Estudo da Camada de Plasma e m...

Bolsa de Integraç

Estudo da Camada de Plasma e

Bolsa de Integração na Investigação (BII)

CEFT/BII/2009/01

da Camada de Plasma e

Microcanais

Cátia Marisa Lourenço

Engenharia Biomédica

Porto, Dezembro

o (BII)

da Camada de Plasma em

Marisa Lourenço Fidalgo

Engenharia Biomédica

Dezembro 2010

Estudo da Camada de

Cátia Fidalgo


CEFT/BII/2009/01

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Com a colaboração de:

Estudo da Camada de Plasma em Microcanais


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Microcanais

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Orientado por: Rui Lima

Co-Orientado por: Ricardo Dias

Realizado por: Cátia Marisa Lourenço Fidalgo

2

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Estudo da Camada de Plasma em

______________________________________________________________________

Cátia Marisa Lourenço Fidalgo


Cátia Fidalgo 3

Agradecimentos

À Fundação para a Ciência e Tecnologia pela bolsa concedida no âmbito da

Bolsa de Integração na Investigação CEFT/BII/2009/01.

Ao orientador, Professor Drº Rui Lima, por todo o apoio, orientação e dedicação

que me deu na realização deste projecto, fico-lhe muito agradecida.

Ao Drº Ricardo Dias, pelo incentivo, simpatia e atenção ao longo do projecto.


Cátia Fidalgo 4

Resumo

Tem havido um interesse crescente, por parte da comunidade científica na área

da Engenharia Biomédica, na concepção de microdispositivos como ferramentas

alternativas no diagnóstico de doenças cardiovasculares e cancerígenas. É, portanto,

importante compreender o comportamento do escoamento sanguíneo neste tipo de

microdispositivos, de forma a optimizar a concepção e utilização de biochips para

análises clínicas. Assim, neste projecto pretendeu-se estudar as principais variáveis que

influenciam a formação da camada de plasma em microcanais circulares de vidro e

polidimetilsiloxano (PDMS).

Após a obtenção de vários vídeos por intermédio de um sistema de

microvisualização confocal, o presente estudo concentrou-se essencialmente na

utilização de um método de análise de imagem para a medição da espessura da camada

de plasma em microcanais de vidro borosilicato com diâmetros de aproximadamente

100µm. Assim, com o auxílio do Image J (NIH) e do plugin MtrackJ foi possível

investigar a influência do hematócrito (Hct) no comportamento da camada de plasma

neste tipo microcanais.

Os resultados sugerem que a espessura da camada de plasma livre de células

sanguíneas tende a aumentar com a diminuição do Hct e com o aumento do diâmetro do

microcanal.


Cátia Fidalgo 5

Abstract

In recent years, there has been a growing interest by the biomedical community

to develop biochips as an alternative tool to diagnose both cardiovascular and cancer

diseases. It is therefore important to understand the behavior of the blood flow and this

type of microdevices in order to optimize the design and the use of biochips for clinical

analysis. Thus, in this project it is aimed to study the main variables that influence the

formation of the plasma layer in circular microchannels of borosilicate glass and

polydimethylsiloxane (PDMS).

After obtaining several videos through a confocal microvisualization system,

this study focused primarily on the use of a method of image analysis for measuring the

thickness of the plasma layer in a microchannel of borosilicate glass with diameters of

about 100 µm. With the help of the Image J (NIH) and the plugin MtrackJ it was

possible to investigate the influence of the hematocrit (Hct) on the behavior of the

plasma layer in such kind of microchannels.

The results suggest that the thickness of the blood-cell-free layer tends to

increase with the decrease of the Hct and with the increase of the diameter of the

microchannel.


Cátia Fidalgo 6

Índice

Resumo ............................................................................................................................. 4

Abstract ............................................................................................................................. 5

Índice de Figuras .............................................................................................................. 8

Índice de Tabelas ............................................................................................................ 10

Nomenclatura.................................................................................................................. 11

1. Introdução ............................................................................................................ 12

2. O Sangue ............................................................................................................. 14

2.1. Constituição do Sangue ................................................................................... 14

2.1.1. Glóbulos Vermelhos ................................................................................. 14

2.1.2. Glóbulos Brancos ..................................................................................... 16

2.1.3. Plaquetas sanguíneas ................................................................................ 17

2.1.4. Plasma Sanguíneo ..................................................................................... 17

2.2. Comportamento dos Fluidos ............................................................................ 19

2.3. Viscosidade Sanguínea .................................................................................... 20

2.4. Escoamento Sanguíneo .................................................................................... 22

2.5. Velocidade do Sangue ..................................................................................... 24

3. Microcanais e Fluidos Fisiológicos ..................................................................... 25

3.1. Capilares de Vidro Borosilicato ....................................................................... 25

3.2. Dextran 40 (Dx40) ........................................................................................... 26

3.3. Etilenodiamino tetra-acético (EDTA) .............................................................. 26

3.4. Soro Fisiológico ............................................................................................... 27

4. Software para o Estudo da Camada de Plasma.................................................... 28

4.1. Phantom ........................................................................................................... 28

4.2. Image J ............................................................................................................. 28

4.2.1. “Z-Project”................................................................................................ 29

4.2.2. “MTrackJ” ................................................................................................ 30

4.2.3. “Brightness/Contrast” ............................................................................... 31

4.2.4. “Find Edges” ............................................................................................ 32

4.2.5. “Binary” .................................................................................................... 33


Cátia Fidalgo 7

5. Procedimento Experimental ................................................................................ 34

5.1. Materiais e Métodos ......................................................................................... 34

5.1.1. Microcanais e Fluidos Utilizados ............................................................. 34

5.2. Aquisição de Imagens ...................................................................................... 35

5.3. Image J ............................................................................................................. 36

5.3.1. “Z-Project”................................................................................................ 37

5.3.2. “MTrackJ” ................................................................................................ 38

5.4. Processamento em Excel ................................................................................. 41

6. Resultados Experimentais ................................................................................... 42

6.1. Análise e processamento de imagem ............................................................... 43

6.2. Resultados da Espessura da Camada de Plasma .............................................. 49

7. Análise e Discussão dos Resultados .................................................................... 56

8. Conclusões e Trabalho Futuro ............................................................................. 61

8.1. Conclusões ....................................................................................................... 61

8.2. Trabalho Futuro ............................................................................................... 62

9. Referências Bibliográficas ................................................................................... 63

Anexos ............................................................................................................................ 66


Cátia Fidalgo 8

Índice de Figuras

Figura 2.1 Capilar sanguíneo ……………………………………………...………….14

Figura 2.2 Estrutura dos glóbulos vermelhos ……………………………...…………15

Figura 2.3 Técnica de obtenção do hematócrito ……………………………...……....16

Figura 2.4 Representação dos tipos de leucócitos ……………………………...…….17

Figura 2.5 Ilustração do plasma numa amostra sanguínea ………………………...…18

Figura 2.6 Variação da tensão de corte em relação ao gradiente de velocidade

………………………………………………………………………………..………...20

Figura 2.7 Variação da viscosidade com o hematócrito ……………………………...20

Figura 2.8 Efeito da viscosidade do sangue in vitro através de capilares de vidro ......21

Figura 2.9 Escoamento laminar e turbulento num tubo de vidro ……………………..23

Figura 3.1 Modelo do microcanal de vidro …………………………………….……..25

Figura 4.1 Esquematização do procedimento para o comando “Z-Project” ………….29

Figura 4.2 Imagem de um microcanal com 15% Hct ……………………………...…30

Figura4.3 (a) Imagem aplicando a intensidade máxima (15% Hct); (b) Imagem

aplicando a intensidade mínima (15% Hct) ……...…………………………………....30

Figura 4.4 Esquematização do “MTrackJ” ……………………….…………...…..….31

Figura 4.5 Esquematização do “Brightness/Contrast” ……………….…….……...….31

Figura 4.6 (a) Imagem original com 24% Hct; (b) Imagem aplicando o

“Brightness/Contrast” ………………………………………………………………....32

Figura 4.7 (a) Imagem depois de aplicada a intensidade máxima com 9% Hct; (b)

Imagem aplicando o “Find Edges” ……..……………………………………………..32

Figura 4.8 Esquematização do “Binary” ……………………………………………...33

Figura 5.1 Representação da preparação das amostras de sangue …………...……….35

Figura 5.2 Esquematização de todos os elementos usados na aquisição de imagem ...36

Figura 5.3 Procedimento para a análise de imagem: (a) Imagem original; (b) Imagem

resultante da intensidade máxima do “Z-Project”; (c) Imagem resultante da aplicação

do “Find Edges” e (d) Imagem com a análise do MTrack J. ………………………….38

Figura 5.4 Representação de uma análise por trajectória de um GV (neste caso na PB),

com 35% Hct …………...…………………………………………………………...…39

Figura 5.5 Imagem de 15% Hct com os pontos da análise ……...………………...….40


Cátia Fidalgo 9

Figura 6.1 Imagem melhorada com 35% de hematócrito …………………………….42

Figura 6.2 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”) ...……43

Figura 6.3 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………….43

Figura 6.4 Imagem resultante do método das trajectórias dos GVs (“Tracking”) …....44


Figura 6.6 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”) ..…….45


Figura 6.8 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”) ...……46


Figura 6.10 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………...47

Figura 6.11 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”) .……47



Figura 6.14 Representação gráfica da variação da ECP para 35% hematócrito ……...50

Figura 6.15 Representação gráfica da variação da ECP para 24% hematócrito …...…51

Figura 6.16 Representação gráfica da variação da ECP para 15% hematócrito ...……52

Figura 6.17 Representação gráfica da variação da ECP para 9% hematócrito …...…..53

Figura 6.18 Representação gráfica da variação da ECP para 2% hematócrito .……....54

Figura 7.1 Representação gráfica da variação da ECP para todos os hematócritos para

microcanais de vidro ………………………………………………………………......57

Figura 7.2 Representação gráfica da variação da ECP para todos os hematócritos para

microcanais de diâmetro 100µm (35%, 24%, 15% e 2%), 92µm (9%) e 75µm para o

caso dos microcanais em PDMS……………………………………………………….59

Figura 7.3 Representação gráfica da espessura da camada de plasma em função do

diâmetro do microvaso in vivo, adaptado de [31] ………………………………………60


Cátia Fidalgo 10

Índice de Tabelas

Tabela 6.1 Resultados da média da ECP para 35% Hct ……………………………...50



Tabela 6.4 Resultados da média da ECP para 9% Hct ……………………………….53

Tabela 6.5 Resultados da média da ECP para 2% Hct ……………………………….54

Tabela 7.1 Resultados da ECP em microcanais de PDMS …………………………...56


Cátia Fidalgo 11

Nomenclatura

GV- Glóbulo vermelho;

Hct – Hematócrito;

ECP – Espessura da Camada de Plasma;

PC – Parede de Cima;

PB – Parede de Baixo;

PDMS – Polidimetilsiloxano;

Dx40 – Dextran 40;

EDTA - Etilenodiamino tetra-acético;


Cátia Fidalgo 12

1. Introdução

Diversos estudos têm demonstrado a importância de estudar o escoamento

sanguíneo na microcirculação. Isto porque existem inúmeras doenças que afectam tanto

os vasos sanguíneos de pequeno calibre como o próprio sangue. Assim, torna-se muito

importante melhorar os nossos conhecimentos por forma a encontrar soluções para estes

problemas. Para tal, já se efectuaram estudos sobre os efeitos de várias doenças nas

propriedades do sangue na microcirculação, que podem afectar a viscosidade do plasma,

a concentração de glóbulos vermelhos (GVs), propriedades mecânicas dos eritrócitos,

viscosidade da membrana, entre outras.

Recentemente, tem havido também interesse por parte da comunidade científica na

área da Engenharia Biomédica, na concepção de microdispositivos como ferramentas

alternativas de análises clínicas. Assim, torna-se imperativo estudar o comportamento

do escoamento sanguíneo em microcanais in vitro, tais como microcanais de vidro em

borosilicato e PDMS, de forma a optimizar a concepção e utilização deste tipo de

microdispositivos em aplicações biomédicas.

O principal objectivo deste projecto consiste na determinação da espessura da

camada de plasma (ECP) em microcanais de vidro borosilicato para diferentes

hematócritos (Hcts). Os microcanais têm diâmetro de 100µm ±2 excepto o caso de 9%

hematócrito em que o microcanal tem apenas 92µm.

O escoamento sanguíneo tem vindo a ser estudado em microcanais de vidro ao

longo dos anos, devido às semelhanças com o escoamento in vivo, apresentando

fenómenos hemodinâmicos como por exemplo o efeito de Fahraeus-Lindqvist. Este

efeito está muito relacionado com o diâmetro do microcanal em análise, tendo grande

importância quando é realizado um estudo como a determinação da ECP em

microcanais de vidro.

Através de um sistema de microvisualização, Micro-PTV Confocal, foi possível,

numa primeira fase, obter as imagens do escoamento sanguíneo com diferentes

hematócritos. Estas imagens foram posteriormente analisadas usando o programa de


Cátia Fidalgo 13

análise de imagem Image J, com o qual foi possível determinar a ECP, sendo este o

principal objectivo deste trabalho.


Cátia Fidalgo 14

2. O Sangue

2.1. Constituição do Sangue

O sangue é uma substância líquida que circula nas artérias e veias do organismo.

Pode ser descrito como um fluido opaco, com viscosidade superior à água e heterogéneo

sendo constituído por um líquido claro – plasma – e uma série de componentes

elementares.

Num adulto saudável com cerca de 70Kg de peso, o volume de sangue corresponde

a aproximadamente 7% do peso do corpo, a que correspondem cerca de 5 litros, dos

quais quase 60% é plasma.

Na Figura seguinte (2.1), é possível observar um vaso sanguíneo em corte, onde se

podem visualizar vários elementos (glóbulos vermelhos e brancos e plaquetas)

suspensos no plasma sanguíneo [10].

Figura 2.1 Capilar sanguíneo. [11]

2.1.1. Glóbulos Vermelhos

Os glóbulos vermelhos são unidades morfológicas da parte vermelha do sangue,

também são conhecidos por eritrócitos ou hemácias. São cerca de 700 vezes mais

numerosos que os leucócitos (glóbulos brancos) e 17 vezes mais que as plaquetas. Em

condições normais existem no sangue aproximadamente 4.5 a 6.5x106/mm3, variando


Cátia Fidalgo 15

do sexo masculino (5.2 milhões de eritrócitos/mm3) para o sexo feminino (4.5 milhões

de eritrócitos/mm3).

São constituídos basicamente por globulina e hemoglobina, esta última

composta por 4 moléculas proteicas de estrutura terciária e 4 grupos heme que contêm

ferro. A sua principal função é transportar o oxigénio (maior quantidade) e o dióxido de

carbono (menor quantidade) para os tecidos; têm um período de vida de

aproximadamente 120 dias [1], [12].

Figura 2.2 Estrutura dos glóbulos vermelhos. [13]

Os eritrócitos não se movem activamente, são movidos através da circulação

pelas forças responsáveis pela circulação sanguínea. Apresentam a forma de disco

bicôncavo, com cerca de 7.5 µm (micrómetros) de diâmetro com as extremidades mais

espessas que o centro da célula (Figura 2.2). De modo a tornar mais fácil o seu

movimento pelos pequenos vasos sanguíneos, os eritrócitos dobram-se pelo centro.

2.1.1.1. Hematócrito (Htc)

O hematócrito é a percentagem ocupada pelos glóbulos vermelhos no volume

total de sangue. Antigamente era usado o método do microhematócrito onde a

percentagem de eritrócitos era obtida pela centrifugação a 10000 r.p.m. durante 5

minutos do sangue dentro de um tubo capilar.

Actualmente é obtido recorrendo a aparelhos automatizados. Esta metodologia

automatizada não mede directamente o hematócrito, mede o volume dos eritrócitos ou o

tamanho médio dos eritrócitos (VCM) e quantifica o número de eritrócitos no sangue

(Figura 2.3), sendo calculado da seguinte forma:


Cátia Fidalgo 16

�� ú�� á��

10

Os valores médios diferem segundo o sexo e a idade, podendo variar 36%-52%,

sendo nos homens 42%-52% e nas mulheres 36%-48%. Esta é uma medida cada vez

mais importante para efeitos clínicos. Caso o valor seja inferior à média significa que

existe pouca quantidade de eritrócitos, o que pode levar a hemorragias, anemias e

leucemias. Caso o valor seja superior à média existem muitos eritrócitos em relação ao

volume de sangue, podendo ocorrer doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) [14].

Figura 2.3 Técnica de obtenção do hematócrito. [15]

2.1.2. Glóbulos Brancos

Os glóbulos brancos ou leucócitos são células produzidas na medula óssea, que

estão presentes no sangue, linfa, órgãos linfóides e vários tecidos conjuntivos. Têm a

função de combater os microrganismos que causam doenças fazendo a sua captura ou

usando anticorpos. Existem três tipos de leucócitos: os granulados (50 a 60%), os

agranulados ou linfáticos (30 a 40%) e os monócitos (até 7%) (Figura 2.4).

Os leucócitos são capazes de realizar a diapdese (migrar para fora dos vasos

capilares) e também a fagocitose que é a captura de organismos estranhos por projecção

das suas extremidades (pseudópodes).

Um adulto normal possui entre 3.800 e 9.800 mil leucócitos/mm3 de sangue e

pode produzir aproximadamente 100 milhões de leucócitos por dia. Uma quantidade

muito pequena de leucócitos (leucopenia) ou muito grande de leucócitos (leucocitose)


Cátia Fidalgo 17

indica um distúrbio. No caso da leucopenia, o indivíduo fica susceptível a infecções, no

caso da leucocitose pode ser uma resposta a infecções ou a substâncias estranhas [16].

Figura 2.4 Representação dos tipos de leucócitos. [17]

2.1.3. Plaquetas sanguíneas

A plaqueta sanguínea ou trombócito é um fragmento de célula presente no

sangue que é formado na medula óssea. A sua principal função é a formação de

coágulos, tendo um papel muito importante na coagulação sanguínea. As plaquetas

estão em circulação no sangue durante cerca de 5 dias sendo depois destruídas no baço.

Um indivíduo normal tem entre 150.000 e 400.000 plaquetas/mm3 de sangue. A

sua diminuição (trombocitopenia) ou disfunção pode levar a sangramentos e o seu

aumento (trombocitose) eleva o risco de trombose [18].

2.1.4. Plasma Sanguíneo

Todos os fluidos fora do compartimento celular constituem o fluído extracelular,

do qual 1 4� ou cerca de 3 litros (considerando um adulto com cerca de 70Kg) está no

interior de vasos sanguíneos constituindo o plasma, a porção líquida ou não celular do

sangue.

O plasma é um líquido (92% água) amarelado e claro no qual as células

sanguíneas estão suspensas; é o maior componente único do sangue, correspondendo a


Cátia Fidalgo 18

55% do volume total do sangue, como se pode observar na Figura 2.5. Contém

inúmeras substâncias em solução ou suspensão, substâncias de pequeno e elevado peso

molecular, correspondendo a 10% do volume de plasma. Destas substâncias, as

proteínas plasmáticas correspondem a 7%, os sais inorgânicos são cerca de 0,9% e o

restante são compostos orgânicos diversos: aminoácidos, glicose, vitaminas, mediadores

químicos, entre outros.

A concentração total de proteína plasmática é aproximadamente 7.0-7.5g/dl

incluindo não só proteínas simples mas também conjugadas: lipoproteínas e

glicoproteínas. É possível separar as proteínas plasmáticas em três grupos: as

albuminas, as globulinas e o fibrinogénio (proteínas da coagulação) [10].

Figura 2.5 Ilustração do plasma numa amostra sanguínea. [20]

A principal função do plasma é transportar as proteínas e as substâncias

dissolvidas, como nutrientes, medicamentos, produtos tóxicos (por exemplo o dióxido

de carbono que as células eliminam) e também transporta para todo o corpo os

medicamentos ingeridos.

O plasma permite uma troca livre dos seus componentes com o líquido

intersticial, através dos poros existentes na membrana capilar. As proteínas plasmáticas

em condições normais, não atravessam a membrana devido às suas grandes dimensões,

permanecendo assim no plasma. O mesmo não acontece com a água e outras

substâncias dissolvidas, que atravessam a membrana facilmente.

A saída de água do plasma através dos capilares é controlada pela pressão

coleidosmótica e pelo estado da permeabilidade das membranas, ou seja, as proteínas

extraem água dos tecidos para os capilares mas dificultam a sua saída dos capilares para


Cátia Fidalgo 19

os tecidos. O principal responsável pela manutenção da pressão coleidosmótica no

plasma é a albumina.

Um método simples de separar as células do sangue do plasma é através de

centrifugação, sendo mais específico a plasmaferese que separa o plasma das hemácias.

Se ao plasma sanguíneo forem retirados os factores de coagulação naturalmente

(como a fibrina), este fica com o nome de soro sanguíneo. Este soro é obtido através da

coagulação do sangue total pois os factores de coagulação foram consumidos pela

coagulação das hemácias.

O plasma não é um meio de armazenamento e transporte para os factores de

coagulação, as proteínas envolventes são necessárias para manter a pressão oncótica do

sangue [19].

2.2. Comportamento dos Fluidos

Os fluidos podem ter dois comportamentos distintos: pode ser newtoniano ou não-

newtoniano, como pode ser observado na Figura 2.6.

Um fluido newtoniano é um fluido em que a tensão de corte aumenta

proporcionalmente com a taxa de deformação. Apresentam a mesma viscosidade em

qualquer velocidade do escoamento. Como exemplos temos a água, gases, plasma e

líquidos com uma forma química simples, em condições normais.

Um fluido não-newtoniano é aquele em que a viscosidade varia de acordo com o

grau de deformação aplicado, e sendo assim, não tem viscosidade bem definida. Alguns

exemplos são suspensões coloidais, emulsões e géis, o sangue é também um exemplo de

um fluido não-newtoniano, pois não apresenta um comportamento linear [28],[29].

Estudo da Camada de

Cátia Fidalgo

Figura 2.6 Variação da tensão de corte em relação ao gradiente de velocidade.

2.3. Viscosidade Sanguínea

A viscosidade do sangue depende directamente da quantidade de sangue composta

por hematócrito. Quanto ma

sangue, então a viscosidade aumenta significativamente com o aumento do hematócrito.

É possível observar esta relação

Figura 2.7


Variação da tensão de corte em relação ao gradiente de velocidade.

Viscosidade Sanguínea


por hematócrito. Quanto maior o hematócrito, maior é o atrito entre as camadas de


É possível observar esta relação no gráfico seguinte (Figura 2.7).

Figura 2.7 Variação da viscosidade com o hematócrito. [22]

20

Variação da tensão de corte em relação ao gradiente de velocidade. [29]


ior o hematócrito, maior é o atrito entre as camadas de



Cátia Fidalgo 21

Como a resistência no sistema circulatório é maior nos vasos de pequeno calibre

(capilares), é importante estudar o comportamento da viscosidade nestes vasos. Além do

hematócrito e das proteínas plasmáticas, existem outros factores que afectam a

viscosidade sanguínea.

Um dos factores é o comportamento da viscosidade nos pequenos vasos em relação

aos grandes vasos; nos pequenos vasos, a viscosidade tem muito menos efeitos. Este

efeito denomina-se efeito de Fahraeus-Lindqvist, que começa a notar-se quando o

diâmetro do vaso é menor que 1.5mm, aproximadamente. Nos capilares, este efeito é

muito acentuado, pois, teoricamente, a viscosidade nos pequenos vasos deveria ser

metade da observada nos grandes vasos, o que não se verifica, como se pode observar

na Figura 2.8.

Figura 2.8 Efeito da viscosidade do sangue in vitro através de capilares de vidro. [23]

O efeito Fahraeus-Lindqvist pode ser causado pelo alinhamento das hemácias

quando atravessam os vasos. As hemácias alinham-se no centro do vaso e o plasma

junto às paredes dos vasos, eliminando-se assim a resistência viscosa característica do

sangue.

Por outro lado, este efeito é compensado pela velocidade do fluxo e pelo

acoplamento de células. A viscosidade sanguínea aumenta significativamente quando há

uma queda na velocidade do fluxo. Assim, como a velocidade do fluxo nos pequenos

vasos é muito baixa, por vezes menor que 1mm/s., a viscosidade pode aumentar até 10


Cátia Fidalgo 22

vezes mais por este motivo. Este efeito pode ser causado pela aderência das hemácias

entre si e às paredes dos vasos [22],[23].

2.4. Escoamento Sanguíneo

O escoamento sanguíneo varia bastante nos diferentes tecidos. Alguns tecidos

necessitam de um escoamento bastante maior do que outros. Os tecidos esqueléticos

apresentam grandes variações no escoamento sanguíneo em diferentes situações.

Durante o repouso, o escoamento é relativamente pequeno, mas aumenta

significativamente durante o trabalho, quando existe um acréscimo não só do consumo

de oxigénio e nutrientes como também da produção de dióxido de carbono.

Através de uma vasoconstrição ou de uma vasodilatação, a cada momento, o

escoamento sanguíneo pode aumentar ou diminuir, devido a uma maior ou menor

resistência proporcionada ao mesmo [1].

O escoamento do sangue nos vasos sanguíneos tem de obedecer aos princípios

físicos do escoamento no interior de condutas, ou seja, da conservação da massa,

energia e quantidade de movimento. As forças que provocam o movimento (circulação

do sangue) são as forças da gravidade e as forças devidas aos gradientes de pressão. A

pressão nos vasos sanguíneos varia de ponto para ponto. É essa variação da pressão com

a distância que provoca o movimento do sangue. As forças que, pelo contrário, se

opõem à circulação do sangue são as forças de corte (tangencial) e as devidas à

turbulência do escoamento [24].

Existem dois tipos principais de escoamento: o escoamento turbulento e o

escoamento laminar, como se pode verificar na Figura 2.9


Cátia Fidalgo 23

Figura 2.9 Escoamento laminar e turbulento num tubo de vidro. [25]

O escoamento laminar é aquele no qual o fluido se move em camadas, ou lâminas,

uma camada deslizando sobre a adjacente e havendo apenas troca de quantidade de

movimento molecular. A viscosidade tende a moderar o aparecimento de instabilidade

ou turbulência. Para o escoamento laminar o número de Reynolds tem um valor inferior

a 2300 em condutas rectilíneas circulares.

No escoamento turbulento, as partículas apresentam um movimento irregular por

isso a velocidade apresenta componentes transversais ao movimento geral do conjunto

do fluido. Tem algumas características especiais, tais como elevado número de

Reynolds (superior a 2300), flutuações tridimensionais e dissipação de energia. [25]

Pode-se analisar se um escoamento é laminar ou turbulento através da sua posição

relativa numa escala de turbulência em que se indica o número de Reynolds (Re). O

número de Reynolds é a relação entre as forças de inércia �� e forças viscosas ��µ�:

�� ∑��

∑�µ; também pode ser calculado para condutas circulares de diâmetro D: ��

ρ !

µ�

!

" [24], [25].

A resistência ao escoamento no interior de um tubo é significativamente inferior no

caso de escoamentos laminares quando comparados com os turbulentos. O escoamento

do sangue é em muitos locais turbulento, sendo laminar nos vasos sanguíneos pequenos,

o que dificulta o estudo do seu escoamento, uma vez que escoamentos laminares são

mais fáceis de entender e a sua teoria está bem desenvolvida, ou contrário dos

turbulentos que são mais difíceis de estudar, sem suporte teórico suficiente.

O sangue nos microcanais em estudo, comporta-se como um escoamento laminar,

apresentam um valor de Re de aproximadamente 0.005.


Cátia Fidalgo 24

A resistência ao escoamento pode depender de factores como o comprimento do

vaso, o diâmetro do vaso e a viscosidade do sangue [1].

2.5. Velocidade do Sangue

A velocidade do sangue nos vasos depende do diâmetro do vaso e da sua

proximidade ao ventrículo esquerdo. Quanto mais próximo do ventrículo, maior será a

velocidade do sangue. Por outro lado, quando o sangue flui numa velocidade contínua,

através de um vaso liso e longo, a velocidade de escoamento no centro do vaso é maior

do que próximo às paredes [26],{27].

Um exemplo para o cálculo da velocidade no sangue no sistema circulatório seria: a

área de secção de recta da artéria aorta é de aproximadamente 2,5 cm2. Já a área de

secção de recta de todos os capilares existentes no nosso corpo (somados) seria de,

aproximadamente, 1000 vezes maior do que a da aorta (2,5 cm2 x 1.000 = 2500 cm2 =

25 m2). A velocidade do sangue na artéria aorta é de, aproximadamente, 30 cm/segundo.

Sendo assim, a velocidade do sangue num capilar seria de, aproximadamente, 1.000

vezes menor, ou seja, 30 cm/seg / 1.000 = 0,3 mm/seg. [27].


Cátia Fidalgo 25

3. Microcanais e Fluidos Fisiológicos

3.1. Capilares de Vidro Borosilicato

O vidro borosilicato é um tipo de vidro resistente ao calor e aos químicos, sendo

fabricado pela adição de boro aos componentes tradicionais do vidro. O seu baixo

coeficiente de dilatação permite que instrumentos de vidro possam manter a precisão

das suas medidas mesmo quando sujeito ao calor. Este tipo de vidro é resistente ao

calor, o que o torna útil em material de laboratório em que tenha que suportar

temperaturas elevadas.

Além de laboratórios, também pode ser usado em indústrias químicas,

equipamento de cozinha, iluminação, telescópios e armazenamento de resíduos

nucleares.

Os capilares de vidro borosilicato usados neste projecto têm 100µm ±2 com a

excepção de um deles que tinha apenas 92µm, usado para o estudo do hematócrito 9%,

este diâmetro diferente talvez seja erro da empresa. Estes capilares foram fabricados

pela Vitrocom (Mountain Lakes, NJ, EUA), que foram montados sobre uma lâmina de

vidro imersa em glicerina que tem o mesmo índice de refracção, como pode ser

observado na Figura 3.1 [3].

O fluxo laminar através de tais microcanais gera um fluxo meramente axial, que

é semelhante ao comportamento do fluxo através dos capilares [21].

Figura 3.1 Modelo do microcanal de vidro. [21]


Cátia Fidalgo 26

3.2. Dextran 40 (Dx40)

O Dextran 40 é um polissacarídeo modificado, solúvel em água, composto por

resíduos de D-glucose e apresenta ligações glicosídicas. É muito usado medicinalmente

como um antitrombótico (anti-plaquetário), reduzindo a viscosidade do sangue e tem

vindo a ter bastantes aplicações na área farmacêutica e biomédica.

O dextran aumenta a electronegatividade das hemácias, plaquetas e do endotélio

vascularizado, reduzindo assim a agregação das plaquetas e dos eritrócitos.

As grandes vantagens da utilização deste composto são que é biodegradável em

humanos, não é tóxico e não provoca reacções no organismo. Por outro lado, existem

poucos efeitos colaterais mas que podem ser graves [1],[2].

3.3. Etilenodiamino tetra-acético (EDTA)

O ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) é um composto orgânico que actua

como agente quelante, e forma complexos muito estáveis com vários iões metálicos. Os

iões podem ser o magnésio, cálcio (para valores de pH superiores a 7), o manganês,

ferro (II e III), zinco, cobalto e cobre (II), chumbo e níquel (para valores de pH

inferiores a 7). O EDTA é um ácido que actua como um ligante hexadentado.

Como apresenta afinidade com o cálcio este ácido é usado como anticoagulante,

sendo também utilizado como descolorante para cabelos, fabricação de pão e outros

derivados da indústria alimentar [6].


Cátia Fidalgo 27

3.4. Soro Fisiológico

O soro fisiológico é uma solução de água destilada e cloreto de sódio (NaCl) sendo

isotónica em relação aos líquidos corporais. Contém 0,9% (em massa) de NaCl em água

destilada, ou seja, cada 100mL da solução aquosa contém 0,9 gramas de sal. A presença

do sal faz com que a solução apresente, normalmente, um pH=7.

Devido às suas características, é muito usado em variadas situações. Em medicina,

pode ser usado em pessoas que apresentam sintomas diversos como gripes, respostas

alérgicas, limpeza de ferimentos (cortes e queimaduras) e desidratação (meio

intravenoso). Em laboratórios é utilizado como meio de soluções para observação ao

microscópio. Pode ainda ser usado para a limpeza de lentes de contacto [7],[8].

Neste projecto o soro fisiológico foi utilizado para lavagem de células

sanguíneas durante a centrifugação.


Cátia Fidalgo 28

4. Software para o Estudo da Camada de Plasma

4.1. Phantom

O progama Phantom faz parte de uma classe de alta velocidade de câmaras digitais

que começou no início de 1990.

O projecto original (patenteado pela Vision Research), inclui num mesmo programa

um sistema completo que inclui um sensor CMOS, um processador e um sistema

operacional interno com memória suficiente para armazenar a enorme quantidade de

informação capturada pelo sensor, um sistema de interface poderosa que permite

downloads e streaming de dados, sinalização de vídeo e controlo do software da câmara,

além da possibilidade de várias redes câmaras sincronizadas. [5]

Com este programa foi possível obter e converter os vídeos numa sequência de

imagens para posterior análise.

4.2. Image J

O Image J é um programa de processamento de imagem desenvolvido no National

Institutes of Health.

Image J permite exibir, editar, analisar, processar, guardar e imprimir de imagens de

8 bits, 16 bits e 32 bits. Este programa possibilita a leitura de variados formatos de

imagem, tais como: TIFF, PNG, JPEG, BMP, DICOM, FITS e também formatos RAW.

Suporta imagens em série, que são partilhadas numa única janela. Permite ainda o

cálculo de ângulos e distâncias, assim como a realização de histogramas de densidade.

Suporta funções de processamento de imagem padrão, tais como operações

aritméticas e lógicas entre imagens, manipulação de contraste, convolução, análise de

Fourier, nitidez, suavização, detecção de bordas e filtragem mediana. Faz


Cátia Fidalgo 29

transformações geométricas como escala, rotação e saltos. O programa suporta qualquer

número de imagens simultaneamente, limitado apenas pela memória disponível. [4]

4.2.1. “Z-Project”

O “Z-Project” é um dos subprogramas usados para efectuar a análise da camada de

plasma. É obtido através dos comandos “Image” – “Stacks” – “Z-Project” (Figura 4.1).

Figura 4.1 Esquematização do procedimento para o comando “Z-Project”.

O “Z-Project” projecta a imagem ao longo de um eixo perpendicular ao plano da

imagem (eixo do z). Existem 5 tipos de projecções: a intensidade média, intensidade

máxima, intensidade mínima, soma e desvio-padrão.

A intensidade média (Average Intensity) caracteriza-se por armazenar a média

da intensidade de todos os pixels de uma imagem. A intensidade máxima (Max

Intensity), permite projectar uma imagem de saída, cujos valores de máxima intensidade

dos pixels são demonstrados. A intensidade mínima (Min Intensity) dá-nos o valor

máximo possível do padrão de intensidade dos brilhos da fonte. A soma (Sum slices),

cria uma imagem real, resultante da soma de todos os pixels de imagem original. O

desvio padrão (Standard Deviation) representa a raiz quadrada da variância e informa

sobre a maior ou menor homogeneidade, ou heterogeneidade, de uma imagem digital.


Cátia Fidalgo 30

Deste subprograma foram usadas apenas dois tipos de projecções (intensidade

mínima e máxima) como se pode visualizar nas Figuras seguintes (4.2 e 4.3):

Figura 4.2 Imagem de um microcanal com 15% Hct.

(a) (b)

Figura4.3 (a) Imagem aplicando a intensidade máxima (15% Hct); (b) Imagem aplicando a intensidade mínima (15%

Hct).

4.2.2. “MTrackJ”

O “MTrackJ” permite seguir os GV e determinar a espessura da camada de plasma

(ECP), efectuando a marcação manual, para posterior análise. Pode ser usado para

seguir a trajectória de um GV através de um filme, resultando uma sequência de valores,

ou mesmo ser utilizado numa imagem para marcar a zona da ECP.

Na Figura 4.4 pode-se ver a esquematização do “MTrackJ”.


Cátia Fidalgo 31

Figura 4.4 Esquematização do “MTrackJ”.

4.2.3. “Brightness/Contrast”

Este comando é obtido no ImageJ através dos comandos “Image” – “Adjust” -

“Brightness/Contrast”, como é possível observar na Figura 4.5:

Figura 4.5 Esquematização do “Brightness/Contrast”.


Cátia Fidalgo 32

Este comando permite fazer uma pré-análise das imagens obtidas, ou seja, ajustar o

contraste (contrast), a luminosidade (brightness), o mínimo (minimum) e o máximo

(maximum). Assim, torna-se mais fácil analisar as imagens pois melhora

significativamente a visualização da ECP, como se pode verificar na Figura 4.6.

(a) (b)

Figura 4.6 (a) Imagem original com 24% Hct; (b) Imagem aplicando o “Brightness/Contrast”.

4.2.4. “Find Edges”

Este comando também foi muito útil para determinar a camada de plasma. É obtido

no Image J através os comandos “Process” – “Find Edges”. Permite encontrar os limites

que temos na imagem a analisar, como se pode verificar na Figura 4.7, muitas vezes é

efectuado um pré-processamento da mesma imagem.

(a) (b)

Figura 4.7 (a) Imagem depois de aplicada a intensidade máxima com 9% Hct; (b) Imagem após a aplicação do “Find

Edges”.


Cátia Fidalgo 33

4.2.5. “Binary”

Este é outro comando do ImageJ, que permite fazer o binário de uma imagem,

ficando apenas a preto e branco. Em algumas análises melhora os resultados, devido ao

contraste da imagem. É obtido através dos comandos “Process” – “Binary” – “Make

Binary” (Figura 4.8).

Figura 4.8 Esquematização do “Binary”.

Incluído neste subprograma está também o comando “Erode”, com o qual se pode

fazer, como indica o próprio nome, uma erosão da imagem obtida. Os resultados

obtidos podem ser melhores ou não, dependendo da imagem que estamos a analisar e do

processamento efectuado.


Cátia Fidalgo 34

5. Procedimento Experimental

5.1. Materiais e Métodos

5.1.1. Microcanais e Fluidos Utilizados

O fluido utilizado - o sangue - foi obtido a partir de um adulto saudável, sendo

adicionado ácido atilenodiamino tetra-acético (EDTA) para impedir a coagulação. Os

eritrócitos foram separados por centrifugação e de seguida foi feita uma aspiração dos

restantes componentes sanguíneos, sendo lavados duas vezes com soro fisiológico.

Posteriormente, os eritrócitos foram marcados com um marcador de fluorescência

celular (CM-Dill, c-7000, Molecular Probles) e diluídos com Dextran40 (Dx40) para

obter a concentração volúmica necessária aos eritrócitos.

Todas as amostras de sangue foram armazenadas hermeticamente a 4ºC até serem

realizados as experiências a uma temperatura controlada de 37ºC. Assim foram obtidos

cinco fluidos contendo Dx40: um fluido com 35% de hematócrito (35% Hct), 24% Hct,

15% Hct, 9% Hct e 2% Hct (Figura 5.1).

Os microcanais usados neste projecto são microcanais de vidro borosilicato, com

um diâmetro de 100µm ±2, com excepção de um que tem um diâmetro de 92µm para o

caso do hematócrito 9%.


Cátia Fidalgo 35

Figura 5.1 Representação da preparação das amostras de sangue [23].

5.2. Aquisição de Imagens

Numa primeira parte experimental, (Figura 5.2) foi usado um sistema denominado

“Micro-PTV Confocal”, que é constituído por um microscópio invertido (IX71,

Olympus, Japão) combinado com uma unidade confocal (CSU22, Yokogawa) e um

laser DPSS (Laser Quantum Ltd) com um comprimento de onda de 532nm. Para a

aquisição de imagens, foi utilizada uma câmara de alta velocidade (Phantom v7.1) que

está ligada à unidade confocal CSU22.

O microcanal obtido anteriormente foi colocado no microscópio invertido onde o

caudal do fluido foi mantido constante com o valor de Re de aproximadamente 0.005

usando uma bomba de seringa (KD Scientific Inc, USA). Para verificar a temperatura

foi usado um sistema controlador de temperatura (Tokai Hit) sendo colocado a 37ºC.

Assim, já é possível fazer a obtenção de imagens. Todas as imagens adquiridas por

este sistema confocal foram captadas no centro dos microcanais com uma resolução de

640x480 pixels, usando uma taxa de 100 imagens/segundo e um tempo de exposição de

9.4ms.

Por fim, estas imagens são transferidas para o computador e no programa Phantom

vão ser convertidas de vídeos para uma sequência de imagens. Esta sequência obtida

pode ser então processada no Image J (NIH) [31], utilizando também os outros


Cátia Fidalgo 36

subprogramas, entre eles o “MTrackJ” [32]. É possível agora determinar a espessura da

camada do plasma no microcanal em análise.

Figura 5.2 Esquematização de todos os elementos usados na aquisição de imagem.[21]

5.3. Image J

Para as imagens poderem ser analisadas neste programa, primeiro têm que ser

importadas, usando os comandos File – Import – Image Sequence, seleccionando a

primeira imagem da sequência e num aviso seleccionar a opção para “8-bit

Grayscale”. Assim as imagens estão prontas a serem analisadas.

Numa primeira parte é efectuado um pré-processamento das imagens usando o

comando “Brightness/Contrast”, para tornar mais fácil a sua análise.


Cátia Fidalgo 37

5.3.1. “Z-Project”

Neste subprograma, foram usados os parâmetros de intensidade máxima e

mínima que projectam a imagem num eixo perpendicular ao plano de imagem (eixo

“z”) com o propósito de obter uma distribuição estatística das células ao longo do

microcanal. Em função do hematócrito e da qualidade das imagens, foram usados os

dois parâmetros, sendo de seguida feito outro ajuste de brilho e contraste.

Com o método do “Find Edges”, foram obtidos os contornos da imagem que

possibilitam uma melhor análise da espessura da camada de plasma.

Uma outra forma de efectuar a análise depois de aplicar a intensidade máxima

ou mínima é pelo método “Erode”, que elimina grande parte do ruído existente na

imagem. De seguida, em cada imagem obtida, quer do “Find Edges” quer do “Erode”,

foi medida manualmente a espessura da camada de plasma (ECP) usando o plugin

“MTrackJ”. As medições efectuadas foram obtidas por localização visual do limite da

camada de plasma, tendo um ponto de referência na parede do microcanal para se poder

obter valores de forma a determinar a ECP. Este procedimento pode ser observado na

Figura 5.3.


Cátia Fidalgo 38

(a) (b)

(c) (d)

Figura 5.3 Procedimento para a análise de imagem: (a) Imagem original; (b) Imagem resultante da intensidade

máxima do “Z-Project”; (c) Imagem resultante da aplicação do “Find Edges” e (d) Imagem com a análise do

MTrack J.

5.3.2. “MTrackJ”

Esta ferramenta foi das mais usadas neste projecto. Numa primeira parte, antes

de analisar qualquer imagem, é muito importante fazer a calibração da mesma. Para tal,

coloca-se uma linha desde a parede de cima (PC) até à parede de baixo (PB) do

microcanal e usando o Set Scale é possível inserir o valor de referência (100 ±2µm) e a

unidade de medida a usar, que neste caso é pixels/µm. Considerou-se que 1 pixel ≅ 0.56

µm.


Cátia Fidalgo 39

5.3.2.1. O método das trajectórias dos GVs (“Tracking”)

O “MTrackJ” permite obter a trajectória dos glóbulos vermelhos (GVs)

“labeled” (células marcadas com corante fluorescente - corados) através de uma

sequência de imagens quando estes estão envolvidos na vizinhança da camada de

plasma, sendo possível adquirir valores viáveis da ECP.

Assim, neste caso, é usado o comando “Add tracks” para colocar um primeiro

ponto de referência na PC e sendo os seguintes pontos colocados de forma a seguir a

trajectória do GV ao longo do microcanal. Este processo é igualmente repetido para a

PB. Com os valores resultantes, é feita uma média dos valores que permite determinar a

ECP.

Como nas imagens obtidas nem sempre se tem uma boa visualização dos GVs

envolvidos na camada de plasma, este processo não foi realizado para todas elas, sendo

apenas efectuado para aquelas que se tem uma boa iluminação dos GVs, como se pode

verificar na Figura 5.4.

Figura 5.4 Representação de uma análise por trajectória de um GV (neste caso na PB), com 35% Hct.


Cátia Fidalgo 40

5.3.2.2. O método “Z-Project”

Nas imagens pré-processadas do “Z-Project”, foi efectuada da mesma forma a

calibração. De seguida, com o comando “Add tracks” é colocado o primeiro ponto

(ponto de referência) na PC do microcanal. Neste caso, vão ser distribuídos 25 pontos,

pois este é o valor que é estatisticamente correcto para uma avaliação deste tipo.

Sendo assim, o 1º ponto é o ponto de referência da PC, e são colocados ao longo

da PC 14 pontos; na PB o 16º ponto é o ponto de referência e os restantes são

distribuídos na PB, como se pode visualizar na Figura 5.5.

Figura 5.5 Imagem de 15% Hct com os pontos da análise.

Os valores dos pontos são obtidos recorrendo ao Measure Tracks, que depois de

guardados em formato ‘.txt’, podem transferidos para o Excel de modo a proceder à sua

análise. Para guardar a imagem final com os pontos respectivos foi usado o comando

Make movie, que permite guardar a imagem em formato TIFF, GIF, JPEG, entre outros;

este último procedimento foi igualmente efectuado para o caso da trajectória dos GVs.


Cátia Fidalgo 41

5.4. Processamento em Excel

Com os valores obtidos do “MTrackJ” já transferidos para o Excel, foi possível

obter os valores médios da ECP para posterior comparação.

Numa primeira fase é feita a diferença entre o valor de referência e todos os outros

valores quer da PC, quer da PB; de seguida é realizado o cálculo da média e do desvio-

padrão. Este procedimento foi efectuado para todos os resultados obtidos de cada

imagem analisada.

De modo a poder fazer uma comparação de todos os dados de cada hematócrito,

foram colocados os valores da média e desvio padrão de cada análise numa nova folha

de Excel e foram feitos gráficos. Assim, é mais simples fazer um melhor estudo de

resultados.

Estudo da Camada de

Cátia Fidalgo

6. Resultados Experimentais

Após a aquisição das imagens com diferentes hematócritos, verificou

não tinham boa qualidade pois não era possível visualizar com clareza os limites das

paredes do microcanal, os GVs e a espessura da camada de plasma. As

pode verificar na Figura 6.1, a

melhor análise.

Figura 6.1

Este procedimento foi efectuado em todas as imagens independentemente do

método a usar (o método “Tracking”

imagens dos vários hematócritos (35%, 24%, 15%, 9% e 2%), foram realizados os dois

métodos ou apenas um deles

Depois da aplicação de cada um dos métodos, pode

nas Figuras resultantes: Figura

tracks” do “MTrackJ”.

Parede de Cima

Parede de Baixo


Resultados Experimentais

imagens com diferentes hematócritos, verificou


paredes do microcanal, os GVs e a espessura da camada de plasma. As

igura 6.1, após o melhoramento da imagem, já é possível fazer uma

Figura 6.1 Imagem melhorada com 35% de hematócrito.

procedimento foi efectuado em todas as imagens independentemente do

o método “Tracking” ou o método “Z-Project”). Para as


métodos ou apenas um deles dependendo da imagem.

Depois da aplicação de cada um dos métodos, pode-se observar a análise realizada

Figura 6.2 até à Figura 6.13, depois da utilização do

Parede de Cima

Baixo Glóbulo Vermelho

Espessura da Camada de Plasma

42

imagens com diferentes hematócritos, verificou-se que estas


paredes do microcanal, os GVs e a espessura da camada de plasma. Assim, como se

pós o melhoramento da imagem, já é possível fazer uma

procedimento foi efectuado em todas as imagens independentemente do

). Para as todas as


se observar a análise realizada

6.13, depois da utilização do “Add

Camada de Plasma


Cátia Fidalgo 43

6.1. Análise e processamento de imagem

• 35% hematócrito:

Na Figura abaixo (6.2) encontra-se um exemplo dos resultados obtidos pela análise

do seguimento manual por intermédio do “MTrackJ”.

Figura 6.2 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”).

Figura 6.3 Imagem resultante do método do “Z-Project”.

Na Figura 6.3 foi realizado um pré-processamento com a utilização da

intensidade máxima seguido de um “binary” e um “erode”.


Cátia Fidalgo 44


Na Figura abaixo (6.4) encontra-se um exemplo dos resultados obtidos pela

análise do seguimento manual por intermédio do “MTrackJ”.

Figura 6.4 Imagem resultante do método das trajectórias dos GVs (“Tracking”).



intensidade máxima seguido de um binário.


Cátia Fidalgo 45







intensidade máxima seguido de um “binary”.


Cátia Fidalgo 46







intensidade máxima seguido de um “find edges”.


Cátia Fidalgo 47



intensidade mínima seguido de um “find edges”.






Cátia Fidalgo 48



intensidade máxima seguido de um “find edges”.



intensidade mínima seguido de um “find edges”.


Cátia Fidalgo 49

6.2. Resultados da Espessura da Camada de Plasma

De todas as análises efectuadas, apenas foram apresentados anteriormente um

exemplo de cada, ou seja, uma imagem com o método das trajectórias do GV

(“Tracking”) e outra resultante do método “Z-Project”, que pode ser de intensidade

máxima ou mínima.

Em anexos encontram-se os valores retirados do “MTrackJ” para todos os

hematócritos de ambos os métodos (um exemplo de cada método), com os quais foi

possível retirar os resultados seguintes.

Como foram obtidos muitos valores com cada análise, foi feito o cálculo das

médias de cada método para facilitar o estudo. Assim, de seguida são apresentados em

tabelas e gráficos os resultados obtidos.

Para uma melhor compreensão das tabelas e gráficos, é de referir que a

intensidade máxima e mínima das tabelas corresponde ao máximo e mínimo nos

gráficos e que o “Tracking” mencionado refere-se ao método da trajectória dos GVs.

Nas tabelas encontram-se os valores da análise efectuada quer para a parede de

cima (PC) quer para a parede de baixo (PB) do microcanal e as respectivas médias, com

ambos os métodos.

Nos gráficos, estão representados os valores da média da espessura da camada

de plasma (ECP) de cada hematócrito, retirados das tabelas.


Cátia Fidalgo 50


Assim, para o hematócrito 35%, são apresentados na tabela 6.1 os valores e na

Figura 6.14 o respectivo gráfico.

Tabela 6.1 Resultados da média da ECP para 35% Hct.

35% Hematócrito (µµµµm) Intensidade Máxima

“Z-Project” “Tracking” Média Total

PC 7,0714 --------- 7,0714

PB 6,4552 9,5192 7,9872

Média ECP 6,7633 9,5192 8,1412

Figura 6.14 Representação gráfica da variação da ECP para 35% hematócrito.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Média Máximos Média Tracking Média Total

Esp

ess

ura

da

Ca

ma

da

de

Pla

sma

( µµ µµm

)

35% Hct


Cátia Fidalgo 51


Para 24% hematócrito, os valores encontram-se na tabela 6.2 e estão

representados no gráfico da Figura 6.15.


24% Hematócrito (µµµµm)

Intensidade

Máxima

“Z-Project”

Intensidade

Mínima

“Z-Project”

“Tracking” Média Total

PC 5,5931 12,9061 12,2468 10,2486

PB 5,2381 11,1271 11,3132 9,2262

Média ECP 5,4156 12,0166 11,7799 9,7374


0

2

4

6

8

10

12

14

Média Máximo Média Mínimo Média Tracking Média TotalEsp

ess

ura

da

Ca

ma

da

de

Pla

sma

(µµ µµm

)

24% Hct


Cátia Fidalgo 52


No caso de 15% hematócrito, na tabela 6.3 estão os valores que estão

apresentados no gráfico da Figura 6.16.



Intensidade

Máxima

“Z-Project”

Intensidade

Mínima

“Z-Project”


PC 8,2723 19,0988 19,2622 15,5444

PB 8,9379 14,3242 14,2 12,4873

Média ECP 8,6051 16,7115 16,7311 14,0159


0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Média Máximo Media Mínimo Média Tracking Média total

Esp

ess

ura

da

Ca

ma

da

de

Pla

sma

( µµ µµm

)

15% Hct


Cátia Fidalgo 53


Em 9% hematócrito, o gráfico da Figura 6.17 foi obtido com os valores da tabela

6.4.



Intensidade

Máxima

“Z-Project”

Intensidade

Mínima

“Z-Project”


PC 10,0821 14,4449 -------- 12,2635

PB 10,5944 12,5025 20,95 14,6823

Média ECP 10,3382 13,4737 20,95 14,9206


0

5

10

15

20

25

Média Máximo Média Mínimo Média Tracking Média Total

Esp

ess

ura

da

Ca

ma

da

de

Pla

sma

( µµ µµm

)

9% Hct


Cátia Fidalgo 54


Por fim, para 2% hematócrito, os valores da tabela 6.5 estão representados no

gráfico da Figura 6.18



Intensidade

Máxima

“Z-Project”

Intensidade

Mínima

“Z-Project”


PC 14,5526 13,0462 -------- 13,7994

PB 13,0382 12,2426 26,45 17,2436

Média ECP 13,7954 12,6444 26,45 17,6299


0

5

10

15

20

25

30

Média Máximo Média Mínimo Média Tracking Média Total

Esp

ess

ura

da

Ca

ma

da

de

Pla

sma

( µµ µµm

)

2% Hct


Cátia Fidalgo 55

Nos casos em que o método “Tracking” não apresenta valores para a PC ou PB é

devido a não haver GVs excitados pelo laser com os quais é possível realizar o

“tracking”; considera-se que o comportamento é semelhante na PC e PB.


Cátia Fidalgo 56

7. Análise e Discussão dos Resultados

Após a análise das imagens, verifica-se que a concentração dos GVs vai sendo

maior no centro do microcanal do que junto às paredes, o que influencia a viscosidade

sanguínea. Assim, a viscosidade é maior no centro do canal e vai diminuindo com a

aproximação da parede. Assim, é importante ter a viscosidade me consideração quando

é feita a análise dos resultados.

Num trabalho realizado anteriormente em microcanais em PDMS [1], foi efectuado

um estudo semelhante ao realizado no presente trabalho. Apesar de os diâmetros serem

diferentes foi decidido compará-los qualitativamente (tabela 7.1)

Tabela 7.1 Resultados da ECP em microcanais de PDMS.[1]

Microcanais

de PDMS

37%

Hematócrito

23%

Hematócrito

13%

Hematócrito

3%

Hematócrito

Média (µµµµm) 7,561 9,283 11,190 22,80

Para se poder comparar os resultados obtidos com microcanais de vidro borosilicato

com os resultados de microcanais de PDMS (tabela 7.1), foram realizados alguns

ajustes, pois a análise foi efectuada para diferentes hematócritos. Assim, vão ser

considerados o Hct 37% como Hct 35%, Hct 23% como Hct 24%, Hct 13% como Hct

15% e Hct 3% como Hct 2%. Estes acertos podem ser considerados válidos pois as

percentagens de hematócrito são muito próximas.

De seguida vai ser feita a análise do gráfico da Figura 7.1, no qual estão

representados todos os resultados obtidos para cada hematócrito.

Estudo da Camada de

Cátia Fidalgo

Figura 7.1 Representação gráfica da variação da

Para 35% hematócrito, foram usados ambos os métodos (“tracking” e “Z

No caso do método do “Z-

intensidade mínima não era possív

considerar ambos os métodos eficazes desde que seja efectuada a intensidade máxima

no método “Z-Project”.

No caso de 24% hct, também foram usados ambos os métodos (

o método “Z-Project”, aplicou

resultados da intensidade máxima estão muito distantes dos outros dois obtidos, por isso

pode-se desde já considerar que esta análise não é eficaz.

tanto o método do “tracking” como o do “Z

métodos para determinar a ECP.

Quanto a 15% hct, pode

para ambos os métodos. Verifica

resultado bastante inferior em relação aos outros dois resultados. Por isso, os melhores

0

5

10

15

20

25

30

35% Hct 24% Hct

Esp

ess

ura

da

Ca

ma

da

de

Pla

sma

(µµ µµm

)


Representação gráfica da variação da ECP para todos os hematócritos para microcanais de vidro.

Para 35% hematócrito, foram usados ambos os métodos (“tracking” e “Z

-Project” apenas foi usada a intensidade máxima, pois com a

intensidade mínima não era possível efectuar uma boa análise. Sendo assim, podem


No caso de 24% hct, também foram usados ambos os métodos (ver Figura

t”, aplicou-se a intensidade máxima e a intensidade mínima. Os


se desde já considerar que esta análise não é eficaz. Assim pode

“tracking” como o do “Z-Project” de intensidade mínima são bons

métodos para determinar a ECP.

Quanto a 15% hct, pode-se observar no gráfico da Figura 7.1 os resultados obtidos

para ambos os métodos. Verifica-se novamente que a intensidade máxima apresent


24% Hct 15% Hct 9% Hct 2% Hct

Z-Project (Máximo)

Z-Project (Mínimo)

Tracking

57

ECP para todos os hematócritos para microcanais de vidro.

Para 35% hematócrito, foram usados ambos os métodos (“tracking” e “Z-Project”).

Project” apenas foi usada a intensidade máxima, pois com a

el efectuar uma boa análise. Sendo assim, podem-se


Figura 7.1). Para

se a intensidade máxima e a intensidade mínima. Os


Assim pode-se concluir que

Project” de intensidade mínima são bons

7.1 os resultados obtidos

se novamente que a intensidade máxima apresenta um


Project (Máximo)

Project (Mínimo)

Tracking


Cátia Fidalgo 58

métodos para determinar a ECP para este hct são o “tracking” e a intensidade mínima

no caso do “Z-Project”.

Para 9% hct, apresentam-se os resultados obtidos de ambos os métodos no gráfico

da Figura 7.1. Neste caso, tanto a intensidade máxima como a intensidade mínima do

método “Z-Project” têm valores bastante inferiores em relação ao “tracking”. Assim,

pode-se considerar que o método do “Z-Project” não é o mais aconselhável para este

hct. Com o método do “tracking” foram obtidos melhores resultados porque é possível

comparar a imagem original com a análise dos GVs que estão iluminados o que permite

assim ter uma melhor noção do limite da ECP, o que não é possível fazer no caso do

método “Z-Project”.

Por último, para o caso de 2% hct, existe uma grande diferença entre os resultados

da análise pelo método do “Z-Project” e pelo “tracking”, representados no gráfico da

Figura 7.1. Tanto o resultado da intensidade mínima como da intensidade máxima estão

muito abaixo do resultado do “tracking”. Considera-se que a melhor forma para

determinar a ECP neste hct é o “tracking”.

Em termos gerais, os resultados sugerem que a espessura da camada de plasma

aumenta com a diminuição do hematócrito, sendo que o método “tracking” é aquele que

apresenta resultados mais próximos da realidade. Isto também se verifica quando é feita

uma comparação dos resultados do “tracking” obtidos com os resultados de PDMS

apresentados na Figura 7.2.

Estudo da Camada de

Cátia Fidalgo

Figura 7.2 Representação gráfica da variação da ECP para todos os hematócritos

100µm (35%, 24%, 15% e 2%), 92

Para 35% hct, verifica

“tracking” um pouco mais elevado,

Nos casos de 24%, 15% e 2%

“tracking” tem um valor superior

Quanto ao resultado de 9% hct, não estão disponíveis valores de PDMS, por isso

não pode ser feita a comparação. No entanto pode

acordo com a evolução da ECP.

Estudos efectuados in vivo

Figura 7.3. Pela análise dos resultados

hematócrito, o que corrobora com os resultados obtidos no presente de estudo. Por outro

lado, também é possível observar qu

vai ser a ECP. Este aumento dá

representado na Figura 7.3.

0

5

10

15

20

25

30

Hct 35%

Esp

ess

ura

da

Ca

ma

da

de

Pla

sma

(µµ µµm

)


Representação gráfica da variação da ECP para todos os hematócritos para microcanais de diâmetro

m (35%, 24%, 15% e 2%), 92µm (9%) e 75µm para o caso dos microcanais em PDMS.

verifica-se que os valores não diferem muito, sendo resultado do

“tracking” um pouco mais elevado, possivelmente devido à diferença de diâmetros.

24%, 15% e 2% hct, verifica-se novamente que o

“tracking” tem um valor superior ao do PDMS.


não pode ser feita a comparação. No entanto pode-se dizer que este resultado está de

a evolução da ECP.

in vivo [33] obtiveram os resultados apresentados no gráfico da

7.3. Pela análise dos resultados in vivo a ECP aumenta com a diminuição do


lado, também é possível observar que quanto maior for o diâmetro do microcanal, maior

vai ser a ECP. Este aumento dá-se segundo uma regressão linear para cada hematócrito

7.3.

Hct 35% Hct 24% Hct 15% Hct 9% Hct 2%

59

para microcanais de diâmetro

m para o caso dos microcanais em PDMS. [1]

se que os valores não diferem muito, sendo resultado do

possivelmente devido à diferença de diâmetros.

que o resultado do


se dizer que este resultado está de

obtiveram os resultados apresentados no gráfico da

a ECP aumenta com a diminuição do


e quanto maior for o diâmetro do microcanal, maior

se segundo uma regressão linear para cada hematócrito

Tracking

Média PDMS


Cátia Fidalgo 60

Figura 7.3 Representação gráfica da espessura da camada de plasma em função do diâmetro do microvaso in vivo,

adaptado de [33].

No entanto, quando se comparam os resultados da ECP do gráfico da figura 7.3

com os resultados deste estudo apresentados no gráfico da Figura 7.2, verifica-se uma

diferença significativa. Por exemplo, para o caso de um hct de 15% os resultados

correspondem a cerca de 17 µm enquanto que o valor para o caso in vivo (ver Figura

7.2 para um diâmetro 10µm) é de aproximadamente 10µm. O mesmo acontece para o

caso de 35% hct, ou seja a diferença é também bastante significativa verifica-se

novamente que o resultado obtido é bastante superior. Esta grande diferença de

resultados pode ser devido ao tipo de microcanais que foram analisados. Os valores do

gráfico da Figura 7.3 são referentes ao estudo de microcanais in vivo, nos quais

interferem vários factores, como por exemplo os factores biológicos, a existência de

bifurcações e de glóbulos brancos em circulação, entre outros. Já no caso dos

microcanais que foram usados neste estudo, estes são microcanais de vidro nos quais

estes factores não são considerados durante o escoamento sanguíneo.


Cátia Fidalgo 61

8. Conclusões e Trabalho Futuro

8.1. Conclusões

Este projecto teve como principal objectivo a determinação da espessura da camada

de plasma (ECP) em microcanais circulares de vidro (92 e 100µm) em função do

hematócrito. As principais conclusões retiradas deste estudo são as seguintes:

- O sistema usado para a análise e tratamento de imagens confocais é um sistema

bastante promissor para estudar escoamento sanguíneo ao longo do microcanal;

- Os resultados experimentais sugerem que a trajectória dos GVs e a ECP são

fortemente dependentes do Hct;

- Pelos ensaios experimentais realizados foi possível concluir que aumentando o

hematócrito diminui a ECP, o que corrobora com os resultados encontrados na

literatura.

- Durante a análise dos resultados foi observado, principalmente para hematócritos

elevados, que ECP variava ao longo do microcanal, uma vez que os GVs ao

deslocarem-se ao longo do plasma realizam movimentos rotacionais e translacionais,

chocando uns com os outros e assim movendo-se de uma forma irregular;

- Em termos gerais, os resultados da ECP obtidos em microcanais de vidro são

qualitativamente concordantes com os resultados obtidos em microcanais de PDMS;

- Os resultados da ECP in vivo são qualitativamente semelhantes aos resultados in

vitro, mas o mesmo não se verifica quantitativamente, em que a ECP in vitro é sempre

superior à ECP in vivo;

- Em termos gerais, dos vários métodos de análise de imagem utilizados neste

estudo, aquele que apresentou resultados mais satisfatórios para a determinação da ECP

foi o método de seguimento (“tracking”) dos GVs ao longo de várias imagens. Para o

caso do método “Z-Project”, a opção da intensidade mínima foi aquela que apresentou

melhores resultados quando comparada com os resultados da opção intensidade

máxima;


Cátia Fidalgo 62

- Os métodos usados neste estudo são muito dependentes da perícia do utilizador, ou

seja é um método manual, se fosse usado um método automático ou semi-automático,

talvez houvesse melhoria dos resultados.

8.2. Trabalho Futuro

Uma proposta para a realização de trabalhos futuros será a melhoria das imagens

obtidas, como foi referido durante este estudo, por vezes era complicado efectuar uma

correcta análise devido à qualidade das imagens. Algumas imagens estavam desfocadas,

com ruído e esbatidas, o que dificulta bastante a identificação da zona de transição entre

o escoamento sanguíneo com os glóbulos vermelhos e a camada de plasma, bem como a

correcta identificação dos limites da parede do microcanal.

Por outro lado, uma forma de melhorar os resultados obtidos será com a utilização

de métodos automáticos ou semi-automáticos de modo a melhorar a análise de imagem

e seu processamento. Os métodos automáticos para além de melhorar a qualidade das

imagens, podem também ajudar a ultrapassar os erros humanos associados à análise

manual de uma imagem.


Cátia Fidalgo 63

9. Referências Bibliográficas

[1] Cerdeira, T., Estudo do Escoamento Sanguíneo em Microcanais, Projecto Final de

Curso, Escola Superior de Tecnologia e Gestão, Instituto Politécnico de Bragança,

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[3] Lima, R.; Wada, S.; Takeda, M., Tsubota, K.; Yamaguchi, T., In vitro confocal

micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the

hematocrit on instantaneous velocity profiles; Journal of Biomechanics 40: 2752-2757;

2007.

[4] http://en.wikipedia.org/wiki/ImageJ; (Consultado em 12/06/10)

[5] Phantom Camera Control Software Documentation, Version 607, Vision Research,

Inc., New Jersey 07470;

[6] http://pt.wikipedia.org/wiki/EDTA; (Consultado em 28/06/10)

[7]http://fernandaguedes.weblog.com.pt/arquivo/2007/10/soro_fisiologic.html;

(Consultado em 28/06/10)

[8] http://pt.wikipedia.org/wiki/Soro_fisiol%C3%B3gico; (Consultado em 28/06/10)

[9] http://pt.wikipedia.org/wiki/Catalisador; (Consultado em 28/06/10)

[10] Teixeira, M.; Sebenta Anatomofisiologia Humana, ESTiG, IPB, 2008;

[11]http://2.bp.blogspot.com/_S7Qz9a3DX6s/SeKPdGxVQLI/AAAAAAAAAn4/Mrf4

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[12] http://pt.wikipedia.org/wiki/Hem%C3%A1cia; (Consultado em 29/06/10)

[13]http://lqes.iqm.unicamp.br/images/pontos_vista_artigo_divulgacao_94_1_globulos_

vermelhos.jpg; (Consultado em 29/06/10)

[14] http://pt.wikipedia.org/wiki/Hemat%C3%B3crito; (Consultado em 29/06/10)


Cátia Fidalgo 64

[15] http://www6.ufrgs.br/favet/lacvet/hematocrito_files/hemato1.jpg; (Consultado em

29/06/10)

[16] http://pt.wikipedia.org/wiki/Leuc%C3%B3cito; (Consultado em 29/06/10)

[17]http://www.sobiologia.com.br/figuras/Corpo/leucocitos.jpg; (Consultado em

29/06/10)

[18] http://pt.wikipedia.org/wiki/Plaqueta_sangu%C3%ADnea; (Consultado em

29/06/10)

[19] http://pt.wikipedia.org/wiki/Plasma_%28sangue%29; (Consultado em 29/06/10)

[20]http://4.bp.blogspot.com/_pMxMXFn7L4/St3O5lWuFnI/AAAAAAAAKFo/aU7n6

Z6i9Ds/s400/19432.jpg; (Consultado em 29/06/10)

[21] Lima, R.; Wada, S.; Tsubota, K.; Yamaguchi, T., Confocal micro-PIV

measurements of three-dimensional profiles of cell suspension flow in a square

microchannel; Measurement Science and Technology, 17: 797-808, 2006;

[22] http://www.icb.ufmg.br/fib/neurofib/Engenharia/Hemodinamica/viscosidade.htm;


[23] Lima, R.; Ishikawa, T.; Imai, Y.; Yamaguchi, T., Blood flow behavior in

microchannel: past, current and future trends; Single and two-Phase Flow on Chemical

and Biomedical Engineering, 2010;

[24] Rosa, S.; Sebenta Teórica de Biofluidos, ESTiG, IPB, 2010;

[25]http://www.hidro.ufcg.edu.br/twiki/pub/Disciplinas/Fen%F4menosDeTransporte/E

xp_Reynolds.pdf; (Consultado em 30/06/10)

[26]http://www.icb.ufmg.br/fib/neurofib/Engenharia/Hemodinamica/fluxo_laminar.htm

; (Consultado em 30/06/10)

[27]http://br.answers.yahoo.com/question/index?qid=20081130093115AAepljs;


[28] http://www.estv.ipv.pt/paginaspessoais/jqomarcelo/OT/DEMad_OT_Fluidos.pdf;



Cátia Fidalgo 65

[29] http://www.deq.ufba.br/docs/downloads/material_maria_fatima/ENG008_8.pdf;


[30] http://pt.wikipedia.org/wiki/Vidro_borossilicato; (Consultado em 01/07/10)

[31] Abramoff M., Magelhaes P., Ram, S. Image Processing with Image J. Biophotonics International 11: 36-42, 2004.

[32] Meijering, E., Smal, I., and Danuser, G., Tracking in Molecular Bioimaging. IEEE Signal Processing Magazine 3 (23): 46-53, 2006.

[33] Maeda, N.; Erythrocyte Rheology in Microcirculation. Japanese Journal of

Physiology 46: 1-14, 1996.


Cátia Fidalgo 66

Anexos

• 35% Hematócrito

“Tracking”

Número de pontos Valores Diferença

Parede Baixo

1 185,2336 11,8744

2 173,3592 11,9261

3 173,3075 12,0375

4 173,1961 12,0321

5 173,2015 12,0279

6 173,2057 12,0624

7 173,1712 12,1344

8 173,0992 12,1138

9 173,1198 12,1173

10 173,1163 12,188

11 173,0456 12,169

12 173,0646 12,1654

13 173,0682 12,2288

14 173,0048 12,2342

15 172,9994 12,2374

16 172,9962 12,3412

17 172,8924 12,33

18 172,9036 12,7282

19 172,5054 12,7693

20 172,4643 13,1758

21 172,0578 13,2181

22 172,0155 13,5845

23 171,6491 13,6642

24 171,5694 13,639

25 171,5946 13,6768

26 171,5568 13,629

27 171,6046 13,5929

28 171,6407 13,3195

29 171,9141 13,3734

30 171,8602 13,3614

31 171,8722 13,4505

32 171,7831 13,8374


Cátia Fidalgo 67

33 171,3962 13,8295

34 171,4041 13,774

35 171,4596 13,7394

36 171,4942 13,756

37 171,4776 13,5998

38 171,6338 13,54

39 171,6936 13,4572

40 171,7764 13,4396

41 171,794 13,3185

42 171,9151 12,937

43 172,2966 13,253

44 171,9806 13,2785

45 171,9551 13,1383

46 172,0953 12,687

47 172,5466 12,7221

48 172,5115 12,6392

49 172,5944 12,6358

50 172,5978 12,6779

51 172,5557 12,4173

52 172,8163 12,9865

53 172,2471 13,0551

54 172,1785 13,1852

55 172,0484 13,1802

56 172,0534 13,0802

57 172,1534 13,2471

58 171,9865 13,2747

59 171,9589 13,2612

60 171,9724 13,3313

61 171,9023 13,1767

62 172,0569 13,1658

63 172,0678 13,3737

64 171,8599 13,1268

65 172,1068 13,3045

66 171,9291 13,25

67 171,9836 13,2779

68 171,9557 13,3435

69 171,8901 13,4854

70 171,7482 13,5564

71 171,6772 13,5724

72 171,6612 12,9129

73 172,3207 13,0241

74 172,2095 13,3883


Cátia Fidalgo 68

75 171,8453 13,3986

76 171,835 13,9048

77 171,3288 13,9485

78 171,2851 13,6181

79 171,6155 13,9575

80 171,2761 13,6051

81 171,6285 13,7269

82 171,5067 13,5989

83 171,6347 13,6152

84 171,6184 13,6052

85 171,6284 13,5674

86 171,6662 13,5479

87 171,6857 13,588

88 171,6456 13,7658

89 171,4678 13,7593

90 171,4743 13,7494

91 171,4842 13,3483

92 171,8853 13,6808

93 171,5528 13,5259

94 171,7077 13,589

95 171,6446 13,8476

96 171,386 13,8861

97 171,3475 13,942

98 171,2916 13,8913

99 171,3423 13,9991

100 171,2345 13,896

101 171,3376 13,8683

102 171,3653 13,8619

103 171,3717 13,8976

104 171,336 13,7196

105 171,514 13,8856

106 171,348 13,91

107 171,3236 13,9406

108 171,293 14,2037

109 171,0299 14,341

110 170,8926 14,2675

111 170,9661 13,6676

112 171,566 13,5857

113 171,6479 13,4437

114 171,7899 13,188

115 172,0456 13,3288

116 171,9048 13,3236


Cátia Fidalgo 69

117 171,91 13,3365

118 171,8971 13,4064

119 171,8272 13,4148

120 171,8188 13,4332

121 171,8004 13,4641

122 171,7695 13,4425

123 171,7911 13,4409

124 171,7927 13,3939

125 171,8397 13,2685

126 171,9651 13,5016

127 171,732 13,4324

128 171,8012 13,4239

129 171,8097 13,4242

130 171,8094 13,432

131 171,8016 13,3848

132 171,8488 13,7525

133 171,4811 13,5675

134 171,6661 13,4307

135 171,8029 12,8355

136 172,3981 13,345

137 171,8886 13,3288

138 171,9048 13,2707

139 171,9629 13,3356

140 171,898 12,4394

141 172,7942 12,3694

142 172,8642 12,6344

143 172,5992 12,7608 Média Desvio-padrão

144 172,4728

13,27207 0,553397715

“Z-Project” – Intensidade Máxima

Número de Pontos Valores Diferença

Parede Cima

1 80,7116 5,8989

2 86,6105 5,4307

3 86,1423 5,3756

4 86,0872 4,4008

5 85,1124 6,7416

6 87,4532 5,8053

7 86,5169 6,5543

8 87,2659 7,0225


Cátia Fidalgo 70

9 87,7341 7,6779

10 88,3895 7,9462

11 88,6578 6,8778

12 87,5894 7,1295

13 87,8411 8,082


15 88,5843

6,6297 1,115003934

Parede Baixo

16 181,7884 7,4906

17 174,2978 5,9457

18 175,8427 6,7322

19 175,0562 6,4098

20 175,3786 6,4794

21 175,309 5,6046

22 176,1838 5,848

23 175,9404 5,6086


25 175,4607

6,271844 0,60556233


“Tracking”


Parede Cima

1 84,1213 12,5106

2 96,6319 12,5755

3 96,6968 12,9507

4 97,072 13,4241

5 97,5454 12,9107

6 97,032 13,0217

7 97,143 13,0419

8 97,1632 13,075

9 97,1963 13,2402

10 97,3615 13,1525

11 97,2738 13,0412

12 97,1625 13,5485

13 97,6698 13,6091


Cátia Fidalgo 71

14 97,7304 13,3067

15 97,428 13,4722

16 97,5935 13,9937

17 98,115 14,038

18 98,1593 14,0294

19 98,1507 13,6135

20 97,7348 13,5302

21 97,6515 13,471

22 97,5923 13,4886

23 97,6099 13,4457

24 97,567 13,3202

25 97,4415 13,4457

26 97,567 13,483

27 97,6043 13,4526

28 97,5739 13,458

29 97,5793 13,3202

30 97,4415 13,4724

31 97,5937 13,4231

32 97,5444 13,4457

33 97,567 13,4457

34 97,567 13,5187

35 97,64 13,4623

36 97,5836 13,5454

37 97,6667 13,1375

38 97,2588 13,4814

39 97,6027 13,1375

40 97,2588 13,1375

41 97,2588 13,3202

42 97,4415 13,6855

43 97,8068 13,3202

44 97,4415 13,4457

45 97,567 12,9464

46 97,0677 12,9335

47 97,0548 12,8978

48 97,0191 12,49

49 96,6113 12,4228

50 96,5441 12,3856

51 96,5069 12,3581

52 96,4794 12,4228

53 96,5441 11,9278

54 96,0491 11,9018

55 96,0231 11,8439


Cátia Fidalgo 72

56 95,9652 11,942

57 96,0633 11,9823

58 96,1036 12,0125

59 96,1338 12,0313

60 96,1526 11,966

61 96,0873 11,5847

62 95,706 11,5894

63 95,7107 11,5641

64 95,6854 11,2992

65 95,4205 11,2881

66 95,4094 11,3745

67 95,4958 11,3703

68 95,4916 11,4937

69 95,615 11,4937

70 95,615 11,8062

71 95,9275 11,8886

72 96,0099 11,8868

73 96,0081 12,3742

74 96,4955 12,3248

75 96,4461 12,2774

76 96,3987 12,2861

77 96,4074 11,8744

78 95,9957 11,4821

79 95,6034 11,7633

80 95,8846 11,756

81 95,8773 11,4937

82 95,615 11,4937

83 95,615 11,4937

84 95,615 11,4937

85 95,615 11,4937

86 95,615 11,4937

87 95,615 11,4937

88 95,615 11,4937

89 95,615 11,4937

90 95,615 11,4937

91 95,615 11,6307

92 95,752 11,2786

93 95,3999 11,2907

94 95,412 11,2662

95 95,3875 11,3269

96 95,4482 11,2662

97 95,3875 11,3469


Cátia Fidalgo 73

98 95,4682 11,3095

99 95,4308 11,285

100 95,4063 11,34

101 95,4613 11,3319

102 95,4532 11,2952

103 95,4165 10,9569

104 95,0782 11,0364

105 95,1577 11,0423

106 95,1636 11,2993

107 95,4206 11,4859

108 95,6072 11,4352

109 95,5565 11,5511

110 95,6724 11,387

111 95,5083 11,527

112 95,6483 11,4732

113 95,5945 11,5403

114 95,6616 11,5804


116 95,7522

12,3308 0,908458

Parede Baixo

117 184,1512 8,5086

118 175,6426 8,4231

119 175,7281 7,995

120 176,1562 8,0072

121 176,144 7,7829

122 176,3683 7,859

123 176,2922 7,8525

124 176,2987 7,7483

125 176,4029 8,2792

126 175,872 7,7269

127 176,4243 7,7422

128 176,409 7,7497

129 176,4015 8,217

130 175,9342 8,2086

131 175,9426 8,1935

132 175,9577 8,2406

133 175,9106 8,2292

134 175,922 7,7393

135 176,4119 8,2219

136 175,9293 8,1744

137 175,9768 8,2045


Cátia Fidalgo 74

138 175,9467 7,6798

139 176,4714 7,6901

140 176,4611 7,6812

141 176,47 8,1806

142 175,9706 8,1746

143 175,9766 7,7502

144 176,401 7,7155

145 176,4357 7,7155

146 176,4357 7,7277

147 176,4235 7,6572

148 176,494 7,6455

149 176,5057 7,6812

150 176,47 7,7497

151 176,4015 7,7388

152 176,4124 7,7041

153 176,4471 7,5785

154 176,5727 7,6321

155 176,5191 7,1447

156 177,0065 7,1093

157 177,0419 7,1676

158 176,9836 7,4415

159 176,7097 7,2258

160 176,9254 7,2018

161 176,9494 7,208

162 176,9432 7,2018

163 176,9494 7,2018

164 176,9494 7,2375

165 176,9137 7,2018

166 176,9494 7,2018

167 176,9494 7,2375

168 176,9137 7,2271

169 176,9241 7,1209

170 177,0303 7,1909

171 176,9603 7,2152

172 176,936 7,2577

173 176,8935 7,2628

174 176,8884 7,3842

175 176,767 7,3497

176 176,8015 7,4182

177 176,733 7,4917

178 176,6595 7,6094

179 176,5418 7,3976


Cátia Fidalgo 75

180 176,7536 7,3044

181 176,8468 7,2546

182 176,8966 7,1442

183 177,007 6,6119

184 177,5393 6,5314

185 177,6198 6,2128

186 177,9384 6,1865

187 177,9647 6,1822

188 177,969 6,1675

189 177,9837 6,1789

190 177,9723 6,1416

191 178,0096 6,1182

192 178,033 6,2178

193 177,9334 6,1073

194 178,0439 6,1039

195 178,0473 6,0647

196 178,0865 6,0727

197 178,0785 6,0511

198 178,1001 6,133

199 178,0182 6,249

200 177,9022 6,1529

201 177,9983 6,0736

202 178,0776 6,1021

203 178,0491 6,0979

204 178,0533 6,0839

205 178,0673 6,1098

206 178,0414 6,0962

207 178,055 6,1131

208 178,0381 6,1189

209 178,0323 6,0238

210 178,1274 6,0277

211 178,1235 6,0996

212 178,0516 6,6259

213 177,5253 6,6345

214 177,5167 6,6311

215 177,5201 6,6331

216 177,5181 6,6331

217 177,5181 6,6407

218 177,5105 6,7178

219 177,4334 6,6881

220 177,4631 6,7212

221 177,43 6,1512


Cátia Fidalgo 76

222 178 6,2313

223 177,9199 6,2831

224 177,8681 6,2282

225 177,923 6,2198

226 177,9314 6,2925

227 177,8587 6,2671

228 177,8841 6,2643

229 177,8869 6,2333

230 177,9179 6,2827

231 177,8685 6,7429

232 177,4083 6,6815


234 177,5316

7,051867 0,747678



Parede Cima

1 84,9336 6,5834

2 91,517 6,3232

3 91,2568 6,4794

4 91,413 6,4143

5 91,3479 5,5036

6 90,4372 6,2322

7 91,1658 6,2322

8 91,1658 5,8679

9 90,8015 6,2322

10 91,1658 6,2322

11 91,1658 5,5036

12 90,4372 6,5965

13 91,5301 5,5036


15 90,4372

6,086279 0,422141849

Parede Baixo

16 185,2757 5,2211

17 180,0546 5,5854

18 179,6903 5,5854

19 179,6903 5,5854

20 179,6903 5,5854

21 179,6903 6,314


Cátia Fidalgo 77

22 178,9617 6,314

23 178,9617 5,2211


25 180,4189

5,5854 0,481923601


“Tracking”


Parede Cima

1 83,4901 18,796

2 102,2861 18,9227

3 102,4128 19,1171

4 102,6072 19,6988

5 103,1889 19,279

6 102,7691 19,2529

7 102,743 19,1159

8 102,606 19,02

9 102,5101 19,1391

10 102,6292 19,5397

11 103,0298 19,5635

12 103,0536 19,6865

13 103,1766 20,0968

14 103,5869 20,2921

15 103,7822 19,8705

16 103,3606 19,7612

17 103,2513 19,7

18 103,1901 19,5477

19 103,0378 19,6052

20 103,0953 19,734

21 103,2241 20,027

22 103,5171 19,9088

23 103,3989 19,697

24 103,1871 19,7047

25 103,1948 19,828

26 103,3181 20,2417

27 103,7318 20,3817

28 103,8718 20,3242


Cátia Fidalgo 78

29 103,8143 20,2291

30 103,7192 19,9656

31 103,4557 19,7317

32 103,2218 19,6874

33 103,1775 19,7385

34 103,2286 19,712

35 103,2021 19,6477

36 103,1378 19,6073

37 103,0974 19,1063

38 102,5964 18,9092

39 102,3993 18,85

40 102,3401 18,9838

41 102,4739 19,2285

42 102,7186 19,1844

43 102,6745 19,2283

44 102,7184 19,0118

45 102,5019 18,8447

46 102,3348 18,5451

47 102,0352 18,4597

48 101,9498 18,5743

49 102,0644 18,3823

50 101,8724 18,1052

51 101,5953 18,2006

52 101,6907 18,769

53 102,2591 18,8168

54 102,3069 18,9967

55 102,4868 19,139

56 102,6291 19,0982

57 102,5883 19,1007

58 102,5908 18,897

59 102,3871 18,5269

60 102,017 18,6027

61 102,0928 19,0093

62 102,4994 19,2517

63 102,7418 19,37

64 102,8601 19,3467

65 102,8368 19,3894

66 102,8795 19,4113

67 102,9014 19,2943

68 102,7844 19,2891

69 102,7792 19,2946

70 102,7847 19,3514


Cátia Fidalgo 79

71 102,8415 19,6149

72 103,105 19,722

73 103,2121 19,7477

74 103,2378 19,6438

75 103,1339 19,4728

76 102,9629 19,2921

77 102,7822 19,1753

78 102,6654 19,3497

79 102,8398 19,4992

80 102,9893 19,7225

81 103,2126 19,8702

82 103,3603 19,7666

83 103,2567 19,3104

84 102,8005 19,095

85 102,5851 18,9977

86 102,4878 19,1374

87 102,6275 19,1066


89 102,9129

19,34871 0,48024



Parede Cima

1 86,9984 9,5096

2 96,508 9,2189

3 96,2173 9,5096

4 96,508 10,0909

5 97,0893 9,5096

6 96,508 9,5096

7 96,508 10,0909

8 97,0893 9,5096

9 96,508 10,0909

10 97,0893 9,5096

11 96,508 10,0909

12 97,0893 10,0909

13 97,0893 10,3816


15 97,6707

9,841779 0,424401

Parede Baixo


Cátia Fidalgo 80

16 187,5655 8,987

17 178,5785 9,3746

18 178,1909 8,2119

19 179,3536 8,5994

20 178,9661 8,2119

21 179,3536 8,987

22 178,5785 8,987

23 178,5785 8,5994


25 179,0872

8,715167 0,394651

• 9% Hematócrito

“Tracking”


Parede Baixo

1 178,086 22,422

2 178,087 22,379

3 178,093 21,931

1 155,664 22,045

2 155,707 22,038

3 156,155 22,042

4 156,041 22,012

5 156,048 21,935

6 156,044 21,933

7 156,074 21,969

8 156,151 22,011

9 156,153 22,017

10 156,117 22,47

11 156,075 22,511

12 156,069 22,503

13 155,616 22,519

14 155,575 22,7

15 155,583 22,78

16 155,567 22,547

17 155,386 22,63

18 155,306 22,555

19 155,539 22,503


Cátia Fidalgo 81

20 155,456 22,516

21 155,531 22,416

22 155,583 23,092

23 155,57 23,08

24 155,67 22,892

25 154,994 23,039

26 155,006 23,764


28 155,047

22,5005 0,494229721

“Z-Project” – Intensidade Mínima


Parede Cima

1 90,6136 12,4075

2 103,0211 12,0047

3 102,6183 12,7929

4 103,4065 12,4989

5 103,1125 13,5153

6 104,1289 15,2273

7 105,8409 14,0188

8 104,6324 13,2132

9 103,8268 12,3023

10 102,9159 11,1991

11 101,8127 11,1991

12 101,8127 11,1991

13 101,8127 12,0047


15 103,0211

12,57074 1,140984708

Parede Baixo

16 189,7281 13,1181

17 176,61 12,3867

18 177,3414 12,0846

19 177,6435 12,3867

20 177,3414 10,8761

21 178,852 13,2931

22 176,435 13,5952

23 176,1329 14,1994


25 176,7372

12,77009 0,969420672


Cátia Fidalgo 82

• 2% Hematócrito

“Tracking”


Parede Baixo

1 187,05 29,048

2 187,06 28,998

1 158,002 28,921

2 158,052 28,903

3 158,129 28,939

4 158,147 28,921

5 158,111 29,074

6 158,129 29,171

7 157,976 29,171

8 157,879 29,168

9 157,879 29,226

10 157,882 29,289

11 157,824 29,261

12 157,761 29,172

13 157,789 29,141

14 157,878 29,134

15 157,909 29,179

16 157,916 29,323

17 157,871 29,3

18 157,727 29,332

19 157,75 29,295

20 157,718 29,319

21 157,755 29,325

22 157,731 29,397

23 157,725 29,346

24 157,653 29,382

25 157,704 29,336


27 157,714

29,19221 0,151488261


Cátia Fidalgo 83

“Z-Project” – Intensidade Mínima


Parede Cima

1 77,5758 8,4105

2 85,9863 8,8033

3 86,3791 8,5205

4 86,0963 11,1051

5 88,6809 10,4812

6 88,057 9,1443

7 86,7201 10,6595

8 88,2353 10,5495

9 88,1253 9,3226

10 86,8984 8,2531

11 85,8289 10,3945

12 87,9703 8,4313

13 86,0071 10,2139


15 87,6114

9,594636 0,997803428

Parede Baixo

16 176,836 9,4563

17 167,3797 9,1889

18 167,6471 10,4367

19 166,3993 7,6738

20 169,1622 10,2585

21 166,5775 9,7237

22 167,1123 8,5651

23 168,2709 8,8324


25 167,3797

9,287967 0,855386201

Estudo da Camada de Plasma e m...

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