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DEDICATÓRIA

A minha esposa Mônica

A meus filhos Gabriel e Matheus

A Meus Pais Francisco e Vera

A minha irmã Erica

DEDICO

ii

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Rodrigo Rocha Latado pelo companheirismo e atenção em todos os pontos da

elaboração deste trabalho.

Ao Pesquisador e Professor Dr. Augusto Tulmann Neto por dividir o seu imenso conhecimento e pela

paciência na elaboração dos dados de irradiação.

Ao Instituto Agronômico (IAC) pela oportunidade para desenvolvimento desde projeto.

À empresa Terra Viva, na pessoa do Eng. Agr. Ronaldo Micoti da Glória, por permitir que esse

trabalho fosse realizado através da disponibilidade de todas as ferramentas necessárias e

disponibilidade do meu tempo.

Às colaboradoras Roseli Pires, Luana e Rosa Antunes, da área de Desenvolvimento e Laboratório da

empresa Terra Viva, pela ajuda em todas as fases de produção das Mandevillas.

Ao Mestre Luciano Delmondes de Alencar pelo fundamental auxílio nas análises estatísticas deste

trabalho.

À todos os docentes do Instituto Agronômico (IAC) que participaram da minha formação acadêmica

no decorrer destes anos.

Por fim, agradeço a DEUS por permitir que tudo isso fosse feito e a SÃO JOÃO BOSCO que, desde

o início de minha vida, é meu exemplo.

iii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. vi

LISTA DE TABELAS................................................................................................. vii

RESUMO .................................................................................................................... viii

ABSTRACT ................................................................................................................ ix

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 10

2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................. 11

2.1 Família Apocynaceae e o gênero Mandevilla........................................................ 11

2.1.1 Mandevilla bahiensis.......................................................................................... 14

2.1.2 Mandevilla híbrida “Pretty Crimson”................................................................. 14

2.2 Melhoramento de ornamentais e de Mandevilla.................................................... 15

2.3 Cultura de tecidos de Mandevillas......................................................................... 17

2.4 Indução de poliploides em plantas......................................................................... 19

2.4.1 Técnica de citometria de fluxo............................................................................ 26

2.4.2 Número cromossômico de plantas de Mandevilla.............................................. 27

2.5 Mutagênese induzida com radiações ionizantes em plantas.................................. 27

3 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 31

3.1 Material Vegetal..................................................................................................... 31

3.2 Indução de mutações in vivo em Mandevilla cultivar “Pretty Crimson”.............. 31

3.2.1 Avaliação da radiossensitividade de estacas (enraizadas ou não) à raios gama.. 31

3.2.2 Irradiação de estacas com dose selecionada e seleção de mutantes durante o florescimento................................................................................................................

33

3.3 Indução de plantas autotetraploides de Mandevilla............................................... 34

3.3.1 Indução de plantas autotetraploides de M. bahiensis por meio de tratamento in vitro...............................................................................................................................

34

3.3.2 Identificação e caracterização de plantas autotetraploides de M. bahiensis........ 35

3.3.2.1 Análise morfológicas e anatômicas de plantas autotetraploides de M. bahiensis.......................................................................................................................

36

3.3.2.2 Análises estomáticas e determinação de teores de clorofila de plantas autotetraploides de M. bahienis....................................................................................

37

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 38

4.1 Indução de mutações in vivo em Mandevilla cultivar “Pretty Crimson” com uso de raios gama................................................................................................................

38

4.1.1 Avaliação da radiossensitividade de estacas (enraizadas ou não) à raios gama.. 38

4.1.2 Irradiação de estacas com dose selecionada e seleção de mutantes durante o florescimento................................................................................................................

42

4.2 Indução de plantas autotetraploides........................................................................ 44

4.2.1 Indução de plantas autotetraploides de M. bahiensis por meio de tratamento in vitro...............................................................................................................................

44

iv

4.2.2 Análises morfológicas e anatômicas de plantas autotetraploides de M.

bahiensis.......................................................................................................................

49

4.2.3 Análises estomáticas e determinação de teores de clorofila de plantas autotetraploides de M. bahiensis..................................................................................

55

5. CONCLUSÕES ....................................................................................................... 58

6. REFERÊNCIAS....................................................................................................... 58

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Planta de Mandevilla bahiensis em floração............................................ 14

Figura 2 - Planta de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson”...................................... 15

Figura 3 - (A) Mudas enraizadas e mudas sem raiz; (B) Cilindro de proteção; (C) Fonte de raios gama; (D) Plantio de mudas enraizadas em potes com substrato e mudas sem raiz em túneis......................................................... 32

Figura 4 - Método das podas repetidas....................................................................... 33

Figura 5 - (A) Explantes de M. bahiensis e meio de cultura; (B) Preparação dos segmentos nodais; (5) Segmentos nodais em meio liquido contendo colchicina; (E) Segmentos nodais em meio liquido contendo colchicina em agitação; (F) Plantas tratadas com colchicina em rustificação............. 35

Figura 6 - Sobrevivência de estacas enraizadas e não-enraizadas de Mandevilla cultivar “Petty Crimson” com uso de diversas doses de mutagênico. Estacas enraizadas e não enraizadas, com proteção e sem proteção das bases das estacas....................................................................................... 41

Figura 7 - (A) Flor da cultivar comercial de Mandevilla “Pretty Crimson” (B) Efeito deletério e transitório nas folhas de plantas M1V1 após a irradiação; (C) Mutante com alteração na cor de pétalas (D) flores do mutante anão (M1) e do controle (Co)...................................................... 43

Figura 8 - Histogramas obtidos por meio da técnica de citometria de fluxo representando a ploidia de plantas diploide (A); mixoploide (B) e tetraploide (C) de M. bahiensis.................................................................. 47

Figura 9 - (A) Flor e folha de planta autotetraploide de Mandevilla bahiensis; (B) Flor e folha de planta diploide de M. bahiensis........................................ 49

Figura 10 - Secção transversal de um folíolo terminal de folha adulta de planta tetraploide de Mandevilla PP – Parênquima Paliçádico; PL – Parênquima Lacunoso; * – Câmara Subestomática; EAd – Epiderme adaxial; EAb – Epiderme abaxial; Setas brancas indicam estômatos. Barra 100µm....................................................................................................... 54

Figura 11 - Secções transversais do limbo foliar de Mandevilla tetraploide (a) e diploides (b). Secção transversal da folha na região da nervura central de Mandevilla tetraploide (c) e diploide (d) Barra 100 µm........................... 54

Figura 12 - A) estômatos de M. bahiensis de planta diploide; B) estômatos de M.

bahiensis de planta tetraploide. Barra = 0,03 mm..................................... 55

vii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Melhoramento de ornamentais pelo mundo. Os países estão apresentados por continente. A importância está indicada através de uma até cinco X (Van Tuyl, 2012)........................................................ 16

Tabela 2 - Taxas de sobrevivência (em %) de estacas enraizadas e não enraizadas de Mandevilla após uso de diferentes doses de raios gama, com e sem proteção da base..................................................................................... 39

Tabela 3 - Taxa de mortalidade, após cultivo temporário de explantes de M.

bahiensis em meio de cultura contendo diferentes concentrações de colchicina.............................................................................................. 45

Tabela 4 - Taxa de sobrevivência, após cultivo temporário em meio de cultura contendo diferentes concentrações de colchicina. Plantas mantidas em substrato de Pinus, em vasos de 1,5 L e em estufa climatizada............................................................................................ 46

Tabela 5 - Determinação da ploidia em plantas de M. bahiensis rustificadas, provenientes de explantes previamente submetidos à cultivo temporário em meio de cultura contendo diferentes concentrações de colchicina e diferentes tempos de exposição........................................ 48

Tabela 6 - Características morfológicas de folhas de plantas de M. bahiensis com

diferentes ploidias.................................................................................. 50

Tabela 7 - Diâmetro do caule a 10 cm de altura (DC) e distância entre nós (DE) de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.............................. 51

Tabela 8 - Largura, comprimento e espessura das flores de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias......................................................... 52

Tabela 9 - Características anatômicas das terceiras folhas completamente expandidas de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias........... 53

Tabela 10 - Caracterização de estômatos de secções paradérmicas da superfície abaxial da terceira folha a partir do ápice, com diâmetro polar dos estômatos (DPE), diâmetro equatorial dos estômatos (DEE) e área dos estômatos de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.............. 56

Tabela 11 - ICF – Índices de Clorofila Falker a e b de plantas de Mandevilla com diferentes ploidias................................................................................. 57

viii

Indução de mutantes em Mandevilla ssp. visando o melhoramento genético

RESUMO

As Mandevillas são plantas ornamentais com grande aceitação no mercado ornamental mundial, mas com baixa variabilidade de cores e formas nas cultivares comerciais. Desta forma, uma alternativa para o aumento da diversidade seria a utilização de técnicas de mutagênese induzida, com uso de mutagênicos físicos (raios gama, por exemplo) ou agentes antimitóticos (colchicina, por exemplo) para induzir alterações. Os agentes mutagênicos físicos têm a capacidade de induzir quebras cromossômicas no DNA das plantas e causar mutações somáticas, enquanto a colchicina possui a capacidade de induzir a produção de plantas autopoliploides. Assim, os objetivos deste estudo foram estabelecer dois métodos de mutagênese induzida em plantas de Mandevilla, um com uso de raios gama e, outro, com uso de colchicina como mutagênicos, de forma a ampliar a variabilidade de plantas desta espécie para fins de melhoramento. Outro objetivo foi a caracterização fenotípica de plantas autotetraploides de Mandevilla. No experimento de mutagênese induzida com uso de raios gama, estabeleceu-se a radiossensibilidade de estacas enraizadas e não enraizadas, além do tratamento mutagênico de estacas com as bases protegidas ou não, utilizando-se cilindros de chumbo. Determinou-se as doses letais para 30 e 50% (DL30 e DL50) dos tipos distintos de estacas. Em seguida, foram irradiadas 2.000 estacas de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson” e realizou-se o método de podas repetidas. Durante o período de florescimento das plantas realizou-se a seleção de dois mutantes, uma planta anã e outro mutante com flores com coloração distinta. No experimento de indução de poliploides não foi observada nenhuma associação entre a taxa de mortalidade de plantas in vitro e o uso de concentrações crescentes de colchicina e nem com o aumento do tempo de exposição ao alcaloide. O total de 12 plantas tetraploides e 54 mixoploides foi obtido nos diversos tratamentos, mas com maior porcentagem de tetraploides induzidos no tratamento de cultivo em meio contendo 0,05% de colchicina, durante 24 horas. As plantas autotetraploides de M. bahiensis

apresentaram efeito giga em relação às plantas controle, com a presença de órgãos maiores: folhas mais largas, mais espessas, com maior área foliar; flores maiores e com pétalas mais espessas; folhas com maiores estômatos, maiores índices de clorofila Falker a e b (ICFa e ICFb), mas menores relações ICFa/ICFb. Os resultados obtidos indicaram que as técnicas de mutagênese induzida com uso de raios gama ou de colchicina, em Mandevilla, foram viáveis para obtenção de mutantes com características de interesse.

Palavras-chave: colchicina, mixoploide, mutação, raios gama, tetraploide

ix

Mutant induction in Mandevilla ssp. aiming plant breeding

ABSTRACT Mandevillas are ornamental plants with great acceptance in the world ornamental market, but with low variability of flower color and shape for commercial cultivars. Thus, an alternative possibility for increasing the diversity would be the use of induced mutagenesis techniques with physical mutagens (gamma rays, for example) or antimitotic agents (colchicine, for example) to induce changes. While physical mutagens have the ability to induce chromosomal breaks in DNA and cause somatic mutations, colchicine has the ability to induce autopoliploid plants. Thus, the objectives of this study were to establish two methods of induced mutagenesis in Mandevilla plants, one using gamma rays and, the other, using colchicine as mutagens, in order to increase the variability of plants for breeding purposes. Another objective was the phenotypic characterization of Mandevilla autotetraploid plants. In a experiment of induced mutagenesis with gamma rays, the radiosensitivity of rooted and non-rooted cuttings was established, as well as the mutagenic treatment of cuttings with or without protected bases, using lead cylinders. The lethal doses were determined for 30 and 50% (DL30 and DL50) of different types of cuttings. Then, 2,000 Mandevilla cuttings were irradiated and, after that, the repeated pruning method was performed. During flowering period two mutants were selected, one dwarf plant and, other, a mutant with distinct color of the flowers. In experiment of polyploid induction no association was observed between in vitro plant mortality rate and the use of increasing concentration of colchicine nor with increasing exposure time to alkaloid. A total of 12 tetraploid and 54 mixoploid plants were obtained in all treatments but the best one, in terms of percentage of tetraploids induced, was the culture in a medium containing 0.05% colchicine, for 24 hours. Mandevilla autotetraploid plants showed a giga effect in relation to control plants, with the presence of larger organs: broader and thicker leaves, with larger leaf area; larger flowers with thicker petals; leaves with larger stomata, higher rates of chlorophyll a and b Falker (ICFa and ICFb), but lower ICFa/ICFb ratios. The results indicated that induced mutagenesis in Mandevilla with the use of gamma rays or colchicine, were feasible to obtain mutants with characteristics of interest. Key words: colchicine, gamma rays, mixoploid, mutation, tetraploid

10

1 INTRODUÇÃO

O setor de plantas ornamentais é muito diversificado e inclui a produção de culturas florais, tais

como flores e folhagens de corte, bulbos, plantas e flores em vasos. O valor global da produção de

flores foi estimado em US$ 55 bilhões em 2016 (Van Rijswick, 2017). Nesse contexto, a floricultura

brasileira destaca-se pelo notável crescimento nos últimos anos, embora ainda não esteja entre os

principais produtores mundiais.

De acordo com o IBRAFLOR (Instituto Brasileiro de Floricultura), em 2017, as flores

movimentaram R$ 7,2 bilhões no Brasil. Esse desenvolvimento está fundamentado na qualidade da

produção e na mudança de hábito da população que tem hoje produtos com beleza e vida útil,

correspondentes ao valor gasto na sua aquisição, ou seja, houve uma evolução no padrão de exigência

do consumidor final (Ibraflor, 2018).

O mercado de flores no mundo, assim como no Brasil, utiliza-se das novidades, isto é, da

introdução de novas cultivares, para manter e estimular o interesse dos consumidores nos produtos.

Nesta questão, as principais necessidades do mercado de flores são cultivares mais adequadas ao

cultivo intenso, de baixo custo e de fácil cultivo, além do aprimoramento das características desejadas

pelos consumidores, tais como: cor, durabilidade, tamanho, aroma, etc. Diante disto, o melhoramento

genético de plantas ornamentais se torna indispensável ao setor (Cardoso, 2013). Na busca de novas

cultivares com as características descritas acima, a indução de mutações é uma ferramenta muito

importante.

Apesar do destacado papel das mutações espontâneas na obtenção de novas cultivares de

plantas, a frequência de aparecimento destas mutações na natureza é muito baixa. Como a mutagênese

induzida tem a capacidade de aumentar várias vezes a frequência de mutações, ela tem sido utilizada

em programas de melhoramento de ornamentais em vários países (Broertjes e Van Harten, 1988).

Segundo Broertjes e Van Harten (1988) as mutações podem ser induzidas através de agentes

químicos ou físicos. A indução de mutações com uso de raios gama tem sido uma das técnicas mais

utilizadas no melhoramento de plantas e tem como objetivo induzir alterações a nível cromossômico

tais como quebras, deleções a alterações mais pontuais no DNA das plantas, e que podem resultar em

alterações no fenótipo (cor e forma de folhas e flores, porte e hábito de crescimento, arquitetura e

etc...). Já a indução de poliploidia por meio do uso de agentes antimitóticos tem como objetivos

práticos a obtenção de plantas com o efeito “giga”, isto é, plantas contendo órgãos maiores (folhas,

flores, frutos e etc...) e/ou plantas que produzem frutos sem sementes (geralmente plantas triploides).

O gênero Mandevilla possui 151 espécies conhecidas, principalmente lianas ou, menos

frequentemente, arbustos ou subarbustos. Este gênero se destaca pelo grande potencial ornamental e

farmacológico. As Mandevillas possuem uma grande aceitação comercial no mercado doméstico e

11

mundial e isto se deve ao seu hábito de crescimento (lianas) e beleza de suas flores. Sua

comercialização ocorre em todos os continentes, inclusive em regiões mais frias, onde são usadas

como ornamentação de verão. Porém, a variação de cor e formas das Mandevillas comerciais é restrita

a poucas cores (branco, rosa e vermelho) e poucas opções de formas de folhas, flores e hábito de

crescimento (Sales, 1993).

Após uma revisão de literatura na área, não foi possível encontrar nenhum estudo prévio

envolvendo a indução de mutações e de poliploides em plantas do gênero Mandevilla visando o

melhoramento genético.

Diante do exposto, o presente estudo tem os seguintes objetivos:

- Estabelecer um método de mutagênese induzida com raios gama, de forma a induzir e

selecionar mutantes de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson”.

- Estabelecer um método de indução de poliploides de Mandevilla bahiensis visando obter

plantas com órgãos maiores.

- Avaliar os efeitos da poliploidização de plantas de Mandevilla bahiensis por meio da

caracterização fenotípica.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Família Apocynaceae e o gênero Mandevilla

A família Apocynaceae apresenta 2.000 espécies, distribuídas em cerca de 200 gêneros. No

Brasil ocorrem 41 gêneros desta família, o que perfaz um total de 376 espécies já catalogadas,

localizadas em diversos ecossistemas (Barroso, 1991). As espécies da família Apocynaceae

desenvolvem-se em vários habitats, desde florestas tropicais úmidas até regiões semiáridas; ao nível

do mar e em topos de montanha, em solos secos, afloramentos rochosos, áreas inundadas e, algumas

vezes, nas margens de rios (Rapini, 2004).

Além de ser bem representada na flora brasileira, esta família destaca-se pela importância

econômica e ou medicinal de alguns representantes devido à produção de metabólitos tais como:

alcaloides e glicosídeos. Apesar disso, ela ainda continua sendo pouco estudada. Os trabalhos

clássicos sobre as Apocynaceae foram elaborados por De Candolle, (1844), Mueller, (1869), Miers,

(1878) e Schumann, (1895), no século dezenove e os estudos foram fundamentalmente ampliados

durante a primeira metade do século vinte, quando propostas de novas classificações e revisões à

12

nível de subfamília ou tribo foram elaboradas (Stapf, 1904; Woodson, 1928, 1933, 1936; Pichon,

1948 e Allorge et al., 1980).

Expedições realizadas na América Central e América do Sul, especialmente na Bolívia,

Suriname e região amazônica da Colômbia e Venezuela, contribuíram sobremaneira para a descoberta

de várias novas espécies, as quais foram descritas por Rusby (1912, 1927); Gleason (1931); Maguire

et al. (1948) e Woodson (1950), entre muitos outros.

Mais recentemente, os estudos desenvolvidos abordaram não só aspectos taxonômicos, como

revisões de gêneros isolados (Allorge, 1975; Boiteau e Allorge, 1976; Barban, 1985 e Stranghetti,

1992), como também acrescentaram valiosas informações sobre morfologia e anatomia floral

(Walker, 1978 e Fallen, 1980) e distribuição geográfica (Allorge et al., 1980). Tais informações são

essenciais para uma melhor interpretação da família, cuja estrutura floral é especializada e complexa.

O gênero Mandevilla possui 151 espécies conhecidas, sendo formado por espécies com

caracteres comuns, tais como estigma penta costado e umbraculiforme, apêndices calicinais

(coléteres) na base interna dos lacínios e a inflorescência racemosa (Sales, 1993). As plantas

pertencentes ao gênero Mandevilla são principalmente lianas ou, menos frequentemente arbustos ou

subarbustos, e com inflorescência em racemos típicos. O período de florescimento parece ser

relativamente curto, ocorrendo na maioria das espécies de dezembro a março, enquanto que a

frutificação ocorre entre junho e agosto. As sementes são anemófilas, numerosas, geralmente estreitas

oblongas a lineares ou às vezes fusiformes (Sales, 1993).

A grande diversidade de formas e cores da corola do gênero Mandevilla, aliada a sua estrutura

floral especializada, pode estar relacionada com a especificidade para polinizadores (Sales, 1993). O

androceu é formado por cinco estames, que formam um cone em volta do estigma. Os grãos de pólen

geralmente são liberados na porção superior do estigma, ainda na fase de botão floral. No entanto, a

parte receptiva do estigma encontra-se localizada na região basal, o que dificulta a realização de

autofecundações e a consequente formação de frutos e sementes a partir de autofecundações (Galetto,

1997; Torres e Galetto, 1998, 1999; Lohne et al., 2004).

As flores abrem no início da manhã e a antese dura aproximadamente quatro dias (Alvino et

al., 2007). Essa longevidade floral, associada à liberação de pólens na parte superior do estigma e à

grande quantidade do mesmo que é retirada durante as primeiras visitas de insetos, sugere que a flor

possa permanecer funcionalmente feminina durante parte da antese, numa estratégia para favorecer a

polinização cruzada. Outra característica que pode influenciar negativamente as taxas de

autofecundação é o baixo volume de néctar presente nas flores, o que induz às espécies polinizadoras

a fazer apenas uma visita na mesma flor e a procurar várias flores favorecendo, assim, a fecundação

cruzada (Alvino et al., 2007).

13

Segundo Alvino et al. (2007), a taxa de pegamento de frutos sob condições de polinização livre

foi de 30,9%. O tratamento experimental de exclusão da visita de insetos revelou que a espécie não é

autogâmica, demonstrando a dependência total de vetores bióticos para a ocorrência de polinização

(cruzada) nas flores. Na autopolinização manual 13,3% das flores formaram frutos que perduraram

até o amadurecimento, significando que o gênero tem certa taxa de autocompatibilidade. Entretanto,

a polinização cruzada manual apresentou uma maior taxa de pegamento de frutos e de produção de

frutos maduros, com cerca de 37,9%.

Este gênero se destaca pelo grande potencial ornamental e farmacológico. Apesar da beleza das

flores, poucas espécies são comercializadas atualmente como plantas ornamentais. No Brasil, são

cultivadas apenas a M. splendens (Hook.) Woodson, enquanto que na Argentina e Chile, a M. laxa

(R. e P.) Woodson também tem sido cultivada comercialmente. No século dezenove, várias espécies

de Mandevilla foram coletadas no Brasil e introduzidas na Europa, para ornamentação de jardins,

como a M. urophylla (Hook.) Woodson, M. illustris (Vell.) Woodson, a M. tenuifolia (Mikan)

Woodson e a M. atroviolaceae (Stadelm.) Woodson (Sales, 1993).

Em estudos farmacológicos, a M. velutina (Mart. ex Stadelm.) Woodson e a M. illustris (Vell.)

Woodson são citadas como eficazes no tratamento de picadas de cobras venenosas, por meio de

maceração e aplicação de extrato de suas túberas (bulbos) na região do corpo onde ocorreu o ataque.

Correia (1984) também atribui essa mesma propriedade às espécies M. atroviolaceae (Stadelm.)

Woodson e M. splendens (Hook.) Woodson. Pesquisas com túberas de M. velutina revelaram a

presença de princípio ativo inibidor da bradequinina, confirmando de certa forma a veracidade das

informações populares (Calixto et al., 1985; Calixto e Yunes, 1986).

Comercialmente, as Mandevillas são utilizadas como ornamentais e reproduzidas

vegetativamente por meio de estacas, retiradas de plantas matrizes, e enraizadas em ambiente

controlado durante aproximadamente quatro semanas. Antes do enraizamento, as estacas devem ter

a base tratada com regulador de crescimento vegetal, indutor de enraizamento, geralmente o ácido

indolbutírico (AIB). O ciclo completo da cultura, considerando do enraizamento de estacas até a

produção de flores, geralmente perfaz 150 dias (Gomes da Costa, 2018, informação pessoal).

Outra forma de reprodução de Mandevillas é por meio de sementes, método usado

principalmente em trabalhos de melhoramento genético. Neste caso, o período desde a polinização

até a dispersão das sementes em frutos maduros é de 112 dias, sendo que a germinação ocorre em 14

dias. Assim, o ciclo sexual completo de plantas deste gênero, da polinização até a nova floração,

demora aproximadamente 350 dias (Gomes da Costa, 2018, informação pessoal).

14

2.1.1 Mandevilla bahiensis

Segundo Watanabe et al. (2009) a Mandevilla bahiensis é uma liana ou arbusto escandente,

com 1-3 m altura e produção de látex branco. Ramos flexuosos, glabros a pubescentes. Folhas

decussadas, 2 - 2,9 × 1,7 – 3 cm, coriáceas, cordiformes, largo-ovais, oblatas, ápice emarginado

mucronulado a cuspidado, base atenuada a cordada, arredondada, margem inteira, sinuada,

conduplicadas, glabras; subsésseis ou curto-pecioladas, pecíolo subcilíndrico, 2 - 4 mm comprimento.

Inflorescência axilar; brácteas 1-4 mm comprimento, triangulares a truladas, ápice agudo, ciliadas;

coléteres 2-4 na base das brácteas. Possui flores actinomorfas. Lacínias do cálice 5-8 mm

comprimento, lanceoladas, ápice acuminado; coléteres 2 – 4 mm escamiformes, oblongos. Corola

infundibuliforme; tubo inferior 1 - 1,4 cm de comprimento, verde-vináceo, o superior 1 - 2,2 cm

comprimento, róseo a magenta; fauce amarela ou branca; lobos 1,2 - 2,3 cm comprimento, obovais,

ápice obtuso, róseos a magenta (Figura 1).

A Mandevilla bahiensis ocorre sobre os afloramentos rochosos nos campos rupestres.

Aparecendo na forma de liana ou arbusto escandente, sempre com folhas conduplicadas e flores

vistosas. Apresenta flores durante todo o ano e, frutos, de maio a janeiro (Watanabe et al., 2009).

Figura 1. Planta de Mandevilla bahiensis em floração. Foto: Everton G. Costa

2.1.2 Mandevilla híbrida “Pretty Crimson”

Mandevilla híbrida, a cultivar “Pretty Crimson” distingue-se pela sua ramificação com

qualidade superior, internódios mais curtos, mas que ainda mantém um crescimento vigoroso. Possui

folhagem verde-escura brilhante e abundância de flores vermelhas, com 5 a 7,5 cm de diâmetro.

Comercialmente esta cultivar pode ser usada como uma planta de vaso tradicional (pote de 14 cm),

15

mas também é ideal para o plantio em vasos pequenos (8 a 12 cm). Em alguns casos pode ser utilizada

com planta pendente. Planta ideal para segmentos de varanda e pátio. Assim não é surpresa que esta

seja uma das cultivares de Mandevilla mais vendidas no mundo.

Figura 2. Planta de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson”. Fonte: Google

2.2 Melhoramento de ornamentais e de Mandevilla

A história do desenvolvimento de flores ornamentais inicia-se há muito tempo atrás, mas

somente nos últimos dois ou três séculos, através das introduções e dos programas de melhoramento

genético, esta atividade tem sido mais documentada para algumas culturas (Kingsbury, 2009). O

melhoramento das espécies Tulipa, Jacinto e Narciso teve seu início datado aproximadamente 300

anos atrás (Doorenbos, 1954), 200 anos atrás para Rosas e Crisântemos (Zlesak, 2006), e menos de

100 anos, para Lírios (Van Tuyl e Arens, 2011).

Os programas de melhoramento de flores e plantas realizados em Institutos e Universidades

públicas são mais bem conhecidos do que os realizados em empresas privadas, devido a maior

divulgação e ao acesso público das publicações. Além do apoio governamental para pesquisa e

desenvolvimento, outra importante fonte de novidades ornamentais são os melhoristas amadores que

estão organizados em sociedades como exemplo: World Federation of Rose Societies, American

Daffodil Society, International Climatis Society, dentre outras (Van Tuyl, 2012).

A principal fonte de novas variedades comerciais para o agronegócio ornamental são as

empresas privadas de melhoramento. Atualmente a Holanda é líder no melhoramento de espécies

ornamentais e quase todas as novas variedades introduzidas são desenvolvidas por empresas

comerciais privadas e comercializadas em todo mundo (Van Tuyl, 2012).

16

Segundo Van Tuyl, 2012, na América do Sul, o Equador e Colômbia são os principais

exportadores de flores de corte. Nestes países, as atividades mais recentes de desenvolvimento de

novas cultivares também são realizadas por empresa privadas (exemplos: Esmeralda Breeding,

Progeny Breeding), que apresentam um alto potencial para o futuro. No Brasil, Argentina e Chile,

Universidades e centros de pesquisa estão envolvidos no melhoramento de ornamentais.

Recentemente, no Brasil, algumas empresas particulares iniciaram programas de melhoramento.

(Tabela 1)

Tabela 1. Melhoramento de ornamentais pelo mundo. Os países estão apresentados por continente e

as importâncias relativas dos locais de condução dos programas de melhoramento (Universidade, empresa privada, Jardim botânico e Hobby) estão indicadas em função do número de indicações (X) (Van Tuyl, 2012).

17

O desenvolvimento de novas cultivares pode ser realizado com a introdução de materiais

nativos, melhoramento de espécies já comercializadas e introdução de plantas exóticas. A introdução

de material nativo pode ser entendida como o uso de espécies nativas em cruzamentos com variedades

comerciais aparentadas, buscando o melhoramento para algumas características desejáveis. As

espécies nativas também podem ser utilizadas diretamente, através de seu pré-melhoramento e

melhoramento genético. Segundo Gomes da Costa et. al. (2012), a seleção de novos produtos nativos

deve ter indicadores objetivos para a avaliação adequada de seu uso, já que a beleza é uma

característica grandemente subjetiva.

O melhoramento de espécies já comerciais atualmente é o caminho mais usado para obtenção

de novos produtos. Este melhoramento busca a criação de novas plantas que atendam as demandas

atuais através das variedades pré-existentes.

A introdução de plantas exóticas ocorre há muito tempo pelo mundo, com trocas de

biodiversidade entre os continentes. Esse processo deve ser realizado com muito cuidado para a

redução da ocorrência de plantas que possam se tornar invasoras.

Atualmente, o melhoramento genético de Mandevillas é realizado por poucas empresas no

mundo. A principal técnica de melhoramento adotada é a hibridização e seleção massal das progênies

obtidas. Essa técnica é trabalhosa, pela dificuldade de polinização, devido a morfologia das flores de

Mandevillas e pela baixa taxa de fertilização. Assim, as técnicas de melhoramento não convencionais,

tais como: a indução de mutações e a poliploidização podem se constituir em ferramentas importantes

no desenvolvimento de novas cultivares.

2.3 Cultura de tecidos de Mandevillas

A primeira revisão sobre a propagação de plantas por meio de cultura de tecidos foi publicada

por Murashige (1974). Ele listou 128 gêneros com potencial para a propagação in vitro, incluindo 22

gêneros de orquídea e 43 outros gêneros de plantas ornamentais. Quatro anos depois, o autor enfatizou

que todas as orquídeas de importância econômica, exceto Paphiopedilum, poderiam ser multiplicadas

in vitro. Adicionalmente, 194 gêneros de vários grupos de plantas, incluindo 118 gêneros de plantas

ornamentais foram considerados passíveis de clonagem por meio de cultura de tecido. Esta lista é

incompleta devido à relutância de alguns laboratórios em divulgar seus casos de sucesso com a

propagação por cultura de tecidos de determinados gêneros, famílias ou espécies vegetais (Laimer et

al., 2003).

Segundo Handro et al. (1998), o cultivo in vitro de Mandevilla velutina e Mandevilla illustris é

importante por causa do potencial uso farmacológico e da necessidade de conservação destas

espécies, que estão ameaçadas na natureza devido à exploração predatória. Os autores estabeleceram

18

um protocolo para a regeneração de plantas a partir de vários explantes de M. velutina (segmentos de

folha, xilopódio ou caule), passando pela fase de calos. O meio mais responsivo para a indução de

calos era o acrescido de ácido naftalenoacético (ANA) e benzilaminopurina (BAP) na concentração

de 1 mg.L-1, cada. Apesar de não ter sido possível obter organogênese direta em nenhum dos meios

testados, os calos obtidos geralmente eram friáveis e altamente organogênicos, resultando em grande

número de brotações após a transferência para meio acrescido de 5 mg.L-1 de BAP e 1 mg.L-1 de

ANA.

Segundo Souza et al. (2011), a fase mais importante do cultivo in vitro de plantas de savana,

caso das Mandevillas, é a de enraizamento das brotações, o que foi obtido por Handro et al. (1998)

após cultivo em meio acrescido de 5 mg.L-1 de ANA ou 8 mg.L-1 de AIB. Assim, os autores sugeriram

a possibilidade de uso de cultivo in vitro de M. velutina para a produção de produtos fitoterápicos.

Biondo et al. (2004) estabeleceram um protocolo para a micropropagação in vitro de M. illustris

a partir de segmentos nodais e consideraram que o enraizamento in vitro de estacas foi mais efetivo

quando se utilizou o meio de cultivo contendo apenas 1/3 da concentração normal de sais de MS. Já

Biondo et al. (2007) estabeleceram um protocolo de micropropagação semelhante, mas para M.

velutina e, Cordeiro et al. (2012), para M. moricandiana.

Souza et al. (2011) testaram vários tratamentos visando o incremento na taxa de enraizamento

in vitro de M. velutina e concluíram que a presença de compostos fenólicos no meio de cultura era

importante para a promoção do enraizamento adventício.

A micropropagação in vitro pode resultar na geração de plantas em grandes quantidades e em

pequeno espaço físico (Teixeira et al., 2001), possibilitando a produção homogênea de metabólitos e

com qualidade garantida (Amaral e Silva, 2003). Técnicas de micropropagação também podem

permitir manipulações genéticas (Rao e Ravishankar, 2002), o estabelecimento de bancos de

germoplasma (Rout et al., 2000), além da redução de extração ilegal de plantas, com consequente

prevenção do declínio dos ecossistemas onde as plantas ocorrem naturalmente (Medeiros, 2003).

Não há ainda relatos de estudos em que se obteve sucesso na regeneração in vitro de plantas de

Mandevilla por meio organogênese direta, nem por embriogênese somática ou protoplastos. Assim,

ainda não se tem descrito um método in vitro apropriado de regeneração de plantas de Mandevilla

com origem a partir de uma ou poucas células. Isto pode ser importante quando se utiliza técnicas de

mutagênese induzida, em que se deseja evitar a presença de quimerismos em plantas tratadas com

mutagênicos.

As técnicas de cultura de tecidos de espécies de Mandevilla podem ser consideradas como

ferramentas biotecnológicas importantes, que podem ser usadas como apoio a programas de

melhoramento, especialmente porque este gênero apresenta uma biologia reprodutiva complexa, com

plantas contendo baixa taxa de cruzamentos e/ou com baixa taxa de obtenção de plantas por sementes.

19

Assim, uma vez obtido um genótipo superior, a manutenção dele pode ser obtida via multiplicação

vegetativa, utilizando-se métodos in vivo (via enraizamento de estacas) ou in vitro (micropropagação

clonal). No entanto, nestes casos, geralmente a cultura de tecidos pode trazer vantagens em termos

de maior taxa de multiplicação, em função do tempo e do espaço físico.

2.4 Indução de poliploides em plantas

Entende-se por poliploidia a existência de mais de dois conjuntos de cromossomos em uma

mesma célula. Células ou tecidos poliploides podem ocorrer em organismos diploides, como na

polissomatia, comum nas raízes das leguminosas. Eventualmente, indivíduos poliploides surgem

espontaneamente em progênies de espécies diploides. Uma determinada espécie pode apresentar

citotipos, isto é, plantas diploides e poliploides, assim como um gênero pode apresentar espécies com

diferentes graus de ploidia (Wittmann e Dall´agnol, 2003).

Os poliploides são classificados basicamente em autopoliploides e alopoliploides. Os primeiros

são originados pela duplicação de um mesmo genoma, se espera alta frequência de multivalentes na

meiose e herança polissômica. Os alopoliploides ou poliploides genômicos são formados pela

duplicação de genomas diferentes de uma planta híbrida, o pareamento cromossômico ocorre apenas

entre os cromossomos do mesmo genoma e se espera herança dissômica. Um tipo intermediário são

os poliploides segmentares, formados pela duplicação dos genomas de espécies aparentadas, que

ainda mantém homologia suficiente entre seus cromossomos para permitir um pareamento parcial.

Assim estes podem exibir formas variadas e intermediárias de herança, ou seja, herança dissômica

para algumas características e, polissômica, para outras (Stebbins, 1971; Sybenga, 1992).

A literatura indica que espécies poliploides naturais surgiram pela união de gametas não

reduzidos (Harlan e De wet, 1975; Hermsen, 1984; Ramsey e Schemske, 1998). No entanto, o

surgimento de espécies poliploides por duplicação somática é considerado um evento raro e isolado,

se é que realmente ocorreu na natureza (De wet, 1980).

Segundo algumas estimativas, até 70% das angiospermas são poliploides naturais (Masterson,

1994). Segundo Soltis e Soltis (1995), os poliploides representam cerca de 53% das espécies de

briófitas e, de acordo com Grant (1981) e Song et al. (2012), pode representar mais que 95% das

pteridófitas. Em gimnospermas, os poliploides representam mais de 38% das espécies existentes

(Ahuja e Neale, 2005), sendo que a Sequoia sempervirens é a única conífera hexaploide natural

(2n=6X=66). A poliploidia é considerada uma via importante para a evolução das plantas e pode

contribuir para o isolamento reprodutivo e especiação abrupta (Ramsey e Schemske, 1998; Wendel,

2000; Soltis et al, 2004).

20

Os efeitos da poliploidia em atributos das plantas também são importantes para horticultores

e agricultores (Ranney, 2006). Cerca de 40% das espécies cultivadas são poliploides (Simmonds,

1980; Wittmann e Dall´Agnol, 2003), entre elas a alfafa, a batata, o fumo e o algodão, que são

tetraploides, As aveias são tetraploides e hexaploides, os trigos são tetraploides (trigo duro) e

hexaploides (trigo de pão, Triticum aestivum) e o morango é octaploide, entre outras espécies.

Entretanto, parece não haver uma relação direta entre poliploidia e domesticação (Hilu, 1993).

O primeiro, e mais conhecido, poliploide surgido por manipulação humana foi

Raphanobrassica, um híbrido entre a couve e o rabanete. Em 1928, Karpechenko, realizando

cruzamentos entre rabanete (Raphanus sativus) e couve (Brassica oleracea), espécies com 2n=18

cromossomos, tentou obter plantas que reunissem a raiz do rabanete e as folhas da couve. Esses

cruzamentos produziam sementes, mas as plantas obtidas eram estéreis. Eventualmente, houve a

produção de algumas sementes, que resultaram em plantas férteis com o dobro do número de

cromossomos. Este alopoliploide, provavelmente, surgiu por poliploidização sexual espontânea.

Entretanto, apresentava a raiz da couve e as folhas do rabanete, não sendo o sucesso agronômico

esperado (Griffiths et al., 2000).

Os poliploides possuem, em geral, plantas maiores e mais robustas do que seus parentes

diploides (Stebbins, 1971). Daí o interesse em desenvolver artificialmente plantas com estas

características (Wittmann e Dall´Agnol, 2003).

Espera-se que plantas poliploides sejam melhores que aquelas diploides em uma série de

características. A razão para tal fato é que, as características adaptativas são controladas por

numerosos genes, distribuídos em vários cromossomos. No processo de evolução dos poliploides, o

efeito da poliploidia em mutações individuais pode ter pequenas consequências, mas coletivamente,

pode gerar características diferentes que estão sob controle de múltiplos genes (Simioni, 2004). Além

disso, o aumento da ploidia pode garantir vantagem adaptativa, pois pode mascarar os efeitos de

mutações deletérias, já que os poliploides, em geral, apresentam um efeito tamponante sobre estas

mutações, que seriam silenciadas devido ao maior número de cópias gênicas (Silva Jr, 2008).

A poliploidia leva à duplicação genômica e, consequentemente, à duplicação gênica. Segundo

Adams e Wendel (2005), a duplicação gênica pode ter as seguintes consequências evolutivas: (a)

genes adquirindo novas funções; (b) “silenciamento” de uma ou das duas cópias duplicadas; (c)

retenção da função original ou similar, persistindo a expressão gênica duplicada, que pode favorecer

casos em que mutações de uma cópia gênica podem conduzir a interações negativas com os produtos

de outros genes essenciais; (d) interação entre genes duplicados (efeito de dose = quanto mais alelos,

mais produto). Estudos envolvendo várias plantas poliploides revelaram um complexo padrão de

evolução dinâmica e contribuíram para o conhecimento sobre a relação entre a composição genômica

e a função dos genes (Yang et al., 2011).

21

A poliploidia induzida pode ser uma poderosa ferramenta para o melhoramento genético, sendo

utilizada basicamente de três maneiras: (1) poliploidização na própria espécie, como um modo de se

tentar conseguir plantas maiores e melhores; (2) poliploidização de um híbrido para restaurar a

fertilidade do híbrido estéril, sintetizar uma nova espécie ou ressintetizar uma espécie já existente e

(3) como uma ponte para transferir genes de interesse entre plantas com diferentes níveis de ploidia,

na mesma ou entre espécies diferentes (Dewey, 1980).

Poliploides induzidos podem ser obtidos por via somática ou sexual. A indução de poliploidia

por via somática é basicamente feita através da utilização de um agente inibidor dos fusos acromáticos

durante a mitose. A poliploidização com origem sexual, por sua vez, se baseia na ocorrência de

gametas não-reduzidos. Gametas contendo o mesmo número somático de cromossomos (não-

reduzidos) ocorrem, normalmente, em frequências muito baixas (em torno de 1%), em populações

naturais, surgindo a partir da não-redução do número cromossômico, causada por anormalidades na

meiose. A falha na redução pode ocorrer na primeira divisão meiótica - restituição na primeira divisão

- se os cromossomos não se dirigem para os pólos na anáfase, ou na segunda divisão meiótica -

restituição na segunda divisão - se não ocorre a citocinese. A detecção citológica, no lado masculino,

é facilmente realizada pela identificação de grãos de pólen diploides maiores do que os normais, ou

pela presença de díades ou tríades na telófase II (Schifino-Wittmann e Dall´Agnol, 2001).

Para a indução de poliploidização somática podem ser utilizados alguns agentes inibidores dos

fusos acromáticos (agentes antimitóticos). Dentre destes, o alcaloide colchicina (C22H25O6N),

extraído das sementes e bulbos do açafrão do prado (Colchicum autumnale), é o mais conhecido e o

mais empregado (Jackson, 1976 e Dhooghe et al., 2011). Diversos métodos de aplicação da colchicina

são utilizados, havendo sempre a necessidade de ajustes e de padronizações, de acordo com a espécie.

A aplicação pode ser feita em sementes, plântulas ou partes vegetativas com tecidos meristemáticos

ativos, como perfilhos e estolhos, por exemplo. O essencial é que haja tecidos em divisão ou com alto

potencial para tanto. Geralmente, concentrações próximas a 0,2% (quase sempre em solução aquosa),

e tempos de exposição de 1 a 16 horas, são as que apresentam melhores resultados. A aplicação pode

ser por imersão do tecido meristemático na solução, por gotejamento da solução sobre o meristema,

por aplicação de algodão embebido na solução diretamente sobre o ponto de crescimento (Eigsti e

Dustin, 1957; Elliott, 1967) ou ainda, adicionando-se a colchicina no meio de cultura in vitro (Silva

et al., 2000; Väinölä, 2000; Petersen et al., 2002).

As grandes vantagens da utilização da colchicina são sua facilidade de aplicação e eficiência na

produção de poliploides. Enquanto que as principais limitações para seu uso seriam: (1) Nem sempre

todas as células do tecido tratado se poliploidizam, o que pode levar à formação de quimeras, ou seja,

tecidos ou plantas com setores duplicados e outros não duplicados coexistindo no mesmo organismo;

22

(2) Fitotóxico para os tecidos das plantas, em concentrações elevadas ou sob tratamento muito

prolongado e (3) Muito prejudicial à saúde humana (Van Tuyl et al., 1992; Hammill et al., 1992).

O primeiro trabalho utilizando colchicina foi o de Menninger que em 1963 induziu tetraploides

de orquídeas do gênero Cymbidium por tratamento de sessões de pseudobulbos com solução de

colchicina.

Outra técnica utilizada para induzir poliploidia consiste em submergir sementes germinadas

recentemente, em água fria, a uma temperatura compreendida entre 1 e 3° C. O tratamento com água

fria é mais eficaz do que com água quente, uma vez que o calor pode danificar o tecido tratado

(Dermen, 1940).

Uma técnica alternativa de poliploidização de plantas é pelo uso da orizalina (Tosca et al.,

1995), utilizado por Van Tuyl et al. (1992) na duplicação de cromossomos de lírio. Os autores relatam

terem observado grande eficácia ao induzir poliploides com orizalina, podendo ser considerada como

uma alternativa para a colchicina. No entanto, a orizalina, que foi originalmente desenvolvida para

uso como herbicida, não está disponível para o uso comercial.

O herbicida Surflan é uma das substâncias com a capacidade de induzir poliploidização em

plantas. O Surflan contém 40% do princípio ativo orizalina e, portanto, é uma alternativa para

colchicina e orizalina pura (Takamura et al., 2002). No entanto, além de orizalina, o Surflan contém

alguns outros ingredientes secundários que, segundo Takamura et al. (2002), não apresentaram

influência na duplicação cromossômica e regeneração de plantas in vitro de lírio. O Surflan também

foi considerado um composto confiável para a poliploidização em kiwi, cebola, gérbera, maçã, batata,

milho e tabaco (Wan et al., 1991; Ramulu et al., 1991; Bouvier et al., 1994; Tosca et al., 1995; Chalak

e Legave, 1996 e Geoffriau et al., 1997). O Surflan pode ser uma alternativa para orizalina na

duplicação de cromossomos por causa da eficácia e preço barato, porém mais testes em outros

genótipos, doses e duração do tratamento são necessários. De acordo com Ascough e Staden (2008),

as dosagens usadas de orizalina variam de 2,5 mM (Allum et al., 2007) a 150 mM (Contreras et al.,

2007).

A época áurea da indução de poliploidia ocorreu nas décadas de 30 a 70 do século XX. Muitos

trabalhos foram publicados sobre poliploides induzidos, em espécies ornamentais e frutíferas (Nebel

e Ruttle, 1938), alfafa (Cooper, 1939; Dunbier et al., 1975), mandioca (Graner, 1941), trevos (Levan,

1942; Bragdo, 1955; Hutton, 1957; Armstrong e Robertson, 1960), Phalaris (Covas e Cialzeta, 1953;

Östergren, 1957), Phaseolus mungo (Sen e Chheda, 1958), Lolium, (Ahloowalia, 1967; Crowley e

Rees, 1968), Phlox drumondii (Raguvanshi e Pathak, 1975), Agroppyron (Asay e Dewey, 1979),

Matricaria chamomilla (Madhusoodana e Arora, 1979), Portulaca grandiflora (Singh, 1979) e

diversas outras, como centeio, uvas, beterraba e melancia (Dewey, 1980). Verificou-se, ao mesmo

tempo, que, de maneira geral, principalmente os autopoliploides recém-induzidos apresentavam, além

23

de níveis variáveis de gigantismo, também características desvantajosas, principalmente uma

diminuição da fertilidade. Sendo assim, houve uma reação de pessimismo em relação à indução de

poliploidia, pois, para utilização deste material, eram necessárias grandes populações e intensa

seleção.

Dewey (1980), examinando o que ocorreu com poliploides induzidos que eram considerados

economicamente promissores na década de 60, como centeio, uvas e beterrabas, mostrou que nenhum

destes teve o sucesso esperado à longo prazo. Mas, mesmo assim, a indução de poliploidia continuava

a ser feita em diversos países, principalmente naqueles com menores recursos econômicos. Segundo

o autor, a poliploidia induzida, para fins de melhoramento, seria mais importante para transferir

características de interesse entre plantas com diferentes níveis de ploidia, do que para obter plantas

maiores. Como em todos os assuntos polêmicos, ou como naquelas situações em que as promessas e

expectativas são muito altas e os resultados modestos, é necessário um balanço das vantagens e

desvantagens e avaliação da relação custo-benefício. Vários autores, desde o início da utilização desta

técnica, apresentavam uma postura mais realista, apontando não só seus problemas, mas

principalmente as suas possibilidades, mostrando que a poliploidia induzida pode ser utilizada como

o passo inicial, e como uma ferramenta importante, em alguns programas de melhoramento (Levan,

1942; Eigsti e Dustin, 1957; Stebbins, 1957, 1971; Elliot, 1967; Simmonds, 1980; Evans, 1981).

Um dos principais obstáculos à utilização de autopoliploides induzidos é a diminuição na

fertilidade, atribuída principalmente, mas não exclusivamente, ao comportamento meiótico dos

poliploides jovens. Entretanto, Ramsey e Schemske (2002), revisando dados da literatura, não

encontraram comprovações de que a fertilidade em neoautopoliploides seja menor do que em

neoalopoliploides. A fertilidade de um organismo está relacionada com o equilíbrio gênico,

consequentemente com o comportamento cromossômico na meiose e, ainda, com outros fatores,

genéticos, fisiológicos e ambientais, que agem na formação dos gametas, no desenvolvimento e na

maturidade do indivíduo. Em gerações avançadas de autotetraploides, muitas vezes, pode ser

observada uma tendência à regularização da meiose, semelhante à diploidização dos poliploides

naturais (Hazarika e Rees, 1967; Simonsen, 1973).

Um dos grandes problemas, que talvez tenha levado, durante um período, a certo descrédito em

relação à indução de poliploidia no melhoramento, é a comparação desigual entre um neopoliploide,

em suas primeiras gerações após a indução, e um progenitor, com milhões de gerações submetidas à

seleção natural, o que se reflete no desempenho inferior dos poliploides em relação aos diploides dos

quais foram derivados (Eigsti e Dustin, 1957). Muitos poliploides induzidos apresentam uma

compensação ao efeito “giga”, como menor número de folhas e flores, desenvolvimento mais lento,

etc... As características indesejáveis presentes em um neopoliploide podem, geralmente, ser

removidas por seleção em grandes populações (Elliott, 1967).

24

Diferentes tipos de plantas cultivadas respondem diferentemente à poliploidia induzida. Tanto

o nível de ploidia original, como o modo de reprodução, o ciclo de vida, perene ou anual, e a parte da

planta cultivada (por exemplo, se o produto final da cultura é o fruto, a semente, a flor ou a parte

vegetativa) influenciam o sucesso do procedimento. Portanto, o melhorista deve considerar com

cuidado as vantagens e desvantagens da utilização desta técnica em seu trabalho específico (Dewey,

1980). Nas espécies ornamentais, principalmente as de reprodução vegetativa, a duplicação do

número cromossômico é, em geral, vantajosa, pois não há uma dependência da fertilidade

(Simmonds, 1980; Allard, 1999). A redução na produção de sementes pode ser compensada, por

exemplo, por flores maiores e mais vistosas (Eigsti e Dustin, 1957). Um exemplo de alopoliploide

artificial em culturas graníferas relativamente bem sucedido e bastante utilizado é o do Triticale,

resultante do cruzamento do trigo e centeio (Müntzig, 1980).

Em geral, o objetivo é alcançar o nível tetraploide ou níveis de ploidia pares. Entretanto,

triploides são usados no melhoramento exatamente por sua esterilidade, como no caso da melancia

triploide, obtida pelo cruzamento de plantas diploides com tetraploides somáticos induzidos. A sua

grande vantagem é a não produção de sementes, o que atrai o consumidor. Por outro lado, o produtor

fica na dependência da compra das sementes triploides, devido à necessidade contínua de refazer os

cruzamentos. Muitos destes triploides podem, também, apresentar vigor híbrido e ser mais resistentes

à doenças. Nos Estados Unidos, cerca de 20 a 50% da produção de melancias é de triploides (Ufl,

1999).

Em plantas forrageiras, principalmente quando o interesse é a produção de forragem, a

poliploidia pode ser vantajosa, como nos autotetraploides de Lolium perenne e Lolium multiflorum e

nos alopoliploides de Lolium x Festuca (Carnahan e Hill, 1961; Evans, 1981). Entre as leguminosas

forrageiras, um bom exemplo é o trevo vermelho, Trifolium pratense (Taylor e Quesenberry, 1996).

Nesta espécie, vários trabalhos demonstraram que, em muitos casos, os autotetraploides são mais

persistentes, produtivos e resistentes à doenças. A diminuição da fertilidade, refletida pela baixa

produção de sementes, pode ser superada por seleção. Na Suécia, até 50% da produção de semente

certificada de trevo vermelho é oriunda de autotetraploides, que, de maneira geral, são mais bem

sucedidos e cultivados na Europa do que na América. Isto, muito provavelmente, deve-se ao fato de

que os melhoristas europeus vêm trabalhando há muito mais tempo com indução de poliploidia em

trevo vermelho, do que os pesquisadores americanos. Aparentemente, é necessário um período

considerável de tempo para que os genes do trevo vermelho se tornem adaptados à existência em

células com nível de ploidia mais alto (Taylor e Quesenberry, 1996).

Em culturas como a alfafa, a poliploidização sexual é utilizada como uma maneira de otimizar

a heterozigose, especialmente pelo modo bilateral (Bingham, 1980), e de possibilitar a introgressão

de genes de espécies diploides silvestres para a alfafa tetraploide cultivada (McCoy e Bingham,

25

1991). Tetraploides formados por poliploidização sexual bilateral apresentam maiores valores para

os componentes de rendimento de forragem e tamanho de folha e de caule, quando comparados a

seus progenitores diploides, apesar de haver uma diminuição na fertilidade (Barcaccia et al., 1998).

Em batata, tetraploides obtidos por poliploidização sexual apresentam maior produção de

tubérculos do que aqueles induzidos por colchicina (Peloquin et al., 1989). Nesta cultura, a

poliploidização sexual vem sendo utilizada como uma forma de transferir, de espécies selvagens

diploides para a tetraploide cultivada, a resistência ao escurecimento durante a armazenagem à frio

(Hayes e Thill, 2002). Uma das dificuldades a serem superadas para uma utilização mais ampla da

poliploidização sexual é a obtenção de genótipos com as características de interesse e que, ao mesmo

tempo, produzam gametas não-reduzidos de forma regular (Ramanna, 1992). Para que isto seja

atingido, há necessidade de seleção para ambos os aspectos.

Além da ampla utilização de poliploides espontâneos em espécies ornamentais, como por

exemplo, narcisos, tulipas, jacintos (Brandham et al., 1995) e cactos (Karle et al., 2002), poliploides

induzidos continuam sendo utilizados no melhoramento de Tripsacum dactyloides (Salon e Earle,

1998), Trifolium alexandrinum (1999), orquídeas (Silva et al., 2000), Gentiana triflora (Morgan et

al., 2003), e nos gêneros Avena (Ladizinsky, 2000) e Rhododendron (Väinölä, 2000), entre muitos

outros. Os trabalhos mais recentes utilizando técnicas de poliploidia são: alterações fenotípicas e

genômicas em poliploides sintéticos de Tulipa (Tulipa) e Hemerocallis em relação aos seus

homólogos diploides (Podwyszynska et al., 2012), ploidia de Lachenalia spp. regenerada e propagada

in vitro em diferentes meios (Bach et al., 2012), indução de poliploidia em Dendrobium hibrido “Miss

Singapore” por meio de cultura de tecidos (Bunnag e Hongthongkham, 2012), indução de poliploidia

in vitro por aplicação de colchicina em Heliconia bihai (Cavalcanti-Filho, et al., 2012), indução de

tetraploides in vitro de Lilium (Gabryszewska, et al., 2012), poliploidização meiótica em Tulipas

Darwin híbridas (Marasek-Ciotakowska, et al., 2012) e geração de poliploides em Calluna vulgaris

(Przybyla, 2014).

As plantas poliploides podem ser identificadas por meio de contagem do número cromossômico

de células, avaliação de caracteres citológicos, tais como: tamanho das células-guarda dos estômatos,

densidade estomática, avaliação do diâmetro dos grãos de pólen (Graner, 1941; Brewbaker, 1952;

Evans, 1955; Armstrong e Robertson, 1960; Elliott, 1967; Silva et al., 2000; Beck et al., 2003; Morgan

et al., 2003), assim como, pela avaliação do número de plastídios presentes nas células dos estômatos

(Bingham, 1968; Boaventura et al., 1981).

Uma alternativa seria a estimativa do nível de ploidia através da determinação do volume de

DNA nuclear, que pode ser feita por microdensitometria ou citometria de fluxo (Schifino-wittmann,

2001). A citometria de fluxo vem sendo cada vez utilizada em determinações de nível de ploidia,

associada à indução de poliploidia ou identificação de poliploides espontâneos (Salon e Earle, 1998;

26

Sáuco et al., 2001; Morgan et al., 2003). Características morfológicas externas, tais como gigantismo

(órgãos maiores e, em geral, mais espessos), podem auxiliar na distinção de plantas poliploides (Eigsti

e Dustin, 1957; Elliot, 1967), sendo, entretanto, estas avaliações consideradas como subjetivas, pois

sofrem grande efeito ambiental e, portanto, são passives de falhas com maior frequência.

É necessário um cuidado especial quando há formação de quimeras nas plantas tratadas com

agentes poliploidizantes pois, dependendo da parte da planta analisada, podem ser observados

resultados contrastantes, levando a conclusões errôneas (Wittmann e Dall´Agnol, 2003).

Apesar da importância do uso de poliploides para obtenção de novas cultivares ornamentais, o

gênero Mandevilla não apresenta nenhum estudo anterior sobre a indução de poliploides, em espécies

nativas ou comerciais.

2.4.1 Técnica de citometria de fluxo

A citometria de fluxo é uma tecnologia que permite a análise simultânea e multiparamétrica de

células ou partículas em suspensão, avaliando-as individualmente. À medida que o fluxo de amostra

passa por um ou mais feixes de luz (gerados por um ou mais lasers), o sistema óptico-eletrônico

registra a forma como as estruturas dispersam a luz do laser incidente e captando as fluorescências

emitidas. Assim, o equipamento obtém informações de diversos parâmetros tais como: tamanho

relativo, complexidade interna e intensidades de fluorescências de cada célula ou partícula avaliada.

Desta maneira, podem ser realizadas análises quantitativas de DNA e revelar a ploidia de células em

suspensão (Loureiro et. al, 2012).

As aplicações da citometria de fluxo na horticultura estão majoritariamente relacionadas com o

controle da estabilidade do nível de ploidia; a conformidade de lotes de sementes; a detecção de

plantas haploides para posterior produção de linhas duplo-haploides, ou seja, linhas puras férteis; a

produção e detecção de triploides estéreis em plantas hortícolas ou para cultivo em parques; a

produção e detecção de novos níveis de ploidia, como plantas tetraploides, que podem apresentar

novas características de interesse econômico e a produção e detecção de híbridos interespecíficos.

Estas aplicações estão intimamente relacionadas com as áreas da biotecnologia e melhoramento

vegetal e beneficiam-se da elevada capacidade de processamento de amostras associada à citometria

de fluxo, aspecto fundamental para a detecção das plantas de interesse em estados de desenvolvimento

inicial.

As principais vantagens no uso da citometria de fluxo são: conveniência (fácil preparação de

amostras), rapidez, análise não destrutiva (as quantidades de material vegetal que são necessárias são

mínimas), não necessita de células em divisão, é capaz de detectar mixoploidias e, por fim, após a

aquisição do instrumento, os custos associados às análises são relativamente diminutos. Por estas

27

razões, a citometria de fluxo é cada vez mais tida como a metodologia ideal para análises deste tipo

em diversas áreas, incluindo a horticultura (Loureiro et. al, 2012).

2.4.2 Número cromossômico de plantas de Mandevilla

Em Apocynaceae, o número cromossômico 2n=22 é o mais comum, embora ocorram

variações nos níveis de ploidia, com registros de triploides (2n=3x=33) e tetraploides (2n=4x=44). O

número básico primário referido para Apocynaceae é x=11, com vários números básicos secundários,

x=6, 12, 16, 18, 20, 21 e 23, de origem diploide (Raven, 1975; Van Der Laan e Arends, 1985).

Segundo Santos et al. (2009) a Mandevilla bahiensis e M. hatschibachii apresentaram 2n=16,

enquanto a Mandevilla sancta, 2n=20. Em todos os casos, foram observados núcleo semi-reticulado

e cromossomos relativamente pequenos.

2.5 Mutagênese induzida com radiações ionizantes em plantas

Apesar do destacado papel das mutações espontâneas na obtenção de novas cultivares de

plantas, a frequência de aparecimento destas mutações na natureza é muito baixa (Broertjes e Van

Harten, 1988). A mutagênese induzida tem a capacidade de aumentar várias vezes à frequência de

mutações. Devido a isto, ela tem sido rotineiramente utilizada em programas de melhoramento de

ornamentais em vários países (Broertjes e Van Harten, 1988).

Os principais fatores da evolução das espécies são as mutações espontâneas, recombinação e

seleção natural. Nesse sentido, o melhoramento de plantas pode ser considerado como a evolução

controlada pelo Homem (Tulmann et al., 1990).

Quando Stadler (1928) relatou que raios x provocavam mutações também em plantas os

melhoristas passaram a dispor de mais uma ferramenta de trabalho para a ampliação da variabilidade

genética. Nos primeiros trabalhos de indução de mutações foram utilizadas sementes, borbulhas,

pólen, etc., isto é, propágulos in vivo (Konzak, 1984). Porém, com o avanço das técnicas de cultura

de células e tecidos, abriu-se novo campo de uso destes mutagênicos associado à cultura in vitro

(Tulmann et al., 1990).

A escolha do mutagênico a ser usado nos tratamentos in vivo ou in vitro de plantas depende de

sua efetividade (relação entre dose utilizada e frequência de mutação) e da sua eficiência (produção

de mutações desejáveis, livres de associações com mutações indesejáveis) (Konzak 1984).

Os mutagênicos físicos compreendem os diferentes tipos de radiações, tais como as radiações

eletromagnéticas: luz ultravioleta (UV), raios x e raios gama, e radiações corpusculares: partículas

alfa, beta, prótons, nêutrons e etc... As radiações transferem sua energia, direta ou indiretamente, ao

28

material genético que é o DNA, por meio de vários processos físico-químicos (Tulmann et al., 1990),

tais como colisão, excitação e ionização. Evidentemente todos os componentes celulares sofrem esses

efeitos. No caso do DNA, a maior parte dos danos é reconstituída pelo sistema de reparo da própria

célula. Nesse caso de reconstituição, poderá haver reposição errada de bases nitrogenadas, causando

alterações no código genético e, consequentemente, causar mutações. Para os outros componentes, o

grau de injurias pode variar, resultando em redução da divisão mitótica ou até morte das células. No

material tratado podem coexistir efeitos fisiológicos, não transmissíveis à linhagem de células

posteriores, e os efeitos genéticos (mutações) (Tulmann et al., 1990).

Quanto às radiações ionizantes, os raios gama têm sido os mais utilizados para mutagênese,

sendo obtidos principalmente por meio dos radioisótopos Cobalto 60 e Césio 137, existindo vários

tipos de equipamentos disponíveis para o tratamento (Briggs e Constantin, 1977; El-Khateeb et al.,

2016).

A determinação da sensibilidade dos propágulos, às radiações a serem utilizadas, é uma etapa

indispensável na aplicação da mutagênese induzida. Estes parâmetros são baseados nos efeitos

fisiológicos indiretos tais como: redução na altura da planta, redução na sobrevivência e outros,

produzidos pelos mutagênicos. Um parâmetro muito utilizado é a recomendação de doses que causem

50% de letalidade. Para a mutagênese in vitro os critérios ainda não estão bem definidos, mas em

linhas gerais, seguem os da mutagênese in vivo (Howland e Hart, 1977).

O que tem sido feito são experimentos preliminares, usando-se doses ou concentrações

crescentes do mutagênico, a partir do explante escolhido para o tratamento. As respostas obtidas são

analisadas e determinadas às doses ou concentrações do mutagênico em função da redução dos

seguintes parâmetros: sobrevivência, crescimento (baseado no peso seco ou peso fresco), número de

novas brotações, número de embriões formados, entre outros. O que se espera é a determinação de

uma alta associação entre o efeito do mutagênico e frequência de mutações (Tulmann et al., 1990).

Uma vez determinada a sensibilidade, pode-se iniciar o experimento com uso de doses definidas de

mutagênico.

Os mutagênicos químicos e físicos apresentam diferenças no modo de ação e a recomendação

geral é que os dois tipos podem ser usados, aumentando assim a possibilidade de obtenção da mutação

procurada. No entanto, não se recomenda o uso das duas formas de tratamento em conjunto evitando

assim mutações deletérias (Tulmann et al., 1990).

Quanto ao tamanho da população inicial a ser tratada, há algumas considerações gerais para a

mutagênese as quais apresentam, também, fórmulas que estimam o tamanho da população a ser

utilizada, levando-se em conta a frequência de mutações naturais ou induzidas, obtidas para uma série

de organismos, de acordo com tipo de mutação (Nabors, 1976; Brock, 1977).

29

Os raios gama foram os mutagênicos físicos mais empregados em trabalhos de mutagênese

induzida (64% dos casos) e as plantas ornamentais ou decorativas foram as que obtiveram o maior

número de cultivares mutantes liberadas, com 25% do total (Maluzynski et al., 2000). Este sucesso

deve-se ao fato de haver uma maior facilidade na seleção de mutações de coloração e de morfologia

e, além disto, pelo fato de as plantas ornamentais geralmente apresentarem ciclo curto e altos níveis

de heterozigosidade, o que possibilita que mutações recessivas (as mais frequentes) possam ser

reconhecidas imediatamente (Broertjes e Van Harten, 1988).

O sucesso desta técnica em ornamentais é particularmente notável na cultura de crisântemo, na

qual foram lançadas 210 novas cultivares, sendo que muitas dessas permaneceram por vários anos no

mercado, contribuindo com milhões de dólares para os produtores (Ahloowalia et al., 2004). Tais

mutantes destacaram-se não apenas pelas novas colorações obtidas, muitas vezes inexistentes na

cultivar original usada para o tratamento, como também por apresentarem novos formatos de

inflorescência, precocidade, resistência ao frio, dentre outras características.

No Brasil a indução de mutações com uso de raios gama já produziu novas cultivares de

crisântemo de corte, que foram liberadas aos produtores e consumidores (Tulmann Neto e Latado,

1997; Adames et al., 1999).

Em experimentos de mutagênese induzida vários são os fatores que podem afetar a frequência

e o espectro de mutantes obtidos, bem como o tipo de quimerismo que pode ocorrer nos mutantes

(quimeras setoriais, mericlinais ou periclinais). Dentre os fatores, podem ser citados o tipo e a dose

de mutagênico, material vegetativo a ser tratado, método de condução das plantas pós-tratamento,

tipo de mutação a ser selecionado, método de seleção da mutação, estabilidade da cultivar usada,

dentre outros (Tulmann Neto e Latado, 1997). Como destacam Broertjes e Van Harten (1988), uma

vez que ocorra alguma mutação com o uso do mutagênico, o quimerismo automaticamente ocorrerá

se mais de uma célula estiver presente no momento do tratamento. Esses autores citam ainda que

quimeras mericlinais, por exemplo, não são estáveis, e que do ponto de vista do melhoramento, outros

métodos devem ser usados de modo a obter mutantes não quiméricos (sólidos) ou quimeras periclinais

(estáveis).

Uma possibilidade para a obtenção de mutantes estáveis (mutantes sólidos ou periclinais) é pelo

o uso da técnica de podas repetidas no ramo ou na planta irradiada, com o objetivo de ampliar o setor

mutado até se conseguir a estabilização. Spiegel–Roy et al. (1990) avançaram até a terceira geração

de podas sucessivas para estabilizar ramos mutantes de limão sem sementes. Já Boersen et al. (2003)

obtiveram mutantes periclinais na primeira geração de plantas resultantes do evento mutagênico e

sem a necessidade de podas, mas somente após o uso das doses maiores de mutagênico, acima de 15

Gy de raios gama.

30

Segundo El-Khateeb et al. (2016) é recomendado usar raios gama em doses mais baixas (10-

100 Gy) para obter mutantes úteis. A esse respeito, Raghava et al. (1988) descobriram que doses de

100 Gy e superiores provaram ser prejudiciais para a altura da planta, número de folhas e tamanho

das folhas do gladíolo. Datta (1997), em Lantana depressa, determinou que a altura de plantas e o

número de folhas foram significativamente reduzidos em todas as doses, exceto 10 Gy. Já

Chakravarty e Sen (2001), em Scilla indica, afirmaram que os raios gama nas doses de 2 ou 5 Gy

promoveram maiores taxas de crescimento e aceleraram a divisão celular. Arafa et al. (2011), em

Zantedeschia aethiopica, descobriram que o tratamento 30 Gy foi superior para o crescimento. Vários

pesquisadores mencionam que se doses mais elevadas de raios gama são utilizadas, o crescimento e

a qualidade das plantas tratadas, diminuem.

Nesse sentido, Dilta et al. (2003) em crisântemo, encontraram reduções significativas na

sobrevivência das plantas, altura da planta, número de folhas e tamanho e número de flores, bem

como aumento em anormalidades de plantas, em função do aumento da dose de mutagênico. Nas

orquídeas, Kozlowska (1994) mostrou que a dose 200 Gy inibia totalmente o crescimento e Gonzales

(2007) descobriu que a altura e o número de folhas diminuíram com doses maiores. Também El-

Khateeb et al. (2007), em melissa, descobriram que o número de folhas diminuía com o aumento das

doses gama. Suraninpong e Wuthisuthimethavee (2013), trabalhando com antúrio (A. andraeanum),

Patil (2014) e Upadhyay (2014) trabalhando com gladíolo, relataram que o crescimento das plantas

tendia a diminuição com o aumento das doses. O efeito da radiação gama no pigmento clorofila foi

estudado por Palamine et al. (2005) em dracena. Eles observaram que o uso de dose de 20 Gy diminuía

a proporção das clorofilas a e b. Também Jinxi (2006), no antúrio (A. andraeanum), encontrou uma

correlação negativa entre doses de radiação gama e conteúdo de clorofilas. No sentido contrário,

Chandrashekar et al. (2013), em Terminalia arjuna, observaram que os teores de clorofila

aumentavam com o uso de doses crescentes de radiação.

Várias anormalidades em folhas (forma, tamanho, margem, ápice e fusão) foram relatadas por

Datta (1997) em plantas de Lantana depressa irradiadas com doses de raios gama superiores a 30 Gy.

Rashid et al. (2013), em gengibre, afirmaram que raios gama causaram anormalidades tais como:

plantas anãs, caules tortos e folhas onduladas. Singh et al. (2015) no gladíolo, observaram a existência

de várias alterações morfológicas após uso de doses de 25 a 45 Gy de raios gama.

31

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material Vegetal

Neste estudo foram utilizadas plantas de Mandevilla bahiensis, que apresentam flores rosas,

pequenas e florescem o ano todo (Figura 1), além de plantas de Mandevilla da cultivar comercial

“Pretty Crimson” da empresa Santory, com flores vermelhas escuro; folhas pequenas, lanceoladas e

com cor verde brilhante (Figura 2).

Plantas da espécie M. bahiensis foram utilizadas para indução de plantas autopoliploides,

enquanto as plantas da cultivar comercial “Pretty Crimson” foram utilizadas nos experimentos de

indução de mutações com uso de raios gama, visando obter mutantes com alteração no ciclo de

cultivo, na coloração e formato da inflorescência.

As cultivares foram selecionadas pela sua importância no mercado de flores sendo consideradas

como as mais comercializadas no Brasil e por apresentarem florações mais uniformes durante todo o

ano.

3.2 Indução de mutações in vivo em Mandevilla cultivar “Pretty Crimson” com uso de raios

gama

3.2.1 Avaliação da radiossensitividade de estacas (enraizadas ou não) à raios gama

O objetivo deste experimento foi avaliar a radiossensibilidade de estacas (enraizadas ou não

enraizadas) à raios gama. Observando os efeitos de doses crescentes de raios gama e a necessidade

ou não de proteção da base das estacas com cilindros de chumbo para evitar danos severos no sistema

radicular das plantas.

Foram utilizadas 960 estacas enraizadas e 960 estacas não enraizadas da cultivar comercial

“Pretty Crimson”, com 10 cm de comprimento, contendo cerca de seis gemas axilares cada. Estas

estacas foram submetidas ao tratamento de exposição aos raios gama na fonte de Co60 do Centro de

Energia Nuclear na Agricultura, Piracicaba, SP, com as doses 0; 7,5; 15; 22,5; 30; 37,5; 45 e 52,5 Gy

(taxa de dose aproximada de 290 Gy/h) e com e sem proteção de cilindros de chumbo.

Foram irradiadas 120 estacas enraizadas com cada dose distinta de mutagênico (8 doses), sendo

metade destas (60 estacas) protegidas com cilindros de chumbo no momento da irradiação, para

proteger a base das plantas (duas últimas gemas basais) dos efeitos da radiação. A outra metade das

plantas não foi protegida com cilindros de chumbo. Os mesmos tratamentos foram realizados com as

estacas não enraizadas.

32

As estacas enraizadas e não enraizadas, após os tratamentos, foram plantadas em vasos de 1 L

de volume usando substrato de casca de Pinus, em estufas climatizadas no município de Holambra,

SP. Os tratos culturais durante todo o período do experimento consistiram de fertirrigações semanais

com condutividade elétrica de 1,5 µs/cm. A temperatura média foi de 25° C e a intensidade média de

luz foi de 40.000 lux.

O delineamento experimental foi realizado em blocos ao acaso, contendo três blocos, sendo

cada parcela composta por 20 estacas, o que totalizava 120 estacas para cada dose de radiação (60

protegidas e outras 60, não protegidas). Os experimentos foram conduzidos na forma de fatorial duplo

(8 x 2), com oito doses de radiação e uso, ou não, de proteção das bases das mudas (bases protegidas

ou não protegidas). Foram realizados dois experimentos iguais e independentes com o uso de estacas

enraizadas ou com uso de estacas não enraizadas (Figura 3).

Figura 3. (A) Mudas enraizadas e mudas sem raiz; (B) Cilindro de proteção; (C) Fonte de raios

gama; (D) Plantio de mudas enraizadas em potes com substrato e mudas sem raiz em túneis.

A avaliação da radiossensitividade foi feita 30 dias após o plantio, com a contagem do total de

plantas vivas em cada tratamento. Em seguida, foi calculada a porcentagem de plantas sobreviventes

por dose de mutagênico.

A escolha da dose de raios gama e a necessidade de proteção da base das estacas para o

prosseguimento da pesquisa foi realizada observando-se o DL50 (dose letal de 50% das plantas) e o

DL30 (dose letal de 30% das plantas) de cada cultivar, nas estacas com bases protegidas ou não, e

ajustando-se os dados com uso de equação de regressão linear.

Os resultados obtidos foram também submetidos à análise de variância do tipo fatorial, com

avaliação do efeito dos dois fatores (proteção das raízes e dose de mutagênico). Em seguida, as médias

dos tratamentos foram comparadas entre si por meio do uso do teste Tukey, a 1% probabilidade.

33

3.2.2 Irradiação de estacas com dose selecionada e seleção de mutantes durante o florescimento

Após a determinação da radiossensitividade foi realizada a irradiação de 2.000 estacas, com

comprimento de 10 cm, não enraizadas, da cultivar “Pretty Crimson”, utilizando-se as doses de 24,7

e 41,2 Gy de raios gama e protegidas na base por cilindros de chumbo. Desta forma foram utilizadas

1.000 estacas para cada dose de mutagênico. Como controle experimental foram utilizadas 100

estacas não irradiadas.

As estacas foram plantadas em vasos pote número 15 sob condições de estufa comercial.

Quando as plantas apresentavam altura média de 15 cm foi feita a aplicação do método das podas

repetidas, de acordo com o citado em Broertjes e Van Harten (1988), descrito a seguir. A primeira

poda foi realizada com a retirada do ápice caulinar de cada planta, o que resultou na quebra da

dominância apical nas plantas. Em seguida, cada planta foi conduzida mantendo-se somente três

ramos (M1V1) e eliminando-se os demais. Ramos M1V1 eram os desenvolvidos a partir de gemas

axilares presentes nas plantas na região inferior ao local das podas.

Após o período de 15 dias, foram aplicadas novas podas, agora com eliminação dos ápices

caulinares dos ramos M1V1, possibilitando o desenvolvimento de ramos M1V2. Apenas um ramo

M1V2 originado de cada ramo M1V1 foi mantido para o desenvolvimento. Em cada planta, a

eliminação dos ramos sem interesse foi feita ao acaso. Os procedimentos foram repetidos até o

desenvolvimento de ramos M1V3, momento a partir do qual as plantas se desenvolveram livremente

(Figura 4).

Figura 4. Método das podas repetidas de plantas irradiadas.

No período de florescimento foram avaliadas e selecionadas plantas com as seguintes

características: flores com coloração e/ou formato da inflorescência, distintas das da cultivar original;

folhas variegadas; folhas com formato distinto ou plantas com alteração no ciclo, isto é, com

florescimento precoce. Essas mutações selecionadas foram consideradas como de interesse para

avaliação ou para uso em programas de melhoramento genético de Mandevillas.

M1V1

M1V2 M1V3

34

Os mutantes encontrados foram numerados e multiplicados vegetativamente por meio de

estaquia, totalizando 200 estacas por mutante selecionado (replicatas). Estes materiais propagativos

foram usados no experimento de avaliação da estabilidade e homogeneidade das mutações.

Para tal, 200 estacas enraizadas de cada clone mutante foram plantadas em vasos e mantidas

em estufa. A estabilidade e a homogeneidade das plantas mutantes foram avaliadas após seis meses

de cultivo. Para a estabilidade foi observado se as características mutadas se mantiveram inalteradas

nas plantas mutantes, propagadas vegetativamente, em relação à característica de interesse observada

na cultivar original cultivar “Pretty Crimsom”. Já a homogeneidade foi avaliada observando se as

características mutadas se mantiveram inalteradas em todas as 200 plantas mutantes, após terem sido

propagadas vegetativamente.

3.3 Indução de plantas autotetraploides de Mandevilla

3.3.1 Indução de plantas autotetraploides de M. bahiensis por meio de tratamento in vitro

O objetivo deste experimento foi induzir plantas autotetraploides de M. bahiensis utilizando-se

do cultivo in vitro temporário de explantes em meio de cultivo contendo colchicina, seguido de

regeneração de brotações em meio sem a presença do alcaloide.

O tipo de explante utilizado para o estabelecimento in vitro foi o segmento nodal, obtidos de

ramos adultos de plantas mantidas em estufas. O meio de cultivo in vitro utilizado para o tratamento

temporário com colchicina e para a regeneração de brotações foi o meio MS acrescido de 30 g.L-1 de

sacarose, 1 mg.L-1 de BAP e 7 g.L-1 de ágar.

Para os tratamentos com colchicina os segmentos nodais foram imersos em meio de cultura

líquido contendo sais e vitaminas de meio MS, acrescido de 10 mM de MES (ácido

morfolinoetanosulfônico), com pH ajustado para 6,0 antes da autoclavagem. A colchicina foi

dissolvida em solução aquosa (3 mL), seguido de filtro-esterilização e adição ao meio de cultura nas

concentrações de 0,025 e 0,05% m/v. O mesmo meio de cultivo (líquido) sem a presença de colchicina

foi usado como controle experimental.

Os frascos contendo solução de colchicina e os explantes foram mantidos a 26° C, no escuro e

sob agitação de 50 rpm, durante 8, 16 e 24 h. Em seguida, os explantes foram lavados duas vezes em

água destilada esterilizada e secos sobre discos de papel filtro esterilizados, antes da transferência

para meio de regeneração de plantas.

Os explantes foram cultivados em meio de regeneração sob condições de fotoperíodo de 16

horas de luz (50 µmol/m2/s) e temperatura de 26° C, até o desenvolvimento de brotações. Após 60

dias de cultivo foi realizada a avaliação do número de brotações contaminadas e brotações

35

sobreviventes. Em seguida, calculou-se as taxas de contaminação e taxa de sobrevivência, expressas

em porcentagem (Figura 5).

Figura 5. (A) Explantes de M. bahiensis e meio de cultura; (B) Preparação dos segmentos nodais;

(5) Segmentos nodais em meio liquido contendo colchicina; (E) Segmentos nodais em meio liquido

contendo colchicina em agitação; (F) Plantas tratadas com colchicina em rustificação.

O delineamento experimental utilizado foi o fatorial 3 x 3, contendo três tempos de exposição

(8, 16 e 24 h.) e 3 concentrações de colchicina (0; 0,025 e 0,05% m/v), sendo cada tratamento

composto por três repetições. Cada repetição do tratamento foi formada por 25 segmentos nodais in

vitro. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANAVA) e as médias, foram

comparadas através do teste Tukey, a 1% probabilidade.

3.3.2 Identificação e caracterização de plantas autotetraploides de M. bahiensis

Para a aclimatização, as brotações desenvolvidas foram mantidas em câmara úmida durante 30

dias, sendo a seguir, transferidas para estufas sob condições de temperatura e umidade relativa

controladas, mantendo-se sempre a identificação do tratamento utilizado (tempo de exposição e

concentração da colchicina). Após este período, avaliou-se a sobrevivência das plantas aclimatizadas.

As plantas aclimatizadas tiveram a sua ploidia avaliada utilizando o método de citometria de

fluxo. A etapa inicial foi a identificação da ploidia das plantas originais usadas no experimento. Para

tal, foram avaliadas duas plantas por meio da técnica de citometria de fluxo utilizando-se o

equipamento Partec CyFlow Ploidy Analyzer DAPI (Partec Gmbh., Alemanha), que é equipado com

lâmpada UV-LED (emissão com comprimento de onda de 365 nm) e um parâmetro ótico para

detecção de fluorescência.

Cada amostra foi composta por suspensões nucleares isoladas a partir de segmentos de folha

(lâmina foliar) com tamanho aproximado de 0,25 cm2 (0,5 x 0,5 cm). Os núcleos das células foram

extraídos por meio de cortes no limbo foliar com auxílio de lâmina de aço afiada (bisturi) e na

presença de 0,2 ml do tampão de extração (kit de coloração CyStain UV precise T-DAPI, Partec

Gmbh.). A seguir, as suspensões foram coradas com 0,8 ml da solução corante do mesmo kit, que usa

36

o 4-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) como fluorocromo, filtradas com filtros CellTrics de 30 μm

(Partec Gmbh.) e analisadas imediatamente.

De cada amostra foram avaliados no citômetro 1.000 núcleos intactos, no mínimo, com uso do

software CyView (Partec Gmbh.) e a calibração: Gain = 535 e Low Level (LL) = 0,70, resultando em

histogramas com o tamanho relativo dos núcleos das células de cada amostra. As amostras cujos

coeficientes de variação (CV) se situaram acima de 10% foram descartadas.

O tamanho relativo médio dos núcleos de cada amostra foi calculado posteriormente utilizando-

se como controle, amostras de plantas de M. bahiensis diploide. Dentre todas as plantas poliploides e

mixoploides identificadas foram selecionadas e multiplicadas vegetativamente seis plantas

tetraploides para serem usadas nos testes posteriores de avaliação fenotípica.

3.3.2.1 Análises morfológicas e anatômicas de plantas autotetraploides de M. bahiensis

Para as análises morfológicas de plantas tetraploides foram utilizadas seis plantas tetraploides

distintas, identificadas por citometria de fluxo, além de uma planta controle diploide. As variáveis

mensuradas foram o diâmetro do caule a 10 cm de altura (DC) e distância entre dois nós (DE),

comprimento foliar (C) e largura foliar (L) de três folhas totalmente expandidas (mais superiores),

sendo posteriormente calculada a relação comprimento/largura foliar (C/L). Em seguida foram

mensuradas a espessura e área foliar.

O diâmetro do caule, distância entre dois nós e a espessura foliar foram avaliados com auxílio

de um paquímetro digital. A área foliar foi avaliada por meio de fotografia digital de folhas, sendo as

imagens posteriormente manuseadas através do Software ImageJ® (Powerful Image Analysis).

A caracterização anatômica das folhas das plantas tetraploides foi realizada confeccionando-se

lâminas permanentes contendo cortes transversais de seções da folha. Utilizou-se o terço médio das

amostras (folhas) contendo a nervura central das terceiras folhas maduras (completamente maduras),

contadas a partir do ápice de plantas.

As amostras foram fixadas em solução FAA 70% (formaldeído, ácido acético e etanol 5:5:90

v/v), por 24 h. Posteriormente as amostras foram mantidas em solução de etanol 70% por mais 24 h.

e, posteriormente, desidratadas em série etílica (70, 80, 90, 95 e 100% v/v), antes da embebição em

solução de infiltração e inclusas em resina de hidroxietilmetacrilato (LEICA-HISTORESIN®),

conforme recomendação do fabricante.

Os blocos foram então cortados em secções transversais com 6 µm de espessura em micrótomo

automático da marca Leica®. Os cortes foram colocados em banho histológico e sobrepostos em

lâminas. Essas lâminas, contendo os cortes, foram coradas com safrablau (Astra-blue 1% e safranina

1%) e as lamínulas foram fixadas nas lâminas com resina sintética (Entellan®).

37

As lâminas histológicas foram fotomicrografadas em microscópio ótico sendo que as imagens

capturadas já continham a escala automática, devidamente calibrada. As imagens foram analisadas

com auxílio do software ImageJ® para mensuração das espessuras da epiderme adaxial (EAd), da

epiderme abaxial (EAb), do parênquima paliçádico (PP) e do parênquima lacunoso (PL).

Os resultados obtidos neste conjunto de experimentos foram submetidos à análise de variância

e as médias comparadas através do teste Tukey, a 1% probabilidade.

3.3.2.2 Análises estomáticas e determinação de teores de clorofila de plantas autotetraploides

de M. bahiensis

Para avaliação da densidade estomática e do tamanho (largura e comprimento) das células-

guarda dos estômatos foram utilizadas folhas totalmente expandidas, geralmente da terceira folha,

contada do ápice para a base do ramo e em ramos distintos.

As folhas foram lavadas e seccionadas em tiras, transferidas para solução de etanol 70%, por

cinco minutos. A seguir, as tiras de folhas foram transferidas para solução de hidróxido de potássio a

5%, em temperatura próxima do ponto de fervura, durante três minutos, seguido de transferência para

água destilada, à temperatura ambiente.

A epiderme abaxial foi retirada com auxílio de uma pinça e colocada na lâmina, com a face

externa para abaixo. Após cobrir a amostra com a lamínula, procedeu-se a visualização num

microscópio ótico Zeiss Axioscop 40 HBO 50 A/C, onde as imagens foram capturadas e depois,

digitalizadas.

A avaliação da densidade estomática foi realizada com uso da objetiva de 40x, observando-se

dez campos de visão por amostra. Como cada campo de visão possuía uma área de 0,046876 mm2,

optou-se pela transformação dos dados originais para densidade de estômatos por mm² de folha.

O comprimento e a largura das células-guarda dos estômatos foram avaliados utilizando-se a

mesma objetiva e com o auxílio do software AxioVision. Foram tomadas medidas de dez células-

guarda, escolhidas ao acaso, de três repetições de cada planta.

A determinação de teores de clorofilas presentes nas folhas de plantas tetraploides e diploides

foi realizada utilizando-se o equipamento Clorofilog (Falker®) que fornece uma medida

adimensional, o Índice de Clorofila Falker (ICF), em folhas. As leituras foram realizadas em quatro

folhas situadas em região superior do caule das plantas, contadas a partir do ápice em direção a base.

Realizou-se cinco leituras na região mediana de cada folha. Depois, calculou-se a média das cinco

leituras e essa média foi tomada como uma repetição, sendo realizadas dez repetições.

Os resultados obtidos neste conjunto de experimentos foram submetidos à análise de variância

e as médias comparadas através do teste Tukey, a 1% probabilidade.

38

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Indução de mutações in vivo em Mandevilla cultivar “Pretty Crimson” com uso de raios gama

4.1.1 Avaliação da radiossensitividade de estacas (enraizadas ou não) à raios gama

Observou-se que as mudas provenientes dos tratamentos com as doses mais elevadas do

agente mutagênico, especialmente exposição à dose de 52,5 Gy de raios gama, apresentaram efeitos

fisiológicos típicos, poucos dias após a irradiação, tais como: plantas com redução no crescimento,

folhas pequenas e deformadas, que se mostravam quebradiças e com pontos cloróticos. Em plantas,

os efeitos fisiológicos pós-irradiação são considerados como transitórios e geralmente cessam durante

o desenvolvimento posterior das plantas (Broertjes & Van Harten, 1988).

No presente estudo, as taxas de sobrevivência de estacas caulinares diminuíram com o

aumento das doses de radiação, independentemente do uso de estacas enraizadas ou não enraizadas

e, também, do uso de estacas com bases protegidas ou desprotegidas (Tabela 1). Outros autores

descreveram a diminuição das taxas de sobrevivência com o aumento das doses de radiação. Boersen

et al. (2007), por exemplo, observaram em mudas de Chrysanthemum diminuições de

aproximadamente 45% nas taxas de sobrevivência após irradiações com dosagens de 20 ou 25 Gy de

raios gama e letalidade completa quando utilizou-se 30 Gy. O mesmo foi observado por Swaroop et

al. (2015) em Bougainvillea, em que a taxa de sobrevivência foi de 41% para dose de 20 Gy, seguida

de 59,5% (15 Gy), 71,5% (10 Gy) e 94% (5 Gy).

Não foram observadas diferenças significativas nas taxas de sobrevivência de estacas

enraizadas e não enraizadas (protegidas ou não protegidas), quando comparados com as do controle

(estacas não irradiadas) quando foram utilizadas as doses de 7,5 e 15 Gy de raios gama (Tabela 1).

Também foi possível observar que a proteção das bases quase sempre resultou na elevação das taxas

de sobrevivência de plantas após a irradiação, em comparação com as estacas não protegidas,

principalmente nas doses iguais ou acima de 22,5 Gy de mutagênico, seja em estacas enraizadas ou

não enraizadas. Isto provavelmente ocorreu devido à proteção com cilindros de chumbo, o que

possivelmente impediu a ação do mutagênico causando danos nas bases das estacas (onde se

originaram posteriormente as raízes das estacas não enraizadas) e nas raízes já existentes (em estacas

enraizadas).

Isso ficou mais evidente para as doses maiores de radiação, a partir da dose de 30 Gy, em que

houve a observação de diferenças estatísticas entre as estacas com e sem proteção, fortalecendo a

hipótese de danos fisiológicos causados pelo uso de altas doses de radiação associado a não proteção

das bases das estacas (Tabela 1).

39

À exceção da dosagem de 52,5 Gy de raios gama, as demais dosagens de mutagênico resultaram

em maiores efeitos, isto é, reduções maiores nas taxas de sobrevivência de estacas quando se utilizou

estacas não enraizadas, em comparação com estacas enraizadas (Tabela 1).

Tabela 2. Taxas de sobrevivência (em %) de estacas enraizadas e não enraizadas de Mandevilla após uso de diferentes doses de raios gama, com e sem proteção da base.

Estacas enraizada (%) Estacas não enraizadas (%) Tratamentos (Gy) Proteção Proteção Com sem Com sem Dose 0,0 95,7 aA 93,8 aA 68,1 abA 71,8 aA Dose 7,5 100,0 aA 95,7 aA 72,8 abA 72,9 aA Dose 15 100,0 aA 87,1 aA 84,4 aA 71,5 aA Dose 22,5 100,0 aA 73,8 bB 69,2 abB 56,9 aB Dose 30 64,8 bB 52,0 cB 77,0 aA 30,0 bB Dose 37,5 51,1 bA 16,1 dB 51,3 bcA 10,0 bB Dose 45 37,2 cA 10,0 dB 34,5 cA 10,0 bB Dose 52,5 10,0 dB 10,0 dB 37,16 cA 10,0 bB CV 25,94 18,29 F Irradiação 80,59 ** 40,89 ** F Proteção 28,47 ** 62,33 ** F Int. I x P 2,69 * 6,35 **

Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas colunas não diferem estatisticamente entre si pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas nas linhas não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade ** significativo ao nível de 1% de probabilidade de erro (p < 0.01) * significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro (p < 0,05).

Para a escolha da dose de mutagênico mais adequada para uso no experimento seguinte, além

da decisão sobre a pertinência ou não do uso de proteção das bases das estacas com chumbo, foram

realizadas análises de regressão linear dos dados com observação das doses relativas a DL30 e DL50

(dose letal de 30 e 50% das plantas, respectivamente), com proteção ou não das bases das mudas

(Figura 6).

As análises de regressão linear dos dados obtidos com o uso de mudas não enraizadas e com

proteção da base resultaram na equação linear ajustada y = -1,213x + 91,852, onde y é o valor da taxa

de sobrevivência ajustada e x é o valor da dosagem de mutagênico usado (Figura 6). Utilizando-se

esta equação é possível calcular DL30 e DL50 teórico com valores de DL 30 = 24,7 Gy e DL50=

41,2 Gy de raios gama. Para estacas não enraizadas e sem proteção, DL30 calculado utilizando-se a

equação de regressão linear definida y = -1,905x + 87,222, onde y é o valor da taxa de sobrevivência

ajustada e x é o valor da dosagem de mutagênico usado foi de 15,8 Gy, assim como o valor calculado

para DL50 foi 26,3 Gy (Figura 6). O mesmo tipo de cálculo foi realizado para estacas enraizadas e

sem proteção, com DL30 e DL50 ajustados resultando nas doses de 12,8 Gy e 21,4 Gy de raios gama,

40

respectivamente. Enquanto que na irradiação de estacas enraizadas e com bases protegidas, DL30

calculado foi de 14,7 Gy e DL50, foi de 24,5 Gy.

No presente estudo os valores de DL30 e DL50 obtidos quando se utilizou proteção da base

das estacas, apresentaram, tanto para estacas enraizadas como para não enraizadas, maiores valores

(indicando menores radiosensibilidades das estacas) de aplicação de raios gama, em comparação a

não proteção das bases das estacas. Isto indica a importância da proteção da base das estacas no

momento da irradiação como forma de aumentar a sobrevivência e evitar efeitos indesejáveis da

utilização da radiação gama.

O uso de estacas não enraizadas, tanto para estacas protegidas ou não protegidas nas bases,

resultou em menores danos fisiológicos e, consequentemente, em menores letalidades após a

irradiação. Isto significa que, teoricamente, doses mais elevadas de raios gama podem ser aplicadas

em estacas não enraizadas, obtendo-se a mesma letalidade. Diante deste fato, em associação com o

fato de que o uso de doses ligeiramente mais elevadas de mutagênico provavelmente poderão

proporcionar percentagens mais elevadas de obtenção de mutantes ou mutantes com setores mutados

maiores (quimeras). Com base nestas considerações conclui-se que a irradiação de estacas não-

enraizadas com suas bases protegidas por cilindros de chumbo deveria ser usada no experimento

seguinte de irradiação de grande número de estacas, em busca de mutantes de Mandevilla com valor

comercial.

41

Figura 6. Sobrevivência de estacas enraizadas e não-enraizadas de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson” com uso de diversas doses de mutagênico. Estacas enraizadas e não enraizadas, com proteção e sem proteção das bases das estacas.

y = -2,3333x + 112,5R² = 0,9059

-20,0

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0 7,5 15 22,5 30 37,5 45 52,5

% d

e S

obre

vivê

nci

a

Doses de raio Gama

Estacas enraizadas não protegidas

y = -2,037x + 119,72

R² = 0,8638

-20,0

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0 7,5 15 22,5 30 37,5 45 52,5

% d

e S

obre

vivê

ncia

Doses de raio Gama

Estacas enraizadas protegidas

y = -1,9048x + 87,222

R² = 0,8795

-20,0

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0 7,5 15 22,5 30 37,5 45 52,5

% d

e S

obre

vivê

ncia

Doses de raio Gama

Estacas não enraizadas e não protegidas

y = -1,2134x + 91,852

R² = 0,6323

-20,0

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0 7,5 15 22,5 30 37,5 45 52,5

% d

e S

obr

e vi

vên

cia

Doses de raio Gama

Estacas não enraizadas e protegidas

42

Outros autores utilizaram parâmetros distintos para selecionar doses mais apropriadas

de mutagênico para uso em programas de melhoramento de plantas de propagação vegetativa.

Boersen et al. (2007), por exemplo, utilizaram a redução da altura das plantas (GR) para a

seleção de doses ótimas de mutagênico após testar doses crescentes de radiação em mudas

enraizadas de crisântemo e correlacionaram estes resultados com as frequências de mutantes

obtidos após os tratamentos mutagênicos. Os resultados obtidos demonstraram que as maiores

frequências totais de mutações foram obtidas com o uso de doses intermediárias (entre 10 e 15

Gy) mas com maior porcentagem de plantas apresentando quimeras setoriais, que são instáveis.

Em contrapartida, o uso de doses maiores (20 e 25 Gy) resultou na observação de maiores

frequências de mutantes periclinais, estáveis, que possuem maior interesse.

4.1.2 Irradiação de estacas com dose selecionada e seleção de mutantes durante o

florescimento

Foram irradiadas 1.000 estacas não enraizadas de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson”

com a dose de mutagênico: 24,7 Gy mais 1.000 estacas não enraizadas da mesma cultivar com

a dose 41,2 Gy de raios gama e, após quatro semanas de enraizamento em substrato, as mudas

foram transplantadas e cultivadas em estufa climatizada.

Durante a seleção de mutantes na época de florescimento não foram encontrados mutantes

nas plantas do controle (Figura 7A) e nem nas plantas irradiadas com dose mais baixa (DL30 =

24,7 Gy). Nas plantas obtidas após a irradiação com dose mais elevada (DL50 = 41,20 Gy),

foram selecionados apenas um mutante anão (Figura 7D) e um mutante de cor da flor (com

pétalas com cor variegada, vermelha e branca) (Figura 7C).

Segundo Konzak e Mikaelsen (1977) a recomendação, observada em estudos anteriores

de mutação induzida, seria para a utilização de mais de uma dose de mutagênico na irradiação

de plantas, em busca de mutantes. Esta estratégia foi utilizada no presente estudo e resultou em

aumento das chances de sucesso, pois possibilitou a obtenção de dois mutantes, apenas nas

plantas irradiadas com a dose mais elevada (41,2 Gy) de raios gama.

43

Figura 7. (A) Flor da cultivar comercial de Mandevilla cv. “Pretty Crimson”; (B) Efeito deletério e transitório nas folhas de plantas M1V1 após a irradiação; (C) Mutante com alteração na cor de pétalas; (D) flores do mutante anão (M1) e do controle (Co).

Segmentos nodais destes mutantes foram extraídos para proceder à multiplicação

vegetativa e obter novos indivíduos. Os clones mutantes foram multiplicados vegetativamente

até a obtenção de 200 indivíduos de cada e colocados em estufa climatizada. Foram observados

no final do ciclo de produção a homogeneidade e estabilidade das plantas clonadas dos

mutantes. O mutante anão apresentou plantas com características distintas daquelas da cultivar

comercial, sendo homogêneas e estáveis. Já o mutante para cor das pétalas se mostrou diferente

da cultivar comercial, mas com plantas demonstrando possuir mutação com pouca estabilidade

e homogeneidade, isto é, as plantas clonadas não apresentaram a mesma distribuição de cores

em suas pétalas, com indicação de quimerismo instável.

Van Harten (1998) recomendou que, em estudos de indução de mutações em plantas,

devem ser utilizadas populações com grande número de indivíduos tratados com mutagênico,

a fim de aumentar as chances de obter mutantes desejados.

Um estudo prévio de indução de mutações em crisântemo resultou na liberação de nova

cultivar mutante após irradiação de uma população de 7.764 plantas. Foram selecionados 5,9%

de mutantes com diferentes cores das sépalas. A partir desta seleção, apenas dois mutantes

tiveram interesse comercial (Tulmann Neto e Latado, 1997). A seleção de maior número de

mutantes com o mesmo fenótipo também pode ser considerado como positivo pois, por não se

saber se as alterações genotípicas foram idênticas, existe a possibilidade de se selecionar mais

44

de um mutante com mesmo fenótipo e, nos testes posteriores de estabilidade e homogeneidade,

aumentam se as chances de sucesso na seleção de algum mutante com valor comercial.

Embora tenha sido utilizado um pequeno número de estacas, o presente trabalho permitiu

verificar alguns pontos relacionados ao uso de mutações baseadas em radiação gama e a

obtenção de dois mutantes. A escolha prévia de doses adequadas de mutagênico não resultou

em grande quantidade de mutações de interesse. Desta forma seria interessante o uso de

quantidades maiores de estacas a serem tratadas com mutagênico visando a obtenção de maior

número de mutantes e/ou com a seleção de outros tipos de mutantes.

Os mutantes obtidos estão sendo mantidos e continuarão a ser avaliados para determinar

se possuem ou não potencial comercial.

4.2 Indução de plantas autotetraploides.

4.2.1 Indução de plantas autotetraploides de M. bahiensis por meio de tratamento in vitro

Após o cultivo temporário (durante 8, 16 ou 24 h.) dos explantes em meios de cultura

contendo concentrações distintas de colchicina (0,025% e 0,05%), além do controle (meio sem

adição de colchicina), não foram observados incrementos nas taxas de mortalidade de explantes

em função do uso de concentrações crescentes de colchicina e do aumento do tempo de

exposição à colchicina (Tabela 3). Este fato não é comum e dá uma indicação de que as

concentrações de colchicina testadas não apresentaram fitotoxidez nas plantas in vitro de

Mandevilla.

As maiores taxas absolutas de mortalidade foram observadas no tratamento de 24 horas

para a dosagem de 0,025% e 0,05%, com 9,3 % e 8,0% de explantes mortos, respectivamente.

Resultados semelhantes foram obtidos por Cavalcanti (2012), com a indução de poliploides de

Heliconia bihai após a aplicação de colchicina nas seguintes doses: 0%, 0,5%, 0,1% e 0,2%,

por 24 e 48 horas.

Os resultados obtidos também demonstraram que, mesmo nos tratamentos do controle (8,

16 e 24 h.), as taxas de sobrevivência não alcançaram 100%. Isto ocorreu possivelmente devido

à imersão e agitação dos explantes durante diferentes períodos em meio de cultura, o que pode

ter ocasionado danos devido à anoxia (Tabela 3).

Após a realização de cultivos sucessivos em meio de indução de brotação foram

selecionados 60 indivíduos ao acaso, de cada tratamento, que foram submetidas as fases de

aclimatização e rustificação às condições ambientais de estufa. O primeiro passo foi a

transferência das plantas in vitro, com ou sem raízes, para câmara de aclimatização. Após quatro

45

semanas, as plantas já bem enraizadas foram transplantadas para vaso de 1,5 L de volume,

contendo substrato comercial (casca de Pinus) para proceder à rustificação em estufa

climatizada.

Tabela 3. Taxa de mortalidade, após cultivo temporário de explantes de M. bahiensis em meio de cultura contendo diferentes concentrações de colchicina.

Tratamento Horas Taxa de

mortalidade (%)

CONTROLE 8 1,3 a

0,025% 8 5,3 a 0,05% 8 4,0 a

CONTROLE 16 2,7 a

0,025% 16 6,7 a 0,05% 16 2,7 a

CONTROLE 24 6,7 a

0,025% 24 9,3 a 0,05% 24 8,0 a

CV% 28,31

As médias seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

A tabela 4 apresenta os dados do total de plantas enviadas para rustificação e do número

de plantas sobreviventes de cada tratamento durante esta etapa experimental. Observou-se uma

diminuição de plantas aclimatizadas com sucesso, em função do aumento da dose de colchicina,

independente do tempo de exposição. Nos tratamentos com concentração de 0,05% de

colchicina, a mortalidade ficou acima dos 30% nos três tempos de exposição (8, 16 e 24 horas).

Como o período, desde o tratamento com colchicina até a aclimatização das plantas, pode

ser considerado como longo (12 semanas), estes resultados não podem ser associados com uma

possível maior fitotoxidez da colchicina nas doses mais elevadas. Seria mais crível supor que o

uso de doses mais elevadas de colchicina resultou na obtenção de maior número de plantas

poliploides e, estas plantas (poliploides) apresentaram menor vigor e maior dificuldade de

enraizamento, o que resultou em maior mortalidade de plantas in vitro no momento de

aclimatização e rustificação.

46

De fato, também foi possível observar o desenvolvimento inicial (enraizamento) mais

lento das plantas tratadas com colchicina quando comparadas aos das plantas controle. Na

literatura, a mortalidade e o desenvolvimento mais lento em outros materiais vegetais

submetidos à poliploidização estão relacionados possivelmente aos efeitos fisiológicos e

fitotoxidez da colchicina (Tang et al., 2010), assim como observa-se menor taxa de crescimento

nas plantas poliploides.

Tabela 4. Taxa de sobrevivência, após cultivo temporário em meio de cultura contendo diferentes concentrações de colchicina. Plantas mantidas em substrato de Pinus, em vasos de 1,5 L e em estufa climatizada.

Tratamento Horas Taxa de

sobrevivência (%)

CONTROLE 8 71.7 a

0,025% 8 50,0 ab

0,05% 8 40,0 b

CONTROLE 16 70,0 a

0,025% 16 61,7 a

0,05% 16 15,0 b

CONTROLE 24 75,0 a

0,025% 24 56,7 ab

0,05% 24 38,3 b

CV% 24,96 As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

Por outro lado, uma associação diretamente proporcional entre a taxa de mortalidade de

plantas, com a concentração e com o tempo de exposição ao agente antimitótico já foi relatado

em vários trabalhos de indução de poliploidia in vitro, em diversas culturas, tais como

Asparagus afficinalis (Carmona-Martín et al., 2015), Paulownnia tomentosa (Tang et al., 2010),

Thymus persicus (Tavan et al., 2015), o que é coerente com a ação tóxica da colchicina.

Após as etapas de aclimatização e rustificação foram determinadas as ploidias das plantas

sobreviventes utilizando-se o método de citometria de fluxo, o que possibilitou a classificação

das plantas tratadas em diploides, mixoploides e tetraploides.

47

Como não há relatos na literatura de trabalhos envolvendo análises de citometria de fluxo

para esta espécie, foi necessário primeiramente ajustar o método determinação de ploidia por

citometria de fluxo. Este método ajustado se mostrou adequado para a determinação de ploidia

em plantas da espécie, com a obtenção de resultados na forma de histogramas com capacidade

de diferenciar plantas com ploidias distintas, além de elevada repetibilidade (Figura 8).

Figura 8. Histogramas obtidos por meio da técnica de citometria de fluxo representando a ploidia de plantas diploide (A); mixoploide (B) e tetraploide (C) de M. bahiensis.

O sucesso da poliploidização se encontra no limite entre a toxicidade do agente

poliploidizante e a sua eficácia da duplicação cromossômica (Dhooghe et al., 2011). A

aplicação de baixas doses de colchicina e/ou por períodos curtos de exposição aumentam a taxa

de sobrevivência dos propágulos, mas, por outro lado, podem resultar na diminuição da

porcentagem de plantas poliploidizadas. Já o aumento das doses de colchicina e/ou o aumento

do tempo de exposição, pode resultar em aumento da taxa de mortalidade e da frequência de

indução de plantas poliploides, mas, também, pode ocasionar a formação de células com níveis

de ploidia maiores que as desejadas (octaploides, por exemplo) (Dhooghe et al., 2011).

Atualmente não existe na literatura um consenso para a definição do tratamento mais

adequado para a indução de poliploides, ocorrendo divergências na realização do cálculo da

eficiência dos tratamentos. Segundo Dhooghe et al. (2011) a eficiência na indução de

poliploides consiste na relação entre o número de plantas poliploidizadas e o número de mudas

tratadas. No presente estudo calculou-se a eficiência de poliploidização calculando-se a razão

entre o número de plantas poliploidizadas (considerando-se a soma de tetraploides e

mixoploides) e o número de plantas avaliadas (Tabela 5).

48

Tabela 5. Determinação da ploidia em plantas de M. bahiensis rustificadas, provenientes de explantes previamente submetidos à cultivo temporário em meio de cultura contendo diferentes concentrações de colchicina e diferentes tempos de exposição.

¹ Eficiência = Número de plantas poliploidizadas (tetraploide + mixoploide)/Número de plantas avaliadas x 100

Assim sendo, ao considerarmos os números de plantas poliploidizadas (soma de

mixoploides e tetraploides) obtidos em relação ao total de plantas avaliadas, observamos que a

eficiência máxima de 27% ocorreu no tratamento de 0,025% de colchicina, em 16 horas de

exposição. Já a menor eficiência foi de 5% para o tratamento 0,05% por 16 horas de exposição.

Isso possivelmente foi resultado da alta taxa de mortalidade de plantas in vitro (85%),

representando uma desvantagem se comparado aos demais tratamentos (Tabela 5). De acordo

com Dhooghe et al. (2011), as taxas de eficiência dos tratamentos encontrados em diversos

trabalhos científicos variam entre 15 e 55%.

A eficiência de indução de poliploides pode variar de acordo com a espécie ou cultivar

utilizada. Segundo Silva (2014) a eficiência de indução de poliploidia in vitro é genótipo-

dependente. Outro fator que gera dúvidas no cálculo da eficiência dos tratamentos é a inclusão

ou não, do número de mixoploides obtidos (Dhooghe et al., 2011).

No presente trabalho o uso de colchicina foi efetivo na produção de plantas

autotetraploides de M. bahiensis, apresentando 12 indivíduos com esta ploidia, além de 54

plantas mixoploides (Tabela 5). A concentração de colchicina que induziu à maior porcentagem

de tetraploides foi a de 0,05%, após 24 horas de exposição ao alcaloide (17% de tetraploides),

assim como o tempo de exposição de 24 horas foi melhor para induzir tetraploides em todas as

dosagens. A dose de 0,05% foi sempre melhor para induzir tetraploides, a exceção de 16 horas.

diploide mixoploide tetraploide

CONTROLE 8 43 (100%) 0 0 00,025% 8 17 (57%) 12 (40%) 01 (3%) 220,05% 8 13 (54%) 09 (38%) 02(8%) 18

CONTROLE 16 42 (100%) 0 0 00,025% 16 21 (57%) 14 (38%) 02 (5%) 270,05% 16 06 (67%) 03 (33%) 0 (0%) 5

CONTROLE 24 45 (100%) 0 0 00,025% 24 23 (68%) 08 (24%) 03 (9%) 180,05% 24 11 (48%) 08 (35%) 04 (17%) 20

Eficiência¹ %

Ploidia explantesTratamento Horas

49

Mas, neste caso, o número de plantas tetraploides observadas foi menor (9 indivíduos), devido

à contaminação excessiva durante o cultivo in vitro.

4.2.2 Análises morfológicas e anatômicas de plantas autotetraploides de M. bahiensis

Seis diferentes plantas tetraploides foram identificadas e multiplicadas vegetativamente

em estufa climatizada para o experimento de caracterização morfológica em relação as

seguintes variáveis: folha (largura, comprimento, espessura, área foliar e a relação comprimento

e largura foliar), caule (internódio e espessura) e flor (comprimento corola, largura corola e

espessura pétala)

Com relação à morfologia externa observou-se diferenças significativas entre as plantas

diploides e as autotetraploides (Figura 9).

Figura 9. (A) Flor e folha de planta autotetraploide de Mandevilla bahiensis; (B) Flor e

folha de planta diploide de M. bahiensis. Quadriculado com 1cm².

As plantas autotetraploides obtidas por indução in vitro podem apresentar fenótipos

distintos. Isso pode se dar pois o processo de duplicação cromossômica in vitro é um processo

que causa distúrbios fisiológicos no momento da divisão celular, com o impedimento da

formação das fibras do fuso, induzindo as células (e plantas) a duplicarem o seu conjunto

A B

50

cromossômico. Entretanto, esse processo, por não ser totalmente controlável, podendo ser

excessivo ou parcial, o que pode resultar em alterações indesejáveis, como a obtenção de plantas

tetraploides aneuploides (devido à perda ou ganho de partes de um ou de mais de um

cromossomo), plantas tetraploides mixoploides (contendo setores quiméricos com ploidias

diferentes) e/ou plantas com ploidia mais elevada (octaploides e etc.), oriundas de um mesmo

tratamento mutagênico com o agente antimitótico. Assim, o fato de terem como origem o

mesmo explante, de uma mesma planta, não garante que os regenerantes sejam geneticamente

iguais ou, mesmo, fenotipicamente iguais (Leitch e Bennett, 2004).

Na Tabela 6 podemos observar que seis plantas autotetraploides apresentaram valores

diferentes para largura, comprimento, espessura e área foliar. Para largura folhar e espessura, o

tetraploide 1 foi o que apresentou os maiores valores 50,2 mm e 0,74 mm respectivamente. Para

o comprimento e área foliar, o tetraploide 5 apresentou os maiores valores 45,1 mm e 146,5

mm², respectivamente.

Tabela 6. Características morfológicas de folhas de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.

Tratamentos Largura

(mm) Comprimento

(mm) C/L Espessura

(mm) Área Foliar

(cm²) Controle 31,25 d 40,24 ab 1,29 a 0,38 d 55,47 d Tetraploide 1 50,25 a 39,60 abc 0,79 c 0,74 a 94,10 bc Tetraploide 2 46,45 abc 38,55 bc 0,83 bc 0,47 c 114,43 b Tetraploide 3 48,12 ab 38,28 bc 0,79 c 0,58 b 110,26 bc Tetraploide 4 41,59 c 30,89 d 0,73 c 0,47 c 92,74 bc Tetraploide 5 48,34 ab 45,17 a 0,94 b 0,55 bc 146,57 a Tetraploide 6 43,93 bc 34,00 cd 0,77 c 0,48 c 86,52 c CV % 7,7 9,85 9 9,78 19.03 dms 5,64 6,21 0,13 0,084 25,9 Valor de p <.0001** <.0001** <.0001** <.0001** <0,0001**

Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey. * probabilidade de erro de 5%. ** probabilidade de erro de 1%. ns – Diferenças não significativas pelo teste estatístico. C/L: relação entre comprimento e largura.

Podemos observar também que a largura média das folhas dos autotetraploides foi maior

do que a média da largura foliar do controle (diploide), enquanto o comprimento médio das

folhas foi quase em sua totalidade menor nos autotetraploides. Para espessura da folha também

houve uma diferenciação, com as plantas autotetraploides apresentando folhas mais espessas.

Shao et al. (2003), trabalhando com indução de tetraploides in vitro usando colchicina em

romã (Punica granatum L.) também observaram alterações nos padrões morfológicos foliares

51

das plantas tetraploides tais como: a diminuição do tamanho da folha e a presença de folhas

mais escuras.

Sobre a morfologia das folhas das plantas tetraploides, Cameron e Frost (1968) e Moreira

(1980) relataram que, comparando-se plantas tetraploides com plantas diploides, as primeiras

geralmente apresentam folhas maiores em largura, do que em comprimento, mais espessas e

com tendência a uma coloração mais escura.

O resultado para a característica distância entre nós (DE), que é relacionada ao vigor das

plantas, não apresentou diferenças significativas entre as plantas controle e as tetraploides

(Tabela 7). Diferentemente do observado por Vichiato et al. (2007), em orquídea, e Dias et al.

(2016), em mudas de eucalipto, a aplicação de colchicina não causou diminuição do vigor das

plantas já estabelecidas. Já para o diâmetro do caule a 10 cm, o tetraploide 1 foi o que apresentou

o maior diâmetro (3,93 mm) e o tetraploide 4 apresentou o menor diâmetro (3,06 mm). Os

demais tetraploides não apresentaram diferenças significativas em relação às plantas do

controle (Tabela 7).

Tabela 7. Diâmetro do caule a 10 cm de altura (DC) e distância entre nós (DE) de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.

Tratamentos DC (mm) DE (cm) Controle 3,64 ab 4,17 Tetraploide 1 3,93 a 5,12 Tetraploide 2 3,64 ab 3,99 Tetraploide 3 3,60 ab 4,02 Tetraploide 4 3,06 b 3,98 Tetraploide 5 3,53 ab 4,4,9 Tetraploide 6 3,16 ab 3,94 CV % 14,75 19,34 dms 0,86 13,58 Valor de p 0,0454* 0,0977ns

Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey. * probabilidade de erro de 5%. ** probabilidade de erro de 1%. ns – Diferenças não significativas pelo teste estatístico

A caracterização das flores permitiu observar, nas plantas autotetraploides, o efeito

“giga”, onde os indivíduos poliploides apresentam órgãos maiores, no caso, flores maiores. No

presente estudo observamos um aumento de até 80% na largura da flor de alguns indivíduos

tetraploides. Os indivíduos tetraploides 1 e 2 apresentaram as maiores larguras de flor, ambas

com 60,6 mm (Tabela 8). Já para o comprimento da flor, o tetraploide 6 apresentou o maior

52

valor: 35,6 mm. Este valor é aproximadamente 21% maior que o da planta controle. Já para

espessura de pétalas, em alguns casos o aumento foi maior que 100% quando comparado à

planta controle. O tetraploide 1 apresentou a maior espessura de pétala (0,29 mm) enquanto o

controle apresentou flores com 0,14 mm de espessura de pétala (Tabela 8).

Tabela 8. Largura, comprimento e espessura das flores de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.

Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey. * probabilidade de erro de 5%. ** probabilidade de erro de 1%. ns – Diferenças não significativas pelo teste estatístico

As análises histológicas de secções transversais das folhas evidenciaram que havia

diferenças nas estruturas foliares de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias (Tabela 9,

Figuras 10 e 11). A espessura das epidermes adaxial (Ead) e abaxial (Eab) apresentaram-se

maiores (e semelhantes entre si) nas plantas tetraploides em comparação com as plantas

diploides (Tabela 9). As espessuras dos parênquimas paliçádico (PP) e lacunoso (PL) também

apresentaram diferenças entre os valores quando comparadas as plantas tetraploides e as do

controle. Dentro das plantas tetraploides, a de número 1 apresentou a maior espessura (111,14

µm). Novamente as plantas tetraploides apresentaram maior espessura do parênquima lacunoso,

quando comparadas ao da planta diploide (Figuras 10 e 11).

TratamentosLargura de flor

(mm)Comprimento de

flor (mm)Espessura de

flor (mm)

Controle 33,6 d 29,4 d 0,14 cTetraploide 1 60,6 a 30,5 cd 0,29 aTetraploide 2 60,6 a 31,7 bc 0,28 aTetraploide 3 58,3 ab 33,0 b 0,25 bTetraploide 4 56,0 b 32,5 b 0,28 aTetraploide 5 55,3 b 32,9 b 0,28 aTetraploide 6 47,1 c 35,6 a 0,25 b

CV % 3,41 2,8 4,1dms 2,99 1,49 0,017Valor de p <.0001** <.0001** <.0001**

53

Tabela 9. Características anatômicas das terceiras folhas completamente expandidas de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.

Tratamentos Ead (µm) Eab (µm) PP (µm) PL (µm) Controle 25,75 b 16,71 b 66,40 c 102,99 c Tetraploide 1 43,70 a 22,07 a 111,14 a 221,51 a Tetraploide 2 45,58 a 21,66 a 93,05 b 225,07 a Tetraploide 3 44,32 a 21,01 a 90,29 b 170,91 b CV % 15,44 31,17 13,97 23,9 Dms 31,88 3,29 66,34 22,31 Valor de p <.0001** <.0001** <.0001** <.0001**

Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey. ** significativo ao nível de 1% de probabilidade de erro (p < 0,01). * significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro (0,01 < p < 0,05). ns = não significativo. Ead – Espessura da epiderme adaxial; Eab – Espessura Epiderme abaxial; PP – Espessura Parênquima paliçádico; PL – Espessura Parênquima lacunoso.

Valores maiores para espessura de parênquimas paliçádico e lacunoso bem como,

espessura total das folhas (soma de mesofilos mais epidermes) foram encontrados em plantas

tetraploides de Phlox drummondii, quando comparadas com as diploides (Vyas et al., 2007).

Ye et al. (2010), ao duplicar os cromossomos de Lagerstroemia indica L., verificaram um

aumento de mais de 50% na espessura das folhas. Enquanto um genótipo diploide apresentava

folhas com espessura de 0,39 mm, plantas tetraploides do mesmo genótipo passaram a medir

0,96 mm de espessura.

Em Triticum observou-se que o volume das células do mesofilo de plantas poliploides

estava fortemente correlacionado com o tamanho do genoma (Jellings e Leech, 1984).

Na análise de anatomia foliar realizada no presente estudo foi possível observar as

diferentes estruturas da folha de M. bahiensis, com estômatos, câmara subestomática,

parênquima paliçádico e lacunoso e epidermes abaxial e adaxial (Figuras 10 e 11).

54

Figura 10. Secção transversal de um folíolo terminal de folha adulta de planta tetraploide de

Mandevilla PP – Parenquima Paliçádico; PL – Parenquima Lacunoso; * – Câmara Subestomática; EAd – Epiderme adaxial; EAb – Epiderme abaxial; Setas brancas indicam estômatos. Barra 100µm.

Figura 11. Secções transversais do limbo foliar de Mandevilla tetraploide (a) e diploides (b). Secção transversal da folha na região da nervura central de Mandevilla tetraploide (c) e diploide (d) Barra 100 µm.

55

4.2.3 Análises estomáticas e determinação de teores de clorofila de plantas

autotetraploides de M. bahiensis

Segundo Dhooghe et al. (2011) existe uma correlação muito forte entre características

estomáticas de folhas e o nível de ploidia de plantas, de modo que essas características podem

ser utilizadas para diferenciar plantas poliploides. Plantas tetraploides tendem a possuir

estômatos maiores, mas geralmente se apresentam com menor densidade estomática nas folhas

(Dhooghe et al., 2011). Estas diferenças no tamanho e no número de estômatos por área têm

sido características comuns apresentadas por diversos materiais vegetais submetidos à

poliploidização, sendo utilizadas como características base na identificação de indivíduos

poliploides em diversos estudos como em Vitis x Muscadinia (Xie et al., 2015) e Thymus

persicus (Tavan et al., 2015).

A análise de caracterização estomática das folhas evidenciou que houve diferenças no

tamanho dos estômatos entre as plantas tetraploides e a do controle (Figura 12 e Tabela 10). A

planta tetraploide apresentava folhas com estômatos com maiores diâmetros polar e equatorial,

o que resultou em estômatos com área acima do dobro do observados nas folhas de plantas

diploides (Tabela 10).

Figura 12. A) estômatos de M. bahiensis de planta diploide; B) estômatos de M. bahiensis de planta tetraploide. Barra = 0,03 mm.

56

Tabela 10. Caracterização de estômatos de secções paradérmicas da superfície abaxial da terceira folha a partir do ápice, com diâmetro polar dos estômatos (DPE), diâmetro equatorial dos estômatos (DEE) e área dos estômatos de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.

Tratamentos DPE (mm) DEE (mm) Área (mm²) Diploide 0,0346 b 0,0258 b 0,00062 b Tetraploide 0,0528 a 0,0326 a 0,00152 a CV % 7,987 13,637 18,587 Dms 0,0033 0,0037 0,0002 Valor de p <.0001** 0,0013* <.0001**

Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey. ** significativo ao nível de 1% de probabilidade de erro (p < 0,01). * significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro (0,01 < p < 0,05). ns = não significativo.

Outro indicador das transformações causadas pela duplicação cromossômica é o índice

de clorofilas Falker a e b (ICFa e ICFb). As clorofilas são grupos de pigmentos verdes

absorventes de luz, ativos na fotossíntese. A luz absorvida por carotenoides ou pela clorofila b

é rapidamente transferida para a clorofila a dando continuidade à cadeia de produção de energia

(Taiz e Zeiger, 2004). Portanto, os teores de clorofilas e as suas proporções equilibradas, são

fundamentais para que as plantas apresentem uma maior eficiência fotossintética.

Provavelmente, quanto maior o teor de clorofila total, maior será a eficiência de produção de

energia para a planta, desde que outros fatores que contribuem para realização da fotossíntese

também estejam em proporções adequadas.

Todos os indivíduos tetraploides apresentaram índice ICFa maiores que o controle, sendo

os tetraploides 1, 2 e 4 os que apresentaram os maiores índices, 43,3, 42,9 e 42,5

respectivamente. Já para o índice ICFb os valores foram, em alguns casos, duplicados em

relação ao do controle. Os tetraploides 1 e 6 apresentaram os maiores valores, ambos com 20,9

(Tabela 11).

Outra característica alterada nas plantas tetraploides de M. bahiensis foi a relação entre

clorofila a e b, que diminuiu nas seis plantas em aproximadamente 30%, quando comparadas

com as plantas diploides (Tabela 11). Romero-Aranda et al. (1997) também observaram valores

25% menores da relação de clorofila a/b nas plantas tetraploides de limão, apesar de verificarem

incremento na concentração total de clorofila nas mesmas plantas.

Para Warner e Edwards (1993), existe uma forte correlação entre tamanho do genoma e

o número de cloroplastos. De modo que, com o aumento da ploidia nas células, ocorre o

aumento de número de cloroplastos. Em milho, essa correlação foi confirmada por Ho e

Rayburn (1991). Em melancia o número de cloroplastos por par de células-guardas é uma

57

técnica usada para a diferenciação de plantas tetraploides e diploides. Enquanto plantas

diploides apresentam em média 11 cloroplastos por par de células, as plantas tetraploides

possuem aproximadamente 19 e, em triploides, a média é de 14. Em melão, as plantas diploides

têm, em média, oito cloroplastos por par de células-guarda, enquanto plantas tetraploides têm

18 (McCuiston e Elmstron,1993).

Assim como as plantas mutantes de Mandevilla da cultivar “Pretty Crimson”, as plantas

autotetraploides estão sendo mantidas em cultivo e continuarão a serem avaliadas para

determinar se possuem ou não potencial comercial e/ou para cruzamentos.

Tabela 11. ICF – Índices de Clorofila Falker a e b de plantas de Mandevilla com diferentes ploidias.

Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey. * probabilidade de erro de 5%. ** probabilidade de erro de 1%. ns – Diferenças não significativas pelo teste estatístico

Tratamentos ICF a ICF b ICFa/ICFb

Controle 34,9 c 9,9 c 3,6 aTetraploide 1 43,3 a 20,9 a 2,1 bTetraploide 2 42,9 a 18,8 ab 2,3 bTetraploide 3 42,1 ab 18,3 ab 2,3 bTetraploide 4 42,5 a 17,7 ab 2,4 bTetraploide 5 39,6 b 15,9 b 2,5 bTetraploide 6 41,8 ab 20,9 a 2,51b

CV % 4,87 14,78 14,33dms 2,722 3,409 0,498Valor de p <.0001** <.0001** <.0001**

58

5 CONCLUSÕES

1. Foi possível estabelecer com sucesso um método de mutagênese induzida com raios gama

em plantas de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson” com a seleção de dois mutantes.

2. Foi possível estabelecer com sucesso um método de indução de plantas autotetraploides em

plantas de Mandevilla bahiensis utilizando o método in vitro e identificação por meio de

citometria de fluxo, com a obtenção de várias plantas tetraploides.

3. As plantas autotetraploides de Mandevilla bahiensis apresentam efeito “giga” em relação às

plantas controle, com a presença de órgãos maiores: folhas mais largas, mais espessas, com

maior área foliar; flores maiores e com pétalas mais espessas; folhas com estômatos maiores,

maiores índices de clorofila Falker a e b (ICFa e ICFb), mas menores relações ICFa/ICFb.

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