Expressão GênicaExpressão Gênica

Marcílio C. P. de SoutoDIMAp/UFRN

Expressão Gênica

Todas as células em um organismo têm o mesmo DNA genômico

Identidades celulares distintas ocorrem por causa de diferenças na expressão gênica (=transcrição & tradução)

A transcrição ou não de um gene é, em geral, determinada pela presença/ausência de outros produtos dos genes (especialmente proteínas)

Expressão Gênica

... então os genes interagem em redes complexas:

Gene A ativa gene B, que desliga gene C que aumenta (upregulates) A, ...

Assim, perturbações em um único gene podem levar a mudanças na expressão de vários genes

Para que estudar Expressão Gênica ?

As células e tecidos tem suas funções normais quando os genes são expressos de forma regulada

A expressão alterada de um gene altera a homeostase do organismo, podendo gerar uma doença

Genômica Funcional O próximo passo após o sequenciamento:

Entendimento da conexão entre seqüências de DNA e características fenotípicas do organismo

Passo complexo Proteínas e genes interagem em redes

altamente conectadas Tradicionalmente a biologia molecular vem

trabalhando baseada no paradigma Um gene, uma função

No entanto,...

Microarrays ... microarray podem medir a expressão de vários

genes ao mesmo tempo Microarrays são em geral lâminas de vidro com

uma matriz de pontos (spots) impressa sobre elas Um spot contém milhões de moléculas de DNA

idênticas ou oligonucleotídeos (sondas) As sondas se ligarão a seqüências específicas de DNA, tais

como cDNA de um gene O microarray pode conter milhares de spots

Por exemplo, um spot para cada gene do genoma humano

Experimentos com Microarrays

Quase todo mRNA mRNA da célula ~ genes expressos

Triture células e extraia o mRNA Faça a transcrição reversa RNA

Utiliza-se cDNA, que é mais estável Rotule cDNA das células de referência de

verde (Cy3) e das células alvo (teste) de vermelho (Cy5) P. Ex.: Cy3=Célula Normal Cy5=Célula Cancerosa

Hibridize ambas as amostras, células referência e alvo, em um único microarray

traduzido proteína

cDNA

Fabricação do Array (1/4)

Seleção das sondas (cDNA) a serem impressas no array

Três dos milhares de cDNAconhecidos relevantes para a questão biológica investigada

Obtidos de bibliotecas de cDNAOu feitos a partir de amostras de mRNA

Fabricação do Array (2/4)

Amplificaçãopor PCR

Fabricação do Array (3/4)

cDNAs são imobilizados em pontos específicos no substrato

Fabricação do Array (4/4)

Spot contendo várias cópias de cDNA (sondas) de um gene específico

Amostra de células a ser analisada(RNA experimental)

Preparação da AmostraAmostra de células de referênciaou controle(RNA controle)

Obs: Também pode ser realizadosexperimentos sem a amostra de controle e também para se compararduas amostras de interesseExtrai RNAm

AAAAA5’

AAAAA

5’AAAAA

5’

AAAAA

5’

AAAAA5’

AAAAA

5’AAAAA

5’

AAAAA5’

Síntese e Rotulação de cDNA (1/3)

Fita de cDNA é sintetizadaCada amostra é marcada com um corante diferente

Primer TTTTTTranscriptase reversadNTP

AAAAA5’

AAAAA5’

TTTTT5’

TTTTT5’

AAAAA5’

Síntese e Rotulação de cDNA (2/3)

mRNA é degradado

TTTTT5’

TTTTT5’ AAAAA5’

AAAAA5’

AAAAA5’

DNA polimerase

Síntese e Rotulação de cDNA (2/3)

Segunda fita do cDNA é sintetizada

TTTTT5’

TTTTT5’TTTTT

5’

TTTTT5’

Síntese e Rotulação de cDNA (2/3)

cDNA é desnaturado

TTTTT5’

TTTTT5’

TTTTT5’

TTTTT5’

Síntese e Rotulação de cDNA (3/3)

Hibridização (1/3)

Amostra sob investigação

Microarray

Amostra é colocada noarray para hibridização

Hibridização (2/3)

Hibridização (3/3)

Lava o excesso de cDNAdas amostras rotuladas

Scanning (1/3)

Scanner

Scanning (2/3)

Software do scannersobrepõe imagens

Scanning (3/3)

Software do scannersobrepõe imagens

Experimentos com Microarrays - Resultados

O spot para o gene 1 = Vermelho se há mais mRNA 1 nas células de teste Verde se há mais mRNA 1 nas células de referência Amarelo se são iguais Preto se o gene não foi expresso

Dados em geral expressos na forma de uma matriz de níveis de expressão relativa

intensidade vermelhaintensidade verde

indexada pelos genes e as amostras das células de teste

Esquema de um microarray

Dados de Microarray

g1 g2 gN-1gN

Padrão 1Padrão 2Padrão 3

Padrão i

Padrão m

Característica

Câncer

Normal

Câncer

Classe

Como é feita a análise ? Quando é feita a comparação dessas fontes, pode-

se chegar a conclusões sobre a expressão gênica num determinado estado fisiológico

Algumas Aplicações Descoberta de genes Determinar quais genes estão sendo expressos em um

determinado tipo de célula em um dado momento e sob certas condições

Comparar a expressão dos genes em dois tipos de células diferentes ou duas amostras de tecido diferentes (tecido saudável x tecido doente)

Examinar mudanças na expressão dos genes em diferentes estágios no ciclo da célula ou durante desenvolvimento do embrião

Análise da regulação gênica Identificação de doenças genéticas complexas Descoberta de medicamentos e estudos de toxicologia Detecção de mutação/polimorfismo

Outras Tecnologias As técnicas de AM a serem descritas

também podem ser aplicadas a dados de expressão gerados com outras tecnologias MPSS (Massively Parallel Signature Sequence

technology) Brenner et al., 2000

SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) Velculescu et al., 1995

Real-time RT-PCR (Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction)

Freeman et al., 1999