FCUP - Repositório Aberto · Medicamente Assistida (PMA), de forma a contribuir para o sucesso dos...

A realidade da Procriação Medicamente Assistida: - Técnicas

laboratoriais - Criopreservação

de ovócitos: Que futuro nos centros?

Raquel Patrício Grijó e Borges Carneiro Relatório de estágio de Mestrado apresentada à

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

Biologia celular e Molecular

2013

A re

alid

ad

e d

a P

rocria

ção

Me

dic

am

en

te A

ssis

tida:

-T

écn

icas la

bo

rato

riais

- C

riop

rese

rvação

de

ov

ócito

s: Q

ue

futu

ro n

os c

en

tros?

Ra

qu

el P

atríc

io G

rijó e

Bo

rge

s

Ca

rne

iro

MS

c

FCUP

2013

2.º

CICLO

A realidade da Procriação

Medicamente Assistida:

- Técnicas laboratoriais

- Criopreservação de

ovócitos: Que futuro

nos centros?

Raquel Patrício Grijó e Borges Carneiro Mestrado em Biologia Celular e Molecular Departamento de Biologia

2013

Orientador

Dra.ª Joana Mesquita Guimarães, Médica especialista em Ginecologia/Obstetrícia

do Centro de Procriação Medicamente Assistida do Centro Hospitalar do Porto

Coorientadores

Dr.ª Alice Pinto, Embriologista do Centro de Procriação Medicamente Assistida do

Centro Hospitalar do Porto

Dra.ª Carla Leal, Embriologista do Centro de Procriação Medicamente Assistida

do Centro Hospitalar do Porto

Professor Doutor Vasco Almeida, Professor auxiliar da Faculdade de Ciências da

Universidade do Porto

Todas as correções determinadas

pelo júri, e só essas, foram efetuadas.

O Presidente do Júri,

Porto, ______/______/_________

FCUP A realidade da PMA

- Técnicas laboratoriais -Criopreservação de ovócitos: Que futuro nos centros?

i

Agradecimentos

Gostaria de expressar a minha sincera gratidão a todas as pessoas que de alguma

forma contribuíram para a realização desta dissertação, e cuja ajuda foi imprescindível

durante todas as etapas do estágio.

Em primeiro lugar, gostaria de agradecer à Dra. Joana Mesquita-Guimarães e ao

Professor Vasco Almeida pela oportunidade que me proporcionaram, pela partilha de

conhecimentos, e acima de tudo pela confiança depositada. Foi uma experiência

marcante poder aprender numa área tão interessante.

Gostaria também de agradecer a toda a equipa do Centro de Procriação Medicamente

Assistida (CPMA) do Centro Hospitalar do Porto, pelo acolhimento durante este ano de

estágio, pela boa disposição e amabilidade com que sempre me receberam.

Um muito obrigada às minhas co-orientadoras Dra. Alice Pinto e Dra. Carla Leal pela

amizade, disponibilidade, paciência e motivação e a quem devo grande parte do que

aprendi. As suas orientações foram uma valiosa ajuda durante a prática laboratorial e

também durante a pesquisa bibliográfica e a escrita desta dissertação.

Não poderia esquecer os meus amigos, Rita, Marina, Inês, Ricardo, Juliana, Ana e

Rosana que me acompanharam durante os 5 anos de percurso académico. Um

sincero agradecimento pela amizade, incentivo, apoio e compreensão mesmo nos

momentos menos fáceis, especialmente nas longas e produtivas horas de estudo.

Aos meus amigos de sempre, pela presença e companheirismo.

Obviamente à minha família pela educação e valores transmitidos, pelo afeto e apoio

em todos os momentos.



ii

Resumo

O ovócito, sendo uma das maiores células do corpo humano possui um grande

teor em água o que o torna extremamente suscetível à formação de cristais de gelo e

aos danos resultantes da congelação/ descongelação. Deste modo, é muito importante

o estudo da criobiologia e a compreensão dos diferentes aspetos que podem

influenciar as taxas de sobrevivência ovocitária ao processo de criopreservação.

O presente trabalho teve como objetivos principais o contacto com as técnicas

laboratoriais de um programa de Fertilização In Vitro, assim como a compreensão das

variáveis clínicas e laboratoriais que influenciam o sucesso da criopreservação de

ovócitos bem como determinar qual ou quais os protocolos mais promissores, tendo

em conta o estado em que se encontra a investigação.

Para tal, foram observadas as mais diversas técnicas laboratoriais com inicio na

punção folicular até à transferência embrionária e chegando mesmo algumas a serem

executadas com supervisão, tal como demonstrado no “logbook”. Numa segunda fase,

foi realizada uma revisão bibliográfica sobre o tema “Criopreservação de ovócitos”.

O presente trabalho demonstrou que apesar dos numerosos trabalhos científicos

já publicados em torno do tema, ainda há muita investigação a fazer no sentido de

alcançar o “protocolo ideal”. Neste momento cada centro deve adotar uma

metodologia, tendo em conta o estado da arte, adaptada aos recursos humanos e de

equipamento disponíveis.

Palavras Chave. Procriação Medicamente Assistida, Ovócitos, Criopreservação.



iii

Abstract

The oocyte, as one of the major cells in the human body has a huge water content thatt

makes it extremely susceptible to ice crystals formation and to the damage caused by

freeze / thawing process. Thus, it is extremely important the study of criobiology and

the understanding of the various aspects that may influence oocyte survival rates to the

cryopreservation procedure.

The main objectives of the present study were the contact with the laboratory

techniques of an in vitro fertilization program, as well as the understanding the clinical

and laboratory variables that influence the success of oocyte cryopreservation and to

determine which are the most promising protocols, taking into account the currently

research.

To this propose, different laboratory techniques were observed starting in the oocyte

pick-up until the embryo transfer. Some procedures were performed under

supervision, as demonstrated in the "logbook". In the second phase, a literature review

on the topic "oocyte cryopreservation" was conducted.

This study demonstrated that despite numerous scientific papers published around the

theme of "oocyte cryopreservation", there is still much more research to do in order to

achieve the "ideal protocol". So, each center should adopt a methodology, according to

the state of the art, adapted to human resources and equipments available.

Key-words: Assisted Reproductive Technology, Oocytes, Cryopreservation.



iv

Índice

Agradecimentos i

Resumo ii

Abstract iii

Lista de figuras vi

Lista de tabelas vi

Lista de abreviaturas viii

CAPÍTULO I - TÉCNICAS DE PROCRIAÇÃO MEDICAMENTE ASSISTIDA

1. INTRODUÇÃO 1

1.1. A infertilidade 1

1.1.1.Os centros de Procriação Medicamente Assistida em Portugal 3

1.2. A Procriação Medicamente Assistida 4

1.2.1. O estudo do casal infértil 4

1.2.2. Tratamentos de 1ª e 2ª linha 5

2. METODOLOGIA 6

2.1. Estudo citobioquímico do esperma 6

2.2. Protocolo clínico de estimulação ovárica 7

2.3. Protocolo de punção folicular 8

2.4. Preparação de esperma para técnicas de Procriação Medicamente Assistida 8

2.5. As técnicas laboratoriais de Procriação Medicamente Assistida 9

2.5.1. Inseminação Intra-Uterina 9

2.5.2. Fertilização In- Vitro 10

2.5.3. Injeção intracitoplasmática de espermatozoide no ovócito 10

2.5.4. Recolha cirúrgica de espermatozóides do testículo para ciclo de ICSI 11

2.6. Avaliação da fecundação e do desenvolvimento embrionário 12

2.7. Classificação da qualidade embrionária 12

2.8. Transferência embrionária e análise de gravidez 15

2.9. Criopreservação de gâmetas masculinos e de embriões 17

2.9.1. Criopreservação de gâmetas masculinos 17

2.9.2. Criopreservação de embriões 17

CAPÍTULO II - DISSERTAÇÃO SOBRE O TEMA: CRIOPRESERVAÇÃO DE

OVÓCITOS- O futuro nos centros de Procriação Medicamente Assistida

1. Breve história da criopreservação 19



v

2. Princípios básicos da criobiologia 21

2.1. Crioprotectores: permeáveis e não permeáveis 21

2.2. Métodos de criopreservação 23

2.2.1. Protocolo de equilíbrio- Congelação lenta 24

2.2.2. Protocolo de não- equilíbrio- Vitrificação 25

2.3. Armazenamento em azoto 26

2.4. Descongelação 26

2.5. Remoção dos crioprotetores 26

3. Indicação para a criopreservação de ovócitos 27

4. Aspetos clínicos, laboratoriais e éticos da criopreservação de ovócitos 28

4.1. Aspetos clínicos: protocolo de estimulação ovárica 28

4.2. Aspetos laboratoriais: Sistema de armazenamento/palhetas 29

4.3. Questões éticas 29

5. Dificuldades associadas 30

6. DISCUSSÃO: Atualidade dos protocolos de criopreservação de ovócitos e

respetivas taxas de sucesso 32

6.1. Estadio de maturação: imaturo vs metáfase II 32

6.2. Desnudação dos ovócitos antes da criopreservação 35

6.3. Congelação lenta vs vitrificação 35

7. CONCLUSÃO 39

8. BIBLIOGRAFIA 39

9. ANEXOS 51

Anexo I - Logbook 51

Anexo II - Resultados obtidos nas principais publicações sobre os protocolos de

congelação lenta e de vitrificação 52



vi

Lista de figuras

Figura 1- Taxa de fecundabilidade e abortamento espontâneo em função da idade

feminina (Heffner,2004). 2

Lista de tabelas

Tabela 1 – Distribuição por região geográfica dos Centros de PMA autorizados de

Portugal (Conselho Nacional de Procriação Medicamente Assistida) 3

Tabela 2 - Valores de referência dos parâmetros seminais (WHO, 2010). 7

Tabela 3 - Número de células expectável consoante o tipo de observação (Almeida,

Sousa, Plancha, Leal, Figueiredo, & Silva, 2012) 13

Tabela 4 - Classificação em D2 e D3 (Almeida, Sousa, Plancha, Leal, Figueiredo, &

Silva, 2012) 13

Tabela 5 - Classificação da mórula (Almeida, Sousa, Plancha, Leal, Figueiredo, &

Silva, 2012) 14

Tabela 6 - Classificação do blastocisto. (Almeida, Sousa, Plancha, Leal, Figueiredo, &

Silva, 2012) 15

Tabela 7 – Passos importantes na história da criopreservação de ovócitos e de

embriões de mamíferos (baseado em Cobo, 2008) 20

Tabela 8 - Danos ocorridos durante os processos de congelação lenta e de vitrificação

(baseado em Vajta & Yovich, 2008) 23

Tabela 9 - Resultados obtidos nas principais publicações que comparam a eficácia de

maturação in vitro de ovócitos imaturos pré criopreservação e pós descongelação.

34

Tabela 10 – Técnicas laboratoriais de PMA realizadas durante o estágio 51



vii

Tabela 11 - Resultados obtidos nas principais publicações sobre criopreservação de

ovócitos em metáfase II pelo método de congelação lenta e de vitrificação (baseado

em Gook & Edgar, 2012). 52



viii

Lista abreviaturas

PMA- Procriação Medicamente Assistida

OMS- Organização Mundial de Saúde

IO- Indução da Ovulação

FIV- Fertilização in vitro

IIU- Inseminação Intra-Uterina

ICSI- Injeção intracitoplasmática de um espermatozoide no ovócito (Intracytoplasmic

Sperm Injection)

TESE- Biopsia Testicular Aberta (Testicular Sperm Extraction)

TE- Transferência Embrionária

FSH-Hormona Folículo Estimulante (Follicle Stimulating Hormone)

GnRH- Hormona Libertadora de Gonadotrofinas (Gonadotrophin Releasing Hormone)

LH- Hormona Hipofisiária Luteinizante (Luteinizing Hormone)

hCG- Gonadotrofina Coriónica Humana (Human Chorionic Gonadotrophin)

MII- Metáfase II

PN- Pronúcleos

VG- Vesícula germinativa

PVP- Polivinilpirrolidona

DMSO- Dimetilsulfoxido

EG- Etilenoglicol

PROH- Propanediol

SHEO- Síndrome de Hiperestimulação Ovárica

SOP- Síndrome do Ovário Poliquístico

FCUP A realidade da Procriação Medicamente Assistida:

-Técnicas laboratoriais -Criopreservação de ovócitos: Que futuro nos centros?

1

Capítulo I- TÉCNICAS DE PROCRIAÇÃO MEDICAMENTE ASSISTIDA

1.INTRODUÇÃO

1.1. A Infertilidade

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a infertilidade é definida

como ”ausência de gravidez após dois anos de relações sexuais regulares e sem uso

de contraceção”. Existe, no entanto, consenso em considerar que após um ano, deve

ser iniciado um processo de avaliação de eventuais fatores envolvidos (Saúde

Reprodutiva- Infertilidade, orientações da Direção Geral de Saúde, 2008).

O termo infertilidade pode ser dividido em: infertilidade primária quando não

houve uma gravidez anterior e infertilidade secundária quando já existiu uma gravidez

prévia, ainda que tenha resultado em abortamento ou gravidez ectópica.

A infertilidade é uma doença que afeta milhões de casais em todo o mundo, de

tal forma que as estimativas sugerem que entre 10 a 15 % dos casais em idade

reprodutiva sejam inférteis (WHO, 2010).

Num ciclo natural, a taxa de gravidez é de cerca de 20-25%, sendo que após 4

meses de relações sexuais periódicas e desprotegidas, num casal fértil, a

probabilidade de gravidez é de 50-55%. Este valor sobe para 95% ao fim de um ano

(Figueiredo, 2005).

A infertilidade é, cada vez mais, considerada uma doença com relevância em

saúde pública, com consequências sociais, económicas e psicológicas, não só ao

nível individual, mas também para o ambiente familiar dos casais.

Neste conceito, torna-se de elevada importância o trabalho dos especialistas da

área, que engloba a investigação e a otimização das técnicas de Procriação

Medicamente Assistida (PMA), de forma a contribuir para o sucesso dos tratamentos,

e consequentemente para o aumento das taxas de gravidez.

Ao contrário do que se pensava há algumas décadas atrás, a mulher não é a

única responsável pela ausência de gravidez, uma vez que o homem também pode

estar na origem desse mesmo problema. Atualmente, sabe-se que cerca de 20-30%

dos casos de infertilidade estão associados a ambos os membros do casal (Barros &

Sousa, 2000).

Quanto às principais causas de infertilidade, estas dividem-se em 4 grandes

grupos: fator masculino (35%), disfunção ovulatória (20%), patologia das trompas de



2

Falópio e do útero (20%) e endometriose (10%). No entanto, também podem ocorrer

situações em que não se pode definir uma causa, o que se denomina de infertilidade

idiopática/ inexplicada, e abrange 10-15% dos casais (Whitman- Elia & Baxley, 2001).

Poderão, também, existir outros fatores que afetam ambos os géneros,

nomeadamente a nível imunológico, genético, endócrino, entre outros. No entanto, na

maioria dos casos, a infertilidade resulta de problemas de saúde específicos, tais

como: obstrução das trompas de Falópio e a disfunção ovulatória na mulher, e

ausência de mobilidade ou diminuição do número e qualidade dos espermatozoides no

homem.

Hoje em dia, sabe-se que o estilo de vida assume um papel fundamental no

bom funcionamento do aparelho reprodutor, sendo o sedentarismo e a obesidade os

maiores flagelos da sociedade moderna com efeitos negativos nesta área da saúde

(Saúde Reprodutiva- Infertilidade, orientações da Direcção Geral de Saúde, 2008).

Além do que já foi referido, existem também razões sociais e profissionais, que

contribuem para o adiamento da primeira gravidez para idades tardias da vida

reprodutiva da mulher. Este fato pode ser mais grave quando se sabe que a partir dos

35 anos a fecundabilidade feminina é reduzida para metade, atingindo níveis mínimos

aos 45 anos de idade, como se pode observar na figura 1.

Figura 1- Taxa de fecundabilidade e abortamento espontâneo em função

da idade feminina (Heffner, 2004)



3

Deste modo, é extremamente importante a anamnese do casal infértil a fim de

programar o tratamento mais adequado para cada caso, e atingir-se o objetivo único: a

gravidez.

1.1.1 Os Centros de Procriação Medicamente Assistida em

Portugal

Os centros de Procriação Medicamente Assistida desempenham um papel de

elevada importância para a resolução dos problemas de infertilidade de muitos casais.

Na tabela que se segue, apresentam-se os centros de PMA autorizados do nosso

país.

Tabela 1- Distribuição por região geográfica dos centros de PMA autorizados em Portugal (Conselho Nacional de

Procriação Medicamente Assistida).

Fazem parte dos objetivos dos centros de PMA, o apoio e orientação dos casais

com dificuldade em obter uma gravidez. Desta forma, os profissionais de saúde da

área são responsáveis pela avaliação da situação clínica e pelo estudo adequado do

casal infértil, facultando informação necessária completa e dados científicos acerca de

todas etapas a percorrer nos tratamentos da infertilidade (Saúde Reprodutiva-

Infertilidade, orientações da Direcção Geral de Saúde, 2008).

Apesar de em algumas situações a solução passar apenas pela correção de

hábitos/estilos de vida, há situações em que poderá ser necessário recorrer a técnicas

laboratoriais. Ressalve-se que estas técnicas têm evoluindo ao longo dos anos,

simultaneamente com a introdução de novas alternativas. O progresso resultou de

anos de investigação sobre os fenómenos relacionados com a reprodução e a

Região Centros

Públicos

Centros

Privados

Norte 4 5

Centro 3 2

Lisboa 3 7

Algarve - 1

Madeira - 1

Açores - 1



4

fertilidade, especialmente estudos realizados por investigadores ingleses nos anos 60-

70.

Apesar das questões de índole ética e religiosa inerentes a esta área da

medicina, rapidamente as técnicas de PMA foram-se estabelecendo a nível mundial.

O recurso a técnicas laboratoriais para a resolução dos problemas de

infertilidade foram iniciados no nosso país com a introdução da Inseminação Intra-

uterina (IIU), iniciada pelo Professor Doutor Alberto Barros na Faculdade de Medicina

do Porto.

Em 1978, introduziu-se uma nova técnica com uma componente laboratorial

mais complexa, a Fertilização in vitro (FIV), que resultou no nascimento da primeira

criança resultante deste procedimento (Edwards & Steptoe, 1978). Em Portugal o

primeiro ciclo de FIV foi realizado em 1985, no Hospital de Santa Maria/ Faculdade de

Medicina de Lisboa (equipa dirigida pelo Professor Doutor Pereira Coelho), tendo a

primeira criança nascido no ano seguinte.

A primeira Injeção Intracitoplasmática de um espermatozoide no ovócito (ICSI)

realizada com sucesso foi descrita em 1992 (Palermo et al., 1992).

Atualmente, existem centros dispersos por quase todo o país, e embora tenha

havido um ligeiro incremento no número de ciclos a realizar por ano, estes ainda são

insuficientes para responder ao elevado número de casais que procuram ajuda.

1.2. A Procriação Medicamente Assistida

1.2.1 O estudo do casal infértil

Apesar do crescente sucesso das técnicas de PMA, o percurso desde a primeira

consulta, para estudo do casal, até à conceção pode ser longo e angustiante. Numa

primeira fase é necessário descobrir qual a causa do problema e determinar os vários

fatores que possam estar a ela associados, de modo a que a estratégia de tratamento

seja direcionada e eficaz.

A avaliação clínica do casal deve ser exaustiva e deve ter em conta numerosas

situações e/ou comportamentos que poderão facilmente ser corrigidos. É realizado um

exame físico geral (peso, altura, Índice de Massa Corporal, cicatrizes abdominais,

órgãos pélvicos, desenvolvimento pubertário, caracteres sexuais secundários, etc.).

Avalia-se também a história reprodutiva do casal: gravidez em relações anteriores,

infertilidade prévia e tratamentos efetuados, duração da infertilidade atual e



5

antecedentes de infeções de transmissão sexual. Devem ser tidos em consideração os

hábitos de consumo, nomeadamente álcool, tabaco e medicamentos como

antidepressivos e anti-inflamatórios.

Nesta etapa são requisitados exames complementares de diagnóstico: o

espermograma ao elemento masculino e doseamentos hormonais das fases folicular e

lútea, ecografia transvaginal, e caso seja recomendado, também se poderá pedir

histeroscopia e histerossalpingografia ao elemento feminino.

O apoio psicológico também é um constituinte fundamental no estudo e

tratamento do casal infértil, sendo por isso parte integrante em todas as etapas.

1.2.2. Tratamentos de 1ª e 2ª linha

O tratamento da infertilidade envolve várias etapas, com grau crescente de

complexidade. Depois de uma primeira abordagem em que se faz o estudo do casal,

este poderá ser referenciado para um dos seguintes tratamentos:

1- Tratamentos de 1ª linha: Indução da Ovulação (IO) e Inseminação Intra

Uterina (IIU).

2- Tratamentos de 2ª linha: Fertilização in vitro (FIV) e Injeção

Intracitoplasmática de um espermatozoide no ovócito (ICSI).

.

No caso da Indução da Ovulação, este tratamento tem apenas uma componente

médica, enquanto que nos restantes, para além da estimulação hormonal, há também

uma componente laboratorial.

A evolução das técnicas de PMA coincidiu com o desenvolvimento da ultra-

sonografia (método primordial para o controlo dos ciclos induzidos) e ajuste das

dosagens hormonais (Fleischer et al., 1981).

Com a evolução destas técnicas, a melhoria no conhecimento da dinâmica

folicular e o uso de fármacos, foi possível o desenvolvimento de protocolos de

estimulação hormonal com o objetivo de desencadear a ovulação múltipla. Os

investigadores desde logo acreditaram que estes protocolos poderiam melhorar as

taxas de gravidez devido ao desenvolvimento multifolícular. Contudo, este

desenvolvimento também pode conduzir ao síndrome de hiperestimulação do ovário,

principal problema associado à indução da ovulação múltipla.



6

Um outro problema associado às técnicas de PMA é a probabilidade acrescida

de gestação múltipla, e para tal tem-se vindo a restringir o número de embriões

transferidos.

O sucesso de qualquer tratamento, depende de variados fatores, tais como: a

duração e tipo de infertilidade, idade da mulher, resposta à estimulação ovárica,

qualidade espermática, bem como o número e qualidade dos embriões transferidos

(Macnamee & Brindsden, 1999).

Não se pode esquecer que estas metodologias têm implicações clínicas, éticas e

cientificas e que são responsáveis por uma vasta diversidade de enquadramentos

legais já existentes em vários países. Em Portugal, a PMA foi regulamentada em 2006

pela Lei nº 32/2006, de 26 de Julho, e foi criado o Conselho Nacional de Procriação

Medicamente Assistida como entidade reguladora da prática desta atividade.

2. METODOLOGIA

2.1. Estudo citobioquímico do esperma

O principal objetivo da análise do sémen é avaliar os parâmetros macroscópicos

e microscópicos de uma amostra recolhida, geralmente, por masturbação.

A Organização Mundial de Saúde (OMS) editou, em 1980, um manual de

laboratório (WHO, 1980) para estabelecer as primeiras diretrizes do estudo de

amostras seminais de modo a evitar variabilidade entre análises de diferentes centros,

tendo sido a última atualização estabelecida em 2010 (WHO, 2010).

Nesta atualização, os valores de referência dos parâmetros seminais encontram-

se descritos na tabela 2.

Desta forma, as características que se estudam são divididas em duas

categorias:

1. Macroscópicas - cor, liquefação, viscosidade, pH e volume.

2. Microscópicas - concentração espermática, motilidade, morfologia,

vitalidade, presença de detritos ou outros elementos celulares do sémen e

aglutinação dos espermatozoides.



7

Através da determinação da qualidade espermática, faz-se uma avaliação da

fertilidade/infertilidade masculina, o que irá permitir selecionar o tratamento de PMA

mais adequado (Orientações Técnicas em Medicina da Reprodução).

Tabela 2- Valores de referência dos parâmetros seminais (WHO, 2010)

Volume ≥2 mL

pH ≥7.2

Concentração ≥15 × 106/ mL (≥ 39 × 106 no ejaculado)

Motilidade ≥ 32% móveis progressivos

Morfologia critérios de Kruger: 4%normais

Vitalidade 58% vivos

Leucócitos 1×106/ mL

2.2. Protocolo clínico de estimulação ovárica

A estimulação ovárica pode ser realizada de diferentes formas, consoante o

tratamento a que o casal está proposto. Pode ser possível a administração de

indutores por via oral (citrato de clomifeno/ Letrozole), estes utilizados particularmente

nos casos de Síndrome de Ovário Poliquístico (SOP) para induzir a ovulação para

coito programado.

No entanto, na maioria dos casos, a estimulação ovárica é conseguida com a

administração exógena de gonadotrofinas, subcutâneas, usadas em IIU e tratamentos

de 2ª linha, e pode, neste último tratamento, seguir dois protocolos: protocolo longo

com agonista ou protocolo curto com antagonista.

O modo de ação dos antagonistas da Hormona Libertadora de Gonadotrofinas

(GnRH) consiste na supressão imediata da libertação das gonadotrofinas pela

hipófise, uma vez que competem com a ligação aos recetores do hipotálamo. (Diedrich

et al., 1994). Contrariamente, nos protocolos longos os agonistas da GnRH numa fase

inicial provocam um estimulo da secreção das gonadotrofinas, uma vez que têm uma

ação semelhante à GnRH. Neste aspeto o uso de antagonistas é vantajoso, pois reduz



8

a incidência de reações adversas como o Síndrome Hiperestimulação Ovárica (SHEO)

e é necessário um menor número de ampolas de gonadotrofinas. (Devroey, 2000;

Bouchard & Fauser, 2000).

Em simultâneo são administradas gonadotrofinas Hormona Folículo Estimulante

(FSH) e/ou LH que podem ser recombinantes ou urinárias altamente purificadas.

O crescimento folicular é monitorizado por ecografia e por doseamento do

estradiol sérico, o que permite o ajuste terapêutico. Quando os folículos estão com

diâmetro que indica a sua maturidade (17mm ou mais), induz-se a ovulação e

consequente maturação dos ovócitos até ao estádio de metáfase II (MII), com a

hormona Gonadotrofina Coriónica Humana (hCG).

2.3. Protocolo de punção folicular

Após simulação do pico de LH (34-36h), através da administração de hCG, o

líquido folicular é aspirado, com controle ecográfico, por intermédio de uma agulha e

sistema de aspiração automática de pressão contínua, provocando o colapso do

folículo. Este líquido é recolhido para tubos apropriados contendo 1 mL de meio de

recolha de ovócitos (Origio®, Denmark) que estão sobre placa térmica previamente

aquecida a ±37ºC.

O líquido folicular é depois observado no laboratório e os ovócitos encontrados

são colocados em gotas de meio de cultura previamente equilibrado a 37,4ºC±0,6 ºC,

5-6% CO2, onde se realiza a primeira lavagem, aspirando e expelindo o ovócito nesse

meio. Seguidamente são colocados em placas de 4 poços e colocados numa

incubadora a 37,4ºC±0,6 ºC, 5-6% CO2 durante 3-4h antes de serem inseminados/

microinjetados.

2.4. Preparação de esperma para técnicas de Procriação

Medicamente Assistida

A prepraração do esperma faz-se para a maioria dos casos através de duas

técnicas: técnica de gradientes de densidade e técnica de “swim up”. A primeira

permite selecionar os espermatozoides mais densos (com melhor morfologia e

motilidade) através de gradientes de densidade, que após centrifugação se depositam

no fundo do tubo, e também permite separá-los de microorganismos, leucócitos e



9

células germinativas imaturas. Esta etapa pretende simular a ação natural do muco

cervical.

A técnica de “swim-up” baseia-se na capacidade que os espermatozoides com

motilidade progressiva rápida têm de avançar num meio de cultura adequado. Este

passo corresponde à ação natural das secreções uterinas e das trompas de Falópio.

O tratamento é iniciado logo após a liquefação do sémen. Analisam-se os

parâmetros: motilidade e morfologia através da observação de uma amostra entre

lâmina e lamela ao microscópio ótico. E calcula-se a concentração por contagem

numa camara de Neubauer. De seguida aspira-se todo o volume de esperma com

auxílio de uma pipeta de Pasteur e coloca-se no topo das duas frações de diferentes

concentrações (55% e 80%). Procede-se à primeira centrifugação durante 20 min, a

1500 rpm. Rejeita-se o sobrenadante e faz-se uma lavagem com meio de preparação

de esperma (Sperm Preparation Medium, Origio®, Denmark), ressuspendendo e

centrifugando uma segunda vez durante 10 min a 1500 rpm. Poderá haver uma

segunda lavagem de apenas 5 min. Finalmente rejeita-se o sobrenadante e coloca-se

cerca de 1mL de meio de preparação de esperma para se proceder ao” swim-up”, para

isso coloca-se o tubo na estufa a 37,4ºC±0,6 ºC, 5-6% CO2 com a tampa semi-aberta

até à sua utilização.

2.5. As técnicas laboratoriais de Procriação Medicamente

Assistida

2.5.1. Inseminação Intra-Uterina

Esta técnica está indicada para disfunções ovulatórias, casos de muco cervical

agressivo e fatores masculinos ligeiros, ou casos de sémen de dador (por ausência de

espermatozoides ou células precursoras).

Pode ser realizada em ciclos naturais ou induzidos através de uma ligeira

estimulação hormonal com gonadotrofinas. Em ambos os casos o momento da

ovulação é determinado por controlo ecográfio e doseamento de estradiol, sendo a IIU,

propriamente dita, realizada ±36h após a administração de hCG.

Após o tratamento do sémen e a incubação a 37,4ºC±0,6ºC, coloca-se numa

câmara de newbaeur uma pequena fração do “swim-up”. Ao microscópio ótico,

determina-se a concentração de espermatozoides, expressa em milhões por mililitro

(Nx106/ml). De acordo com a concentração calculada, aspira-se para uma seringa o

volume adequado da fração de “swim-up”, de modo a conter entre 1-10 milhões de



10

espermatozoides, para a realização da IIU propriamente dita. Este volume é colocado

na cavidade uterina com a ajuda de um cateter específico.

2.5.2. Fertilização In- Vitro

Esta técnica está indicada maioritariamente para problemas femininos tais como:

disfunção ovulatória moderada a severa, obstrução tubar, endometriose e falhas de

gravidez após ciclos de IIU e também para casos masculinos ligeiros.

Num ciclo FIV, o desenvolvimento folicular é conseguido através da

hiperestimulação controlada dos ovários, que permite o crescimento de vários folículos

em cada ovário, através da administração exógena de hormonas gonadotrofinas

recombinantes ou altamente purificadas e agonistas ou antagonistas da GnRH durante

1-2 semanas.

Cerca de 3h após punção folicular, colocam-se os espermatozoides (recolhidos

da fração “swim-up” ) à concentração de 100 000 espermatozoides/mL numa placa de

cultura. A fecundação dá-se in vitro numa incubadora a 37,4ºC±0,6 ºC, 5-6% CO2.

2.5.3. Injeção intracitoplasmática de espermatozoide no

ovócito

Apesar da microinjeção ser a técnica eleita para os casos de fator masculino

grave como alterações significativas dos parâmetros seminais de que fazem parte

oligozoospermia e astenozoospermia, também se aplica aos casais com falha de

fecundação na FIV, em casos de pacientes com risco de transmissão de partículas

virais pelo sémen (vírus da SIDA, hepatite B e hepatite C), ou em casos em que é

necessário diagnóstico genético pré-implantação.

Numa fase inicial, a mulher é submetida a uma estimulação hormonal controlada

dos ovários tal como na FIV.

Cerca de 2 a 3h após a colheita dos ovócitos, estes são desnudados através de

uma digestão enzimática das células do cumulus oophuros com a enzima

Hialuronidase (SynVitro Hyadase, Origio®, Denmark), durante 30 segundos, seguindo-

se a desnudação mecânica através da aspiração dos ovócitos com pipeta de

desnudação (Vitrolife®, Sweden) em gota de meio próprio. Deste modo as células



11

foliculares soltam-se, deixando os ovócitos despidos do cumulus. Os ovócitos

desnudados são colocados em placa de cultura na incubadora por mais 1h.

Prepara-se todo o material necessário para a ICSI propriamente dita (preparação

da placa e sistema de micromanipulação) e processa-se à seleção dos

espermatozoides que apresentem morfologia e motilidade normais. Cada

espermatozoide é lavado e imobilizado por pressão do flagelo com ajuda da pipeta de

ICSI (Vitrolife®, Sweden), aspirado e injetado suavemente no ovócito. Este processo

repete-se para cada ovócito maduro. Para imobilizar o ovócito, utiliza-se uma pipeta

“holding” (Vitrolife®, Sweden).

2.5.4. Recolha cirúrgica de espermatozoides do testículo para

ciclo de ICSI

A biopsia testicular aberta, vulgarmente designada como TESE (Testicular

Sperm Extraction) é realizada em casos de azoospermia obstrutiva ou excretora,

assim como nos casos em que a qualidade embrionária se mostra sempre diminuída

em ciclos sucessivos, em que o fator masculino demostra ser a provável causa dessa

má qualidade embrionária.

A obtenção de gâmetas masculinos é feita diretamente do testículo através de

uma pequena cirurgia, efetuada com anestesia local. Consiste numa pequena incisão

(<1 cm) na parede escrotal, seguindo-se a secção das outras camadas do escroto até

à albugínea testicular. Neste local procede-se à extração de um ou vários fragmentos

de polpa testicular, que são colocados numa placa de Petri com gotas (±0,3 mL) de

meio de preparação de esperma (Sperm Preparation Medium, Origio®, Denmark).

Depois de macerados com as lâminas de bisturi e homogeneizados, faz-se a pesquisa

dos gâmetas por observação ao microscópio de uma preparação lâmina-lamela. Caso

sejam encontrados espermatozoides, coloca-se num tubo de centrífuga e adiciona-se

meio de preparação de esperma. Realizam-se duas centrifugações de 10 min, a 1500

rpm, rejeitando o sobrenadante e colocando meio de preparação de esperma entre

cada uma. Os espermatozoides encontrados podem ser usados no dia da punção

folicular, ou então, se esta se realizar no dia seguinte, deixa-se a incubar durante a

noite a 32-37ºC em atmosfera de 5-6% CO2. Caso não seja para uso em ciclo devem

ser criopreservados para posterior utilização.



12

2.6. Avaliação da fecundação e do desenvolvimento embrionário

De acordo com o Consenso de Istambul (2011), é essencial a padronização dos

momentos de observação das diferentes fases do desenvolvimento embrionário,

tendo como referência a hora da inseminação, para a possível comparação de

resultados entre laboratórios.

Tendo em conta os referidos aspetos, a avaliação da fertilização deve ser

realizada cerca de 17 ±1h após a inseminação (por FIV ou ICSI).

O ovócito fertilizado, idealmente deve apresentar uma série de características

que permitem fazer a distinção dos ovócitos não fertilizados ou fertilizados

anormalmente. Assim, este deve ser esférico, ter dois glóbulos polares, dois

pronúcleos (PN) de igual tamanho, ambos com membranas bem definidas, justapostas

e localizadas no centro do ovócito.

Os PN devem ter número semelhante de corpos percursores de nucléolos, do

mesmo tamanho e, idealmente alinhados pela zona equatorial, na região de

justaposição das membranas dos PN.

Sistema de classificação

2.7. Classificação da qualidade embrionária

A avaliação da qualidade embrionária nos dois primeiros dias de

desenvolvimento, poderá ser um indicador da qualidade dos gâmetas, uma vez que

geralmente gâmetas anormais não dão origem a embriões normais. Por sua vez o

desenvolvimento embrionário posterior, desde o 3º até ao 5º dia, reflete a expressão

genética, diferenciação e controlo do desenvolvimento, pois a partir desta altura o

embrião passa a ser controlado pelo seu próprio genoma.

Qualidade embrionária nos dias 2 e 3

A seleção dos embriões a transferir é uma das etapas mais importantes para o

sucesso das técnicas de PMA. Contudo, existe uma grande divergência nos critérios

de classificação da qualidade embrionária. Geralmente, o método utilizado baseia-se

em critérios cinético-morfológicos, observados ao microscópio ótico de alta resolução.

Para isso são utilizados sistemas de classificação específicos. Na tabela 3 encontra-se

descrito o estado de desenvolvimento expectável para cada observação.



13

Tabela 3 - Número de células expectável consoante o tipo de observação (Almeida, Sousa, Plancha, Leal, Figueiredo,

& Silva, 2012) .

Tipo de observação Hora pós-inseminação/

microinjeção

Estado de

desenvolvimento

expectável

Avaliação da clivagem

precoce

26h ±1h pós ICSI

28h± 1h pós FIV 2 células

Avaliação do embrião em

D2 44h± 1h 4 células

Avaliação do embrião em

D3 68h± 1h 8 células

Tabela 4 - Classificação em D2 e D3 (Almeida, Sousa, Plancha, Leal, Figueiredo, & Silva, 2012).

Grau Classificação Descrição

1 Boa qualidade

<10% fragmentação

Tamanho de células de acordo com o respetivo

estádio celular

Ausência de multinucleação

2 Qualidade

razoável

10-25% fragmentação

Tamanho das células de acordo com o respetivo

estádio celular para a maioria das células

Ausência de multinucleação

3 Má qualidade

>25% fragmentação

Tamanho das células não está de acordo com o

respetivo estádio celular

Presença de multinucleação

Os embriões que apresentam taxas de clivagem mais lentas ou mais rápidas que

o esperado, não serão selecionados pois apresentam um potencial de implantação

reduzido.

São vários os critérios observados para classificar os embriões:

Dimensão dos blastómeros

Nestes estádios celulares associa-se a desigualdade celular a uma

redução do potencial de implantação.



14

Multinucleação

É considerada quando se observa mais do que um núcleo num

blastómero. Está relacionada com um aumento da incidência de anomalias

cromossómicas.

Fragmentação

A presença de fragmentos celulares é comum nos embriões humanos e

quando o grau de fragmentação é inferior a 25% não parece estar relacionado

com a redução do potencial de implantação.

Na tabela 4 encontram-se descritas as caraterísticas observadas para

cada um dos referidos critérios, correspondentes a cada grau de classificação

Mórula

Tabela 5 - Classificação da mórula (Almeida, Sousa, Plancha, Leal, Figueiredo, & Silva, 2012).

Grau Avaliação Descrição

1 Bom Entrou na 4ª divisão mitótica (16 células) e/ou compactação que

envolve praticamente todo o volume do embrião.

2 Razoável Entrou na 4ª divisão mitótica (16 células) e/ou compactação que

envolve a maioria do volume do embrião.

3 Mau Compactação envolve menos de metade do volume do embrião,

com blastómeros permanecendo como células individualizadas.

Esta designação é atribuída ao embrião ao 4º dia de cultura (92h±2h) que entrou

na quarta divisão mitótica, que se encontra compactado ou em compactação. A

compactação deve englobar praticamente todo o volume do embrião, quando o

mesmo não se verifica associa-se a um prognóstico mais reduzido.

Blastocisto

É designado por blastocisto o embrião ao 5º dia de cultura (116h±2h), totalmente

expandido ou eclodido, com massa celular interna protuberante, bem definida, com

muitas células compactadas e aderentes, e trofoectoderme constituída por um epitélio



15

pavimentoso simples com muitas células aderentes. Na tabela 6 é apresentado o

sistema de classificação do blastocisto.

Tabela 6- Classificação do blastocisto (Almeida, Sousa, Plancha, Leal, Figueiredo, & Silva, 2012).

Grau Avaliação Descrição

Estádio

1

Blastocisto inicial

2 Blastocisto

3 Blastocisto expandido

4 Blastocisto em eclosão ou

eclodido

Massa celular

interna

1 Bom

Protuberante, bem definida e com

muitas células compactadas e

aderentes

2 Razoável Bem definida, com muitas células

mal agrupadas

3 Mau Mal definida, com poucas células

Trofoectoderme

1 Bom Muitas células formando um

epitélio coeso

2 Razoável Poucas células, formando um

epitélio disperso

3 Mau Muito poucas células

2.8. Transferência embrionária (TE) e análise de gravidez

A transferência embrionária (TE), geralmente, realiza-se entre o 2º e o 5º dia

após punção folicular. Os embriões são transferidos para a cavidade uterina com

ajuda de um cateter específico, por via vaginal e sob controlo ecográfico.



16

A seleção dos embriões para transferência é baseada na sua classificação,

sendo selecionados os que apresentem melhores caraterísticas. A classificação dos

embriões é feita de acordo com o número de blastómeros, percentagem de

fragmentação e presença ou não de blastómeros multinucleados, como já foi referido.

O cateter é carregado com os embriões dentro da câmara de fluxo laminar e os

embriões são então libertados junto ao fundo uterino (a ±1cm de distância). Após a

transferência, o conteúdo do cateter é avaliado no laboratório, através de observação

ao estereomicroscópio, para confirmar que os embriões foram corretamente

depositados na cavidade uterina, isto é, não se encontram no cateter. A transferência

de embriões é o passo mais crítico condicionando as taxas de gravidez, logo a seguir

à qualidade e ao número de embriões transferidos. Por norma são transferidos um a

dois embriões se a paciente tiver idade inferior a 35 anos, e em casos muito

particulares, poderão ser transferidos até três embriões, isto é, em mulheres com

idade superior a 35 anos e quando, no dia da transferência, os embriões obtidos

apresentam qualidade reduzida.

Os embriões que não são transferidos mas que apresentam critérios de boa

qualidade (grau 1 e 2) são criopreservados.

Se a transferência for efetuada ao 2º/3º dia, os embriões supranumerários

podem ser cultivados até ao 5º /6º dia, sendo avaliada novamente a sua qualidade e

só nesta altura são criopreservados.

Cerca de 14-16 dias após a colheita ovocitária, realiza-se o teste de gravidez,

através do doseamento do nível de beta-hCG no sangue. Após a implantação, o

primeiro sinal libertado pelo trofoblasto detetado no sangue materno é a hCG, sendo

usado como marcador diagnóstico de gravidez. De acordo com o valor obtido, este

doseamento hormonal permite o diagnóstico da gravidez, ainda antes da sua

confirmação ecográfica (Pooikkeus et al., 2002).

Numa gravidez de embrião único, cerca de 15 dias após a ovulação o valor de

beta-hCG deverá ser superior a 100 mIU/ml, embora possa variar muito de caso para

caso.

Assim, possibilita a identificação de gravidez com maior probabilidade de

evolução, sendo também útil na predição de gravidez ectópica ou de gravidez não

evolutiva. Nestes casos são geralmente detetados níveis mais baixos de beta-hCG.

Este doseamento também permite prever uma gestação múltipla, sendo neste caso

detetados valores mais elevados (Jayachandran et al., 2012).



17

2.9. Criopreservação de gâmetas masculinos e de embriões

A criopreservação de gâmetas e embriões envolve uma exposição a agentes

crioprotetores, redução da temperatura abaixo dos 0oC e seu armazenamento, que

pode ser em azoto líquido (-196ºC). Posteriormente, procede-se à descongelação,

diluição e remoção dos crioprotetores, com o retorno ao seu estado fisiológico, de

modo a permitir a futura utilização em técnicas de PMA.

2.9.1. Criopreservação de gâmetas masculinos

A criopreservação de espermatozoides está indicada para as seguintes

situações: disfunções sexuais e neurológicas (ex: electro-ejaculação), uso de esperma

de dador, casos de oligozoospermia, pacientes submetidos a tratamentos de quimio/

radioterapia, casos de vasectomia (deve-se criopreservar antes da cirurgia), biopsia

testicular em que se observam espermatozoides, entre outras.

Esta técnica, no CPMA é efetuada através de um protocolo de congelação lenta.

Após a preparação do esperma através das centrifugações, rejeita-se o sobrenadante

e ressuspende-se o sedimento em meio de preparação de esperma (Sperm

Preparation Medium, Origio®, Denmark). Adiciona-se, gota a gota, o meio de

criopreservação (Sperm freezing Medium, Origio®, Denmark) na proporção 1:1,

previamente aquecido à temperatura ambiente, à preparação de esperma,

homogeneizando muito bem. Deixa-se repousar durante cerca de 10 min e de seguida

carregam-se as palhetas e selam-se as extremidades (selagem a quente em palhetas

de alta segurança). Enche-se um recipiente próprio com azoto líquido e colocam-se as

palhetas suspensas de modo a ficar em contacto com a fase gasosa do azoto. Deixa-

se repousar entre 20 a 30 min, e posteriormente transferem-se para o recipiente de

azoto líquido -196ºC específico, onde ficam armazenadas.

2.9.2. Criopreservação de embriões:

A criopreservação de embriões é uma técnica bastante vantajosa, pois evita

nova estimulação hormonal para obtenção de ovócitos. Estes embriões poderão ser

armazenados a temperaturas sub-zero, e num futuro ciclo utilizados, após

descongelação para transferência para a cavidade uterina.



18

O protocolo utilizado no CPMA do Centro Hospitalar do Porto é a vitrificação, isto

é, técnica que usa altas concentrações de crioprotetores e rápidas taxas de

arrefecimento e aquecimento.

Os embriões são passados por uma série de soluções de vitrificação, com

diferentes concentrações de crioprotetores, previamente estabilizadas a 37ºC, numa

atmosfera sem CO2, durante cerca de 10-15 minutos. Quando colocados na última

solução, são carregadas as palhetas.

Os embriões podem ser criopreservados ao 2º/3º dia e em estádio de

blastocisto. Neste último caso deve-se, previamente, colapsar o blastocisto.

Para isso, utiliza-se uma pipeta de hatching para realizar uma abertura numa

zona de junção de duas células da trofoectoderme, numa zona oposta à do botão

embrionário e na zona onde se verifique a existência de mais água. Aguardam-se

alguns segundos e faz-se uma nova incisão. A partir deste ponto procede-se de igual

forma à vitrificação de embriões de 2º/3º dia de desenvolvimento.

A descongelação de embriões vitrificados em fase de divisão (2º/3º dia de

desenvolvimento) é realizada anteriormente de acordo com o estadio inicial, e deixada

em cultura até ao 5º/6º dia, no qual se realiza a transferência embrionária. Assim,

realiza-se a monotorização da evolução dos embriões após descongelação.

No caso da descongelação de blastocistos vitrificados, esta técnica é efetuada

no dia da transferência, que será realizada cerca de duas horas após a conclusão da

descongelação.

Para a descongelação de embriões vitrificados procede-se à passagem dos

mesmos por uma série de soluções de concentrações decrescentes de crioprotetor

previamente estabilizadas a 37 oC. No final os embriões são transferidos para uma

placa de cultura com o meio apropriado ao dia de desenvolvimento em que se

encontram e colocados na incubadora a 37,4ºC±0,6 ºC, 5-6% CO2 até à transferência.



19

Capítulo II- DISSERTAÇÃO SOBRE O TEMA: CRIOPRESERVAÇÃO DE

OVÓCITOS

1. Breve história da criopreservação

Apesar de poderem ser datados estudos de criobiologia tão longínquos como

nas primeiras civilizações, em 2500 aC, a criopreservação de células e tecidos só se

tornou possível em meados do século XX.

As primeiras tentativas não foram bem sucedidas uma vez que os procedimentos

utilizados conduziam a danos celulares provocados pelo excesso de desidratação,

formação de cristais de gelo e alteração da concentração de solutos intra e

extracelulares. No entanto, foi demonstrado, por Luyet e Hodapp (1938), o efeito

benéfico da desidratação usando açúcares, previamente à congelação.

Um passo importante na história da criobiologia ocorreu no final dos anos 40,

com a descoberta das propriedades crioprotetoras do glicerol na congelação e

descongelação de espermatozoides (Polge et al. 1949). Nos anos que se seguiram

deram-se rápidos avanços nesta área e em 1954 foi descrito o primeiro nascimento

humano resultante da congelação de espermatozoides (Sherman, 1973). Desde então,

o glicerol é considerado o crioprotetor preferencialmente utilizado para a

criopreservação dos gâmetas masculinos.

Em 1950 este mesmo crioprotetor, foi também utilizado nas primeiras tentativas

de criopreservação de gâmetas femininos de mamíferos, utilizando ovócitos de rato

não fertilizados, embora com muito pouco sucesso.

Os primeiros estudos da criopreservação de ovócitos humanos datam de 1980,

mas só seis anos após foi conseguido alcançar, por Chen e Al Hasani e a sua equipa,

a primeira gravidez com ovócito criopreservado através da técnica de congelação lenta

com dimetilsulfoxido (DMSO) (Chen, 1986). O autor relatou taxas de sobrevivência e

de fertilização de 80% e 83%, respectivamente, numa amostra de 40 ovócitos. Durante

a década seguinte muitos investigadores tentaram alcançar resultados superiores aos

descritos, contudo depararam-se com a dificuldade de fertilização do ovócito após

descongelação, principalmente devido ao endurecimento da zona pelúcida (Carroll et

al., 1990).

Com o desenvolvimento da técnica de ICSI, em 1992, esse problema foi

ultrapassado, sendo que o primeiro relato de nascimento, resultante da utilização da

técnica de vitrificação de ovócitos, foi descrito por Kuleshova e a sua equipa em 1999,



20

depois de ter vitrificado 17 ovócitos utilizando 40% de etilenoglicol (EG) e 0,6M de

sacarose em sistema aberto (Kuleshova et al., 1999).

Tabela 7- Passos importantes na história das técnicas de criopreservação de ovócitos e embriões de mamíferos

(baseado em Cobo, 2008)

Polge, 1952 Criopreservação de espermatozoides de

touro

Whittingham et al., 1972 Criopreservação de embriões de rato

Wilmut et al., 1973 Criopreservação de embriões de bovino

Willadsen et al., 1976 Criopreservação de embriões de ovelha,

técnica definitiva de congelação lenta

Whittingham, 1977 Criopreservação de ovócitos de rato

Trouson e Mohr, 1983 Criopreservação de embriões humanos

Rall e Fahy, 1985 Vitrificação de embriões humanos

Testart et al., 1986 Criopreservação eficaz de embriões

humanos em propanediol

Massip et al., 1986 Vitrificação de embriões bovinos

Chen, 1986 Criopreservação de ovócitos humanos

pelo método de congelação lenta

Nakagata, 1989 Vitrificação de ovócitos de rato

Hamano et al., 1992 Vitrificação de ovócitos de bovino

Kuleshova et al., 1999 Primeiro nascimento com técnica de

vitrificação de ovócitos humanos

Kuwayama et al., 2005 Vitrificação em grande escala de

embriões e ovócitos humanos

A criopreservação de ovócitos é uma das técnicas mais desafiantes na

criobiologia e poderá trazer importantes benefícios para as técnicas de PMA. No

entanto, em contraste com o evidente sucesso da criopreservação de gâmetas



21

masculinos e embriões, esta técnica está ainda em fase de investigação, e necessita

de ser otimizada de modo a ultrapassar todos os problemas associados.

Apesar de ser uma técnica hoje em dia muito divulgada, fatores como a

temperatura, tempo de exposição, tipo e concentração de crioprotetores ainda devem

ser estudados para que se alcancem resultados mais satisfatórios.

2. Princípios básicos da criobiologia

O termo “criopreservação” designa o processo de armazenamento de células e

tecidos a uma temperatura de −196oC, de modo a bloquear todos os processos

fisiológicos (atividade enzimática, respiração, entre outros) e preservá-las por tempo

indeterminado para uma futura utilização (Bakhanach, 2009).

O grande desafio da criopreservação é a redução ou total eliminação da

formação de cristais de gelo. Outro objetivo importante é diminuir o choque osmótico

provocado pela entrada de água livre na célula durante o aquecimento, e a toxicidade

causada pelas altas concentrações de eletrólitos e outros solutos a baixas

temperaturas.

Fundamentalmente, para o sucesso das técnicas de criopreservação o ovócito

necessita tolerar três condições não fisiológicas: exposição a concentrações molares

de crioprotetores, o arrefecimento a temperaturas abaixo de zero e a remoção ou

conversão de toda a água liquida ao estado sólido (Picton et al., 2002).

2.1. Crioprotetores: permeáveis e não permeáveis

Os crioprotetores são solventes orgânicos adicionados às soluções utilizadas em

todos os procedimentos de criopreservação e são essenciais para o seu sucesso, pois

previnem os danos celulares através de diferentes mecanismos, principalmente devido

à regulação dos níveis de água e formação de gelo, no momento de descida abrupta

da temperatura.

Os crioprotetores são divididos em duas categorias, de acordo com o seu modo

de ação: permeáveis à membrana ou intracelulares (Dimetilsulfoxido (DMSO),

etilenoglicol (EG), propanediol (PROH) e glicerol) e não permeáveis à membrana ou

extracelulares (sacarose, glucose, trealose amido, ficol, proteínas e lipoproteínas).



22

A sua complexa ação protetora das células e tecidos durante a diminuição da

temperatura deve-se a várias propriedades, especialmente a sua alta solubilidade, o

que os torna essenciais para o sucesso das técnicas de criopreservação.

Apesar de atuarem de diferentes formas, os crioprotetores têm algumas

características comuns. Ambas as classes têm a capacidade de: (1) baixar o ponto de

congelação da solução em que são incluídos; (2) interagir com as modificações que

ocorrem na membrana durante o processo de criopreservação (de um estado fluido

para um estado rígido) e (3) prevenir a exposição do ovócito a altas concentrações de

eletrólitos quer intra- ou extracelularmente, através da sua ligação aos mesmos e

substituição parcial da água (Rall et al., 1984).

Os crioprotetores mais comuns e mais utilizados são os crioprotetores

permáveis. São pequenas moléculas de baixo peso molecular que facilmente

penetram no interior das células, e devido a esta particularidade impedem a

desidratação celular excessiva durante o processo de criopreservação. Na vitrificação,

a sua principal função é impedir a formação de gelo intracelular (Fuller & Paynter,

2004).

Por sua vez, os crioprotetores não permeáveis são representados por moléculas

de maior dimensão, que não atravessam a membrana plasmática. Criam um gradiente

osmótico que provoca a saída de água da célula, e consequentemente facilita a

desidratação celular durante o equilíbrio, antes da congelação. Desta forma, protegem

contra o aumento excessivo de volume e rutura das membranas celulares durante a

descongelação e rehidratação. Conferem proteção adicional quando utilizados em

conjunto com os crioprotetores permeáveis e, têm a vantagem de diminuir a

concentração necessária dos mesmos. Fazem parte deste grupo moléculas com baixo

peso molecular como galactose, glicose, sacarose e trealose e macromoléculas de

elevado peso molecular como polietileno glicol, ficol ou Polivinilpirrolidona (PVP).

Estas macromoléculas são utilizadas em muitos protocolos de vitrificação, incluídas

como suplemento nas soluções crioprotetoras. Atuam através do aumento da

viscosidade, ajudando a suportar a vitrificação, mesmo com concentrações baixas de

crioprotetores (Liebermann, 2003).

Foi verificado que a sobrevivência ovocitária pode ser melhorada se forem

incluídos na solução de criopreservação crioprotetores não permeáveis em pequenas

concentrações, especialmente sacarose a 0,2-0,3 mol/l (Fabri et al., 2001; Chen et al.,

2004).

A trealose, um dissacarídeo semelhante à sacarose, é uma recente inovação na

criopreservação ovocitária (Eroglu et al., 2002). Foi demonstrado que não só facilita a



23

desidratação celular durante a congelação lenta, mas também ajuda na estabilização

das moléculas da superfície celular durante a congelação/descongelação. Contudo,

até à data, a sua aplicação na criopreservação de gâmetas e embriões ainda é

limitada.

Não há consenso sobre qual o melhor crioprotetor na criopreservação de

ovócitos, uma vez que a concentração de exposição, a temperatura e o tipo de

crioprotetor podem causar danos nas células pela elevada toxicidade química.

No entanto, para o seu uso deve-se ter em consideração a toxicidade que

podem causar e a associação entre eles, além da técnica e do tipo de material a ser

utilizado. Tudo isto poderá ser crucial para o sucesso da técnica.

2.2. Métodos de criopreservação

Tabela 8 – Danos que ocorrem durante a congelação lenta e a vitrificação (baseado em Vajta & Yovich, 2008)

Congelação lenta Vitrificação

Toxicidade dos crioprotetores + +++

Stress osmótico ++ +++

Efeito tóxico solução +++ −

Risco de formação de gelo

intracelular ++ −

Risco desidratação − ++

Tecnologia +++ +

Custo +++ +++

Risco de contaminação − ++

A criopreservação de ovócitos pode ser realizada pelo método convencional de

congelação lenta, ou por vitrificação. Ambas as técnicas apresentam vantagens e

desvantagens relacionadas com a sua capacidade de superar os principais danos

físicos e riscos laboratoriais associados à criopreservação de ovócitos. Na tabela 8

encontram-se descritos os principais danos que ocorrem durante a congelação lenta e

vitrificação e a sua possível intensidade.



24

2.2.1. Protocolo de equilíbrio - Congelação lenta

O método de congelação lenta foi adaptado, inicialmente, como padrão para a

criopreservação de ovócitos de mamíferos, tendo sido baseado no protocolo

originalmente desenvolvido para embriões (Lassalle et al., 1985).

Esta técnica é caraterizada pela diminuição lenta da temperatura (0,3ºC/ min),

conseguida através da utilização de equipamentos de congelação a velocidade

controlada, conjugada com uma exposição prolongada a reduzidas molaridades de

crioprotetores permeáveis (1-2 M) como dimetilsulfoxido (DMSO), etileno glicol (EG)

ou propanediol (PROH), e um crioprotetor não permeável como a sacarose (0,1-0,5 M)

proporcionando uma desidratação celular lenta, reduzindo os efeitos negativos de uma

concentração aumentada de solutos (Whittingham, 1977).

Depois da exposição aos crioprotetores, os ovócitos são colocados em palhetas

onde ficam armazenados. Estas são expostas a temperaturas sucessivamente mais

baixas e a formação de cristais de gelo na solução é induzida (“ seeded”) através do

contacto com um objeto metálico arrefecido a -196ºC na extremidade da palheta mais

afastada do local onde se encontram as células. Este passo constitui um avanço

importante nos programas de criopreservação de ovócitos humanos: previne a

supercongelação, iniciando-se assim o processo de desidratação celular.

A indução da formação de gelo vai provocar o aumento gradual da concentração

de solutos na fração não congelada, pois a água passa a estar incorporada nos

cristais de gelo extracelulares. A formação deste gradiente osmótico através da

membrana celular, induz a progressiva desidratação das células.

Numa primeira fase, o arrefecimento dá-se a uma velocidade relativamente

rápida até -7ºC (temperatura a que ocorre o início da formação de gelo) de seguida

são arrefecidas a uma taxa de 0.3-0.5ºC/ min até aproximadamente -40ºC, depois a

10ºC/ min até -150ºC, e finalmente são transferidas para o contentor de azoto liquido (-

196ºC) onde ficarão armazenadas.

Através da congelação suficientemente lenta, quase toda a água pode ser

removida do meio intracelular o que permite que não ocorram danos nas células

quando são transferidas para o azoto líquido (Shaw, 1993).



25

2.2.2. Protocolo de não-equilíbrio – Vitrificação

O conceito de “vitrificação” significa a solidificação de uma solução a baixas

temperaturas sem a formação de cristais de gelo. Este fenómeno é conseguido

através do aumento da viscosidade, consequente da grande velocidade de

arrefecimento (>2000ºC/min) e pelo uso de soluções crioprotetoras a altas

concentrações (6-8M) que impedem a formação de cristais de gelo.

Contudo, de forma a minimizar o impacto das soluções hiperosmóticas, o tempo

de exposição terá de ser reduzido (˂1min) (Shaw et al., 1992). Nesta técnica não são

necessários os equipamentos de arrefecimento programado utilizados nos protocolos

de congelação lenta, diminuindo o tempo requerido para a criopreservação das

células. Dada a grande variabilidade inter-individual na sensibilidade dos ovócitos à

criopreservação, foi sugerido que a congelação rápida possa de alguma forma

prevenir os danos comuns resultantes da congelação lenta, tais como a formação de

cristais de gelo intracelulares. (Leibo & Pool, 2011).

Com esta técnica também são evitados danos que possam ocorrer devido à alta

concentração de solutos que ocorre quando a água precipita em forma de gelo.

O sucesso do método de vitrificação está relacionado com a concentração e

volume dos crioprotetores, com o tempo de exposição aos mesmos e com a

velocidade de arrefecimento, que devem ser adequados para impedir a formação de

cristais de gelo intracelular, sem deste modo provocar lesões e efeito tóxico ou

osmótico.

Na vitrificação elimina-se totalmente a formação de cristais de gelo, contudo

existe uma grande probabilidade de ocorrer fratura da zona pelúcida, com

consequente alteração dos organelos intracelulares e do citoesqueleto (Vincent &

Johnson, 1992).

O método de vitrificação consiste em dois passos: 1) equilíbrio - os ovócitos são

expostos a baixas concentrações de crioprotetores, o que permite que a água saia do

meio intracelular e 2) vitrificação - as células são submetidas a um gradiente osmótico

elevado, havendo desidratação celular. Deste modo, os ovócitos podem ser

diretamente colocados em azoto liquido para armazenamento (Borini & Cotichio,

2008).



26

2.3. Armazenamento em azoto

As amostras podem ser armazenadas em azoto líquido, ou em azoto na fase

gasosa. São mantidas a temperaturas inferiores a −140ºC, e poderão ficar

armazenadas por tempo indeterminado.

2.4. Descongelação

A velocidade de aquecimento é também um passo condicionante para o sucesso

das técnicas de criopreservação. O principal problema associado à descongelação é a

recristalização, com a formação de gelo intracelular o que irá reduzir a sobrevivência

dos ovócitos pós criopreservação. O processo de aquecimento deverá ser muito

rápido, cerca de 275ºC/min, de modo a evitar que os pequenos cristais de gelo

intracelulares, que possam ter sido formados durante a criopreservação, tenham

tempo de aumentar de tamanho e provocar danos às células. Também os cristais de

gelo extracelulares irão derreter e atravessar a membrana celular para a rehidratação

dos ovócitos (Friedler et al., 1988).

O método mais comum de descongelação é o denominado de rápida e direta,

pois os ovócitos são colocados na solução de descongelação a uma temperatura entre

20ºC até 37ºC. O passo seguinte é a re-hidratação e remoção dos agentes

crioprotetores, que também deverá ser executado rapidamente (Borini & Cotichio,

2008).

2.5. Remoção dos crioprotetores

Outro fator que afeta a sobrevivência ovocitária é a remoção dos crioprotetores.

Quando se transfere o ovócito que contém uma elevada concentração de crioprotetor,

para um meio com reduzida concentração do mesmo, a taxa de entrada da água na

célula é superior à taxa de saída do crioprotetor, o que provoca aumento de volume

celular e pode até conduzir à rotura da membrana. Para evitar este aumento excessivo

de volume da célula, a remoção dos crioprotetores é realizada através de uma série de

passos em que submetem os ovócitos a soluções com concentrações sucessivamente

mais reduzidas do crioprotetor.



27

A presença de uma molécula não permeável neste meio, como a sacarose, em

concentrações elevadas sabe-se que é muito importante, pois serve como equilíbrio à

concentração do crioprotetor na célula, reduzindo o choque osmótico e controlando o

influxo de água para o interior do ovócito (Shaw, 1993).

3. Indicações para a criopreservação de ovócitos

Quanto à criopreservação de ovócitos propriamente dita, esta oferece várias

vantagens, quer no tratamento da infertilidade, quer na preservação da função

reprodutiva, em pacientes oncológicos ou por questões sociais (Cobo, 2008).

No programa de fertilização in vitro, a criopreservação de ovócitos tem elevada

importância na resolução de várias questões, como por exemplo nos casos em que há

ausência de espermatozoides no dia da punção folicular por dificuldade de colheita

dos gâmetas masculinos ou inexistência de espermatozoides móveis na biópsia

testicular.

Outro exemplo são as más respondedoras, que devido ao reduzido número de

ovócitos recuperados no dia da punção folicular, as possibilidades de sucesso são

diminuidas. Para estes casos a acumulação de ovócitos em metáfase II de diferentes

ciclos de estimulação, teoricamente, permitirá ter uma acrescida capacidade de

selecção embrionária e, consequentemente, aumentará a possibilidade de gestação.

Em situações em que são recuperados um número elevado de ovócitos, no 1º

ciclo, a criopreservação de ovócitos será muito útil, uma vez que permitirá uma nova

tentativa, no caso de não ocorrência de gestação, sem a necessidade de uma nova

estimulação ovárica.

Outra importante aplicação será na prevenção da Síndrome de Hiperestimulação

Ovárica (SHEO), caraterizada por uma resposta exagerada do ovário à estimulação.

Assim, nas situações em que se prevê que a mulher desenvolva esta síndrome, os

ovócitos podem ser criopreservados para utilização num próximo ciclo, sem que a

mulher corra novamente esse risco.

A criopreservação de ovócitos é também indicada a nível da preservação da

fertilidade em mulheres que estão prestes a perder a sua função ovárica por cirurgia,

quimioterapia ou radioterapia, ou para aquelas que queiram ver a sua maternidade

adiada. Para todas estas situações a oferta da criopreservação de ovócitos,

previamente ao início da terapia oncológica é uma possibilidade promissora e,



28

proporcionando a mesma taxa de sucesso do que com ovócitos a fresco, será sem

dúvida a melhor alternativa para preservação da fertilidade.

Certas condições genéticas, como mutações nos genes BRCA 1 e BRCA 2

estão relacionadas com o alto risco de desenvolvimento de cancro dos ovários, sendo

recomendada como medida preventiva a remoção cirúrgica dos mesmos. Para estes

casos, a criopreservação de ovócitos poderá ser uma opção viável como medida

preventiva da esterelidade.

Existe, ainda, outro grupo de mulheres que poderá beneficiar desta técnica,

como por exemplo as que apresentam desordens associadas com falência ovárica

prematura como o Síndrome de X frágil e deleções no cromossoma X. Para aumentar

a probabilidade de sucesso, nestes casos é essencial o diagnóstico precoce (Practice

Committees of the American Society for Reproductive Medicine and the Society for

Assisted Reproductive Technology ,2013).

Outra importante aplicação será na simplificação dos programas de doação de

gâmetas femininos. Atualmente, nos ciclos de doação de ovócitos é necessário que

haja coordenação dos ciclos entre dadora e recetora, o que se torna trabalhoso e com

custos elevados. Assim, exclui-se a necessidade de sincronizar as pacientes dadora

de ovócitos com a recetora.

4. Aspetos clínicos, laboratoriais e éticos da criopreservação de

ovócitos

4.1. Aspetos clínicos: protocolo de estimulação ovárica

Para a obtenção de ovócitos para criopreservar, em situações oncológicas, o

protocolo de estimulação deverá ser: seguro, de modo a evitar o risco de estimulação

do crescimento de neoplasia já existente; rápido, para não adiar o início do tratamento

e eficiente, ou seja com boa possibilidade de recrutamento ovocitário. (Revelli et al.,

2012).

O maior obstáculo na oferta da preservação da fertilidade a doentes com

tumores hormonodependentes como o caso de cancro da mama, é a exposição a

níveis de estradiol muito elevados, durante a estimulação com gonadotrofinas. No

entanto, já foram desenvolvidos protocolos eficientes e potencialmente seguros com

tamoxifeno (Oktay et al., 2003) e inibidores de aromatase (Oktay et al., 2005), que



29

provaram não ter efeitos deletérios nas taxas de sobrevivência destas mulheres (Azim

et al., 2008).

4.2. Aspetos laboratoriais: sistema de armazenamento/

palhetas

Existem diferentes tipos de sistemas de armazenamento para a criopreservação de

ovócitos. As palhetas de plástico convencionais foram um dos primeiros sistemas

utilizados, no entanto devido ao volume de amostra necessário (4 a 5µl) torna-se difícil

alcançar a velocidade de arrefecimento ultra-rápida essencial para a técnica de

vitrificação, sendo necessárias elevadas concentrações de crioprotetores (Chen et al.,

2000).

Com o objetivo de reduzir os efeitos tóxicos das altas concentrações de

crioprotetores necessárias para esta técnica, têm sido desenvolvidos métodos que

permitem um mínimo volume da amostra (˂1µl). Esta abordagem tem também outros

benefícios, tais como o aumento das velocidades de arrefecimento e aquecimento e

também a diminuição da probabilidade da formação de cristais de gelo (Zhang et al.,

2011). Para este efeito, foram desenvolvidos sistemas de armazenamento que

permitem que a amostra seja submergida rapidamente em azoto líquido: Cryotop

(Kuwayama, 2007), McGill Cryoleaf (Chian et al., 2005), nylon loop ou Cryoloop (Lane

et al., 1999a; Lane et al., 1999b), Cryotip (Kuwayama et al., 2005), thin capillary ou

Open-Pulled Straw (OPS) (Vajta et al., 1998), hemi-straw (Vanderzwalmen et al., 2003)

e electron microscope copper/gold grids (Martino et al., 1996a).

4.3. Questões éticas

Na sociedade atual, particularmente nos países desenvolvidos as mulheres

optam por adiar temporariamente a maternidade enquanto dão prioridade a outros

objetivos, como por exemplo a construção de uma carreira professional. Quando

pretendem engravidar em idades mais tardias a taxa de gravidez será mais reduzida,

como consequência da diminuição da reserva ovárica que ocorre naturalmente. Para

estes casos, a possibilidade de criopreservação ovocitária será muito útil, embora

levante diversas questões éticas, uma vez que a infertilidade destas mulheres não

resulta de motivos exteriores ao seu controlo, como é o caso de doenças oncológicas.



30

A preocupação principal que surge associada à criopreservação de ovócitos é o

seu uso para o adiamento eletivo da maternidade, que potencialmente poderá ocorrer

até após a idade reprodutiva.

Outro aspeto ético relacionado com a criopreservação de ovócitos, são os casos

de doação ovocitária, que pode ser problemático para os que defendem religiões como

o cristianismo, islamismo ou judaísmo uma vez que estes ovócitos são para o uso

exterior ao casamento ou como um meio de tratamento da infertilidade, o que implica

um terceiro interveniente na relação (Borini & Coticchio, 2009)

5. Dificuldades associadas

Numa primeira fase, não há dúvida que o objetivo primordial da criopreservação

de ovócitos se centra na manutenção da viabilidade das células congeladas, mesmo

após um longo período de armazenamento. Contudo, devido às caraterísticas da

membrana plasmática, à presença de grânulos corticais e ao fato de, na maior parte

dos casos, o ovócito se apresentar no estádio de metafase II (MII) da meiose com o

seu sistema complexo do fuso meiótico presente, justifica a dificuldade em alcançar

essa mesma viabilidade.

O sucesso inicial das técnicas de criopreservação de ovócitos maduros foi

limitado pela fragilidade do ovócito em metáfase II, relacionada com o seu tamanho

(≈150 µm), conteúdo em água e arranjo cromossómico.

O ovócito, sendo das maiores células do corpo humano, é constituído por uma

grande percentagem de água. Na criobiologia, o tamanho e consequentemente a

massa são fatores decisivos no sucesso das técnicas.

Segundo Mazur (1963) o fator com maior influência na resposta da célula à

congelação é a razão área de superfície/ volume celular. Geralmente quanto maior é a

célula, mais lento terá de ser o arrefecimento e maior será o tempo necessário de

exposição aos crioprotetores de modo a permitir atingir o equilíbrio osmótico.

Justifica-se, deste modo, a diferente tolerância aos danos provocados pela

criopreservação entre espermatozoides e ovócitos, especialmente a formação de

cristais de gelo, stress osmótico e toxicidade dos crioprotetores (Stachecki & Cohen,

2004; Mazur, 1963). Portanto, as trocas osmóticas entre a membrana celular, que

incluem os processos de desidratação e incorporação dos crioprotetores, são muito

mais complexas nos ovócitos, existindo um maior risco de formação de gelo.



31

É importante, por isso, salientar que o principal problema das células

criopreservadas é a lesão causada nos organelos devido à formação de cristais de

gelo intracelulares. Ao congelar, a água intracelular pode assumir uma forma

cristalizada, com consequente aumento de volume e pressão sobre as células

congeladas provocando alterações no citoplasma.

Para além disso, comparativamente a outras células de mamíferos, os ovócitos

têm uma reduzida razão superfície/volume, o que condiciona as trocas osmóticas e

consequentemente afeta a desidratação celular, essencial para a sobrevivência pós-

descongelação (Sathananthan et al., 1987).

A lesão causada pelo frio (efeito “chilling”) é o maior obstáculo para o sucesso da

criopreservação de ovócitos, promovendo lesões nas membranas celulares,

microtúbulos e na organização do citoesqueleto e zona pelúcida. Desta forma são

observadas anomalias cromossómicas nos ovócitos após criopreservação. Esta lesão

ocorre quando a membrana da célula é submetida à transição do estado líquido para o

sólido, durante a congelação lenta, no momento em que as temperaturas variam entre

5oC e −15oC. Tal fato, promove alteração nos lípidos das membranas, nos

microtúbulos do fuso meiótico, e endurecimento da zona pelúcida.

Outro fator limitante é o facto de o ovócito ser esférico, o que dificulta a

distribuição homogénea do crioprotetor, principalmente na área mais central, e

portanto pode afetar a sua proteção.

O número de células é também uma fragilidade. Enquanto que os embriões

sendo entidades multicelulares, podem sobreviver à perda de até 50% das suas

células durante os processos de congelação/ descongelação, no caso do ovócito isto

já não se verifica, sendo este uma única célula, torna-se muito mais vulnerável.

Assim, todas estas fragilidades tornam os ovócitos suscetíveis a vários danos

estruturais durante a descongelação: no fuso meiótico e consequentemente provocam

instabilidade das ligações entre os cromossomas, nos microfilamentos essenciais à

extrusão do glóbulo polar, migração dos pronúcleos e citocinese, na zona pelúcida

como fendas e endurecimento e nos grânulos corticais causando a reação cortical

prematura.



32

6. DISCUSSÃO

Atualidade do protocolo de criopreservação de ovócitos e

respetivas taxas de sucesso

Nos últimos anos, o desenvolvimento de metodologias eficazes para a

criopreservação de ovócitos tem sido um dos maiores objetivos na PMA. Como foi

referido anteriormente, esta técnica tem o potencial, não apenas de ultrapassar

problemas éticos e legais associados com a criopreservação de embriões, mas

também de preservar a fertilidade em pacientes com risco de falência ovárica

prematura, e ainda em mulheres que são obrigadas a adiar a sua maternidade devido

a doenças oncológicas.

Ao longo da segunda parte do trabalho foi possível estudar os aspetos biológicos

e laboratoriais que influenciam o sucesso desta técnica, bem como conhecer as

metodologias existentes. Em relação a este último aspeto, ainda existe alguma

variação entre os protocolos e, até à data ainda não foi possível estabelecer um

protocolo ideal. Com o intuito de prever qual ou quais os protocolos com melhores

taxas de sucesso, foi realizada uma análise crítica dos resultados obtidos nos estudos

realizados ao longo dos últimos anos, tendo em conta as principais questões que se

colocam na escolha de um protocolo de criopreservação de ovócitos. Para isso,

tiveram-se em consideração as três questões principais relacionadas com a

criopreservação ovocitária, que são: 1) O estádio de maturação em que se encontram

os ovócitos, se se deve criopreservar em estádio imaturo de vesícula germinativa ou

maduro, em metáfase da segunda divisão da meiose (metáfase II); 2) Desnudação dos

ovócitos antes da criopreservação e 3) O protocolo a utilizar, congelação lenta ou

vitrificação. O objetivo final será estimar qual ou quais as metodologias mais

promissoras para a sua inclusão como técnica de rotina dos centros de PMA.

6.1. Estádio de maturação: imaturo vs metafase II

Os resultados de vários estudos sugerem que as principais variáveis que afetam

a sobrevivência ovocitária são o seu estadio de maturação, e fatores biofísicos

resultantes do protocolo de criopreservação utilizado (Ludwig et al., 1999).

Relativamente ao estádio de maturação, os ovócitos podem ser criopreservados, tanto



33

em estádio imaturo de vesícula germinativa (VG), como em estádio maduro de

metáfase II, cada uma com as suas vantagens e limitações.

Devido à estrutura particular dos ovócitos em estádio de VG, foi proposto que a

criopreservação nesta fase poderá evitar os danos que ocorrem no fuso meiótico

durante o processo de criopreservação de ovócitos em metáfase II pelo método de

congelação lenta (Toth et al., 1994a). Nos ovócitos imaturos, em estádio de diplóteno

da profase I, a cromatina ainda não está condensada e está rodeada pela membrana

nuclear, o que teoricamente poderá ter a vantagem de evitar a despolimerização do

fuso meiótico e o risco consequente de poliploidia e aneuploidia (Toth et al., 1994b).

Apesar das taxas de sobrevivência à criopreservação de ovócitos imaturos e em

metáfase II serem semelhantes, os maiores problemas associados com a

criopreservação de ovócitos imaturos é a redução da capacidade de maturação in vitro

após descongelação e da taxa de fertilização (Toth et al., 1994 a,b; Son et al., 1996;

Cooper et al., 1998; Isachenko et al., 1999; Mandelbaum et al., 1998; Mandelbaum et

al., 2004).

Até à data, apenas estão descritos um número reduzido de nascimentos

resultantes de ovócitos criopreservados em fase de vesícula germinativa, maturados in

vitro e fertilizados por ICSI (Chian et al., 2009a; Tucker et al.,1998; Chian et al.,

2009b).

As dificuldades associadas com a maturação e cultura in vitro, parecem

sobrepor-se aos potenciais benefícios da criopreservação neste estádio de maturação.

Além disso, a criopreservação neste estádio também está relacionada com o aumento

da incidência de anomalias cromossómicas. (Park et al., 1997).

Estudos recentes, apontam para as vantagens de induzir a maturação in vitro

previamente à criopreservação, e deste modo criopreservar os ovócitos em metáfase II

após a sua maturação, pelo método de vitrificação (Cao et al., 2009; Cao e Chian,

2009; Fasano et al., 2012; Lee et al., 2013).

A recolha de ovócitos imaturos sem estimulação ovárica prévia, e posterior

vitrificação é uma opção promissora para a preservação da fertilidade de mulheres que

não podem ser submetidas a estimulação ovárica ou não podem adiar o seu

tratamento gonadotóxico, e também para mulheres em risco de SHEO (Chian et al.,

2013). A questão que se coloca prende-se com a dúvida entre criopreservar os

ovócitos em estádio imaturo de VG e submetê-los a maturação após descongelação,

ou se será mais vantajoso submeter os ovócitos a fresco a maturação in vitro e

criopreservá-los em metáfase II.



34

Na tabela 9 são enunciados os principais estudos que investigaram qual das

metodologias será a mais eficiente, no que respeita à taxa de sobrevivência,

fertilização e maturação ovocitária.

Tabela 9 - Resultados obtidos nas principais publicações que comparam a eficácia de maturação in vitro de ovócitos

imaturos pré criopreservação e pós descongelação

Taxa de sobrevivência (%) Taxa de maturação in vitro (%) Taxa de fertilização (%)

Publicação

Maturação in

vitro pré

criopreservação

Maturação in

vitro pós

descongelação

Maturação in

vitro pré

criopreservação

Maturação in

vitro pós

descongelação

Maturação in

vitro pré

criopreservação

Maturação in

vitro pós

descongelação

Cao et al.

(2009a) 86,1 85,4 85,4 50,8 58,8 62,1

Fasano et

al. (2012) 86,9 84,5 46 23,8 52,5 45

Lee et al.

(2013) 83 83,3 50 25 ND ND

Com o desenvolvimento das técnicas de vitrificação, foi possível melhorar os

resultados relativamente às taxas de sobrevivência, e portanto em estudos recentes foi

demonstrado não haver diferenças significativas entre a taxa de sobrevivência de

ovócitos vitrificados em estádio de vesícula germinativa e em metáfase II, os valores

obtidos encontram-se entre 83-87% (Cao et al., 2009; Fasano et al., 2012; Lee et al.,

2013).

Contudo, o potencial de maturação foi consideravelmente reduzido nos ovócitos

vitrificados em estádio imaturo (50,6%; 23,8%; 25%), quando comparados com os

resultados obtidos quando se induz a maturação anterior ao processo de

criopreservação (85,4%; 46%; 50%). Estes resultados sugerem que os ovócitos

imaturos deverão ser submetidos a maturação in vitro previamente ao processo de

vitrificação em vez de vitrificados em estádio de vesícula germinativa, como era

realizado em estudos anteriores.

Assim, a vitrificação de ovócitos maturados in vitro representa uma nova opção

para a preservação da fertilidade, no entanto será muito importante que futuramente

se avalie o desenvolvimento das crianças nascidas como resultado da vitrificação de

ovócitos em MII, que foram previamente maturados in vitro.



35

6.2. Desnudação dos ovócitos antes da criopreservação

Outra possibilidade para a criopreservação de ovócitos, é a desnudação destes

antes da criopreservação propriamente dita. Isto é, os gâmetas são completamente

desnudados das células protetoras do cumulus antes de serem criopreservados.

Contudo, alguns autores creem que as células do cúmulos poderão oferecer alguma

proteção contra as repentinas alterações osmóticas, induzidas pelo rápido

influxo/afluxo de água e de crioprotetores durante a desidratação/ rehidratação, que

ocorrem, respetivamente, na fase pré e pós congelação. Foi observado tanto para o

método de congelação lenta com ovócitos humanos (Imoedemhe & Sigue, 1992),

como para vitrificação com ovócitos de cavalo (Tharasanit et al., 2009).

Recentemente foi provado a não existência de diferenças significativas na

sobrevivência e no desenvolvimento de embriões de boa qualidade, obtidos a partir de

ovócitos vitrificados com ou sem corona radiata intacta. A diferença está na

capacidade de fertilização por FIV. Neste estudo concluíu-se que apenas é obtida uma

taxa normal de fertilização nos ovócitos em que as células do cumulus se mantiveram

intactas durante a criopreservação (Tong et al., 2012).

Anteriormente também já tinha sido sugerido que o procedimento de

criopreservação poderia induzir a rutura e libertação prematura dos grânulos corticais,

estruturas estas que são responsáveis por impedir que mais que um espermatozoide

fertilize o ovócito. Este acontecimento resulta no endurecimento da zona pelúcida, o

que impede a fertilização dos ovócitos durante uma inseminação convencional

(Vincent et al., 1990; Matson et al., 1997; Ko et al., 2008).

Sendo esta a única desvantagem da criopreservação de ovócitos sem as células

do cumulus, o método mais utilizado é a desnudação antes do processo de

criopreservação, para avaliar a maturidade ovocitária. Após a descongelação, os

ovócitos são fertilizados pela técnica de ICSI, permitindo ultrapassar as limitações

observadas quando se utilizava a técnica de FIV.

6.3. Congelação lenta vs vitrificação

Outra principal questão que se coloca é relativamente ao método de

criopreservação: se se deve utilizar um protocolo de congelação lenta ou de

vitrificação. Foi avaliada a eficácia clínica destas duas alternativas, comparando as

taxas de sucesso nos principais estudos utilizando os protocolos de congelação lenta

e vitrificação. Para isso, tiveram-se em consideração três variantes fundamentais: taxa



36

de sobrevivência após descongelação, taxa de fertilização e, quando possível, taxa de

implantação, apresentadas na tabela 11 (anexo II). A combinação destes resultados

permitirá avaliar a eficiência de cada uma das técnicas.

Os primeiros estudos que obtiveram resultados da taxa implantação de embriões

usando ovócitos criopreservados pelo protocolo de congelação lenta foram descritos

nos anos 80, e utilizavam DMSO como crioprotetor (Chen, 1986; Al-Hasani et al.,1987;

Van Uem et al., 1987; Siebzehnruebl et al., 1989). No entanto, estudos realizados

posteriormente não conseguiram reproduzir este sucesso inicial.

Na década seguinte foram realizados vários estudos que permitiram reduzir as

preocupações com a segurança deste método (Gook et al., 1993; 1994;1995a, b),

estes estudos eram baseados na utilização de PROH (1.5M) e sacarose (0.1M) como

crioprotetores, protocolo que tinha sido desenvolvido para a utilização em embriões

humanos. Este protocolo foi adotado por vários grupos de investigação e em 1997 foi

descrito o primeiro nascimento resultante desta técnica (Porcu et al., 1997).

Contudo apenas cerca de 50% dos ovócitos sobreviviam à criopreservação

(Tucker et al., 1996; Porcu et al., 1997; Antinori et al., 1998; Nawroth e Kissing, 1998;

Polak de Fried et al., 1998; Tucker et al., 1998; Young et al., 1998; Wurfel et al., 1999;

Chia et al., 2000; Porcu et al., 2000., 2002; Huttelova et al., 2003; Notrica et al., 2003;

Allan, 2004; Borini et al., 2004; Miller et al., 2004; De Santis et al., 2007; Gook and

Edgar, 2007; Greco et al.,2008). Estes resultados em conjunto com uma taxa de

fertilização inferior a 50% limitaram a aplicação clínica deste protocolo (Gook and

Edgar, 2007).

Na tentativa de aumentar a taxa de sobrevivência ovocitária, foram introduzidas

novas modificações, nomeadamente com o aumento da concentração de crioprotetor

não permeável, utilizando sacarose 0.2M (Fabbri et al., 2001; Chen et al., 2004) e

0.3M (Fosas et al., 2003) onde foram obtidas taxas de sobrevivência superiores.

Apesar da sobrevivência ovocitária à congelação lenta ter melhorado com a

introdução de sacarose (0.1M) na solução crioprotetora, mesmo aumentanto esta

concentração (0.2M e 0.3M) estudos evidenciaram que os resultados obtidos nunca

são superiores a 70-80%, como se pode observar na tabela 11 (Yang et al.,2002;

Bianchi et al., 2007; Konc et al., 2008; Permegiani et al., 2009; Ferraretti et al.,2010;

Gook e Edgar, 2011).

Utilizando um protocolo de congelação lenta com sacarose 0.2M Yang et al.

(2002) obtiveram uma taxa de implantação com embriões obtidos a partir de ovócitos

criopreservados de 25,3%, inferior à obtida com o grupo controlo, de 43,4% (embriões

obtidos a partir de ovócitos não criopreservados). Apesar de em muitos estudos haver



37

uma falha em relação à comparação dos resultados obtidos com ovócitos

criopreservados pelo método de congelação lenta com os resultados obtidos com

ovócitos a fresco, em estudos realizados em anos seguintes, que apresentaram esta

comparação, estes valores foram semelhantes no que se refere às taxas de

fertilização e implantação (Bianchi et al., 2007; Konc et al. 2008; Gook & Edgar, 2011).

Na tentativa de melhorar estes resultados, foi introduzida uma nova técnica de

criopreservação de ovócitos- a vitrificação, cujas caraterísticas já foram apresentadas,

anteriormente. O primeiro nascimento resultante de um ovócito vitrificado foi

conseguido por Kuleshova et al. (1999), em que utilizaram um único crioprotetor

permeável (EG) a uma concentração muito alta (7.1M), em conjunto com um

crioprotetor não permeável (0.6M sacarose). Posteriormente foram introduzidas

modificações neste protocolo (5.5M EG, 1.0M sacarose) (Yoon et al., 2000; Wu et al.,

2001; Yoon et al., 2003; Kuwayama et al., 2005; Kim et al., 2010), também sendo

utilizadas com sucesso. Katayama et al. (2003) introduziram um protocolo utilizando

uma combinação de dois crioprotetores permeáveis (2.7M EG, 2.1M DMSO) com

sacarose (0.5M), tornando-se no método mais adotado por outros grupos de

investigação (Kyono et al., 2005; Okimura et al., 2005; Lucena et al., 2006; Selman et

al., 2006; Antinori et al., 2007).

Apesar de futuramente ainda poderem ser desenvolvidos métodos otimizados,

os métodos atualmente existentes para a congelação lenta de ovócitos humanos

parecem afetar negativamente o potencial de desenvolvimento dos embriões obtidos e

também as taxas de sobrevivência, que são mais baixas em comparação com as

descritas para o método de vitrificação, cerca de 90% (Antinori et al., 2007; Cobo et

al., 2008; Nagy et al., 2009; Rienzi et al., 2010; Ubaldi et al., 2010; Almodin et al.,

2010; Cobo et al., 2010; Trokoudes et al., 2011; Garcia et al., 2011).

Os estudos sobre a eficácia da vitrificação geralmente utilizam o sistema de

armazenamento aberto, em que as células estão em contacto direto com o azoto

líquido, permitindo deste modo aumentar a velocidade de arrefecimento e podendo ser

utilizadas concentrações inferiores de crioprotetores, diminuindo assim o efeito tóxico

dos mesmos. Contudo, surgem preocupações com a possibilidade de contaminação

das amostras armazenadas.

Paffoni et al. (2011) e Papatherodorou et al. (2013) compararam a eficácia da

vitrificação por sistema aberto e por sistema fechado (tabela 11), tendo obtido taxas de

sobrevivência ligeiramente superiores nos ovócitos armazenados em sistema aberto

(82,8% a 91%) quando comparadas com as taxas de sobrevivência obtidas nos

ovócitos armazenados em sistema fechado (57,9% a 87,9%). As taxas de fertilização e

http://humupd.oxfordjournals.org/content/early/2012/04/25/humupd.dms016.full#ref-213














38

implantação no primeiro estudo foram superiores no grupo vitrificado em sistema

aberto, em contrapartida no segundo estudo os resultados não corroboram os obtidos

por Paffoni et al. (2011), em que as taxas de fertilização e implantação foram

superiores no grupo vitrificado em sistema fechado, ainda que a diferença não seja

significativa.

Todos estes estudos se concentram apenas num protocolo. Contudo, a forma

mais válida de comparar as taxas de sucesso do método de congelação lenta e

vitrificação será avaliar os resultados obtidos num único estudo em que o material

biológico e as condições de cultura serão mais semelhantes. Contudo, poucos estudos

estão descritos.

Smith et al. (2010) e Fadini et al. (2009) evidenciaram um aumento das taxas de

sobrevivência, fertilização e implantação na vitrificação de ovócitos em MII quando

comparada com a técnica de congelação lenta. No entanto nestes estudos não são

apresentados dados relativamente à comparação com ovócitos a fresco (não

criopreservados).

A vitrificação é uma alternativa que está a ser usada em muitos laboratórios

mundialmente (Antinori et al., 2007; Cobo et al., 2011; Lucena et al., 2006; Chian et al.,

2008; Gosden et al., 2011) e por apresentar uma maior sobrevivência após

descongelação pensa-se que no futuro, será a principal técnica de criopreservação de

gâmetas femininos, particularmente os métodos que utilizam um volume mínimo como

o cryotop, pois os resultados obtidos são bastantes promissores.

Apesar da vitrificação também poder ter consequências na segregação dos

cromossomas em ovócitos humanos (Coticchio et al., 2009), evidencía melhores

resultados que a congelação lenta (Gook et al., 2012; Coticchio et al., 2001).

Esta técnica alcançou resultados semelhantes aos obtidos com ovócitos a fresco,

tanto com ovócitos recolhidos de mulheres saudáveis- dadoras (Cobo et al., 2008;

Nagy et al., 2009; Cobo et al., 2010; Trokoudes et al., 2011; Garcia et al., 2011), como

de pacientes de infertilidade (Antinori et al., 2007; Rienzi et al., 2010; Ubaldi et al.,

2010¸ Almodin et al., 2010).



39

7. CONCLUSÃO

A medicina reprodutiva sofreu grandes mudanças ao nível do desenvolvimento

de métodos de criopreservação de gâmetas e embriões. A determinação do protocolo

adequado para cada tipo celular é um processo árduo e longo, e apesar da

criopreservação de embriões e espermatozoides fazer parte da rotina dos Centros de

Procriação Medicamente Assistida ainda existem algumas limitações no que respeita à

criopreservação de ovócitos. Atualmente acredita-se que o futuro esteja na vitrificação

de ovócitos em metáfase II, descrita pela primeira vez por Katayama et al. (2003). No

entanto, ainda não existe um protocolo considerado ideal. Devido à variabilidade de

protocolos utilizados, julga-se que a metodologia a adotar deverá ser adaptada a cada

laboratório, nomeadamente tendo em conta os recursos disponíveis, equipamento e

consumíveis.

Em suma, ainda há muita investigação a fazer no sentido de alcançar a melhor

técnica e com melhores resultados, uma vez que a criopreservação de ovócitos é sem

dúvida promissora. Contudo, ainda não se tem o conceito de qual a melhor técnica de

criopreservação.

8.BIBLIOGRAFIA

Allan, J. (2004) Re: case report: pregnancy from intracytoplasmic injection of a frozen-thawed oocyte. Aust N Z J Obstet Gynaecol 44:588.

Al-Hasani, S., Diedrich, K., van der Ven, H., Reinecke, A., Hartje, M., Krebs D. (1987) Cryopreservation of human oocytes. Hum Reprod 2:695-700.

Almeida, V., Sousa, A., Plancha, C., Leal, F., Figueiredo, H., & Silva, J. (2012). Classificação da Qualidade Embrionária. In Orientações Técnicas em Medicina da Reprodução. Grafisol.

Almodin, C.G., Minguetti-Camara, V.C., Paixao, C.L., Pereira, P.C. (2010) Embryo development and gestation using fresh and vitrified oocytes. Hum Reprod 25:1192-1198.

Antinori, M., Licata, E., Dani, G., Cerusico, F., Versaci, C., Antinori, S. (2007) Cryotop vitrification of human oocytes results in high survival rate and healthy deliveries. Reprod Biomed Online 14:72–79.

Antinori, S., Dani, G., Selman, H.A., Vidali, A., Antinori, M., Cerusico, C., Versaci, C. (1998) Pregnancies after sperm injection into cryopreserved human oocytes. Hum Reprod 13:157–158.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Al-Hasani%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3437048

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Diedrich%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3437048

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=van%20der%20Ven%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3437048

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Reinecke%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3437048

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hartje%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3437048

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Krebs%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=3437048



40

Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest group of Embryology. (2011)The Istambul consensus Workshop on embryo assessment proceedings of an expert meeting. Hum Reprod 26: 1270-1283.

Azim, A.A., Costantini-Ferrando, M., Oktay, K. (2008) Safety of fertility preservation by ovarian stimulation with letrozole and gonadotropins in patients with breast cancer: a prospective controlled study. J Clin Oncol 26: 2630–2635.

Bakhanach, J. (2009) The cryopreservation of composite tissues: Principles and recent advancement on cryopreservation of different types of tissues. Organogenesis 5:119-126.

Barros, A., Sousa M. (2000) Reprodução medicamente assistida na infertilidade de causa masculina. In Andrologia clínica. Sociedade Portuguesa de Andrologia (ed), Cap. II:157-162.

Bianchi, V., Coticchio, G., Distratis, V., Di Gusto, N., Flamigni, C., Borini, A. (2007) Differential sucrose concentration during dehydration (0.2 mol/l) and rehydration (0.3 mol/l) increases the implantation rate of frozen human oocytes. Reprod Biomed Online 14:64-71.

Borini, A., Bonu, M.A., Coticchio, G., Bianchi, V., Cattoli, M., Flamigni, C.(2004) Pregnancies and births after oocyte cryopreservation. Fertil Steril 82:601–605.

Borini, A., Coticchio, G. (2009) Preservation of Human Oocytes: From Cryobiology Science to Clinical Applications. Informa Health Care. London.

Bouchard, P., Fauser, B.C. (2000) Gonadotropin-releasing hormone antagonist: new tolls vs. old habits. Fertil Steril 73:18–20.

Cao, Y., Chian, R.C. (2009) Fertility preservation with immature and in vitro matured oocytes. Semin Reprod Med 27: 457-464

Cao, X.Y., Xing, Q., Zhang, Z.G., Wei, Z.L., Zhou, P., Cong, L. (2009) Cryopreservation of immature and in-vitro matured human oocytes by vitrification. Reprod Biomed Online 19:369-373. . Caroll, J., Depypere, H., Mathew, C.D. (1990) Freeze-thaw-induced changes of the zona pellucida explains decreased rates of fertilization in frozen-thawed mouse oocytes. J Reprod Fertil 90:547-553. Chang, C.C., Elliott, T.A., Wright, G., Shapiro, D.B., Toledo, A.A., Nagy, Z.P. (2013) Prospective controlled study to evaluate laboratory and clinical outcomes of oocyte vitrification obtained in in vitro fertilization patients aged 30 to 39 years. Fertil Steril 99:1891-1897. Chen C. (1986) Pregnancy after human oocyte cryopreervation. Lancet 1:884-886.

Chen, S.U., Lien, Y.R., Chen, H.F., Chao, K.H., Ho, H.N., Yang, Y.S. (2000) Open pulled straws for vitrification of mature mouse oocytes preserve patterns of meiotic spindles and chromosomes better than conventional straws. Hum Reprod 15:2598–2603.

Chen, S.U., Lien, Y.R., Chang, L.J., Tsai, Y.Y., Ho, H.N., Yang, Y.S. (2004) Cryopreserved sibling oocytes and intracytoplasmatic sperm injection rescue

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chang%20CC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23481277

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Elliott%20TA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23481277

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wright%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23481277

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shapiro%20DB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23481277

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Toledo%20AA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23481277

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nagy%20ZP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23481277



41

unexpectedly poor fertilization in conventional in vitro fertilization. J Assist Reprod Genet 21:367-369.

Chia, C., Chan, W., Quah, E., Cheng, L. (2000) Triploid pregnancy after ICSI of frozen testicular spermatozoa into cryopreserved human oocytes. Case Report. Hum Reprod 15:1962–1964.

Chian, R.C., Gilbert, L., Huang, J.Y.J., Son, W.Y., Holzer, H., Cui, S.J., Buckett, W.M., Tulandi, T., Tan, S.L. (2009a) Obstetrical outcomes following vitrification of oocytes matured in-vivo or in-vitro. Fertil Steril 91:2391-2398.

Chian, R.C., Gilbert, L., Huang, J.Y.J., Demirtas, E., Holzer, H., Benjamin, A., Buckett, W.M., Tulandi, T., Tan, S.L. (2009b) Live birth after vitrification of in vitro matured human oocytes. Fertil Steril 91:372-376.

Chian, R.C., Huang, J.Y.J., Tan, S.L., Lucena, E., Saa, A., Rojas, A., Ruvalcaba Castellón, L.A., García Amador, M.I., Montoya Sarmiento, J.E. (2008) Obstetric and perinatal outcome in 200 infants conceived from vitrified oocytes. Reprod Biomed Online 16:608–610.

Chian,R.C, Son, W.Y., Huang, J., Cui, S.J., Buckett, W.M., Tan, S.L. (2005) High survival rates and pregnancies of human oocytes following vitrifi cation: preliminary report. Fertil Steril 84, S36.

Chian, R.C., Uzelac, P.S., Nargund, G. (2013) In vitro maturation of human immature oocytes for fertility preservation. Fertil Steril 99:1173-1181.

Cobo, A. (2008) Criopreservacion de ovocitos: congelación lenta y vitrificación. In Cuadernos de Medicina Reproductíva: Criobiología. Adalia, Madrid.

Cobo, A., Diaz, C. (2011) Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertil Steril 96:277–285.

Cobo, A., Kuwayama, M., Perez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohi, J. (2008) Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertil Steril 89:1657-1664.

Cobo, A., Meseguer, M., Remoh, J., Pellicer, A. (2010) Use of cryo-banked oocytes in an ovum donation programme: a prospective, randomized, controlled, clinical trial. Hum Reprod 25:2239–2246. Conselho Nacional de Procriação Medicamente Assistida. Consultado em Maio de

2013 http://www.cnpma.org.pt/

Cooper, A., Paynter, S.J., Fuller, B.J., Shaw, R.W. (1998) Differential effects of

cryopreservation on nuclear or cytoplasmic maturation in vitro in immature mouse

oocytes from stimulated ovaries. Hum Reprod 13:971–978.

Coticchio, G., Bromfierod, J.J., Sciajno, R., Gambardella, A., Scaravelli, G., Borini, A., Albertini, B.F. (2009) Vitrification may increase the rate of chromosome misalignment in the mataphase II spindle of human mature oocytes. Reprod Biomed Online 19:29–34.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ruvalcaba%20Castell%C3%B3n%20LA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18492361

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ruvalcaba%20Castell%C3%B3n%20LA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18492361

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Garc%C3%ADa%20Amador%20MI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18492361

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Montoya%20Sarmiento%20JE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18492361

http://www.cnpma.org.pt/



42

Coticchio, G., Garetti, S., Bonu, M.A., Borini, A. (2001) Cryopreservation of human oocytes. Hum Fertil 4:152–157.

De Santis, L., Cino, I., Rabellotti, E., Papaleo, E., Calzi, F., Fusi, F.M., Brihante, C., Ferrari, A. (2007) Oocyte cryopreservation: clinical outcome of slow-cooling protocols differing in sucrose concentration. Reprod Biomed Online 14:57–63.

Devroey, P. (2000) GnRH antagonists. Fertil Steril 73:15–17.

Diedrich, K., Diedrich, C., Santos, E., Zoll, C., Al-Hasani, S., Reissmann, T., Krebs, D., Klingmüller D. (1994) Suppression of the endogenous luteinizing hormone surge by the gonadotrophin-releasing hormone antagonist Cetrorelix during ovarian stimulation. Hum Reprod 9:788–791.

Eroglu, A., Toner, M., Toth, T.L. (2002) Beneficial effect of microinjected trehalose on the cryosurvival of human oocytes. Fertil Steril, 77:152-158.

Fabbri, R. , Porcu, E., Marsella, T., Rocchetta, G., Venturoli, S., Flamigni, C. (2001) Human oocyte cryopreservation: new perspectives regarding oocyte survival. Hum Reprod 16:411-416.

Fadini, R., Brambillasca, F., Renzini, M.M., Merola, M., Comi, R., De Ponti, E., Dal Canto, M.B. (2009) Human oocyte cryopreservation: comparison between slow and ultrarapid methods. Reprod Biomed Online 19:171-180.

Fasano, G., Demeestere, I., Englert, Y. (2012) In-vitro maturation of human oocytes before and after vitrification? J Assist Reprod Genet 29:507-512.

Ferraretti, A.P., Lappi, M., Magli, M.C., Muzzonigro, F., Resta, S., Gianaroli, L. (2010) Factors affecting thawed oocyte viability suggest a customized policy of embryo transfer. Fertil Steril 94:1308-1313.

Figueiredo, H. (2005) A procriação medicamente assistida e as gerações futuras, Gráfica de Coimbra, Coimbra.

First baby born of frozen embryo (1984) The New York Times.

Fleischer, A.C., Daniell, J.F., Rodier, J., Lindsay, A.M., James, A.E. (1981) Sonographic monitoring of ovarian follicular development. J Clin Ultrasound 9:275–280.

Fosas, N., Marina, F., Torres, P.J., Jove, I., Martin, P., Perez, N., Arnedo, M., Marina, S. (2003) The births of five Spanish babies from cryopreserved donated oocytes. Hum Reprod 18:1417–1421. Friedler, S., Giudice, L., Lamb, E. (1988) Cryopreservation of embryos and ova. Fertil Steril 49: 743–764.

Fuller, B., Paynter, S. (2004) Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reprod Biomed Online 9:680-869.

Garcia, J.I., Noriega-Portella, L., Noriega-Hoces, L. (2011) Efficacy of oocyte vitrification combined with blastocyst stage transfer in an egg donation program. Hum Reprod 26:782-790.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Klingm%C3%BCller%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7929723



43

Gook, D.A., Edgar, D.H. (2007) Human oocyte cryopreservation. Hum Reprod Update 13:591–605.

Gook, D.A., Edgar, D.H. (2011) Implantation rates of embryos generated from slow cooled human oocytes from young women are comparable to those of fresh and frozen

embryos from the same age group. J Assist Reprod Genet 28:1171-1176.

Gook, D.A., Edgar, D.H. (2012) A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Hum Reprod Update 18:536–554.

Gook, D.A., Osborn, S.M., Bourne, H., Johnston, W.I. (1994) Fertilization of human oocytes following cryopreservation; normal karyotypes and absence of stray chromosomes. Hum Reprod 9:684–691.

Gook, D.A., Osborn, S.M., Johnston, W.I. (1993) Cryopreservation of mouse and human oocytes using 1,2-propanediol and the configuration of the meiotic spindle. Hum Reprod 8:1101–1109. . Gook, D.A., Osborn, S.M., Johnston, W.I. (1995a) Parthenogenetic activation of human oocytes following cryopreservation using 1,2-propanediol. Hum Reprod 10:654–658. Gook, D.A., Schiewe, M.C., Osborn, S.M., Asch, R.H., Jansen, R.P., Johnston, W.I. (1995b) Intracytoplasmatic sperm injection and embryo development of human oocytes cryopreserved using 1,2-propanediol. Hum Reprod 10:2637-2641.

Gosden, R. (2011) Cryopreservation: a cold look at technology for fertility preservation. Fertil Steril 96:264–268.

Greco, E.,Iacobelli, M.,Rienzi, L., Menchini Fabris, G.F., Tesorio, N., Tesarik, J. (2008) Birth of a healthy boy after fertilization of cryopreserved oocytes with cryopreserved testicular spermatozoa from a man with nonmosaic Klinefelter syndrome. Fertil Steril 89:991.e5-991.e7.

Hamano,S., Koikeda, A., Kuwayama, M., Nagai, T. (1992) Full-term development of in-vitro matured, vitrified and fertilized bovine oocytes. Theriogenology 38:1085-1090.

Heffner, L.J. (2004) Advanced maternal age – How old is too old? New England Journal of Medicine 351:1927-1929.

Huttelova, R., Becvarova, V., Brachtlova, T. (2003) More successful oocyte freezing. J Assist Reprod Genet 20:293. Imoedemhe, D.G., Sigue, A.B. (1992) Survival of human oocytes cryopreserved with or without the cumulus in 1,2-propanediol. J Assist Reprod Genet 9: 323–327.

Isachenko, E.F., Nayudu, P.L. (1999) Vitrification of mouse germinal vesicle oocytes: effect of treatment temperature and egg yolk on chromosomal normality and cumulus integrity. Hum Reprod 14:400–409.

Jayachandran, K.D., Natarajan, P., Pandiyan, R. (2012) First Postembryo Transfer Beta-hCG Level and Pregnancy Outcome in an Assisted Reproductive Technology Program. Int J Infertility Fetal Med 3: 57-62.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schiewe%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8567784

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Osborn%20SM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8567784

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Asch%20RH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8567784

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jansen%20RP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8567784

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Johnston%20WI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8567784



44

Katayama, K.P., Stehlik, J., Kuwayama, M., Kato, O., Stehlik, E. (2003) High survival rate of vitrified human oocytes results in clinical pregnancy. Fertil Steril 80:223–224.

Kim, T..J.,Laufer, L.R., Hong, S.W. (2010) Vitrification of oocytes produces high

pregnancy rates when carried out in fertile women. Fertil Steril ;93:467-474.

Ko, C.S., Ding, D.C., Chu, T.W., Chu, Y.N., Chen, I.C., Chen, W.H., Wu, G.J. (2008) Changes to the meiotic spindle and zona pellucida of mature mouse oocytes following different cryopreservation methods. Anim Reprod Sci 105:272–282.

Konc, J., Kanyo, K., Varga, E., Kriston, R., Cseh, S. (2008) Births resulting from oocyte cryopreservation using a slow freezing protocol with propanediol and sucrose. Syst Biol Reprod Med 54:205-210.

Kuleshova, L., Gianaroli, L., Magli, C., Ferraretti, A., Trounson, A. (1999) Birth following vitrification of a small number of human oocytes: case report. Hum Reprod 14:3077–3079.

Kuwayama, M., Vajta, G., Leda, S., Kato, O. (2005) Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and the elimination of potential contamination. Reprod Biomed Online 11:608–614.

Kuwayama, M. (2007) Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67:73–80.

Kyono, K.,Fuchinoue, K., Yagi, A., Nakajo, Y.,Yamashita, A., Kumagai, S. (2005) Successful pregnancy and delivery after transfer of a single blastocyst derived from a vitrified mature human oocyte. Fertil Steril 84:1017.

Lane, M., Bavister, B.D., Lyons, E.A., Forest, K.T.(1999a) Container-less vitrification of mammalian oocytes and embryos.Nat Biotechnol 17:1234–1236.

Lane, M., Schoolcraft, W.B., Gardner, D.K. (1999b) Vitrification of mouse and human blastocysts using a novel cryoloop container-less technique. Fertil Steril 72:1073–1078.

Lassalle, B., Testart, J., Renard, J.P.(1985) Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil Steril 44:645-651.

Lee, J. A., Barritt, J., Moschini, R.M., Slifkin, R.E., Copperman, A.B. (2013) Optimizing human oocyte cryopreservation for fertility preservation patients: should we mature then freeze or freeze then mature? Fertil Steril 99:1356-1362. Leibo, S.P., Pool, T.B. (2011) The principal variables of cryopreservation: solutions, temperatures and rate changes. Fertil Steril 96:269-276.

Liebermann, J., Tucker, M.J., Sills, E.S. (2003) Cryoloop vitrification in assited reproduction: analysis of survival rates in >1000 human oocytes after ultra-rapid cooling with polymer augmented cryoprotectants. Clin Exp Obstet Gynecol 30:125-129.

Lucena, E., Bernal, D.P., Lucena, C., Rojas, A., Moran, A., Lucena, A. (2006) Successful ongoing pregnancies after vitrification of oocytes. Fertil Steril 85:108–111.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Slifkin%20RE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23266213

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Copperman%20AB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23266213

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tucker%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12854859

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sills%20ES%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12854859

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12854859



45

Ludwig, M., Al-Hasani, S., Felberbaum, R., Diedrich, K. (1999) New aspects of cryopreservation of oocytes and embryos in assisted reproduction and future perspectives. Hum Reprod 14: 182-185.

Luyet, B. e Hodapp, A. (1938) Revival of frog's spermatozoa vitrified in liquid air. Proc Meet Soc Exp Biol 39: 433-434. Macnamee, M., Brinsden, P. (1999), “Superovulation strategies in assisted conception” in In vitro fertilization ans assisted reproduction- The Bourn Hall guide to clinical and laboratory practice, Peter R. Brinsden (Ed.), Bourn Hall Clinic, London pp.91-95.

Mandelbaum, J., Anastasiou, O., Lévy, R., Guérin, J.F., de Larouzière, V., Antoine, J.M. (2004) Effects of cryopreservation on the meiotic spindle of human oocytes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 113: S17–S23.

Mandelbaum, J., Belaïsch-Allart, J., Junca, A.M., Antoine, J.M., Plachot, M., Alvarez, S., Alnot, M.O., Salat-Baroux, J. (1998) Cryopreservation in human assisted reproduction is now routine for embryos but remains a research procedure for oocytes. Hum Reprod 13:161–177.

Martino, A., Songsasen, N., Leibo, S.P. (1996a) Development into blastocysts of bovine oocytes cryopreserved byultra-rapid cooling. Biol Reprod 54: 1059–1069.

Martino, A., Pollard, J.W., Leibo, S.P. (1996b) Effect of chilling bovine oocytes on their development competence. Molecular Reproduction and Development 45:503-512.

Massip, A., Van Der Zwalmen, P., Schaeffen, B., Ectors, F. (1986) Pregnancies following transfer of cattle embryos preserved by vitrification. Cryo-Letters 7:270-273.

Matson, P.L., Graefling, J., Junk, S.M., Yovich, J.L., Edirisinghe, W.R. (1997) Cryopreservation of oocytes and embryos: use of a mouse model to investigate effects upon zona hardness and formulate treatment strategies in an in-vitro fertilization programme. Hum Reprod 12:1550-1553. .

Mazur, P. (1963) Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likehood of intracelular freezing. J General Physiology 47:347-349.

Miller, K.A., Elkind-Hirsch, K., Levy, B.,Graubert, M.D., Ross, S.J., Scott, R.T. Jr. (2004) Pregnancy after cryopreservation of donor oocytes and preimplantation genetic diagnosis of embryos in a patient with ovarian failure. Fertil Steril 82:211-214.

Nagy, Z.P., Chang, C.C., Shapiro, D.B., Bernal, D.P., Kort, H.I., Vajta, G. (2009) The efficacy and safety of human oocyte vitrification. Semin Reprod Med 27:450-455.

Nakagata, N. (1989) High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Reprod Fertil 87:479-483.

Nawroth, F., Kissing, K. (1998) Pregnancy after intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) of cryopreserved human oocytes. Acta Obstet Gynecol Scand 77:462-463.

Notrica, J., Kanzepolsky, L., Divita, A., Neuspiller, F., Polak de Fried, E. (2003) A healthy female born after ICSI of a cryopreserved oocyte and cryopreserved



46

spermatozoa banked prior to radiotherapy in a patient with a seminoma: a case report. Fertil Steril 80:S149-S186.

Noyes, .N, Knopman, J., Labella, P., McCaffrey, C., Clark-Williams, M., Grifo J. (2010) Oocyte cryopreservation outcomes including pre-cryopreservation and post-thaw meiotic spindle evaluation following slow cooling and vitrification of human oocytes. Fertil Steril 94:2078-2082.

Okimura, T.,Kato, K., Zhan, Q., Kuwayama, M., Zhang, J., Kato, O. (2005) Update on clinical efficiency of the vitrification method for human oocytes in an in vitro fertilization program. Fertil Steril 84:S174.

Oktay, K., Buyuk, E., Davis, O., Yermakova, I., Veeck, L., Rosenwaks, Z. (2003) Fertility preservation in breast cancer patients: IVF and embryo cryopreservation after ovarian stimulation with tamoxifen. Hum Reprod 18:90–95.

Oktay, K., Buyuk, E., Libertella, N., Akar, M., Rosenwaks, Z. (2005) Fertility preservation in breast cancer patients: a prospective controlled comparison of ovarian stimulation with tamoxifen and letrozole for embryo cryopreservation. J Clin Oncol 23:4347–4353.

Pafonni, A., Guarneri, C., Ferrari, S., Restelli, L., Nicolosi, A.E., Scarduelli, C., Ragni, G. (2011) Effects of two vitrification protocols on the developmental potential of human

mature oocytes. Reprod Biomed Online 22:292-298.

Palermo, G., Joris, H., Devroey, P., Van Steirteghem, A.C. (1992) Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte Lancet 340:17-18.

Papatheodorou, A., Vanderzwalmen, P., Panagiotidis, Y., Prapas, N., Zikopoulos, K., Georgiou, I., Prapas, Y. (2013) Open versus closed oocyte vitrification system: a prospective randomized sibling-oocyte study. Reprod Biomed Online 26:595-602.

Park, S.E., Son, W.Y., Lee, S.H., Lee, K.A., Ko, J.J., Cha, K.Y.(1997) Chromosome and spindle configurations of human oocytes matured in vitro after cryopreservation at the germinal vesicle stage. Fertil Steril 68:920-926.

Permegiani, L., Bertocci, F., Garello, C., Salvarani, M.C., Tambuscio, G., Fabbri, R. (2009) Efficiency of human oocyte slow freezing: results from five assisted reproduction centres. Reprod Biomed Online 18:352-359.

Picton, H.M., Gosden, R.G., Leibo, S.P. (2002) Cryopreservation of oocytes and ovarian tissue. In Vayena E, Rowe PJ and Griffin PD (eds) Medical, Ethical and Social Aspects of Assisted Reproduction (2001, Geneva), Current Practices and Controversies in Assisted Reproduction: Report of a WHO Meeting. WHO Publications, Geneva, 142-151.

Polge, C., Smith, A.U. , Parkes, A.S. (1949) Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature pp.164-166.

Polge, C. (1952) Fertilizing capacity of bull spermatozoa after freezing at 79 degrees C. Nature 169:626-627.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yermakova%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12525446

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Veeck%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12525446

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rosenwaks%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12525446

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Akar%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15824416

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rosenwaks%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15824416

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Papatheodorou%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602678

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Vanderzwalmen%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602678

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Panagiotidis%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602678

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Prapas%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602678

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zikopoulos%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602678

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Georgiou%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23602678



47

Polak de Fried, E., Notrica, J., Rubinstein, M., Marazzi, A. (1998) Oocyte cryopreservation program: removal vs non removal of cumulus corona complex. Fertil Steril 70:S148. Abst P-7.1

Pooikkeus P., Hiilesmaa V., Tiitinema A. (2002) A serum hCG 12 days after embryo transfer in predicting pregnancy outcome. Hum Reprod 17(7):1901-1905.

Porcu, E., Fabbri, R., Ciotti, P., Frau, F., De Cesare, R., Venturoli, S.(2002) Oocytes or embryo storage. Fertil Steril 78:S15. Abst O-38.

Porcu, E., Fabbri, R., Giunchi, S., Damiano, G., Fratto, R., Ciotti, P.M., Venturoli, S., Flamigni, C. (2000) Clinical experience and applications of oocytecryopreservation. Mol Cell Endocrinol 169:33–37.

Porcu, E., Fabbri, R., Seracchioli, R., Ciotti, P.M., Magrini, O., Flamigni, C.(1997) Birth of a healthy female after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes. Fertil Steril 68:724-726.

Practice Committees of the American Society for Reproductive Medicine and the Society for Assisted Reproductive Technology (2013) Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertil Steril 99:37–43. Rall, W.F., Fahy, G.M. (1985) Ice-free cryopreservation of mouse embryos by vitrification. Nature 313:573-575.

Rall W.F., Reid D.S., Polge C. (1984) Analysis of slow warming injury of mouse embryos by cryomicroscopical and physiochemical methods. Cryobiology 21:106–121.

Revelli, A., Molinari, E., Salvagno, F., Luisa Delle Piane, Dolfin, E., Ochetti, S. (2012) Oocyte Cryostorage to Preserve Fertility in Oncological Patients. Obstetrics and Gynecology International, 7p.

Rienzi, L., Romano, S., Albricci, L., Maggiulli, R., Capalbo, A., Baroni, E. Rienzi, L., Romano, S., Albricci, L., Maggiulli, R., Capalbo, A., Baroni, E., Colamaria, S., Sapienza, F., Ubaldi, F. (2010) Embryo development of fresh ‘versus’ vitrified metaphase II oocytes after ICSI: a prospective randomized sibling-oocyte study.Hum Reprod 25:66–73.

Sathananthan, A.H., Trounson, A., Freeman, L. (1987) Morphology and fertilizability of frozen human oocytes. Gamete research. 16:343-354.

Saúde Reprodutiva/Infertilidade/Direção Geral de Saúde (2008). http://www.saudereprodutiva.dgs.pt, Consultado em Maio de 2013.

Selman, H., Angelini, A., Barnocchi, N., Brusco, G.F., Pacchiarotti, A., Aragona, C.(2006) Ongoing pregnancies after vitrification of human oocytes using a combined solution of ethylene glycol and dimethyl sulfoxide. Fertil Steril 86:997-1000.

Shaw, J.M. (1993). In: Trounson A. and Gardner D. (eds), In Vitro Fertilization. Chap. 11. CRC Press, Boca Raton, Florida.

Shaw, P.W., Bernard, A.G., Fuller, B.J., Hunter, J.H., Shaw, R.W. (1992) Vitrification of mouse oocytes using short cryoprotectant exposure: effects of varying exposure times on survival. Mol Reprod Dev 33:210–214.

http://www.saudereprodutiva.dgs.pt/



48

Sherman, J. (1973) Synopsis of the use of frozen human sémen since 1964: state of the art of human sémen banking. Fertil Steril 24: 397-412.

Siebzehnruebl, E.R. (1989) Cryopreservation of human and rabbit oocytes and one cell-embryos: a comparison of DMSO and propanediol. Hum Reprod 4:312-317.

Smith, G.D., Serafini, P.C., Fioravanti, J., Yadid, I., Coslovsky, M., Hassun, P., Alegrett,i J.R., Motta, E.L. (2010) Prospective randomized comparison of human oocyte cryopreservation with slow-rate freezing or vitrification. Fertil Steril 94:2088-2095.

Sociedade Portuguesa de Medicina da Reprodução. http://www.spmr.pt/, Consultado em Maio de 2013.

Son, W.Y., Park, S.E., Lee, K.A., Lee, W.S., Ko, J.J., Yoon, T.K., Cha, K.Y. (1996) Effects of 1,2-propanediol and freezing on the in vitro developmental capacity of human immature oocytes. Fertil Steril 66:996–999.

Stachecki, J.J., Cohen, J. (2004) An overview of oocyte cryopreservation. Reprod BioMedicine online, 96:152-163.

Steptoe, P.C., Edwards, R.G.(1978) Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet 2:366.

Stoop, D., De Munck, N., Jansen, E., Platteau, P., Van den Abbeel, E., Verheyen, G., Devroey, P. (2012) Clinical validation of a closed vitrification system in an oocyte-donation programme. Reprod Biomed Online 24:180-185.

Testart, J., Lassalle, B., Belaisch-Allart, J., Hazout, A., Forman, R., Rainhorn, J.D. Frydman, R. (1986) High pregnancy rate after early human embryo freezing. Fertil Steril 46:268-272.

Tharasanit, T., Rungarunlert, S. e Techakumphu, M. (2009). Cryopreservation of immature porcine oocytes using open pulled straw vitrification. Thai J Vet Med 39: 163-171.

Tong, X.H., Wu, L.M., Jin, R.T.,Luo, L.H.,Luan, H.B., Liu, Y.S. (2012) Fertilization rates are improved after IVF if the corona radiata is left intact in vitrified-warmed human oocytes. Hum Reprod 27(11):3208–3214.

Toth, T.L., Baka, S.G., Veeck, L.L., Jones, H.W. Jr, Muasher, S., Lazendorf, S.E. (1994a) Fertilization and in vitro development of cryopreserved human prophase I oocytes. Fertil Steril 61:891-894.

Toth, T.L., Lazendorf, S.E., Sandow, B.A., Veeck, L.L., Hassen, W.A., Hansen, K. Hodgen, G.D. (1994b) Cryopreservation of human prophase I oocytes collected from unstimulated follicles. Fertil Steril 61:1077-1082.

Trokoudes, K.M., Pavlides, C., Zhang, X. (2011) Comparison outcome of fresh and vitrified donor oocytes in an egg-sharing donation program. Fertil Steril 95:1996-2000.

Trounson, A., Mohr, L. (1983) Human pregnancy following cryopreservation, thawing, and transfer of an eight-cell embryo. Nature 305:707-709.



49

Tucker, M., Wright, G., Morton, P., Shanguo, L., Massey, J., Kort, H. (1996) Preliminary experience with human oocyte cryopreservation using 1,2-propanediol and sucrose. Hum Reprod 11:1513-1515.

Tucker, M., Wright, G., Morton, P., Massey, J. (1998) Birth after cryopreservation of immature oocytes with subsequente in vitro maturation. Fertil Steril 70: 578-579.

Ubaldi, F., Anniballo, R., Romano, S., Baroni, E., Albricci, L., Colamaria, S., Capalbo, A., Sapienza, F., Vajta, G., Rienzi, L. (2010) Cumulative ongoing pregnancy rate achieved with oocyte vitrification and cleavage stage transfer without embryo selection in a standard infertility program. Hum Reprod 25:1199-1205.

Vajta, G., Holm, P., Kuwayama, M., Booth, P.J., Jacobsen, H., Greve, T., Callesen, H. (1998) Open pulled straw (OPS) vitrification: a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos. Mol Reprod Dev 51: 53–58.

Vajta, G., Yovich, J. (2008) Principios fundamentales de Criobiolgía. Introducción a la

congelación lenta y vitrificación. In Cuadernos de Medicina reproductiva: Criobiologia.

Adalia, Madrid.

Van Uem, J.F.H.M., Siebzehnrübl, E.R., Schuh, B., Koch, R., Trotnow, S., Lang,.N.(1987) Birth after cryopreservation of unfertilised oocytes. Lancet 1:752-753.

Vanderzwalmen, P., Bertin, G., Debauche, C.H., Standaert, V., Bollen, N., van Roosendaal, E., Vandervorst, M., Schoysman, R., Zech, N. (2003) Vitrification of human blastocysts with the Hemi-Straw carrier: application of assisted hatching after thawing. Hum Reprod 18: 1504–1511.

Vincent, C., Pickering, S.J., Johnson, M.H. (1990) The hardening effect of dimethylsulphoxide on the mouse zona pellucida requires the presence of an oocyte and is associated with a reduction in the number of cortical granules present. J Reprod Fertil 89:253–259.

Vincent, C., Johnson, M.H. (1992) Cooling, cryoprotectants and the cytoskeleton of the mammalian oocyte. Ox Rev Reprod Biol 14:72-100.

Whitman-Elia, G.F., Baxley, E.G. (2001) A Primary Care Approach to the Infertile

Couple. J Am Board Fam Pract 14:33-45.

Whittigam, D.G., Leibo, S.P., Mazur, P. (1972) Survival of mouse embryos frozen to

−196ºC and −269ºC. Science 178:411-414.

Whittingham, D.G. (1977) Fertilization in vitro and development to term of unfertilized

mouse oocytes previously stored at -196oC. J Reprod Fertil 49:89-94.

Willadsen, S.M., Polge, C., Rowson, L.E., Moor, R.M. (1976) Deep freezing of sheep

embryos. Reprod Fertil 46:151-154.

Wilmut, I., Rowson, L.E.A. (1973) Experiments on the low temperature preservation of

cow embryos. Vet Rec 92:686-690.

World Health Organization (1980) WHO Laboratory Manual for the Examination of

Human Semen and Semen-Cervical Mucus Interaction. Press Concern, Singapore.

http://www.thelancet.com/search/results?fieldName=Authors&searchTerm=E.R.+Siebzehnr%C3%BCbl

http://www.thelancet.com/search/results?fieldName=Authors&searchTerm=B.+Schuh

http://www.thelancet.com/search/results?fieldName=Authors&searchTerm=R.+Koch

http://www.thelancet.com/search/results?fieldName=Authors&searchTerm=S.+Trotnow

http://www.thelancet.com/search/results?fieldName=Authors&searchTerm=N.+Lang

http://www.thelancet.com/search/results?fieldName=Authors&searchTerm=N.+Lang



50

World Health Organization.(2010) WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. Geneva: WHO press.

Wu, J., Zhang, L., Wang, X. (2001) In vitro maturation, fertilization and embryo development after ultrarapid freezing of immature human oocytes. Reproduction 121:389-393.

Wurfel, W., Schleyer, M., Krusmann, G., Hertwig, I.V., Fiedler, K. (1999) Fertilization of cryopreserved and thawed human oocytes (Cryo-Oo) by injection of spermatozoa (ICSI)—medical management of sterility and case report of a twin pregnancy. Zentralbl Gynakol 121:444-448.

Yang, D., Winslow, K., Blohm, P., Brown, S., Nguyen, K., Brubaker, C. (2002) Oocyte donation using cryopreserved donor oocytes. Fertil Steril 78:S14. Abst O-37.

Yoon, T., Chung, H., Lim, J., Han, S., Ko, J., Cha, K. (2000) Pregnancy and delivery of healthy infants developed from vitrified oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertil Steril 74:180-181.

Yoon, T.K., Kim, T.J., Park, S.E., Hong, S.W., Ko, J.J., Chung, H.M., Cha, K.Y. (2003). Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertil Steril 79:1323-1326.

Young, E., Kenny, A., Puigdomenech, E., Van Thillo, G.,Tiveron, M., Piazza, A. (1998) Triplet pregnancy after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved oocytes: case report. Fertil Steril 70:360-361.

Zhang, X., Catalano, P.N., Gurkan, U.A., Khimji ,I., Demirci, U. (2011) Emerging

technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine

(Lond.) 6:1115–1129.



51

9. Anexos

Anexo I- LOGBOOK

Tabela 10- Técnicas laboratoriais de PMA realizadas durante o estágio

Outras atividades:

Preparação de meios e placas para técnicas de PMA Registos de parâmetros dos equipamentos Registos e elaboração de relatórios de técnicas laboratoriais

Registos e reposição de azoto líquido Aplicação de técnicas de limpeza e desinfeção laboratorial

Colaboração em estatística laboratorial

Número de procedimentos realizados Assinatura

Espermograma 55

Preparação de esperma para técnicas de PMA 110

Criopreservação de espermatozoides 20

Pesquisa de espermatozoides ao MI 13

Pesquisa de ovócitos no liquido folicular 17

FIV 8

IA 40

Desnudação de ovócitos 2

Classificação de zigotos e embriões 54



52

Anexo II - Resultados obtidos nas principais publicações sobre os protocolos de congelação lenta e vitrificação.

Tabela 11- Resultados obtidos nas principais publicações sobre criopreservação de ovócitos em MII pelo método de congelação lenta e de vitrificação (baseado em Gook & Edgar, 2012)

Publicação Protocolo Crioprotetores

Taxa de

sobrevivência

(%)

Taxa de

fertilização (%)

Taxa de

fertilização a

fresco (%)

Taxa de

implantação (%)/

embrião transferido

Taxa de

implantação a

fresco (%)

Congelação Lenta

Yang et al. (2002) 1.5M PROH, 0.2M

sacarose 70.9 ND ND 25.3 43.4

Bianchi et al. (2007) 1.5M PROH, 0.2M

sacarose

75.1 (≤38

anos)

77.3 (≤38

anos) 79.6 (≤38 anos) 16.7 (≤38 anos) 17.3 (≤38 anos)

Konc et al. (2008) 1.5M PROH, 0.3M

sacarose 76.0 76.0 ND 15.4 18.0

Permegiani et al. (2009) 1.5M PROH, 0.3M

sacarose 71.6 86.2 ND 15.1 ND

Ferraretti et al. (2010) 1.5M PROH, 0.3M

sacarose 73.6 73.1 ND 10.5 ND

Gook & Edgar (2011) 1.5M PROH, 0.2M

sacarose 75.8 67.6 ND 30.0 (˂38 anos) 26.0 (˂38 anos)

Vitrificação

Antinori et al.(2007) Cryotop 15% EG+15% DMSO,

0.5M sacarose 99.4 93.0 96.7 13.2 10.3

Cobo et al. (2008),

dadoras Cryotop

15% EG+15% DMSO,

0.5M sacarose 96.9 76.3 82.2 40.8 100 (2/2)

Nagy et al. (2009),

dadoras Cryotop

15% EG+15% DMSO,

0.5M sacarose 89.0 87.0 67.0 55.3 47.4



53

Rienzi et al. (2010) Cryotop 15% EG+15% DMSO,

0.5M sacarose 96.8 79.2 83.3 20.2 30.0 (≤34 anos)

Ubaldi et al.(2010)

Cryotop

15% EG+15% DMSO,

0.5M sacarose 89.7 85.4 87.1 16.1 23.2

Almodin et al. (2010) Vitri-equip 15% EG+15% DMSO,

0.5M sacarose 84.9 80.8 81.3 14.9 21.3

Cobo et al. (2010),

dadoras Cryotop

15% EG+15% DMSO,

0.5M sacarose 92.5 74.2 73.3 39.9 40.9

Trokoudes et al. (2011),

dadoras cryotop

15% EG+15% DMSO,

0.5M sacarose 91.4 84.4 86.6 24.7 25.6

Garcia et al. (2011),

dadoras cryolock

15% EG+15% DMSO, 0.5M sacarose

89.4 76.1 87.5 43.9 42.9

Paffoni et al. (2011)

S. aberto (Cryotop)

82.8 73.0 76.2 13.4 ND

S. fechado (Cryotip)


57.9 57.6 78.5 5.8 ND

Stoop et al. (2012)

S. fechado (High Security System)


90.2 77.5 ND 11.7 ND

Chang et al. (2013) S. aberto 15% EG+15% DMSO, 0.5M sacarose

79.6 83.8 75 30.1 ND

Papatherodorou et al. (2013)

S. aberto (Vitrisafe)


91.0 73.4 ND 10.1 ND

S. fechado (Vitrisafe)


82.9 82.5 ND 13.8 ND



54

ND- Não determinado, PROH- Propanediol, EG- Etilenoglicol, DMSO- Dimetilsulfoxido

Congelação lenta vs vitrificação

Smith et al. (2010)

congelação lenta

1.5M PROH, 0.3M sacarose

65.0 67.0 ND 13 ND

vitrificação 15% EG+15% DMSO, 0.5M sacarose

75.0 77.0 ND 38.0 ND

Noyes et al. (2010)

congelação lenta


85.0 90.0 ND ND ND

vitrificação 15% EG+15% DMSO, 0.5M sacarose

88.0 77.0 ND ND ND

Fadini et al. (2009)

congelação lenta


57.9 64.6 ND 4.3 ND

vitrificação EG, PROH, sacarose 78.9 72.8 ND 9.3 ND

FCUP - Repositório Aberto · Medicamente Assistida (PMA), de forma a contribuir para o sucesso dos...

Documents

Transcript of FCUP - Repositório Aberto · Medicamente Assistida (PMA), de forma a contribuir para o sucesso dos...