Faculdade de Engenharia Mecânicarepositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/332172/1/Salles... ·...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Engenharia Mecânica

TAIS HELENA COSTA SALLES

Desenvolvimento de membranas poliméricas pelo

processo de eletrofiação para aplicação em

regeneração tecidual

CAMPINAS

2017

TAIS HELENA COSTA SALLES




Tese de Doutorado apresentada à Faculdade

de Engenharia Mecânica da Universidade

Estadual de Campinas para obtenção do título

de Doutora em Engenharia Mecânica, na

Área de Materiais e Processos de Fabricação.

Orientador: Prof. Dr. Marcos Akira d’Ávila

CAMPINAS

2017

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA

TESE DEFENDIDA PELA ALUNA TAIS HELENA COSTA

SALLES, E ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCOS

AKIRA d’ÁVILA

___________________________________

ASSINATURA DO ORIENTADOR

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CNPq, 401297/2014

Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Área de Engenharia e ArquiteturaLuciana Pietrosanto Milla - CRB 8/8129

Salles, Tais Helena Costa, 1986- Sa34d SalDesenvolvimento de membranas poliméricas pelo processo de eletrofiação

para aplicação em regeneração tecidual / Tais Helena Costa Salles. –Campinas, SP : [s.n.], 2017.

SalOrientador: Marcos Akira D'Ávila. SalTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de

Engenharia Mecânica.

Sal1. Engenharia tecidual. 2. Eletrofiação. 3. Polímeros. 4. Regeneração

tecidual guiada. 5. Extratos vegetais. I. D'Ávila, Marcos Akira,1972-. II.Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Mecânica. III.Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Development of polymer membranes by electrospinning processfor application in tissue regenerationPalavras-chave em inglês:Tissue engineeringElectrospinningPolymerGuided tissue regenerationPlant extractsÁrea de concentração: Materiais e Processos de FabricaçãoTitulação: Doutora em Engenharia MecânicaBanca examinadora:Marcos Akira D'Ávila [Orientador]Mary Ann FoglioAna Rita MoralesEliana Cristina da Silva RigoArnaldo Rodrigues dos Santos JuniorData de defesa: 21-02-2017Programa de Pós-Graduação: Engenharia Mecânica

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA MECÂNICA

COMISSÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA

MECÂNICA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE MANUFATURA E

MATERIAIS

TESE DE DOUTORADO




Autor: Tais Helena Costa Salles

Orientador: Prof. Dr. Marcos Akira d’Ávila

A Banca Examinadora composta pelos membros abaixo aprovou esta Dissertação:

Prof. Dr. Marcos Akira d’Ávila

Universidade Estadual de Campinas – FEM/DEMM

Profa. Dra. Mary Ann Foglio

Universidade Estadual de Campinas – FCF

Profa. Dra. Ana Rita Morales

Universidade Estadual de Campinas – FEQ/DEMBio

Profa. Dra. Eliana Cristina da Silva Rigo

Universidade de São Paulo – FZEA

Prof. Dr. Arnaldo Rodrigues dos Santos Junior

Universidade Federal do ABC – CCNH

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida

acadêmica do aluno

Campinas, 21 de Fevereiro de 2017.

Dedico este Doutorado aos meus pais Luís e Maria Aparecida; pelo

esforço, dedicação, compreensão e amor, em todos os momentos da

minha vida. Meus agradecimentos pelo carinho e amor incondicional

que sempre me estimularam nos momentos difíceis, concedendo a mim

a oportunidade de me realizar ainda mais. A Vitória desta conquista

dedico com todo o meu amor, unicamente a vocês!

Parabéns!

Agradecimentos

Agradeço a Deus pelas oportunidades que me foram dadas na vida, pois minha caminhada tem

sido marcada por realizações diárias. Por ter me dado força nos momentos difíceis, por me

iluminar e me dar tranquilidade para seguir em frente com os meus objetivos.

Aos meus pais Luiz Anilton de Salles e Maria Aparecida de Salles, razão da minha vida e da

minha luta. Sempre apoiaram as minhas escolhas, incentivaram os meus sonhos e

proporcionaram condições para eu alcançá-los. Não poderia ter encontrado e vivido ao lado de

pais melhores. Vocês são a riqueza e felicidade da minha existência! Rezo para que Deus os

proteja e abençoe grandemente! Muito Obrigada pela vida, pelo amor incondicional, por vibrar

com as minhas conquistas e por serem as pessoas que posso e poderei me apoiar a vida inteira!

Eu Amo Muito Vocês! Muito Obrigada!

À alma gêmea de minha’alma Fernando Bertini Sartori, por estar ao meu lado de forma

incondicional e pelo apoio e incentivo que tem demonstrado nesta longa caminhada. Obrigada

por ter acreditado em mim muitas vezes mais do que eu mesma! Por me encorajar os 8 meses

de ausência que permaneci em College Station e se fazer presente me dando força e

tranquilidade para alcançar meus objetivos. Obrigada por me fazer feliz!

Ao Prof. Dr. Marcos Akira d’Ávila, meu agradecimento por ter me aceito e pela confiança em

ter em seu grupo de Engenharia de Materiais uma aluna Odontóloga. Por ter acreditado, me

incentivado nos momentos de dificuldades e se fazer sempre presente como orientador.

Obrigada pela oportunidade, apoio e suporte para realização desta pesquisa, dedicação e

orientação no desenvolvimento deste trabalho. Obrigada por me ajudar a conquistar esse sonho.

À Profa. Dra Maria Cristina Zindel Deboni, por ser tão amigável e amável. Por ter aceito nossa

parceria, se fazer sempre presente, pelo interesse evidenciado, incluindo o benéfico

acompanhamento ao longo do meu percurso acadêmico, contribuindo de forma ímpar para

minha formação profissional. Exemplo de profissional e pessoa, sou grata por ter lhe conhecido.

Obrigada pelos conselhos, que foram muitos nesta caminhada. Te admiro muito!

To Prof. Dr. Roland Kaunas for giving me an opportunity to work in Texas A & M University,

College Station, where I did part of my PhD project. Thanks for the orientation and share your

knowledge. For being gentle and attentive. And also by the support of your students. Thank

you! I hope I can work with you again.

A Profa. Dra Mary Ann Foglio por ter acreditado e confiado no meu trabalho. Por fornecer os

extratos vegetais que nos concebeu uma patente. Sou muito grata a essa parceria e oportunidade

que engrandeceu meu projeto. Que possamos continuar trabalhando juntas.

Ao Prof. Dr. Marcelo Lancelloti e a Pós-doc Daisy Machado pelos ensinamentos, pela

disponibilidade para realização dos ensaios in vitro no Departamento de Bioquímica do Instituto

de Biologia, que nossa parceria continue dando frutos.

Aos membros da banca examinadora, Profa. Dra Eliana Cristina da Silva Rigo, minha primeira

orientadora durante a Iniciação Científica, obrigada por me introduzir nesse universo de

pesquisa, pelo incentivo e paciência. A Profa. Dra Ana Rita Morales, que tive o privilégio de

assistir as suas aulas e aprender muito, sempre atenciosa e amigável. A Profa. Dra Mary Ann

Foglio, que contribiu ricamente com esse trabalho. Ao Prof Dr Arnaldo Rodrigues Santos Junior

pela atenção, disponibilidade de tempo e prontidão. Meu Muito Obrigada!

À Natacha Kalline de Oliveira e Daniel Sendyk pela dedicação, paciência, pelos ensinamentos,

por acreditar em nosso trabalho e pela ajuda técnica disponibilizada aos ensaios in vivo

realizado na Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo. Muito Obrigada.

À Fabiana Volpe Zanutto, que se tornou minha amiga e companheira de testes, análises e

discussões. Você foi uma supresa e um presente na minha vida durante o Doutorado. Obrigada

por compartilhar seu conhecimento, ser sempre muito prestativa e atenciosa, por não medir

esforços para me ajudar. Por ser amiga, ouvir meus desabafos e conflitos. Conquistamos muitas

coisas juntas e espero que nossa caminhada continue. Obrigada por tudo Minha Querida!

A Ilza Maria de Oliveira Souza da Divisão de Fitoquímica - CPQBA/UNICAMP, pela

colaboração e parceria, por permitir a execução das análises laboratoriais, pela ajuda técnica

disponibilizada aos ensaios, por ser sempre prestativa e atenciosa.

A todas as pessoas do Laboratório de Polímeros do Programa de Pós Graduação em Engenharia

Mecânica da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) – Rosimeire dos Santos

Almeida, Geraldine Perea, Nicolao Lima, Ana Flávia Nascimento, Peterson Pulgrossi, José

Luis Dávila e João de Deus Moraes que eu fiz amizade e que me ajudaram direta ou

indiretamente, pois estas fizeram ser um ótimo lugar para trabalhar. Meus agradecimentos pelas

conversas, o interesse, as dúvidas, os estímulos, o auxílio nas dificuldades e o carinho.

Agradeço a Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e o Departamento de Engenharia

Manufatura e Materiais da Faculdade de Engenharia Mecânica da UNICAMP, pelo apoio

financeiro, estrutura física e pedagógica que me pertimiram realizar o meu projeto de

Doutorado. Tenho orgulho e consciência que a UNICAMP tem um caminho institucional sólido

e consistente que nos inspira e nos respalda para construir nosso sonho acadêmico. Muito

Obrigada.

A todos os funcionários da Faculdade de Engenharia Mecânica pelo agradável convívio e

dedicação do seu tempo.

To my best friends in College Station, Lyndsay Phillips, Hilary Crowder and Enoc Medina,

without you I can not would support live there. You were my friends and family all time. I

learned so much with you. I never forgot what you did for me. Thank God for putting you in

my life.You live in my heart and I love you so much! I hope I can see you soon.

Ao Meu Grande Amigo Adilson Vitor Rodrigues, foi minha primeira amizade no Mestrado que

perdura até os dias de hoje. Um grande incentivador e paciente em um dos momentos mais

difíceis da minha vida acadêmica, o primeiro contato com a área de exatas. Sou grata por sua

amizade, apoio, ensinamento, pela ajuda, pelo auxílio nas dificuldades. Somos amigos na vida

pessoal e compartilhamos muitos momentos de desabafos, frustações, conquistas e alegrias,

sempre torcemos um pela Felicidade do outro! Migs Muito Obrigada!

Aos meus queridos amigos (as) e familiares que de perto e de longe, me acompanharam por

quatro anos nesta luta do Doutorado, com quem compartilhei tantas preocupações, aflições.

Agradeço pela compreensão por tantos momentos de ausência. Que nossas vidas seguirão para

um lado bonito e estaremos juntos por muito mais tempo ainda. Citar nomes, aqui, me levaria

a uma obrigatória omissão ou esquecimento, portanto fica a mensagem. Obrigada por terem

crescido comigo. Foi bom conviver com vocês, Minha Eterna Gratidão! Às novas amizades.

Muito obrigada!

Nesta hora de encerramento de uma etapa muito especial, de uma maneira muito sincera,

agradeço a todos que de uma forma ou de outra colaboraram para a realização desse sonho.

Meus sinceros agradecimentos!

“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as

grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível.” Charles Chaplin

https://pensador.uol.com.br/autor/charles_chaplin/

Resumo

Há uma necessidade de desenvolvimento em recursos biocompatíveis para preservar ou

restaurar a função de células, tecidos e órgãos danificados e/ou perdidos, como consequência

de acidentes, traumas, queimaduras e doenças graves. A engenharia tecidual consiste no

desenvolvimento de novos dispositivos com o auxílio dos biomateriais, que fornecem apoio

estrutural e funcional para proliferação, adesão e diferenciação celular, proporcionando uma

melhora na saúde humana e na qualidade de vida. O processo de eletrofiação é uma técnica

promissora para produção de membranas poliméricas fibrosas que são extensivamente

aplicadas na área de regeneração tecidual, devido às suas principais vantagens como alta área

superficial em relação ao volume, alta porosidade e mimetizar a morfologia da matriz

extracelular (MEC). Neste estudo, membranas poliméricas de poli (ε-caprolactona) (PCL) e

polirotaxano (PR), e respectiva blenda, com arquitetura e topografia diferentes foram obtidas

pelo processo de eletrofiação com o intuito de avaliar se estas eram capazes de serem utilizadas

em aplicações médicas e odontológicas. A fim de melhorar o potencial de aplicação,

membranas poliméricas de PCL foram associadas a dois extratos de plantas Pterodon pubescens

Benth (Sucupira) e/ou Arrabidaea chica Verlot, que apresentam atividade antiinflamatória e

cicatrizante, respectivamente. Assim, este trabalho foi dividido em 3 estudos distintos, onde o

foco dos estudos foram regeneração tecidual guiada, crescimento celular em tecidos submetidos

a solicitações mecânicas cíclicas e liberação controlada de princípios ativos vegetais. Os

resultados fundamentais obtidos por este trabalho, sugerem que as membranas são

biocompatíveis, servem de suporte biológico para crescimento celular e possuem perfil para o

sistema de liberação controlada de princípios ativos, apresentando alto potencial para futuras

aplicações em regeneração tecidual.

Palavras-Chave: Engenharia tecidual; polímeros; eletrofiação, extrato vegetal, regeneração

tecidual guiada.

Abstract

There is a need for development in biological resources to preserve or restore a function of

damaged and/or lost cells, tissues and organs as result of accidents, burns, and severe diseases.

Tissue engineering consists of the development of new devices with the aid of biomaterials,

which provide a structural and functional support for cell proliferation, treatment and

differentiation, improving in human health and a quality of life. The electrospinning process is

a promising technique for the production of fibrous polymer membranes that are extensively

applied in the area of tissue regeneration due to its main advantages such as high surface area

in relation to volume, high porosity and mimetize an extracellular matrix morphology (ECM).

In this study, the polymer membranes of poly (ε-caprolactone) (PCL) and polyrotaxane (PR),

and respective blends, with different architecture and topography were obtained by the

electrospinning process in order to evaluate then capacity for use in medical and dental

applications. In order to improve the application potential, PCL polymer membranes were

associated with two plant extracts Pterodon pubescens Benth (Sucupira) and/or Arrabidaea

chica Verlot. Thus, this work was divide into 3 distinct studies, where the focus was on guided

tissue regeneration, cell growth in tissues submitted to cyclical mechanical demands and the

controlled release of active principles of plants. The fundamental results obtained by this work

suggest that the membranes are biocompatible, serve as biological support for cell growth and

have a profile for the controlled release system of active principles, presenting high potential

for future applications in tissue regeneration.

Keywords: Tissue engineering; polymer; electrospinning, vegetal extract, guided tissue

regeneration.

Lista de Ilustrações

Figura 2.1: Equipamento de eletrofiação. A) Bomba infusora; B) Placa coletora; C) Fonte de

alta tensão. ........................................................................................................................... 34

Figura 2.2: Micrografia das fibras eletrofiadas (A) PCL e (C) PCL/PR e os respectivos

histogramas de distribuição dos diâmetros das fibras das membranas (B) PCL e (D) PCL / PR.

............................................................................................................................................ 40

Figura 2.3: Ângulo de contato: Gotas de água destilada sobre as membranas poliméricas..... 42

Figura 2.4: Distribuição do diâmetro dos poros na membranas de PCL/PR .......................... 43

Figura 2.5: Avaliação da viabilidade em células BALB/c 3T3. As células BALB/c 3T3 foram

cultivadas sobre as membranas de PCL e PLC/PR por 24 horas. Os valores foram expressos em

absorbância em relação ao grupo controle, onde as células não foram expostas aos materiais. O

experimento foi realizado em microplacas de 24 poços e os resultados representam as médias e

desvios padrão do experimento. * p<0,05. ............................................................................ 44

Figura 2.6: As médias e desvio padrão (mm2) das áreas da imagem radiográfica do defeito em

diferentes períodos experimentais. Teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Significativo

quando p <0,05. ................................................................................................................... 47

Figura 2.7: Fotomicrografias do aspecto histológico do reparo do defeitos ósseos: Período de 7

dias, A) Grupo PCL/ PR apresentou maior quantidade de tecido de granulação (seta); B) Grupo

controle, organização de tecido de granulação (seta); Período 14 dias, C) Neoformação óssea

PCL/PR (seta); D) Grupo controle área de formação óssea (seta). Período de 21 dias, E) Grupo

PCL/PR, mostrou formação de tecido ósseo (asterisco) e aglomerado de células gigantes (seta);

F) Grupo controle, tecido ósseo neoformado (seta). Período de 42 dias, G) Grupo PCL/PR,

mostra clusters de células gigantes (seta) e neoformação óssea (asterisco); H) Grupo controle

com neoformação óssea (seta). Hematoxilina e eosina, baixo aumento, objetivo 2.5X. ......... 51

Figura 2.8: Distribuição da média e desvio padrão das áreas totais de neoformação óssea em

μm2. Kruskal-Wallis e teste de Mann-Whitney. * Significativo p <0,05. .............................. 52

Figura 3.1: Representação esquemática da montagem básica de um aparelho de eletrofiação

(Salles et al, 2015). .............................................................................................................. 63

Figura 3.2: Ilustração esquemática de um coletor com dois eletrodos em paralelo, utilizados

para a produção de fibras altamente alinhadas no processo de eletrofiação (Bellan & Craighead

2011). .................................................................................................................................. 64

Figura 3.3: Fotografias do equipamento Zaber Technologies T-LSR075D. A) Antes das

adaptações: 1 e 2) correspondem aos braços dos dois motores dispostos linearmente, 3) Suporte

de aço inoxidável; B) Após as adaptações: 4) Suporte de alumínio, 5) Componentes de alumínio

(parafusos + roscas) e 6) Caixa de metacrilato fixa à estrutura de metal. ............................... 69

Figura 3.4: Micrografias das fibras eletrofiadas (A) PCL-R e (C) PCL-A e os respectivos

histogramas de distribuição dos diâmetros das fibras das membranas (B) PCL-R e (D) PCL-A.

Note: o * indica a fita dupla face de carbono. ....................................................................... 72

Figura 3.5: A) Distribuição da orientação das fibras aleatórias; B) Distribuição da orientação

das fibras alinhadas. ............................................................................................................. 73

Figura 3.6: Imagens de microscopia confocal de fibroblastos cultivados em placa de

poliestireno (controle) por 1 (A), 3 (B) 3 e (C) 7 dias. Em verde observa-se os filamentos de

actina e em vermelho o núcleo. ............................................................................................ 75

Figura 3.7: Eletromicrografia de varredura da superfície das fibras de PCL arranjadas

aleatoriamente (A). Por microscopia confocal dos fibroblastos aderidos neste arcabouço, as

células foram analisadas após 1 (B), 3 (C) e 7 dias (D). Em verde observa-se a marcação para

filamentos de actina e em vermelho o núcleo. ...................................................................... 76

Figura 3.8: Eletromicrografia de varredura da superfície das fibras de PCL alinhadas (A). Por

microscopia confocal dos fibroblastos aderidos neste arcabouço, mostra que as células se

apresentaram alinhadas na mesma orientação das fibras. As células foram analisadas após 1

(B), 3 (C) e 7 dias (D). Em verde observa-se a marcação para filamentos de actina e em

vermelho o núcleo. ............................................................................................................... 76

Figura 3.9: A) Eletromicrografia de varredura da superfície das fibras de PCL arranjadas

aleatoriamente, Imagens de microscopia confocal B, C e D) Morfologia dos fibroblastos após

o teste de alongamento sobre fibras de PCL-R. Em verde observa-se a marcação para filamentos

de actina e em vermelho o núcleo. Note: a flecha indica a direção que a força de estiramento

foi aplicada. ......................................................................................................................... 79

Figura 3.10: A) Eletromicrografia de varredura da superfície das fibras de PCL alinhadas,

Imagens de microscopia confocal B, C e D) Morfologia dos fibroblastos após o teste de

estiramento paralelo às fibras de PCL-A. Em verde observa-se a marcação para filamentos de

actina e em vermelho o núcleo. Note: a flecha indica a direção que a força de estiramento foi

aplicada................................................................................................................................ 79

Figura 3.11: A) Eletromicrografia de varredura da superfície das fibras de PCL alinhadas;

Imagens de microscopia confocal B, C e D) Morfologia dos fibroblastos após o teste de

estiramento perpendicular às fibras de PCL-A. Em verde observa-se a marcação para filamentos

de actina e em vermelho o núcleo. Note: a flecha indica a direção que a força de estiramento

foi aplicada. ......................................................................................................................... 80

Figura 4.1: Fotografias do esquema do aparato adaptado de célula de Franz, utilizado no ensaio

de liberação dos extratos vegetais: 1) Membrana associada com extrato recortada (1,0 x 1,0

cm2); 2) Célula de Franz adaptada; 3) Agitador magnético; 4) Selamento das células de Franz;

5) Câmara aquecedora com agitação magnética; 6) Câmara acrílica adaptada contendo água

aquecida; 7) Termômetro. .................................................................................................... 95

Figura 4.2: Micrografias das fibras eletrofiadas A) PCL-Pp, C) PCL-Ac e E) PCL-PpAc e os

respectivos histogramas de distribuição dos diâmetros das fibras das membranas B, D e E. 100

Figura 4.3: Fotografias de gotas de água destilada sobre membranas poliméricas para análise

do perfil de ângulo de contato. A) Membrana eletrofiada de PCL puro (controle); B) PCL-Pp:

membrana eletrofiada de PCL associada com P. pubescens; C) PCL-Ac: membrana eletrofiada

de PCL associada com A.chica; D) PCL-PpAc: membrana eletrofiada de PCL associada com

P. pubescens e A.chica. ...................................................................................................... 101

Figura 4.4: Cromatogramas referente à análise padrão de P. pubescens (sucupira) A)

Voucapano m/z 362 (tempo de retenção 8.89 min) e B) Voucapano m/z 404 (tempo de retenção

12.98 min). ........................................................................................................................ 103

Figura 4.5: Cromatogramas referente à análise de liberação de P. pubescens (sucupira) A)

Voucapano m/z 362 (tempo de retenção 8.71 min) e B) Voucapano m/z 404 (tempo de retenção

13,06 min). ........................................................................................................................ 104

Figura 4.6: Gráfico de liberação do extrato vegetal P. pubescens associado às membranas de

PCL em períodos de 1,3 e 7 dias de imersão em PBS. A) PCL-Pp e B) PCL-PpAc............. 108

Figura 4.7: Cromatograma referente à análise padrão de A.chica (carajurina) (tempo de retenção

13.05 min). ........................................................................................................................ 108

Figura 4.8: Cromatograma referente à análise de liberação de extrato A.chica (carajurina)

(tempo de retenção 13.03 min). .......................................................................................... 109

Figura 4.9: Fotografias da membrana de PCL-Ac após ensaio de liberação do extrato vegetal

no período de 7 dias. A) 1: Célula de Franz e 2) Solução de PBS avermelhada; B) 3: Membrana

de PCL-Ac e 4: Agitador magnético avermelhado. ............................................................. 110

Figura 4.10: Avaliação da viabilidade em células BALB/c 3T3. As células BALB/c 3T3 foram

cultivadas sobre as membranas de PCL-Pp, PCL-Ac e PCL-PpAC por 24 horas. Os valores

foram expressos em absorbância em relação ao grupo controle, onde as células não foram

expostas aos materiais. O experimento foi realizado em microplacas de 24 poços e os resultados

representam as médias e desvios padrão do experimento. * p<0,05. ................................... 112

Figura 4.12: Avaliação da proliferação de células de fibroblastos BALB/c 3T3 em membranas

de PCL-Pp, PCL-Ac e PCL-PpAc, após 1, 3 e 7 dias. Os valores foram expressos em

porcentagens de redução de MTT em relação ao ensaio controle, onde as células não foram

expostas as membranas. O experimento foi realizado em microplacas de 24 poços e os

resultados representam as médias e desvios padrão do experimento em triplicata. * p<0,05 113

Lista de Tabelas

Tabela 2.1: Parâmetros de eletrofiação ................................................................................. 33

Tabela 2.2: Resultado da intrusão de mercúrio na membrana de PCL/PR ............................. 43

Tabela 2.3: Distribuição das amostras finais nos grupos e períodos experimentais. ............... 45

Tabela 2.4: Distribuição dos valores médios ± desvio padrão das mensurações das áreas

radiográficas dos defeitos ósseos comparativamente entre os grupos e os períodos. .............. 46

Tabela 2.5: Dados descritivos em média ± desvio padrão da mensuração da área de neoformação

óssea (µm2), comparativamente intergrupos para cada período de observação. ..................... 52

Tabela 3.1: Parâmetros de eletrofiação ................................................................................. 67

Tabela 4.1 Quantidade em massa (mg) dos extratos vegetais ................................................ 92

Tabela 4.2: Condições cromatográficas utilizadas para quantificação de voucapanos em extratos

de P. pubescens. ................................................................................................................... 96

Tabela 4.3: Condições cromatográficas utilizadas para quantificação da carajurina em extratos

de A. chica. .......................................................................................................................... 97

Tabela 4.4 Média do total dos vouacapanos m/z 362 e m/z 404 liberado em microgramas por

centímetro quadrado (µg/cm2) por tempo (dias).................................................................. 105

Lista de Abreviaturas e Siglas

Abreviações

3D Tridimensional

ANOVA Análise de variância

MEC Matriz extracelular

PCL Poli (ε-caprolactona)

PR Polirotaxano

PLGA Poli (ácido lático-co- ácido glicólico)

PLA Poli (ácido láctico)

PLLA Poli (L-ácido láctico)

RTG Regeneração tecidual guiada

TG Transição vítrea

TGA Termogravimetria

CDs Ciclodextrinas

UV Ultravioleta

OH Hidroxilas

DP Desvio padrão

µm Micrômetro

nm Nanômetro

mm Milímetro

≅ Igual aproximadamente

NIH National Institute of Health

3T3 3-day transfer, inoculum 3 x 105 cells

NIH 3T3 Swiss mouse embryo cultures

HPLC Cromatografia liquida de alta performance

PEG Polietilenoglicol

PTFE Politetrafluoretileno

MEV Microscopia eletrônica de varredura

PBS Phosphate buffered saline

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

RPMI

1640

Roswell Park Memorial Institute

m/z

Massa molecular nominal

Siglas

ASTM American Society for Testing and Materials

FDA Food and Drug Administration

IUPAC União Internacional de Química Pura e Aplicada

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 24

Objetivos .................................................................................................................. 27

1.1.1 Objetivo geral ................................................................................................... 27

1.1.2 Objetivos específicos......................................................................................... 27

Referências Bibliográficas ........................................................................................ 28

2. Desenvolvimento e fabricação de membranas de policaprolactona (pcl) e

polirotaxano (pr) pelo processo de eletrofiação: estudo com caracterização e

avaliação in vitro e in vivo. ..................................................................................... 29

Introdução ................................................................................................................ 30

Material e Métodos ................................................................................................... 33

2.2.1 Material ............................................................................................................ 33

2.2.2 Eletrofiação ...................................................................................................... 33

2.2.3 Caracterização ................................................................................................. 34

2.2.3.1 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) para as membranas ...........................................34

2.2.3.2 Ângulo de contato ................................................................................................................35

2.2.3.3 Porosimetria por intrusão de mercúrio .................................................................................35

2.2.4 Ensaios in vitro ................................................................................................. 36

2.2.4.1 Esterilização das membranas ................................................................................................36

2.2.4.2 Cultura celular ......................................................................................................................36

2.2.4.3 Ensaio de viabilidade celular .................................................................................................36

2.2.5 Ensaio in vivo ................................................................................................... 37

2.2.5.1 Eutanásia e amostras de fixação ...........................................................................................38

2.2.5.2 Preparação de amostras para análises de raios X e de imagem .............................................38

2.2.5.3 Preparação e análise histológica ...........................................................................................39

Resultados e Discussões ........................................................................................... 40

2.3.1 Microscopia eletrônica de Varredura (MEV) .................................................... 40

2.3.2 Ângulo de contato ............................................................................................. 41

2.3.3 Porosimetria ..................................................................................................... 42

2.3.4 Ensaios biológicos ............................................................................................ 44

2.3.4.1 Viabilidade Celular – Ensaio in vitro ......................................................................................44

2.3.5 Ensaio in vivo ................................................................................................... 45

2.3.5.1 Características pós-operatório in vivo ...................................................................................45

2.3.5.2 Análise das imagens radiográficas ........................................................................................46

2.3.5.3 Análise Histomorfológica ......................................................................................................48

2.3.5.3.1 Período de 7 dias .............................................................................................................48

2.3.5.3.2 Período de 14 dias ...........................................................................................................48

2.3.5.3.3 Período de 21 dias ...........................................................................................................48

2.3.5.3.4 Período de 42 dias ...........................................................................................................49

2.3.5.4 Análise histomorfométrica ...................................................................................................51

Conclusão................................................................................................................. 55

Referências Bibliográficas ........................................................................................ 56

Anexo A .............................................................................................................................. 60

3. Influência do alinhamento de fibras eletrofiadas de poli (ε-caprolactona )

pcl e os efeitos biológicos em ensaio de estiramento celular em fibroblastos . 61

Introdução ................................................................................................................ 62


3.2.1 Materiais .......................................................................................................... 66

3.2.2 Eletrofiação ...................................................................................................... 66

3.2.3 Caracterização das membranas ........................................................................ 67

3.2.4 Preparação das amostras ................................................................................. 67

3.2.5 Esterilização das membranas............................................................................ 68

3.2.6 Cultura celular – Fibroblastos 3T3 ................................................................... 68

3.2.7 Ensaio de estiramento (stretch) cíclico uniaxial ................................................ 69

3.2.8 Morfologia celular – Microscopia confocal ...................................................... 70


3.3.1 Microscopia eletrônicade varredura – MEV ..................................................... 71

3.3.2 Ensaios biológicos ............................................................................................ 74

3.3.2.1 Caracterização morfológica dos fibroblastos – Teste estático ................................................74

3.3.2.2 Caracterização morfológica dos fibroblastos – Ensaio de estiramento (Stretching) ................78

Conclusão................................................................................................................. 82

Referências Bibliograficas ........................................................................................ 83

4. Desenvolvimento de membranas poliméricas obtidas pelo processo de

eletrofiação com associação de pterodon pubescens benth e arrabidaea chica

verlot para aplicação em regeneração tecidual guiada ....................................... 89

Introdução ................................................................................................................ 90


4.2.1 Preparo das soluções ........................................................................................ 92

4.2.2 Eletrofiação ...................................................................................................... 93

4.2.3 Caracterização ................................................................................................. 93

4.2.3.1 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) para as membranas ...........................................93

4.2.3.2 Ângulo de contato ................................................................................................................93

4.2.4 Ensaio de liberação do extrato vegetal ............................................................. 94

4.2.5 Análise por HPLC ............................................................................................ 95

4.2.5.1 Condições cromatográficas para P. pubescens ......................................................................96

Coluna ................................................................................................................................. 96

4.2.5.2 Condições cromatográficas para A. chica ..............................................................................96

Coluna ................................................................................................................................. 97

4.2.6 Ensaio in vitro .................................................................................................. 97

4.2.6.1 Ensaio de viabilidade e proliferação celular ..........................................................................97

4.2.7 Teste estatístico ................................................................................................ 98


4.3.1 Caracterização das membranas ........................................................................ 99

4.3.1.1 Microscopia eletrônica de Varredura (MEV) .........................................................................99

4.3.1.2 Ângulo de contato .............................................................................................................. 100

4.3.2 Ensaio de liberação dos extratos vegetais ....................................................... 102

4.3.3 Ensaio de viabilidade celular .......................................................................... 111

4.3.4 Ensaio de proliferação celular ........................................................................ 113

Conclusão............................................................................................................... 116

Conclusões finais.................................................................................................... 117

Sugestões para trabalhos futuros ............................................................................. 119

Referências Bibliográficas ...................................................................................... 120

24

1. INTRODUÇÃO

Engenharia de tecido é um campo multidisciplinar e abrange áreas da medicina clínica,

engenharia mecânica, ciência dos materiais, dentre outras (O’Brien, 2011; Singh et al, 2016).

O campo de pesquisa em engenharia tecidual tem como intuito desenvolver métodos e

dispositivos que possam promover qualidade de vida através de terapias que preservem,

melhorem e/ou restaurem as funções teciduais (Singh et al. 2016).

O desafio deste trabalho foi desenvolver, utilizando o processo de eletrofiação,

membranas poliméricas biocompatíveis que possibilitam a regeneração tecidual guiada, o

crescimento celular em tecidos submetidos a solicitações mecânicas cíclicas e possuam a

capacidade de liberação controlada de princípios ativos vegetais.

O processo de eletrofiação é um método de fabricação de membranas com fibras

poliméricas em escala micro e nanométricas a partir de polímeros biorreabsorvível como poli

(ε-caprolactona) (PCL) e polirotaxano (PR) (Zhao et al. 2016). No caso de aplicações

biomédicas, o uso de membranas eletrofiadas de polímeros biorreabsorvível, como poli (L-

ácido láctico) (PLLA), poli (L-lactideco-glicolido) (PLGA), celulose, gelatina, colágeno e

quitosana (Moheman et al. 2016; Nune et al. 2016), tem encontrado grande potencial em várias

aplicações, como pode ser constatado em diversos estudos na literatura (Chew et al, 2006;

Kulkarni et al, 2010; Guimarães et al, 2015; Moheman et al, 2016; Nune et al, 2016).

As membranas obtidas pelo processo de eletrofiação possuem estrutura fibrosa com

elevada área superficial em relação ao volume, alta porosidade e poros interconectados e,

portanto, apresentam semelhança com a matriz extracelular (MEC), o que pode proporcionar

aumento na adesão, proliferação e crescimento de células (Meng, et al. 2010). As aplicações

destas membranas em regeneração tecidual podem promover o reparo da região a ser

regenerada, podendo ser espontânea ou induzida, como por exemplo, quando associado com

extratos vegetais como a Arrabiadaea chica e/ou Pterodon pubescens, que apresentam

atividade cicatrizante e antiinflamatória, respectivamente.

Assim, nesta tese foram desenvolvidas membranas de PCL e blenda de PCL/PR, com

arquiteturas e morfologias diferentes. Este trabalho foi divido em 3 estudos distintos, onde cada

25

um deles teve como foco estudar um determinado aspecto na obtenção e/ou aplicações das

membranas desses polímeros e blenda. Estes estudos correspondem aos Capítulos 2 a 4 desta

tese e são apresentados na forma de artigos, pois correspondem a manuscritos submetidos e em

preparação para submissão em revistas indexadas.

No primeiro estudo (capítulo 2), blendas de PCL/PR foram fabricadas visando

aplicações em regeneração tecidual guiada (RTG), que são cada vez mais utilizadas na

odontologia moderna para tratamento de reparação de tecidos ósseos perdidos ou danificados.

O sistema PCL/PR foi caracterizado e a sua citotoxicidade foi avaliada em um modelo de

cultura fibroblástica, bem como o seu comportamento biológico em um experimento de defeito

ósseo de tamanho crítico em calvária de rato Wistar. Neste estudo foi apresentado pela primeira

vez na literatura resultados inéditos de blendas de PCL/PR eletrofiadas visando aplicações

biomédicas.

No capítulo 3 consiste no estudo de fibras de PCL com orientações aleatória e alinhada

que foram obtidas pelo processo de eletrofiação, com o intuito de compreender a influência do

alinhamento das fibras e de estímulo mecânico cíclico na resposta celular, visando aplicações

em tecido que recebem solicitações mecânicas cíclicas, tais como o menisco do joelho e

músculos. As fibras foram incorporadas às células de fibroblastos 3T3. As estruturas foram

estudadas sob condições estática em períodos de 1, 3 e 7 dias e de alongamento cíclico de 10%

a frequência de 1 Hz com duração de 6 horas.

Finalmente, no capítulo 4 é apresentado um estudo onde foram obtidas membranas de

PCL associada com os extratos vegetais de Pterodon pubescens Benth (Sucupira) e/ou

Arrabidaea chica Verlot, que apresentam atividade antiinflamatória e cicatrizante,

respectivamente. Foi analisada a capacidade das membranas de liberarem princípios ativos

vegetais, com as referidas atividades biológicas sendo esses extratos utilizados pela primeira

vez em associação, assim estas membranas foram patenteadas (Número do registro no INPE:

BR 10 2016 028506 2).

No capítulo 5 e 6, respectivamente, uma conclusão geral sobre os três estudos

desenvolvidos neste trabalho e sugestões para trabalhos futuros fundamentados pelos resultados

obtidos nesta tese são apresentados.

Portanto, através destes estudos, foi possível apresentar novas estruturas e aspectos

relevantes acerca das membranas de PCL e PR para aplicações na área de engenharia tecidual

26

guiada, como suporte para crescimento celular em tecidos que são submetidos a solicitações

mecânicas cíclicas e na capacidade de liberação de princípios ativos vegetais. Pode-se então

constatar que os estudos contidos nesta tese contribuem para pesquisas relacionadas ao

processamento e desenvolvimento de novos materiais visando aplicações nas áreas médicas e

odontológicas, utilizando membranas poliméricas biocompatíveis obtidas pelo processo de

eletrofiação.

27

Objetivos

1.1.1 Objetivo geral

Obter e caracterizar membranas poliméricas de PCL e PR que possuam capacidades

biológicas para aplicações em engenharia tecidual.

1.1.2 Objetivos específicos

Determinar os parâmetros de processamento adequados para a obtenção das membranas

poliméricas de PCL e PR em suas diferentes composições.

Caracterizar as propriedades das membranas obtidas pelo processo de eletrofiação.

Avaliar o aspecto topográfico das membranas de PCL-R (membranas com fibras

aleatórias) e PCL-A (membranas com fibras alinhadas) em relação a morfologia celular.

Analisar o potencial mecânico cíclico e a orientação das fibras aleatórias e alinhadas em

relação a morfologia celular.

Associar extratos vegetais, de Pterodon pubescens Benth (Sucupira) e/ou Arrabidaea

chica em membranas poliméricas de PCL para aplicações em regeneração tecidual.

Analisar a capacidade das membranas eletrofiadas de PCL para liberação in vitro dos

extratos vegetais Pterodon pubescen e Arrabidaea chica.

Observar a influência dos extratos vegetais no crescimento e proliferação de

fibroblastos.

Verificar o potencial das membranas de PCL/PR in vitro e in vivo, para serem aplicadas

nas áreas médicas e odontológicas.

28

Referências Bibliográficas

Chew, S. Y., Mi, R., Hoke, A., Leong, K.W. The effect of the alignment of electrospun

fibrous scaffolds on Schwann cell maturation. Biomaterials, 29(6), pp.653–661, 2008.

Guimarães, P. P. G., Oliveira, M. F., Gomes, A. D. M., Gontijo, S. M. L., Cortés, M. E.,

Campos, P. P., Vianad, C.T.R., Andrade, S.P., Sinisterra, R. D. PLGA nanofibers improves the

antitumoral effect of daunorubicin. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 136, pp.248–255,

2015.

Kulkarni, A., Bambole, V. a. & Mahanwar, P.A. Electrospinning of Polymers, Their

Modeling and Applications. Polymer-Plastics Technology and Engineering, 49(January 2013),

pp.427–441, 2010.

Meng, Z. X., Wang, Y. S., Ma, C., Zheng, W., Li, L., & Zheng, Y. F. Electrospinning

of PLGA / gelatin randomly-oriented and aligned nano fi bers as potential scaffold in tissue

engineering, 30, pp.1204–1210, 2010.

Moheman, A., Sarwar, M. & Mohammad, A., 2016. Recent trends in electrospinning of

polymer nano fibers and their applications in ultra thin layer chromatography, 229, pp.1–24.

Nune, M., Krishnan, U.M. & Sethuraman, S., 2016. PLGA nano fi bers blended with

designer self-assembling peptides for peripheral neural regeneration. , 62, pp.329–337.

O’Brien, F.J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. March

2011, 14, Number 3.

Singh, R. S., Kaur, N., Rana, V., & Kennedy, J. F. Recent insights on applications of

pullulan in tissue engineering. Carbohydrate Polymers, 153, pp.455–462, 2016.

Zhao, W., Li, J., Ji, K., Liu, W., Qiu, X., & Li, C.. Fabrication of functional PLGA-

based electrospun scaffolds and their applications in biomedical engineering. Materials Science

and Engineering C, 59, pp.1181–1194, 2016

29

2. Desenvolvimento e fabricação de membranas de policaprolactona (PCL) e

polirotaxano (PR) pelo processo de eletrofiação: estudo com caracterização

e avaliação in vitro e in vivo.

Resumo

A eletrofiação é reconhecida como uma técnica para produzir fibras poliméricas que apresentam

várias vantagens, tais como alta área superficial, alta porosidade e similaridade física com a

morfologia da matriz extracelular (MEC). Sabe-se que a hidrofilicidade da matriz extracelular

é um fator importante que afeta a adesão das células. A fim de melhorar a hidrofilicidade das

membranas fibrosas eletrofiadas de poli (ε-caprolactona) (PCL), o polímero poli (rotaxano)

(PR) foi utilizado com PCL e fibras eletrofiadas dessa blenda foram obtidas a partir de soluções

poliméricas. A citotoxicidade das membranas de PCL/PR foi avaliada in vitro em células NIH-

3T3 durante 24 horas. Além disso, a avaliação in vivo foi realizada através da implantação da

mesma em 8 mm de diâmetro de defeito crítico de calvária 40 ratos Wistar machos. Dois grupos

foram estudados: no primeiro grupo os defeitos da calvária foram cobertos com membranas

PCL/PR, enquanto que no segundo grupo os defeitos da calvária permaneceram descobertos,

onde apenas o coágulo de sangue ocupou o defeito. Os animais foram eutanasiados aos 7, 14,

21 e 42 dias pós-operatórios. Os espécimes foram radiografados e preparados para análise

histológica. Os resultados sugerem que a membrana eletrofiada de PCL/PR é um biomaterial

que é adequado para aplicações futuras em regeneração tecidual guiada, onde pode se

incorporar materiais funcionais, tais como agentes antibacterianos, extratos vegetais e fatores

de crescimento.

Palavras-chave: regeneração óssea, cicatrização de feridas, eletrofiação, polímero.

30

Introdução

A engenharia tecidual consiste no desenvolvimento de novos dispositivos utilizando

biomateriais (Kulkarni et al. 2010), que fornecem alternativas eficazes para o tratamento de

doenças graves, cujo transplante ou enxerto sejam as únicas opções. As técnicas de regeneração

tecidual guiada (RTG) são cada vez mais utilizadas no tratamento de defeitos periodontais, na

reconstrução de tecido ósseo perdido, danificado e atrofiado, em procedimentos de implantes

dentários ou na preservação de cavidades alveolares após a extração dentária (Sela & Sela

1995). Geralmente, as membranas poliméricas utilizadas na RTG são divididas grosseiramente

em bioabsorvíveis e não reabsorvíveis, onde em ambos os casos devem ter as seguintes

propriedades: biocompatibilidade, manutenção no espaço de implantação, adaptação à área de

uso, flexibilidade e cobertura ótima do defeito tecidual (Xue et al. 2015; Wang et al. 2016)

Eletrofiação é um processo de fabricação utilizado para obter fibras com diâmetros na

faixa micrométrica a nanométrica. Esta técnica permite obter fibras com grande potencial para

uma variedade de aplicações biomédicas, tais como scaffolds (estruturas tridimensionais

porosas), membranas fibrosas para administração controlada de fármacos, regeneração guiada

de tecidos (GTR), materiais adsorventes, entre outros (Garg et al. 2014; Ghorani & Tucker,

2015). Assim, há uma ampla gama de potenciais aplicações de tais membranas em periodontia

e implantologia oral, uma vez que as membranas poliméricas podem atuar como uma barreira,

o que ajuda a prevenir a migração do tecido epitelial para a área defeituosa, permitindo tempo

suficiente para regeneração óssea, cemento e ligamento periodontal (Wang et al. 2016). Tais

membranas atuam na retenção do coágulo sanguíneo e proporcionam um ambiente seguro à

migração de células indesejadas, o que pode comprometer a reparação óssea (Oster et al. 2015).

A partir de pesquisas no campo da bioengenharia foram desenvolvidas várias membranas não

reabsorvíveis e reabsorvíveis para uso em GTR (Annen et al. 2011). Estes estudos visaram

melhorar as limitações das barreiras clássicas não reabsorvíveis de politetrafluoroetileno

expandido (ePTFE), que apresenta desvantagens, tais como o risco de remoção prematura do

implante e a necessidade de um segundo estágio cirúrgico para a remoção do implante (Nyman

et al. 1982). Para ultrapassar algumas destas limitações, as membranas poliméricas de

PLGA/PGA mostraram ser tão eficientes como o ePTFE, contudo, a sua degradação hidrolítica

associada à reabsorção de parte do osso regenerado pode comprometer a resposta do hospedeiro

31

(Nyman et al. 1982; Al-nawas et al. 2009). As membranas de colágeno apareceram como um

substituto natural que poderia promover a integração de tecidos e o transporte de nutrientes. No

entanto, a rápida degradação por atividade enzimática de macrófagos e leucócitos

polimorfonucleares, reduz substancialmente a resistência mecânica levando ao colapso da

membrana (Annen et al. 2011). Assim, para a obtenção de membranas adequadas a serem

utilizadas como barreira física, foram estudados neste trabalho, polímeros utilizados em

aplicações biomédicas, PCL e PR, e seu comportamento biológico por meio de uma blenda

polimérica eletrofiada sendo avaliado em modelo de regeneração óssea guiada.

A poli (ε-caprolactona) (PCL) é um polímero sintético semicristalino biorreabsorvível

com boa biocompatibilidade e flexibilidade. É um polímero hidrofóbico com alta resistência

mecânica e baixa citotoxicidade. PCL é aprovado pela Food and Drug Administration (FDA)

para uso como biomaterial (Woodruff & Hutmacher, 2010). As aplicações biomédicas deste

polímero são diversas, tais como liberação controlada de fármacos e engenharia de tecidos em

tecidos epidérmicos, musculares, ósseos e cartilaginoso (Gautam et al. 2013).

Poli (rotaxano) (PR) é um polímero com arquitetura topológica supramolecular, com a

inclusão de múltiplas moléculas cíclicas (por exemplo, α-ciclodextrinas) em um polímero linear

(por exemplo, polietilenoglicol, PEG) e as extremidades da cadeia bloqueadas com grupos

volumosos (adamantanaminas) (Lipatova et al. 1982; Scientific et al. 2001). As ciclodextrinas

(CDs) são oligossacáridos cíclicos formados por moléculas de D-glicose ligadas entre si através

de ligações (α-1, 4), são cristalinos, homogêneos e não higroscópicos. Suas moléculas têm

grupos hidroxilas primárias anulares na parte mais estreita do cone, enquanto que os grupos

hidroxilas secundárias estão na parte mais larga do cone. Assim, os grupos hidroxilas na

extremidade tornam as ciclodextrinas hidrofílicas e solúveis em água (Wang et al. 2012). Este

material tem excelentes propriedades de elasticidade e dilatação, o que é atraente para várias

aplicações no campo biomédico, tal como no sistema de liberação de fármaco bioativo e

hidrogéis biocompatíveis (Lipatova et al. 1982; Araki & Ito, 2007; Gong et al. 2015).

No presente estudo, membranas fibrosas de PCL e PCL/PR foram obtidas por

eletrofiação visando futuras aplicações na regeneração de tecidos. Até onde sabemos, não foram

relatados na literatura estudos de blendas de PCL/PR eletrofiadas visando aplicações

biomédicas.

32

O objetivo deste estudo foi obter pelo método de eletrofiação, membranas de PCL puro

e membranas de blendas de PCL com polirotaxano (PCL/PR). Assim, analisando

comparativamente algumas das características micromorfológicas, o comportamento in vitro

das fibras pura e de sua blenda, além de verificar o efeito da blenda de PCL/PR na recuperação

de um defeito ósseo crítico in vivo.

33

Material e Métodos

2.2.1 Material

Neste trabalho foram utilizados PCL com massa molecular de 80000 g/mol (Sigma

Aldrich®), PR com massa molecular 496000 g/mol e índice de hidroxila de 71 mg KOH/g, que

foi gentilmente fornecido pela UBE, sendo um material de grau não-comercial. Os solventes

utilizados foram clorofórmio (Merck, Alemanha) e acetona (Synth-Brasil).

O clorofórmio e a acetona foram misturados em proporções em peso (1:1) e as soluções

de polímero foram obtidas por adição de PCL e PR (1:1). As soluções foram agitadas

magneticamente durante 2 horas a 23 °C. Todas as soluções foram eletrofiadas no mesmo dia

de preparação.

2.2.2 Eletrofiação

O sistema de eletrofiação utilizado neste estudo consistiu de uma seringa de 10 mL e

utilizando agulhas com diâmetro de 0,55 a 0,7 mm, uma bomba de infusão (kdScientific,

modelo KDS-100), uma fonte de alta tensão (Testtech) e uma placa coletora aterrada. Soluções

foram eletrofiadas a 23ºC com tensões de 15 a 20 kV e vazões de 1 a 5 mL/h. A Tabela 2.1

mostra os parâmetros de eletrofiação utilizados neste trabalho. Figura 2.1 mostra uma foto do

equipamento de eletrofiação utilizado neste trabalho.

Tabela 2.1: Parâmetros de eletrofiação

Parâmetros PCL PCL/PR

Vazão (mL/h) 1 5

Voltagem (kV) 15 20

Diâmetro da agulha (mm) 0,55 0,7

Distância (cm) 10 20

34

Figura 2.1: Equipamento de eletrofiação. A) Bomba infusora; B) Placa coletora; C)

Fonte de alta tensão.

2.2.3 Caracterização

2.2.3.1 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) para as membranas

A morfologia das fibras obtidas a partir das soluções eletrofiadas neste estudo foi

avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) utilizando um equipamento ZEISS

(Modelo Evoma-15). As amostras foram fixadas em suporte metálico com fita dupla face de

carbono e revestidas em ouro, utilizando um equipamento Sputter Coater, Bal-Tec (Modelo

SCD-O5O). Os diâmetros médios das fibras foram determinados por análise das imagens de

MEV, utilizando o programa de análise de imagens ImageJ®, onde foram medidos os diâmetros

de 50 fibras de cada amostra escolhidas aleatoriamente, valores médios e desvios-padrão foram

obtidos.

35

2.2.3.2 Ângulo de contato

O ângulo de contato foi medido para avaliar o caráter hidrofílico das membranas

eletrofiadas. Foi utilizado um microscópio óptico Hitachi com o software Axio s40 V4.8.2.0®.

Gotas de água deionizada (5,0 µL) foram colocadas sobre a superfície da amostra, utilizando

uma pipeta (Transferpette®). Todas as medições foram realizadas a 25 ± 3 °C com uma umidade

relativa de 40 ± 4%. Os ângulos de contato foram medidos usando o programa ImageJ® 1.47v

com o plugin Análise Drop (LB-ADSA®). Três medições foram realizadas para cada grupo de

amostras e valores médios e desvios-padrão foram obtidos. Após a coleta dos dados e a

categorização das variáveis, foi realizada a transferência dos valores para o Programa GraphPad

Prism 5®. As análises estatísticas dos resultados foram analisadas, aplicando-se os testes

estatísticos Análise de Variância (Anova) e Comparação múltipla com o teste de Tukey.

Considerou-se o nível de significância de 5%, ou seja, os dados foram estatisticamente

significativos para p <0,05.

2.2.3.3 Porosimetria por intrusão de mercúrio

As determinações de porosimetria por intrusão de mercúrio foram realizadas em

equipamento AutoPore IV – Micromeritics, de acordo com o procedimento descrito pela norma

ISO 15901-1/ 2005. O volume de mercúrio que penetra na amostra é função de pressão

hidrostática aplicada, que é relacionada ao diâmetro dos poros pela equação de Washburn (dp =

-4.γ.cosθ / P).

As medidas foram efetuadas com leitura gradual para cada pressão aplicada (modo

stepwise), na amostra previamente seca.

36

2.2.4 Ensaios in vitro

2.2.4.1 Esterilização das membranas

As membranas eletrofiadas de PCL e sua respectiva blenda (PCL/PR) foram

esterilizadas com radiação ultravioleta (UV) em ambos os lados, durante 30 min cada (Gautam,

et al. 2013). A radiação UV tem sido utilizada para reduzir a microbiota nos materiais e uma

alternativa para a inativação microbiana (Li et al, 2007; Artemenko et al, 2012; Gautam et al.

2013). O UV na faixa de 210 a 330 nm são eficientes como germicidas por serem absorvidos

por proteínas e ácidos nucleicos, fazendo a ruptura dos cromossomas, mutações genéticas,

inativação de enzimas e, consequentemente, a morte celular (Elmnasser et al. 2007).

2.2.4.2 Cultura celular

Neste trabalho foi utilizada linhagem estabelecida BALB/c NIH-3T3 (fibroblasto

murino). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro

fetal bovino (SFB) e 1% de antibiótico (penicilina e estreptomicina). As células foram

plaqueadas em garrafas de 75 cm² na densidade de 2x104 células/mL e incubadas a 37°C sob

atmosfera úmida com 5% de CO2.

2.2.4.3 Ensaio de viabilidade celular

Ensaio de viabilidade celular através da redução do MTT (3-brometo de (4,5-dimetil-2-

tiazolil)-2,5-difenil-tetrazólio).

Nesse ensaio, a viabilidade celular foi avaliada através da medida da capacidade das

células de reduzir o MTT (3-brometo de (4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-tetrazólio) a

formazan. O formazan é um pigmento insolúvel que é extraído das células e quantificado

espectrofotometricamente em =570 nm. A redução do MTT é catalisada principalmente pelas

37

desidrogenases mitocondriais e também do citoplasma. Portanto, a alteração da função

mitocondrial poderá ser detectada através da variação da capacidade de redução do MTT

(Mosmann, 1983).

As células foram plaqueadas na densidade de 6 x 104células/mL em placas de 24 poços

que já continham lamínulas com ou sem biomaterial a ser estudado. Posteriormente, foram

incubadas a 37ºC, 5% de CO2 por 24h. Após 24h de incubação, o meio foi removido, os poços

foram lavados com tampão fosfato salino (PBS) e adicionado no meio sem soro contendo o

corante MTT (0,5 mg/mL). Após incubação por 3h a 37ºC, o meio foi retirado cuidadosamente

e adicionado 100 L de etanol para solubilização do formazan. As placas foram agitadas por 5

minutos e a absorbância correspondente a cada poço foi lida no leitor de placas em = 570 nm.

Os valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao controle, onde

as células não foram expostas aos agentes testes (Mosmann, 1983).

2.2.5 Ensaio in vivo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a Care

International e Uso de Animais de Laboratório, sendo aprovados pelo Comitê de Ética

Institucional para Pesquisa Animal (CEP FOUSP No. 20/2013) (ver anexo I) Os ensaios em

animais foram realizados na Universidade de São Paulo - USP, campus São Paulo, na Faculdade

de Odontologia no Departamento de Cirurgia Odontológica e Bucomaxilofacial.

Quarenta e um Rattus norvegicus, albinus, ratos Wistar (Centro Experimental Animal,

ICB, Intituto de Ciências Biomédicas, São Paulo, Brasil), pesando cerca de 200 a 250g, foram

submetidos à cirurgia sob anestesia geral com injeção intramuscular de 0,8 mg / kg de peso

corporal (pc) de cloridrato de cetamina (Dopalen®, Vetbrands, São Paulo, Brasil) e 0,3 mg / kg

de peso corporal de cloridrato de xilazina. Todos os animais também receberam profilaxia com

antibióticos via injeção intramuscular com 150.000 UI/Kg de peso corporal de benzilpenicilina

benzatina (Roche Brasil, São Paulo, Brasil). O acesso a calota craniana do animal através de

uma incisão foi retilíneo na pele da área média do crânio, seguida por uma divisão lateral do

tecido subcutâneo, músculo temporal e periósteo. O defeito ósseo foi feito com uma trefina de

aço (8 mm de diâmetro; SIN®, São Paulo, Brasil), que foi adaptado para uma peça de mão

38

dentária na broca implante (600 baby®, Driller, São Paulo, Brasil) em baixa velocidade. Os

defeitos foram feitos sob irrigação constante de solução salina. Finalmente, a pele foi suturada

com fio de sutura de seda 3-0 (Ethicon, Somerville, NJ, EUA). Após a cirurgia, os animais

foram divididos aleatoriamente em dois grupos. Defeitos no grupo de teste (n = 21) receberam

uma cobertura de membrana de PCL/PR. Defeitos no grupo controle (n = 20) não tem cobertura

por qualquer membrana e foram preenchidas apenas por coágulo de sangue. Todos os animais

foram mantidos em gaiolas de plástico individuais com dieta padrão (Labina®, Purina, São

Paulo, Brasil) e água ad libitum.

2.2.5.1 Eutanásia e amostras de fixação

Os animais de cada grupo por período experimental foram eutanasiados numa câmara

de CO2 a 7, 14, 21, e 42 dias após a operação. Após a eutanásia, os crânios foram dissecados e

amostras, incluindo a região com defeito em conjunto das calvárias foram imediatamente

fixados em solução tamponada formalina a 10% para imagens de raios X e procedimentos de

preparação histológicos.

2.2.5.2 Preparação de amostras para análises de raios X e de imagem

Antes do processamento laboratorial para análise histológica, todas as amostras

cirúrgicas foram radiografadas. As imagens de raios X foram obtidas em filme dental periapical

(Kodak Insight, Eastman Kodak Co. EUA), utilizando um raio X odontológico (Timex 70E,

Gnatus® São Paulo, Brasil). Todas as radiografias foram obtidas de uma forma padronizada,

utilizando uma distância focal de 4,5 cm e um tempo de exposição de raios X de 3,2 segundos.

Os filmes de raio-X de todas as amostras foram desenvolvidos em conjunto, de acordo com

critérios padronizados de tempo e temperatura. A análise de raios X foram cegos para as

designações de grupo e consistiu de medida da área do defeito ósseo radiotransparente usando

ImageJ® (NIH, Bethesda, Maryland, EUA).

39

2.2.5.3 Preparação e análise histológica

Para preparar as seções histológicas as amostras foram embebidas em solução de EDTA

(ethylenediaminetetraacetic acid) a 7,4% m /M pH 10 durante 6 semanas por descalcificação

do tecido ósseo. A área do defeito foi seccionada exatamente no plano sagital meio de calvária,

resultando em duas partes para a ferida: os lados esquerdo e direito. Cada lado foi incluído em

seu próprio bloco de parafina. Em seguida, quatro seções parassagitais de 4,5 mícrons de

espessura foram coradas com hematoxilina e eosina.

Os cortes histológicos foram acessados cegamente por um patologista usando um

microscópio de luz convencional (DM5000, Leica Microsystems, Alemanha) em 40X de

objetiva de ampliação. Os aspectos histomorfológicas de reparação óssea focada principalmente

na presença de infiltrado inflamatório, tecido de granulação, necrose, vasos recém-formados e

formação de osso novo. A análise histomorfométrica foi executada para quantificar a área de

formação de novo osso em cortes histológicos aleatórios a partir de ambos os lados do defeito

(direito e esquerdo) em três regiões distintas da ferida: dois na borda lateral e um no centro do

defeito. As imagens de cada área da secção histológica foram digitalizadas e transferidas para

um software de morfometria digital (ImageJ, NIH). As medidas foram realizadas em quatro

seções histológicas de cada lado. A área total de formação de osso novo em cada lado foi

calculada pela soma da área obtida em cada campo. Este valor foi então somado ao obtido a

partir do outro lado. No final, obteve-se a média do total da área de formação de osso novo para

cada grupo e período experimental.

40

Resultados e Discussões

2.3.1 Microscopia eletrônica de Varredura (MEV)

A Figura 2.2 apresenta as imagens de MEV das membranas eletrofiadas de PCL e

PCL/PR e as distribuições de diâmetro das fibras. Observa-se que os diâmetros das fibras estão

na escala de micrômetros e foram obtidas com sucesso pelo processo de eletrofiação. Nota-se

que as membranas são altamente porosas sem a presença de defeitos, como pérolas ou beads.

De acordo com (Zhu et al. 2008), esta morfologia pode promover boa adesão e diferenciação

de células na membrana e, regeneração do tecido danificado.

Figura 2.2: Micrografia das fibras eletrofiadas (A) PCL e (C) PCL/PR e os respectivos

histogramas de distribuição dos diâmetros das fibras das membranas (B) PCL e (D) PCL /

PR.

Ambas as membranas de PCL (Fig. 1A) e PCL/PR (Fig. 1C) apresentaram morfologias

semelhantes, caracterizada como uma manta de não tecido, com alta dispersão de diâmetros. O

41

diâmetro médio da fibra de PCL (Fig. 1B) e PCL/ PR (Fig. 1D) foram de 2,5 (± 0,88) e 2,3 µm

(± 0,82) µm, respectivamente. Por conseguinte, as amostras não são estatisticamente diferentes

em relação ao diâmetro da fibra.

2.3.2 Ângulo de contato

O ângulo de contato de PCL e PCL/PR foram 131,58o ± 0,74o and 108,45o ±3,72o,

respectivamente. Este resultado mostra que a presença de PR aumentou a hidrofïlicidade da

membrana, demonstrado por uma diminuição de 18% no ângulo de contato médio, o que pode

ser observado na Figura 2.3. O valor médio para PCL foi comparável aos relatados por outros

autores, com valores variando de 118º ± 6 a 124º ± 3 ( Lipatova et al. 1982; Meng, Zheng, et

al. 2010; Gautam et al. 2013).

O PCL é um polímero amplamente utilizado em aplicações biomédicas e o uso do PR

para formar blendas com PCL são interessantes devido às possibilidades de melhorar as

propriedades mecânicas e de superfície, pois a presença de grupos hidroxilas das ciclodextrinas

(α-CDs) permite a funcionalização de polímeros inertes. De maneira geral, a CDs tem o papel

de molécula “hospedeira” (Fett 1999; Fraceto et al. 2007), pois apresentam cavidade

hidrofóbica e superfície hidrofílica, devido à presença em sua estrutura de grupos hidroxilas

(OH) primários e secundários orientados para o exterior (Fett 1999; Fraceto et al. 2007). Estes

grupos podem melhorar as propriedades físicas e biológicas para liberação de fármacos, tais

como estabilidade, aumentar a solubilidade do fármaco hidrofóbico em meio aquoso e/ou

biodisponibilidade ( Li et al, 2011; Jiang et al, 2013). Assim, a abundância de grupos funcionais

(OH) nas CDs facilita a capacidade dos PR de transportar uma grande dose de fármacos

hidrofóbicos (Jiang et al, 2013). O aumento da hidrofilicidade da membrana da blenda PCL/PR

em comparação à membrana de PCL, indica que a blenda pode promover uma melhora na

adesão celular (Wan et al. 2003; Webb et al. 2009).

42

Figura 2.3: Ângulo de contato: Gotas de água destilada sobre as membranas poliméricas

A) PCL; B) PCL/PR

2.3.3 Porosimetria

A porosimetria de mercúrio é uma técnica que caracteriza o tamanho e a quantidade de

poros. O teste de porosimetria foi realizado somente na membrana de PCL/PR devido a

disponibilidade do equipamento. Porém, conforme apresentado na Figura 2.4, devido à

membrana de PCL ser morfologicamente similar à membrana de PCL/PR, sugere-se que a

porosidade de ambas as membranas são semelhantes. Ainda, como a membrana de PCL/PR

apresentou-se mais hidrofílica, esta membrana foi escolhida para ser utilizada nos testes in vivo.

A Tabela 2.2 apresenta os resultados de porosidade da membrana de PCL/PR, onde se

verifica a presença de poros com diâmetros médios de 4,5 µm e uma área total dos poros de

0,954 m2/g. Pela Figura 2.4, que apresenta a curva de distribuição de poros, pode-se observar

um pico largo e definido na faixa de 1000 a 10000 nm, que representa uma homogeneidade no

tamanho do diâmetro dos poros. De acordo com a União Internacional de Química Pura e

Aplicada (IUPAC) a membrana analisada apresenta macroporos, pois apresenta poros maiores

que 0,05 µm e menores que 7,5 µm. A porosidade da membrana foi de 39%. No entanto, a

porosidade e o tamanho dos poros podem variar dependendo do grau de interligação das fibras,

tornando as membranas mais densas (Ionescu & Mauck, 2013).

43

Tabela 2.2: Resultado da intrusão de mercúrio na membrana de PCL/PR

Volume de intrusão 0,825 ml/g

Área total de poros 0,954 m2/g

Diâmetro mediano dos poros 4464,0 nm

Porosidade 39,51%

Figura 2.4: Distribuição do diâmetro dos poros na membranas de PCL/PR

A importância da interconexão dos poros na aplicação da engenharia tecidual, está

relacionada com a capacidade de favorecer a difusão dos gases e nutrientes necessários para

suportar o crescimento celular in vitro ou in vivo promovendo o metabolismo celular (Kim et

al. 2012; Guo et al. 2015). No trabalho de Guo et al. 2016, observou-se que a alta porosidade

nos scaffolds e uma boa interconexão entre os poros favorece o crescimento, migração e

regeneração celular, demonstrando que scaffolds que apresentam essas propriedades são

adequados para aplicações em engenharia tecidual. . Ainda, Guo et al., (2015), observou que

44

scaffolds com porosidade da ordem de 45%, que é próxima a porosidade encontrada neste

trabalho, apresentam um aumento na proliferação celular. Membranas altamente porosas são

promissoras em medicina regenerativa por simularem a matriz extracelular (Garg & Bowlin

2011).

2.3.4 Ensaios biológicos

2.3.4.1 Viabilidade Celular – Ensaio in vitro

A Figura 2.5 mostra a atividade mitocondrial dos fibroblastos murinos (BALB/c 3T3)

após 24h em cultura. Pode-se observar que todas as membranas estudadas não foram citotóxicas

quando comparadas com o controle.

Figura 2.5: Avaliação da viabilidade em células BALB/c 3T3. As células BALB/c 3T3

foram cultivadas sobre as membranas de PCL e PLC/PR por 24 horas. Os valores foram

expressos em absorbância em relação ao grupo controle, onde as células não foram expostas

aos materiais. O experimento foi realizado em microplacas de 24 poços e os resultados

representam as médias e desvios padrão do experimento. * p<0,05.

45

Em relação às membranas de PCL e PCL/PR não houve diferença significativa na

viabilidade celular conferida entre as membranas e entre o grupo controle (p > 0,05) e todas

apresentaram biocompatibilidade.

A média dos resultados proveniente do cultivo sobre as membranas poliméricas confere

viabilidade celular superior a 70% em comparação ao controle negativo, demonstrando a

citocompatibilidade das membranas em todas as composições (ISO 10993-5, 2009), com

valores na faixa de 113 a 117% aproximadamente.

Estes resultados estão de acordo com a literatura, que sugere que membranas de

polímeros sintéticos PCL, obtidas pelo processo de eletrofiação apresentam biocompatibilidade

in vitro (Wutticharoenmongkol et al. 2006; Sahoo et al. 2010; Goes et al. 2012). Neste contexto,

as membranas apresentaram propriedades para fixação e crescimento celular, pois as fibras

mimetizam a morfologia da matriz extracelular, demonstrando assim, alto potencial em

aplicações nas áreas médicas e odontológicas (Sahoo et al. 2010; Garg & Bowlin 2011; Chen

et al. 2015)

2.3.5 Ensaio in vivo

2.3.5.1 Características pós-operatório in vivo

Dos 50 ratos, oito morreram no dia seguinte ao procedimento cirúrgico experimental e

um no momento da anestesia. A amostra final foi composta por 41 animais distribuídos em dois

grupos Tabela 2.3.

Tabela 2.3: Distribuição das amostras finais nos grupos e períodos experimentais.

Grupo 7 dias 14 dias 21 dias 42 dias

PCL/PR 4 5 7 5

Controle 5 5 5 5

46

Durante o período experimental, o peso dos animais em todos os grupos variou de 240 a

250 g e no dia da eutanásia oscilou entre 260 e 320g. Nenhum animal apresentou sinais de

infecção na região da ferida cirúrgica. Todas as feridas foram limpas e a região da incisão

cutânea não apresentou deiscência visível ou exposição da membrana ao ambiente externo.

2.3.5.2 Análise das imagens radiográficas

A Tabela 2.4 apresenta a comparação entre as áreas dos defeitos ósseos em ambos os

grupos experimentais. Os valores médios e os correspondentes desvios-padrão são apresentados

em unidades de pixel/mm2. A Figura 2.6 mostra graficamente a diferença entre os grupos para

o tamanho variável da imagem de defeito ósseo.

Tabela 2.4: Distribuição dos valores médios ± desvio padrão das mensurações das áreas

radiográficas dos defeitos ósseos comparativamente entre os grupos e os períodos.

Grupo

Período (dias)

n

Média ± DP (pixel/mm2)

(p)

PCL/PR

7

14

21

42

4 52,89±2,05

0.014

0.60

0.37

0.08

Controle 5 56,44±1.31

PCL/PR 5 52,72±7,34

Controle 5 54,55±4,39

PCL/PR 7 51,34±3,56

Controle 5 52,95±3,06

PCL/PR 5 46,63±4,99

Controle 5 53,20±2,09

Test of Kruskal-Wallis. Significância p ≤ 0,05.

47

Figura 2.6: As médias e desvio padrão (mm2) das áreas da imagem radiográfica do defeito

em diferentes períodos experimentais. Teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney.

Significativo quando p <0,05.

Qualquer teste biológico visa verificar três características celulares fundamentais, tais

como, adesão, proliferação e diferenciação de um dado biomaterial, bem como propor

melhorias e personalização para aplicações clínicas. Neste estudo, a membrana PCL/PR foi

utilizada isoladamente, uma vez que o objetivo era testar se o polímero poderia exercer algum

efeito sobre a reparação óssea sem interferência de outros substitutos ósseos ou fatores de

crescimento.

Tanto os resultados radiográficos como os histológicos apresentaram resultados

consistentes e coerentes que se complementam. As medidas das imagens radiográficas

mostraram que a diminuição na área corrobora com achados histológicos. No entanto, deve ser

observado que a análise da imagem radiográfica isoladamente é um método subjetivo e limitado

48

para avaliar neoformação óssea. Resultados coerentes entre a análise de imagem e os achados

histológicos podem reduzir os erros inerentes à subjetividade da análise por radiografia.

2.3.5.3 Análise Histomorfológica

2.3.5.3.1 Período de 7 dias

O grupo PCL/PR apresentou um infiltrado neutrofílico e linfocitário mais intenso

quando comparados ao controle. A presença de osteoclastos foi ligeiramente mais intensa, mas

não significativa no grupo Controle. Houve formação de tecido de granulação no grupo controle

e semelhança de resultados para necrose, e neoformação óssea e células gigantes (ver

Figura 2.7 A,B).


A presença de células gigantes foi mais intensa no grupo PCL/PR. O processo

inflamatório no grupo PCL/PR manteve-se moderado, com redução da intensidade

comparativamente ao período anterior. As áreas de necrose, tecido de granulação e hemorragia

foram similares em ambos os grupos (ver

Figura 2.7 C,D).


Houve uma redução no processo inflamatório nos dois grupos. A presença de células

gigantes foi mais intensa e significativa para PCL/PR (p=0,009). As áreas de necrose, tecido

49

de granulação e hemorragia foram similares para o controle e para a membrana grupos. Houve

uma atividade osteoclástica ligeiramente maior no grupo controle (ver

Figura 2.7 E,F).


A presença de células gigantes foi intensa e significativa no grupo PCL/PR. A

neoformação óssea foi semelhante para os dois grupos, entretanto houve uma concentração

maior de células gigantes no grupo da membrana. O infiltrado inflamatório, as áreas de

hemorragia, necrose e tecido de granulação, foram similares (ver

Figura 2.7 G,H).

51

Figura 2.7: Fotomicrografias do aspecto histológico do reparo do defeitos ósseos: Período

de 7 dias, A) Grupo PCL/ PR apresentou maior quantidade de tecido de granulação (seta); B)

Grupo controle, organização de tecido de granulação (seta); Período 14 dias, C) Neoformação

óssea PCL/PR (seta); D) Grupo controle área de formação óssea (seta). Período de 21 dias,

E) Grupo PCL/PR, mostrou formação de tecido ósseo (asterisco) e aglomerado de células

gigantes (seta); F) Grupo controle, tecido ósseo neoformado (seta). Período de 42 dias, G)

Grupo PCL/PR, mostra clusters de células gigantes (seta) e neoformação óssea (asterisco);

H) Grupo controle com neoformação óssea (seta). Hematoxilina e eosina, baixo aumento,

objetivo 2.5X.

2.3.5.4 Análise histomorfométrica

3.2.3. Análise histomorfométrica

As médias das áreas de neoformação óssea mensuradas nos corte das três áreas de defeito

(anterior, central e posterior) em µm2 são mostradas na Tabela 2.5. A Figura 2.8 mostra

graficamente as diferenças da neoformação óssea entre os grupos de acordo com os períodos

de observação.

52

Tabela 2.5: Dados descritivos em média ± desvio padrão da mensuração da área de

neoformação óssea (µm2), comparativamente intergrupos para cada período de observação.

Grupo

Período (dias)

n

Média ± DP

(µm2)

(p)

PCL/PR 7

14

21

42

4 23.886 ± 16.824

0.0001

0,1071

0,0004

0,2192

Controle 4 20.52 ± 15.468

PCL/PR 4 42.848 ± 17.204

Controle 4 37.81 ± 8.488

PCL/PR 4 62.832 ± 21.174

Controle 4 43.278 ± 10.393

PCL/PR 4 290.117 ± 121.742

Controle 4 335.864 ± 146.32

Kruskal-Wallis Test. Significance p ≤ 0.05.

Figura 2.8: Distribuição da média e desvio padrão das áreas totais de neoformação óssea

em μm2. Kruskal-Wallis e teste de Mann-Whitney. * Significativo p <0,05.

53

A avaliação histomorfológica mostrou que a neoformação óssea em todos os grupos foi

madura, organizada e exibiu trabéculas coalescentes. Entre os 7 e 14 dias, o grupo PCL/PR

apresentou inflamação mais intensa, que diminuiu em 21 dias e neoformação óssea significativa

em todos os períodos de tempo. Em 14, 21 e 42 dias, o grupo PCL/PR apresentou uma intensa

atividade de células gigantes, sugerindo uma reação de corpo estranho, e uma discussão

posterior é apresentada a seguir.

Em todos os períodos experimentais, foram encontrados vestígios de membranas, o que

está de acordo com a literatura, onde o material exógeno pode ser observado em vários períodos

de avaliação, como no trabalho de (Polimeni et al. 2008), com dispositivos de PLA, que

exibiram uma quantidade substancial de biomaterial residual nos períodos de 3, 5, 7 e 12 meses.

Neste estudo, o dispositivo de PLA permaneceu intacto durante o intervalo de cicatrização de

12 meses, onde estavam presentes sinais de bioresorção, mas estavam confinados à periferia do

dispositivo. Além disso, a análise histológica permitiu observar que a formação óssea ocorreu

de forma centrípeta, ou seja, desde as bordas até o centro da ferida. É interessante notar que,

apesar de uma maior neoformação óssea após 42 dias, a formação óssea foi maior entre 7 e 14

dias do que entre 21 e 42 dias, mostrando que em um defeito crítico, o crescimento ósseo tende

a se estabilizar.

Verificou-se que os dados comparativos entre os grupos controle e o grupo PCL/PR

estavam muito próximos e, portanto, a membrana PCL/PR não promoveu uma regeneração

óssea guiada expressiva. Além disso, observamos que os aglomerados de células gigantes foram

encontrados mais intensamente no grupo PCL/PR. Além disso, a permanência de células

gigantes em um estágio tardio de reparação poderia ser possível devido a uma resposta

individualizada de espécies animais ao tipo de polímero utilizado. A porosidade da membrana

provavelmente influenciou a resposta inflamatória crônica. Assim, no primeiro momento, esta

reação ao corpo estranho pode ser considerada como um fator negativo para o efeito de

biocompatibilidade desta membrana. Entretanto, alguns autores, como Ghanaati et al. 2010,

mostraram que o papel da reação de corpo estranho aos biomateriais deve ser reconsiderado,

uma vez que a presença de células gigantes com características histoquímicas específicas pode

estar relacionada a um estímulo para a formação de tecido vascular. Embora a

imunorreatividade aos fatores vasculares não tenha sido testada aqui, observamos que a

54

presença de membrana PCL/PR pareceu ter aumentado a presença de vasos. Marcadores

imunohistoquímicos poderiam confirmar essa hipótese.

O modelo proposto de membrana PCL/PR por eletrofiação não demonstrou desempenho

efetivo para terapia de regeneração óssea guiada em grandes defeitos ósseos quando usado

sozinho. No entanto, uma vez que apresentou viabilidade, melhorias em relação à padronização

em sua produção e características morfológicas, podem levar a estudos deste material como um

arcabouço funcionalizado com fármacos, proteínas, células tronco que promovem a

regeneração óssea guiada.

A blenda de PCL/PR mostrou biocompatibilidade in vitro, revelando aspectos

promissores a serem funcionalizados por células-tronco com potencial para ser utilizado como

biomaterial bioativo para a reconstrução do tecido ósseo. A bioengenharia adota três estratégias

para a criação de novos tecidos orgânicos: em primeiro lugar, a presença de células,

particularmente células-tronco, que poderiam ser induzidas a diferenciar para o tecido

adequado, em segundo lugar, fatores específicos de crescimento que devem ser apresentados

para estimular as células à proliferação adequada e, finalmente, um scaffold para desempenhar

um papel como estrutura, que sustentarão e manterão células viáveis a serem transferidas para

um leito de recepção para formar um novo tecido (Changotade et al. 2015).

A distribuição geométrica das fibras poliméricas mostrou que as células têm espaço e

interconectividade porosa para a proliferação e diferenciação celular, embora, outros testes in

vitro específicos devam ser realizados para confirmar. Além disso, a presença de ciclodextrinas

em sistemas poliméricos pode ser promissora em aplicações farmacêuticas como veículos para

liberação controlada de fármacos ou fatores de crescimento. Quando utilizados como uma

blenda com outros polímeros, os anéis de ciclodextrinas podem melhorar as características

físicas e biológicas, como estabilidade e solubilidade em ambiente aquoso (Jiang et al. 2013;

Li et al. 2011). Além disso, a possível ligação de grupos OH funcionais pode enriquecer

propriedades de degradação e transporte para fármacos hidrofóbicos em sistemas de

administração de fármacos biocompatíveis (Jiang et al. 2013).

De nosso conhecimento, a literatura científica sobre o uso de membranas fibrosas de um

polímero sintético do sistema PCL/PR para fins de regeneração óssea é inexistente. Assim, os

dados originais obtidos aqui não devem desencorajar a bioengenharia, mas sim estimular novos

estudos a fim de melhorar e compreender as propriedades desses biomateriais.

55

Conclusão

As membranas PCL e PCL/PR eletrofiadas foram produzidas com sucesso. Com a

adição de PR, a hidrofilia da membrana aumentou quando comparada com a de PCL pura, e

ambas apresentaram biocompatibilidade e favoreceram o crescimento celular in vitro após 24

horas. Para o caso de testes in vivo, as membranas PCL/PR promoveram uma intensa atividade

de células gigantes, sugerindo uma reação de corpo estranho. No entanto, o comportamento in

vivo foi estável e não aumentou a área do defeito crítico e seu desempenho foi comparável ao

grupo controle. Sob os limites deste estudo, as membranas de PCL/PR eletrofiadas

demonstraram que não são citotóxicas em um teste de viabilidade em 24 horas, contudo, este

material não melhorou a reparação em um defeito de tamanho crítico ósseo.

56


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60

Anexo A

61

3. Influência do alinhamento de fibras eletrofiadas de poli (ε-caprolactona )

PCL e os efeitos biológicos em ensaio de estiramento celular em

fibroblastos

Resumo

Eletrofiação é uma técnica promissora de processamento de membranas fibrosas, devido à sua

versatilidade e potenciais aplicações em regeneração tecidual. As fibras processadas podem ser

alinhadas para mimetizar a natureza anisotrópica de fibras de tecidos alinhados, tais como o

menisco do joelho, disco intervertebral e os músculos. A influência da orientação das fibras e

os efeitos dos estímulos mecânicos na interação com a morfologia celular foram o foco deste

estudo. Fibras a partir de poli (ε-caprolactona) (PCL) foram processadas com orientações

aleatórias (PCL-R) e alinhadas (PCL-A), visando aplicações em tecido que recebem

solicitações mecânicas cíclicas. As fibras foram incorporadas em células de fibroblastos 3T3.

As estruturas foram estudadas sob condições estáticas em períodos de 1, 3 e 7 dias e sob

estiramento mecânico, sujeitos a alongamento cíclico de 10%, frequência de 1 Hz, com duração

de 6 horas. Microscopia confocal foi utilizada para avaliar a orientação e morfologia das células.

Observou-se que o alinhamento das fibras influencia diretamente no alinhamento celular,

facilitando a orientação da célula ao longo da fibra, em contrapartida, os ensaios de

alongamento cíclico com as variáveis adotadas neste estudo não influenciaram diretamente a

morfologia dos fibroblastos.

Palavra-chave: eletrofiação, poli (ε-caprolactona) (PCL), estiramento mecânico, fibras

alinhadas.

62

Introdução

Engenharia tecidual é uma abordagem científica que visa o desenvolvimento de métodos

para regenerar e/ou substituir órgãos e tecidos danificados. A falência orgânica e perda de tecido

devido a traumas ou problemas de saúde têm acessibilidade limitada e dificuldade para

encontrar doadores compatíveis (Unnithan et al. 2017). O uso de membranas fibrosas tem

apresentado excelente desempenho em aplicações na área biomédica (Erickson et al. 2015;

Tang & Yu 2015), pois apresentam uma arquitetura semelhante à matriz extracelular (MEC),

que pode atuar no sentido de orientar o crescimento e o desenvolvimento celular (Xu et al.

2004; Baker & Mauck 2007).

A eletrofiação é um processo no qual uma solução polimérica pode ser transformada em

membranas fibrosas utilizando forças elétricas externas (Tang & Yu 2015). São necessários

quatro componentes básicos: uma fonte de alta voltagem, uma bomba de infusão, uma seringa

conectada à uma agulha metálica e uma placa coletora de metal. O processo de eletrofiação

inicia-se quando cargas elétricas passam para a solução polimérica através da agulha metálica,

resultando na indução de cargas sobre as gotículas do polímero. Com o uso de uma bomba de

infusão, a solução polimérica pode ser alimentada a uma taxa constante e controlável. Para

formar um campo elétrico, um eletrodo da fonte de alta tensão está conectado à ponta da agulha

para carregar eletricamente a solução, enquanto que o outro eletrodo está conectado a um

coletor de polaridade oposta, geralmente um condutor aterrado. Quando o campo elétrico é

submetido, as forças elétricas agindo na solução polimérica supera a tensão superficial,

ocasionando o estiramento e escoamento da solução polimérica na direção do campo elétrico.

Antes do jato atingir a placa coletora, o solvente da solução evapora-se, solidificando o

polímero, que é recolhido em forma de pequenas fibras como uma rede interligada (Huang et

al, 2003; Garg et al, 2014; Haider et al, 2015). A Figura 3.1 mostra um esquema de um sistema

de eletrofiação.

63

Figura 3.1: Representação esquemática da montagem básica de um aparelho de eletrofiação (Salles

et al, 2015).

A geometria do coletor utilizado no processo de eletrofiação que são normalmente

metálicos, tais como cobre e alumínio (Bhardwaj & Kundu 2010), influenciam na disposição

das fibras (Bhardwaj & Kundu 2010). As fibras com orientação aleatória são depositadas sobre

um coletor plano e estático, isso ocorre devido à instabilidade do escoamento do jato na

trajetória da ponta da seringa ao coletor. Fibras aleatórias podem ser aplicadas em películas de

recobrimento de implantes, curativos e sistemas de liberação controlada de fármacos (Huang et

al, 2003). Para obtenção de fibras alinhadas, uma das alternativas é fixar dois eletrodos em

paralelo com uma abertura ou secção de isolamento entre os eletrodos, que criam um perfil no

campo elétrico que obrigam as cargas das fibras a cobrirem esse espaço ( Huang et al, 2003; Li

et al, 2003; Jalili et al, 2006; Teo et al, 2011), obtendo-se assim fibras altamente alinhadas.

Fibras alinhadas são interessantes, pois melhoram as propriedades mecânicas para aplicações

específicas, como regeneração de nervos, tendões e diferenciação celular ( Schnell et al. 2007;

64

Chew et al. 2008). A Figura 3.2 apresenta um esquema de um sistema de coletor com dois

eletrodos em paralelos e deposição de fibras alinhadas.

Figura 3.2: Ilustração esquemática de um coletor com dois eletrodos em paralelo, utilizados

para a produção de fibras altamente alinhadas no processo de eletrofiação (Bellan &

Craighead 2011).

Uma variedade de polímeros sintéticos são investigados para aplicação em engenharia

tecidual. Entre eles, o PCL é material promissor para a fabricação de membranas fibrosas

obtidas pelo processo de eletrofiação, devido à sua biocompatibilidade e biorreabsorbilidade

(Elzubair et al. 2006; Shor et al. 2007; Pok et al. 2010; Abdelrazek et al. 2016). É um material

reconhecido e aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) (Kweon et al. 2003; Kim

et al. 2012) e tem sido utilizados em suturas reabsorvíveis, sistemas de liberação controlada de

fármacos e como scaffolds para auxiliar o crescimento de células e em substitutos de enxertos

ósseos (Elzein et al. 2004; Elzubair et al. 2006; Pok et al. 2010).

Os scaffolds podem substituir vários tecidos, incluindo artérias, pulmões e pele, que

estão sujeitos a cargas mecânicas significativas. Consequentemente, os scaffolds que podem

substituir estes tecidos devem suportar os efeitos de estresse e de tensões específicas exercidas

por cada estrutura (Guilak et al. 2001). Estes efeitos incluem não apenas as propriedades

65

mecânicas gerais dos scaffolds (Pelham & Wang et al. 1997), mas também as respostas

celulares às tensões mecânicas as quais estão expostas, que respondem para regular a

proliferação celular, a rigidez das células (Solon et al. 2007) e diferenciação (Engler et al.

2006). As células têm a capacidade de responder à rigidez mecânica da matriz extracelular

circundante (Buxboim et al. 2011). Além disso, as células cultivadas em estruturas de suporte

alinhadas demonstraram produzir matriz extracelular organizada in vitro, portanto, melhoram

as propriedades mecânicas para aplicações específicas como em menisco do joelho, disco

intervertebral e músculos (Ifkovits et al. 2010).

Assim, o objetivo deste estudo foi desenvolver e caracterizar scaffolds de PCL com

fibras alinhadas e cultivar fibroblastos sobre as mesmas para avaliar alterações morfológicas

das células sob as influências em ensaios estáticos e cíclicos para aplicações em engenharia

tecidual, tais como músculos cardíacos, ligamentos, nervos, tendões, menisco do joelho e com

potencial entrega de células in vivo.

66

Material e Métodos

3.2.1 Materiais

Neste trabalho foram utilizados PCL com massa molecular de 80000 g/mol (Sigma

Aldrich). Os solventes utilizados foram clorofórmio (Merck, Alemanha) e acetona (Synth-

Brasil).

As soluções foram preparadas por dissolução de 27% em massa de PCL e 36,5% em

peso de clorofórmio e acetona (1:1), foram agitadas magneticamente durante 3 horas à

temperatura de aproximadamente 23 a 26 °C. Todas as soluções foram eletrofiadas no mesmo

dia de preparação.


O processo de eletrofiação foi realizado à temperatura de aproximadamente 23 a 26 °C,

utilizando uma seringa descartável de 10 mL e uma agulha metálica de 0,55 mm de diâmetro

interno. O pólo positivo da fonte de alta tensão (0-30kV, Testtech) foi conectado à ponta da

agulha metálica da seringa. Para obter fibras aleatórias utilizou uma placa de cobre plana e

estática, em contrapartida para produzir as fibras alinhadas empregou dois eletrodos de

alumínio em paralelo com uma abertura de 7 x 10 cm. A vazão foi controlada por uma bomba

de infusão (KD-Scientific, KDS Model-100), ligada à seringa. A distância da ponta da agulha

para o coletor, a tensão da solução processada, esses parâmetros são apresentados na Tabela

3.1. As amostras foram coletadas na forma de membranas sobre folha de alumínio. Para cada

ensaio, aproximadamente 5 ml da solução de polímero foi utilizada.

67

Tabela 3.1: Parâmetros de eletrofiação

Parâmetros Fibras Aleatórias (PCL-R) Fibras Alinhadas (PCL – A)

Voltagem (kV) 15 20

Vazão (mL) 1 8

Distância (cm) 15 20

Dimensões da placa (cm) 9.0 x 15.0 13.0 x 16.0

Geometria da placa Placa plana Eletrodos paralelos

Material da placa Cobre Alumínio

3.2.3 Caracterização das membranas

A morfologia das fibras obtidas a partir das soluções eletrofiadas neste estudo foram

avaliadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) utilizando um equipamento ZEISS

(Modelo Evoma-15). Para a observação pelo MEV, as amostras foram fixadas em suporte

metálico com fita dupla face de carbono e revestidas em ouro utilizando um equipamento

Sputter Coater, Bal-Tec (Modelo SCD-O5O). Os diâmetros médios das fibras foram

determinados por análise das imagens de MEV, utilizando o programa de análise de imagens

ImageJ, onde foram medidos os diâmetros de 50 fibras de cada amostra escolhidas

aleatoriamente, valores médios e desvios-padrão foram obtidos. O alinhamento das fibras foi

qualificado utilizando o programa ImageJ com o plugin OrientationJ para analisar a orientação

das fibras.

3.2.4 Preparação das amostras

As fibras aleatórias (PCL-R) e alinhadas (PCL-A) foram fixadas sobre uma fina

membrana de silicone, uma vez que estas são altamente transparentes, elásticas e não tóxicas

para as células cultivadas (Wang et al. 1995; Wang et al. 2000). Com o auxílio de uma cola de

silicone (Sylgard® 184 Silicone Elastómero) que apresenta propriedades como, qualidade

translúcida para microscopia óptica e de fluorescência e biocompatibilidade, este elastomêro de

silicone comercial, foi utilizado na proporção de 1:10 do agente de cura/base, e foram

68

misturados manualmente durante 10 min. Em seguida, o conjunto fibras de PCL fixado as

membranas de silicone foram colocadas no forno (VWRTM) durante 24 horas à temperatura de

23 °C de acordo com o fabricante (Versaevel et al. 2014).

3.2.5 Esterilização das membranas

As membranas eletrofiadas de PCL-R e PCL-A foram esterilizadas com radiação

ultravioleta (UV) em ambos os lados, durante 30 minutos cada (Gautam et al. 2013). A radiação

UV tem sido utilizada para reduzir a microbiota nos materiais e uma alternativa para a

inativação microbiana (Li, 2009; Artemenko et al. 2012; Gautam et al. 2013). O UV na faixa

de 210 a 330 nm são eficientes como germicidas por serem absorvidos por proteínas e ácidos

nucleicos, fazendo a ruptura dos cromossomas, mutações genéticas, inativação de enzimas e,

consequentemente, a morte celular (Elmnasser et al. 2007).

3.2.6 Cultura celular – Fibroblastos 3T3

As células de fibroblastos 3T3 foram cultivadas DMEM (ATCC) suplementado com

10% soro bovino fetal (ATCC) e 1 mM penicilina/estreptomicina. As culturas de células

permaneceram à temperatura de 37°C, em estufa umidificadora contendo 95% de ar e 5% de

CO2 (Kaunas et al. 2006). As membranas de PCL foram divididas em dois grupos

experimentais compreendendo o grupo estático e o grupo de estiramento cíclico uniaxial. O

grupo estático e o grupo de estiramento uniaxial foram compostos por fibras de PCL aleatórias

(PCL-R) e alinhadas (PCL-A). As membranas de PCL para o ensaio estático foram cortadas

para se encaixar em cavidades de uma placa com 6 poços, em contrapartida, as membranas de

PCL para o ensaio de estiramento foram cultivadas em placas de petri (15x60 mm). As fibras

de PCL foram então enxaguadas 3 vezes com PBS estéril antes de semear as células. Em

seguida, as células foram semeadas sobre as fibras fixadas à membrana de silicone. As células

foram semeadas sobre as fibras em alíquotas de 50μl contendo 2,5 × 105 células e em seguida

69

os poços foram completados com 2,5 mL e a placa de petri com 5 mL de meio para células de

fibroblastos. Após 24 horas de cultivo o teste de estiramento foi realizado por 6 horas, no

entanto, o grupo estático foi analisado em períodos de 1, 3 e 7 dias.

3.2.7 Ensaio de estiramento (stretch) cíclico uniaxial

O teste de estiramento uniaxial cíclico foi conduzido na direção longitudinal e

perpendicular às fibras. O dispositivo Zaber Technologies T-LSR075D foi utilizado para

estiramento uniaxial cíclico, onde foi necessário fazer adaptações no equipamento. Foram

adicionadas duas peças de alumínio, que foram fixadas nos dois motores lineares (Parker

Propostas) de uma maneira simétrica. O dispositivo de estiramento foi montado em um suporte

de aço inoxidável (Gibraltar). Uma caixa de metacrilato foi fixada à estrutura metálica e

componentes de alumínio foram utilizados para prender a caixa aos braços dos motores. As

amostras permaneceram sujeitas a um alongamento cíclico de 10% a 1 Hz com duração de 6

horas. A Figura 3.3 representa as fotografias do equipamento Zaber Technologies T-LSR075D

com suas adaptações.

Figura 3.3: Fotografias do equipamento Zaber Technologies T-LSR075D. A) Antes das

adaptações: 1 e 2) correspondem aos braços dos dois motores dispostos linearmente, 3) Suporte

de aço inoxidável; B) Após as adaptações: 4) Suporte de alumínio, 5) Componentes de alumínio

(parafusos + roscas) e 6) Caixa de metacrilato fixa à estrutura de metal.

70

3.2.8 Morfologia celular – Microscopia confocal

Após o teste de estiramento e o ensaio estático, todas as membranas com as células

foram lavadas com solução tampão fosfato salinas (PBS) e fixadas em paraformaldeído

preparado a 4% em PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Após lavagem com PBS,

foi colocado Triton X-100 a 0,1% durante 20 minutos e seguida de lavagem por 3 vezes com

PBS. Após a lavagem foi realizada a coloração com “Alexa Fluor® 488 Phalloidin - Thermo

Fisher Scientific” por 1 hora, seguida de lavagem por 3 vezes com PBS. Assim, em seguida

colocou-se o RNase (SIGMAR-4875) durante 1 hora e 30 minutos, após realizar lavagem com

PBS por 3 vezes, aplicou-se o iodeto de propídio durante 20 minutos, assim, realizou-se

lavagem com PBS 3 vezes. As imagens foram capturadas usando um microscópio confocal de

varredura a laser Nikon C1 com uma objetiva de 60X (necessário cobrir a amostra com água)

iluminada por um laser de íons 40-mW de argônio e hélio néon verde (Melles Griot).

71


3.3.1 Microscopia eletrônicade varredura – MEV

A Figura 3.4 apresenta a morfologia e o histograma de distribuição das membranas de

PCL-R e PCL-A. Nota-se que as orientações das fibras são diferentes. Na Figura 3.4A as fibras

possui orientação aleatória e na Figura 3.4C as fibras possuem um elevado grau de

alinhamento. Pode-se também observar que em ambas, as fibras são uniformes e livres de

defeitos, como pérolas e beads. Os diâmetros médios das fibras aleatória e alinhadas foram de

2,5 (± 0,88) e 1,66 (± 0,7), respectivamente. Observa-se que na Figura 3.4C, devido as fibras

apresentarem maior espaçamentro entre elas, aparece ao fundo a fita dupla face de carbono,

utilizada para fixar as fibras para obtenção das micrografias no MEV.

72

Figura 3.4: Micrografias das fibras eletrofiadas (A) PCL-R e (C) PCL-A e os respectivos histogramas de

distribuição dos diâmetros das fibras das membranas (B) PCL-R e (D) PCL-A. Note: o * indica a fita dupla

face de carbono.

A Figura 3.5 A, B apresentam os gráficos de grau de orientação, que está associado ao

ângulo de alinhamento das fibras aleatórias (Figura 3.5A) e alinhadas (Figura 3.5B),

respectivamente. Na Figura 3.5 A nota-se que não há um ângulo de orientações definido,

enquanto que na Figura 3.5 B, pode-se observar um pico com alta intensidade bem definido.

73

Figura 3.5: A) Distribuição da orientação das fibras aleatórias; B) Distribuição da orientação

das fibras alinhadas.

A área de aplicação das membranas é um fator importante para considerar na escolha da

arquitetura e orientações das fibras, assim uma das limitações encontrada em scaffolds com

fibras aleatórias por eletrofiação é a redução da porosidade, devido ao empacotamento denso

das fibras, que pode diminuir a infiltração das células através da profundidade dos scaffolds

(Ifkovits et al. 2010; Kim et al, 2016), a distribuição desigual das células sobre os scaffolds é

capaz de impedir o desenvolvimento homogêneo da MEC, limitando o progresso nas

74

propriedades mecânicas em menisco, que foi o modelo utilizado (Ionescu & Mauck 2013). No

trabalho de Kim, et al (2016), foi observado que o aumento da porosidade das membranas está

relacionado com o aumento da molhabilidade, que é um requisito importante para scaffolds

poliméricos aplicados em áreas biomédicas.

No entanto, outro ponto relevante são as propriedades mecânicas dos scaffolds, assim,

Xie et al (2010), em seu trabalho realizaram testes mecânicos, onde observaram que nas curvas

de tensão-deformação as fibras alinhadas apresentaram os valores de módulo e tensão final

significativamente maiores em relação às fibras aleatórias, demonstrando que as propriedades

mecânicas dos scaffolds são dependentes da distribuição de orientação das fibras, resultados

semelhante encontrado no trabalho de Lee et al ( 2005) e Baker & Mauck (2007), onde os

scaffolds com fibras alinhadas apresentaram melhores propriedades mecânicas em relação as

com fibras aleatórias. Devido a estes fatores, optamos pelos coletores com dois eletrodos

paralelos que permite produzir fibras com espaçamento maiores e alinhadas, características

promissoras para os ensaios de estiramento cíclico.

3.3.2 Ensaios biológicos

3.3.2.1 Caracterização morfológica dos fibroblastos – Teste estático

Para avaliar a biocompatibilidade das fibras de PCL, os fibroblastos foram cultivados

por 1, 3 e 7 dias em membranas de PCL com fibras aleatórias e alinhadas em ensaio estático e

foram examinadas em microscópio confocal.

As Figura 3.6Figura 3.7Figura 3.8 mostram imagens de microscopia confocal, onde

os fibroblastos foram cultivados sobre a placa de poliestireno (controle), fibras de PCL

aleatórias (PCL-R) e fibras de PCL alinhadas (PCL-A), respectivamente. Observa-se que as

células exibiram morfologias substancialmente diferentes.

A Figura 3.6 representa os fibroblastos cultivados em placas de poliestireno que foram

utilizados como controle e apresentaram em sua maioria um formato poligonal rico em

75

filopódios para as primeiras 24 horas e mais espraiado e alongado para 3 e 7 dias em orientação

aleatória na placa de cultura.

Figura 3.6: Imagens de microscopia confocal de fibroblastos cultivados em placa de poliestireno

(controle) por 1 (A), 3 (B) 3 e (C) 7 dias. Em verde observa-se os filamentos de actina e em

vermelho o núcleo.

A Figura 3.7 apresenta a morfologia dos fibroblastos para as membranas de PCL-R.

Observa-se que se apresentaram mais arredondados, o que demonstra menor adesão celular a

membrana, baixa quantidade de filopódios e poucas fibras de stress em 1 dia de cultura. Em 3

e 7 dias, apresentaram-se distribuídas aleatoriamente e formação alongada com maior

quantidade de fibras de stress observáveis. Em contrapartida, na Figura 3.8, nota-se que células

cultivadas em PCL-A, apresentaram uma morfologia cordonal alongada (fusiforme) e na

mesma orientação das fibras, sugerindo que o alinhamento atuou como um guia de orientação

da adesão celular, assim as células assumiram um formato fusiforme, semelhante a morfologia

encontrada in vivo. Este alinhamento celular é muito semelhante ao observado em outros

estudos (Yang et al, 2005; Schnell et al. 2007; Chew et al. 2008; Xie et al, 2010; Liu et al.

2015). Observou-se que após a incubação durante 7 dias, a morfologia celular foi semelhante

ao observado durante 1 e 3 dias, mas com maior densidade celular devido à proliferação celular.

76

Figura 3.7: Eletromicrografia de varredura da superfície das fibras de PCL arranjadas aleatoriamente (A).

Por microscopia confocal dos fibroblastos aderidos neste arcabouço, as células foram analisadas após 1

(B), 3 (C) e 7 dias (D). Em verde observa-se a marcação para filamentos de actina e em vermelho o núcleo.

Figura 3.8: Eletromicrografia de varredura da superfície das fibras de PCL alinhadas (A). Por microscopia

confocal dos fibroblastos aderidos neste arcabouço, mostra que as células se apresentaram alinhadas na

mesma orientação das fibras. As células foram analisadas após 1 (B), 3 (C) e 7 dias (D). Em verde

observa-se a marcação para filamentos de actina e em vermelho o núcleo.

Os fibroblastos cultivados em PCL-R demonstraram múltiplas adesões e as células

assumiram organização irregular e em rede sobre as fibras aleatórias (ver Figura 3.7 B, C e D).

No entanto, em PCL-A os fibroblastos exibiram uma morfologia orientada ao longo eixo das

fibras alinhadas, o que determinou diferença no alinhamento celular (ver Figura 3.8 B, C e D).

Assim para o mesmo período de tempo, os fibroblastos obtiveram comportamento diferente, o

que sugere estar diretamente relacionado com a morfologia topográfica das fibras, pois os

fibroblastos assumiram morfologias distintas de acordo com a orientação das fibras.

77

Nas fibras aleatórias, a apresentação morfológica se mostrou em disposição irregular no

qual as células não assumiram uma morfologia semelhante as demais. O aspecto esférico

(Figura 3.7 B) com 1 dia de cultivo demonstra que neste período de adesão inicial, as células

mostraram pouco espraiamento, o que propõe menor capacidade em formarem contatos focais.

Já após 3 e 7 dias (Figura 3.7 C e D), a adesão foi mais evidente e as células se orientaram

irregularmente conforme as fibras se encontravam distribuídas. No entanto, com o alinhamento

das fibras (Figura 3.8 A), as células assumiram morfologia fusiforme, o qual acompanhou o

sentido da orientação das fibras, assim nos tempo de cultivo inicial de 1 dia. Comparando a

morfologia das células com as fibras aleatórias e alinhadas após 1 dia de cultivo, fica evidente

que a orientação aleatória das fibras pode vir a minimizar a adesão inicial dos fibroblastos em

virtude da morfologia esférica, o que demonstra uma relação direta entre topografia do material

versus capacidade de adesão inicial.

Estudos na literatura mostram a importância na orientação das fibras em relação a

resposta celular. No trabalho de Montero et al ( 2014), observou-se que fibras alinhadas são

capazes de conduzir o crescimento das células endoteliais e sua formação em vasos funcionais,

enquanto que as fibras aleatórias resultaram em células endoteliais desorganizadas. Gaharwar

et al. (2015), observaram que células endoteliais cultivadas em fibras alinhadas, permitem o

alinhamento dos núcleos celulares e das fibras de actina, além de favorecer uma maior

proliferação celular em relação às fibras aleatórias, além de promover a expressão de junção

intercelular específica de células endoteliais, que é um dos principais determinantes da

angiogênese, que consiste no desenvolvimento de novos vasos sanguíneos. No estudo de Shang

et al (2010), foi observado que células cultivadas sobre fibras alinhadas apresentaram

proliferação e migração significativamente mais elevada do que em relação ao grupo controle

(fibras aleatórios e filmes obtidos por casting). As células ficaram alinhadas paralelamente as

fibras alinhadas em contraste com a forma poligonal das células cultivadas sobre fibras

aleatórias.

Este fenômeno da orientação, chamado orientação de contato (Chew et al. 2008),

descreve a migração e orientação de locomoção celular frente a processos químicos, estruturais

e/ou mecânicos dos substratos onde as células são cultivadas (Wang et al. 2000; Baker & Mauck

2007). Assim, o alinhamento das fibras induz o eixo das células a acompanharem a mesma

direção linear por remodelação citoesquelética, resultando em orientação celular controlada. Há

78

interesse significativo na área de engenharia tecidual em estruturas com arquitetura hierárquica

e organizada para aplicações em nervos, tendões, ligamentos, músculo liso (ex: tecido cardíaco)

e ossos, pois permite a replicação da MEC para cada tipo de tecido específico (Wang et al.

2004; Wang 2013). Assim, as características topográficas das membranas aplicadas em

engenharia tecidual podem influenciar no comportamento celular (Montero et al. 2012). A

morfologia fusiforme no qual os fibroblastos aderidos ao PCL-A assumiram, são próximos de

sua morfologia in vivo, e assim pode ser um fator que venha a favorecer sua funcionalidade

diferenciada que é a produção de matriz extracelular.

Desta maneira, fibras alinhadas obtidas pelo processo de eletrofiação podem fornecer

orientação de contato para uma variedade de aplicações como neurônios, fibroblastos, células

endoteliais, cardiomiócitos, células musculares esqueléticas e células de Schwann (Xie et al,

2010)

As Figura 3.6Figura 3.7 Figura 3.8, apresentam os períodos de cultivo celular em um,

três e sete dias, observa-se um crescimento celular sugerindo uma proliferação celular

qualitativa, indicando que as membranas permitem que as células se expandam em proliferação.

3.3.2.2 Caracterização morfológica dos fibroblastos – Ensaio de estiramento (Stretching)

A Figura 3.9 representa a morfologia celular após 6 horas de estiramento cíclico sobre

fibras aleatórias. Nota-se que as células não apresentaram uma tendência de alinhamento e

permaneceram sobre as membranas de forma aleatória mesmo após o teste de estiramento,

consequentemente entende-se que para fibras aleatórias a topografia das fibras mostrou-se

como o fator principal à resposta celular.

79

Figura 3.9: A) Eletromicrografia de varredura da superfície das fibras de PCL arranjadas

aleatoriamente, Imagens de microscopia confocal B, C e D) Morfologia dos fibroblastos após o teste

de alongamento sobre fibras de PCL-R. Em verde observa-se a marcação para filamentos de actina e

em vermelho o núcleo. Note: a flecha indica a direção que a força de estiramento foi aplicada.

As Figura 3.10 (B, C e D) e Figura 3.11 (B, C e D), mostram imagens, onde observa-

se a morfologia celular após o ensaio com 10% de estiramento durante seis horas com aplicação

de força paralela e perpendicular as células cultivadas sobre as fibras alinhadas,

respectivamente. Observa-se que a tendência dos fibroblastos é de acompanhar

longitudinalmente a direção do alinhamento das fibras independente do sentido da força

exercida.

Figura 3.10: A) Eletromicrografia de varredura da superfície das fibras de PCL alinhadas, Imagens de

microscopia confocal B, C e D) Morfologia dos fibroblastos após o teste de estiramento paralelo às

fibras de PCL-A. Em verde observa-se a marcação para filamentos de actina e em vermelho o núcleo.

Note: a flecha indica a direção que a força de estiramento foi aplicada.

80

Figura 3.11: A) Eletromicrografia de varredura da superfície das fibras de PCL alinhadas; Imagens de

microscopia confocal B, C e D) Morfologia dos fibroblastos após o teste de estiramento perpendicular

às fibras de PCL-A. Em verde observa-se a marcação para filamentos de actina e em vermelho o núcleo.

Note: a flecha indica a direção que a força de estiramento foi aplicada.

Para os ensaios de estiramento, os fibroblastos mantiveram morfologias distintas em

relação à orientação das fibras e as forças exercidas pelo ensaio mecânico. Nas fibras aleatórias,

as conformações morfológicas dos fibroblastos mostraram-se irregulares e espraiadas

aleatoriamente, demonstrando que não houve interferência das forças de estiramento na

resposta celular, pois os fibroblastos assumiram a mesma morfologia já apresentada no ensaio

estático (Figura 3.7), constatando sua capacidade em formarem os contatos focais. Todavia, os

fibroblastos cultivados sobre as fibras alinhadas que receberam forças uniaxiais cíclicas

longitudinais e perpendiculares à direção das fibras, apresentam uma morfologia fusiforme e

alongada na direção das fibras. Assim, pode-se constatar que a orientação de contato pré-

estabelecido entre fibras de PCL e os fibroblastos predominaram em relação à orientação da

tensão mecânica aplicada. Portanto, existe um efeito predominante da orientação das fibras do

que das forças exercidas pelo estiramento cíclico na morfologia dos fibroblastos diante dos

parâmetros utilizados neste estudo.

Yoshigi et al (2003) e Huang et al. (2013), observaram que células endotelias e

fibroblastos, respectivamente, cultivadas sobre suportes de silicones (sem texturas pré-

existentes), quando são submetidos à forças de estiramento apresentam reorientação celular no

sentido perpendicular da força aplicada. Essa reposta celular é uma adaptação das fibras de

actina para minimizar as tensões resultantes nos corpos celulares, como uma maneira de “fugir”

da força de estiramento (Neidlinger-Wilke et al. 2001; Ghazanfari et al. 2009). Porém, no

estudo de Wang et al (2004), em fibroblastos de tendão humano cultivados sobre membranas

81

de silicones com micro sulcos retangulares nas dimensões de 10 mm de largura e 3 mm de

profundidade, os fibroblastos permaneceram alinhados na direção dos sulcos, independente das

forças mecânicas exercidas serem paralelas ou perpendiculares aos sulcos. Deste modo, os

resultados obtidos sugerem que não só a magnitude da tensão aplicada, mas a arquitetura dos

suportes influenciam na morfologia das células quando sujeitas a tensão uniaxial cíclica.

No estudo de Lee et al (2005), para fibras de poliuretano alinhadas e aleatórias em ensaio

estático, observou-se que a produção de colágeno nas fibras alinhadas foram superiores em

relação as células cultivadas em fibras aleatórias. No entanto, quando os fibroblastos foram

submetidos a estiramentos nos sentidos paralelos e perperdicular, esses não apresentaram

diferenças histológicas significativas, porém, nas fibras alinhadas que receberam estiramento

paralelo à sua direção, observou-se um aumento significativo de colágeno, indicando que

estruturas com fibras alinhadas tem potencial de aplicação como scaffolds para ligamentos em

engenharia tecidual.

Subramony et al (2013) apresentaram para o sistema de células mesenquimais, quando

estimulado mecanicamente e cultivadas sobre fibras alinhadas de PLGA e submetidas a força

uniaxial na mesma direção das fibras alinhadas, podem induzir a diferenciação celular, fato não

observado quando as células sofrem estímulos mecânicos sobre fibras aleatórias. Esta

combinação do estímulo mecânico e fibras alinhadas promoveram a diferenciação de células

mesenquimais em fibroblastos, sem a necessidade de estímulos químicos.

Portanto, a orientação das fibras como fator determinador da morfologia celular como

um guia de orientação morfológico é um fator que pode diretamente influenciar na

funcionalidade da célula. Assim, é importante compreender a influência topográfica das

membranas, a fim de otimizar o desenvolvimento de novos métodos de regeneração tecidual.

82

Conclusão

As fibras de PCL aleatórias e alinhadas foram obtidas com sucesso. Os tempos de

cultivo de 1 a 7 dias mostraram uma proliferação celular qualitativa, apresentando excelente

biocompatibilidade dos fibroblastos sobre as fibras de PCL, que desempenham um papel

importante na regeneração de tecidos. As células se ligam e se espalham em membranas

fibrosas de PCL em um padrão fusiforme típico de fibroblastos para as fibras alinhadas. A

reorientação dos fibroblastos variou com orientação de fibra inicial do estiramento aplicado, e

em cada caso foi predito com precisão com a suposição de que a reorientação ocorre.

83

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89

4. Desenvolvimento de membranas poliméricas obtidas pelo processo de

eletrofiação com associação de Pterodon pubescens Benth e Arrabidaea

chica Verlot para aplicação em regeneração tecidual guiada

Resumo

A técnica de regeneração tecidual guiada (GTR) pode ser aplicada na odontologia e em outras

especializações da medicina, tal como na ortopedia. Na odontologia moderna a GTR tem sido

principalmente utilizada em periodontia e implantodontia, para tratar defeitos periodontais,

reconstruir tecido ósseo perdido, danificado e atrofiado, em procedimentos de implantes

dentários ou para preservar as bases alveolares após a extração dentária. A fim de melhorar o

potencial de aplicação para a GTR, membranas poliméricas de poli (ε-caprolactona) (PCL)

obtidas pelo processo eletrofiação foram associadas a dois extratos vegetais, o Pterodon

pubescens Benth (P. pubescens) e/ou Arrabidaea chica Verlot (A. chica) que são caracterizados

pelas suas atividades farmacológicas de ação antiinflamatória e cicatrizante, respectivamente.

As membranas fibrosas de PCL associada aos extratos vegetais foram avaliadas na sua

capacidade de liberação dos princípios ativos através da análise de Cromatografia Líquida de

Alta Eficiência (HPLC). Ensaios de citotoxicidade e proliferação celular foram realizados in

vitro em células NIH-3T3 durante 1, 3 e 7 dias. Os resultados sugerem que a membrana de PCL

eletrofiada associada aos extratos vegetais P. pubescens e/ou A. chica apresentam propriedades

anti-inflamatória e cicatrizante, respectivamente, que são promissoras e adequadas para

aplicações em regeneração tecidual guiada.

Palavras-chaves: eletrofiação, PCL, Pterodon pubescens, Arrabidaea chica, liberação de

fármaco

90

Introdução

Eletrofiação é uma técnica promissora e fornece um meio relativamente simples e de

baixo custo para produzir membranas fibrosas que têm sido utilizadas extensivamente em

aplicações no sistema de regeneração tecidual guiada (RTG), liberação controlada de fármaco,

curativos para feridas, suporte de crescimento celular, dentre outras, devido à sua alta relação

área/volume e porosidade (Bhardwaj & Kundu, 2010; Liao et al, 2012; Nune et al, 2016).

As membranas poliméricas (scaffolds) desenvolvidas pelo processo de eletrofiação

podem ser empregadas como barreiras físicas em RTG. O conceito de RTG, baseia-se na

utilização de barreiras físicas que impedem o epitélio gengival e células do tecido conjuntivo

de invadir a cavidade óssea durante o processo de cura (Castillo-dalí et al, 2016). Assim,

recentemente, na área de odontologia, principalmente periodontia e implantodontia, tem usado

amplamente essa prática para tratar defeitos ósseos, alcançando sucesso (Ma et al. 2014;

Jamuna-Thevi et al. 2016). A aplicação dessas membranas poliméricas tem como finalidade a

regeneração do tecido ósseo, promovendo o reparo da região através da síntese do tecido

original, podendo ser espontânea ou induzida associados com fatores de crescimento, fármacos

ou extratos vegetais (P.pubescens e/ou A. chica), sendo aplicadas no local da ferida ou

diretamente na lesão (O’Brien, 2011; Gautam et al, 2013). Atualmente, ocorre a extrapolação

desta técnica para vários tecidos, como tecido nervoso, cartilaginoso e conjuntivo (Iamaguti et

al. 2008).

Polímeros sintéticos biorreabsorvíveis como o poli (ε-caprolactona) (PCL) oferecem

vantagens no desenvolvimento de membranas fibrosas obtidas pelo processo de eletrofiação,

pois possui a capacidade de adequar propriedades mecânicas e cinética de degradação, pode ser

fabricado em diversas formas com características morfológicas e poros interconectados que são

propícios ao tecido em crescimento celular, além de estarem associadas com extratos vegetais

que podem induzir o crescimento tecidual e melhor a resposta inflamatória do hospedeiro

(Gunatillake 2003).

Neste estudo, foram desenvolvidas composições de membrana polimérica de PCL

obtida pelo processo eletrofiação, contendo extratos vegetais. Os extratos utilizados foram

obtidos de Pterodon pubescens Benth (Sucupira) e/ou Arrabidaea chica Verlot, pois estes

apresentam atividade anti-inflamatória (Sabino et al. 1999; Coelho et al. 2005; Montero et al.

91

2012; Hoscheid & Cardoso 2015) e cicatrizante (Zorn et al. 2001; Jorge et al. 2008; Aro et al.

2013; Paula et al. 2013), respectivamente. Ressalta-se que as barreiras físicas devem promover

resposta celular (A. chica estimulação da cicatrização) e não produzir reação inflamatória (P.

pubescens: ajuda no combate do processo anti-inflamatório e apresenta propriedades

analgésicas, devido à presença dos vouacapanos). Portanto, foi desenvolvida uma membrana

com a capacidade de liberar de forma controlada os princípios ativos vegetais com as referidas

atividades biológicas, sendo esses extratos utilizados pela primeira vez em associação. Os

resultados apresentados nesta sessão originaram um pedido de patente (Número do registro no

INPE: BR 10 2016 028506 2).

92

Material e Métodos

O material utilizado neste trabalho foram PCL ( poly(caprolactone) com massa

molecular de 80000 g/mol (Sigma Aldrich) e acetona (Synth-Brasil). O PCL (20% massa) e a

acetona (80% massa) foram misturados sem qualquer tratamento ou purificação e suas

concentrações mantidas constantes nas membranas. Os extratos vegetais Pterodon pubescens

Benth e Arrabidae chica Verlot foram gentilmente fornecidos pela Prof Mary Ann Foglio do

Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) - UNICAMP

da Divisão de Farmacologia e Toxicologia. O preparo e a padronização dos extratos vegetais

P. pubescens e A. chica estão detalhados nos trabalhos de Grando (2013) e Sousa (2013),

respectivamente.

4.2.1 Preparo das soluções

Todas as soluções foram agitadas durante três horas (Shaker Nova Ética, modelo 114),

à temperatura de 23 °C submetido ao processo de eletrofiação no mesmo dia da preparação. A

Tabela 4.1 apresenta a quantidade em massa (mg) dos extratos vegetais adicionada à solução

polimérica de PCL.

Tabela 4.1 Quantidade em massa (mg) dos extratos vegetais

Amostras P. pubescens A. chica

PCL-Pp 0,10 -

PCL-Ac - 0,25

PCL-PpAc 0,10 0,25

*Pp: Pterodon pubescens; Ac: Arrabidaea chica

93


O sistema de eletrofiação utilizado neste estudo consistiu de uma seringa de 10 mL e

uma agulha com diâmetro 0,55 mm, uma bomba de infusão (kdScientific, KDS-100 Modelo),

uma fonte de alta tensão (Testtech) e uma placa de colectora aterrada.

As soluções foram fiadas à temperatura ambiente a 25ºC e umidade de 52%, com vazão

de 2 mL/h e tensões de 12 a 13 kV. A distância da ponta da agulha à placa coletora foi de 12

cm.

4.2.3 Caracterização

4.2.3.1 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) para as membranas

A morfologia das fibras obtidas a partir das soluções eletrofiadas neste estudo foram

avaliadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) utilizando um equipamento ZEISS

(Modelo Evoma-15). Para a observação pelo MEV, as amostras foram fixadas em suporte

metálico com fita dupla face de carbono e revestidas em ouro utilizando um equipamento

Sputter Coater, Bal-Tec (Modelo SCD-O5O). Os diâmetros médios das fibras foram

determinados por análise das imagens de MEV, utilizando o programa de análise de imagens

ImageJ®, onde foram medidos os diâmetros de 50 fibras de cada amostra escolhidas

aleatoriamente, valores médios e desvios-padrão foram obtidos.


O ângulo de contato foi medido para avaliar o caráter hidrofílico das membranas de

PCL-Pp, PCL-Ac e PCL-PpAc, no entanto, as membranas de PCL foram utilizadas como

controle. Foi utilizado um microscópio óptico Hitachi com o software Axio s40 V4.8.2.0. Gotas

de água deionizada (5,0 µL) foram colocadas sobre a superfície da amostra, utilizando uma

94

pipeta (Transferpette). Todas as medições foram realizadas a 25 ± 3 ° C com uma umidade

relativa de 40 ± 4%. Os ângulos de contato foram medidos usando o programa ImageJ 1.47v

com o plugin Análise Drop (LB-ADSA®). Três medidas foram realizadas para cada grupo de

amostras e valores médios e desvios-padrão foram obtidos. Após a coleta dos dados e a

categorização das variáveis, foi realizada a transferência dos valores para o Programa GraphPad

Prism 5®. As análises estatísticas dos resultados foram analisadas, aplicando-se os testes

estatísticos Análise de Variância (Anova) + Comparação múltipla com o teste de Tukey.

Considerou-se o nível de significância de 5%, ou seja, os dados foram estatisticamente

significativos para p <0,05.

4.2.4 Ensaio de liberação do extrato vegetal

Para a análise da liberação dos extratos vegetais P. pubescens e A. chica, as amostras

das membranas foram cortadas nas dimensões de 1,0 x 1,0 cm2 e estas foram imersas em

duplicata em células de Franz adaptadas (Figura 4.1.) contendo 2 mL de tampão fosfato salino

(PBS) pH 7,4. As células de Franz foram seladas com Parafilm® M (Sigma-Aldrich®).

O experimento de liberação foi realizado em aparato adaptado de célula de difusão

vertical tipo Franz, conforme a Figura 4.1. Para manter as amostras à temperatura de 37ºC, foi

utilizada uma câmara de aquecimento com agitação magnética IKA® Werke (RT 15 power) e

acima desta, foi adicionada uma câmara acrílica com as mesmas dimensões (180 x 495 mm),

contendo 15 orifícios para posterior introdução das células de Franz adaptadas. Toda a câmara

foi preenchida com água destilada, que manteve-se à temperatura de 37± 2ºC. A temperatura

manteve-se constante e o controle da mesma foi realizada com o auxílio de termômetro digital

(Incoterm®) durante todo o experimento de liberação dos extratos (1, 3 e 7 dias).

A solução de PBS presente nas células de Franz adaptadas mantiveram-se homogêneas

com o auxílio de agitadores magnéticos de 0,5 cm e sob agitação magnética constante de 400

rpm. Em intervalos de tempo pré-estabelecidos (1, 3 e 7 dias) foram coletadas alíquotas de 250

μL de cada réplica e transferidas para inserts de 300 μL e reservadas na geladeira. Após a

95

retirada de cada alíquota foi reposto um volume correspondente ao retirado. Todos os ensaios

foram realizados em triplicata. A Figura 4.1 mostra fotografias do ensaio de liberação dos

extratos vegetais.

Figura 4.1: Fotografias do esquema do aparato adaptado de célula de Franz, utilizado

no ensaio de liberação dos extratos vegetais: 1) Membrana associada com extrato

recortada (1,0 x 1,0 cm2); 2) Célula de Franz adaptada; 3) Agitador magnético; 4)

Selamento das células de Franz; 5) Câmara aquecedora com agitação magnética; 6)

Câmara acrílica adaptada contendo água aquecida; 7) Termômetro.

4.2.5 Análise por HPLC

Nos experimentos in vitro de liberação, a quantidade do composto a ser analisada,

normalmente, é muito pequena, o que requer metodologias analíticas seletivas e de alta

sensibilidade. Em razão disso, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) tem sido

empregada como método analítico de escolha na maioria dos estudos de liberação in vitro

(SILVA et al., 2010).

96

4.2.5.1 Condições cromatográficas para P. pubescens

As análises foram realizadas por cromatográfo líquido de alta eficiência Shimadzu LC-

10AD, detector espectrofotométrico por conjunto de arranjo de diodos UV/VIS Shimadzu SPD-

M10AVP, sistema controlador SCL-10AVP, conectado a um computador com

software Shimadzu Class-VP versão 5.02, injetor automático (SIL-20ª HT). As condições

cromatográficas utilizadas estão descritas na Tabela 4.2.

Tabela 4.2: Condições cromatográficas utilizadas para quantificação de voucapanos em

extratos de P. pubescens.

Equipamentos e acessórios Especificação

Coluna CN Phenomenex (250mm x 4,6 mm x 5mm)

Volume de injeção 10mL

Vazão 1 mL/min

Fase móvel - H2O: Acetonitrila (65:35 v/v)

Temperatura interna detector 35°C

Software Software Class Vp 5:02

Comprimento de onda 220nm

4.2.5.2 Condições cromatográficas para A. chica

As análises foram realizadas pelo sistema de HPLC, Thermo Scientific (modelo -

Dionex Ultimate 3000), detector espectrofotométrico por conjunto de arranjo de diodos DAD

3000. Módulo de bomba LPG -3400SD e módulo de injetor: WPS – 3000TSL, conectado a um

computador com Software: Chromeleon 6.80®. As condições cromatográficas utilizadas estão

descritas na Tabela 4.3.

97

Tabela 4.3: Condições cromatográficas utilizadas para quantificação da carajurina em extratos

de A. chica.

Equipamentos e acessórios Especificação

Coluna Acclaim 120, C18 - 5um - 4,6x250mm

Volume de injeção 10µL

Vazão 1 mL/min

Fase móvel - H2O: Ácido fórmico (99:1 v/v)

Temperatura interna detector 35°C

Software Software Chromeleon 6.80

Comprimento de onda 470 nm

4.2.6 Ensaio in vitro

Neste trabalho foi utilizada linhagem estabelecida não cancerígena BALB/c 3T3

(fibroblasto murino). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10%

de soro fetal bovino (SFB) e 1% de antibiótico (penicilina e estreptomicina). As células foram

plaqueadas em garrafas de 75 cm² na densidade de 2 x 104 células/mL e incubadas a 37°C sob

atmosfera úmida com 5% de CO2.

4.2.6.1 Ensaio de viabilidade e proliferação celular

Ensaio de viabilidade e proliferação celular através da redução do MTT (3-brometo de

(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-tetrazólio).

Nesse ensaio, a viabilidade celular foi avaliada através da medida da capacidade das

células de reduzir o MTT (3-brometo de (4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-tetrazólio) a

formazan. O formazan é um pigmento insolúvel que é extraído das células e quantificado

espectrofotometricamente em =570 nm. A redução do MTT é catalisada principalmente pelas

desidrogenases mitocondriais e também do citoplasma. Portanto, a alteração da função

mitocondrial poderá ser detectada através da variação da capacidade de redução do MTT.

98

As células foram plaqueadas na densidade de 6 x 104 células/mL em placas de 24 poços

que já continham lamínulas com ou sem biomaterial a ser estudado. Posteriormente, foram

incubadas a 37ºC, 5% de CO2 por 1, 3 e 7 dias. Após os períodos determinados de incubação,

o meio foi removido, os poços foram lavados com tampão salina tamponado com fosfato (PBS)

e adicionado no meio sem soro contendo o corante MTT (0,5 mg/mL). Após incubação por 3h

a 37ºC, o meio foi retirado cuidadosamente e adicionado 100 L de etanol para solubilização

do formazan. As placas foram agitadas por 5 minutos e a absorbância correspondente a cada

poço foi lida no leitor de placas em =570 nm. Os valores foram expressos em porcentagens de

redução de MTT em relação ao controle, onde as células não foram expostas aos agentes testes

(Mosmann, 1983). As análises foram realizadas em triplicata.

4.2.7 Teste estatístico

Após a coleta dos dados e a categorização das variáveis, foi realizada a transferência

dos valores para o Programa GraphPad Prism 5®. As análises estatísticas dos resultados foram

analisadas, aplicando-se os testes estatísticos Análise de Variância (Anova) + Comparação

múltipla com o teste de Tukey. Considerou-se o nível de significância de 5%, ou seja, os dados

foram estatisticamente significantes para p <0,05.

99


4.3.1 Caracterização das membranas

4.3.1.1 Microscopia eletrônica de Varredura (MEV)

A Figura 4.2 apresenta as imagens de MEV das membranas eletrofiadas de PCL-Pp,

PCL-Ac e PCL-PpAc e seus histogramas de distribuições de diâmetro. Observa-se que as fibras

estão na escala de micrômetros e foram obtidas com sucesso pelo processo de eletrofiação.

Nota-se que as membranas são altamente porosas sem a presença de defeitos, tais como esferas.

O diâmetro médio das fibras de PCL-Pp (Figura 4.2 B), PCL-Ac (Figura 4.2 D) e PCL-

PpAc (Figura 4.2 F) foram de 0,45 (± 0,12) µm, 1,25 (± 0,5) µm e 1,91 (± 0,71) µm,

respectivamente. No entanto, as amostras são estatisticamente diferentes em relação ao

diâmetro da fibra.

100

Figura 4.2: Micrografias das fibras eletrofiadas A) PCL-Pp, C) PCL-Ac e E) PCL-PpAc e os

respectivos histogramas de distribuição dos diâmetros das fibras das membranas B, D e E.

Observa-se na Figura 4.2 que todas as membranas têm uma ampla distribuição do

diâmetro das fibras e a formação e interligações dos poros. Esta morfologia estrutural das

membranas fibrosas obtidas pelo processo de eletrofiação, destaca-se, pois o tamanho médio

dos poros das membranas eletrofiadas encontram-se na gama de micrômetros, o que dificulta a

infiltração dos fibroblastos (He et al. 2017), consequentemente servem como barreira física

para impedir que o tecido conjuntivo migre para o defeito ósseo (Lee et al. 2016), além de

produzir membranas com alta relação superfície/volume, o que melhora a adesão e proliferação

celular e aumenta área de incorporação de fármacos tais como antibióticos, anti-inflamatórios

e fatores de crescimento para o sistema de liberação controlada (Zhu et al. 2008; Xue et al.

2014; Lee et al. 2016; He et al. 2017)


A Figura 4.3 apresenta as imagens dos perfis dos ângulos de contatos entre as

membranas de PCL puro (controle), PCL-Pp, PCL-Ac e PCL-PpAc e uma gota de água

destilada. As fotografias foram obtidas em aproximadamente 3 segundos após a gota de água

entrar em contato com as membranas. Observa-se que apenas para membrana de PCL puro

101

(controle), foi possível mensurar os valores médios de 131,58o ± 0,74o referente ao ângulo de

contato.

Segundo Hayakawa et al (2004) uma superfície é considerada hidrofílica ou hidrofóbica

caso os âgulos estejam entre 0° < θ < 90° ou 90° < θ < 180°, respectivamente. De acordo com

o parâmetro citado anteriormente, observamos que apenas a membrana de PCL puro apresenta

comportamento hidrofóbico, enquanto que as membranas associadas aos extratos vegetais

apresentaram comportamento hidrofílico. As amostras associadas com P. pubescens e A.chica

apresentaram maior molhabilidade em relação às membranas de PCL puro, sendo as fotografias

registradas no mesmo período de tempo.

O aumento dessa molhabilidade é atribuído as modificações químicas que podem ter

ocorrido no PCL. As hidroxilas (OH) livres nos compostos presentes em A. chica e P. pubescens

estão relacionadas ao aumento da hidrofilicidade das membranas, visto que foi observada em

todas as amostras uma rápida absorção de água. Assim, observou-se que os extratos vegetais

aumentaram a hidrofilicidade das membranas de PCL puro, o que pode proporcionar um melhor

perfil na adesão e proliferação celular (He et al. 2015).

Figura 4.3: Fotografias de gotas de água destilada sobre membranas poliméricas para análise do perfil

de ângulo de contato. A) Membrana eletrofiada de PCL puro (controle); B) PCL-Pp: membrana

eletrofiada de PCL associada com P. pubescens; C) PCL-Ac: membrana eletrofiada de PCL associada

com A.chica; D) PCL-PpAc: membrana eletrofiada de PCL associada com P. pubescens e A.chica.

102

4.3.2 Ensaio de liberação dos extratos vegetais

A Figura 4.4 apresenta o cromatograma padrão com os picos dos voucapanos

tradicionais m/z 362 (éster 6α,7β-dihidroxivouacapano-17β-oato de metila) e m/z 404, que que

representa a misturas dos isômeros: m/z 404 A (éster 6α- hidroxi-7β-acetoxi-vouacapano-17β-

oato de metila) e m/z 404 B (éster 6α-acetoxi-7β-hidroxi-vouacapano-17β-oato de metila), que

são utilizados para a identificação do P. pubescens. Uma das vantagens da Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência (HPLC) em ensaios de liberação de ativos vegetais, é a sensibilidade

do equipamento, que é capaz de detectar baixas concentrações de vários compostos ao mesmo

tempo.

103

Figura 4.4: Cromatogramas referente à análise padrão de P. pubescens (sucupira) A) Voucapano m/z

362 (tempo de retenção 8.89 min) e B) Voucapano m/z 404 (tempo de retenção 12.98 min).

A Figura 4.5 representa o cromatograma do ensaio de quantificação, obtido neste

estudo após o ensaio de liberação do extrato vegetal P. pubescens. Nota-se a identificação dos

dois voucapanos tradicionais, utilizados como marcadores deste extrato, são eles, o m/z 362 e

m/z 404, que determinam a presença dos mesmos nas soluções analisadas após o ensaio de

liberação.

104

Figura 4.5: Cromatogramas referente à análise de liberação de P. pubescens (sucupira) A) Voucapano

m/z 362 (tempo de retenção 8.71 min) e B) Voucapano m/z 404 (tempo de retenção 13,06 min).

Nos estudos de Cabral et al (2013) e Grando (2013), demonstraram que os frutos de P.

pubescens podem apresentar diferenças significativas em seu perfil químico, como por exemplo

no teor dos compostos ativos m/z 362 e m/z 404. Interessante ressaltar que a concentração do

voaucapano m/z 404 é cerca do dobro do m/z 362, para o extrato diclorometânico de P.

pubescens (Grando, 2013). No entanto, neste estudo, verificou-se uma maior concentração na

liberação do voaucapano m/z 362 em relação ao m/z 404 para as membranas de PCL-Pp, em

contrapartida, para as membranas de PCL-PpAc, observou uma maior concentração liberada de

m/z 404, o que era esperado pelo fato deste ser majoritário no extrato do P. pubescens (ver

Tabela 4.4). Assim, esse sinergismo entre os extratos vegetais P. pubescens e A.chica precisam

ser melhores avaliados e segue como sugestão para trabalhos futuros. A Tabela 4.4 apresenta

os valores médio do total dos vouacapanos m/z 362 e m/z 404 liberado em microgramas por

centímetro quadrado (µg/cm2) por tempo (dias).

105

Tabela 4.4 Média do total dos vouacapanos m/z 362 e m/z 404 liberado em microgramas

por centímetro quadrado (µg/cm2) por tempo (dias)

PCL-Pp PCL-PpAc

Vouacapanos 362 404 362 404

1 dia 2896,0 (±2,90) 2504,0 (±0,87) 1996 (±2,64) 2255,0 (±1,95)

3 dias 2838,4 (±2,81) 2806,8 (±0,45) 1642,5 (±0,35) 2314,1 (±0,52)

7 dias 2935,0 (±0,62) 3057,5 (±0,19) 1795,0(±1,57) 2597,5 (±0,83)

Os diferentes perfis de liberação observados nas membranas de PCL-Pp associada ao

extrato de Pterodon pubencens podem ser explicados devido à substâncias de diferentes

polaridades presente nos extratos.

O fenômeno da liberação encontrada para as membranas de PCL-Pp pode ser explicado

devido à polaridade das substâncias. O composto de m/z 404 (ver Figura 4.4 B) é menos polar

que o m/z 362 (ver Figura 4.4 A), observa-se que o m/z 362 tem maior quantidade de hidroxilas

(OH) livres em sua estrutura molecular, caracterizado como uma molécula polar, ou seja, tem

afinidade pela água. Deste modo, pelo fato do PCL ser hidrofóbico, pode ter ocorrido uma

afinidade entre PCL e a substância m/z 404, e assim por esta ser mais hidrofóbica apresentou

maior dificuldade de ser liberada através da membrana de PCL. Em contrapartida, a substância

de m/z 362 não demonstrou a mesma dificuldade e liberou facilmente da matriz polimérica do

PCL, provavelmente por ser uma substância mais polar e assim, por possuir afinidade com o

meio externo (solução de PBS) foi liberada em maior concentração em relação ao outro

marcador do extrato de P. pubescens.

Deste modo, ocorreu um interessante perfil de liberação nas membranas PCL-Pp, por

liberar maior quantidade de seu marcador minoritário m/z 362 liberando no primeiro dia de

experimento 2896,0 µg/cm2 contra 2504,0 µg/cm2 do marcador m/z 404. Conforme Tabela 4.4

podemos observar que no terceiro dia de ensaio houve uma leve diminuição na liberação do

composto m/z 362 com 2838,4 µg/cm2 e um ligeiro aumento de m/z 404 (2806,8 µg/cm2). Uma

maior liberação do composto m/z 404 (3057,5 µg/cm2) foi observado também no sétimo e

último dia de ensaio, com um ligeiro aumento do composto m/z 362 (2935,0 µg/cm2). Apesar

do composto marjoritário (m/z 404) não ter sido liberado em grande quantidade no primeiro dia

106

do ensaio, nos outros dias apresentou um considerável aumento na liberação com média de 553

µg/cm2 a mais liberado em relação ao primeiro dia. Já o composto m/z 362 apresentou um perfil

de liberação constante em todas as concentrações coletadas, não apresentando diferenças

significativas no perfil de liberação. Considera-se um ótimo resultado de liberação em relação

à área, comprovando que as membranas desenvolvidas atuam como um novo sistema de

liberação de substâncias biologicamente ativas.

Com relação aos resultados de liberação da membrana contendo a associação dos

extratos de P. pubescens e A. chica (PCL-PpAc) observa-se que ocorreu um diferente perfil de

liberação dos principais compostos presentes no extrato de sucupira (P. pubescens), em relação

à membrana contendo apenas P. pubescens (PCL-Pp).

Após 24 horas de liberação a membrana PCL-PpAc liberou um total médio de 1996

µg/cm2 do composto m/z 362, ou seja 900 µg/cm2 à menos em relação à PCL-Pp. Já o composto

de m/z 404 apresentou liberação média de 2255 µg/cm2 apresentando menos 249 µg/cm2 em

relação à outra membrana. No terceiro dia de ensaio, verificou-se que a membrana PCL-PpAc

foi capaz de liberar um total médio de 1642,5 µg/cm2 do m/z 362, representando uma quantidade

de 353,5 µg/cm2 à menos em relação à dosagem inicial. Neste mesmo período de tempo, a

referida membrana liberou 2314,1 µg/cm2, referente à 59,1 µg/cm2 a mais do composto m/z 404

em relação à dosagem coletada referente ao período de 24 horas. No sétimo dia, verificou-se

que houve um ligeiro aumento na quantidade de composto m/z 362 liberado (1795 µg/cm2)

correspondendo 152,5 µg/cm2 a mais relação ao terceiro dia de ensaio. Já o composto m/z 404

apresentou liberação de 2597 µg/cm2 neste dia de experimento, correspondendo a 342,5 µg/cm2

a mais liberado em relação ao primeiro dia de ensaio e 282,9 µg/cm2 em relação ao terceiro dia

de ensaio.

O resultado de liberação apresentado pela membrana PCL-PpAc difere do resultado

discutido anteriormente (PCL-Pp), pois esta membrana apresenta a associação do extrato de A.

chica, que trata-se de um extrato etanólico contendo grande quantidade de compostos polares,

como os flavonoides marjoritários conhecidos como carajurina e carajurona (Jorge et al. 2008).

As plantas produzem uma variedade de substâncias antioxidantes, dentre as quais se destacam

os compostos fenólicos. A atividade antioxidante de compostos fenólicos, em especial os

flavonóides, deve-se, principalmente, as suas propriedades redutoras e estrutura química

caracterizada pelo grupo catecol (OH-C=C-OH), dupla entre C2 e C3 conjugada (O=C-C-OH-

107

C=C) e dupla entre OH em C3 e C5 com 4-oxo (OH-C=C-C=O-C-OH) (Zanutto et al., 2013).

Assim, os compostos presentes em A. chica podem ter contribuído para alterar a hidrofilicidade

da nova membrana desenvolvida (PCL-PpAc) em associação com dois diferentes tipos de

extratos vegetais. E, estes compostos podem ter influenciado no perfil de liberação dos

compostos m/z 404 e m/z 362 presentes no extrato de sucupira.

A Figura 4.6 A e B mostra os gráficos de liberação do extrato vegetal P. pubescens para

as membranas de PCL-Pp e PCL-PpAc, respectivamente. Membranas fibrosas obtidas pelo

processo de eletrofiação normalmente apresentam uma liberação de explosão inicial severa,

devido à alta concentração do fármaco distribuído na superfície das fibras (He et al. 2015).

Observou-se que o perfil de liberação para ambas as membranas e para ambos voaucapanos

foram caracterizados por uma liberação inicial, e por conseguinte uma liberação gradual e

constante até o sétimo dia. O tempo de degradação in vivo do PCL é de aproximadamente 24 a

36 meses (Barbanti et al., 2005), assim, o mecanismo de liberação dos extratos vegetais

provavelmente será pelo sistema de difusão, ou seja, passagem do extrato vegetal do meio mais

concentrado (membrana), para o local de menor concentração (organismo) (He et al. 2015).

Esta técnica pode ser usadas para dar um controle adequado sobre cinética de liberação de

fármacos (Sill & von Recum, 2008). Sob os efeitos dos fatores acima, as membranas de PCL

mostram uma liberação controlada e sustentada dos voaucapano m/z 362 e m/z 404.

108

Figura 4.6: Gráfico de liberação do extrato vegetal P. pubescens associado às membranas de PCL em

períodos de 1,3 e 7 dias de imersão em PBS. A) PCL-Pp e B) PCL-PpAc.

A Figura 4.7 apresenta o cromatograma padrão com o pico tradicional da carajurina

que é utilizada para a identificação da A. chica.

Figura 4.7: Cromatograma referente à análise padrão de A.chica (carajurina) (tempo de retenção

13.05 min).

109

A Figura 4.8 representa o cromatograma do ensaio de quantificação, obtido neste

estudo após o ensaio de liberação do extrato vegetal A.chica. Nota-se a identificação da

carajurina (6,7-dihidroxi-5,4’-dimetoxiflavilium) utilizada como marcadora do extrato vegetal

A.chica, que determinou a presença da mesma na solução analisada após ensaio de liberação.

Devido a limitação da técnica de HPLC-UV, somente uma amostra de PCL-PpAc do período

de 1 dia foi identificada e quantificada com uma concentração de 540 µg/cm2, assim as outras

amostras serão analisadas pela técnica de LCMSMS (Cromatografia líquida acoplada ao

espectrômetro de massa) em um segundo momento.

Figura 4.8: Cromatograma referente à análise de liberação de extrato A.chica (carajurina) (tempo de

retenção 13.03 min).

A Figura 4.9 mostra fotografias da membrana de PCL-Ac após o ensaio de liberação

do extrato vegetal A.chica. Visualmente, foi observado que após 7 dias do ensaio de liberação

a solução de PBS e o agitador magnético encontram-se avermelhados, este fato pode estar

relacionado com os pigmentos vermelhos que as folhas da A. chica fornecem, caracterizado

como marcador da carajurina (Taffarello 2008).

110

Figura 4.9: Fotografias da membrana de PCL-Ac após ensaio de liberação do extrato vegetal

no período de 7 dias. A) 1: Célula de Franz e 2) Solução de PBS avermelhada; B) 3:

Membrana de PCL-Ac e 4: Agitador magnético avermelhado.

O interesse da associação dos extratos vegetais P. pubescens e A.chica para aplicações

em regeneração tecidual guiada, deve se ao fato destes apresentarem propriedades anti-

inflamatórias/analgésicas e cicatrizantes, respectivamente. O processo de cicatrização pode ser

divido basicamente em três fases, tais como, fase inflamatória (4 a 6 dias), fase de proliferação

(4 a 14 dias) e fase de remodelamento ou de maturação (8 dias à 1 ano) (Childs & Murthy,

2017)

O processo inflamatório é importante para desencadear a cascata da cicatrização e pode

ser visto como um mecanismo de defesa do organismo, porém, a inflamação pode causar

desconforto como dor e edema. Observou na Figura 4.6 que os voaucapanos m/z 362 e m/z 404

tendem a permanecerem lineares entre o período de 3 a 7 dias, sendo que a presença deste

extrato no organismo durante este período pode minimizar a fase inflamatória, pois a planta

medicinal P. pubescens limita significativamente as fases de resposta à dor e a formação de

edema (Nucci et al. 2012). Em cirurgias odontológicas, a intensidade da dor, geralmente está

111

relacionada com a extensão da cirurgia (Fattah et al, 2005), visto que, a dor e o edema fazem

parte de complicações pós-operatórias e pacientes e cirurgiões ficam apreensivos com os

supostos sintomas (Paulesini et al. 2008), propor alternativas para prevenir ou aliviar a dor

aguda e o edema, podem melhorar a qualidade de vida dos pacientes pós-cirurgia.

A fase proliferativa da cicatrização envolve a migração e proliferação dos fibroblastos

e células endoteliais (Childs & Murthy, 2017). Os fibroblastos compõem o maior número de

células do tecido conjuntivo e sintetizam grande parte da matriz extracelular (Isaac et al. 2010).

Assim, alguns resultados obtidos na literatura (Jorge et al. 2008; Aro et al. 2013; Taffarello et

al. 2013), reportam que o extrato de A. chica tem a capacidade de induzir a proliferação de

fibroblastos, consequentemente, possui ação cicatrizante. Assim, um extrato que estimule a

proliferação de fibroblastos pode favorecer a cura de feridas (Houghton et al. 2005). Então, a

membrana de PCL associada com o extrato de P. pubescens e A. chica tem a intenção de inibir

a ação inflamatória aguda, diminuir a dor pós-cirurgia e estimular o processo de cicatrização.

4.3.3 Ensaio de viabilidade celular

A Figura 4.10 mostra a atividade mitocondrial dos fibroblastos murinos (BALB/c 3T3)

após 24h. Em relação às membranas de PCL-Pp, PCL-Ac e PCL-PpAc todas apresentaram um

comportamento não citotóxico. A média dos resultados proveniente do cultivo sobre as

membranas poliméricas, confere viabilidade celular superior a 70% em comparação ao controle

negativo, demonstrando a citocompatibilidade das membranas em todas as composições (ISO

10993-5, 2009), com valores na faixa de 96 a 148% aproximadamente.

Após 24 horas de cultivo, uma maior densidade de células foram encontradas nas

membranas de PCL-Ac e PCL-PpAc, significativamente mais elevado em 22% (p >0,1) e 48%

(p >0,001) respectivamente, em comparação ao grupo controle (p>0,5, Método de Tukey).

112

Figura 4.10: Avaliação da viabilidade em células BALB/c 3T3. As células BALB/c 3T3

foram cultivadas sobre as membranas de PCL-Pp, PCL-Ac e PCL-PpAC por 24 horas. Os

valores foram expressos em absorbância em relação ao grupo controle, onde as células não

foram expostas aos materiais. O experimento foi realizado em microplacas de 24 poços e os

resultados representam as médias e desvios padrão do experimento. * p<0,05.

Estes resultados estão de acordo com a literatura que preleciona que o PCL é um

polímero sintético que pode ser utilizado como biomaterial, pois apresentam

biocompatibilidade consagrada e segura para aplicações biomédicas (Elzubair et al. 2006;

Baker et al. 2009; Kim et al. 2015). Além do mais, observou que os extratos vegetais P.

pubescens e A. chica também apresentaram perfil não citotóxico, ressaltando que as membranas

de PCL funcionalizadas com A. chica favoreceram significativamente o crescimento dos

fibroblastos, resultados também observados nos estudo in vitro e in vivo obtidos por Jorge et al

(2008) e Taffarello et al (2013), que sugeriu a ação cicatrizante do extrato vegetal A. chica

(Taffarello et al, 2013).

113

4.3.4 Ensaio de proliferação celular

A Figura 4.11 mostram o perfil de comportamento proliferativo das células de

fibroblastos 3T3 cultivadas sobre as membranas de PCL associados com os extratos vegetais

ao longo do tempo de 1, 3 e 7 dias. Observamos que no decorrer do tempo de cultivo dos

fibroblastos, houve um crescimento ascendente do número de células, onde as membranas de

PCL associados aos extratos vegetais P. pubescens e A. chica susteraram a proliferação celular

até o período de 7 dias in vitro. Estes resultados demonstram que todos os grupos analisados,

podem ser utilizados como membranas funcionalizados em engenharia tecidual.

Figura 4.11: Avaliação da proliferação de células de fibroblastos BALB/c 3T3 em

membranas de PCL-Pp, PCL-Ac e PCL-PpAc, após 1, 3 e 7 dias. Os valores foram expressos

em porcentagens de redução de MTT em relação ao ensaio controle, onde as células não foram

expostas as membranas. O experimento foi realizado em microplacas de 24 poços e os

resultados representam as médias e desvios padrão do experimento em triplicata. * p<0,05

114

Na Figura 4.11, nota-se que a membrana de PCL-Pp quando comparada ao perfil de

crescimento celular do grupo controle, durante o período de 1 e 3 dias, não apresentaram

diferença estatística, porém no sétimo dia o grupo controle apresentou um crescimento celular

significativo (p< 0,01) em relação ao PCL-Pp. Este comportamento revela que a membrana de

PCL-Pp não é citotóxica, mas no entanto, não estimula a proliferação celular. A membrana de

PCL-Ac vs grupo controle apresentou uma diferença significativa (p< 0,001), nos intervalos de

tempo de 3 e 7 dias, em contrapartida a membrana de PCL-PpAc demonstrou resultados

significativamente melhores em todos os intervalos de tempo analisados, (p< 0,01) para 1 dia e

p< 0,001 para 3 e 7 dias. Percebe-se que as concentração de A. chica nas membranas de PCL-

Ac e PCL-PpAc foram a mesma (ver Tabela 4.1), assim ambas apresentaram o mesmo

comportamento durante o ensaio de proliferação celular nos períodos de 3 e 7 dias, ou seja, não

houve convergência na ação dos princípios ativos e não mostraram interferência no perfil de

liberação dos extratos vegetais quando foram associados.

Jorge et al (2008), avaliaram a ação cicatrizante da A. chica para a síntese de colágeno

in vitro e in vivo. Os resultados in vitro demonstraram que uma dose de 250 µg /mL de A. chica

foi capaz de aumentar a produção de colágeno e em testes in vivo o extrato foi capaz de reduzir

lesões da pele em 13 % em dois dias após aplicação tópica, sendo que em 10 dias, 96% da pele

estava cicatrizada, isto é, relatou a eficiência da propriedade do extrato para cicatrização de

feridas.

Segundo Taffarelo et al (2013), em ensaios in vitro demonstraram que o extrato vegetal

de A. chica nas concentrações de 0,25; 2,5 e 25 µg/mL-1 induz o crescimento de fibroblastos da

linhagem 3T3 e sugeriu que a ação cicatrizante dos extratos pode estar relacionada à presença

das antocianinas, que se destacam pela ação antioxidante, anti-inflamatória e anticancerígena.

No trabalho de Aro et al (2013), o tendão de ratos Wistar foram parcialmente lesionados

e em seguida tratados com extratos de A. chica. Assim, no 14º dia perceberam que o extrato

tinha melhorado a organização das fibras de colágeno e notaram a presença das células de

fibroblastos mais alongadas e fibrilas longitudinalmente e transversalmente orientadas, fator

importante para restaurar a organização estrutural da matriz extracelular que foi perdida durante

a lesão. Assim, demonstraram que a aplicação tópica do extrato de A. chica poderia melhorar a

organização das fibras de colágeno no reparo do tendão, sendo interessante para aplicações em

115

procedimentos clínicos, desta maneira as membranas de PCL-Ac e PCL-PpAc apresentam

potencial aplicações em regeneração tecidual.

Estudos da literatura comprovam as atividades antinoceptiva e anti-inflamatória do

extrato P. pubescens, estas atividades são atribuídas à presença de geranilgeraniol e

voaucapanos isolados (Spindola et al. 2010; Spindola et al. 2011).

No trabalho de Vieira et al (2008) foi demonstrado que a atividades no ensaio de

viabilidade celular com extrato alcoólico a partir das sementes de P. pubescens à uma

concentração de 30 mg/mL exerceu uma atividade antitumoral, podendo matar células de

melanona humano. Nota-se que no presente estudo, a concentração do extrato de sucupira

utlizada nas membranas poliméricas (ver Tabela 4.1), não apresentou citotoxicidade e não

afetou o crescimento ascendente dos fibroblastos.

Estudos na literatura têm demonstrado a eficácia do extrato de P. pubescens em

aplicações terapêuticas, como inibir edema e dor causada por artrite (Sabino et al. 1999) e para

tratamento de doenças reumáticas (Hoscheid & Cardoso 2015). Coelho et al (2005), estudaram

os efeitos antinociceptivos do extrato de sementes de Pterodon, sugerindo que ambos os

mecanismos inibitórios periféricos e centrais estão envolvidos e mostraram esse

comportamento com doses baixas (13 µg/kg), justificando o uso popular em distúrbios da dor.

Grando (2013), apresentou em seu estudo dados que sugerem um efeito sinérgico dos

compostos vouacapanos e geranilgeraniol que são encontrados nos extratos de P. pubescens,

favorecendo o aumento do efeito antinociceptivo, todavia mostraram que a atividade anti-artrite

reumatóide do extrato diclometânico foi evidenciado pela redução do índice de artrite e

diminuição do número de linfócitos e o uso contínuo por durante 14 dias, não interferiu nas

funções renais e hepáticas dos animais. Hoscheid et al (2013), mostraram que a administração

do extrato de P. pubescens exibe atividade anti-inflamatória e não apresenta toxicidade para

modelos de pleurisia e artrite induzida em ratos Wistar. Nucci-Martins et al (2015), apresentou

em seu trabalho que a administração oral do óleo de P. pubescens causa inibição significativa

na dor neuropática sem causar efeitos colaterais, como sedação ou disfunção e não apresentaram

toxicidade em níveis de lesão renal ou hepática, destacando seu potencial terapêutico medicinal.

A técnica de eletrofiação tem o potencial de produzir membranas fibrosas

funcionalizadas com a incorporação de agentes bioativos diretamente na matriz polimérica,

como os extratos vegetais e promover a liberação controlada destes agentes durante um período

116

específico. Assim, neste estudo, através do processo de eletrofiação conseguimos funcionalizar

as membranas de PCL com os extratos vegetais P. pubescens e A. chica e com os resultados

obtidos, acreditamos que estas membranas possam ser utilizadas em diversas aplicações na área

médica e odontológica.

Conclusão

Assim, sob as condições adotadas no processo de eletrofiação obtivemos sucesso no

desenvolvimento das membranas de PCL contendo os extratos vegetais A. chica e P. pubescens.

Nas três composições, as membranas não apresentaram efeitos citotóxicos. Com a incorporação

dos extratos vegetais, a membrana hidrofóbica de PCL modificou-se em membranas

hidrofílicas. A liberação dos extratos vegetais apresentaram um perfil de liberação linear e

gradual. A A.chica apresentou atividade de proliferação de fibroblastos. Isto demonstrou que as

referidas membranas PCL-Ac e PCL-PpAC possuem potencial de aplicação em regeneração

tecidual guiada.

117

Conclusões finais

Este trabalho permitiu estabelecer os parâmetros do processo de eletrofiação para obter

membranas fibrosas de PCL e PR, podendo ou não estar associada com os extratos vegetais P.

pubescens e A. chica. Assim, as membranas foram produzidas com sucesso.

A adição do polímero PR e dos extratos vegetais P. pubescens e A. chica melhoraram a

hidrofilicidade das superfícies das membranas de PCL, considerando uma diminuição nos

ângulos de contato das membranas de PCL/PR, PCL-Pp, PCL-Ac e PCL-PpAc.

As características biológicas apresentadas por todas as membranas obtidas neste trabalho,

mostraram que estes biomateriais demonstram comportamento adequado in vitro, como pode

ser observado pela ausência de citotoxicidade. Por conseguinte, indicam que as membranas são

promissoras para aplicações em regeneração tecidual.

Para o ensaio in vivo, as membranas PCL/PR promoveram uma intensa atividade de

células gigantes, sugerindo uma reação de corpo estranho, no entanto, o comportamento in vivo

foi estável e não aumentou a área do defeito crítico e seu desempenho foi comparável ao grupo

controle. Sob os limites deste estudo, as membranas eletrofiadas de PCL/PR demonstraram que

não são citotóxicas em um teste rápido de 24 horas, contudo, este material não melhorou a

reparação em um defeito ósseo de tamanho crítico.

Os efeitos da orientação de contato fornecida pelas estruturas fibrosas aleatórias e

alinhadas, demonstraram em ensaio estático e cíclico que as células de fibroblastos

acompanharam a morfologia das fibras, assim os fibroblastos foram espalhados aleatoriamente

sobre as fibras com direções aleatórias, em contrapartida, em fibras alinhadas, os fibroblastos

mostraram uma morfologia alongada e alinhada uniformemente à direção das fibras. Portanto,

os parâmetros do ensaio de estiramento uniaxial cíclico estabelecidos neste estudo não

influenciaram diretamente na morfologia celular.

118

As membranas de PCL associada com P.pubescens e A.chica desenvolvidas neste estudo,

apresentaram biocompatibilidade e eficiência na liberação controlada dos respectivos extratos

vegetais, mostrando ser uma alternativa viável como sistema de liberação controlada

implantável para o tratamento de regeneração tecidual com potencial aplicação em medicina e

odontologia. Todavia, o extrato de A. chica evidenciou sua eficiência para induzir a proliferação

de fibroblastos, consequentemente, sugerindo ação cicatrizante o que pode favorecer a cura de

feridas.

Assim, o presente trabalho contribuiu para o desenvolvimento de membranas fibrosas de

PCL e PR através do processo de eletrofiação com potencial de aplicação biomédica bastante

expressivo. Além disso, até o momento, não foram relatados na literatura estudos de blendas de

PCL/PR eletrofiadas visando aplicações biomédicas. Contudo, a funcionalização das

membranas de PCL com os extratos vegetais P.pubescens e A.chica que apresentam

desempenho satisfatórios devido suas propriedade anti-inflamatória e cicatrizante,

respectivamente, já conhecidos pela literatura, colaboraram com elaboração das membranas

que foram patenteadas e são promissoras para novas terapias teciduais.

119

Sugestões para trabalhos futuros

Funcionalizar as membranas de PCL/PR com os extratos vegetais P.pubescens e

A.chica para avaliar seu perfil de liberação.

Realizar o ensaio de quantificação das amostras referentes as membranas de PCL-

Ac e PCL-PpAc pela técnica de LCMSMS (Cromatografia líquida acoplada ao

espectrômetro de massaS) para identificar e quantificar a carajurina marcador

principal da A.chica.

Analisar por Desorção por ionização por electrospray (DESI), a quantificação dos

extratos vegetais por cm2.

Associar os extratos vegetais P.pubescens e A.chica em polímeros que apresentem

menor tempo de bioreabsorção.

Realizar estudos in vivo a longo prazo para as membranas de PCL-Pp, PCL-Ac e

PCL-PpAC para avaliar o perfil de liberação dos extratos vegetais e o potencial de

regeneração de tecidual.

120


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