

1.45 (Conor McCarthy, Griffith University) e o Clustal w

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html, Larkin et al., 2007).

26

2.5 Produção das linhas de A. thaliana transgénicas

2.5.1 Ligação dos fragmentos amplificados no vector pENTR/D-TOPO

As construções proAGP::NLS:3xGFP utilizadas para a produção de linhas de A. thaliana que

expressam a GFP sob o controlo dos promotores endógenos das diferentes AGPs foram obtidas

utilizando o sistema de clonagem Gateway (Invitrogen). A tecnologia Gateway é um sistema

universal de clonagem e sub-clonagem de sequências de DNA. Uma vez inseridas neste sistema as

sequências de DNA podem ser facilmente transferidas entre diferentes vectores utilizando locais

específicos de recombinação. O vector pENTR/D-TOPO permite uma clonagem fácil e rápida de

fragmentos de DNA com extremidades cegas, constituindo uma forma de entrada no sistema

Gateway. Estes vectores possuem locais de recombinação específicos attL para recombinação do

vector de entrada com um vector de destino, um local de clonagem direccional que permite a

ligação de produtos de PCR de extremidades cegas e possuem o gene de resistência à canamicina

para selecção em E. coli (ver anexo I para representação esquemática das reacções de

recombinação). As sequências das regiões promotoras das diferentes AGPs foram obtidas por PCR

(2.4.3) e purificadas a partir de géis de agarose (2.4.6). Estas sequências foram clonadas no vector

de entrada pENTR/D-TOPO (Gateway, Invitrogen) utilizando o pENTR Directional TOPO Cloning Kit

(Gateway, Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante, com algumas alterações. As reacções

de ligação constituídas pelos componentes descritos na tabela 2.6 foram incubadas durante 5 min

à temperatura ambiente e depois transferidas para gelo.

Tabela 2.6: Componentes das reacções de ligação para o vector pENTR/D-TOPO.

Reagentes Volume por 3 µL de reacção

Concentração final

Produto de PCR 0,25 - 2 µL razão molar 1:1

Solução Salina 0,5 µL NaCl 0,2 M e MgCl2 0,01M

H2O estéril até 3 µL Vf -

Vector pENTR/D-TOPO 0,5 µL 1,25 ng/µL

Vf – volume final

27

De seguida procedeu-se à transformação de uma alíquota de E. coli One Shot TOP10

(Invitrogen) por cada construção (2.3.3). Os clones positivos foram seleccionados primeiro através

de PCR de colónias (2.4.3), e depois confirmados por análise de restrição (2.4.8), utilizando para

isso duas enzimas de restrição que fazem a excisão do fragmento de inserção. Todos os vectores

obtidos foram sequenciados (2.4.9) utilizando o oligonucleótidos de iniciação universal M13

Forward e o oligonucleótido de iniciação esquerdo utilizado para amplificação de cada uma das

sequências por PCR (tabela 2.2), de modo a confirmar a presença do fragmento de inserção no

local e na orientação correctos.

2.5.2 Linearização dos vectores de entrada

Após sequenciação dos vectores obtidos em 2.5.1 procedeu-se à introdução das sequências

inseridas no vector pENTR/D-TOPO no vector de destino. Antes deste passo foi necessário linearizar

estes vectores com enzimas de restrição adequadas, uma vez que o vector de destino possui o

mesmo gene de resistência que o vector de entrada, a canamicina, evitando-se assim o

aparecimento de falsos positivos nesta segunda clonagem. Foram usadas diferentes enzimas para

os diferentes vectores de modo a evitar o corte do fragmento de interesse e o corte dos locais de

recombinação attL (2.4.8). Todas as digestões foram efectuadas durante 12 - 16 h, de modo a

garantir que todos os vectores presentes na solução eram linearizados. Os resultados das restrições

foram analisadas por electroforese em gel de agarose (2.3.2), e a banda correspondente ao vector

linearizado foi excisada e purificada conforme descrito acima (2.3.6).

2.5.3 Obtenção das construcções pAGP::NLS:3xGFP

Para a localização celular das AGPs seleccionadas foi utilizado o vector de destino

pNLS3xGFPnost-pGII de Shinobu Takada (Universidade de Tübingen, Alemanha) no qual foi

introduzida uma cassete Gateway (Invitrogen) utilizando os locais de corte da enzima de restrição

Sal I, (Milly Ron, Universidade da Califórnia, Berkeley). As sequências promotoras foram transferidas

para o vector de destino através de uma reacção para cada uma das inserções (Gateway,

Invitrogen) utilizando o Gateway LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen), seguindo as instruções do

28

fabricante, com algumas alterações. As reacções de ligação constituídas pelos componentes

descritos na tabela 2.7 foram incubadas durante 1 h a 25ºC.

Tabela 2.7: Componentes das reacções LR.

Reagentes Volume por 4 µL de

reacção Concentração final

Vector de entrada 0,5 – 3,5 µL 50 – 150 ng

Vector de destino 0,5 µL 150 ng/µL

Tampão TE, pH 8 até 4 µL Vf 1x

LR Clonase II enzyme mix 1 µL 1x

Vf – volume final

Estas reacções foram terminadas pela adição de 1 µL de solução de proteinase K 2 µg/µL

(Invitrogen) e incubação a 37ºC durante 10 min. De seguida procedeu-se à transformação de 100

µL de E. coli DH5α por cada construção (2.3.3) e selecção das colónias que contêm o plasmídeo

recombinante por análise de restrição (2.4.8). Depois de efectuadas todas as reacções LR, os

plasmídeos contendo as construções pAGP::NLS:3xGFP foram inseridos em A. tumefaciens estirpe

GV3101::pMP90::pSOUP por (2.3.5). Como o A. tumefaciens produz poucas cópias dos plasmídeos

que contém, primeiro procedeu-se à extracção dos plasmídeos das bactérias transformadas (2.4.7),

depois à tranformação de E. coli DH5α (2.3.3) com estes plasmídeos e por fim os clones positivos

foram selecionados por análise de restrição (2.4.8). Esta análise de restrição foi feita utilizando as

mesmas enzimas de restrição utilizadas para o rastreio de clones positivos após a reacção LR.

2.5.4 Transformação de A. thaliana pelo método de “floral dip”

Todas as transformações de A. thaliana foram efectuadas de acordo com o método descrito

por Clough e Bent (1998), com algumas alterações. Foram utilizadas plantas de A. thaliana que

apresentavam o maior número possível de gomos florais, de modo a aumentar a eficiência da

transformação. A estas plantas foram removidas a maioria das silíquas e flores abertas. Quando as

plantas apresentavam poucos gomos florais, 4 a 8 dias antes da transformação das plantas, as

inflorescências primárias eram removidas de modo a eliminar o efeito de dominância apical e

promover assim a produção de um maior número de inflorescências secundárias. Três dias antes

29

da transformação das plantas, as células de A. tumefaciens contendo os clones de interesse foram

inoculadas em 5 mL de meio YEP suplementado com rifampicina 10 µg/mL, gentamicina 15

µg/mL e tetraciclina 2 µg/mL e canamicina (50 µg/mL). Estas culturas foram incubadas durante 2

dias, a 28ºC, com agitação a 150 rpm. Após os dois dias, as diferentes culturas de A. tumefaciens

contendo os clones de interesse foram inoculadas em 200 mL de meio líquido YEP suplementado

com os mesmos antibióticos, e foram incubadas a 28ºC, com agitação a 150 rpm, durante 24 h.

Após as 24 h de incubação, as células foram centrifugadas a 6000 rpm durante 10 min, à

temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 200

mL de meio de infiltração (sacarose 5% e Silwet L-77 0,005% [OSi Specialties, Inc., Danbury, CT,

USA]). As flores foram depois mergulhadas nesta solução de infiltração contendo as células de A.

tumefaciens durante cerca de 30 segundos a 1 min, com alguma agitação, de modo a facilitar a

entrada da solução nos óvulos dos gomos florais. As plantas transformadas foram resguardadas

com sacos de plástico durante 12 - 16 h. No dia seguinte estes sacos foram removidos, e três

semanas depois procedeu-se à recolha das sementes.

30

3. Resultados

3.1 Selecção das AGPs

Num primeiro passo seleccionaram-se as AGPs com níveis de expressão génica relativa mais

elevados nos ovários. Para tal, recorreu-se a bases de dados disponíveis on-line, o Genevestigator

(http://genevestigator.ethz.ch; Zimmermann et al., 2004) e à base de dados Arabidopsis eFP

Browser (http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi; Winter et al., 2007). Foram ainda

utilizados dados de experiências de microarrays relativos à expressão das AGPs nas sinergídeas, na

célula central e na oosfera de Arabidopsis thaliana, resultados não publicados, gentilmente cedidos

pelo Laboratório do Prof. Dresselhaus, Universidade de Regensburg, e resultados de microarrays

obtidos com pólen com os gâmetas masculinos de Arabidopsis thaliana (Borges et al., 2008). Com

base nos dados de microarrays disponíveis on-line foram seleccionadas 3 AGPs clássicas: AGP1,

AGP9 e AGP10, e 5 péptidos AG: AGP12, AGP15, AGP16, AGP20 e AGP21. Os dados relativos às

experiências de microarrays nas sinergídeas, na célula central e na oosfera, bem como os dados de

microarrays de pólen e dos gâmetas masculinos permitiram fazer uma selecção mais específica,

sendo assim seleccionadas 4 AGPs clássicas: AGP1, AGP5, AGP9 e AGP10, e 6 péptidos AG:

AGP12, AGP15, AGP16, AGP20, AGP21 e AGP23. Nesta última selecção, escolheram-se as AGPs

que estavam presentes na célula central, na oosfera e nas sinergídeas, reduzindo-se assim o

número de proteínas candidatas para este estudo e tornando esta selecção mais específica.

3.2 Análise dos alinhamentos proteicos

Foi obtida uma árvore filogenética a partir do alinhamento múltiplo das sequências proteicas

das AGPs clássicas: AGP1, AGP2, AGP3, AGP4, AGP5, AGP6, AGP7, AGP9, AGP10, AGP11, AGP

25, AGP26 e AGP27, dos péptidos AG: AGP12, AGP13, AGP14, AGP15, AGP16, AGP20, AGP21,

AGP22, AGP23 e AGP24 e das AGPs ricas em lisina: AGP17, AGP18 e AGP19 (figura 3.1) através

do programa T-Coffee. As AGPs com domínios tipo-fasciclina (FLAs) foram excluídas desta análise

por não terem sido seleccionadas para este estudo, e, para além disso, estas AGPs possuem não só

domínios típicos das AGPs, mas também domínios de adesão celular, sendo por isso consideradas

31

AGP17

AGP1

AGP5

AGP18

AGP2

AGP10

AGP19

AGP7

AGP4

AGP9

AGP11

AGP6

AGP3

AGP12

AGP21

AGP13

AGP14

AGP22

AGP16

AGP20

AGP24

AGP15

AGP26

AGP25

AGP23

AGP27

Figura 3.1: Árvore filogenética obtida a partir do alinhamento múltiplo das sequências proteicas das AGPs clássicas,

dos péptidos AG e das AGPs ricas em lisina de Arabidopsis thaliana, utilizando o programa T-Coffee. AGPs clássicas:

AGP1, AGP2, AGP3, AGP4, AGP5, AGP6, AGP7, AGP9, AGP10, AGP11, AGP 25, AGP26 e AGP27; péptidos AG: AGP12,

AGP13, AGP14, AGP15, AGP16, AGP20, AGP21, AGP22, AGP23 e, AGP24; AGPs ricas em lisina: AGP17, AGP18 e

AGP19. As AGPs seleccionadas para este estudo, com base nos dados de microarrays, estão assinaladas com um

asterisco. A clade formada pelas AGP1 e AGP5 está realçada a amarelo, a clade formada pelas AGP12 e AGP21 está

realçada a roxo, e a clade formada pelas AGP16 e AGP20 está realçada a verde.

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

32

AGPs quiméricas (Johnson et al., 2003), podendo diminuir a exactidão do alinhamento obtido. A

análise da similaridade entre as diferentes sequências proteicas das AGPs poderá ajudar a prever se

duas ou mais proteínas poderão ou não exercer funções semelhantes devido ao elevado ou baixo

grau de similaridade das sequências, respectivamente.

Das AGPs seleccionadas a partir dos dados de microarrays, apenas algumas das sequências

apresentavam maior similaridade entre si, encontrando-se associadas no mesmo grupo. As

sequências proteicas da AGP1 e da AGP5, da AGP12 e da AGP21 e da AGP 16 e da AGP20, são as

que apresentam um maior grau de similaridade entre si. Já as restantes AGPs, AGP9, AGP10,

AGP15 e AGP23 não apresentam similaridades relevantes entre si. A AGP9 apresenta uma maior

similaridade com a AGP4, proteína não seleccionada para este estudo, e a AGP23 revela

similaridades elevadas com a AGP27, também não seleccionada para este trabalho.

3.3 Expressão de genes de AGPs nos óvulos

Uma vez que o objectivo deste trabalho é estudar os genes de AGPs presentes nos tecidos e

células gametofíticas femininas que estivessem possivelmente envolvidos no direccionamento do

tubo polínico até ao saco embrionário, todas as flores utilizadas nesta experiência foram recolhidas

num estado de desenvolvimento em que ainda não tivesse ocorrido polinização, mas em que o

pistilo já estivesse totalmente desenvolvido. Sendo assim, todas as flores que foram recolhidas

encontravam-se nas fases finais de desenvolvimento do estado 11, em que o pistilo já está bem

desenvolvido, embora ainda não se distingam os estiletes, e as anteras ainda não estão maduras,

no estado de desenvolvimento 12, em que o pistilo está totalmente desenvolvido e as anteras ainda

não estão maduras e nas fases iniciais de desenvolvimento do estado 13, imediatamente antes da

fase em que o estigma já está receptivo e a polinização pode ocorrer (Smyth et al., 1990). Após a

recolha das flores, os pistilos foram isolados e devidamente dissecados de modo a separar apenas

os óvulos. Todos estes procedimentos foram efectuados de modo a evitar ao máximo a injúria

provocada nos tecidos e a consequente alteração do programa de expressão génica.

A análise da expressão génica foi efectuada por RT-PCR em tempo real para os genes da

AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP15, AGP16, AGP20 e AGP21 como forma de confirmação dos

dados obtidos a partir dos microarrays de óvulos. No entanto, para os genes da AGP16 e da AGP21,

apesar de terem sido testadas diferentes condições de PCR, os oligonucleótidos de iniciação destes

dois genes não apresentaram eficiências adequadas para a realização das experiências de RT-PCR

33

em tempo real e as experiências efectuadas para o gene da AGP21 possuíam curvas de dissociação

que apresentavam mais do que um pico, indicando a formação de dímeros de primers.

Para todos os restantes genes foram obtidas as respectivas curvas de dissociação (anexo II).

Para todos os genes amplificados estas curvas apresentavam um único pico. Curvas padrão foram

também obtidas para todos os genes em estudo, determinando-se assim a eficiência dos pares de

oligonucleótidos iniciadores para amplificação dos diferentes genes de interesse. A eficiência de

todos os oligonucleótidos encontrava-se entre os 93–105 % (anexo III). Para a obtenção destas

curvas foi utilizada uma série de diluições (10-1, 10-2, 10-3) de cDNA de óvulos, para todos os genes.

Para a obtenção das curvas de amplificação foram utilizadas as diluições 10-2 de cDNA dos óvulos.

Uma vez que os diferentes oligonucleótidos de iniciação necessitavam de diferentes condições de

PCR para funcionaram em condições óptimas, reacções independentes tiveram de ser efectuadas

para cada um destes genes. Após a obtenção das curvas de dissociação e das curvas padrão para

cada um dos genes em estudo procedeu-se à aquisição das curvas de amplificação para todos os

genes. A partir destas curvas foram determinados os CT para cada um dos genes e a partir destes

valores foram obtidos os níveis de expressão relativa destes genes, utilizando o gene da UBC9 para

a normalização dos resultados através do método CT (Livak e Schmittgen, 2001).

Os resultados dos níveis de expressão relativas dos genes em estudo estão apresentados nas

figuras 3.2 a 3.7. Os resultados não revelaram diferenças significativas entre os níveis de expressão

dos genes em estudo e a expressão do gene de referência UBC9. Os níveis de expressão relativa do

gene da AGP1 são muito semelhantes aos níveis de expressão do gene de referência (figura 3.2).

Os genes da AGP9 e da AGP12 apresentam níveis de expressão relativa um pouco mais baixos do

que o gene de referência (figuras 3.3 e 3.5, respectivamente). Por sua vez os genes da AGP10 e da

AGP20 apresentam níveis de expressão relativa mais baixos do que o gene de referência (figura 3.4

e 3.7, respectivamente). O gene da AGP15 apresenta níveis de expressão relativa apenas

ligeiramente reduzidos em relação aos níveis de expressão do gene da UBC9 (figura 3.6).

34

AGP1UBC90

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Genes

Nív

eis

de e

xpre

ssão

rel

ativ

a

Figura 3.2: Gráfico representativo dos níveis de expressão relativa do gene da AGP1 utilizando como gene

de referência o gene da UBC9. As linhas indicam o erro padrão.

AGP9UBC90

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Genes

Nív

eis

de e

xpre

ssão

rel

ativ

a



AGP10UBC90

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Genes

Nív

eis

de e

xpre

ssão

rel

ativ

a



35

AGP12UBC90

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

Genes

Nív

eis

de e

xpre

ssão

rel

ativ

a



AGP15UBC90

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Genes

Nív

eis

de e

xpre

ssão

rel

ativ

a



AGP20UBC90

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Genes

Nív

eis

de e

xpre

ssão

rel

ativ

a



36

3.4 Amplificação dos fragmentos das regiões promotoras

Os fragmentos das regiões promotoras para os genes da AGP1, da AGP9, da AGP10, da

AGP12, da AGP15, da AGP20 e da AGP23 foram amplificados por PCR a partir de DNA genómico

de folha de Arabidopsis thaliana. Estes fragmentos foram posteriormente separados por

electroforese em gel de agarose (figuras 3.8 e 3.9).

5000 bp

1500 bp

500 bp

m 1 2 3 4

5000 bp

1500 bp

500 bp

m 1 2 3 4

Figura 3.8: Separação electroforética dos produtos de PCR correspondentes aos fragmentos das regiões promotoras

das AGPs: (1) AGP1; (2) AGP15; (3) AGP20 e da (4) AGP23.

m – marcador de tamanhos moleculares (GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, Fermentas).

Após a separação electroforética dos diferentes produtos de PCR, foi observada a formação

de uma banda evidente e com o tamanho esperado para todos os fragmentos das regiões

promotoras amplificados para as diferentes AGPs em estudo. Para o gene AGP1 foi obtido um

fragmento com 828 bp (figura 3.8, pista 1). Para o gene da AGP15 obteve-se um fragmento com

1526 bp (figura 3.8, pista 2). Para o gene AGP20 foi obtido um fragmento com 1873 bp (figura 3.8,

pista 3). Para o gene da AGP23 obteve-se um fragmento com 622 bp (figura 3.8, pista 4). Para o

gene da AGP12 obteve-se um fragmento com 1600 bp (figura 3.9 b, pista 1). Para o gene da AGP9

obteve-se um fragmento com 1491 bp (figura 3.9 a, pista 1) e para o gene da AGP 10 foi obtido um

fragmento com 3135 bp (figura 3.9 c, pista1).

37

m 1

5000 bp

1500 bp

500 bp

m 1

5000 bp

1500 bp

500 bp

5000 bp

1500 bp

500 bp

m 1

5000 bp

1500 bp

500 bp

m 1 m 1

5000 bp

1500 bp

500 bp

m 1

5000 bp

1500 bp

500 bp

Figura 3.9: Separação electroforética dos produtos de PCR correspondentes aos fragmentos das regiões promotoras

de AGPs. a) Produtos de PCR amplificado a partir da região promotora da AGP9. b) Produto de PCR amplificado a partir

da região promotora da AGP12. b) Produto de PCR amplificado a partir da região promotora da AGP10.

m – marcador de tamanhos moleculares (GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, Fermentas).

As bandas correspondentes aos fragmentos de interesse foram excisadas dos géis e

purificadas para clonagem no vector pENTR/D-TOPO.

3.5 Obtenção dos vectores de entrada pENTR/D-TOPO/pAGP

Os fragmentos de DNA amplificados por PCR e posteriormente purificados, correspondentes

às regiões promotoras das diferentes AGPs, foram separadamente clonados por recombinação no

vector pENTR/D-TOPO (anexo IV). Os produtos das reacções de recombinação foram utilizados

separadamente para a transformação de uma alíquota de E.coli TOP10 por cada reacção. Dos

transformantes obtidos foram seleccionados os clones recombinantes por PCR de colónias. Os

clones recombinantes seleccionados foram cultivados em meio líquido e o DNA plasmídico foi

extraído para confirmação da presença da inserção por análise de restrição. A confirmação da

presença das inserções nos diferentes clones recombinantes foi feita por clivagem do DNA com as

enzimas de restrição AscI e NotI, que permitem efectuar a excisão do fragmento de inserção do

vector pENTR/D-TOPO.

b) c) a)

38

5000 bp

1500 bp

500 bp

m 1.1 1.2 2.1 2.2

5000 bp

1500 bp

500 bp

m 1.1 1.2 2.1 2.2

5000 bp

1500 bp

500 bp

m 1.1 1.2

5000 bp

1500 bp

500 bp

m 1.1 1.2

5000 bp

1500 bp

500 bp

m 1.1 1.2

5000 bp

1500 bp

500 bp

1.1 1.2 m

5000 bp

1500 bp

500 bp

1.1 1.2 m

6000 bp

3000 bp

1000 bp

m 1.1 1.2

6000 bp

3000 bp

1000 bp

m 1.1 1.2

Figura 3.10: Separação electroforética dos fragmentos de DNA palsmídico obtidos a partir das análises de restrição de

várias construções em pENTR/D-TOPO: a) fragmento da região promotora da AGP1 em pENTR/D-TOPO não digerido

(1.1) e digerido pelas enzimas de restrição (1.2) e fragmento da região promotora da AGP15 em pENTR/D-TOPO não

digerido (2.1) e digerido pelas enzimas de restrição (2.2); b) fragmento da região promotora da AGP20 em pENTR/D-

TOPO não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição (1.2); c) fragmento da região promotora da AGP23 em

pENTR/D-TOPO não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição; (continuação da legenda na próxima página)

a) b)

c) c)

c)

39

(continuação da legenda da figura 3.10 da página anterior) d) fragmento da região promotora da AGP9 em pENTR/D-

TOPO não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição; e) fragmento da região promotora da AGP12 em

pENTR/D-TOPO não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição. m – marcador de tamanhos moleculares

(GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, Fermentas e GeneRuler 1 KB DNA Ladder).

Os resultados da análise de restrição feita aos clones recombinantes foram os esperados, ou

seja, após a separação electroforética dos fragmentos obtidos observa-se uma banda

correspondente ao vector, com cerca de 2580 bp, e uma banda com o tamanho aproximado do

fragmento de inserção (figura 3.10). De acordo com os resultados obtidos seleccionou-se um clone

recombinante por cada uma das construções obtidas, e estes foram sequenciados de modo a

confirmar a presença do fragmento de inserção no local e na orientação correctos. Todos estes

clones foram sequenciados utilizando o oligonucleótido de iniciação universal M13 Forward e o

oligonucleótido de iniciação esquerdo utilizado para amplificação de cada uma das sequências por

PCR, pelo que o fragmento sequenciado corresponde apenas ao local de recombinação attL1 e a

uma pequena porção de cada uma das inserções. Após alinhamento dos fragmentos sequenciados

com a sequência esperada para cada uma das construções (anexo V) verificou-se que os clones

recombinantes seleccionados estavam no local e na orientação correctos.

3.6 Obtenção das construções pAGP::NLS:3xGFP

Todas as sequências promotoras, excepto a da AGP20, foram transferidas dos respectivos

vectores de entrada para o vector de destino pNLS3xGFPnost-pGII. Este é um vector binário que

permite a expressão de GFP direccionada para o núcleo, possuindo 3 repetições da molécula de

GFP ligadas a uma sequência de localização nuclear (NLS), sob o controlo de sequências

promotoras endógenas (figura 3.11). Os vectores de entrada foram linearizados com enzimas de

restrição apropriadas, de modo a evitar o corte dos diferentes fragmentos de inserção e dos locais

de recombinação, uma vez que os vectores de entrada, pENTR/D-TOPO e o vector de destino

pNLS3xGFPnost-pGII possuem um gene de resistência ao mesmo antibiótico, a canamicina. Este

passo permitiu evitar a formação de falsos clones positivos nesta segunda clonagem. Através de

uma reacção de recombinação para cada uma das diferentes construções, as sequências

promotoras foram transferidas a partir dos respectivos vectores de entrada para o vector de destino

pNLS3xGFPnost-pGII.

40

pAGP NLS GFP GFPGFP nostpAGP NLS GFP GFPGFP nost

Figura 3.11 – Representação esquemática das construções pAGP::NLS:3xGFP. pAGP - fragmento da região promotora

da AGP; NLS – sinal de localização nuclear; GFP – proteína de flurescência verde; nost – terminador da nopalina

sintetase.

Os produtos das reacções de recombinação foram utilizados separadamente para a

transformação de uma alíquota de E.coli DH5α por cada reacção. Dos transformantes obtidos foram

seleccionados os clones recombinantes por análise de restrição. Para a análise de restrição foram

utilizadas enzimas de restrição que cortassem o fragmento de inserção e o plasmídeo. Sendo

assim, diferentes enzimas de restrição foram utilizadas para as diferentes cosntruções. Para as

construções pAGP1::NLS:3xGFP, pAGP9::NLS:3xGFP, pAGP10::NLS:3xGFP e pAGP15::NLS:3xGFP

utilizou-se a HindIII. Para a construção pAGP12::NLS:3xGFP utilizaram-se as enzimas de restrição

SalI e BamHI e para a construção pAGP23::NLS:3xGFP utilizaram-se as enzimas de restrição SalI e

SpeI. Após a análise electroforética esperavam-se diferentes padrões de bandas resultantes da

separação dos fragmentos de DNA plamídico clivados pelas enzimas de restrição (tabela 3.1).

Tabela 3.1: Tamanho dos fragmentos de DNA plasmídico esperados para cada construção

pAGP::NLS:3xGFP após análise de restrição.

Construções Enzimas de restrição

Tamanho dos fragmentos esperados após restrição enzimática

pAGP1::NLS:3xGFP HindIII 7500 bp, 550 bp

pAGP9::NLS:3xGFP HindIII 8200 bp, 610 bp, 340 bp, 390 bp

pAGP10::NLS:3xGFP HindIII 7890 bp, 1020 bp, 800 bp, 420 bp

pAGP12::NLS:3xGFP SalI e BamHI 7670 bp, 1260 bp, 800 bp

pAGP15::NLS:3xGFP HindIII 7660 bp, 1080 bp, 805 bp

pAGP23::NLS:3xGFP SalI e SpeI. 7100 bp, 800 bp, 670 bp

Foram testados vários clones e detectados clones recombinantes que apresentam o padrão

de bandas esperado para as construções pAGP1::NLS:3xGFP, pAGP9::NLS:3xGFP,

pAGP10::NLS:3xGFP e pAGP15::NLS:3xGFP (figura 3.12).

41

3000 bp

1000 bp

500 bp

m 1 2

3000 bp

1000 bp

500 bp

m 1 2

3000 bp

1000 bp

500 bp

m 1 2

3000 bp

1000 bp

500 bp

m 1 2

3000 bp

1000 bp

500 bp

m 1 2

3000 bp

1000 bp

500 bp

m 1 2

3000 bp

1000 bp

500 bp

1 2 m

3000 bp

1000 bp

500 bp

1 2 m

Figura 3.12: Separação electroforética dos fragmentos de DNA palsmídico obtidos a partir das análises de restrição de

várias construções em pNLS3xGFPnost-pGII: a) pAGP1::NLS:3xGFP não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de

restrição (1.2); b) pAGP9::NLS:3xGFP não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição (1.2); c)

pAGP10::NLS:3xGFP não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição (1.2); d) pAGP15::NLS:3xGFP não

digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição (1.2) m – marcador de tamanhos moleculares (GeneRuler DNA

Ladder Mix, Fermentas).

Para as construções pAGP12::NLS:3xGFP e pAGP23::NLS:3xGFP o padrão de bandas

detectado foi diferente do esperado para todos os clones testados. O cálculo do tamanho dos

diferentes fragmentos esperados da análise de restrição é apenas aproximado, uma vez que ainda

não está disponível a sequência completa deste plasmídeo. Sendo assim, após análise de restrição

seleccionou-se um clone recombinante por cada uma das construções obtidas confirmadas por

a) b)

c) d)

42

análise de restrição e um clone por cada uma das construções obtidas mas não confirmadas pela

análise de restrição e estes foram sequenciados de modo a confirmar a presença do fragmento de

inserção no local e na orientação correctos. Todos estes clones foram sequenciados utilizando o

oligonucleótido de iniciação universal M13 Forward. Após alinhamento dos fragmentos

sequenciados com a sequência esperada para cada uma das construções (anexo VI) verificou-se

que todos clones recombinantes seleccionados estavam no local e na orientação correctos. Os

resultados relativos à sequenciação da construção pAGP1::NLS:3xGFP não foram os esperados,

devido a erros no processo de sequenciação, no entanto, como os resultados da análise de restrição

foram os esperados, prosseguiu-se com o estudo para esta proteína, bem como para todas as

outras.

Foram seleccionados clones recombinantes para cada uma das construções obtidas para a

transformação de Agrobacterium tumefaciens. A selecção dos transformantes foi efectuada em

meio de cultura selectivo, utilizando canamicina, tetraciclina, rifampicina e gentamicina. Os clones

recombinantes seleccionados nestas culturas foram submetidos a análise de restrição utilizando as

mesmas enzimas de restrição descritas acima, de forma idêntica à apresentada para rastreio dos

clones transformantes pAGP::NLS3xGFP. Como o A. tumefaciens produz poucas cópias dos

plasmídeos que contém, não é aconselhado efectuarem-se os ensaios de restrição com este DNA

plasmídico. Sendo assim, primeiro procedeu-se à extracção dos plasmídeos das bactérias

transformadas, depois à transformação de E. coli DH5α com estes plasmídeos e por fim os clones

positivos foram seleccionados por análise de restrição. Os clones positivos foram utilizados para a

transformação de Arabidopsis thaliana por floral dip.

43

4. Discussão

A análise molecular e funcional de todos os mecanismos envolvidos na dupla fecundação

constitui uma área de estudo muito importante na biologia vegetal, uma vez que este processo

representa um aspecto central do ciclo de vida das Angiospérmicas. O direccionamento do TP até

ao saco embrionário é um mecanismo fundamental para que ocorra a dupla fecundação, e este

direccionamento, na última fase de crescimento do TP, está dependente de interacções que

ocorrem entre o TP e os tecidos do pistilo que rodeiam o GF e as diferentes células que o

constituem (Yadegari e Drews, 2004).

A maior parte destes mecanismos de interacção eram até há pouco tempo desconhecidos.

No entanto, durante os últimos anos vários estudos utilizando diferentes espécies de plantas

permitiram elucidar alguns dos mecanismos envolvidos no direccionamento do TP. (Higashyama e

Hamamura, 2008). Mas, apesar dos numerosos trabalhos efectuados a nível das interacções que

ocorrem entre o tubo polínico e os tecidos e células femininas, estes estudos tornam-se bastante

difíceis uma vez que todos estes processos ocorrem em estruturas profundamente envolvidas pelos

tecidos esporofíticos da flor. Recentemente, o desenvolvimento de novas abordagens genéticas e

moleculares e o aperfeiçoamento das técnicas de microdissecção permitiram um rápido avanço

nesta área de estudo, permanecendo, no entanto, ainda muitos mecanismos por compreender.

Com este trabalho pretendeu-se contribuir para o esclarecimento da função das AGPs nas

diferentes células e tecidos do pistilo. A presença destas proteínas foi detectada nestes tecidos

através de estudos de imunocitoquímica, com um padrão de distribuição muito específico (Coimbra

et al., 2007): nas células gametofíticas, nomeadamente no aparelho filiforme, nas células do

tegumento micropilar e do nucelo micropilar. A presença das AGPs nestas células e tecidos, que

representam o trajecto que o TP segue quando direccionado para o saco embrionário, sugere o seu

envolvimento no processo de atracção do tubo para o saco embrionário. Neste trabalho, de modo a

permitir a identificação de AGPs de A. thaliana que podem estar envolvidos neste processo, foram

obtidas construções que permitem efectuar a localização celular destas proteínas. Estas AGPs

foram previamente seleccionadas por análise de dados de microarrays e RT-PCR em tempo real.

Foram assim obtidas construções que permitem a expressão do gene repórter NLS:3xGFP sob o

controlo dos promotores endógenos de 6 AGPs: AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP15 e AGP23.

Estas construções foram designadas, de um modo geral, por pAGP::NLS:3xGFP.

44

4.1 Selecção das AGPs

Foram seleccionadas 3 AGPs clássicas: AGP1, AGP9, AGP10, 5 péptidos AG: AGP12, AGP15,

AGP16, AGP20 e AGP21 com base em dados de microarrays correspondentes a experiências

efectuadas com ovários de Arabidopsis thaliana. No entanto, a nível da flor, os dados de expressão

génica disponíveis em bases de dados actualmente apenas permitem estabelecer padrões de

expressão para os estames, o pólen, para o estigma e para os ovários. Sendo assim, e como o

principal objectivo deste trabalho consiste no estudo de genes de AGPs presentes no GF, foram

também analisados dados relativos a experiências de microarrays nas sinergídeas, na célula central

e na oosfera (dados não publicados, Laboratório do Prof. Dresselhaus, Universidade de Regensburg)

bem como os dados de microarrays relativos a experiências feitas com pólen e com os gâmetas

masculinos (Borges et al., 2008). Esta análise permitiu tornar a selecção mais específica, obtendo-

se 4 AGPs clássicas: AGP1, AGP5, AGP9 e AGP10, 6 péptidos AG: AGP12, AGP15, AGP16, AGP20,

AGP21 e AGP23 como sendo as que possuem níveis de expressão génica relativa mais elevados

nas sinergídeas, na célula central e na oosfera. Com estes dados foram seleccionadas mais 2 AGPs,

a AGP5 e a AGP23. Nas experiências relativas aos ovários é analisada a expressão dos genes em

todos os tecidos do carpelo, sendo que AGPs que poderiam apresentar níveis de expressão elevada

nas células do GF, aqui podem revelar níveis de expressão relativa mais baixos, e o inverso pode

também acontecer. Daí que algumas das AGPs não tenham sido seleccionadas na primeira análise.

Foram também utilizados dados de microarrays relativos a experiências feitas com pólen e

gâmetas masculinos (Borges et al., 2008) de forma a verificar se existiria algum padrão de

expressão comum dos genes das diferentes AGPs nas células do GF e no pólen e gâmetas

masculinos. No entanto isto não se observou.

Relativamente à expressão génica relativa das AGPs nas células do GF, verificou-se que a

AGP16, a AGP20, AGP12, a AGP21, a AGP 23 e a AGP24 apresentam padrões de expressão

semelhantes, sendo expressas na oosfera, nas sinergídeas e na célula central.

De modo a complementar esta selecção baseada em dados de experiências de microarrays

fez-se uma análise das similaridades existentes entre as sequências proteicas das AGPs clássicas,

dos péptidos AG e das AGPs ricas em lisina. As FLAs não foram incluídas nesta análise uma vez que

constituem um grupo bastante heterogéneo, podendo apresentar um ou dois domínios típicos das

AGPs e um ou dois domínios tipo-fasciclina, sendo que estes domínios, por sua vez, apresentam

uma similaridade entre as sequências muito reduzida (Johnson et al., 2003). Isto poderia diminuir a

45

exactidão do alinhamento, e uma vez que estas FLAs não foram seleccionadas para este estudo

optou-se por exclui-las desta análise.

Esta análise revelou que existe uma maior similaridade entre as sequências proteicas da

AGP16 e da AGP20, da AGP12 e da AGP21 bem como da AGP1 e da AGP5, reunindo estas AGPs

em 3 grupos. Estas similaridades poderão sugerir que estas proteínas desempenham funções

semelhantes nos tecidos em que se encontram. Estudos prévios, com AGPs, sugerem que poderá

existir uma relação entre a formação de grupos evolutivos e a similaridade funcional destes grupos

(Faik et al., 2006). Curiosamente a AGP16 e a AGP20 bem como a AGP21 e a AGP12, aqui

agrupadas, apresentam um padrão de expressão génica relativa semelhante, conforme referido

acima, o que poderá indicar que estas duas proteínas desempenham funções semelhantes. As

AGPs constituem uma grande família de proteínas, e nestes casos é comum existir alguma

redundância funcional. Esta redundância funcional foi já verificada recentemente para a AGP6 e a

AGP11 no pólen (Coimbra et al., 2009).

A expressão dos genes das AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP15, AGP16, AGP20 e AGP21

foi analisada por PCR em tempo real de modo a confirmar os dados obtidos a partir das

experiências de microarrays. Esta análise foi efectuada antes de se ter acesso aos dados de

microarrays relativos a experiências com as células do GF, por isso foi efectuada com as primeiras

AGPs seleccionadas. Os resultados obtidos permitiram confirmar a expressão destes genes nos

óvulos, e mostraram que os genes da AGP9 e da AGP12 apresentam níveis de expressão relativa

um pouco mais altos do que o gene de referência e que os genes da AGP10 e da AGP20

apresentam níveis de expressão relativa mais baixos do que o gene de referência. Quanto aos genes

da AGP1 e da AGP15, verificou-se que os seus níveis de expressão relativa estão muito próximos

dos nineis de expressão relativa do gene de referência. Uma vez que tiveram de ser efectuadas

reacções independentes para cada um dos genes em estudo, os resultados obtidos para cada gene

foram comparados apenas com o gene de referência utilizado em cada uma das experiências, não

se comparando a expressão dos diferentes genes de AGPs em estudo entre si.

4.2 Obtenção das construções pAGP::NLS:3xGFP

Para o prosseguimento deste estudo optou-se por obter construções pAGP::NLS:3xGFP para

as AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP15, AGP20 e AGP23, deixando as restantes AGPs, AGP5,

AGP21 e AGP16 para estudos posteriores. Este plasmídeo, aqui utilizado, permite efectuar a

46

observação da expressão do gene repórter NLS:3xGFP sob o controlo de promotores endógenos das

AGPs em estudo. O sinal de localização nuclear (NLS) permitirá concentrar a localização da GFP no

núcleo das células, facilitando assim a visualização do transgene e tornando o sinal de fluorescência

mais nítido. Foram obtidas as construções pAGP::NLS:3xGFP para todas as AGPs, excepto para a

AGP20. No entanto, o promotor da AGP20 encontra-se inserido no vector pENTR/D-TOPO o que

permitirá, mais tarde a sua recombinação com o vector de destino pNLS3xGFPnost-pGII e a

obtenção da respectiva construção. Foram já transformadas plantas de Arabidopsis thaliana com

estas construções. As sementes destas plantas serão colhidas, sementeiras serão feitas em terra e

as plantas devidamente seleccionadas para estudos de localização de AGPs. Os óvulos destas

plantas serão observados ao microscópio confocal (CLSM).

Estas construções permitirão localizar a nível celular as AGPs em estudo e confirmar os

dados obtidos a partir das experiências de microarrays. A obtenção destas construções é

extremamente importante para se prosseguir com futuros estudos funcionais das AGPs. Todos os

estudos de imunocitoquímica (Coimbra e Salema, 1997; Coimbra e Duarte, 2003; Pereira et al.,

2006; Coimbra et al., 2007) permitem apenas verificar a presença de AGPs, uma vez que

reconhecem apenas epítopos de carbohidratos presentes em todas estas proteínas, e não

determinam que AGPs específicas estão presentes ao longo deste trajecto. Estas construções

permitirão identificar a localização celular de AGPs específicas e determinar se algumas destas

AGPs são as que se encontram presentes ao longo do trajecto seguido pelo TP na sua fase final de

direccionamento, identificadas em estudos anteriores (Coimbra et al., 2007).

4.3 Considerações finais

As AGPs constituem uma grande família de proteínas, tendo sido já identificados 47 genes

que codificam estruturas proteicas de AGPs (Schultz et al., 2000, 2002). O estudo das AGPs, que

se encontram presentes nas células do saco embrionário, no nucelo micropilar e no próprio

micrópilo dos óvulos de Arabidopsis thaliana, torna-se bastante difícil uma vez que estes se

encontram profundamente envolvidos pelos restantes tecidos do óvulo, no interior dos ovários. Estas

moléculas possuem um padrão de distribuição bastante específico nestes tecidos (Coimbra et al.,

2007). Sendo assim, o desenvolvimento de ferramentas que permitam identificar cada AGP

específica presente nestas células e/ou tecidos reveste-se de enorme importância para que futuros

47

estudos funcionais possam ser efectuados de forma a esclarecer se estas proteínas estão

envolvidas nos processos de direccionamento do TP para o saco embrionário.

Neste trabalho determinaram-se quais as AGPs candidatas a estarem envolvidas no processo

de direccionamento do TP. As AGPs são óptimas candidatas a moléculas de sinalização para este

processo de direccionamento em Arabidopsis thaliana.

Vários estudos consideram as pequenas proteínas e péptidos como os principais candidatos

para a mediação dos diferentes eventos de comunicação que ocorrem durante a reprodução

sexuada das plantas com flor (Dresselhaus, 2006). Pelo que os péptidos AG poderão funcionar

como estas moléculas de sinalização.

As AGPs possuem várias características que as tornam boas candidatas a moléculas de

atracção. Para além da sua presença nestes tecidos, com um padrão de distribuição bastante

específico (Coimbra et al., 2007), estas proteínas possuem várias características que as tornam

boas candidatas a moléculas de atracção. Encontram-se presentes no aparelho filiforme das

sinergídeas, podendo estar relacionadas com as secreções produzidas por estas células através do

micropilo (Coimbra et al., 2007) e estão ancoradas à membrana através de uma âncora GPI o que

lhes fornece um possível mecanismo de libertação a partir da membrana citoplasmática para o

meio extracelular (Borner et al., 2002; Schultz et al., 2004). Para além de tudo isto, as AGPs são

proteínas altamente glicosiladas, e vários estudos sugerem que uma das principais funções da

glicosilação é facilitar a secreção das proteínas (Borner et al., 2002).

No entanto, desconhece-se se as moléculas de atracção produzidas pelas sinergídeas serão

apenas uma substância ou um conjunto de substâncias. Estas substâncias poderão funcionar de

forma redundante ou em conjunto, num complexo (Higashiyama e Hamamura, 2008). É possível

que existam várias moléculas de atracção redundantes, o que dificultará o estudo de mutantes, e

mesmo a identificação prévia de moléculas de atracção (McCormick e Yang, 2005).

As ferramentas obtidas com a realização deste trabalho permitirão localizar a nível celular as

AGPs específicas presentes nos tecidos do pistilo. Sabendo-se que AGPs específicas estão presentes

nestes tecidos, será possível prosseguir com estudos funcionais de mutantes knock-out e knock-

down, de forma a esclarecer a função destas proteínas nos tecidos femininos, determinando se

estão envolvidas no processo de direccionamento do TP até ao saco embrionário.

48

5. Referências Bibliográficas

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the initiation of female gametogenesis in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2614-2628.

- Berger, F. 2008. Double fertilization – from myths to reality. Sexual Plant Reproduction. 21, 3–5.

- Berger, F., Hamamura, Y., Ingouff, M. e Higashiyama, T. 2008. Double fertilization – caught in

the act. Trends in Plant Science. 13, 437–443.

- Borges, F., Gomes, G., Gardner, R., Moreno, N., McCormick, S., Feijó, J. A. & Becker, J. D. 2008.

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- Borner, G. H. H., Sherrier, D. J., Stevens, T. J., Arkin, I. T. e Dupree, P. 2002. Prediction of

glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in Arabidopsis. A genomic analysis. Plant Physiology.

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53

Anexos

Anexo I - Representação esquemática das reacções de recombinação BP e LR que

constituem a base da tecnologia Gateway

Reacção BP - facilita a recombinação dos produtos de PCR que contêm os locais de recombinação

específicos attB com um vector dador que contenha os locais de recombinação específicos attP,

como o pENTR/D-TOPO, de modo a originar um vector de entrada que contenha os locais de

recombinação específicos attL.

Reacção LR - facilita a recombinação de um vector de entrada que contenha os locais de

recombinação específicos attL com um vector de destino que contenha os locais de recombinação

específicos attR, como por exemplo o pNLS3xGFPnost-pGII, de modo a originar um vector de

expressão que contenha os locais de recombinação específicos attB.

(Adaptado a partir de Gateway® Technology: A universal technology to clone DNA sequences for

functional analysis and expression in multiple systems. Nº de catálogo: 12535-019 e 12535-027)

54

Anexo II - Curvas de dissociação dos genes em estudo nas experiências de RT-PCR em

tempo real

Curva de dissociação – UBC9

Figura 1: Resultado da curva de dissociação para o gene da UBC9. A curva demonstra as temperaturas de

emparelhamento e a pureza dos fragmentos gerados neste ensaio. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0,

Standard Edition Optical System Software versão 2.0 (Biorad).

Curva de dissociação – AGP1

Figura 2: Resultado da curva de dissociação para o gene da AGP1. A curva demonstra as temperaturas de



55









56









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Anexo III - Curvas padrão dos genes em estudo nas experiências de RT-PCR em tempo

real para determinação da eficiência das reacções

Curva Padrão – AGP1

Figura 1: Resultado da curva padrão para o gene da AGP1. O declive é de -3,201 sendo a eficiência da reação de

105,3%, e o R=0,999. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software

versão 2.0 (Biorad).

Curva Padrão – UBC9

Figura 2: Resultado da curva padrão para o gene da UBC9. O declive é de -3,262 sendo a eficiência da reação de



59



92,2%, e o R=1. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software versão

2.0 (Biorad).





60



92,9%, e o R=1. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software versão

2.0 (Biorad).





61



98%, e o R=0,998. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software






62









63









64

Anexo IV – Representação esquemática do vector pENTR/D-TOPO

65

Anexo V – Resultado da sequenciação das construções obtidas após recombinação

com o vector pENTR/D-TOPO

Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP1 inserido no

vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP1) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido universal

M13uni, da construção obtida após recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO

(TOPOAGP1_M13uni). O alinhamento das sequências foi efectuado recorrendo ao programa ClustalW2

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).

66


vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP1) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido de iniciação

esquerdo utilizado para amplificação da sequência por PCR, da construção obtida após recombinação da

sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP10_pAGP1rv). O alinhamento das sequências

foi efectuado recorrendo ao programa ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).

67


vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP9) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido universal




68


vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP9) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido de iniciação

esquerdo utilizado para amplificação da sequência por PCR, da construção obtida após recombinação da

sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP9_pAGP9rv). O alinhamento das sequências foi

efectuado recorrendo ao programa ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).

69

Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP10 inserido

no vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP10) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido universal




70


no vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP10) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido de

iniciação esquerdo utilizado para amplificação da sequência por PCR, da construção obtida após

recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP10_pAGP10rv). O

alinhamento das sequências foi efectuado recorrendo ao programa ClustalW2


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Anexo VI – Resultado da sequenciação das construções obtidas após recombinação do

vector pENTR/D-TOPO, contendo a sequência promotora de cada AGP, com o vector

pNLS3xGFPnost-pGII


vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP1NLS3GFP) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido

universal M13uni, da construção obtida após recombinação do vector pENTR/D-TOPO, contendo a sequência

promotora da AGP1, com o vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP1NLS3GFP_M13uni). O alinhamento das

sequências foi efectuado recorrendo ao programa ClustalW2


80


vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP9NLS3GFP) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido





81


no vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP10NLS3GFP) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido





82







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Ferramentas para o estudo da expressão de genes de...

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