Faculdade de Engenharia Qufmica de Lorena Departamento de...

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Faculdade de Engenharia Qufmica de Lorena Departamento de Biotecnologia

Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial

Avaliação ln Vivo dos Níveis de Atividade de Invertase em Leveduras

Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora.

' / I , i

Lorena - SP - Brasil 1998

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Ficha Catalográf"1e2 Elaborada pela Biblioteca do Departamento de

Biotecnologia da F AENQUIL

CARVALHO. Patrícia Maria Barroso de Avaliação in vivo dos níveis de anvidade de invertase em leveduras/

C:; 3 1 a Patrícia Maria Barroso de Carvalho. -Lorena. 1998. ~p '

Dissertação (Mestrado) • Faculdade de Engenharia Química de Lorena.! Depanamento de Biotecnologia

Orientadora: Medeiros. Maria Bemadete

1. Biotecnologia 2. Leveduras 3. lnvertase 4. Método GOD-PAP. l. Título ll. Medeiros. Maria Bemadete, orientadora

574.6 CDU

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i

ÍNDICE

Páginas

LISTA DE FIGURAS iii LISTA DE TABELAS V

RESUMO vi ABSTRACT vii

- 1. INTRODUÇAO ...•............................•.•.............•..................•....•.•.•.......•••.• 1 1.1. BIOTECNOLOGIA 1 1.2. LEVEDURAS 4 1.3. INvERTASE .. 7 1.4. APLICAÇÃO INDUSTRIAL DA INVERT ASE 13 1.5. MÉTODOGOD-PAP 15

2. OWETIVOS: 16

, 3 . .MA. TERIAL E ME TODOS 17

3.1. AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE PRODUÇÃO DE INVERTASE 17 3 .1.1. Leveduras 17 3 .1.2. Ativação das células 17 3. 1.3. Obtenção de massa celular 18 3. 1. 4. Cultivo para a produção de in vertase . . . . . .. . .. . . . . . .. . . . .. .. .. . . .. .. .. .. . .. . .. . 18 3.1.5. Ensaio enzimático 19 3.1.5. l. Preparo das células para a dosagem de invertase 19 3.1.5.2. Reação enzimática 19 3.1.6. Curvas de crescimento e concentração de glicose no meio 20

3.2.DOSAGEM DE GLICÍDIOS 20 3.3. DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS ENVOLVIDOS NO AUMENTO DA ABSORBÂNCIA DURAi~ A DETERMINAÇÃO DA GLICOSE PELO MÉTODO GOD-PAP 22 3 .3 .1. Medida do pH das soluções de glicídios adicionadas da solução de reação do método GOD-P AP 22 3.3.2. Influência do aquecimento a temperatura de fervura da água na inversão da sacarose 22 3.3.3. Efeito da solução de reação do método GOD-PAP sobre diferentes glicídios 23 3.3.4. Efeito das enzimas do método GOD-PAP sobre a sacarose 23

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3.3.S. Cinética da reação de hidrólise da sacarose pelo reagente GOD-PAP 23 3.3.6. Determinação da variação da absorbância para diversas concentrações de glicose na presença de sacarose 24

- 4. RESULTADOS E DISCUSSAO e ••••••••••••••••••••••• 25 4.1. IDENTIFICAÇÃO DAS VARIÁ VEIS RELACIONADAS À INADEQUAÇÃO DO MÉTODO GOD-PAP PARA DOSAGEM DA GLICOSE EM MISTURA COM SACAROSE 26 4.1.1. Influência do pH 27 4.1.2. Influência do aquecimento da solução de sacarose 28 4.1.3. Reação do método GOD-PAP com diferentes glicídios 32 4.2. ClNÉTICA DA REAÇÃO DE HIDRÓLISE DA SACAROSE PELA SOLUÇÃO DE REAÇÃO DO M:Él'ODO GOD-PAP 35 4.3. ADAPTAÇÃO DO MÉ'TOOO ·································································· 37 4.3.1. Determinação da variação da absorbância para diversas concentrações de glicose na presença de sacarose 3 7 4 .4. PRODUÇÃO DE INVERT ASE 40 4.5. CRESCIMENTO CELULAR E CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO 44

5. CONCLUSOES 58

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 59

7. APÊ~DICES

.. - ·-·· ·-····--·--···---------- ili

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

FIGURA 1: CINÉTICA DA REAÇ.ÃO DE HIDRÓLISE DA SACAROSE PELA SOLUÇÃO DE REAÇÃO DO MÉTODO GOD-PAP 35

FIGURA 2: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DE DEBARYOMYCES HANSENJJ (50059) 45

FIGURA 3: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DE RHOOOTHORUU RUBRA (50596) 45

FIGURA 4: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DE SA.CCHAROMYCESCEREVJSUE(50613) 46

FIGURA 5: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DE PICHJA BECKJ { 5053 7) 4 7

FIGURA 6: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DE PICHIA Of{}...fERJ (50808) 47

F'IGUR.\ 7: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DEAUREOBASID!lJM PULUL4NS(51102) 48

FIGl"R.\ 8: Cor--.;CENTR..AÇ.i.O DE GUCOSE NO \{EIO DE CUL rrvo E CRESCIMENTO CELL1.AR DE TORCL4SPORA PRETORJE.VSJS (50811 ) 49

flGl'R.\ 9: CONCENTRAÇAO DE GLICOSE NO ~{EIO DE CUL nvo E CRESCIMF\'TO CELULAR DE WIUJOPSISCAllFORNJCA (50420) 50

FIGUR.\ 10: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DE CRYPTOCOCCUS ATER (51032) 51

FIGURA 11: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DE CRYPTOCOCCUS MACERANS (50361 ) 51

FIGURA 12: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DE SACCHAROMYCES KLVYVERY (50629) 52

FIGURA 13: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE cu.nvo E CRESCIMENTO CELULAR DE ZYGOSSA.CHAROMYCESSP(50965) 53

FIGURA 14: CONCENTIUÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DE DEIWUOMICF.S SP (50385) 53

FIGURA 15: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DE SÃCCJUROMYCES CF.REJIISIAE (IR2) 54

FIGURA 16: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DE SÃCC™ROMTCF.S CEREVJSUE (ATCC 9763) 55

FIGURA 17: CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE NO MEIO DE CULTIVO E CRESCIMENTO CELULAR DE PJCHM CARSONJ (50809) 55

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V

ÍNDICE DE TABELAS

Página

TABELA 1: VALORES DO PH DAS SOLUÇÕES DE GLICÍDIOS ADICIONADAS À SOLUÇÃO DE REAÇÃO 00 MÉTOOO GOD-PAP 27

TABELA 2: INFLUÊNCIA 00 1EMPO DE AQUECIMENTO A 96°C DA SOLUÇÃO DE SACAROSE 40 MM SOBRE O AUMENTO DA CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE 29

T ADE.LA 3: INFLUÊNOA 00 TEMPO DE AQUECIMENTO A 96°C DAS SOLUÇÕES DE SACAROSE l O E 20 MM SOBRE O AUMENTO DA CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE 29

TABELA 4: INFLUÊNCIA DO TEMPO DE AQUECIMENTO A 96°C DA SOLUÇÃO DE SACAROSE 10 MM DILUÍDA EM ÁGUA DESTILADA SOBRE O AUMENTO DA CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE 30

TABELA S: INFLUÊNCIA DO TEMPO AQUECIMENTO A 96°C DE SOLUÇÕES DE SACAROSE l O MM SOBRE O AUMENTO DA CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE - .. 3 l

TABELA 6: REAÇÃO DE XILOSE, FRUTOSE, TREALOSE, CELOBIOSE E RAFINOSE 40 MM COM A SOLUÇÃO DE REAÇÃO DO MÉTODO GOD-PAP 33

TABELA 7: EFEITO DA ENZIMA GLICOSE OXIDASE SOBRE A SOLUÇÃO DE

SACAROSE 10 MM ·-···-········-···········································-··············35

TABELA 8: CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES TOTAIS DA SOLUÇÃO DE SACAROSE 10 MM - 36

TABELA 9: VARIAÇÃO EM FUNÇÃO DO TEMPO DE LEITURA DOS VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE DETERMlNADOS PELO MÉTODO GOD-P AP A PARTIR DE DE SOLUÇÕES DE GLICOSE NAS CONCENTRAÇÕES DE 5 A 180 µGIML DILUÍDAS EM SACAROSE 10 MM 38

TABELA 10: NÍVEIS DE ATIVIDADE DA INVERTASE EM DIFERENTES LEVEDURAS 42

RESUMO· · --

Avaliação ln Vivo dos Níveis de Atividade de lnffrtase em Leveduras. Patricia Maria Barroso de Carvalho. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Ora. Maria Bemadete Medeiros (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12.000-000, Lorena I SP-Brasil). Banca examinadora: Dra. Denise Maria Mano Pessoa e Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata. Setembro de 1998.

A avaliação in vivo dos nrvers de atividade de inverta.se (13-frutofuranosideo frutoidrolase E.C. 3.2.1.26) é de fundamental importância no estudo do potencial de linhagens de .le~ para aplicação biotecnológica. A maior parte dos processos industriais que fazem uso dessa enzima emprega células vivas de leveduras.

Em sua maioria, os métodos descritos para a quantificação da invertase correlacionam a atividade dessa enzima com a quantidade de glicose ou açúcares redutores totais ( AR T) liberados após a hidrólise enzimática da sacarose em condições pré determinadas. O método da Glicose Oxidase-Peroxidase (GOD-PAP - Merck 8443) é um método colorimétrico utilizado na quantificação da glicose na faixa de concentração de O a 200 µg/mL.

No presente trabalho, foi feita uma avaliação dos níveis de atividade de invertase em 16 linhagens de leveduras pertencentes a 9 diferentes gêneros. Dentre as linhagens testadas, 31,25% não apresentaram atividade enzimática nas condições experimentais enquanto 68, 7 5°/o apresentaram atividade em níveis que variaram de 0,8 a 18 U (U=µg de ART liberados por mio).

O método GOD-P AP forneceu leituras crescentes de absorbância à 51 O nm, sempre que foi utilizado para determinar a concentração de glicose liberada após o ensaio enzimático. Esse resultado foi atribuído à hidrólise subseqüente e contínua da sacarose por algum reagente( s) não enzimático(s) presente(s) na solução de reação do método. O estudo realizado sobre a cinética dessa reação demonstrou que o método GOD-P AP só pode ser utilizado para a determinação da concentração de glicose em presença de sacarose mediante adaptação: trabalhar com concentração inicial de glicose entre 40 e 100 µglmL e efetuar a leitura de absorbância com o tempo de 21 min de reação.

ABSTRACT

ln Vivo Evaluation of Invertase Activity Leveis in Y easts. Patricia Maria Barroso de Carvalho. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Ora. Maria Bernadete Medeiros (Departamento de Biotecnologia, F AENQUIL, CP 116, 12.000-000, Lorena I SP-Brasil). Banca examinadora: Ora. Denise Maria Mano Pessoa e Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata. Setembro de 1998.

The in vivo evaluation of invertase @-fructofmanoside fructohydrolase E.C. 3.2.1.26) activity leveis is a subject of major concem to the study of yeasts strains potential for biotecnological application. Most of the industrial processes which makes use of this enzyme employs whole yeasts cells.

ln general, methods described for estimating invertase activity correlate this enzyme activity with either the amount of glucose or total reducing sugars (TRS) produced after sucrose enzymatic hydrolysis under standardized conditions. The Glucose Oxidase-Peroxidase Method (GOD-PAP - Merck) is a colorimetric method used to determine the amount of glucose in a concentration range from O to 200 µg/mL.

ln the present work, we performed an evaluation of the invertase activity levels in 16 strains belonging to 9 different genera. Amongst the tested strains, 31.25°/o did not show invertase activity under experimental conditions, whereas 68.75% showed activity in leveis ranging between 0.8 and 18 U (U=µg ofTRS produced per min).

At 510 nm, the GOD-PAP Method yielded increasing mesurements of absorbance whenever it was employed to determine the glucose concentration produced after the enzymatic assay. We regarded this result as being due to the subsequent and continuous hydrolysis of sucrose by some non-enzymatic reagent(s) included in the reaction solution of the method. The study performed on the kinetics of this reaction showed that the GOD-PAP Method can only be used for the assessment of glucose concentration in the presence of sucrose, providing that some assumptions be made, that is, to work with an initial glucose concentration from 40 to 100 µg/mL, and to accomplish absorbance mesurements 21 min after the beginning of the reaction.

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Biotecnologia

A biotecnologia surgiu como um campo de atividades

interrelacionadas das ciências da biologia, química e engenharia. Segundo

Buli (1995) pode ser definida como a aplicação de princípios científicos e da

engenharia no processamento de materiais por agentes biológicos para a

obtenção de bens e serviços. A biotecnologia tem suas origens na

microbiologia aplicada à medicina, agricultura e indústria e, no seu início,

tinha por ferramentas linhagens naturais isoladas em meio seletivo e

purificadas. A moderna biotecnologia, no entanto, permite ainda a alteração

da estrutura genética das células com a conseqüente criação de novos

microrganismos e metabólitos.

As leveduras provavelmente representam os primeiros orgamsmos

explorados pelo homem como agentes biotecnológicos (Kirsop, 1988). A

utilização de leveduras em processos para a produção de bebidas e

alimentos remonta aos primórdios da história da humanidade. Tais processos

desenvolveram-se quase por acaso, ainda antes de que fossem conhecidas

suas bases científicas e mesmo sem a noção de que neles as leveduras

executavam funções específicas. A fermentação de sucos de frutas e de

extratos de cereais por populações mistas de leveduras provavelmente

constituiu o primeiro uso desses microrganismos pelo homem, resultando em

tipos de bebidas alcoólicas que podem ser consideradas como precursoras

dos modernos vinhos e cervejas. Como resultado da longa história das

leveduras a serviço do homem, muito se foi aprendendo sobre a

manipulação e o controle da atividade das leveduras, tendo esse

conhecimento permitido a evolução da primitiva produção doméstica para a

escala industrial.

O interesse no potencial biotecnológico das leveduras foi

impulsionado pelo reconhecimento de características tais como a facilidade

de manuseio e de obtenção de grandes quantidades de massa celular, a

habilidade de crescer em uma variedade de substratos, faixas de pH e taxas

de oxigênio. As células das leveduras crescem de modo estável tanto como

haplóides quanto como diplóides e políplóides, sendo a obtenção de

mutantes mais fácil na fase haplóide.

Além disso, as leveduras são apropriadas como objeto para estudos

experimentais como modelo de células eucariotas, pois podem ser, de

maneira semelhante às bactérias, cultivadas e manipuladas com facilidade e,

dessa forma contnbuem, também, para a elucidação de processos

bioquímicos, metabólicos e genéticos das células eucarióticas (Stewart &

Russell, 1988).

Assim como outros organismos, as leveduras utilizam os açúcares

como fontes de carbono e energia nos processos biossintéticos necessários

ao crescimento. A contribuiçàodas leveduras, notadamente da

Saccharomyces cerevisiae e das espécies intimamente relacionadas a ela,

para o progresso da humanidade, tem sido principalmente baseada em sua

capacidade de efetuar rápida e eficientemente a conversão de açúcares em

dióxido de carbono e etanol usado tanto como bebida como para propósitos

industriais e combustível.

As indústrias farmacêuticas e de alimentos têm tido uma longa e

lucrativa associação com as leveduras as quais constituem-se em ricas fontes

de enzimas de importância comercial que podem ser produzidas a partir de

açúcares simples e nitrogênio amoniacal. Como exemplo cita-se a

p-galactosidase (E.C. 3.2.1.23) produzida por Kluyveromyces fragilis e

Kluyveromyces lactis, a triacilglicerol lipase (E.C. 3.1. l.3) produzida por

Saccharomyces lipolytica e Candida lipolytica e a (Wlllllase (E.C. 3.2.1.L)

produzida por Schwanniomyces alluvius, Schwanniomyces castelli e

Saccharomyces diastaticus.

Uma grande variedade de espécies de leveduras é explorada na

biotransformação, biorremediação e na produção de flavorizantes, óleos,

gorduras e proteínas heterólogas (Roberts & Wildman, 1995). A replicação

e segregação dos cromossomos e a síntese de macromoléculas ocorrem nas

leveduras e nos eucariotos superiores de forma similar, tomando promissor

o seu uso para a clonagem e expressão de genes heterólogos para, por

exemplo, a produção de interferon, hormônio do crescimento humano e

insulina (Williamson, 1988).

Segundo Stewart & Russel ( 1988), o uso industrial das leveduras

pode ser classificado em três grupos de acordo com a relação do produto

com a bioquímica do microrganismo. No primeiro está o uso dos

constituintes celulares das leveduras para a produção de alimentos e ração

na forma de proteína unicelular, e de componentes macromoleculares como

lipídeos, proteínas, peptideos, enzimas, coenzimas, vitaminas e ácidos

nucléicos. No segundo, o uso de seus produtos de excreção na obtenção de

cerveja, vinho, cidra, etanol industrial, glicerol e dióxido de carbono para

bebidas carbonadas e na fermentação de massas de pães e bolos. E, no

terceiro, o uso em processos que exploram a interação enzima-substrato,

como por exemplo, a utilização da p-galactosidase para a hidrólise da

lactose na produção de laticínios destinados a pessoas com intolerância a

esse dissacarídeo.

1.2. Levedaras

Leveduras e orgarusmos leveduriformes são microfungos que

diferenciam-se dos fungos filamentosos por não produzirem esporos

assexuais ( conídias) em estruturas aéreas distintas ( conidióforos) e por

apresentarem-se predominantemente ou exclusivamente sob forma

unicelular. As células são geralmente esféricas, ovais, ou cilíndricas. Como

células simples crescem e reproduzem-se mais rapidamente que os fungos

filamentosos. Em contraste com os fungos filamentosos, o estágio sexual das

leveduras não ocorre em corpos de frutificação. Sua reprodução vegetativa

faz-se geralmente por gemulação, fissão ou gemulação-fissão que é

característico das leveduras com gemulação bipolar. Não possuem clorofila

e são portanto incapazes de suprir suas necessidades orgânicas via

fotossíntese ou quimiossíntese, devendo, portanto, viver como saprófitas,

simbiontes ou parasitas.

As leveduras são organismos ubíquos. Muitas são encontradas na

superficie das plantas onde são capazes de explorar os nutrientes

naturalmente exudados e exudados mais copiosos oriundos de lesões ou de

senescência de parte das plantas. São mais abundantes em folhas e frutas e

no néctar das flores. Outras são encontradas na superficie externa e no trato

digestivo de animais, especialmente de insetos. Poucas são patógenos de

plantas e de animais de sangue quente, incluindo o homem. Ocorrem

também com freqüência nos solos e nos corpos d'água (CarWe &

Watkinson, 1996).

Taxonomicamente não constituem um grupo definido de

microrganismos, sendo dificil fornecer uma lista de características

específicas que abranja todas as leveduras. Muitas têm ciclos de vida

complexos e algumas podem apresentar uma fase filamentosa. Possuem

s

parede celular rfg1da, de espessura quo varia de 1 SO a 400 um.em moção da

espécie e das condições da cultura. A parede é composta de glucana,

manana, proteínas, lipídeos e quitina que, dependendo da espécie, estão

presentes em diferentes proporções ou mesmo ausentes. O núcleo é bem

organizado com membrana nuclear, mas não possuem qualquer meio de

locomoção, o que as encaixa na divisão Eumycota.

A classificação taxonômica das leveduras é feita com base no seu

modo de reprodução o qual pode ser sexuado ou assexuado. A propriedade

de formar esporos sexuais dentro de ascos, ou produzí-los externamente em

basídios, colocam algumas leveduras na sub-divisão Ascomycotina e outras

na Basidiomycotina, respectivamente. As espécies para as quais não se

conhece um estágio sexual perfeito são consideradas como sendo fungos

imperfeitos e estão incluídas na sub-divisão Deuteromycotina.

Além das divergências apresentadas quanto aos ciclos de vida sexual

e assexual, as espécies de leveduras também não formam um grupo

homogêneo no que concerne ao metabolismo energético. Há espécies que

usam preferencialmente vias fennentativas enquanto outras preferem as vias

oxidativas (Gonzáles Siso et al., 1996). Apresentam uma variação no

número de cromossomos que vai de 3 a mais de 20. Essa diversidade indica

que levedura é uma estrutura morfológica que foi favoravelmente

selecionada e que apareceu recorrentemente no curso da evolução (Benitéz

et ai., 1996).

Nas leveduras classificadas na sub-divisão Ascomycotina, uma célula

diplóide sofre meiose e forma quatro a oito esporos ( ascósporos) encerrados

dentro do asco. Os ascósporos são células haplóides; células haplóides de

diferentes organismos se combinam para formar um novo organismo

diplóide. A essa sub-divisão pertencem numerosas espécies de leveduras

entre as quais encontram-se as principais leveduras de importância industrial

- --

6

como: Saccharomyces cernisiae e Saecharoa,yces.,~~~

utilizadas para a produção de etanol e de proteína unicelular, Hansenula

polymorpha e Hansenula anomala, utilizadas para a produção de triptofano,

L-alanina, L-lisina , L-valina e outros aminoácidos, e Saccharomyces

elipsoideus, utilizada para a produção de vinho.

A sub-divisão Basidiomycotina não tem fornecido leveduras de

importância industrial. Esses organismos reproduzem-se formando esporos

assexuais externos em uma estrutura chamada basídio ou em um promicélio

originado a partir de um teliósporo.

A sub-divisão Deuteromycotina inclui as leveduras que reproduzem-

se geralmente por gemulação; muitas entretanto produz.em esporos

assexualmente. Essa sub-divisão compreende umas poucas espécies

relevantes do ponto de vista industrial, dentre as quais destacam-se as

pertencentes ao gênero Cândida: C. unlis é usada na produção de ração

animal na forma de proteína unicelular, C. ltpolitica, na produção de ácido

cítrico e C. boidinii, C. tropicalis e C. gutlliermondii, na produção de

xilitol.

Organismos leveduriformes podem ser fungos superiores dimórficos

que crescem como as leveduras por meio de gemulação, fissão ou

conídiações sucessivas ou, podem ser organismos que possuem corpos de

frutificação simples mas que, por alguma razão, não são considerados como

leveduras. Algumas espécies leveduriformes são bastante úteis em processos

biotecnológicos, como por exemplo a produção de riboflavina por

Ashbya gossypii e de lipase por Geotrichum candidum.

7

u. lnvertase

A invertase (f3-frutofuranosideo frutoidrolase, E.C. 3.2.1.26) catalisa a

hidrólise da rafinose e da sacarose. A ação da invertase sobre a sacarose

resulta numa mistura equimolar de glicose e frutose - açúcar invertido

(Wiseman & Woodward, 1975). A invertase também realiza a transferência

de grupos frutosil produzindo fruto-oligossacarideos. A atividade de

transfrutosilação da invertase aumenta em concentrações de sacarose

superiores a 120 g/L (Vitolo & Yassuda, 1991).

A atividade da invertase em leveduras foi observada por Bertholet, em

1833, sendo a enzima isolada por ele em 1866. Essa enzima, desde então,

tem sido extensivamente estudada e, questões como sua localização na

célula da levedura e a permeabilidade da membrana à sacarose, foram temas

de prolongada discusão.

Wickerham ( 1958) forneceu evidências de que a maiona das

leveduras que fermentam a sacarose secreta quantidades variáveis de

invertase durante o seu crescimento. Esse autor observou ainda, que na

maioria das espécies por ele estudadas o nível de produção de invertase

extracelular é uma caracteristica da linhagem. Islam & Lampem ( 1962)

demonstraram, que a fermentação da sacarose por protoplastos de

Saccharomyces cerevistae consiste de uma secreção inicial de invertase no

meio, seguida da hidrólise da sacarose e da assimilação e fermentação das

hexoses acumuladas externamente.

A síntese da invertase por leveduras não necessita de um indutor

específico (Zimmerman & Schell, 1977) mas sofre repressão catabólica pela

presença de glicose no meio de cultura (Moreno et ai., 1979). Da mesma

forma, quando a levedura cresce em sacarose, a síntese é reprimida assim

que a concentração das hexoses produzidas pela hidrólise desse dissacarídeo

g

chega a uma ccmceatraçlo critica (Mouteneeourt e1 ai., 1973).

A partir da década de 60, ficou constatado que há diferentes formas

moleculares de invertase. Em S. cerevisiae, a espécie mais estudada quanto

a produção dessa enzima, há a produção de duas diferentes formas de

invertase: uma que é glicosilada e que está localizada externamente à

membrana celular, retida no espaço periplasmático e em associação com a

parede celular, e outra que não é glicosilada e que permanece no citoplasma

(Zárate & Belda, 1996). A forma extracelular é uma glicoproteína com

massa molecular de 270 kDa que contém 50% de fosfomanana e 3% de

glicosamina. A forma interna é livre de carboidratos, corresponde à metade

da enzima extracelular e tem massa molecular de 135 kDa. Como a

membrana celular é impermeável à sacarose, somente a invertase externa

está disponível para a reação esse dissacarídeo (Grossmann & Zimmermann,

1979~ Mizunaga et ai., 1981).

A invertase externa nativa é oligomérica ocorrendo principalmente

como dímero, tetrâmero e octâmero (Zech & Gõrish, 1995). Para ser

excretada, a invertase é inserida co-traducionalmente no retículo

endoplasmático, onde é glicosilada, assume a estrutura quartemária

oligomérica, sendo então transportada para o aparelho de Golgi, empacotada

em vesículas secretoras e, finalmente, liberada no espaço periplasmático

(Esmon et ai., 1987). A glicosilação estabiliza a enzima com respeito à

desnaturação térmica e é necessária para o arranjo em tetrâmeros e

octâmeros.

As quantidades relativas das duas formas da enzima ( externa e

intracelular) dependem das condições em que as células foram cultivadas

(Moreno et ai., 1975). A enzima externa é quantitativamente mais afetada

pela repressão por glicose, podendo estar presente em níveis baixos (menos

de l Oo/o do total) em células reprimidas, ou seja, quando cultivadas em meio

9

com concentração de glicose superior a O,OS%, ·,Oll podo.-, a ·fonna

predominante ( mais de 95% do total) em células desreprimidas (Gascón &

Ottolenghi, 1972). Segundo Elorza et ai. (1977), em células de

S. cerevisiae, a repressão da síntese da invertase pela glicose é exercida em

três níveis: em nível da transcrição, em nível da tradução e em nível da

estabilidade do RNA mensageiro. A presença de glicose não tem efeito

sobre os processos de glicosilação e secreção e não interfere na atividade

catalítica da enzima.

As isoenzimas não aparentam ser interconversíveis e diferem na

cinética da sua síntese durante o ciclo celular e na composição de

aminoácidos (Perlman & Halvorson, 1981). Porém, de acordo com

Ottolenghi (1972), essa diferença na composição de aminoácidos

aparentemente não tem significância para a função da enzima em nível

molecular.

Pela análise genética de S. cerevisiae foi estabelecida a existência de

uma família de seis genes estruturais, não alélicos, denominados SUC, que

codificam diferentes isoenzirnas. Qualquer um desses genes leva à produção

das duas formas de invertase e ao consumo de sacarose e rafinose

(Rodriguez et ai., 1981). Naumov et ai. (1996) analisaram 91 linhagens

diferentes de S. cerevisiae e verificaram que na maioria das linhagens um

único gene SUC2 estava presente, mas em algumas linhagens foram

encontrados dois ou três genes SUC.

O gene SUC2 de S. cerevisiae foi o mais amplamente estudado

( Carlson et ai., 1983; Perlman et al., 1984; Sarokin & Carlson, 1985;

Perlman et al.; 1986; Sarokin & Carlson, 1986). Codifica as duas formas da

enzima sintetizadas a partir de códons de iniciação diferentes dando origem

a dois RNAs mensageiros distintos. Um, de 1,9 kb, codifica um precursor da

forma externa glicosilada, cuja produção é regulada pela repressão por

10

da proteína formada) uma seqüência responsável pela produção de um

peptídio sinal. E outro, de 1,8 kb, codifica a forma não glicosilada

intracelular que não possui o peptídeo sinal e é produzida constitutivamente

em níveis baixos, sem função fisiológica aparente (Carlson et al., 1983).

Invertases de linhagens do gênero Saccharomyces produzidas pelos

genes SUCl a SUC5 apresentaram comportamento muito similar entre si.

Todas sofrem repressão pela glicose e as constantes cinéticas para a

hidrólise da sacarose por essas enzimas parcialmente purificadas são

semelhantes entre si, porém não idênticas (Rodriguez et al., 1981). Também

não se observou diferenças discerníveis quanto ao comportamento das

formas externa e interna de invertase produzidas por qualquer um desses

genes ( Ottolenghi, 1972).

Mais recentemente, além do gênero Saccharomyces, outros gêneros

de levedura têm recebido crescente atenção quanto à produção de invertase,

devido tanto à diversidade metabólica desses gêneros quanto à possibilidade

de se realizar modificações genéticas em algumas espécies. As técnicas de

biologia molecular permitiram o rápido avanço na compreensão de muitas

leveduras pertencentes a outros gêneros que não Saccharomyces.

As propriedades da invertase de Torulaspora pretoriensis são

similares às da invertase externa de S. cerevisiae. A enzima purificada por

Oda & Tonomura ( 1994) é uma glicoproteína tetramérica cujo conteúdo de

carboidrado representa 50% da sua massa molecular total. A massa

molecular estimada para os monômeros e para a proteína nativa é de 130 e

530 kDa, respectivamente. A atividade da invertase foi detectada no espaço

periplasmático e/ou na parede celular. Portanto, a hidrólise da sacarose dá-

se externamente à membrana celular. O pH ótimo para atividade encontra-se

na faixa de 4,5-5,0 e a temperatura é de 45ºC, respectivamente. Em pH 4,5,

-----··-----------------------------:--=----- 11

os valores de Km calculados para essa enmnas com sacarose e rafiRose como substrato, foram de 48,3 e 120 mM, respectivamente.

A invertase de Candida utilis purificada por Chávez et ai. (1997) é

uma glicoproteína dimérica composta de dois monômeros idênticos com

massa molecular aparente de 150 kDa. A enzima possui atividade em

sacarose e em rafinose apresenta 64% da atividade observada em sacarose.

É estável em pH na faixa de 3 - 6, sendo que o pH ótimo para a sua

atividade é 5,5. A temperatura ótima encontrada foi de 7<fC. Os valores de

Km observados para a enzima de C. utilis tendo a sacarose como substrato

foram cerca de 400/o menores que os encontrados para a de S. cerevisiae,

indicando uma maior afinidade da invertase de C. utilis pela a sacarose.

A invertase de Schizosaccaromyces pombe é também uma

glicoproteína cujo conteúdo de carboidrato é de 67o/o. Está associada à

parede celular e contém resíduos terminais de galactose e manose. A enzima

é estável em temperaturas inferiores a 60ºC e o pH ótimo para a sua

atividade é 4,0. O valor de Km para a sacarose é 22 mM ( Zárate & Belda,

1996)

Rodriguez et ai. ( 1995) purificaram e caracterizaram a invertase de

Pichia anomaia. Esses autores verificaram que a maioria das características

da enzima analisada por eles era similar às das invertases produzidas por

outras leveduras. A invertase foi encontrada quase que exclusivamente em

associação com a parede celular. A enzima purificada era uma glicoproteína

oligomérica composta de 3 ou 4 subunidades de tamanho idêntico

(86,5 kDa). A presença de carboidrato ligado à porção N-terminal da

proteína contribui para aproximadamente 30% da massa total da molécula,

porção essa que consiste de oligossacarídeo de manose. Também, da mesma

forma que para S. cerevisiae, a síntese da invertase por P. anomala é

influenciada pela concentração da fonte de carbono no meio; concentrações

12

supenores A

decréscimo na atividade foi observado para valores de pH inferiores a 4, O e

superiores a 6,5.

Em um trabalho posterior Pérez et ai. (1996) clonaram e

seqüenciaram o gene INVI que codifica a invertase em P. anomala. A

seqüência de 5 50 aminoácidos prevista a partir da seqüência de nucleotídeos

apresentou homologia significativa com as invertases das espécies

S. cerevisiae e Schizosaccharomyces occidentalts, na relação de 37,8% e

45,6%, respectivamente. A maior semelhança foi encontrada na porção N-

terminal da proteína madura a qual apresentou várias regiões altamente

conservadas, uma das quais contendo três dos dez sítios potenciais para

glicosilação identificados na seqüência da invertase de P. anomala.

A caracterização da invertase heteróloga, obtida da expressão do gene

SUC2 de S. cerevisiae em S. pombe, forneceu informações sobre a

habilidade dessa levedura no processamento glicoproteínas heterólogas,

indicando que ela pode ser capaz de galactosilar não somente as suas

próprias glicoproteínas mas também glicoproteinas heterólogas codificadas

por genes heterólogos e introduzidos nessa levedura por transformação.

Essa habilidade pode colocar S. pombe em posição de vantagem em relação

a S. cerevisiae na expressão de glicoproteínas de eucariotos superiores com

oligossacarídeos do tipo complexo ou h.tbrido, os quais além de manose

possuem galactose e ácidos siálicos (Zárate & Belda, 1996).

13

1.4. Aplicaçio illd9Strial da â1Yei tase

A frutose é o monossacarídeo mais doce que se conhece, tem duas

vezes o poder adoçante da sacarose e, portanto, os processos para a

produção de frutose são de considerável valor comercial. A descoberta por

Bruyn & Eckensteín, em 1895, da interconversão da glicose em frutose, em

condições alcalinas, forneceu bases químicas para a produção de frutose a

partir de glicose. Porém, não houve produção industrial decorrente dessa

descoberta devido à formação de sub-produtos não metabolizáveis e

indesejáveis para o consumo humano. Uma alternativa para a indústria de

alimentos é a produção de frutose a partir da hidrólise enzimática da

sacarose utilizando para isso, a invertase de leveduras. A frutose está

disponível no mercado em solução com a glicose, como açúcar invertido,

derivado da hidrólise enzimática da sacarose de cana de açúcar ou

beterraba, como também pura e cristalizada ou como xarope.

A invertase purificada pode ser utilizada, também, na produção de

marzipan e na manufatura do recheio cremoso de bombons; em produtos

para a higiene oral para prevenção e remoção de placas dentais; na hidrólise

da rafinose para a produção de melibiose; na estocagem de tâmaras para

evitar a cristalização da sacarose; e em biossensores, na forma imobilizada,

para a determinação de sacarose (Ribeiro, 1977).

As leveduras que produzem a invertase são utilizadas in vivo na

produção de massas para pães e bolos, de álcool industrial e de bebidas

alcoólicas (Kretzschmar, 196 l ). Para a produção de proteína unicelular e de

complexos vitamínicos, as leveduras são propagadas em matéria-prima

contendo como substrato a sacarose (Crueger & Crueger, 1989).

A invertase é usada comercialmente no processo de produção de

fruto-oligossacarídeos (FOS) a partir da sacarose pela transferência de

-------·---- ------ 14

grupos iiutosil (Hayasbi et ai., 1994; Cllen,; 199S; <>a,, 1996}. Os FOS

possuem a metade do poder adoçante da sacarose e não são susceptíveis à

decomposição pelas enzimas digestivas do homem e de animais e, portanto,

são açúcares não cariogênicos. Também exibem efeito estimulante sobre o

crescimento da bifidobacteria intestinal, a qual é favorável à saúde e

nutrição humanas sendo, por isso, no Japão, correntemente usados em uma

variedade de alimentos (Cheng et ai., 1996). Dentre os usos potenciais dos

FOS está incluído seu emprego como flavorizante em iorgutes (West, 1996).

Um fator critico para a utilização de enzimas em escala industrial é a

redução de custos; as enzimas, em geral são solúveis e instáveis e podem ser

usadas apenas uma vez em um determinado processo. O desenvolvimento de

técnicas de imobilização permitiu a redução da quantidade de enzima

utilizada na conversão de substratos com consequente diminuição de custos.

A imobilização consiste na ligação, por meios fisicos ou químicos, da

molécula da enzima a um suporte inerte com retenção da atividade catalítica.

A enzima pode, dessa forma, ser usada continuamente. Diferentes materiais

têm sido estudados como suportes para imobilizar a invertase produzida por

leveduras, tais como poliestireno (Gemeiner et ai., 1995), Concanavalina A

(Mutlu et ai., 1996), Dowex (Ribeiro, 1997). Em todos os casos, obtem-se

maior estabilidade aliada à possibilidade de uso continuo e repetido da

invertase, ampliando assim o interesse para a sua aplicação industrial.

JS

1.5. Método GOD-P AP '"' . ;:,,· ·:-,· :-" ~-~ "'- ..,. ·r <\ ,. .,. J, .. - •.•• :

Os métodos colorimétricos usados para quantificar a atividade da

invertase são geralmente baseados na dosagem de açúcares redutores totais

(ART) ou da glicose liberados após a hidrólise enzimática da sacarose.

Desde fins dos anos 50, o método baseado no uso da enzima glicose

oxidase tem sido modificado e usado para a determinação de glicose no

sangue (Raabo & Terkilasen, 1960). Posteriormente, o uso desse método

que combina especificidade e simplicidade foi extendido para a

quantificação da atividade de enzimas que hberam glicose a partir de seus

substratos, como a maltase, P- galactosidase, u-amilase, P-glicosidase e

invertase.

Nesse método, na presença da enzima glicose oxidase, a glicose é

transformada em glucanolactona a qual reage com água para formar ácido

glucônico e peróxido de hidrogênio. Na presença de peroxidase, elétros são

transferidos do peróxido de hidrogênio formado para um aceptor gerando

cor, com aceptores como a o-dianisidina e o 2 ,2 '-azino-di( 3-

etilbenzotiazolina-6-sulfonato (ABTS), ou fluorescência com o ácido

hidroxifenilacético. Dependendo do aceptor de elétrons diferenres faixas de

sensibilidade são obtidas (Baker, 1991 ).

O Método GOD-P AP (Merck 8443) foi desenvolvido para a dosagem

de glicose no sangue e tem sensibilidade para a faixa de concentração de O a

200 µg/mL. Nesse caso, o peróxido de hidrogênio reage na presença de

peroxidase com a 4-aminofenazona e o 2,4-diclorofenol formando a

antipirilquinooimina. A quantidade desse corante formada é proporcional à

concentração de glicose na amostra.

16

2. OBJETIVOS:

O presente trabalho teve como objetivos:

• Avaliar os níveis de atividade de invertase em leveduras que assimilam ou

fermentam a sacarose.

• Avaliar a utilização do método GOD-PAP (Merck 8443) para a

quantificação da glicose formada a partir da hidrólise enzimática da

sacarose.

• Avaliar a influência da concentração de glicose na repressão da síntese da

invertase em diferentes linhagens de levedura.

17

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Avaliação dos níveis de produção de invertase

Para avaliar os níveis de produção de invertase em leveduras, foi

desenvolvida a metodologia que se segue:

3.1.1. Leveduras

Foram utiliz.adas linhagens procedentes da coleção de cultura de

leveduras do Instituto de Microbiologia Dr. Paulo de Goes da Universidade

Federal do Rio de Janeiro e duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae,

ATCC 9763 e IR2 procedente do Fermentation Research Institute de

T sukuba, Japão. As linhagens, previamente identificadas, foram

selecionadas segundo a capacidade de fermentar e/ou assimilar a sacarose.

As culturas estoque foram mantidas sob refrigeração em tubos com meio

G YMP (glicose 20 g/L; extrato de levedura 5 g/L; extrato de malte 1 O g/L;

fosfato de sódio dibásico 2 g/L; ágar 20 g/L - esterilizado em autoclave a

12 1 ºC por 15 min).

3.1.2. Ativação das células

Uma porção de células das culturas estoque foi tranferida para tubos

de ensaio contendo 3 mL de meio líquido (glicose 20 g/L; extrato de

levedura 5 g/L; fosfato de sódio dibásico 2 g/L; pH 4,5 - esterilizado em

autoclave a 12lºC por 15 min). Os tubos foram incubados a 30ºC por 16 h

sob agitação de 200 rpm. Após o período de incubação, as células foram

colhidas por centrifugação, lavadas duas vezes e resuspensas em 3 mL de

18

água destilada est«Jl.

3.1.3. Obtenção de massa celular

A suspensão de células do item anterior foi vertida em um erlenmeyer

de 125 mL contendo 20 mL de meio de cultura (Y east Nitrogen Base -

Difco) 6, 7 g/L, extrato de levedura 1 O g/L, glicerol 3 g/l, - esterilizado por

vapor fluente por 15 min). Os erlenmeyers foram incubados sob agitação de

200 rpm a 30ºC por 24 h. As células foram colhidas por centrifugação,

lavadas duas vezes e resuspensas em l O mL de água destilada estéril. As

células foram usadas como ínóculo.

3.1.4. Cultivo para a produção de invertase

As leveduras foram cultivadas em quatro erlenmeyers de 250 mL

contendo 50 mL de meio (YNB 6, 7 g/L, extrato de levedura l O g/L, glicose

1 g/L - esterilizado por vapor fluente por 15 min) nos quais foi inoculado um

volume determinado da suspensão celular, de forma a se obter uma

absorbância inicial a 600 nm de O, 1 no sistema inoculado. Dois erlenmeyers

foram utilizados para avaliar os níveis de atividade da invertase nas células

após 4 e 8 h de cultivo e os outros dois, para a elaboração de curva de

crescimento celular.

9

3.1.S. Euaio euimitico

3.1.5.1. Preparo das células para a dosagem de invertase

As células foram preparadas centrifugando-se e lavando duas vezes

com água destilada estéril todo o conteúdo dos erlenmeyers. A massa celular

foi resuspensa em 4 mL de água destilada estéril. Foi feita a leitura da

absorbância dessa suspensão de células a 600 nm em espectrofotómetro

Shimadzu UV-150-02 e, o volume dela ser utilizado na reação enzimática

foi calculado de modo a fornecer no volume final da reação enzimática

(3000 µL) uma absorbância de 2 e 4 para os tempos de 4 e 8 h de

incubação, respectivamente (Rodriguez et ai., 1995).

3.1.5.2. Reação enzimática

Os ensaios foram conduzidos em tubos de centrifuga contendo

1500 µL de uma solução de sacarose 1 O mM em tampão acetato de sódio

O, 1 M, pH 5,0. Após a adição da suspensão de células, preparada como

descrito acima, completou-se o volume para 3000 µL com tampão acetato

de sódio O, 1 ~ pH 5,0.

Em seguida, os tubos foram deixados em banho termostatizado a 30ºC

por 15 min. Após esse período, para paralisar a reação enzimática, os tubos

foram aquecidos à temperatura de fervura da água (96ºC) por 2 min. Para

cada ensaio foi feito wn branco interrompendo-se a reação imediatamente

após a adição da suspensão de células. Os tubos foram centrifugados e no

sobrenadante foi dosada a concentração de glicose.

A atividade da enzima foi definida em termos de µg de AR T liberados

20

por min de reação a 30°C. A atividade normalizada foi expressa como µg de ART.min-1/00 (Chávez et al., 1997).

3.1.6. Curvas de crescimento e concentração de glicose no meio

Durante o cultivo das leveduras, foram retiradas amostras de 2 mL em

intervalos de 2 h por 1 O horas. As Células foram centrifugadas, lavadas duas

vezes em água destilada estéril e resuspensas em 2 mL de água. A leitura

das absorbâncias foi feita em duplicata, em um espectrofotômetro Shimadzu

UV-150-02 a 600 nm. As curvas foram obtidas graficando-se o logarítimo

da absorbância em função do tempo de incubação (h).

A concentração de glicose no meio foi calculada mediante a seguinte

fórmula:

% glicose= [(Gi - Gt)/Gi].100,

onde, Gi é a concentração inicial de glicose (1 g/L) e Gt é a concentração de

glicose dosada em um tempo determinado. A glicose foi dosada pelo método

GOD-PAP.

3.2. Dosagem de glicídios

Foram utilizados dois métodos para dosagem de glicídios redutores:

um, GOD-PAP, específico para dosagem de glicose e outro, de Somogy,

para dosagem de açúcares redutores totais (ART) (Somogy, 1952), ambos

com sensibilidade para a faixa de concentração de O a 200 µglmL .

•

21

Método GOD-PAP (Merc:k 8"3)

Reagentes:

1. Mistura tampão-enzima:

Tampão fosfato

Tampão Tris

pH da solução tampão

0,1 mmol/L

0,05 mmol/L

8,0

Glicose oxídase (GOD)

Peroxídase (POD)

7KU/L

1,4 KU/L

2. Corantes:

4-Aminofenazona

2,4-Diclorofenol

0,25 mmol/L

0,3 mmol/L

A solução de reação foi feita dissolvendo-se a mistura tampão-enzima

e os corantes em 500 mL de água bidestilada. Essa solução foi mantida sob

refrigeração a l OºC.

Para a dosagem de glicose, adicionou-se a 100 µL de amostra 1 mL

da solução de reação. Após 15-20 min de reação a 3 7ºC, foi feita a leitura

da absorbância a 51 O nm em um espectro fotômetro Shimadzu UV-150-02.

Foi feita uma curva de calibração utilizando-se soluções de glicose em

concentrações de l O - 200 µg/mL e, para o cálculo da concentração de

glicose, utilizou-se a equação obtida dessa curva.

3.3. Determiaaçio dos parimetros envolvidas ao aumento da

absorbância durante a dosagem da glkose pelo método GOD-P AP

3.3.1. Medida do pH das soluções de glicídios adicionadas da

solução de reação do método GOD-P AP

Foram medidos o pH da mistura da solução de reação do método

GOD-P AP com as soluções de glicose 40 ug/ml, e de sacarose 1 O mM

(3 420 µg/mL) em tampão acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0 utilizando-se

potenciômetro Micronal 83 7 4.

Um volume de 20 mL das soluções dos glicídios foi diluído em 20 mL

de tampão acetato 0,1 mM, pH 5,0 antes da medida ser efetuada, simulando-

se, dessa forma, a diluição e o pH da dosagem de glicose após o ensaio

enzimático.

3.3.2. Influência do aquecimento a temperatura de fervura da

água na inversão da sacarose

A 5 mL das soluções de sacarose 1 O, 20 e 40 mM acrescentou-se

5 mL de tampão acetato O, 1 mM, pH 5,0 ou em água destilada, quando

indicado, e, em seguida, colocou-se l ml de cada diluição em três tubos de

ensaio. O primeiro não foi aquecido, o segundo foi aquecido por 1 min à

temperatura de fervura da água (96°C), e o último foi aquecido à mesma

temperatura por 2 min, Após o aquecimento, foi feita pelo método

GOD-PAP a dosagem da glicose formada.

23

3.3.3. Efeito da sohaçle de reaçio do método GOD-P AP sobre

diferentes glicídios

Foram feitas soluções 40 µg/mL de x.ilose, frutose, trealose, rafinose e

celobiose. Foi efetuada a reação, em triplicara, destas soluções de glicídios

com o reagente GOD-PAP seguindo-se a metodologia sugerida pela Merck

para a dosagem de glicose por meio do reagente em questão.

3.3.4. Efeito das enzimas do método GOD-P AP sobre a sacarose

Foi feita a reação de l 00 µL das soluções de sacarose l O mM e de

glicose 40 µg/m.L com l mL da mistura tampão-enzima do método

GOD-PAP. Após 15 min de incubação a 37ºC, a dosagem de ART formados

foi efetuada pelo método de Somogy.

3.3.5. Cinética da reação de hidrólise da sacarose pelo reagente

GOD-PAP

Foi feita uma diluição de 1 mL da solução de sacarose 1 O mM em

1 mL de tampão acetato 0,1 M, pH 5,0. A cinética da reação dessa solução

com o reagente GOD-P AP) foi acompanhada em um espectrofotômetro

Hitachi U 200 l por 2 h.

O tempo zero da reação correspondeu a 17 min após a adição do

reagente GOD-P AP. Sendo desse tempo, 15 min correspondentes à

incubação a 37ºC, conforme recomendação da Merck, e 2 min

correspondentes ao tempo de ajustar o aparelho às condições desejadas.

Foi feito o gráfico da concentração de glicose em função do tempo de

reação.

3.3.6. Determinação da variação da absorbância para diversas

concentrações de glicose na presença de sacarose

Foram feitas diluições de l mL de soluções de glicose 10, 20, 40, 80,

120, 140, 200, 240, 280, 320, e 360 µg/ml em l mL de sacarose 10 mM. A

cinética da hidrólise de cada uma das soluções de sacarose pela solução de

reação do método GOD-PAP foi acompanhada por 30 min em um

espectrofotômetro Hitachi U-2001. Os ensaios foram feitos em triplicata.

Como no item anterior, o tempo zero das reações correspondeu a

17 min após a adição do reagente GOD-PAP.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A determinação in vivo da invertase periplasmática de leveduras é de

grande interesse, pois, o emprego dessa enzima na indústria alimentícia, de

bebidas alcoólicas e do álcool industrial dá-se pela utilização de células

vivas (Silveira et ai., I 996).

Os métodos descritos para a determinação da atividade da invertase

periplasmática são baseados na medida da glicose ou dos açúcares

redutores totais (ART) formados pela hidrólise enzimática da sacarose sob

condições pré-estabelecidas de pH, temperatura, massa celular e tempo de

reação.

A literatura cita amplamente a utilização da enzima glicose oxidase

para a dosagem da glicose, na forma de "kits" de reagentes ou da

elaboração dos reagentes em laboratório e por meio de biossensores

(Cheetham, I 995).

Não obstante, no presente trabalho, a metodologia proposta para

avaliar os níveis de produção de invertase mostrou-se inadequada na etapa

da quantificação (pelo método GOD-P AP) da glicose formada pela ação

dessa enzima numa solução contendo sacarose 1 O mM em tampão acetato

0,1 M, pH 5,0. Por essa metodologia, não foi possível determinar a

quantidade de invertase produzida pelas leveduras ou mesmo determinar se

houve ou não síntese da enzima, pois as dosagens de glicose em solução

contendo sacarose forneciam, em todas as determinações, leituras de

absorbância crescentes.

Vitolo & Borzani (1983) verificaram que a interrupção da reação

enzimática em um dado momento é um ponto crítico na determinação da

atividade da invertase em células intactas de leveduras; a parede celular

protege a enzima e impede a rápida inativação da invertase.

26

As leituras de absorbância crescentes no entanto somente eram obtidas quando a glicose formada durante a reação enzimática era dosada

pelo método GOD-PAP. Quando a determinação dos ART era feita pelo

método de Somogy, esse resultado não se repetia. Além disso, após a

reação enzimática, as células eram separadas do meio de reação por

centrifugação. Dessa forma, mesmo que a reação enzimática não tivesse

sido o interrompida pelo aquecimento, no momento da dosagem dos

açúcares não havia invertase presente no meio de reação.

Investigou-se o que poderia estar afetando a adequação do método

GOD-PAP para a dosagem de glicose nas condições experimentais

estabelecidas para o presente trabalho.

4.1. Identificação das variáveis relacionadas à inadequação do método

GOD-P AP para dosagem da glicose em mistura com sacarose

O aumento das leituras de absorbância nas dosagens da glicose

formada após os ensaios enzimáticos poderia estar relacionado à

contaminação da sacarose com glicose ou com a hidrólise da sacarose. A

hidrólise da sacarose poderia estar ocorrendo em função do pH da reação

enzimática, do aquecimento à temperatura de fervura da água (96°C) para a

interrupção dessa reação ou da combinação desses dois fatores. Outra

hipótese seria a inversão química ou enzimática da sacarose pelos

componentes da solução de reação do reagente GOD-PAP.

-····---------

4. 1.1. hdluâlda do pH

A sacarose é facilmente hidrolisada em meio ácido. O açúcar

invertido industrial é obtido por hidrólise ácida em pH 3,5, e o mel de

abelha, que é um açúcar invertido natural, tem pH 4,0 (Alais & Linden,

1991).

A solução de reação do método GOD-PAP tem pH 8,0. Porém, como

nos ensaios enzimáticos foi utilizado tampão acetato 0,1 M, pH 5,0, e como

a reação da glicose com a enzima glicose oxidase resulta na formação de

ácido glucônico, pensou-se na possibilidade de desvio do pH para a faixa

ácida, o que poderia resultar em uma hidrólise ácida da sacarose. Foi, então,

feita a determinação do pH da mistura.

Os valores determinados de pH na faixa de 6,0-7,7 não sugerem uma

hidrólise ácida da sacarose (Tabela 1). A formação de ácido glucônico não

altera significativamente o pH do sistema de reação. O desvio do pH de 8,0

para 6,0, nos ensaios com tampão acetato O, 1 M, pH 5,0 e sacarose, devem

ser atribuídos a influência do pH do tampão, uma vez que a solução de

sacarose foi feita em tampão acetato O, 1 M, pH 5,0.

Tabela 1: Valores do pH das soluções de glicídios adicionadas à solução

de reação do método GOD-PAP.

Soluções pH

Glicose+ Solução de reação

Sacarose + Solução de reação Tampão acetato + Solução de reação

7,67

6,03

6,00

--------·· ------

4.1.2. Influência do aquecimento da ~o de sacarose

Esses experimentos foram realizados com o objetivo de verificar se a

sacarose utilizada na reação enzimática, estava sendo hidrolisada com o

aquecimento por 2 min a 96ºC, utilizado para interromper a reação

enzimática.

Na Tabela 2, as leituras apresentadas para os tempos l e 2 min de

aquecimento e sem aquecimento da reação enzimática correspondem à

primeira leitura obtida após a adição do reagente GOD-P AP seguido de

incubação por 15-20 mina 37°C, conforme recomendação da Merck. Após

esse período, no entanto, esses valores aumentavam progressivamente

sendo impossível determinar qual o real valor da concentração de glicose

presente na solução.

Por esse experimento, verificou-se que o aquecimento a 96ºC por

2 min não é responsável pela hidrólise da sacarose. A obtenção de

concentrações de glicose em torno de 170 ug/ml, com e sem aquecimento, a

princípio indicava que a sacarose estivesse contaminada com glicose e que

essa reagia lentamente com a glicose oxidase fornecendo, dessa forma,

valores sempre crescentes de leitura de absorbância. Em vista disto, optou-

se pelo uso de uma solução de sacarose mais diluída que, nesse caso, daria

menor interferência nos ensaios enzimáticos. Para verificar esta hipótese, o

mesmo ensaio foi repetido com soluções de sacarose 1 O e 20 mM.

Tabela 2: JnfWncia do tempo de aqueci•nento a 96°C da solução de

sacarose 40 mM sobre o aumento da concentração de glicose.

TempG de aquecimento Leitura da absorbância Concentração de glicose

(min) (510 mn) (µg/mL)

2 0,553 170,58

l 0,548 168,97

sem aquecimento 0,549 169,29

A Tabela 3, apresenta as leituras iniciais de absorbância das soluções

10 e 20 mM com e sem aquecimento. Obteve-se resultado idêntico ao

anterior: leituras que aumentavam progressivamente sem que houvesse

influência do tempo de aquecimento das soluções a 96°C.

Tabela 3: Influência do tempo de aquecimento a 96ºC das soluções de

sacarose 1 O e 20 mM sobre o aumento da concentração de

glicose.

Concentração da Tempo de Leitura da Concentraçâo

solução de sacarose aquecimento absorbância de glicose

(mM) (min) (510 nm) (µg/mL)

2 0,108 27,03

10 1 0,102 25,10


2 0,198 56,06

20 1 0,204 58,00


30

Como a reaç.ão eomnática era realizada em tampão acdato de sódio

O, 1 M, pH 5,0, para esses ensaios as soluções de sacarose foram diluídas

nesse tampão, simulando, assim, as condições da reação enzimática. Para

eliminar a possibilidade de que a combinação desse valor de pH com a

temperatura de 96ºC promovesse a hidrólise da sacarose, esse ensaio foi

repetido com a solução de sacarose 1 O mM, substituindo-se na diluição o

tampão por água destilada (Tabela 4 ).

Tabela 4: Influência do tempo de aquecimento a 96ºC da solução de

sacarose 1 O mM diluída em água destilada sobre o aumento

da concentração de glicose.

Tempo de aquecimento Leitura da absorbância Concentração de glicose

(min) (510nm) (µglmL)

2 0,097 23,48

1 0,091 21,55


Os resultados obtidos foram semelhantes aos dos ensaios realizados

com o tampão acetato 0,1 M, pH 5,0. Permanecia, portanto, a conclusão de

que a presença de glicose em concentrações em tomo de 22 µg/mL, era

devido à contaminação da sacarose por glicose.

Na tentativa de se encontrar uma sacarose que não fosse contaminada

ou que fosse menos contaminada por glicose, foram testadas outras quatro

amostras de sacarose de fabricantes diferentes, sendo que de um fabricante

foram utilizadas amostras de 2 lotes. Foram então preparadas soluções

31

1 O mM dessas amostras de sacarose e o ensaio foi repetido fa7.endo.se as

diluições em tampão acetato O, 1 M, pH 5,0 (Tabela 5).

Tabela 5: Influência do tempo de aquecimento a 96ºC de soluções de

sacarose I O mM sobre o awnento da concentração de glicose.

Tempo de Leitura da Concentração

Amostra aquecimento absorbância de glicose

(mio) (510nm) (µg/mL)

2 0,094 22,52

I 1 0,085 19,61


2 0,131 34,45

2 1 0,120 30,90


2 O, 107 26,71

3 1 0,091 21,55

sem aquecimento O, 110 27,68

2 0,059 11,23

4 l 0,062 12, 19


Para as quatro amostras de sacarose obteve-se, quanto ao aumento

das leituras de absorbância, um resultado idêntico aos dos ensaios

anteriores.

32

4.1.3. Reaçio do método GOD-P AP cem difeftlltes gliddiGs

Para explicar os aumentos observados nas leituras de absorbância,

levantou-se a hipótese de que se a sacarose estivesse contaminada com

glicose e frutose livres, a glicose oxidase estaria reagindo inicialmente com

a glicose e em seguida com a frutose que, de alguma forma, estaria sendo

convertida em uma aldose. Por outro lado, a ligação glicosídica da molécula

de sacarose ( do tipo J3- l ,2) poderia estar sendo rompida pelas enzimas ou

reagentes cromógenos presentes na solução de reação do método

GOD-PAP, hberando desta forma os monômeros de glicose e frutose.

Se assim fosse, a especificidade do reagente seria duvidosa, podendo

haver reação com outros glicídios que não a glicose. E, em misturas de

açúcares, após reação com a solução de reação do método GOD-P AP, a

formação de antipirilquinonimina não corresponderia necessariamente à

quantidade de glicose. As informações obtidas no presente trabalho até

então, indicavam que pelo método GOD-P AP obtinha-se uma leitura de

absorbância pontual para dosagem de glicose e crescente para sacarose.

Para verificar a possibilidade da solução de reação do método

GOD-P AP reagir com outros glicídios e, no caso de estar havendo hidrólise

da sacarose, assim como para conferir se havia especificidade para um

determinado tipo de ligação, foi elaborado um ensaio utilizando-se soluções

40 mM de xilose ( ai dose), frutose ( cetose ), trealose ( dímero de glicose,

ligação n-I, 1 ), celobiose ( dímero de glicose, ligação J3- l, 4) e rafinose

(trissacarídeo composto de galactose, glicose e frutose, ligações a-1,6 e

J3- l ,2).

Nenhum dos glicídios testados reagiu com a solução de reação do

método GOD-PAP (Tabela 6). Não se obteve leitura de absorbância com

xilose, frutose e rafinose. As leituras de absorbância obtidas com a

33

celobiose e com a trealose foram coostaotes e correspondem a uma

concentração de glicose de cerca de 2 µg/mL, podendo ser atribuídas a

traços de glicose presentes na solução desses dissacarídeos ou, como esses

valores estão fora da curva de calibração, podem ser considerados sem

significado. Com esses resultados concluiu-se que os reagentes e/ou

enzimas presentes na solução de reação do método GOD-PAP não eram

capazes de reagir com outros açúcares ou de converter frutose em glicose.

Permanecia, no entanto, a dúvida quanto ao porquê da reação contínua com

a sacarose; se esse efeito era ocasionado pela hidrólise desse dissacarídeo

seguida de reação com a glicose formada ou pela reação direta da enzima

glicose oxidase com a sacarose.

Tabela 6: Reação de xilose, frutose, trealose, celobiose e rafinose

40 µg/mL com a solução de reação do método GOD-PAP. .. - -

Glicídio Leitura da absorbância Concentração de glicose

(510nm) (µg/mL)

Xilose 0,000 0,00

Glicose O, 157 40,00

Frutose 0,000 0,00

Celobiose 0,009 2,19

Trealose 0,008 2,04

Rafinose 0,000 0,00

Como a enzima glicose oxidase é específica para a D-glicose,

reagindo com o carbono 1 da molécula e convertendo-a em ácido glucônico

e na molécula de sacarose é este carbono o que está ligado à fiutose, a hipótese de reação direta com a sacarose era, portanto, menos provável.

Concluiu-se que havia de fato hidrólise da sacarose e que essa, uma

vez que não era causada pelo aquecimento a 96ºC e/ou pela alteração do pH

da reação enzimática, deveria ser promovida por alguma substância ( outra

enzima ou reagente) presente na solução de reação do método GOD-P AP.

Pela mesma razão acima exposta, se a hidrólise fosse enzimática, não

seria realizada pela glicose oxidase. A outra enzima que está presente nesse

reagente é a mutarotase bacteriana, que acelera a interconverção de

açúcares anoméricos e que também não causaria esta hidrólise. Restava a

possibilidade de que a hidrólise fosse química e ocasionada pelos outros

reagentes.

Para eliminar definitivamente a possibilidade de uma hidrólise

enzimática da sacarose, foi feito um ensaio com as enzimas do método

GOD-PAP livres dos reagentes cromógenos. A dosagem de ART formados

foi efetuada pelo método químico colorimétrico de Somogy.

Não ocorreu inversão da solução de sacarose pela enzima glicose

oxidase (Tabela 7), como evidenciado pela ausência de ART. Dessa forma,

concluiu-se que as enzimas da solução de reação do método GOD-PAP não

invertem a sacarose.

33

Tabela 7: Efeito da enzima glicose oxidase sobre a solução de sacarose lOmM.

Glicídio Concentração Leitura da absorbância

(µg/mL) (510nm)

Sacarose 3 420

40

0,0

0,105 Glicose

4.2. Cinética da reação de hidrólise da sacarose pela solução de reação

do método GOD-P AP

Diante desses resultados, foi feita uma cinética da reação de hidrólise

da sacarose pela solução de reação do método GOD-PAP (Figura 1). A

hidrólise foi acompanhada pelo período de 2 h, tempo máximo para leitura

depois do qual, segundo indicação da Merck, o reagente perde a

estabilidade.

45 - -'O T

35-:- .-.. . ] 30 -L- ;,c ,:. 25 -f-

! 2() t t5 15 t

10 + y =0,3272x+ l,8189 R; =0,9982

o~•~~~~~~~~~~~~~--~~ o 20 40 so

Te..,(min)

)00 120

Figura l: Cinética da hidrólise da sacarose pela solução de reação do

método GOD-P AP.

------------------------ 36

Para confirmar que a reação observada era provocada pela hidrólise

da sacarose e não pela presença de AR T contaminantes, foi determinada,

pelo método de Somogy, a concentração de ART presente na solução de

sacarose l O mM utilizada no experimento descrito acima.

Pelo resultados apresentados nas Tabelas 7 e 8, concluiu-se que a

solução de sacarose não possui glicose e frutose livres. Por isso, as leituras

obtidas pelo método GOD-PAP não podem ser atnbuídas à contaminação

da sacarose pelos monossacarídeos que a compõem mas sim, à hidrólise

química da sacarose. Portanto, em primeira análise, não é possível a

utilização do método GOD-P AP para a dosagem de glicose na presença de

sacarose. Portanto, foi feita uma proposta de adaptação do método.

Tabela 8: Concentração de açúcares redutores totais da solução de

sacarose l O mM_

Glicídio Concentração

(µg/mL)

Leitura da absorbância

(510nm)

Sacarose

Glicose

3 420

40

0,0

0,106

- ----------- 31

4.3. Adaptaçio do método

4.3.1. Determinação da variação da absorbincia para diversas

concentrações de glicose na presença de sacarose

A Tabela 9, apresenta a variação das concentrações das soluções de

glicose em presença de sacarose. Nessa tabela, o tempo zero de leitura

corresponde a 17 min após a adição da solução de reação ( 15 min de

incubação a 3 7ºC recomendados pela Merck e mais 2 min consumidos para

ajustar o espectrofotômetro ). Não foi observada influência da concentração

inicial de glicose livre na hidrólise da sacarose. Durante os 30 min de

leitura, a cinética da reação de hidrólise da sacarose pela solução de reação

do método GOD-PAP pôde ser descrita por um modelo linear em todos os

casos. Para verificar o ajuste desses modelos foram feitas tabelas de análise

de variância (ANOVA). Os gráficos com as equações das retas e as tabelas

de ANOVA estão apresentadas em apêndice.

-···· ·--· ···--····· ······ ----·

• ~ e,

1 o o o o

"O o - ~ e o ü Q. cn o

"O

~ = = ·- e o u - - ~ u

"O o ~ ta o o () ~

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"O ~ o "O = , ... ~ = - .... tJ "O

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"O cn = u V) 1- o Q) ca "O > IJl 'Jl Q)

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e. = o N ..,. '° 00 N .... '° 00 o .D e·- o N .... '° 00 N o e- e - - - - - N N N N .... E-- -

39

A primeira leitura de absorbincia das soluções S, l O e 20 P!VJDl correspondem, respectivamente a concentrações de glicose 54,44, 26,60, e

10,21 % superiores à concentração esperada. Na faixa entre 40 e 100 µg/ml,

a primeira leitura de absorbância fornece valores de concentração de glicose

muito próximos aos que estavam presentes na solução. E, apesar de

prosseguir aumentando, essas leituras fornecem concentrações equivalentes

às esperadas nos 4 primeiros minutos para as concentrações de 40 e

60 µg/ml, entre 2 e 8 min para a concentração de 80 µgim] e entre 4 e

1 O min para a concentração de 100 µg/ml. Na faixa de 120 a 180 µg/ml, as

leituras iniciais fornecem concentrações de glicose de 9 a 13% menores que

as concentrações reais sendo que, a última leitura, efetuada 30 min após a

primeira, corresponde a concentrações de 3 a 9,32% menores que as

esperadas.

Para a utilização do método GOD-P AP para a dosagem de glicose em

presença de sacarose, se faz necessário observar duas condições: que a

concentração de glicose esteja na faixa entre 40 e 100 µg/ml e que o tempo

decorrido entre o momento de adição da solução de reação e a leitura da

absorbância seja rigorosamente o mesmo para todas as leituras. Conforme

os resultados apresentados, a leitura da absorbància deve ser feita

preferencialmente 21 min após a adição do reagente.

A concentração de glicose presente no sistema de reação ao final do

ensaio enzimático esteve abaixo da faixa de calibração de 40-100 µg/ml em

todos os ensaios preliminares cujas concentrações de AR T foram

determinadas pelo método de Somogy. Por isso, optou-se por dar

seguimento ao trabalho utilizando-se apenas o método de Somogy para a

dosagem de AR T.

40

4.4. Produçlo de invenue

Os meios usados para o cultivo de microrganismos devem conter

todos os elementos mnna forma apropriada para a síntese das substâncias

celulares e para a produção de produtos metabólicos.

O meio Y east Nitrogen Base (YNB) foi desenvolvido por Wickerham

( 1958). Contém vários elementos traço, 9 vitaminas, 3 aminoácidos -

histídina, metionina e triptofano, e os principais sais minerais - fosfato de

potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio e cloreto de cálcio. A fonte

de nitrogênio é o sulfato de amônio, que pode ser usado pela maioria das

leveduras conhecidas. A fonte de carbono deve ser acrescentada (Phaff et

al., 1978).

Em ensaios preliminares, a levedura Saccharomyces cerevisiae

(50613) foi cultivada em YNB acrescido de 0,1% de glicose e, como

resultado, não se obteve crescimento celular. Acrescentou-se ao meio O, lo/o

de extrato de levedura, tendo sido então obtido crescimento celular.

Resultados idênticos foram obtidos para seleção de leveduras produtoras de

xilitol (Barbosa et ai., 1988). Os extratos de levedura contém 18

aminoácidos os quais podem estimular o crescimento de certas leveduras

fastidiosas.

A fonte de carbono a ser uti1izada foi escolhida mediante comparação

do cultivo dessa mesma levedura em YNB com 0,1 % de extrato de levedura

e 0,1 % de glicídio na forma de sacarose ou glicose. Como o crescimento

celular em sacarose foi escasso, concluiu-se que as linhagens que

apresentassem baixa atividade de invertase apresentariam pouco

crescimento em meio contendo sacarose.

Além disso, Martínez-Pastor & Estruch (1996) observaram que

quando as células de levedura foram inoculadas em um meio, visando a

.. ----------------··-·----··------- -------- 41

desrepressão da invertase, cuja fonte de cmbono alo era a glicose, a expressão dessa enzima foi retardada. A atividade da invertase foi detectada

nas primeiras horas de cultivo somente em meio contendo glicose como

fonte de carbono. Segundo os mesmos autores, a ausência de atividade da

invertase nessa condição não representa uma falha na transcrição dos genes

reprimíveis pela glicose, e sim uma completa inibição da tradução na

ausência de fontes de carbono rapidamente utilizáveis, como a glicose. A

capacidade de tradução só é retomada após várias horas de incubação.

Portanto, quando a indução transcricional é medida por meio da

atividade enzimática, há que se considerar as condições de cultivo

favoráveis à tradução, como a presença de glicose, uma vez que a ausência

de atividade enzimática não é sempre sinônimo de ausência de trancrição.

A principal condição para a obtenção de leveduras ricas em invertase

é o cultivo em meio contendo glicose em concentração inferior a 0,5 g/L

(Ribeiro, 1997). Essa condição foi considerada como critério para

desrepressão da síntese da invertase no presente trabalho.

Diante do exposto, foi proposto cultivar as leveduras por 1 O h em

meio contendo concentração inicial de l g/L de glicose, monitorar a

concentração de glicose no meio e fazer duas determinações da atividade da

invertase, com 4 e 8 h de cultivo.

Na Tabela l O estão apresentadas as atividades e as atividades

normaliz.adas da invertase em diferentes leveduras.

·-·---···-----·-·· --····-··--·--------- ·'2

Tabela 10: Níveis de atividade da invertase em diferentes leveduras.

Atividade da lnvertase

LEVEDURAS ug.ml." µg.mL-1/00

4h 8b 4h 8b

S. cerevisiae (IR2) 1,00 2,00 0,50 0,50

S. cerevisiae (ATCC 9763) 1,06 2,34 0,53 0,58

S. cerevisiae ( 50613) 0,00 0,00 0,00 OJ>O

S. kluyve,y(50629) 1,15 1,73 0,57 0,43

Zygossacharomyces sp (50965) 0,22 0,22 0,11 0,05

P. becki ( 50808) 0,00 0,00 0,00 0,00

P. carsoni(50809) 0,22 0,36 0,11 0,09

P. ohmeri (50537) 0,00 0,00 0,00 0,00

W califomtca (50420) 0,00 0,57 0,00 0,14

D. hanseni (50059) 0,00 0,00 0,00 0,00 ..

Debaryomyces sp (50385) 0,08 0,04 0,04 0,01 ·-

R. rubra (50596) 0,00 0,00 0,00 0,00

T pretoriensis (50811) 0,00 0,47 0,00 0,12

e. macerans ( 50361) 4,94 4,85 2,47 2,21

C. ater (51032) 1,28 l, 70 0,64 0,42

A. pululans (51102) 0,08 0,00 0,04 0,00

Considerando-se os resultados obtidos nas condições experimentais,

as leveduras estudadas podem ser agrupadas, quanto à síntese de invertase

nos tempos de 4 e 8 h de cultivo, como se segue:

• não produziram a enzima - D. hanseni (50059), R. rubra (50596),

S. cerevisiae (50613), P. becki (50808) e P. ohmeri (50537)~

• produziu somente no tempo 4 h -A. pululans (51102)

43

• produzi•am somae no tempo 8 h - W. colifomica (S0420) e T. pretoriensis ( 50811);

• produziram a enzima nos doi.s tempos - C. ater (51032),

C. macerans (50361), Zygossacharomyces sp (50965), P. carsoni

(50809), S. cerevisiae ATCC 9763, S. cerevisiae IR2 e Debaryomyces

sp (50385), S. kluyvery (50629).

As leveduras procedentes da coleção de culturas do Instituto de

Microbiologia da UFRJ, utili~das no presente trabalho, foram escolhidas

conforme o critério de assimilar ou fermentar a sacarose, como evidenciado

nos testes bioquímicos utilizados nos trabalhos de identificação dessas

leveduras. A ausência de atividade da invertase em algmnas linhagens

(50059, 50537, 50596, 50613, 50808) deve refletir mais a dificuldade de se

determinar a atividade da invertase em células vivas do que a incapacidade

dessas leveduras produzirem a enzima.

A quantificação da atividade das enzimas do espaço periplasmático

em suspensão de células de leveduras, está sujeita a erros quantitativos por

uma variedade de razões. De maior importância é a relação entre a

velocidade de formação do produto pela enzima que está sendo monitorada

e a velocidade dos processos que dissipam o produto. Se a velocidade de

assimilação, for relativamente alta a concentração do produto pode ser

subestimada ou não quantificada (Arnold, 1991).

Silveira et ai. ( 1996) não detectaram atividade da invertase em

células vivas de S. cerevisiae seguindo as metodologias descritas na

literatura para o ensaio enzimático e atribuíram o fato ao consumo de

glicose e frutose produzidas pela ação da enzima. Os níveis reais de

atividade somente foram evidenciados após inibição da enolase ( enzima da

-------- ---- --· ----- - - ---------------------- - ---- -- -- :.w---··-·-· ···-

via glicolítica que converte o 2-fosfoglicerato ·em fosfoenolpiruvato) durante

o ensaio enzimático, pela adição de fluoreto de sódio 50 mM.

4.5. Crescimento celular e concentração de glicose no meio de cultivo

A concentração inicial de glicose presente no meio de cultivo para a

síntese de invertase era de l g/L. A presença de glicose em concentração

inferior a 0,5 g/L foi considerada como condição para desrepressão da

síntese da enzima. Seguindo-se esse critério, as leveduras estariam

desreprimidas quando o consumo ultrapassasse 50% da glicose inicial.

Não foi detectada a produção de invertase pelas linhagens

D. hanseni (50059) e R. rubra (50596) (Figuras 2 e 3) por meio da

metodologia proposta. D. hanseni apresentou pouco crescimento celular e

baixo consumo de glicose. A concentração de glicose no meio de cultivo

permaneceu acima de 0,5 g/L durante o crescimento celular. R. rubra

apresentou melhor crescimento do que D. hanseni mas também não havia

consumido 50% da glicose presente no meio com 8 h de cultivo.

Em ambos os experimentos as células encontravam-se sob condição

de repressão da síntese da invertase nos tempos nos quais foi medida a

atividade enzimática. Portanto, é possível que em condições de

desrepressão, essas duas leveduras produzam a enzima em questão.

--· - -·------------·--· --· -·-----------·----------;is-----··· --·

100 90-r ~l

li i

! 70, ~ 60 + -;,

50 + -8 40 + $. 30 .i

20 j_

10 + o • o

e =

• 2

-+-cresc. celular

4 6 Temp,(11)

8 10

Figura 2: Concentração de glicose no meio de cultivo e crescimento celular

de Debaryomyces hansenii (50059).

100 ------------ 90 - ~------- ! 70 _ , ---- % de glicose

~ 60 - · --+- cresc. celular ";'.: :() - ---·--- ~ 40 - '/!. 30 -

20 - !O - O~------------------- 0.1

8 !O

- 10

e = - - 1 -:

-; ~ "" -

O 2 4 6 Temp> (b)


de Rhodothorula rubra (50596).

Seguindo-se a metodologia proposta também não se detectou

produção de invertase pelas leveduras S. cerevisiae (50613), P. becki

(50808) e P. ohmeri (50537) (Figuras 4 a 6). Com 4 h de cultivo essas

leveduras não haviam consumido 50~ô da glicose presente no meio de

cultura, estando, portanto, sob condição de repressão da síntese de

invertase. Com 8 h de cultivo, no entanto, quase 100°/o da glicose já havia

sido consumida, proporcionando condições para a síntese da enzima.

A não detecção de atividade de invertase para essas leveduras após

oito horas de cultivo pode significar a existência de baixos níveis de

atividade da enzima associada à rápida assimilação da glicose e frutose

formadas a partir da hidrólise da sacarose.

. -· - -........,..,

100 - !O <)'.) - ~- s ;,, 70 - -----------

~ ------ % de gh;;-Ose = - ] 60 - - - ";'.: 50 - -+-- cresc . .xkllar ,,: - Ji -e 40 - 11

~ 30 - li= • ~ 20 - !O T o o

o 2 4 6 8 10 Teqio (h)


de Saccharomyces cerevisiae ( 50613 ).

·-···--·-··· --·····----------------

o 2 4 6 8 10

Te-.,()a)

Figura S: Concentração de glicose no meio de cultivo e crescimento celular

de Pichia becki (50808).

- 10

~ e s =

-= =": - 1 ,.c

~ ,. "i

~ :t o .s

o o 1 4 6 8 10 ..

Te~(b)


de Pichia ohmeri (50537).

----·-·--··-- ----

A. pululans (51102) (Figura 7) apresentou pouco crescimento e COllSUDlO

inferior a 20% da glicose do meio de cultura com 1 O h de cultivo. Portanto,

nos tempos 4 e 8 h de cultivo encontrava-se sob condição de repressão da

síntese de invertase. Foi verificada atividade da invertase presente com 4 h

(0,08 ug.ml,") e ausente com 8 h de cultivo. Com 4 h de cultivo, a atividade

normalizada obtida foi de 0,04 ug.ml," /00.

A atividade detectada com 4 h de cultivo, quando ainda não tinha

havido consumo da glicose do meio, indica a existência de condição de

desrepressão da síntese da invertase, em presença de concentrações de

glicose superiores a 0,5 g/L. Para P. anomala a síntese de invertase só é

reprimida em concentrações de glicose superiores a 2 g/L (Rodrigues et ai.,

1995).

A não detecção da atividade com 8 h pode ser devido à assimilação

da glicose e frutose formadas, considerando-se que as células colhidas com

8 h de cultivo estariam com o metabolismo mais ativo do que aquelas

colhidas com 4 h.

100 • • • - 10 1 • • 90 -----.

~...;. '1 70.,. _.._%de glicose e ! = ~ 60 +

1-+-cresc. ceillar ~ ~ 1 \(> 50 + ~ 1 -1 -8 40 + __.------+ ~ 30 + j •

20 + L 10 .; o. • 0,1

o 2 4 6 8 10

Te~(h)


de Aureobasidium pululans (51102).

" --···---·----·-·-··--·-·-- -- --------- - ----------------------------49-

Para T. pretoriensis (50811) e W. califomica (50420) (Figuras 8 e 9)

foi verificada produção de invertase com 8 h de cultivo mas não com 4 h.

Para ambas as leveduras, a produção com 8 h deu-se sob condição de

desrepressão, pois já havia sido consumida mais de 50% da glicose do meio.

A atividade normalizada obtida com 8 h de cultivo foi de 0,12 µg.mL.1/00

para T pretoriensis e de 0,14 µg.mL.1/00 para W califomica.

T 10 i !

E ~ 70 + ---- % de glicose = g 1 g ~ 60 + -+-cresc. ceular -;, "° so+ + l -1 -8 40 + ;t. 30 + ! 20--:--

o o 2 4 6 8 10

Tempo(b)


de Torulaspora pretoriensts (50811 ).

····--· ··--· ··----· -·-· -···· ·-·--···-··-· . ----··-- --·------------r,r---···----

100 10 ex) - e ~ ro -

-----% de gbcose j 1

= ! 70 - g ..:! (iO - i ";'e 50 ~ -+-cresc. cehllarj t l ,,e

-8 40 + -1 ~ 30 +

1 ! 20 - 10 - o o

o 2 4 6 8 10

Teq,o(h)


de Williopsis ca/ifomica (50420).

Com 4 e 8 h de cultivo de C. ater (51032) (Figura 10) a concentração

de glicose no meio era superior a 50o/o e portanto as células encontravam-se

sob condição de repressão. A atividade da invertase foi de 4, 73 e de

6,30 ug.ml," com 4 e 8 h de cultivo, respectivamente. A atividade

normalizada da invertase obtida com 4 h (0,64 µg.mL.1/00) foi maior do

que aquela apresentada com 8 h (0,42 µg.mL-1/00).

Esperava-se, para todas as leveduras estudadas, que a atividade

verificada com 8 h fosse o dobro da obtida com 4 h, considerando-se que

para o ensaio enzimático realizado com 8 h, foi empregado o dobro de

células. Esse resultado corrobora a suposição de que as células

metabolicamente mais ativas estariam assimilando mais rapidamente os

produtos da hidrólise da sacarose e dessa forma os valores detectados

estariam sub-estimados.

Para C. macerans (50361) (Figura 11) as atividades normalizadas

verificadas com 4 e 8 h foram semelhantes, 2,47 e 2,21 µg.mL-1/DO,

respectivamente.

Também para essas leveduras, a repressão da síntese da invertase

deve ocorrer em concentrações de glicose superiores a 0,5 g/L.

100 T lO ~T 1

i

so + ---- % de gli;:ose e ~ :± ! r:: ~ -+- cresc, cem lar g -;, l,C

-8 :i -1 ~ 30 + .s 1

20 + 10 o

o 2 4 6 8 lO Teq,o(h)

Figura 1 O: Concentração de glicose no meio de cultivo e crescimento

celular de Cryptococcus ater (51032).

: -. - --

100 90 - ~- ·------- e " 70 - ---- °'o de gbcose e !:

] 60 - -+- cresc ce lu lar -;: 50 - ...:;

-8 40-:- ~ ~ 30' i' • ~ 20 .;

10 - o 0.1

o 2 4 6 8 10

Tempo(h)

Figura 11: Concentração de glicose no meio de cultivo e crescimento

celular de Cryptococcus macerans (50361).

·----------- -· -·-- ---- - --- --- ----------·- ----,.,51..--····--- . -·····

Para S. kluyvery (50629), Zygossacbaromyces sp (S096S) e Debaryomyces sp (50385) (Figuras 12 a 14) foi verificada produção de

invertase em duas condições distintas, sob repressão com 4 h e sob

desrepressão com 8 h. Para Zygossacharomyces sp (50965) a atividade

normalizada obtida com 4 h (0,11 µg.mL-1/00) foi o dobro da obtida com

8 h (0,05 µg.mL-1/00). Para Debaryomyces sp (50385) a atividade

normalizada verificada com 4 h (0,04 µg.mL-1/00) foi 4 vezes maior do que

a apresentada com 8 h (0,01 µg.mL-1,'DO).

Esse resultado, embora contrário ao esperado, corrobora a hipótese de

que as células metabolicamente mais ativas estariam assimilando mais

rapidamente os produtos da hidrólise da sacarose e, dessa forma, os valores

de atividade apresentados com 8 h estariam sub-estimados.

100 - 10 <X) - &) - ------ e ~ 70 - -%de glicose e

J;

J fi) - -.-..:resc. celular ~ :,e 50 - - 1 ~ 40 - ~ ~ 30 - r • ""\

20 - - 10 - o o

o 2 4 6 8 !O

Temp>(b)


celular de S.kluyvery (50629).

100 1 - lO

90 + i

V ~t ã ! ~ i =v= g ~ 'ic '° -8 40 + 1-+-cresc. ceklltr: -1 ~ 30+ .! •

ro + o . o o 2 4 6 8 10

Tempo(h)


celular de Zygossacharomyces sp (50965).

100 - 10 'X) -

~- 41 70 - ----- % de g bco se E s = w- - ~ ~ cres e ,;e ln lar :::: x ~- - l ~ ~ ~) - ~ ~ 30 - iC • "'\

20 - - IO ~ o o

o 2 4 6 8 10 Tempo(h)


celular de Debaryomyces sp ( 50385).

Para S. cerevisiae (IR2) (Figura l 5), foi encontrada atividade nos dois

tempos de cultivo, sendo que a atividade normalizada observada com 4 h

(0,50 µg.mL-1/DO) foi idêntica à apresentada com 8 h (0,50 µg.mL"1/DO).

Resultados similares a esse, apresentados nas Figuras 16 e 17

respectivamente, foram obtido também com outra linhagem de

S. cerevisiae (ATCC 9763) e com P. carsoni (50809).

100 T 10 90 t ~+ E ~ 70 + ! - % de gJ.;ose

c:I

j! 60 + ! ~ -;, 50 ..L -+- cresc. cem1ar l -e

-8 40 .; ' .; ':!.. 30 .; x') • ~

20 +

10 - o OJ

o 2 4 6 8 10 Tempo(h)


celular de Saccharomyces cerevisiae (IR2).

······-·--- ······--··-···------------··----------- -- . ---------------- ss

100~---- so 7

ll) + : 70 + ,---""-d-~--~ j 60 J_ 1, ---- 70 e gill,AJse 'ic 50 + -+- cresc. cekllar -8 40 + '.t. 30 +

20 + 10 + 0~'------+----.------t--- ....... ~~-- O

--r 10

o 2 4 6 Tempo(h)

8 10


celular de Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763).

ICü---...._ so -

\1 !l) - ------ ! "O - ......_º·ode l!OCOSe ~ 60 - - ~ 50 - -+- -:resc .::e lular -8 .tO - ~ 30 - • 20 -

10 - Q.,C.=-------'-------------=::::,,e

- 10

e = - 1

-.:; li "i ~ -

o 4 6 8 10

Tempo(h)

O 2


celular de Pichia carsoni ( 50809).

A dificuldade de se comparar as atividades enzimáticas obtidas no

presente trabalho com dados de literatura reside no fato de que os vários

autores utilizam em seus trabalhos unidades definidas de diversos modos.

Silveira et ai. ( 1996) definem l unidade como sendo 1 µmol de glicose

produzida por minuto de reação por mg de células. Cbávez et ai. (1997)

definem 1 unidade como a quantidade de enzima que hidroliz.a 1 mM de

sacarose por min de reação. Para Vitolo & Borzani (1983) a atividade da

invertase é definida como sendo a quantidade, expressa em g, de ART

liberada por min de reação por g de peso seco de células.

Além disso, as metodologias empregadas para o cultivo das células e

as condições utilizadas para os ensaios enzimáticos variam de acordo com

os autores. A isso acrescente-se que, no ensaio enzimático, alguns autores

trabalham com células vivas íntegras enquanto outros utilizam protoplastos

(Kuo & Lampem, 1971) ou frações celulares (Zárate & Belda, 1996).

No presente trabalho, os melhores resultados foram obtidos com

C macerans (50361 ). Pelo fto dessa levedura, até o presente momento, não

Ter aplicação industrial, não foi encontrado na literatura nenhum dado sobre

a atividade da invertase nesse gênero.

Com relação às demais linhagens utilizadas, por comparação com

C. macerans (50361), o gênero Saccharomyces e a espécie C. ater (51032)

apresentaram níveis médios de atividade ( de 1,00 a 2,34 ug.ml,") E, as

demais linhagens que produziram a invertase foram classificadas como

produtoras de baixos níveis de atividade ( de 0,04 a 0,57 ug.ml,").

Muitas aplicações industriais de leveduras produtoras de invertase, no

entanto, envolvem condições em que altos níveis de atividade não são

desejáveis. Há evidências de que a habilidade de S. cerevisiae fermentar

altas concentrações de sacarose, incluindo aquelas presentes na massa para

5. CONCLUSÕES

• A utilização do método GOD-PAP (Merck 8443) para a dosagem de

glicose em presença de sacarose requer cautela. Os reagentes do método

hidrolisam a sacarose durante o tempo de reação. A glicose formada é

quantificada pelo método GOD-PAP levando à obtenção de leituras de

absorbância crescentes.

• Para que o método GOD-PAP (Merck 8443) seja utilizado para dosagem

de glicose em presença de sacarose é necessário que a concentração

inicial de glicose esteja na faixa de 40 - l 00 µg/m.L e que o tempo de

leitura seja o mesmo para todos as amostras. Esse tempo deve ser

preferencialmente de 21 min após a adição do reagente.

• Do universo de linhagens de leveduras testadas, quanto a produção de

invertase, 68)5'% produziram a enzima e 3 l ,25o/o não a produziram nas

condições experimentais.

• A concentração de glicose que reprime a síntese da invertase varia de

acordo com a linhagem; 50o/o das leveduras testadas produziram invertase

em concentrações de glicose superiores a 0,5 g/L.

• A linhagem que apresentou melhor resultado quanto a produção de

invertase foi C. macerans (50361).

59

A ,

6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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- •···· --·--···-··--··-··--- ·- - --- -·· - . --- - --· - ------·--·-· - . -----·--·--- ·------- -- -- . ----

A

7. APENDICES

13 T

y = O, 1399x + 7,6873 R2 =0,99'J3

o 5 10 15

Tempo(min)

20 25 30

Figura A: Variação da absorbância da glicose 5 µglml na presença

de sacarose 1 O mM

Tabela de ANOV A

Fonte de Soma Nº de g.l. Média MQíajl'MQep MQ../MQr

variaS:ào quadrática quadrática

Modelo 2,40.1013 2,40.1013 3,01.1011 46,06

Residual 2,40.1013 46 5,21.1011 4,08 F 1,46

Falta de 2,40.1013 14 1,71.1012 2 F 14,32 ajuste

Erro puro 182,00 32 5,70

Total 4,80.1013 47 ANOVA - (Analysis of Variance) Analise de variância

~ de g.I. - Número de graus de liberdade

MQraj - Média quadrática da falta de ajuste

MQcp - Média quadrática do erro puro

MQm - Média quadrática do modelo

MQr - Média quadrática do resíduo

20 T 19 t

::- 18 - _,ê 17 -:- ~ .:- 16 .... i. 15 .; ! 14 l a 13 !

12 r 11-:~~~~~~~~~-+-~-+-~------ o

y = Q,210lx + 12,681 R2 =0,9997

5 10 15

Tempo(min)

20 25 30

Figura B: Variação da absorbância da glicose 10 µg/ml na presença

de sacarose 1 O mM

Tabela de ANOVA

Fonte de Soma N2 de g.l. Média MQfajlMQcp MQ.JMQr varia~ào quadrática quadrática

Modelo 180, 1 O 1 180, 1 O 0,0 l 467,89

Residual 17,71 46 0,38 4,08 F 1,46

Falta de 0,06 14 0,00 2 F 14,32 3JUSte

Erro puro 17,65 32 0,55

Total 197 ,81 47

15

Tempo(m)

Figura C: Variação da absorbância da glicose 10 µg/mJ na presença

30 -e-

29-:- ,.... 28 - e 27 - ~ 26 i ::, -t-

';' 25 t ! 24 + ~ 23 I C5 : 22

21 + 20 +-'. --+---+----+---+----+-----,

o

y = 0.2369" + rum R2 = 0,9998

5 10 20 25 30

de sacarose 20 mM

Tabela de ANOVA

Fonte de Sorna Nº de g.l. Média MQraJMQ.,,, MQml'MQr variação quadrática quadrática

Modelo 228,98 228,98 0,0 l 808,69 .. - -a

Residual 11,78 46 0,26 4,08 F 1,46

Falta de 0,05 14 0,00 2 F 14,32 ajuste

Erro puro 11, 73 "'I ., 0,37 s :

Total 252,53 47

·-·-- .. ... . -- . ·---- ----·--·--------

47 T 1

46 t ,...., 45 + ê ' ~ 44 T :, 1

';' 43 ~ ! 42 + a 41 1

40 1 39-+-~-+-~~t--~~~-+-~~+--~-

y = (),2183x + 39,9 R2 =0.999

o 5 10 15 Tempo(min)

20 25 30

Figura D: Variação da absorbância da glicose 40 µglml na presença

de sacarose 10 mM.

Tabela de ANOVA

Fonte de Soma ~ de g.l. Média MQrajlMQep MQm!MQ, varia~ão quadrática quadrática

Modelo 194,43 1 194,43 0,01 228,74

Residual 38,87 46 0,85 4,08 F 1,46

Falta de 0,19 14 0,01 2 F 14,32 ajuste

Erro puro 38,68 32 1,21

Total 233,31 47

----------------- ·--

67 T

ti6 + ) 65 ~ ee 64 + :::, i .._.. 63 + li I g 62 l. u ' B 61 l

so ~+---_.__--+--+---+---+-----!

y =0,1174x+(i(),114 Rz =0,9%6

15 Tempo(min)

Figura E: Variação da absorbância da glicose 60 ug/ml na presença

o 5 10 20 25 30

de sacarose 1 O mM

Tabela de ANOVA

Fonte de Soma Nº de g.l. Média MQrafMQcp MQmlMQr varia~ão quadrática quadrática

Modelo 192,83 1 192,83 0,03 165,09

Residual 53,73 46 l, 17 4,08 F 1,46

Falta de 0,67 14 0,05 2 F 14,32 ajuste

Erro puro 53,06 32 1,66

Total 246,56 47

-··--·-- --·------- .. - -----·--------------

86 -e-

85 T

i 84; cc 83, :s : ';' 82 + ! 81 J..

C5 so + 79 ~ 78-·--+-------+---------1----

0

•

y = 0,2152x + 79,C!J7 R2 =0,9899

5 10 15

Tempo(min)

20 25 30

Figura F: Variação da absorbância da glicose 80 ug/ml na presença

de sacarose 1 O mM

Tabela de ANOVA

Fonte de Soma Nº de g.l. Média MQra/MQep MQu/MQ, varia~ão quadrática quadrática

Modelo l 88,95 188,95 0,05 96,19

Residual 90,36 46 1,96 4 08 F 1,46 '

Falta de l,93 14 O, 14 2 F 14,32 ajuste

Erro puro 88,43 32 2,76

Total 279,31 47

-·-···· ...• - .. --· . ·-·-- ·-------------. - ------------ -·-· -------- ------·----

1~ - 105 +

i ,.._ 104 , ] 103 -t- • i .:, 102 + ! 101 + ;; 100 f '..,; 99 +

98 ~ <n -.-!--+----.-----,....---------

º

y = 0,2386x + 9&, 164 ' R- =0,9911

5 10 15

Tempo(min)

20 25 30

Figura G: Variação da absorbância da glicose 100 µglml na presença

de sacarose 10 mM.

Tabela de ANOVA

Fonte de Soma N2 de g.l. Média MQfa/MQq, MQn/MQr vana~ão quadrática quadrática

Modelo 43430,21 1 43430,21 1757 ,84 46, 19

Residual 43256,20 46 940,35 4,08 F 1,46

Falta de 43200,03 14 3085,72 ') F 14,32 ajuste

Erro puro 56, 17 32 1,76

Total 86686,41 47

ll7 - ll6 ~

i 115 - :ili 114..,... ~ :

-; 1)3 + ! 112 + a 111 +

llO ' 109~·~~--~---~----~~--~~~---; o

y = Q,2199x+ 109,92 R2 =0,9949

5 10 15

Tempo(min)

20 25 30

Figura H: Variação da absorbância da glicose 120 µg!ml na presença

de sacarose 10 mM.

Tabela de ANOVA

Fonte de Soma ~ de g.l. Média MQrajMQcp MQu/MQr vana~ão quadrática quadrática

Modelo 197,29 197,29 0,14 501,58

Residual 18,09 46 0,39 4,08 F 1,46

Falta de l ,02 14 0,07 2 F 14,32 ajuste

Erro puro 17 ,08 32 0,53

Total 215,39 47

. . . " . . ------------------------- -

129 - 128..;...

.-. ": P7 - ~ - ~ t 126- ~___.,~

! 125 + ~ ã 124 t ~ Y =0,1932x+ 122,66 123 ~. R2 = 0,9953

1n~•~~--~-+-~---~~-----~--+-~---< o 5 10 15 20 25 30

Tempo(min)

Figura 1: Variação da absorbância da glicose 140 µg/ml na presença

de sacarose 1 O mM

Tabela de ANOVA

Fonte de Soma N2 de g.l. Média MQra_/MQ.., MQnlMQr varia~ão quadrática quadrática

Modelo 152,29 1 152,29 0,04 158,71

Residual 44, 14 46 0,96 4,08 F 1,46

Falta de 0,72 14 0,05 2 F 14,32 ajuste

Erro puro 43,42 32 1,36

Total 196,43 47

147 -

146- ~ :::, 145 - -· s -+- ? :~ = - ~_._-.-- j 142 r ~ y=~1Sx+140,t9 0 14 t - __. Ri = 0.9933

140 .----. 139+---------r----+---+-----i

O 5 10 15 20 25 30

Tempo(min)

Figura J: Variação da absorbância da glicose 160 µg/ml na presença

de sacarose 1 O mM.

Tabela de ANOVA

Fonte de Soma Nº de g.l. Média MQra/MQci, MQnlMQr varia~ào quadrática quadrática

Modelo 165,66 1 165,66 0,09 254,42

Residual 29,95 46 0,65 4,08 F 1,46

Falta de 1, 12 14 0,08 2 F 14,32 ajuste

Erro puro 28,83 32 0,90

Total 195,61 47

------ ---·------- -- ·- - - - -- ---- ------

164 - -. 163- ~ e I ez - ____..---- 1 l 6 t - ,__ _,_____..--- - ";' ieo - ~- ! t59 -. ~ ij 158 -

157 ..:: 156 t •

O 5

y=~+l57.15 R"" = 0.9&3 l

10 15 20 25 30

Tempo(min)

Figura L: Variação da absorbância da glicose 180 µg/ml na presença

de sacarose 10 mM.

Tabela de ANOV A

Fonte de Soma Nº de g.l. Média MQrajMQcp MQolMQr variaS:ãO quadrática quadrática

Modelo 176,35 1 176,35 0,03 31,65

Residual 256,33 46 5,57 4,08 F 1,46

Falta de 3,04 14 0,22 2 F 14,32 ajuste

Erro puro 253,29 32 7,92

Total 432,68 47

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