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FERNANDO ROCHA DOS SANTOS

N ÍVE IS SÉRICOS DE ÓXIDO N ÍTRICO E EXPRESSÃO DA ÓXIDO

N ÍTRICO S INTASE INDUZÍVE L NO BAÇO DE CÃES NATURALMENTE

INFECTADOS COM Leishmania (Le ishmania ) chagas i.

D isser tação ap resen tada ao P rograma de Pós -Graduação em C iênc ias B io lóg icas da Un ive rs idade Va le do R io Doce, como requ is i to pa rc ia l pa ra ob tenção do t í t u l o de Mest re em C iênc ias B io lóg i cas (Á rea de concent ração : Imunopa to log ia de Doenças In fecc iosas e Paras i tá r ias ) .

Or ien tado r :

D r . Lu iz Cosme Cot ta Ma laqu ias

Np IMUNO/UNIVALE

Co -Or ien tado res :

D r . A lex andre Barbosa Re is

D ra . C láud ia Carne i ro Mar t ins

NUPEB/ ICEB/UFOP.

Governador Va ladares

2008

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FERNANDO ROCHA DOS SANTOS

N ÍVE IS SÉRICOS DE ÓXIDO N ÍTRICO E EXPRESSÃO DA ÓXIDO

N ÍTRICO S INTASE INDUZÍVE L NO BAÇO DE CÃES NATURALMENTE

INFECTADOS COM Leishmania (Le ishmania ) chagas i.

D isser tação ap resen tada ao P rograma de Pós -Graduação em C iênc ias B io lóg icas da Un ive rs idade Va le do R io Doce, como requ is i to pa rc ia l pa ra ob tenção do t í t u l o de Mest re em C iênc ias B io lóg i cas (Á rea de concent ração : Imunopa to log ia de Doenças In fecc iosas e Paras i tá r ias ) .

Governador Va ladares , 08 de Ju lho de 2008 .

Banca examinadora:

P ro f . D r . Lu iz Cosme Co t ta Malaqu ias

Un ive rs idade Va le do R io Doce

P ro f . D r . Wanderson Gera ldo L ima

Un ive rs idade Federa l de Ouro P re to

P ro fa . Dra . Vanessa Peruh ype Maga lhães Pascoa l

Cent ro de Pesqu isas René Rachou

3

Ded ico es te t raba lho aos meus f i l hos Rhuan e

M yrna . Espero que se i nsp i rem no meu

es forço , dete rminação e perseverança e

avancem mais do que eu avance i no

conhec imento c ien t í f i co . Lembrando que

buscar com humi ldade o conhec imento ,

p r inc ipa lmente das ve rdades in te rnas , nos

ap rox imará do Cr iado r .

4

AGRADECIMENTOS

Aos meus o r ien tado res Dr . Lu iz Cosme Cot ta Malaqu ias , Dr . A lexandre

Barbosa Reis e Dra C láud ia Mar t i ns Carne i ro pe la pac iênc ia ao me

ens ina rem a rac ioc inar c i ênc ia . Agradeço po r i rem além da c iênc ia e

t ransmi t i rem a fe to em mu i tos momentos .

À Me Pau la Me lo Abreu V ie i ra por me aux i l i a r nos exper imentos de

imuno-h is toquím ica e na aná l i se de imagens com ded icação , pac iênc ia e

humi ldade.

À Cr is t i ane , m inha esposa , pe lo ca r i nho nos momentos impor tan tes e

dec is i vos de minha v ida , aos meus f i l hos po r compreenderem m inhas

ausênc ias , mesmo quando eu es tava f i s i camen te p resente , à Rose l y,

m inha i rmã, pe lo apo io e ao Breno, meu sob r inho, pelo supor te d ig i t a l .

À Técn i ca Mar ia Amél i a Gonça lves e aos B ioquímicos Ana E l i e te da

Conce ição Te les e Va ld iney J . O l i ve i ra po r me subs ti t u í rem no t raba lho .

A todos do NUPEB/ ICEB/UFOP que de a lguma fo rma me ajudaram,

espec ia lmente à Técn i ca Mar ia Chaves do Labora tór io de

Imunopato log ia , por seu apo io nas técn i cas de h i s tolog ia p r inc ipa lmente

na mic ro tomia dos tec idos .

À Coordenação de Aper fe i çoamen to de Pessoa l de N ível Super ior

(CAPES) e UNIVALE pe la bo lsa de es tudos . À P re fe i tura Mun ic ipa l de

I t a ipé pe lo apo io .

Ao Deus -Cr iado r po r t udo que me perm i t i u aprender nessa caminhada . . .

5

“Deus tem seu a l ta r no se io da c r i ação , e o

t em também em cada coração humano . No

p r imei ro o f i c i am as po tênc ias cósmicas ; no

segundo, a consc iênc ia i nd iv i dua l . ”

Car los Bernardo Gonzá les Peco tche

(Raumso l ) – O Espí r i t o

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RESUMO

Este es tudo ob je t i vou ava l i a r os n íve i s sé r i cos de óx ido n í t r i co (NO) , a exp ressão esp lên i ca da enz ima Óx ido N í t r i co S in tase induz íve l ( iNOS) por método imuno-h i s toquímico ( IHQ) em cães natu ra lmen te i n fec tados (C I) com Le ishman ia (L . ) chagas i compara t i vamen te a cães não i n fec tados (CNI), po is o baço é um ó rgão l in fó ide re lac ionado com a de fesa i na ta e adap ta t i va f requentemen te acomet ido po r es ta paras i t ose . Os an imais fo ram agrupados de acordo com a fo rma c lí n i ca em cães ass in tomát i cos (CA) , o l i goss in tomát i cos (CO) e s in tomát i cos (CS) e de aco rdo com a carga paras i t á r i a em an ima is com ba ixo (BP) , méd io (MP) e a l t o pa ras i t i smo (AP) . A lém d i sso , fo ram rea l i zadas co r re lações dos resu l t ados de NO e iNOS com a exp ressão esp lên i ca das c i t oc inas IL-10 , IFN- γ e TNF-α e com imunog lobu l i nas sé r i cas IgG1 , IgG2 e IgG to ta l an t i -Leishmania . Observou -se ma io r ca rga paras i t á r i a em CS em re lação a CA (p<0,01 ) . A med iana dos n í ve is sé r i cos de NO dos C I fo i s i gn i f i ca t i vamente maio r quando comparada à med iana dos n í ve is sé r i cos de NO em CNI (p<0 ,05 ) . Quando subd iv id idos de aco rdo com a fo rma c l í n i ca , a med iana de NO em CS fo i s i gn i f i ca t i vamente maio r que a med iana de NO em CNI (p<0,01 ) . Observou -se também uma co r re lação pos i t i va das med ianas do NO sér ico com a dens idade paras i t á r i a esp lên i ca (p<0,0001 , r=0 ,6444) . A aná l i se de co r re lação most rou -se pos i t i va en t re n í ve i s sér i cos de NO e exp ressão esplên i ca de TNF-α (p=0,005, r=0 ,589 ) , com IgG2 (p=0 ,019 , r=0 ,466 ) e IgG to ta l (p=0,047, r=0 ,400 ) . Foram observadas fo r tes marcações da enz ima iNOS em C I e ausênc ia dessa marcação em CNI. Os t i pos de marcação imuno-h is toquímica fo ram categor izados como d i fusa , foca l e pon tua l . Na ava l i ação semi -quan t i t a t i va , as marcações fo ram mais f requentemente observadas em CS, segu ida po r CO e CA. Quant i ta t i vamente , os resu l t ados da IHQ demonst ram que a med iana da expressão de iNOS fo i maio r em CS (p<0,01) e CO (p<0,05) comparada à med iana em CNI. Es tes resu l t ados sugerem que o agravamento c l í n i co es tá assoc iado à maio r exp ressão de iNOS. A assoc iação en t re a exp ressão da iNOS com a ca rga paras i t á r i a esp lên i ca não apresen tou va lo r s ign i f i ca t i vo (p=0 ,055) , mas observou-se um p redomín io de maio r exp ressão de iNOS em cães com a l to pa ras i t i smo, embora i s to não tenha se to rnado uma regra . Aná l i ses de co r re lações en t re iNOS e c i t oc inas esp lên i cas TNF-α , IFN-γ e IL-10 ou com IgG1 , IgG2 e IgG to ta l não fo ram s ign i f i ca t i vas (p>0,05 ) . A t ravés des te es tudo fo i poss íve l suger ir que oco r re um aumento dos n í ve is de NO com o agravamento c l ín i co e com o aumento da dens idade paras i t á r i a em Le i shmaniose V iscera l Can ina (LVC) . Conc lu i -se haver exp ressão esp lên i ca da enz ima iNOS em cães com LVC e sugere -se que a ex p ressão es tá aumen tada com o agravamento c l in i co . A lém d isso , os resu l t ados perm i tem in fe r i r que o NO sér i co pode se r usado como fe r ramen ta prognós t i ca em LVC. Pa lavras chave: Le i shmaniose V iscera l Can ina . Óx ido n í t r i co . Óx ido n í t r i co s in tase induz íve l ( iNOS) . C i toc inas . Imunoglobu l inas.

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ABSTRACT

This s tud y a imed to eva lua te ser i c l eve ls o f n i t r i c ox ide (NO) , sp leen ex press ion o f the enzyme induc ib le n i t r i c oxide s yn thase ( iNOS) b y immunoh is tochemis t ry i n dogs na tura l l y i n fec ted w i th Leishmania (L . ) chagas i ( ID ) compared to non - in fec ted dogs (N ID) because sp leen is an o rgan l ympho id re la ted to i nna te and adapt i ve defense a f fec ted by the paras i t e . The an imals were grouped acco rd ing to c l in i ca l fo rm in as ymptomat i c (AD) , o l i gos yn tomat i c (OD) and s ymptomat i c dogs (SD) and i n acco rdance w i th t he paras i t e l oad in an ima ls w i th l ow (LP) , med ium (MP) and h igh paras i t i sm (HP) . Add i t i ona l l y, da ta f rom NO and iNOS exp ress ion were co r re la ted w i th t he sp len ic exp ress ion o f cytok ines IL-10 , IFN-γ , TNF-α and w i th se ra immunog lobu l ins IgG1 , IgG2 and IgG to ta l an t i -Leishmania. In SD the re was h igher paras i t e l oad i n re la t ion to AD (p<0,01 ) . The med ian sera l eve ls o f NO in ID was s ign i f i can t l y h igher than the med ian found in N ID (p<0 ,05 ) . When assessed acco rd ing to c l i n i ca l fo rm, the med ian o f SD was s ign i f i can t l y h igher t han the med ian found i n N ID (p<0,01 ) . There was a lso a pos i t i ve co r re la t ion between o f med ian se r ic NO w i th sp len i c pa ras i t e dens i t y (p<0,0001 , r=0 ,6444) . The ana l ys i s o f co r re la t ion showed a pos i t i ve co r re la t ion between se r i c l eve ls o f NO and sp len i c exp ress ion o f TNF-α (p=0,005, r=0 ,589 ) and IgG2 (p=0 ,019 , r=0 ,466 ) and to ta l IgG (p=0 ,047 , r= 0 ,400) . Semiquant i t a t i ve l y ana lys i s o f the IHC showed h igher ex p ress ion o f t he enz yme iNOS in ID and l ack o f express ion i n N ID . The iNOS labe l ing were ca tego r ized as d i f fuse , foca l and punc tua l . F rom qua l i t a t i ve po in t o f v i ew, the s t ronges t and p rominen t l abe l i ng was observed in SD, fo l l owed b y OD and AD. Quan t i t a t i vel y ana l ys i s showed ex p ress ion o f iNOS was h igher in SD (p<0.01 ) and OD (p<0.05 ) compared to N ID (p=0 ,001) . These resu l ts sugges t tha t t he c l in i ca l de ter io ra t i on i s assoc ia ted w i th inc reased ex press ion o f iNOS. The assoc ia t ion between the ex press ion o f iNOS w i th the sp len i c paras i t e l oad was no t s i gn i f i can t (p=0,055) , bu t t here was a tendency o f h igher ex p ress ion o f iNOS in dogs w i th h igh paras i t i sm, a lt hough th is was no t a ru le . Ana l ys i s o f co r re la t ion between iNOS and exp ress ion sp len i c cytok ines IL-10 , TNF-α , IFN-γ o r w i th immunog lobu l i ns IgG1 , IgG2 and IgG to ta l was no t s i gn i f i can t (p>0.05) . These resu lts sugges t t ha t ser i c NO may be assoc ia ted w i th t he c l i n i ca l worsen ing and inc reased sp len i c pa ras i t e load i n Can ine V iscera l Le i shmanias is (CVL) . In conc lus ion , i t was observed the exp ress ion o f the enz yme iNOS in the sp leen i n CVL and sugges ts t h is exp ress ion inc rease w i th the c l ini ca l worsen ing o f the d isease . A lso , t he resu l t s sugges t tha t l eve ls o f se r i c NO may be used as p rognos t i c t oo l i n CVL. Key words : Can ine V iscera l Le i shmanias is . N i t r i c oxide . Induc ib le n i t r i c ox ide syn thase ( iNOS) . Cytok ines . Immunog lobu l ins .

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L ISTA DE FIGURAS

Figu ra 1 - Dens idade paras i t á r i a esp lên i ca (LDU – “Le i shmania Donovan Un i ts ” ) po r fo rma c l ín ica de l e ishmaniose v i scera l can ina . Cães ass in tomát i cos (CA; n= 10 ) , cães o l i goss in tomát i cos (CO; n= 10 ) e cães s in tomát i cos (CS; n= 15) . D i fe rença s ign i f i ca t i va rep resentada po r p< 0 ,01 ; Tes te de Kruska l Wal l i s e pós- tes te de Dunn . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37 F igu ra 2 - N íve is sér i cos de NO (NO2

- e NO3- ) em cães não in fec tados

(CNI; n=10) , comparados a cães natu ra lmen te i n fec tados com L. (L . ) chagas i (C I ; n=35) . D i fe renças s ign i f i ca t i vas representadas po r (p<0,05 ) ; Tes te de Mann Wh i tney. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 F igu ra 3 - N íve is sé r i cos de NO (NO2

- e NO3- ) de cães não i n fec tados

(CNI; n= 10 ) , comparados a cães ass in tomát i cos (CA; n=10) , cães o l i goss in tomát i cos (CO; n=10) e cães s in tomát i cos (CS; n=15) . D i fe renças s ign i f i ca t i vas rep resentadas po r (p<0,01) ; Tes te de Kruska l Wal l i s e pós - tes te de Dunn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 F igu ra 4 - N íve is sé r i cos de NO (NO2

- e NO3- ) de cães in fec tados com

Leishmania (L . ) chagas i (C I ; n=35) subd i v id idos em an imais ap resentando ba ixo paras i t i smo (BP; LDU en t re 0 e 10 ) , méd io paras i t i smo (MP; LDU en t re 11 e 250 ) e a l t o pa ras i ti smo (AP; LDU en t re 251 e 2564) . D i fe renças s ign i f i ca t i vas representadas por p<0,05 (en t re BP e MP) e p<0,001 (en t re BP e AP) . Tes te de Kruskal Wal l i s e pós -tes te de Dunn . B) Cor re lação de Spearman en t re NO sér i co e dens idade paras i t á r i a esp lên i ca de C I (p<0001 , r=0 ,6444, n=35) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 F igu ra 5 - Aná l i ses de co r re lação dos n í ve is sér icos de NO (NO2

- e NO3- )

em cães i n fec tados com Leishmania (L . ) chagas i (C I , n=21) com ex p ressão esp lên i ca de IL-10 (A ; p=0 ,971) , IFN-γ (B ; p=0,181) e TNF-α (C ; p=0 ,005 , r=0 ,589 ) . Cor re lação de Spearman . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 F igu ra 6 - Aná l i se Aná l i se de co r re lação dos n íve i s sé r i cos de NO (NO2

- e NO3

- ) cães natu ra lmente i n fec tados com Le ishman ia (L . ) chagas i (C I ; n=24) com n íve is sé r i cos de IgG to ta l an t i -Leishmania (A ; p=0 ,047 , r=0 ,400 ) , IgG1 (B ; p=0 ,964) e IgG2 (C; p=0 ,019 , r=0 ,466 ) . Co r re lação de Spearman. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 F igu ra 7 - Fo tomic rogra f i as de de co r te h i s to lóg i co esp lên i co de cães na tu ra lmente i n fec tados com Le i shmania (L. ) chagas i submet ido a reação imuno-h is toquím ica an t i - iNOS. A ) Ausênc ia de marcação no grupo cont ro le (CNI) ; B ) Exp ressão d i sc re ta em cão ass in tomát i co (CA) ; C ) moderada em cão o l i goss in tomát ico (CO) ; D) acen tuada em cão s in tomát i co (CS) . 600X. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 F igu ra 8 - Ava l i ação quant i t a t i va da ex p ressão de Óx ido Ní t r i co S in tase i nduz íve l ( iNOS) no baço de cães não in fec tados (CNI) e na tu ra lmente

9

i n fec tados com Le ishmania (L . ) chagas i. Imuno-h i s toquím ica an t i -iNOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 F igu ra 9 - Ava l i ação quant i t a t i va da ex p ressão de Óx ido Ní t r i co S in tase i nduz íve l ( iNOS) no baço de cães não i n fec tados (CNI, n=8 ) e na tu ra lmente in fec tados com Leishman ia (L . ) chagas i, c l ass i f i cados po r fo rmas c l ín i cas de LVC (CA; n=8,CO; n=8e CS ; n=13) . D i fe rença s ign i f i ca t i va en t re CNI e CO rep resentada po r p<0,05 e en t re CNI e CS rep resentada po r p<0 ,01 . K ruska l Wal l i s e pós - tes te de Dunn. Imuno-h is toquímica an t i - iNOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 F igu ra 10- Ava l i ação quant i ta t i va da exp ressão de Óx ido N í t r i co S in tase i nduz íve l ( iNOS) no baço de cães não i n fec tados (CNI, n=8 ) e na tu ra lmente in fec tados com Leishman ia (L . ) chagas i, c l ass i f i cados po r dens idade paras i t á r i a esp lên i ca (Ba ixo paras i t i smo : LDU en t re 0 e 10 ) , méd io paras i t i smo: LDU en t re 11 e 250 e a l t o pa ras it i smo : LDU en t re 251 e 2564) . p>0 ,05 . Tes te de Kruska l Wa l l i s e pós -tes te de Dunn . . . . . . . 48 F igu ra 11- Cor re lação de Spearman da exp ressão esp lên i ca de iNOS em cães natura lmen te i n fec tados com Leishmania (L . ) chagas i (C I ; n=21) com a exp ressão esp lên i ca de IL-10 (A ; p=0,110) , IFN-γ (B; p=0 ,697 e TNF-α (C ; p=0 ,205) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 F igu ra 12- Cor re lação de Spearman da exp ressão esp lên i ca de iNOS em cães natura lmen te i n fec tados com Leishmania (L . ) chagas i (C I ; n=24) com as imunoglobu l i nas IgG1 , IgG2 e IgG to ta l an t i -Leishmania (A ; p=0,076) , IgG1 (B ; p=0,999) , IgG2 (C; p=0 ,203) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

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L ISTA DE TABELAS

Tabe la 1 - F reqüênc ia de graus de paras i t i smo esp lêni co assoc iado a fo rmas c l í n i cas em cães natu ra lmente in fec tados com Leishmania (L . ) chagas i. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 Tabe la 2 - Méd ia percentua l de marcação da exp ressão de iNOS por g rupo c l í n i co quanto ao t ipo e in tens idade nos f ragmentos esp lên i cos de cães in fec tados com Leishmania (L . ) chagas i. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

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L ISTA DE ABREVIATURAS

ABC Complexo Av id ina B io t ina

AMG Aminoguan id ina

AP A l to Paras i t i smo

BP Ba ixo Paras i t i smo

CA Cães Ass in tomát i cos

CD4+ “ Clus ter o f d i fe ren t i a t ion ” 4 pos i t i vo (Grupo de d i fe renc iação)

CD8+ “ Clus ter o f d i fe ren t i a t ion ” 8 pos i t i vo (Grupo de d i fe renc iação)

CCZ Cent ro de Cont ro le de Zoonoses

C I Cães na tu ra lmente i n fec tados

CNI Cães Não In fec tados

cNOS Óx ido Ní t r i co S in tase cons t i tu t i va

CO Cães Ol i goss in tomát i cos

CS Cães S in tomát i cos

DAB D iaminobenz id ina

eNOS Óx ido Ní t r i co S in tase endote l i a l

HE Hematox i l i na Eos ina

H IV V í rus da Imunode f ic i ênc ia Humana

IFN- γ In te r fe ron gama

Ig Imunog lobu l i na

IL -10 In te r l euc ina 10

iNOS Óx ido Ní t r i co S in tase induz íve l

LDU “Le i shman Donovan Un i ts ”

LPG Lipo fos fog l i canos

LPS L ipopo l i ssacár ides

LT Le i shman iose Tegumenta r

LT- α1β2 L in fo tox ina-α1β2

LV Le i shman iose V iscera l

LVC Le i shman iose V iscera l Can ina

RNAm Ác ido R ibonuc lé i co mensage i ro

NK Célu las “na tu ra l k i l l e r ”

nNOS Óx ido Ní t r i co S in tase neurona l

NO Óx ido Ní t r i co

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PALM Ba inha l i n fó ide per i -a r te r i o la r

PALMS Ba inhas l in fó ides per i -a r ter io la res

PB Po lpa Branca

PBS “Phospha te Bu f fe red Sa l ine ” (So lução sa l i na tamponada com

fos fa to )

PV Po lpa Verme lha

R IF I Reação de Imuno f luo rêscenc ia Ind i re ta

RT-PCR Reação em Cadeia da Po l imerase com Transc r i ção Reversa

SRD Sem Raça De f in ida

TGF-β Fato r de C resc imento T rans fo rman te be ta

Th1 L in fóc i t os T “he lper ” t ipo 1

Th2 L in fóc i t os T “he lper ” t ipo 2

TNF-α Fa to r de Necrose Tumora l a l fa

ZM Zona marg ina l

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1 .1 ASPECTOS GERAIS DAS LE ISHMANIOSES. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1 .2 FORMAS CLÍN ICAS DA LE ISHMANIOSE V ISCERAL CANIA. . . . . . 17 1 .3 ASPECTOS IMUNOPATOLÓGICOS DA LVC. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . 18 1 .4 BAÇO: ESTRUTURA E FUNÇÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1 .5 B IOLOGIA DO ÓXIDO N ÍTR ICO: SUA PARTIC IPAÇÃO NA RESPOSTA IMUNE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2 OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2 .1 OBJ ETIVO GERAL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2 .2 OBJ ETIVOS ESPECÍF ICOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2 .2 .1 Dete rmina r a ca rga pa ras i tá r i a no baço de cães na tu ra lmen te in f ec tados com L . (L . ) ch ag as i po r tado res de d i f e ren tes f o rmas c l í n i cas de l e i shman iose e def in i r os g raus de paras i t i smo esp lên i co . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2 .2 .2 De te rmina r os n í ve is do óx ido n í t r i co sé r i co de cães na tu ra lmen te in f ec tados com L . (L . ) chagas i e associa r os resu l tados com as fo rmas c l ín i cas e g raus de paras i t i smo esp lên i co . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2 .2 .3 Ava l i a r a exp ressão da enz ima iNOS em baço de cães na tu ra lmen te in f ec tados com L . ( L . ) c h ag as i e assoc ia r os resu l tados com as fo rmas c l ín i cas e g raus de paras i t i smo esp lên i co . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2 .2 .4 Assoc ia r os per f i s de exp ressão de iNOS em baço e os n íve i s de NO sér i cos com a p rodução das c i toc inas INF- γ , TNF-α e IL -10 . . . . . . . 30 2 .2 .5 Assoc ia r os per f i s de exp ressão de iNOS em tec ido esp lên ico e os n íve i s sé r i cos de NO com os n í ve is de IgG1, IgG2 e IgG to ta l an t i -L e i shm an ia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3 MATERIAIS E MÉTODOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3 .1 ANIMAIS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3 .2 AVALIAÇÃO CLÍN ICA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32 3 .3 ANÁLISE PARASITOLÓGICA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3 .4 QUANTIF ICAÇÃO SÉRICA DE NO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3 .5 REAÇÃO IMUNO-H ISTOQUÍM ICA PARA DETECÇÃO DE INOS. . 34 3 .6 ANÁLISES ESTATÍST ICAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 4 RESULTADOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 4 .1 DETERMINAÇÃO DA CARGA PARASITÁRIA . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . 37 4 .1 .1 Carga pa ras i tá r i a po r fo rma c l ín i ca . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 4 .1 .2 Ca tegor i zação po r g raus de pa ras i t i smo esp lênico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 4 .2 N ÍVE IS SÉRICOS DE ÓXIDO N ÍTRICO. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 4 .2 .1 Dosagem de NO sér i co em cães não in f ec tados comparados a cães i n fec tados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 4 .2 .2 De terminação dos n í ve i s sér i cos de NO comparada po r carga pa ras i tá r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 4 .3 ANÁLISE DE CORRELAÇÃO ENTRE OS NÍVE IS SÉRICOS DE NO COM EXPRESSÃO ESPLÊNICA DE IL-10 , IFN-γ E TNF-α E COM OS N ÍVE IS SÉRICOS DE IgG1 , IgG2 E IgG TOTAL ANTI-LEISHMANIA. . 41 4 .4 EXPRESSÃO ESPLÊNICA DE iNOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 4 .4 .1 Aná l i se semi -quan t i ta t i va de iNOS. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 4 .4 .1 .1 Marcação D i fusa (MD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

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4 .4 .1 .2 Marcação Foca l (MF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 4 .4 .1 .3 Marcação Pontua l (MP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 4 .4 .2 Aná l i se quan t i ta t i va de iNOS. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4 .4 .2 .1 Expressão esp lên i ca de iNOS comparados po r fo rma c l í n i ca . . . . . 46 4 .4 .2 .2 Expressão esp lên i ca de iNOS comparada po r ca rga paras i tá r ia . . 48 4 .4 .2 .3 Aná l i se de co r re lação en t re a exp ressão da iNOS com n íve i s esp lên i cos de IL-1 0 , IFN-γ e TNF-α e com n íve is de IgG1 , IgG2 e IgG to ta l an t i -Leishmania. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 5 DISCUSSÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 6 CONCLUSÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 7 REFERÊNCIAS B IBLIOGRÁFICAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

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1 INTRODUÇÃO

1 .1 ASPECTOS GERAIS DAS LE ISHMANIOSES

As Le i shmanioses são um con jun to de doenças em sua ma io r ia

zoonoses causadas por p ro tozoár ios da o rdem K inetop las t i da, f amí l ia

Trypanosomat idae e gênero Leishmania (LA INSON e t a l ., 1987) . O

gênero Le ishman ia f o i desc r i t o pe la p r imei ra vez po r Ross em 1903,

agrupando espéc ies de p ro tozoár ios un i ce lu la res , d igenét i cos que

hab i tam o t ra to d iges t i vo de hospede i ros inver teb rados em suas fo rmas

f l age ladas (p romas t i go ta e paramas t i go ta ) . Es tes paras i tos também

in fec tam cé lu las do s is tema fagoc í t i co mononuc lear (SFM) de

ve r teb rados em sua fo rma sem f l age los ex te r io r i zados (amas t i go ta ) . A

t ransmissão ocor re pe la p i cada da fêmea do f l ebo tomíneo Lutzomya

l ong ipa lp i s, que tem s ido reg i s t rada em ambien tes ru ra i s e u rbanos ,

p róx imos a an imais domést i cos e hab i tações humanas (MARZOCHI e t

a l . , 1985; LA INSON e t a l ., 1987; LA INSON & RANGEL, 2005; S ILVA

e t a l ., 2007) .

A fo rma in fec tan te , p romas t i go ta metac íc l i ca , p resen te no inseto

ve to r é a i nocu lada na derme jun to à sa l i va du ran te o repas to sangu íneo.

Com base no desenvo l v imento das fo rmas p romast igo tas no tubo

d iges t i vo do inse to ve to r , LA INSON & SHAW (1988) p ropuseram um

agrupamento das espéc ies do gênero Leishmania em do is subgêneros:

pa ras i t os que têm seu desenvo l v imento l im i tado ao es tômago do veto r

( sup rap i l á r i a ) per tencem ao subgênero Le ishman ia , enquan to os paras i t os

que se aderem às paredes do p i lo ro ou í l eo a t ravés do f lage lo

(Per ip i l á r i a ) per tencem ao subgênero Viann ia.

As l e i shmanioses podem ser d iv idas em do is g rupos cl í n i cos:

Le i shman iose Tegumenta r (LT ) e Le i shmaniose V isceral (LV) .

As d i fe ren tes man i fes tações c l í n i cas das l e i shmanioses es tão

envo lv idas com a espéc ie do paras i to , espéc ie do vetor e es tado imune do

hospede i ro den t re ou t ros aspectos (MARZOCHI e t a l ., 1985) .

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A LT pode se man i fes tar em d i ve rsas fo rmas c l ín i cas ta i s como:

cu tânea, cu tânea mucosa , e cu tânea d i fusa (GONTIJO & CARVALHO,

2003) .

A LV humana, t ambém chamada de ca lazar , também man ifes ta -se

em d i fe ren tes fo rmas c l í n i cas , va r i ando desde a fo rma c l í n i ca

ass in tomát i ca ou sub -c l í n i ca , a té as fo rmas c l í n i cas (aguda e c rôn i ca )

(BADARO e t a l ., 1986) .

A LV é uma doença de cará te r c rôn i co que a t i nge órgãos i n te rnos ,

p r inc ipa lmente o f í gado, baço, medu la óssea e l i n fonodos . A in fecção

pode se r ass in tomát i ca ou pode evo lu i r ap resentado feb re reco r ren te e

mal -es ta r segu ido de p rogress i va p io ra , anemia e hepa to-esp lenomega l i a ,

l i n fadenopat i a , l eucopen ia , pe rda de apet i te , fad iga e es tado de

deb i l idade p rogress i vo . Se não t ra tada l eva à mor te dent ro de 2 a 3 anos

(MALLA & MAHAJAN, 2006) .

O agente e t i o lóg ico da LV no ve lho mundo ( Índ ia e les te da

Á f r i ca ) é a Leishmania (L . ) donovan i; na Ch ina , Ás ia Cen t ra l , sudes te da

Europa e Med i te r râneo é a Leishmania (L . ) i n fan tum e no Novo Mundo

(Amér i ca La t ina ) é a Leishmania (L . ) chagas i (LA INSON, 1970 ;

LA INSON & SHAW, 1972) .

Cor ren temente as le i shmanioses a fe tam 12 mi l hões de ind i v íduos

em todo mundo com oco r rênc ia ap rox imada de 500.000 novos casos de

LV po r ano. C inco países l i de ram a p reva lênc ia da doença: Índ ia ,

Bang ladesh, Nepa l , Sudão e Bras i l (ENGWERDA e t a l ., 2004) . Com a

ex pansão da A IDS , pac ien tes co - i n fec tados com Le ishman ia e H IV j á são

no t i f i cados , o que ocas iona aumento nos d i s tú rb ios imuno lóg i cos , uma

vez que a i n fecção pe lo H IV l eva à dep leção de cé lulas T CD4+ ,

f avo recendo o desenvo lv imento de fo rmas graves de le i shmanioses , ou

po r ou t ro lado l evam ao aumen to da rep l i cação do v írus (DESJEUX &

ALVAR, 2003; S INHA e t a l ., 2005; KUMAR e t a l ., 2007) .

Nos ú l t imos anos a LV , que e ra t ip icamen te c i r cunscr i t a à zona

ru ra l , vem u rban izando-se e a tua lmente a LV es tá p resente em 19 dos 27

es tados b ras i l e i ros . Nos anos 90 as reg iões Nor te , Sudes te e Cent ro -

Oeste passaram a cont r i bu i r e levando a i nc idênc ia da LV no Bras i l . Nos

ú l t imos c inco anos oco r re ram 3500 casos novos , a maio r i a na reg ião

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Nordes te . Es te p rocesso de expansão e u rban ização es tá l i gado à

p rox im idade en t re as hab i tações , a l t a dens idade popu lac iona l e à

suscet ib i l i dade da popu lação (GONTIJO & MELO, 2004).

Dados da l i t e ra tu ra re la tam que o aparec imento de casos humanos

de le ishman iose é an teced ido pe lo achado de cães i nfec tados

(PALATNIK-DE-SOUZA e t a l. , 2001) . No en tan to , a inda ex is tem

cont rovérs ias sob re es ta ques tão , que j us t i f i ca a rea l i zação de novos

es tudos , po is a e l im inação dos cães so ropos i t i vos nas á reas endêmicas

não tem imped ido o aparec imento de casos humanos, embora ba ix em a

p reva lênc ia da Le i shmaniose V i scera l Can ina (LVC) (BRAGA e t a l .,

1998) . Out ros pesqu isadores demonst ra ram a poss ib i li dade de in fecção

do i nseto ve tor pe lo homem, suger indo a poss ib i l i dade des te func ionar

como reservató r io da l e ishmaniose (COSTA e t a l ., 2000) . En t re tan to ,

es te mecan ismo é pouco ace i t o e cont rad iz t odo o parad igma desc r i t o na

l i t e ra tu ra du ran te a década de 50 , quando fo ram de fi n idos os pape is do

homem, da raposa e do cão no c i c lo ep idemio lóg i co da LV no Bras i l

(DEANE & DEANE, 1954) .

1 .2 FORMAS CLÍN ICAS DA LE ISHMANIOSE V ISCERAL CANINA

A LVC assume grande impor tânc ia no es tudo das l e i shmanioses ,

po i s o cão tem s ido responsab i l i zado como o p r i nc ipa l reservató r i o

domést i co da LV , encont rando-se nos i nquér i tos ep idemio lóg icos de

reg iões endêmicas , a l t a i nc idênc ia de cães in fec tados . Es tes achados

oco r rem p rovave lmente dev ido a sua suscep t ib i l i dade à i n fecção e

p r inc ipa lmente pe lo e levado paras i t i smo cu tâneo comumente encon t rado ,

poss ib i l i t ando a manutenção do c i c lo b io lóg ico do paras i to ao i n fec ta r o

i nseto ve to r no amb ien te domés t i co (DEANE & DEANE, 1954 ; KEENAN

e t a l ., 1984a ; ABRANCHES e t a l ., 1991b; BRAGA e t a l ., 1998 ; COSTA

e t a l ., 1999; REIS e t a l ., 2006b) .

A lém d i s to , o i n tenso paras i t i smo cu tâneo mesmo em cães

ass in tomát i cos fo r ta lece sua impor tânc ia como fon te de i n fecção para

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f l ebo tomíneos (MOLINA e t a l ., 1994) . Out ro impor tan te aspecto que se

deve ressa l ta r é o fa to de que o cão é um ex ce len te modelo exper imenta l

pa ra o en tend imento da LV humana bem como para tes tes de drogas e

vac inas (MORENO & ALVAR, 2002; ALVAR e t a l ., 2004) .

A LVC pode se r ca tego r izada em t rês d is t in tas fo rmas c l ín i cas :

Cães Ass in tomát icos (CA) – Cães que ap resentam apenas

so ro log ia pos i t i va , sem s ina i s c l ín i cos .

Cães Ol igoss in tomát i cos (CO) - Observam-se no máx imo t rês

s ina i s c l ín i cos , podendo aparecer i so ladamen te ou combinados de fo rma

b randa e i nespecí f i ca : a lopec ia loca l i zada, moderado emagrec imento ,

adenopat i a , esp lenomegal i a l eve, o lhos opacos .

Cães S in tomát i cos (CS) – Os an imais ap resen tam uma

combinação de ma is de t rês s in tomas assoc iados . Podem apresenta r

a lopec ia loca l ou genera l i zada, desp igmentação , es fo l i ação , nódu los ,

fo rmação de pús tu las , l esões cu tâneas u l ce radas , gera lmen te no foc inho,

o re lha e ex t remidades , con jun t i v i t e , i r i t e e uveí te, ce ra to -con jun t i v i t e ,

on i cogr i fose, aumen to dos l in fonodos , hepatomega l i a, esp lenomega l i a e

deb i l idade gera l . Ou t ros s ina i s também podem ocor rer como d ia r ré ia,

apa t i a ge ra l , hemorrag ia i n tes t ina l , pares ia do t rem pos ter i o r , bem como

emagrec imento progress i vo evo lu indo para caquex ia e ób i t o (POZIO e t

a l . , 1981; TRYPHONAS e t a l ., 1977; MANCIANTI e t a l ., 1988;

BARROUIN-MELO e t a l ., 2006; REIS e t a l ., 2006a) .

1 .3 ASPECTOS IMUNOPATOLÓGICOS DA LVC

A h i s tó r i a natura l da LVC é um tóp i co amplamente i nves t i gado po r

d ive rsos au to res oco r rendo uma sér i e de man i fes tações

imunopa to lóg i cas , sendo o acúmulo de cé lu las fagocít i cas mononuc leares

nos tec idos l in fó ides uma carac ter í s t i ca fundamen tal . A lém d is to ,

observa-se h ipe rp las ia ce lu la r nos órgãos a fe tados : f í gado , baço, medu la

óssea , mucosa do in tes t ino de lgado e l in fonodos (TAFURI e t a l ., 2001;

ENGWERDA e t a l ., 2004) .

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No contex to h i s topato lóg ico observa-se no f í gado de cães

na tu ra lmente ou exper imenta lmen te i n fec tados (C I) com Leishmania (L . )

chagas i reações granu lomatosas , h iperp las ia e h ipe r t ro f ia das cé lu las de

Kup f fe r , das qua i s mu i tas se ap resentam paras i t adas por fo rmas

amas t i go tas . Re la ta -se também a p resença de i n f i l t rado

l in foh i s t i op lasmoc i tá r i o acentuado no compar t imento hepá t i co . No baço

d ive rsos t raba lhos na l i t e ra tu ra desc revem a reação in f lamató r i a c rôn i ca

e d i fusa, podendo oco r re r t ambém a presença de granu lomas c i r cundando

macró fagos rep le tos de paras i t os (OLIVE IRA e t a l ., 1993; TAFURI e t

a l . , 1996) e em modelo mur ino c i t a -se a perda da m ic roarqu i t e tu ra

esp lên i ca com o agravamento da LV (ENGWERDA e t a l ., 2004) .

Os l i n fonodos apresentam aumen to no tamanho e número dos

fo l í cu los l i n fó ides , com marcada h iperp las ia , h ipert ro f ia medu la r e

macró fagos medu la res paras i t ados , fenômeno es te i n timamen te

re lac ionado com a l i n fadenopat i a f reqüentemente observada na LVC

(L IMA e t a l ., 2004) .

Na medu la óssea observam-se fo rmas amast i go tas no in ter io r dos

macró fagos , podendo oco r re r anemia e t romboc i topen ia nos an imais

i n fec tados (TAFURI e t a l ., 2001) .

A in tens idade do paras i t i smo no baço , f í gado e medula óssea

encon t ra -se assoc iada à fo rma c l ín ica da doença e ac red i t a -se que a

d isseminação na pe le do an imal oco r ra após a v isce ra l i zação do paras i t o

p r inc ipa lmente após sua chegada à medu la óssea (G IUNCHETTI e t a l .,

2006; REIS e t a l ., 2006a; G IUNCHETTI e t a l ., 2008) .

D i ve rsos es tudos cons ide rando as d i fe ren tes fo rmas c l ín i cas da

LVC demonst raram que CA apresen tam paras i t i smo cu tâneo sendo ,

po r tan to , fon te de i n fecção aos f l ebo tomíneos , embora CO e CS

ap resentem maio r in fec t i v i dade (MOLINA e t a l ., 1994; GUARGA e t a l .,

2000; TRAVI e t a l ., 2001) .

O quadro b ioquím ico c láss ico na LVC ava l i ado pe la ele t ro fo rese

de p ro te ínas sé r i cas most ra i nversão das tax as de albumina /g lobu l ina ,

l evando a h ipe rgamaglobu l i nemia em ap rox imadamente 70% dos casos .

Es te quadro é marcante e exp l i ca a in tensa a t i v i dade po l i c l ona l de

cé lu las B , com e levada p rodução de imunog lobu l inas ( Ig ) o r i g inando os

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quadros mais g raves com desenvo l v imento de l esões rena is com

g lomeru lone f r i t e mesang iop ro l i f e ra t i va dev ido à depos i ção de

imunocomp lexos no g loméru lo de Malp igh i (TRYPHONAS e t a l ., 1977 ;

TAFURI e t a l ., 1989 ; POLI e t a l ., 1991) .

Es ta i n tensa a t i v idade po l i c lona l na LVC leva à p rodução de

d ive rsas c lasses e subc lasses de Ig p roduz idas du ran te a evo lução da

doença . A lguns au to res admi tem que a IgG1 es ta re lac ionada com

p rogressão enquanto ou t ros most ram o cont rá r io (BORJA-CABRERA e t

a l . , 2004 ; REIS e t a l ., 2006c; RODRIGUEZ-CORTES e t a l ., 2007) .

REIS e t a l . (2006c) demonst ra ram que cães natu ra lmente

i n fec tados c lass i f i cados como o l i go e s in tomát i cos são capazes de

p roduz i r a l t os n íve i s de an t i co rpos de d i ve rsas c lasses ( IgG, IgM, IgA ,

IgE) , e most raram uma assoc iação de a l t os t í t u l os de IgG2 com a l ta

ca rga paras i t á r i a , p r inc ipa lmente na pe le e baço . Es tes au to res também

mos t ra ram que o paras i t i smo de medu la óssea e baço es tá pos i t i vamente

co r re lac ionado com a grav idade da doença .

Os mecan ismos re lac ionados com a res i s tênc ia à in fecção po r L .

chagas i a inda não es tão c la ros na i n fecção natu ra l can ina . A LVC

s in tomát i ca tem s ido assoc iada com mudanças imuno lóg i cas envo lvendo

cé lu las T (P INELL I e t a l ., 1995) , es tando re lac ionada com depressão da

imun idade ce lu la r , conseqüentemen te com perda da capac idade de de fesa

imune , com queda na produção de c i toc inas do T ipo 1, favo recendo a

d isseminação e reprodução dos paras i tos (ABRANCHES e t a l ., 1998) .

A lguns t raba lhos mos t ram assoc iação en t re a t i vação de cé lu las

p rodutoras de IFN-γ , IL-12 , IL-2 e TNF-α e a fo rma ass in tomát i ca da

LVC. Por ou t ro l ado , observa-se que paras i t i smo esplên i co es tá

assoc iado com maio res n í ve is de exp ressão de IL-4 e IL -10 (P INELL I e t

a l . , 1995; LAGE e t a l ., 2007) i nd i cando uma p rováve l re lação en t re es ta

c i t oc ina e a fo rma c l í n i ca da doença.

21

1 .4 BAÇO: ESTRUTURA E FUNÇÃO

O baço é um ó rgão l i n fó ide secundár io comp lexo e com d ive rsas e

impor tan tes funções para o o rgan ismo, a tuando a t i vamen te no

metabo l i smo do fer ro , des t ru i ção de hemácias ve lhas (e r i t ro fagoc i tose

esp lên i ca) , a lém de se r um reserva tór io de sangue em s i tuações de

es forço . Na fase embr ionár ia o baço tem a função hematopo ié t i ca , que é

parc ia lmen te perd ida após o nasc imen to . Possu i reg iões compos tas por

cé lu las de de fesa responsáve is po r fagoc i t ose de o rgan ismos es t ranhos,

ap resentação de an t ígenos , p rodução de an t i co rpos e cé lu las de memór ia .

Sua o r i gem embr io lóg i ca são as cé lu las p rogen i to ras mesodermais

(BRENDOLAN e t a l. , 2007) .

O baço é c i r cundado po r uma espessa cápsu la de tec ido

con jun t i vo , que é reves t i da po r ep i t é l i o pav imentoso s imp les . Os sep tos

de tec ido con jun t i vo pene t ram no parênqu ima des te órgão, conduz indo os

vasos sanguíneos para o in te r i o r . É cons t i tu ído pe la po lpa b ranca (PB) e

po lpa verme lha (PV) . A PB tem um ar ran jo de ba inha c i l í nd r i ca

c i r cu lando a a r té r ia cen t ra l , composta po r t rês sub-compar t imentos : A

ba inha l in fó ide per i -a r ter io la r (PALM) , a zona margina l (ZM) e os

fo l í cu los . A cápsu la compõe-se de tec ido conec t i vo , f i b roso , f ib ras

e lás t i cas e muscu la tu ra l i sa . A camada ex te rna da cápsu la esp lên i ca é

composta de cé lu las mesote l i a i s , que podem não se r ev identes no co r te

h is to lóg ico . Da par te i n te rna da cápsu la o r i g inam-se t rabécu las de

muscu la tu ra l i sa e t ec ido f ib ro -e lás t i co em d i reção ao parênqu ima

esp lên i co , con tendo também vasos sangu íneos , l i n fá ti cos e nervos , sendo

os vasos l in fá t i cos do t ipo e fe ren tes , a t ravés dos qua is l i n fóc i t os migram

para os nodos l in fá t i cos esp lên i cos (CESTA, 2006) .

O sangue chega ao baço a t ravés da a r té r i a esp lên i ca a fe ren te , que

se d iv ide em ar tér i as t rabecu la res que penet ram no parênqu ima, se

rami f i ca em pequenas a r te r ío las que en t ram na PV, onde se to rnam

ar te r ío las cent ra i s . Ou t ras a r te r ío las menores o r i ginam cap i l a res da PB.

As a r te r ío las são c i r cundadas po r tec ido l in fó ide , fo rmando as PALMS,

composta po r cé lu las T , cé lu las dendr í t i cas e cé lu las es t romais . Os

22

f o l í cu los são fo rmados po r cé lu las B fo l i cu la res , cé lu las dendr í t i cas e

cé lu las es t roma is , podendo oco r rer expansão c lona l de cé lu las B , quando

a t i vadas , l evando a h iper t ro f i a fo l i cu la r (ENGWERDA e t a l ., 2004) .

A ZM s i t ua-se en t re a PB e PV, cons is t indo num se io reves t i do

po r cé lu las endo te l ia is que permi te um f luxo ráp ido e um pon to de

en t rada de l eucóc i tos na PB. Es ta reg ião esp lên i ca é composta po r

macró fagos meta lo f ín i cos marg ina is , macró fagos da zona marg ina l ,

cé lu las B e T , sendo espec ia l i zada em fagoc i tose de par t í cu las es t ranhas

ao o rgan ismo, como p ro tozoár ios , bac té r ias e v í rus (OLIVER e t a l .,

1997; MARTIN & KEARNEY, 2002 ; P ILLA I e t a l ., 2005) .

Os fa to res que a tuam na migração de l i n fóc i tos B , T, cé lu las

dendr í t i cas no in ter i o r esp lên i co são cont ro lados po r c i toc inas , como a

l in fo tox ina -α1β2 (LT-α1β2) e fa to r de nec rose tumora l α (TNF-α ) , es tes

po r sua vez con t ro lam a exp ressão de qu imioc ina l i gan te CXC13

(CXCL13) , responsáve l pe la a t ração de l i n fóc i t os B aos fo l í cu los de

cé lu las B . A qu imioc ina l i gan te CC19 (CCL19) e qu imioc ina l i gan te CC

21 (CCL21) a tuam d i r i g i ndo cé lu las T à zona de l in fóc i tos T ,

conseqüentemen te o per fe i t o func ionamento do baço e a manutenção de

sua arqu i t e tu ra é dependente da harmon ia de d i ve rsas qu imioc inas e do

TNF-α , que so f rem a l te rações na sua produção quando há paras i tose

esp lên i ca em modelo mur ino (ENGWERDA e t a l ., 2002) .

As respos tas adap ta t i vas e i na tas podem ser e f i c ientemen te

mon tadas no baço, fazendo des te um impor tan te ó rgão na homeos tase

imune . Enquanto a PV es tá res t r i t a à respos ta adapta t i va , a ZM es tá

envo lv ida em ambos os t ipos de respos ta , a t ravés de macró fagos e

l in fóc i tos , es ta é uma região c ruc ia l onde pa tógenos da co r ren te

sanguínea são seqües t rados . Cé lu las B e macró fagos da ZM podem

fo rmar uma in teração en t re imun idade i na ta e adap tat i va (MEBIUS e t a l . ,

2004) .

A PV cons is te de s inusó ides que fo rmam lab i r i n tos at ravés de

con jun tos ce lu la res conhec idos como co rdões esp lên icos ou de B i l ro th ,

es tes , po r sua vez , são fo rmados po r f ib ras re t i cu lares com cé lu las

re t i cu la res , macró fagos assoc iados e hemác ias . São cons ideradas cé lu las

re t i cu la res os mio f i b rob las tos que tem a função de cont ração do ó rgão .

23

As f i b ras re t i cu lares são compos tas de co lágeno e fi b ras e lás t i cas ,

m io f i b r i l as , l âmina basa l de cé lu las re t i cu la res e f i b ras nervosas

ad renérg i cas não mie l in izadas (MEBIUS & KRAAL, 2005) .

A lguns t raba lhos mos t ram que no baço mur ino , cé lu las T CD4+

aumentam suas percen tagens após a in fecção com Leishmania i n fan tum

superando o número de cé lu las T CD8+ (GOMES-PEREIRA e t a l ., 2004) .

Ou t ros exper imentos reve la ram que o número de cé lu las T CD4+ e

T CD8+ aumentavam no baço após in fecção com Leishmania in fan tum,

mos t rando que es tas par t i c i pam em con jun to na respos ta imune ce lu la r

con t ra o paras i t o (TSAGOZIS e t a l ., 2003) .

1 .5 B IOLOGIA DO ÓXIDO N ÍTR ICO: SUA PARTIC IPAÇÃO NA

RESPOSTA IMUNE

A e l im inação de mic roo rgan i smos i n t rac i t op lasmát icos ocor re

a t ravés da p rodução de espéc ies reat i vas do ox igên io e do n i t rogên io ,

sendo um des tes p rodutos o óx ido n í t r i co (NO) , uma molécu la

responsáve l po r numerosos fenômenos f i s io lóg i cos (BOGDAN 1997,

2001) .

O NO é um gás inco lo r à t emperatu ra ambien te , pouco so lúve l em

água , a l t amen te reat i vo , com meia -v ida de 5 a 30 segundos . É s in te t i zado

pe la ação da enz ima Óx ido N í t r i co S in tase (NOS) sobre o subs t ra to L-

a rg in ina, conver tendo-a em L-c i t ru l ina e l ibe rando NO. Es te pode ser

ex c re tado a t ravés do a r exp i rado em sua fo rma in i c ia l ou pe lo suo r ,

sa l i va e fezes em sua fo rma ox idada n i t r i to ou n i t ra to . A ex creção

p r inc ipa l ocor re pe la u r ina (BAYLIS & VALLANCE, 1998; ELLIS e t a l . ,

1998) .

Mu i tos exper imentos têm s ido fe i t os para se ava l i a r a par t i c ipação

do NO l i gada ao cont ro le da pressão a r te r i a l , neu rot rasmissão ,

re laxamento muscu lar , per is ta l t i smo in tes t i na l , coagu lação sanguínea,

adesão e agregação p laquetá r i a (ADAMS, 1996 ; JORES e t a l ., 1992;

FAHEY et a l ., 1996 ; WALDECK et a l ., 1998; RADOMSKI e t a l ., 1990;

24

FA INT e t a l ., 1991 ; LORENTE et a l ., 1996) , bem como ver i f i ca r sua

par t i c ipação na b io log ia de tumores (AMBER et a l ., 1988; STUEHR &

NATHAN, 1989) , reações i n f l amató r ias au to - imunes (SINGH e t a l .,

2000) , no choque sépt i co (TRZECIAK e t a l . , 2008) e em doenças

i n f l amató r i as (GRABBE & SCHUWARZ, 1998) .

A l i t e ra tu ra desc reve t rês i soenz imas de Óx ido Ní t ri co S in tases

(NOS) p resen tes no c i t oso l , sendo duas cons t i t u t i vas (eNOS e nNOS) e

uma induz íve l ( iNOS) (CERQUEIRA & YOSHIDA, 2002) ,

es t ru tu ra lmen te semelhan tes , mas regu ladas de d i fe ren tes fo rmas . As

cNOS oco r rem em duas i so fo rmas , neu rona l (nNOS) e endote l i a l (eNOS),

a nNOS es tá envo lv ida com p rocessos homeos tá t i cos como

neuro t ransmissão, pe r i s ta l t i smo e a eNOS com cont role imed ia to da

p ressão a r te r i a l e vasod i l a tação (F ILHO & ZILBERSTEIN , 2000) .

As cNOS têm peso molecu lar de 133 kDa ap resentando-se nas

fo rmas monomér i cas , são regu ladas por um mecan ismo Ca2 +/ ca lmodu l ina

que a t i va e ina t i va as enz imas, es tas têm s ín tese basa l e p roduzem

concent rações p i comola res de NO. Ao con t rá r i o , Óx ido N í t r i co S in tase

i nduz íve l ( iNOS) necess i t a da Ca2 +/ ca lmodu l ina apenas para sua

a t i vação , não oco r rendo ina t i vação quando a concen tração de cá l c io ca i .

A iNOS é expressa quando há indução da s ín tese do RNAm por

endo tox inas bac te r i anas , l i popo l i sacár i des (LPS) , ou c i t oc inas

re lac ionadas com respos ta do T ipo 1 , como IFN-γ , TNF-α , IL -1 β. Esta

enz ima t em peso molecu lar de 130 kDa e ap resen ta-se sob a fo rma de

monômero e te t râmero . A at i vação da iNOS leva a concent rações

nanomola res de NO (1000 vezes maio r que as cNOS) e a ação dessa

enz ima requer n i co t i namida aden ina d inuc leo t ídeo fos fa to (NADPH) ,

t e t rah id rob iop te r ina (BH4) , f l av ina aden ina d inuc leo t ídeo (FAD) , f l av ina

mononuc leo t ídeo (FMN) , O2 e heme como co fa to res ( IGNARRO, 1996; L I

& POULOS, 2005; TE IXE IRA e t a l ., 2002) .

A loca l i zação imuno-h is toquím ica de iNOS no baço de ra tos ,

i nduz ida po r Prop ion ibacte r ium acnes e LPS fo i demonst rada em

macró fagos , a lguns l in fóc i t os , neut ró f i los e eos inóf i l os , suger indo ass im

a ex pressão da enz ima em vár ios t ipos ce lu la res (FÖRSTERMANN &

DUN, 1996) .

25

A geração de NO é ca rac te r ís t i ca de cé lu las do s is tema imune ta is

como: cé lu las dendr í t i cas , NK, monóc i tos , macró fagos , m ic róg l i a ,

cé lu las de Kupf fe r , eos inó f i l os e neu t ró f i l os . A lém d is to , ou t ros t ipos

ce lu la res como: cé lu las endo te l i a i s , ep i t e l i a is , célu las da muscu la tu ra

l i sa , f ib rob las tos , condróc i t os , hepatóc i tos , cé lu las mesang ia i s e cé lu las

de Schwann também são po tenc ia i s p roduto ras de NO (MONCADA e t a l .,

1991) .

O p roduto da ox idação do NO gerado pe las cé lu las o ri g ina n i t r i t os

e n i t ra tos (MARLETTA, 1988; MARLETTA e t a l ., 1988 ; MAYER e t a l .,

1989) e sua a t i v i dade an t im icrob iana tem s ido demonst rada po r uma sér ie

de exper imentos , sendo que há ev idênc ias demonst rando que a p rodução

de NO é par te i n tegran te da respos ta do hospede i ro à in fecção

(MACMICKING e t a l. ,1997) .

A l t a p rodução de NO por macró fagos depende de L-a rgin ina

ex t race lu la r em quan t idades adequadas (HEVEL & MARLETTA, 1992) .

Na maio r i a dos t ipos ce lu la res , o t ranspor te da a rgin ina oco r re v ia

s is tema ca t i ôn i co i ndependente do pH e Na+ , enquan to a a t i v i dade é

med iada po r uma famí l i a de p ro te ínas t ranspor tado ras de aminoác idos

ca t i ôn i cos (CAT1 , CAT2A, CAT2B) (N ICHOLSON e t a l ., 2001) . O

per fe i t o func ionamento desse s is tema é en tão necessár io pa ra que o

s is tema de de fesa in t race lu la r a tue .

A NADPH ox idase e a iNOS são enz imas envo lv idas na p rodução

de i n te rmed iá r ios do ox igên io e espéc ies rea t i vas do n i t rogên io

respec t i vamente . A fusão dessas mo lécu las a l t amente reat i vas pode gera r

pe rox in i t r i to (OONO-) , S -n i t ro t io is (RSNO), óx ido de n i t rogên io I I I

(N 2O3) , t e t róx ido de d in i t rogên io IV (N2O4) e complexos d in i t ros i l - fe r ro

(CDNF) (CERQUEIRA & YOSHIDA, 2002; PACHER e t a l ., 2007) ,

l evando à fo rmação de vá r i as mo lécu las com poder ant im ic rob iano.

O NO pode es ta r re lac ionado tan to na defesa do hospede i ro

(BRANDONIS IO e t a l. , 2001; PANARO e t a l. , 2001) e com a v i ru lênc ia

de p ro tozoár ios (HERTZ & MANSFIE LD, 1999 ; GENESTRA et a l .,

2006a) .

Pesqu isadores re la tam a p resença de mo lécu las p ro teto ras

p resentes na membrana ce lu lar des tes paras i tos , t a is como: g l i co l íp ides ,

26

g l i co inos i to l fos fo l íp ides e l ipo fos fog l i cano (LPG) , os ú l t imos com

potenc ia l capac idade in ib ido ra de s ín tese de NO, quando macró fagos

a inda não fo ram at i vados pe lo IFN-γ . Es tes es tudos re la tam que LPG

podem in ib i r a s ín tese de IL -12 e en tão b loquear i nd i re tamente a indução

da iNOS (L IEW e t a l ., 1997) .

A p rodução de NO e a t i v idade an t i -Le ishmania fo i de tec tada em

l inhagem de macró fagos can inos i n fec tados após incubação com IFN-γ ,

TNF-α e IL -2 (P INE LLI e t a l ., 2000) . Ou t ros pesqu isadores

demonst ra ram a impor tânc ia da geração de NO como m ic rob ic ida , em

LVC, usando cu l t u ra de cé lu las mononuc leares do sangue per i fé r i co de

cães exper imenta lmente i n fec tados com L. (L . ) chagas i, nas qua i s o

i n i b ido r especí f i co da iNOS, aminoguan id ina (AMG), l evou ao aumento

da ca rga paras i t á r ia e d im inu i ção dos n í ve is de NO em sobrenadan te de

cu l tu ra (RODRIGUES e t a l ., 2007) .

A impor tânc ia l e ishmanic ida do NO v ia iNOS em cu l tura de

macró fagos mur inos , t ambém usando i n ib ido res específ i cos da enz ima

mos t ra ram que a a t i v i dade da iNOS é c ruc ia l para con t ro le da

pers is tênc ia da Leishmania em hospede i ros imunocompetentes após a

reso lução da in fecção p r imár ia . D ive rsos t raba lhos demonst ram que a

fa lha em mante r iNOS at i va pode l evar a uma reat i vação de in fecção

l a ten te causada po r o rgan ismos sens íve i s ao NO, duran te a fase de

imunossupressão (L IEW e t a l ., 1990a; STENGER e t a l ., 1996) .

O NO e a sua capac idade l e i shmanic ida em macró fagos de cães

vac inados com promast i go tas de Le ishman ia (L . ) in fan tum ap resenta ram

assoc iação en t re a p rodução de NO induz ido po r IFN-γ (BACELLAR e t

a l . , 2000 ; PANARO e t a l ., 2001) . Refo rçando a impor tânc ia do NO como

m ic rob ic ida , demonst rou -se um aumen to da expressão de iNOS em

cu l tu ra de macró fagos can inos in fec tados com Leishman ia (L . ) in fan tum

es t imu lados com IFN-γ . Naque le es tudo, a maio r exp ressão de iNOS

levou ao aumento na p rodução de NO (S ISTO e t a l ., 2001) .

A iNOS tem s ido assoc iada a res is tênc ia à in fecção por

Leishmania ma jo r em camundongos C57BL/6 , nos qua i s t em s ido

demonst rada a ex pressão des ta enz ima desde o in í c io da i n fecção na

27

pe le . Cont ra r i amente , macró fagos de camundongos BALB/c , suscep t íve i s

à i n fecção , ap resen tam n íve i s menores de exp ressão de iNOS dev ido à

i n i b i ção causada por TGF-β e d im inu i ção da respos ta ao IFN-

γ (STENGER e t a l ., 1994; BOGDAN, 1997; 2001) .

GANTT e t a l ., (2003) ava l i ando os mecan ismos de de fesa das

l e i shmanias “ i n v i t ro ” mos t ra ram que es tas podem l ibera r p ro tease

ca teps ina B , capazes de a t i var TGF-β l a ten te e ass im a t i va r a a rg inase . O

TGF-β a tua r i a de fo rma a pro longar o pa ras i t i smo , i n ib indo o s i s tema de

de fesa dos macró fagos e des ta fo rma d iminu indo a p rodução de NO.

Re la ta -se que a po la r i zação da respos ta T ipo 1 (Th1) é e f i c i en te

na geração de NO e es tá assoc iada com doenças i n f l amató r i as e

e l im inação de patógenos in t race lu la res v ia iNOS. Em con t ras te , quando

p redominam no me io ex t race lu la r c i t oc inas como IL-4, IL -5 , IL-10 e

TGF-β ocor re i n i b i ção da produção de NO ( respos ta T ipo 2 ou Th2)

(NAGELKERKEN e t a l ., 1993; BACELLAR e t a l ., 2000) . Exper imentos

demonst ra ram que o p redomín io de cé lu las do T ipo 2 , com aumentada

p rodução de IL-4 , ca rac te r i zam-se po r não se rem p rote to ras con t ra as

l e i shmanioses , ocor rendo exacerbação dos s in tomas (LOHOFF e t a l .,

1997) .

Os e fe to res ce lu la res Th1 e Th2 se or i g inam a par t ir de cé lu las

p recurso ras chamadas Thp. Es tas quando são es t imu ladas pe la IL -12 dão

o r i gem a cé lu las T ipo 1 e quando es t imu ladas pe la IL -4 o r i g inam cé lu las

T ipo 2 (MOSMANN & COFFMAN, 1989) . En t re tan to , são mui tos os

fa to res que in f l uenc iam na po la r i zação para um dos t i pos de respos ta

imune f ren te a paras i tos do gênero Leishmania spp . Recentemente fo i

desc r i t o que a lém das popu lações e fe to ras der i vadas de LT aux i l i a res

desc r i t as ac ima, a ex is tênc ia de cé lu las T regu la tór i as (T CD4+CD25+ )

poder iam favo recer a i n fecção levando uma modu lação da imun idade

p ro te to ra ao paras i to (L IU e t a l ., 2003; XU e t a l ., 2003) .

Es tudos re la ta ram que cães natura lmente i n fec tados com

Leishmania (L . ) chagas i, s in tomát i cos , apresenta ram ma iores n íve is de

c i t oc inas IL-10 e TGF-β (BELKA ID e t a l ., 2001; CORREA e t a l ., 2007) ,

suger indo que a ex i s tênc ia de cé lu las regu la tó r i as poder ia i n f luenc ia r a

28

i n te ração paras i to -hospede i ro e des ta fo rma favo recer a man i fes tação de

fo rmas c l ín i cas graves na LVC.

A lém da sua par t i c i pação na imun idade a i n fecções , o NO pode

es ta r envo lv ido em p rocessos imunopato lóg i cos , po is sua a l t a reat i v idade

pode ocas ionar danos ce lu la res acar re tando um e fe i to tóx i co indese jáve l

no compar t imento ce lu la r . Há consenso de que o e fe it o c i t o tóx ico do NO

oco r re dev ido à s inerg ia com o íon superóx ido , p r i nc ipa lmente pe lo

subprodu to perox in i t r i to ( ISCHIROPOULOS, 2004; NORMAN & L IEW,

1995) . Es te p rodu to do NO é também um fo r te ox idante e pode reag i r

d i re tamen te com ampla gama de molécu las p resen tes no meio ce lu la r ,

p r inc ipa lmente os g rupos r i cos em e lé t rons , sua me ia v ida é cu r ta (~10 –

20 ms) , mas su f i c i en te para c ruzar a membrana ce lu lar , d i fund indo -se

uma a duas cé lu las de d iâmet ro (DENICOLA e t a l. , 1998) . Seus

p r inc ipa is a lvos são p ro te ínas , sendo i nc lus i ve capaz de i na t i var a iNOS

po r mod i f i cação ox idat i va de seu grupo heme (HUHMER e t a l. , 1997) ,

aminoác idos , p r inc ipa lmente ox idação das c i s te inas (SH IBATA e t a l. ,

1996) e po r mecan ismos ind i re tos de reações qu ímicas l eva a n i t ração de

t i ros inas , a fe tando a es t ru tu ra e função p ro té i ca , resu l tando na geração

de ep i t opos an t i gên i cos , mudança na a t i v idade de enz imas , a l t e rada

o rgan ização do c i to -esque le to e a l t e rações impor tantes na t ransdução de

s ina i s (SCHOPFER e t a l. , 2003) . J á se demonst rou seu po tenc ia l

ox idat i vo também sobre os aminoác idos t r i p to fano , met ion ina e

h is t id ina , a lém de reag i r com l i p íd ios e ác idos nuclé icos (PACHER et

a l . , 2007) .

Ev idênc ias es tão se acumulando no sen t ido de admi t ir que o NO

cont r i bua para a lgumas cond ições pa to lóg i cas como asma, a r t r i te

reumató ide, l esões a te rosc le ró t i cas , t ubercu lose, esc le rose múl t ip l a ,

A lzhe imei r e gas t r i te induz ida por Hel i cobacter py lo r i (DUSSE et a l. ,

2003) .

A ava l i ação da expressão da enz ima iNOS em tec ido esp lên i co de

cães natu ra lmente in fec tados Le ishmania (L . ) chagas i, bem como a

quan t i f i cação sé r ica de NO é um tóp i co pouco inves ti gado . A lém d isso , a

assoc iação en t re esses b iomarcadores , as d i fe ren tes fo rmas c l ín i cas , os

g raus de paras i t i smo esp lên i co e suas co r re lações com o per f i l de

29

c i t oc inas e subc lasses de an t i co rpos pode aux i l i a r no en tend imento da

imunopa togênese da LVC. Nes te sent ido , o p resente traba lho , buscou

fo rnecer i n fo rmações ad i c iona i s à e luc idação do complexo mecan ismo de

i n te ração paras i t o -hospede i ro na LVC cons iderando o compar t imen to

esp lên i co como um impor tan te ó rgão l i n fó ide a t ing ido pe lo paras i t o .

30

2 OBJET IVOS

2 .1 OBJ ETIVO GERAL

Cor re lac ionar n í ve is sé r i cos de NO e a exp ressão da enz ima iNOS

no baço com per f i l de c i t oc inas e subc lasses de Ig de cães na tu ra lmente

i n fec tados com Leishmania (Le i shmania ) chagas i , apresentando

d i fe ren tes fo rmas c l ín i cas e g raus de paras i t i smo esp lên i co .

2 .2 OBJ ETIVOS ESPECÍF ICOS

2 .2 .1 De te rminar a ca rga paras i t á r i a no baço de cães natu ra lmente

i n fec tados com L . (L . ) chagas i po r tado res de d i fe ren tes fo rmas c l ín icas

de l e i shmaniose e de f in i r os g raus de paras i t i smo esp lên i co

2 .2 .2 De te rminar os n í ve is do óx ido n í t r i co sé r i co de cães

na tu ra lmente i n fec tados com L. (L . ) chagas i e assoc ia r os resu l t ados com

as fo rmas c l í n i cas e g raus de paras i t i smo esp lên i co.

2 .2 .3 Ava l i a r a exp ressão da enz ima iNOS em baço de cães

na tu ra lmente i n fec tados com L. (L . ) chagas i e assoc ia r os resu l t ados com

as fo rmas c l í n i cas e g raus de paras i t i smo esp lên i co.

2 .2 .4 Assoc ia r os per f i s de exp ressão de iNOS em baço e os n íve is de

NO sér i cos com a produção das c i toc inas INF-γ , TNF-α e IL -10 .

2 .2 .5 Assoc ia r os per f i s de ex pressão de iNOS em tec ido esp lên i co e

os n íve is sé r icos de NO com os n í ve is de IgG1 , IgG2 e IgG to ta l an t i -

Leishmania.

31

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Este es tudo é f ru to de uma co laboração en t re o Núc leo de

Pesqu isa em Imuno log ia da UNIVALE e o Labora tó r io de Imunopato log ia

do NUPEB/UFOP.

O banco de dados d i sponíve l pa ra c i t oc inas e an t i corpos des tes

an imais poss ib i l i t ou aná l i ses de co r re lações en t re os n í ve is sér i cos de

NO e ex pressão esp lên i ca de iNOS com a exp ressão esp lên i ca de IL-10 ,

IFN- γ , TNF-α e n íve is sé r i cos de Ι gG1, IgG2 e IgG to ta l an t i–

Leishmania .

3 .1 ANIMAIS

Soro e f ragmen tos de baço de 35 cães sem raça de f i nida (SRD) de

ambos os sexos , com idade es t imada en t re 2 a 6 anos, p rocedentes do

cen t ro de con t ro le de zoonoses (CCZ) de Be lo Hor izon te – MG, fo ram

se lec ionados para es te es tudo. O uso ex per imenta l des tes fo i ap rovado

pe lo comi tê de é t i ca da UFMG (CETEA) . Os an imais hav iam s ido

p rev iamente t ra tados com ant i -he lmín t i cos de l a rgo espect ro (Enda l

p lus®) e imun izados cont ra parvov i rose, l ep tosp i rose , pa ra in f luenza e

hepat i t e (P f i zer®) . Os cães inser i dos nes te es tudo ap resentavam tes tes

so ro lóg i cos pe la Reação de Imuno f l uo rêscenc ia Ind i re ta (R IF I) e ELISA

pos i t i vos (C I) .

Dez cães com t í tu los in fe r io res a 1 :40 (R IF I) , ex ames

paras i t o lóg i cos nega t ivos e c l i n i camen te sad ios fo ram cons iderados não

i n fec tados e i nc lu ídos no grupo cont ro le (CNI) .

32

3 .2 AVALIAÇÃO CLÍN ICA

Os cães so ropos i t i vos po r R IF I fo ram c l in icamente class i f i cados

de aco rdo com presença ou ausênc ia de s ina is c l ín icos em: Ass in tomát i co

(CA, n=10) , quando não hav ia s ina i s ou s in tomas da doença;

O l i goss in tomát i co (CO, n=10) , com no máx imo t rês s ina i s c l ín i cos

i nc lu indo có rnea opaca e /ou a lopec ia e /ou moderada perda de peso;

S in tomát i co (CS , n=15) , apresentando s ina i s c l ín i cos de l e i shmaniose

v isce ra l , com córneas opacas , severa perda de peso , on icogr i fose, l esões

cu tâneas , apat ia e ce ra to -con jun t i v i t e . A ava l i ação c l ín ica fo ra rea l i zada

po r um méd ico veter i ná r io t re inado em LVC.

3 .3 ANÁLISE PARASITOLÓGICA

Após nec rops ia , amos t ras do baço dos cães so ropos i ti vos fo ram

submet idas a exames paras i t o lóg icos para pesqu isa de fo rmas

amas t i go tas de Leishmania po r meio de es f regaços e c lass i f i cados de

aco rdo com a ca rga paras i t á r i a . Nes te t raba lho fo i usado o índ i ce de

ca rga paras i tá r ia ob t i do pe la aná l i se do tec ido esplên i co .

Amost ras do baço fo ram co le tadas e impressões fo ram rea l i zadas

em duas l âm inas m ic roscóp i cas que após secas ao a r fo ram f i xadas em

metano l , co radas com Giemsa e examinadas ao mic roscóp io óp t i co . Fo i

con tado o número de fo rmas amast i go tas po r 1000 cé lu las nuc leadas e os

resu l t ados ex pressos como “Le i shman Donovan Un i ts ” (LDU) de aco rdo

com STAUBER (1955) mod i f i cado po r REIS e t a l . (2006 a ,b ,c ) .

O paras i t i smo esp lên i co fo i ca tegor izado como ba ixo (BP) , méd io

(MP) e a l t o paras i t i smo (AP) con fo rme os va lo res de LDU

es ta t i s t i camente catego r izados em terc i s da segu in te fo rma: BP (0 – 10 ) ,

MP (11– 250) e AP (251 – 2564) de aco rdo com LAGE et a l . (2007) .

33

3 .4 QUANTIF ICAÇÃO SÉRICA DE NO

A ava l i ação da concen t ração de NO sér i co fo i rea l izada pe la med ida

de n i t r i t os (NO2- ) e n i t ra tos (NO3

- ) , de aco rdo com a reação de Gr iess

(GREEN e t a l ., 1982; GUTMAN & HOLLYWOOD, 1992) . Os so ros dos

cães fo ram cod i f i cados an tes da rea l i zação da dosagem e decod i f i cados

após , com pos te r i o r aná l i se dos dados ob t i dos .

Para ava l i ação dos n íve i s sér i cos de NO, a 100 µ L de so ro de cada

cão d i lu ído 1 :4 em água des t i l ada fo ram ad i c ionados 10 µL de n i t ra to

redutase (1U/mL) (S igma-A ld r i ch Co. , S t . Lou i s , MO, USA) , 10 µL de

NADPH (6mM) (S igma-A ld r i ch Co. , S t . Lou is , MO, USA) e 10 µL de

FAD (200 mM) (S igma-A ld r i ch Co . , S t . Lou is , MO, USA) . Es te

p roced imento fo i necessár io pa ra reduz i r n i t ra to (NO3- ) em n i t r i t o (NO2) .

Após um per íodo de incubação po r 12 horas a 37oC, as amost ras fo ram

submet idas ao t ra tamento com 1 /20 de su l fa to de z inco (300g/L) (S igma-

A ldr i ch Co . , S t Lou is , MO, USA) . Subseqüen temente , as amost ras fo ram

cen t r i f ugadas a 10000g po r 15 minu tos . Após cent r i fugação , 100 µL de

cada amos t ra fo ram ad i c ionadas em dup l i ca ta em p lacas de 96 poços de

fundo p lano . Pos ter i o rmente , fo ram ad i c ionados 100 µ L de reagente de

Gr iess (0 .1% naphth yle thylend iam ine d ihyd roch lo r ide, 1%

su lphanylam ide , 5% phosphor i c ac id ) (S igma-A ld r i ch Co . , S t Lou is , MO,

USA) às amost ras p rocessadas de so ro . Após i ncubação em câmara

escu ra po r 10 minu tos , as amost ras fo ram submet idas ao l e i t o r

au tomát i co de mic rop lacas e a abso rbânc ia fo i ava l iada no compr imento

de onda de 570 nm. A concent ração de n i t r i t o das amost ras fo i

de terminada pe la ex t rapo lação da cu rva -padrão de d ilu ição da so lução de

n i t r i t o de sód io (com var i ação l inear de 0 ,78 -100 µmol /L) poss ib i l i t ando

a iden t i f i cação de va lo res de cada amost ra . Os resul t ados (em µM) fo ram

ex p ressos como méd ia da concen t ração de NO sér i co .

34

3 .5 REAÇÃO IMUNO-H ISTOQUÍM ICA PARA DETECÇÃO DE INOS

Co r tes h i s to lóg i cos p rocessados e para f in izados foram submet idos à

m ic ro tomia para a ob tenção de 2 cor tes com espessu ra de 4 µm e es tes

fo ram f i xados em lâminas ge la t i n izadas . A segu i r , os co r tes fo ram

despara f in izados em x i lo l (do i s banhos de 15 minu tos cada) , h id ra tados

em concent rações dec rescentes de á l coo l (100 , 90 , 80 e 70%) em banhos

de 5 m inu tos cada . Em segu ida , os co r tes fo ram lavados em água

co r ren te po r 5 minu tos e en tão se p rocedeu ao b loque io da perox idase

endógena (180ml de á l coo l met í l i co /20mL de peróx ido de h id rogên io

30%) por 30 minu tos à tempera tu ra ambien te . Segu iu -se a l avagem em

PBS com t rês banhos de 5 minu tos cada .

Para a recuperação an t i gên i ca fo i u t i l i zado o tampão c i t ra to pH

6 .0 em fo rno de mic roondas po r 10 minu tos . Depo is de re t i radas do fo rno

de m icroondas , os co r tes fo ram de ixados à temperatura amb ien te para

oco r re r um res f r iamento p rogress i vo dos mesmos a inda imersos no

tampão c i t ra to pH 6 .0 . Só en tão fo ram lavados em PBS, em t rês banhos

de 5 minu tos cada .

Após a secagem das bo rdas dos co r tes com pape l absorvente ,

ap l i cou -se o soro no rmal de cava lo (R .T .U . Vectas tain Un iversa l E l i t e

ABC; Vecto r Labora to r ies , Inc . ) po r 30 minu tos em câmara úmida a

37°C, com o ob je t i vo de b loquear s í t i os i nespec í f i cos . Em segu ida ,

secou-se o excesso de so ro no rma l de cava lo e os cor tes fo ram incubados

po r 18 ho ras em câmara úm ida a 4°C com o an t i co rpo po l i c lona l IGG de

coe lho an t i - iNOS (Rabb i t an t i -Mouse iNOS, SC-651 , Santa C ruz

B io techno logy, INC. ) d i l u ído 1 :200 em so lução d i l uen te de an t i co rpo

com componentes redutores de “background” (DakoCytomat ion , USA) .

Pos te r i o rmen te , os co r tes fo ram lavados em PBS e i ncubados com

o an t i co rpo secundár io b io t in i l ado (R .T .U. Vectas tain Un ive rsa l E l i t e

ABC; Vecto r Labora to r ies , Inc . ) po r 30 minu tos em câmara úmida a

37°C. Segu i ram-se t rês banhos de 5 m inu tos cada, em PBS. Os co r tes

fo ram en tão incubados com o complexo ABC (R .T .U. Vec tas ta in

Un ive rsa l E l i t e ABC; Vector Labora tor i es , Inc . ) po r 30 m inu tos em

35

câmara úmida a 37°C . Segu iu -se a lavagem em PBS, t rês banhos de 5

m inu tos cada. A reve lação da reação da perox idase fo i ob t i da a t ravés da

i ncubação em so lução de DAB (50mg de d iaminobenz id ina em 250 mL de

PBS e 500 µL de Peróx ido de H id rogên io 30%) du ran te 5 minu tos . No

i n tu i t o de i n te r romper a reve lação, os co r tes fo ram lavados em água

co r ren te po r c inco m inu tos .

Para rea l i za r a con t ra -co lo ração , fo i u t i l i zado Hematox i l i na de

Har r i s por 10 segundos à temperatu ra amb ien te segu ida pe la l avagem dos

co r tes por 5 minu tos em água co r ren te . O mate r i a l fo i des id ra tado em

á l coo l 100% e seco em es tu fa 56°C. Após a secagem as l âminas fo ram

mon tadas com res ina (P ró -C i to ) e l amínu la .

Como cont ro le da reação fo ram inc lu ídos co r tes de pe le ob t idos de

cão inocu lado com ant ígeno de Leishmania (V iann ia ) b ras i l i ens is e

sapon ina, que j á hav ia most rado a l t a ex pressão de iNOS, du ran te a fase

de padron ização da reação imuno-h is toquímica . Como con t ro le nega t ivo ,

omi t iu -se o an t i corpo an t i - iNOS, que fo i subs t i t u ído po r PBS em uma

lâm ina . Os tec idos ass im obt idos fo ram u t i l i zados para ana l i sa r a

ex p ressão de iNOS no baço. Es te exper imento fo i real i zado em dup l i ca ta

em d ias d i fe ren tes e em cada ba ter i a hav ia 1 cont role pos i t i vo e 1

cont ro le nega t i vo . As l âminas fo ram submet idas à aná l i se qua l i t a t i va

usando-se mic roscóp io óp t i co e pos te r io rmente à anál i se quant i t a t i va da

ex p ressão de iNOS a t ravés de mic roscóp io Le i ca DM 5000/Le i ca CTR

5000 , p rocessadas com o aux í l i o do so f tware Le i ca Qwin P lus ,

ana l i sando-se 20 campos a leató r i os de cada l âm ina e os resu l t ados

ex p ressos em µm2 . Seqüenc ia lmen te os d i fe ren tes grupos c l í n i cos fo ram

assoc iados aos resu l tados de exp ressão de iNOS.

Fo ram u t i l i zados d i fe ren tes parâmet ros na observação da

ex p ressão da iNOS, a saber : d i fusa (quando a marcação oco r r i a em toda

ex tensão do campo mic roscóp io ana l i sado) , foca l (quando os focos de

marcação f i cavam de l im i tados em áreas bem de f in idas) e pontua l

(quando cé lu las marcadas i so ladamen te e ram observadas ) .

36

3 .6 ANÁLISES ESTATÍST ICAS

Rea l i za ram-se aná l i ses es ta t ís t i cas u t i l i zando-se tes tes espec í f i cos

para compara r os resu l t ados das dosagens de NO em so ro e exp ressão de

iNOS esp lên i ca com o apo io ins t rumenta l do so f tware PRISM 4 .0

adotando-se n í ve l de s ign i f i cânc ia a 5%. Os dados fo ram submet idos aos

tes tes não paramét r i cos . Para aná l i se da ca rga paras i t á r i a po r g rupos

c l í n i cos , dos n í ve is sé r icos de NO por g rupos c l í n icos , n íve i s sé r i cos de

NO po r carga paras i t á r i a , ava l i ação quan t i t a t i va de iNOS po r g rupos

c l í n i cos e ava l iação quan t i t a t i va de iNOS po r ca rga paras i t á r i a fo i usado

o tes te de Kruska l Wal l i s . Os d i fe ren tes graus de paras i t i smo esp lên i co

fo ram es t imados po r t e rc i s . Para aná l i se dos n í ve i s de NO ent re an imais

i n fec tados e não i n fec tados usou-se o tes te de Mann-Whi tney. Para

aná l i ses de co r re lação en t re n í ve is sér i cos de NO e per f i l sé r i co de Ig ,

co r re lação en t re n íve is sé r i cos de NO e dens idade paras i tá r ia esp lên i ca ,

co r re lação en t re n íve is sé r i cos de NO e per f i l de ci t oc inas esp lên i cas ,

co r re lação en t re exp ressão esp lên i ca de iNOS e per fi l sé r i co de Ig e

co r re lação en t re exp ressão esp lên i ca de iNOS e per fi l de c i t oc inas

esp lên i cas usou-se co r re lação de Spearman .

37

4 RESULTADOS

4 .1 DETERMINAÇÃO DA CARGA PARASITÁRIA

4 .1 .1 Carga pa ras i tá r ia po r fo rma c l í n i ca

A carga paras i t á r ia esp lên i ca dos d i fe ren tes grupos c l í n i cos de

cães catego r izados em CA, CO e CS ap resentou med iana de LDU igua i s a

2 , 20 e 298 respec t i vamente , havendo d i fe rença s igni f i ca t i va en t re os

g rupos (p<0 ,01 ) . Ver i f i cou -se aumento da ca rga paras i tá r i a assoc iada à

maio r g rav idade da LVC, como demons t rado na F igu ra 1 .

F i g u r a 1 - D e n s i d a d e p a r a s i t á r i a e s p l ê n i c a ( L D U – “ Le i s h ma n i a D o n o v a n U n i t s ” ) p o r f o r ma c l í n i c a d e l e i s h ma n i o s e vi s c e r a l c a n i n a . C ã e s a s s i n t o má t i c o s ( C A ; n = 1 0 ) , c ã e s o l i g o s s i n t o mát i c o s ( C O ; n = 1 0 ) e c ã e s s i n t o má t i c o s ( C S ; n = 1 5 ) . D i f e r e n ç a s i g n i f i ca t i v a r e p r e s e n t a d a p o r p < 0 , 0 1 ; T e s t e d e K r u s k a l W a l l i s e p ó s - t e s t e d e D u n n .

38

4 .1 .2 Ca tegor i zação por g raus de paras i t i smo esp lêni co

O paras i t i smo esp lên i co fo i ca tegor izado como ba ixo (BP) , méd io

(MP) e a l t o paras i t i smo (AP) con fo rme os va lo res de LDU

es ta t i s t i camente catego r izados em terc i s da segu in te fo rma: BP (0 – 10 ) ,

MP (11– 250) e AP (251 – 2564) . Es ta c lass i f i cação permi t iu es t imar o

percen tua l de grau paras i t i smo por g rupo c l ín ico . Fo i observado que o

g rupo CS ap resen tava 53 ,3% de AP , 33 ,3% de MP e apenas 13 ,3% de BP;

O grupo CO apresen tava 20% de AP, 50% de MP e 30% de BP; Enquanto

o g rupo CA ap resen tava 30% de MP e 70% de BP (Tabe la 1 ) .

T a b e l a 1 - F r e q ü ê n c i a d e g r a u s d e p a r a s i t i s mo e s p l ê ni c o a s s o c i a d o a f o r ma s c l í n i c a s e m c ã e s n a t u r a l me n t e i n f e c t a d o s c o m L e i s h m a n i a ( L . ) c h a g a s i

G R A U D E

P A R A S I T I S M O F O R M A S C L Í N I C A S

C A % C O % C S %

B P ( n = 1 2 ) 7 0 3 0 1 3 , 3

M P ( n = 1 3 ) 3 0 5 0 3 3 , 3

A P ( n = 1 0 ) 0 2 0 5 3 , 3

T o t a l % 1 0 0 1 0 0 1 0 0

C A – C ã e s a s s i n t o má t i c o s ; C O – C ã e s o l i g o s s i n t o má t ic o s ; C S – C ã e s s i n t o má t i c o s ; B P – B a i x o p a r a s i t i s mo ; M P - M é d i o p a r a s i t i s mo ; A P – A l t o p a r a s i t i s mo . ( n = 3 5 ) .

4 .2 N ÍVE IS SÉRICOS DE ÓXIDO N ÍTRICO

A dete rm inação dos n í ve is sé r i cos de óx ido n í t r i co fo i rea l i zada

de acordo com a redução de n i t ra tos a n i t r i tos , es tes reve lados pe la

reação de Gr iess e os resu l t ados assoc iados às fo rmas c l ín i cas dos cães ,

bem como ao grau de paras i t i smo esp lên i co .

39

4 .2 .1 Dosagem de NO sér i co em cães não i n fec tados comparados a

cães i n fec tados

Os n í ve i s sé r i cos de NO (NO2- e NO3

- ) f o ram dete rminados em

CNI e C I ap resentando d i fe ren tes fo rmas c l ín icas da le i shmaniose. C I

ap resenta ram maiores n íve i s sé r i cos de NO quando comparados a CNI,

ap resentando med ianas 14 ,92 e 4 ,44 µM respect i vamente (p<0 ,05)

(F igu ra 2 ) . En t re tan to , quando os va lo res de NO de C I fo ram separados

de acordo com a fo rma c l í n i ca observou -se d i fe rença s ign i f i ca t i va apenas

en t re CS e CNI, sendo as med ianas de CA, CO e CS respec t i vamente

5 ,42 ; 3 ,95 e 23 ,75 µM (p<0,01 ) (F igu ra 3 ) .

F igu ra 2 – N í v e i s s é r i c o s d e N O ( N O2- e N O3

- ) e m c ã e s n ã o i n f e c t a d o s ( C N I ; n = 1 0 ) , c o mp a r a d o s a c ã e s n a t u r a l me n t e i n f e c t a d o s c o m L . ( L . ) c h a g a s i ( C I ; n = 3 5 ) . D i f e r e n ç a s s i g n i f i c a t i v a s r e p r e s e n t a d a s p o r ( p < 0 , 0 5) ; T e s t e d e M a n n W h i t n e y .

40

F i g u r a 3 - N í v e i s s é r i c o s d e N O ( N O2- e N O3

- ) d e c ã e s n ã o i n f e c t a d o s ( C N I ; n = 1 0 ) , c o mp a r a d o s a c ã e s a s s i n t o má t i c o s ( C A ; n = 1 0 ) , c ã e s o l i g o s s i n t o má t i c o s ( C O ; n = 1 0 ) e c ã e s s i n t o má t i c o s (C S ; n = 1 5 ) . D i f e r e n ç a s s i g n i f i c a t i v a s r e p r e s e n t a d a s p o r ( p < 0 , 0 1) ; T e s t e d e K r u s k a l W a l l i s e p ó s - t e s t e d e D u n n . .

4 .2 .2 De te rminação dos n í ve i s sé r i cos de NO comparada por ca rga

pa ras i tá r i a

Fo ram ava l i ados também os n í ve is sé r i cos de NO de aco rdo com o

grau de paras i t i smo esp lên i co . Observa-se que a mediana de NO do grupo

com BP (1 ,49 µM) é s ign i f i ca t i vamen te menor que a med iana dos grupos

com MP (18 ,84 µM) e AP (26 ,37 µM) (p<0,05 ) (F igu ra 4A) . Es te

resu l t ado fo i re fo rçado pe la aná l i se de co r re lação en t re es tas va r i áve is

que reve la ram ex is t i r uma fo r te co r re lação en t re a ca rga paras i t á r i a e os

n íve i s sé r i cos de NO (p<0,0001 , r= 0 ,6444) (F igura 4B) .

41

F i g u r a 4 - A ) N í v e i s s é r i c o s d e N O ( N O2

- e N O3- ) d e c ã e s i n f e c t a d o s c o m

L e i s h m a n i a ( L . ) c h a g a s i ( C I ; n = 3 5 ) s u b d i v i d i d o s e m a n i ma i s a p r e s e n t a n d o b ai x o p a r a s i t i s mo ( B P ; L D U e n t r e 0 e 1 0 ) , mé d i o p a r a s i t i smo ( M P ; L D U e n t r e 1 1 e 2 5 0 ) e a l t o p a r a s i t i s mo ( A P ; L D U e n t r e 2 5 1 e 2 5 6 4 ) . D i f e r e n ç a s s i g n i f i c a t i v a s r e p r e s e n t a d a s p o r p < 0 , 0 5 ( e n t r e B P e M P ) e p < 0 , 0 0 1 ( e n t r e B P e A P ) . T e s t e d e K r u s k a l W a l l i s e p ó s - t e s t e d e D u n n . B ) C o r r e l a ç ã o de S p e a r ma n e n t r e N O s é r i c o e d e n s i d a d e p a r a s i t á r i a e s p l ê n i c a d e C I ( p < 0 0 0 1 , r = 0 , 6 4 4 4 , n = 3 5 ).

4 .3 ANÁLISE DE CORRELAÇÃO ENTRE OS NÍVEIS SÉRICOS DE NO COM EXPRESSÃO ESPLÊNICA DE IL-10 , IFN-γ E TNF-α E COM OS N ÍVE IS SÉRICOS DE IgG1 , IgG2 E IgG TOTAL ANTI-LEISHMANIA

Fo i rea l i zada aná l i se de cor re lação en t re os n í ve is sé r icos de NO

com os dados ob t idos por dens i t omet r i a das bandas de RT-PCR (método

semi -quant i t a t i vo ) pa ra IL -10 , IFN-γ e TNF-α e com n íve is sé r i cos de

IgG1 , IgG2 e IgG to ta l an t i -Le ishmania.

Observou -se co r re lação pos i t i va en t re os n íve is sé ri cos de NO e

ex p ressão esp lên i ca de TNF-α (p=0 ,005, r= 0 ,589 ) , não se observando

co r re lação (p>0 ,05) com IFN-γ e IL-1 0 (F igu ra 5 ) . Também se observou

co r reção pos i t i va en t re NO sér i co e n í ve is de IgG Tota l (p=0,047,

r=0 ,400 ) e IgG2 (p=0,019, r=0 ,466 ) , sendo que não houve cor re lação

des te com IgG1 (p>0 ,05 ) (F igura 6 ) .

B A

42

F i g u r a 5 – A n á l i s e s d e c o r r e l a ç ã o d o s n í v e i s s é r i c o s d e N O ( N O2

- e N O3- ) e m

c ã e s i n f e c t a d o s c o m L e i s h m a n i a ( L . ) c h a g a s i ( C I , n = 2 1 ) c o m e x p r e s s ã o e s p l ê n i c a d e I L - 1 0 ( A ; p = 0 , 9 7 1 ), I F N -γ ( B ; p = 0 , 1 8 1 ) e T N F -α ( C ; p = 0 , 0 0 5 , r = 0 , 5 8 9 ) . C o r r e l a ç ã o d e S p e a r ma n .

F i g u r a 6 - A n á l i s e d e c o r r e l a ç ã o d o s n í v e i s s é r i c o s d e N O ( N O2

- e N O3- ) d e

c ã e s n a t u r a l me n t e i n f e c t a d o s c o m L e i s h m a n i a ( L . ) c h a g a s i ( C I ; n = 2 4 ) c o m n í v e i s s é r i c o s d e I g G t o t a l a n t i -L e i s h m a n i a ( A ; p = 0 , 0 4 7 , r = 0 , 4 0 0 ) , I g G 1 ( B ; p = 0 , 9 6 4 ) e I g G 2 ( C ; p = 0 , 0 1 9 , r = 0 , 4 6 6 ) . C o r r e l a ç ã o d e S p e a r ma n.

B

0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .80

2 0

4 0

6 0

8 0

IgG 2

NOµM

p = 0 ,0 19 r = 0 ,4 66

C

1 .50 .0 0 .5 1 .00

2 0

4 0

6 0

8 0

IgG 1

NO

(µM

) p = 0 ,9 64

0 .00 0 .15 0 .30 0 .45 0 .600

2 0

4 0

6 0

8 0

IgG T o ta l

NO

(µM

)

p = 0 ,0 47 r = 0 ,4 00

A

0 1 0 2 0 3 0 0

2 0

4 0

6 0

I F N - γ

NO

(µ

M)

p = 0 , 1 8 1

0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 00

2 0

4 0

6 0

8 0

I L - 1 0

8 0N

O (µ

M) p = 0 , 9 7 1

A B

0 1 0 2 0 3 0

r = 0 , 5 8 9 p = 0 , 0 0 5

C

NO

(µ

M)

8 0

6 0

4 0

2 0

0

T N F -α

43

4.4 EXPRESSÃO ESPLÊNICA DE iNOS

4 .4 .1 Aná l i se semi -quan t i ta t i va de iNOS

Cor tes h is to lóg i cos de f ragmentos de baço dos cães natura lmente

i n fec tados com L . chagas i fo ram submet idos à reação imuno-

h is toquímica i nves t i gando-se a expressão da enz ima iNOS (F igu ra 7) .

Fo ram u t i l i zados d i fe ren tes parâmet ros na observação da exp ressão da

iNOS, a saber : d i fusa (quando a marcação oco r r i a em toda ex tensão do

campo m icroscóp io ana l i sado) , foca l (quando os focos de marcação

f i cavam de l im i tados em áreas bem def i n idas ) e pontua l (quando cé lu las

marcadas i so ladamente e ram observadas ) (Tabe la 2 ) . Observou -se

também marcação nas t rabécu las e cápsu las , que fo i i nc lu ída como

marcação d i fusa.

44

F igu ra 7 – F o t o m i c r o g r a f i a s d e c o r t e h i s t o l ó g i c o e s p l ê n i c o d e c ã e s n a t u r a l me n t e i n f e c t a d o s c o m L e i s h m a n i a ( L . ) c h a g a s i s u b me t i d o a r e a ç ã o i mu n o - h i s t o q u í m i c a a n t i - i N O S . A ) A u s ê n c i a d e ma r c a ç ã o n o g r u p o c o n t r o le ( C N I ) ; B ) E x p r e s s ã o d i s c r e t a e m c ã o a s s i n t o má t i c o ( C A ) ; C ) mo d e r a d a e m c ã o o l i g o s s i n t o má t i c o ( C O ) ; D ) a c e n t u a d a e m c ã o s i n t o má t i c o ( C S ) . 6 0 0 X .

A B

C D

45

4 .4 .1 .1 Marcação D i fusa (MD)

No grupo CS , 53% dos an imais apresentaram marcação d i fusa

acentuada (MDA) , 30 ,8% marcação d i fusa moderada (MDM) e 16 ,2% não

ap resenta ram MD. 45% dos CO ap resen taram MDA, 18 ,2% MDM, 18 ,2%

marcação d i fusa l eve (MDL) e 18 ,6% não ap resenta ram MD. CA

ap resenta ram MDL em 57,1% dos an ima is e 42 ,9% de les não

ap resenta ram MD (Tabe la 2 ) .

4 .4 .1 .2 Marcação Foca l (MF)

Apresenta ram marcação foca l acentuada (MFA) 30 ,8% dos an imais

do grupo CS , 7 ,7% marcação foca l moderada (MFM), 5 ,5% marcação

foca l l eve (MFL) e 56% não ap resenta ram MF. 18 ,2% de CO

ap resenta ram MFA, 18 ,2% MFM, 9 ,1% MFL e 54 ,5% não apresentavam

MF. 14 ,2% de CA ap resen ta ram MFL e 85 ,8% não apresentavam MF

(Tabe la 2 ) .

4 .4 .1 .3 Marcação Pontua l (MP)

No grupo CS 7 ,7% dos an imais apresentaram marcação pon tual

acentuada (MPA) , 15 ,4% marcação pon tua l moderada (MPM) , 15 ,4%

marcação pon tua l leve (MPL) e 61 ,5% não ap resen ta ram MP. 9 ,1% de CO

ap resenta ram MPM, 18 ,2% MPL e 72 ,7% não ap resenta ram MP. 14 ,3% de

CA ap resen taram MPM, 14 ,3% MPL e 71 ,4% não ap resenta ram MP

(Tabe la 2 ) .

46

T a b e l a 2 – M é d i a p e r c e n t u a l d e ma r c a ç ã o d a e x p r e s s ão d e i N O S p o r g r u p o c l í n i c o q u a n t o a o t i p o e i n t e n s i d a d e n o s f r a g me n t o s e s p l ê n ic o s d e c ã e s i n f e c t a d o s c o m L e i s h m a n i a ( L . ) c h a g a s i

Forma

clínica Marcação Difusa Marcação Focal Marcação Pontual

AUS. LEVE MOD. ACEN. AUS. LEVE MOD. ACEN. AUS. LEVE MOD. ACEN.

CA

(n=8) 42,9 57,1 0 0 85,8 14,2 0 0 71,4 14,3 14,3 0

CO

(n=8) 18,6 18,2 18,2 45 54,5 9,1 18,2 18,2 72,7 18,2 9,1 0

CS

(n=13) 16,2 0 30,8 53 56 5,5 7,7 30,8 61,5 15,4 15,4 7,7

C A – C ã e s a s s i n t o má t i c o s ; C O – c ã e s o l i g o s s i n t o má t ic o s ; C S – C ã e s S i n t o má t i c o s . A U S = a u s e n t e , M O D . = mo d e r a d a ; A C E N . = a c e n t u a d a .

4 .4 .2 Aná l i se quan t i ta t i va de iNOS

4 .4 .2 .1 Expressão esp lên i ca de iNOS comparados po r fo rma c l í n i ca

A aná l i se quant i t a t i va de iNOS em f ragmentos esp lênicos de 8

CNI e 29 C I fo i rea l i zada usando o ana l i sador de imagens Le i ca Qwin

P lus fo togra fando-se a lea to r i amente 20 campos mic roscóp i cos de cada

co r te h is to lóg i co ca l cu lando-se a méd ia de do is exper imentos . CNI não

ap resenta ram marcação detec táve l , po r tan to não fo i poss íve l quan t i f i car

iNOS nes te g rupo. A quan t i f i cação da exp ressão da iNOS em C I

ap resentou grande d ispersão dos dados , va r i ando de 0 a 1 .051 .769 µm2

com med iana 30 .561 µm2 (F igu ra 8 ) . As aná l i ses en t re as d i fe ren tes

fo rmas c l ín icas de C I com CNI most ra ram d i fe rença sign i f i ca t i va en t re

CS e CNI (p<0 ,01) e en t re CO e CNI (p<0,05 ) (F igu ra 9 ) .

47

F i g u r a 8 – A v a l i a ç ã o q u a n t i t a t i v a d a e x p r e s s ã o d e Óx i d o N í t r i c o S i n t a s e i n d u z í v e l ( i N O S ) n o b a ç o d e c ã e s n ã o i n f e c t a d o s ( C NI ) e n a t u r a l me n t e i n f e c t a d o s c o m L e i s h m a n i a ( L . ) c h a g a s i. I mu n o - h i s t o q u í m i c a a n t i - i N O S .

F i g u r a 9 – A v a l i a ç ã o q u a n t i t a t i v a d a e x p r e s s ã o d e Ó x i d o N í t r i co S i n t a s e i n d u z í v e l ( i N O S ) n o b a ç o d e c ã e s n ã o i n f e c t a d o s ( C NI , n = 8 ) e n a t u r a l me n t e i n f e c t a d o s c o m L e i s h m a n i a ( L . ) c h a g a s i, c l a s s i f i c a d o s p o r f o r ma s c l í n i c a s d e L V C ( C A ; n = 8 , C O ; n = 8 e C S ; n = 1 3 ) . D i f e r e n ç a s i g n i f i ca t i v a e n t r e C N I e C O r e p r e s e n t a d a p o r p < 0 , 0 5 e e n t r e C N I e C S r e p r e s e n ta d a p o r p < 0 , 0 1 . K r u s k a l W a l l i s e p ó s - t e s t e d e D u n n . I mu n o - h i s t o q u í m i c a a n t i- i N O S

48

4 .4 .2 .2 Expressão esp lên i ca de iNOS comparada po r ca rga paras i tá r ia

Não fo ram encont radas d i fe renças s ign i f i ca t i vas quando os

va lo res da exp ressão de iNOS fo ram agrupados po r carga paras i t á r ia

(p=0,055) . As med ianas de iNOS em cães com BP, MP e AP fo ram 4302,

21523, e 171524 µm2 respec t i vamente . Os resu l t ados demonst ram que

50% dos cães com BP não exp ressam n íve is detec táve is da enz ima, no

en tan to , em 100% dos cães com AP a ex p ressão oco r re (F igu ra 10) .

F i g u r a 1 0 – A v a l i a ç ã o q u a n t i t a t i v a d a e x p r e s s ã o d e Ó x i d o N í t r i co S i n t a s e i n d u z í v e l ( i N O S ) n o b a ç o d e c ã e s n ã o i n f e c ta d o s ( C N I , n = 8 ) e n a t u r a l me n t e i n f e c t a d o s c o m L e i s h m a n i a ( L . ) c h a g a s i, c l a s s i f i c a d o s p o r d e n s i d a d e p a r a s i t á r i a e s p l ê n i c a ( B a i x o p a r a s i t i s mo : L D U e n t r e 0 e 1 0 ) , mé d i o p a r a s i t i s mo : L D U e n t r e 1 1 e 2 5 0 e a l t o p a r a s it i s mo : L D U e n t r e 2 5 1 e 2 5 6 4 ) . p > 0 , 0 5 . T e s t e d e K r u s k a l W a l l i s e p ó s -t e s t e d e D u n n .

4 .4 .2 .3 Aná l i se de co r re lação en t re a exp ressão da iNOS com n íve is

esp lên i cos de IL-1 0 , IFN-γ e TNF-α e com n í ve is de IgG1 , IgG2 e IgG

to ta l an t i -Leishmania

Fo ram rea l i zadas aná l i ses de co r re lação de Spearman en t re os

dados quant i t a t i vos da ex p ressão de iNOS em C I com os n í ve is de IL -10 ,

49

IFN- γ e TNF-α, não sendo encont rados resu l t ados s ign i f i ca t i vos (p>

0 ,05 ) (Figura 11 ) . As aná l i ses de co r re lações en t re os dados

quan t i t a t i vos da exp ressão de iNOS em C I com os n í ve i s de IgG To ta l

an t i – Leishmania, IgG1 e IgG2 também não ap resentaram resu l t ados

s ign i f i ca t i vos (p>0,05) (Figu ra 12 ) .

F i g u r a 1 1 – C o r r e l a ç ã o d e S p e a r ma n d a e x p r e s s ã o e s p l ê n i c a d e i NO S e m c ã e s n a t u r a l me n t e i n f e c t a d o s c o m L e i s h m a n i a ( L . ) c h a g a s i ( C I ; n = 2 1 ) c o m a e x p r e s s ã o e s p l ê n i c a d e I L - 1 0 ( A ; p = 0 , 1 1 0 ) , I F N -γ ( B ; p = 0 , 6 9 7) e T N F -α ( C ; p = 0 , 2 0 5 ) .

50

0.0 0.2 0.4 0.60

50

100

150

IgG Total

0.0 0.5 1.0 1.50

50

100

150

IgG 1

0.00 0.25 0.50 0.750

50

100

150

IgG 2

Áre

a m

arca

da p

ara

iNO

S (µm

2 ) x

104

p = 0,776 p= 0,966

p= 0,203

A

C

B

Áre

a m

arca

da p

ara

iNO

S (µm

2 ) x

104

Áre

a m

arca

da p

ara

iNO

S (µm

2 ) x

104

F i g u r a 1 2 – C o r r e l a ç ã o d e S p e a r ma n d a e x p r e s s ã o e s pl ê n i c a d e i N O S e m c ã e s n a t u r a l me n t e i n f e c t a d o s c o m L e i s h m a n i a ( L . ) c h a g a s i ( C I ; n = 2 4 ) c o m a s i mu n o g l o b u l i n a s I g G 1 , I g G 2 e I g G t o t a l a n t i -L e i s h m a n i a ( A ; p = 0 , 0 7 6 ) , I g G 1 ( B ; p = 0 , 9 9 9 ) , I g G 2 ( C ; p = 0 , 2 0 3 ) .

51

5 D ISCUSSÃO

A LV ap resenta ampla d is t r i bu i ção ep idemio lóg i ca em áreas

t rop i ca i s e subt rop i ca is do g lobo (TESH, 1995) . É uma das mais

re levantes e emergen tes doenças paras i t á r i as de todo o mundo , podendo

l evar a 98% de mor ta l idade se não t ra tada . No Bras i l , a impor tânc ia da

LV es tá no fa to da sua a l t a inc idênc ia e amp la d is tr i bu ição geográ f i ca ,

seu p rocesso de expansão , u rban ização e na poss ib i li dade de a t ing i r

fo rmas graves assoc iadas à desnut r i ção e in fecções concomi tan tes . Na

maio r i a das á reas endêmicas 80% dos casos reg i s t rados oco r rem em

c r i anças com menos de 10 anos , sendo no t i f i cados aprox imadamente

1980 casos po r ano. Des tes , 90% s i t uam-se na reg ião no rdes te (GONTIJO

& MELO, 2004; S ILVA e t a l ., 2001).

Do pon to de v is ta ep idemio lóg i co a LVC é apontada como mais

impor tan te que a doença humana dev ido a sua ma io r preva lênc ia e pe lo

fa to de CA e CS serem in fecc iosos ao inse to ve to r e p r inc ipa lmente

dev ido à i n fecção can ina an teceder o aparec imen to de casos humanos

(DEANE & DEANE, 1954; KEENAN e t a l ., 1984b ; ABRANCHES e t a l .,

1991a; MOLINA e t a l ., 1994) .

A suscep t i b i l i dade can ina à i n fecção e o s ta tus c l ín i co

desenvo lv ido es tão re lac ionados com d ive rsos mecan ismos de i n te ração

paras i t o -hospede i ro . Para cont r i bu i r com os avanços na e luc idação des tes

mecan ismos em LVC fo ram rea l i zados nes te es tudo , a ava l i ação da ca rga

paras i t á r i a esp lên ica , quant i f i cação dos n íve is séri cos de NO e a

ex p ressão da enz ima iNOS, assoc iando os resu l tados ob t i dos com n íve is

da exp ressão de IFN-γ , TNF-α , IL -10 , IgG1 , IgG2 e IgG to ta l an t i -

Leishmania .

Os resu l t ados na F igu ra 1 e Tabe la 1 most ram aumen to da ca rga

paras i t á r i a em cães s in tomát i cos , ou se ja , com maior compromet imento

c l í n i co . Es tes resu l tados se ap rox imam do expos to po r a lguns au tores

que re la ta ram haver co r re lação en t re a ca rga paras itá r i a do baço e

l in fonodos e o agravamento c l ín ico da LVC (SANCHEZ e t a l ., 2004;

G IUNCHETTI e t a l ., 2006) . Os resu l t ados es tão também de aco rdo com o

52

ex pos to po r REIS et a l. (2006a) que ap resenta ram uma co r re lação en t re o

s ta tus c l í n i co na LVC e grau de paras i t i smo most rado em esca la

dec rescente , re f le t ido pe la o rdem: medu la óssea, baço , l i n fonodos , pe le e

f í gado .

A quan t i f i cação de NO tem s ido rea l i zada po r vá r i os

pesqu isadores , dev ido ao seu po tenc ia l c i t o tóx ico re lac ionado com

mecan ismos de de fesa ina ta em vár i as doenças i n fecciosas (MACHADO

e t a l. , 2004) . Na Le i shmaniose, PANARO e t a l ., (1999) demonst ra ram o

po tenc ia l m ic rob i c ida do NO em macró fagos humanos in fec tados com L.

i n fan tum es t imu lados com IFN-γ e LPS bacte r i ano. An ter io rmente ,

VOULDOUKIS e t a l ., (1996) hav iam demons t rado a capac idade

m ic rob ic ida do NO ao re la ta r o aumento sér i co de L-c i t ru l ina , metabó l i to

da L-a rg inase, ao so f re r ação da iNOS, em cães i n fec tados com

Leishmania in fan tum submet idos a t ra tamento com ant imon ia l

pentava len te (g lucan t ime) .

En fa t i zando a impor tânc ia do NO como agen te l e ishmanic ida

pesqu isadores demonst ra ram que macró fagos can inos , an te r io rmente

vac inados com p romas t i go tas mor tas de Leishman ia in fan tum,

ap resentam ma io r capac idade de p rodução de NO associada à ma io r

capac idade de mata r o pa ras i t o (PANARO e t a l ., 2001) . P INELL I e t a l .,

(2000) ap resenta ram aumento dos n íve is de NO em sobrenadante de

cu l tu ra de macró fagos can inos in fec tados com Leishmania i n fan tum

a t i vados com IFN-γ , TNF-α e IL -2 e LPS . Out ros t raba lhos most ra ram a

impor tânc ia dessas c i toc inas na a t i vação da exp ressão de iNOS e

conseqüentemen te da p rodução de NO (L IEW e t a l . , 1990a ,b ) .

PANARO e t a l . (2008) , em exper imentos “ in v i t ro ” , suger i ram que

a p rodução de NO es tá envo l v ida na p ro teção e no p rognós t i co de cães

na tu ra lmente i n fec tados po r L . in fan tum, most rando que a adoção de

l in fóc i tos au tó logos reduz ia a p rodução de NO po r macró fagos de

an imais s in tomát icos e ass in tomát icos à med ida que a i n fecção se

to rnava mais c rôn ica .

Nes te t raba lho , os resu l tados demonst ram que C I ap resen taram a

med iana dos n íve is sé r i cos de NO s ign i f i ca t i vamente maiores que a

med iana do grupo de CNI (p<0 ,05 ) (F igu ra 2 ) . En t re os C I , os n í ve is de

53

NO em CS fo ram s ign i f i ca t i vamen te maiores quando comparados aos

n íve i s ob t idos em CNI (p<0 ,01 ) (F igu ra 3 ) . Quando ava l i ados os n íve i s

sé r i cos de NO em re lação à ca rga paras i t á r i a encon tra ram-se n í ve i s

s i gn i f i can temen te menores de NO em cães com BP em re lação a MP

(p<0,05 ) e AP (p<0 ,001) . Re fo rçando es tes resu l t ados a aná l i se de

co r re lação en t re NO sér i co e ca rga paras i t á r i a revelou uma fo r te

co r re lação pos i t i va (p=0 ,0001, r= 0 ,6444) (F igura 4A e B) .

O aumento da p rodução de NO em cães na tu ra lmente infec tados

com a l to pa ras i t i smo e s in tomát i cos poder ia se r i nduz ido po r mo lécu las

do paras i t o como o LPG (L IEW e t a l . ,1997) . Naque le t raba lho , os

au to res re la ta ram que fos fog l i canos (PG) l ibe rados pe lo paras i t o são

capazes de i n ib i r ou i nduz i r a s ín tese de NO po r macró fagos mur inos

es t imu lados com IFN-γ e LPS . No en tan to , es tes são aspectos

cont roversos , po is exper imentos rea l i zados reve la ram que molécu las

p resentes na Leishmania como LPG podem in ib i r a p rodução de IL-12 ,

que é o p r inc ipa l i ndu tor de respos ta do T ipo 1 (PROUDFOOT et a l. ,

1996; L IEW et a l . ,1997) .

Fo i encon t rada uma assoc iação en t re os n íve is sé r icos de NO e a

ex p ressão esp lên i ca da c i toc ina TNF-α (p=0 ,005) e en t re a p rodução de

IgG2 (p=0 ,019) e IgG to ta l (p=0,047) (F igu ras 5 e 6) . É sab ido que o

TNF-α é uma das c i t oc inas i nduto ras da a t i vação da exp ressão de iNOS

(L IEW e t a l. 1990b) e es ta c i toc ina pode se r p roduz ida po r macró fagos ,

cé lu las Th1 , Th2 e mastóc i tos (BEUTLER & CERAMI, 1989) .

A co r re lação pos i t i va com os i so t ipos de IgG sugere uma

po la r i zação da respos ta para o per f i l Th2. An ima is suscept íve i s

desenvo lvem uma respos ta t i p i camen te Th2 e uma respos ta humora l

ex uberan te (HONORÉ e t a l. , 1998; ROLÃO e t a l. , 2007) . Níve is maio res

de IgG2 têm s ido reg is t rados re lac ionados a mau p rognós t i co

(BOURDOISEAU e t a l ., 1997; REIS e t a l ., 2006c) bem como a bom

p rognós t i co na LV (DEPLAZES e t a l ., 1995; N IETO e t a l ., 1999) ,

havendo cont rovérs ias en t re os au tores , necess i t ando-se i nves t i gações

ad i c iona is .

54

Deve-se cons ide rar t ambém o fa to des te es tudo te r si do rea l i zado

com cães natu ra lmente i n fec tados . A p rodução de NO pode te r s ido

impor tan te na fase aguda da doença, de f i n indo qua l se r ia o p rognós t i co

dos cães . MANNA e t a l. , (2006) re la ta ram em es tudo de “coo r te ” que

cães ass in tomát icos natura lmen te i n fec tados com L . in fan tum que

ap resenta ram expressão de IFN-γ no tempo i n i c i a l do es tudo

permaneceram ass in tomát i cos ou evo lu í ram com poucos s in tomas , mas

an imais que não ap resenta ram es ta ex p ressão evo lu í ram para fo rma

c l i n i ca s in tomát i ca . A exp ressão de iNOS em modelo mur ino , na fase

aguda , t em demonst rado que o NO gerado p romove o con t ro le de

i n fecções po r L. ma jo r, sendo ex pressa na pe le e l in fonodos d renantes da

l esão em camundongos res is ten tes C57BL/6 l evando à d im inu i ção no

número de paras i t os . Já em camundongos suscept íve i s, que não se cu ram

espontaneamente (BALB/c ) , es ta expressão é s ign i f i ca t i vamente menor e

não oco r re redução da ca rga paras i t á r ia (STENGER et a l. , 1994) .

Ou t ro impor tan te aspecto que pode exp l i ca r em par te a p resença

de maio res n í ve is de NO em cães ap resentando a l to pa ras i t i smo é a

poss ib i l i dade de par te da p rodução do NO te r s ido sin te t i zada pe las

p róp r i as le ishman ias . A lguns au to res demonst ra ram a capac idade de

l e i shmanias p roduz i rem NO e re lac ionaram es te aspecto d i re tamente à

capac idade i n fecc iosa do paras i to . A p rodução de NO po r fo rmas

p romas t i go tas e amast i go tas axên i cas de L . amazonens i s fo i

demonst rada , oco r rendo d im inu i ção quando se emprega o uso de

i n ib ido res de NOS como o L-NAME (NG-n i t ro -L-a rg in ina met i l es te r ) .

Es tes au to res suger i ram a inda que o NO gerado pe lo paras i t o possa

d im inu i r a respos ta m ic rob ic ida dos macró fagos reduz indo a a t i v idade da

iNOS, poss ive lmente po r a tua r em mecan ismos pós - t ransc r i c iona i s da

enz ima, in ib indo a p rodução de NO ou re ta rdando a apoptose da cé lu la

pa ras i t ada . Também demons t ra ram que a capac idade de p roduz i r NO es tá

p resente em vár ias espéc ies como L . amazonens i s , L . b ras i l i ens is e L .

chagas i em mecan ismos dependentes do Ca2 +(GENESTRA e t a l. , 2006

a ,b ; 2003) . Os mecan ismos de regu lação da s ín tese de NO têm s ido

amplamente inves t i gados e sua p rodução pode se r in ib ida por um

55

mecan ismo de “ feedback ” nega t i vo , onde o NO regu la sua p róp r i a

p rodução (L IEW, 1994) .

Os resu l t ados sugerem que maiores n íve is de NO, na fase c rôn i ca

da LVC, es tão assoc iados a mau prognós t i co , re lac ionados com a l t o

pa ras i t i smo, podendo-se in fe r i r que o NO pode se r usado como

b iomarcador da progressão c l ín i ca da doença. No en tan to , se r i am

necessár ios t raba lhos ad i c iona is pa ra se es tabe lecer uma a f i rmação, po i s

ex is tem l im i tações metodo lóg i cas que devem ser conside radas na

dosagem sér i ca do NO pe lo método de Gr iess cu jos resu l tados podem não

re f l e t i r apenas os aspec tos re lac ionados com a doença , mas também

in te r fe rênc ia pe la d ie ta ou p rodução de n i t r i t os pela f l o ra in tes t i na l

(MARZINZIG e t a l . , 1997) . É impor tan te ressa l ta r que a va l i dade da

de terminação das concent rações de n i t r i t o e n i t ra to como verdade i ro

í nd ice da p rodução de NO endógeno poder ia ge ra r cont rovérs ias dev ido a

fa to res como: i n terações qu ím icas in v i vo (KNOWLES & MONCADA,

1994; BENJAMIN & VALLANCE, 1994) . No en tan to , o método de Gr iess

tem s ido va l idado po r d i versos au tores que most ram que as

concent rações de n i t r i to e n i t ra to a l t e ram-se como resu l tado de d i ve rsas

doenças (FARREL e t a l ., 1992; M IDDLETON e t a l . , 1993; BALDEWEG

e t a l . , 1996) .

A aná l i se qua l i t a t i va da exp ressão da iNOS é apresen tada na

F igu ra 7 e Tabe la 2 . Podem ser observados d i fe ren tes t ipos de marcação

imuno-h is toquím ica . O grupo de CNI não ap resentou marcação

de tec táve l . Quando os an imais fo ram ava l i ados de aco rdo com a fo rma

c l í n i ca ve r i f i cou -se que a marcação em CA var i ou de l eve a moderada e

não se encon t rou nes tes an ima is marcação acentuada em nenhum dos

c r i t é r i os adotados . Po r sua vez , os g rupos CO e CS apresentaram uma

maio r f reqüênc ia e i n tens idade da ex p ressão de iNOS, sendo mais

p roeminente no ú l t imo . Es ta marcação pode es ta r re lac ionada com os

eventos in f l amató r i os observados na LVC. O t i po de marcação d i fusa

pode es ta r re lac ionado com a i n tensa h ipe rp las ia de macró fagos no baço

de cães com LV (TAFURI e t a l. , 2001) . A marcação foca l pode es ta r

re lac ionada com a marcação pr inc ipa lmente nas PALMS, ZM ou

fo l í cu los , po is macró fagos e cé lu las dendr í t i cas estão p resentes nessas

56

es t ru tu ras e podem es ta r a t i vadas e p roduz i r iNOS. J á a marcação

pontua l re lac iona-se com marcação em cé lu las i so ladas . Quanto à

marcação nos vasos esp lên icos , MONCADA e t a l . (1991) c i t am vár i as

cé lu las capazes de ex p ressar iNOS, en t re e las as célu las endo te l i a i s que

são poss i ve lmente as marcadas nes te exper imento .

Uma poss íve l exp l i cação para a exp ressão da iNOS por C I

con fo rme a F igura 8 pode es ta r oco r rendo v ia recepto res do t i po To l l

(TRLs ) , uma impor tan te famí l i a de recepto res p resentes em cé lu las

imunes de mamí fe ros que reconhecem mot ivos conservados de pa tógenos

(pad rão molecu la r assoc iado à pa tógenos – PAMPs) . Os TRLs p resentes

nas membranas dos macró fagos ou l in fóc i tos de cães podem es ta r sendo

a t i vados por PAMPs p resentes nas le i shmanias (LPG) (BECKER e t a l .,

2003; L IESE e t a l ., 2007) . Es ta a t i vação l eva a p rodução de c i t oc inas

p ró - in f lamató r i as dependente da a t i vação do fa to r nuc lea r kB (NFkB) , o

qua l d i spara mecan ismos e fe to res m ic rob ios tá t i cos /mic rob i c idas por

an imais res is ten tes em in fecções po r Trypanosoma cruz i , T rypanosoma

b ruce i , Le ishmania sp., Toxop lasma gond i i e P lasmodium sp . (TAKEDA

e t a l ., 2003; GAZZINE LLI e t a l ., 2004) .

Observou -se c la ramente que hav ia uma ma io r exp ressão de iNOS

assoc iada à g rav idade da doença cons iderando-se aval i ação semi -

quan t i t a t i va (Tabe la 2 ) e es ta fo r te marcação es tava assoc iada aos cães

ap resentando a l t o pa ras i t i smo esp lên i co , embora es ta observação não

tenha se to rnado uma regra e tenham s ido encon t rados cães com médio

ou ba ixo paras i t i smo com a l t a exp ressão de iNOS, bem como CS ou com

a l t o pa ras i t i smo com ba ix a exp ressão de iNOS.

O aumen to da expressão de iNOS es ta r assoc iado com a fo rma

c l í n i ca , cons ide rando-se as aná l i ses semi -quant i ta ti va e quan t i t a t i va de

iNOS, (mais i n tenso em CS e CO) pode es ta r re lac ionado ao maio r

número de cães com AP nes tes grupos (Tabe la 2 , F igura 9 ) . Quanto a

CNI não ap resen tar marcação detec táve l , es tá de acordo com resu l t ados

de LAGE e t a l. (2007) cu jo t raba lho reve lou que es te g rupo não

ap resenta exp ressão esp lên i ca de IFN-γ , que po r sua vez tem s ido

demonst rado es ta r re lac ionado com a a t i vação da ex pressão de iNOS

57

(HEVEL & MARLETTA, 1992; HOLAN et a l ., 2006; NIEDBALA e t a l. ,

2002; P INE LLI e t a l. 2000) .

Apesar de não te r s ido observado d i fe rença s ign i f i ca t i va quan to à

ex p ressão esp lên i ca de iNOS por dens idade paras i t á ria esp lên i ca , do

ponto de v i s ta semi -quant i t a t i vo (Tabe la 1 e 2 ) os resu l t ados sugerem

que a maior ex p ressão de iNOS não es tá necessar iamente l i gada à

redução da ca rga paras i t á r i a no tec ido esp lên i co ou que es ta expressão

u l t rapassa os n íve is idea i s pa ra o c lea rence esp lêni co e to rna-se tóx i co

ao hospede i ro poss i ve lmente pe la geração de perox ini t r i t o (PACHER et

a l . , 2007) . ANDERSON et a l. , (2005) mos t ra ram que camundongos

C57BL/6 gera lmente res i s ten tes , quando exper imenta lmen te in fec tados

po r cepas v i ru len tas de L. ma jor , fa l haram em e l im inar os paras i t os,

apesar de exp ressarem a l tos n íve is de iNOS na lesão e de ap resenta rem

uma respos ta po lar i zada de Th1 .

Deve-se cons ide ra r a inda que a exp ressão de iNOS e a p rodução

de NO são apenas par te da respos ta imune na LVC. REIS et a l. , (2006b)

demonst ra ram que C I ap resentam d iminu i ção nas taxas de cé lu las T

CD4+ /CD8+ no sangue per i fé r i co comparados a CNI e que CA apresentam

s ign i f i ca t i vamente maio r quan t idade cé lu las T CD8+ e CD4+ que CS, bem

como ma io r exp ressão MHC c lasse I I po r l i n fóc i tos ci r cu lan tes . Ass im, a

queda na taxa de cé lu las T CD4+ /CD8+ , bem como a queda de l i n fóc i t os

T CD8+ e CD4+ , impor tan tes fon tes de IFN-γ poder iam levar os

macró fagos de CS e CO a es ta rem ine f i c i en tes em p romoverem a

e l im inação dos paras i tos , po r uma a t i vação i ncomp leta dev ido à

i nsu f i c i en te p rodução de IFN-γ . De fo rma semelhante CARRERA e t a l .,

(1996) sugerem que a p rodução de IL -12 é f i rmemente regu lada em

macró fagos mur inos po r p romast i go tas de l e ishmanias du ran te a

i n fecção. Ass im, o cont ro le dessa impor tan te c i t oc ina a t i vadora de

respos ta do T ipo 1 pode es ta r assoc iada, de fo rma ind i re ta , às

i nsu f i c i en tes p roduções de IFN-γ e ex p ressão de iNOS que se r i am

necessár ios para promover a mor te dos paras i tos em C I .

Há mui tas ev idênc ias c l í n i cas e ex per imenta i s i nd icando que a

reso lução da i n fecção l e i shmania l é dependente de cé lu las T e

58

macró fagos a t i vados po r c i toc inas der i vadas de cé lulas T , havendo

t raba lhos demons t rando a impor tânc ia do IFN-γ no cont ro le das

l e i shmanioses (CARVALHO e t a l ., 1985; L IEW e t a l ., 1982; SACKS e t

a l . , 1987) . Out ros es tudos re la taram cães ass in tomát icos com LVC

ap resentando aumen to na p rodução de IL -2 , TNF-α e IFN-γ (CABRAL e t

a l . , 1992; P INELL I e t a l ., 1994a,b ; P INELL I e t a l ., 1995) .

Con t ra r i amente , a IL -10 tem s ido assoc iada à sup ressão de produção de

c i t oc inas do T ipo 1 e à modu lação da a t i v i dade le i shmanic ida de

macró fagos (BOGDAN e t a l ., 1991; MOSMANN & MOORE, 1991) . A

ex p ressão de RNAm do IFN-γ es tá d im inu ída no in íc i o de in fecção

ex per imenta l de cães i n fec tados com Leishmania in fan tum. Num per íodo

p ré -pa ten te subseqüente oco r re aumento do IFN-γ e pos te r io r dec résc imo

quando aparecem os s ina i s c l ín i cos da doença, havendo também

ex p ressão de RNAm para IL-10 em cu l t u ra de cé lu las mononuc leares do

sangue per i fé r i co (SANTOS-GOMES e t a l ., 2002) . CORREA et a l. ,

(2007) demonst ra ram que cães natu ra lmente in fec tados po r Le ishman ia

(L . ) chagas i ap resen tam maio res n íve i s de IL-10 e TGF-β e es tas tem

s ido assoc iadas com fo r te in ib i ção da capac idade m ic rob ic ida de

macró fagos . GAZZINE LLI e t a l ., (1992) mos t ram que a IL -10 e TGF-

β também in ib i ram a mor te de fo rmas t r i pomast i gos tas do Trypanosoma

c ruz i po r macró fagos mur inos a t i vados po r IFN-γ em mecan ismo

dependente de NO. Por sua vez , resu l tados ob t i dos po r ANDERSON et

a l . (2005) most ra ram que em camundongos C57BL/6 gera lmente

res i s ten tes à i n fecção po r L . ma jo r quando i nocu lados com cepas do

paras i t o res i s ten te ao t ra tamento não oco r r i a a cu ra da l esão na derme

mesmo com uma po lar i zação de respos ta do T ipo 1 , havendo aumen to da

ca rga paras i t á r i a , demonst rando que a p rodução de IL-10 es tava

re lac ionada com o aumento da suscept i b i l i dade .

Apesar de não te r s i do observada co r re lação en t re a iNOS e as

c i t oc inas IL -10 , IFN-γ , e TNF-α , e os an t i co rpos IgG1 , IgG2 ou IgG

to ta l an t i–Leishman ia (p>0,05 ) (F iguras 11 e 12 ) , LAGE e t a l . (2007)

demonst ra ram uma co r re lação en t re IL -10 e o s ta tus c l ín ico severo e a l ta

59

carga paras i t á r i a ao desc rever que 100% dos C I com AP ap resentavam

ex p ressão de RNAm de IL-10 .

A suscept i b i l i dade à i n fecção pode ser dev ido ao estabe lec imento

de c i r cu i t os imunor regu la tó r i os , onde a maior i ndução de c i toc inas

regu la tó r i as como o TGF-β e IL -10 poder ia render os macró fagos

i ne f i c i en tes no c lea rence dos paras i tos (BELKA ID e t a l. , 2001; GANTT

e t a l, 2003 , ANDERSON et a l . , 2005 ; CORREA et a l. , 2007) .

Também podemos supor que em LVC possa oco r re r a pa rt i c ipação

de cé lu las T regu la tó r i as (T reg) an te r i o rmen te es tudadas no mode lo

mur ino (XU e t a l ., 2003) , como as cé lu las T CD4+CD25+ que poder iam

es ta r e levando os n íve i s esp lên i cos de IL-10 imped indo a po la r i zação

para respos ta do T ipo 1 , modu lando a p rodução de IFN- γ , iNOS, NO e

conseqüentemen te p ro tegendo o paras i to con t ra os mecan ismos

m ic rob ic idas dos macró fagos (RONCAROLO e t a l ., 2006 ; ANDERSON et

a l . , 2005) . Resu l tados opos tos fo ram ap resentados po r NYLEN e t a l .,

(2007) , que descar tam es tas cé lu las como pr inc ipa i s fon tes de IL-10 na

fase in ic i a l da l e ishmaniose humana.

A impor tânc ia da par t i c ipação da IL-10 na pers i s tênc ia do

paras i t o é re fo rçada po r a lguns au to res que demonstraram em

camundongos nocau tes para IL-10 ou uso de an t i corpos b loqueadores

an t i - IL-10 l evava a cu ra es té r i l quando in fec tados com L . ma jor. No

en tan to , oco r r i a l a tênc ia da le ishman iose quando hav ia exp ressão de IL-

10 . Es tes au to res demonst raram a inda que a IL -10 p roduz ida po r cé lu las

T reg ocor re r i a na tu ra lmente , e e ra c ruc ia l pa ra pers is tênc ia da in fecção

po r L . ma jo r em le i shmaniose cu tânea em modelo mur ino (BELKA ID e t

a l . , 2002) .

A supos ta par t i c i pação de cé lu las regu la tó r i as merece

i nves t i gação em fu tu ros t raba lhos , p r i nc ipa lmente re lac ionando sua

p resença com a fo rma c l ín i ca , po is render iam in fo rmações que poder iam

e luc ida r aspectos igno rados da imunopa to log ia em LVC.

A f a lha na e l im inação dos paras i tos mesmo quando o baço can ino

es tá exp ressando a l t os n íve i s de iNOS, pode es ta r li gado a mecan ismo de

escape dos paras i tos pe la exp ressão de molécu las por le i shmanias como

as perox idox inas LcPx n-1 e LcPx n-2 ou superóx ido d ismutase que

60

con ferem p ro teção aos paras i t os con t ra os mecan ismos m icrob i c idas

(OLIV IER e t a l ., 2005) .

A inda en t re os poss íve i s mecan ismos de escape presentes no

gênero Leishmania, re la ta -se a sua capac idade de l ibe ra r ca theps ina B ,

uma p ro tease capaz de c l i va r TGF-β l a ten te à fo rma a t i va

imunossupresso ra capaz de p ro longar a sob rev ivênc ia do paras i t o em

macró fagos (WILSON et a l. , 2005) .

A lém dos mecan ismos de escape dos p ro tozoár ios deve-se

cons ide rar o fa to de te rmos t raba lhado com cães natu ra lmente in fec tados ,

es tes poder iam es tar pa ras i t ados po r d i fe ren tes cepas de L. (L . ) chagas i e

es tas poder iam ap resenta r ma io r ou menor patogen ic idade e v i ru lênc ia

sendo mais ou menos res is ten tes ao NO gerado pe la cé lu la hospede i ra

(NATAMI e t a l ., 2000) .

A de te rminação da fo rma c l í n i ca que se es tabe lece no an imal pode

es ta r re lac ionada com d i fe renças gené t i cas (HOWARD e t a l. , 1980;

FOWELL & LOCKSLEY, 1999 ; L IPOLDOVÁ e t a l, 2000 , 2002) ,

i n fecções concomi tan tes (BARRAL-NETTO e t a l. , 1995; HASSAN et a l .,

2006; RODRÍGUEZ-SOSA e t a l. , 2006) , número de p icadas e e fe i t o da

sa l i va de f l ebó tomos i n fec tados (MBOW e t a l. , 1998; DE MOURA et a l. ,

2007; OLIVE IRA e t a l. , 2008) e fa to res nu t r i c iona is (HOLZMULLER et

a l . , 2006 ; ANSTEAD et a l . 2001; 2003) .

61

6 CONCLUSÃO

Tomados em con jun to , os resu l tados sugerem que em cães

na tu ra lmente in fec tados po r L. chagas i a ex acerbação das fo rmas c l ín i cas

es tá assoc iado ao aumento da ca rga paras i t á r i a , aumen to do n í ve is

sé r i cos de NO e da ex pressão esp lên i ca de iNOS. O es tabe lec imen to de

c i r cu i tos imunor regu la tó r i os com a p rodução de c i toc inas regu la tó r i as

poder ia t o rnar os macró fagos dos cães in fec tados i ne fe t i vos na

e l im inação dos paras i tos e a p rodução de NO poder ia es ta r assoc iada aos

mecan ismos imunopa to lóg i cos na LVC.

.

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7 REFERÊNCIAS BIBL IOGRÁFICAS :

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UNIVERSIDADE VALE DO R IO DOCE

FACULDADE DE C IÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM C IÊNCIAS BIOLÓGICAS

Fe rnando Rocha dos San tos

NÍVEIS SÉRICOS DE ÓXIDO NÍTRICO E

EXPRESSÃO DA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE

INDUZÍVEL NO BAÇO DE CÃES

NATURALMENTE INFECTADOS COM

Leishmania (Leishmania) chagasi

Governador Va ladares

2008

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Santos, Fernando Rocha dos Níveis séricos de óxido nítrico e expressão da óxido nítrico Sintase induzível no baço de cães naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi /, Fernando Rocha dos Santos. --2008. 82f. Dissertação (mestrado) – Universidade Vale do Rio Doce, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Governador Valadares, MG, 2008. Orientador: Luiz Cosme Cotta Malaquias. 1. Leishmaniose visceral canina. 2. Óxido nítrico – Níveis Séricos. 3. Parasitologia. I. Malaquias, Luiz Cosme Cotta II. Universidade Vale do Rio Doce. III. Título.

CDD 636.089696

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