UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE – UFSCENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIALABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

RELATÓRIOESTUDO COMPARATIVO DA ATIVIDADE DA AMILASE EM

DETERGENTE EM PÓ E EM SALIVA

ALUNOS: FELIPE PIMENTEL E THIAGO HENRIQUECURSO: FARMÁCIATURMA: C1PROFESSOR: Dr. HUMBERTO REIS MATOS

SÃO CRISTÓVÃO – SEMAIO 2010

OBJETIVOS:

o Verificar a atividade enzimática da amilase do detergente em pó

(ASSIM) de uso comum usando amido solúvel como substrato .

o Verificar a atividade enzimática das amilases da saliva usando

amido solúvel como substrato.

o Fazer o uso do espectrofotômetro para a obtenção das

absorbâncias que comprovam a atividade enzimática.

o Observar as temperaturas e pHs adequados para se atingir uma

atividade ótima.

INTRODUÇÃO:

As enzimas, catalisadoras de sistemas biológicos, são notáveis

dispositivos moleculares que determinam o perfi l de transformações

químicas. As características mais impressionantes das enzimas são o seu

poder catalít ico e a sua especificidade. A catálise ocorre em um local

particular na enzima, chamada de centro ou sít io ativo.

Assim quase todas as funções biológicas são sustentadas por

reações químicas catalisadas por enzimas, os catalisadores biológicos.

Um metabolismo eficiente é controlado por vias metabólicas ordenadas

seqüencial e ramificadamente. A maioria das enzimas aceleram as

reações químicas sob condições fisiológicas, temperatura de 37°C e pH

neutro. No entanto uma enzima não pode alterar o equil íbrio da reação,

mas somente acelerar sua velocidade, diminuindo sua energia de

ativação. As enzimas são envolvidas na maioria das formas de

metabolismo e a regulação de suas atividades permite ao metabolismo

uma adaptação a condições em rápida alteração.

Os princípios básicos de uma reação catalisada por uma enzima são

os mesmos de uma reação química. Quando ocorre uma reação química

o substrato deve ganhar uma energia de ativação até atingir o ponto

denominado estado de transição da reação no qual o nível de energia é

o máximo. Como o estado de transição da reação catalisada pela enzima

tem uma energia menor do que aquela da reação não-catalisada, a

reação pode ocorrer mais rapidamente.

A maior parte das enzimas são proteínas, com exceção da molécula

de RNA que possui propriedades catalít icas.

As propriedades enzimáticas são também aproveitáveis na área da

biotecnologia industrial, essas são largamente aplicadas em produtos de

uso comum na l impeza doméstica como sabão em pó e detergentes lava-

louça.

Fatores que influenciam as reações enzimáticas

Efeito da temperatura:

Em catalisadores inorgânicos, a velocidade da reação aumenta com

o aumento da temperatura do sistema. No caso das enzimas a

temperatura ideal de atuação é a temperatura corporal, porém como

muitas enzimas podem ter atuação extra corpórea essas exibem uma

temperatura ótima in vitro, pois a estrutura tridimensional de uma

proteína envolve l igações fracas como pontes de hidrogênio, que pode

ser rompidas em temperaturas muito elevadas.

Efeito do pH:

Da mesma forma as enzimas apresentam um pH ótimo, uma vez que

o pH do organismo encontra-se entre 6,8 e 7,4, muitas enzimas

funcionam otimamente nessa faixa. Existem algumas enzimas com

propriedades específicas, com um pH ótimo entre 1,5 e 2,0, como a

pepsina, secretada pelas células gástricas e com funções nos sucos

gástricos. As modificações no pH interferem com as cargas iônicas das

cadeias laterais dos aminoácidos das enzimas, podendo resultar em um

efeito drástico na atividade catalít ica da enzima.

Além destes, várias moléculas, inclusive substratos, produtos

intermediários e moléculas reguladoras também interferem com a

atividade das reações enzimáticas. Alguns compostos que podem

diminuir a atividade da enzima são chamados de inibidores enzimáticos.

A inibição pode ser reversível ( inibição competitiva, não competitiva e

incompetitiva) ou irreversível (envenenada).

A especificidade enzimática:

A maioria das enzimas são altamente específicas tanto para os tipos

de reação catalisada quanto para a natureza do substrato. A

especificidade da reação e a reação que a enzima catalisa são

determinadas quimicamente pelos resíduos de aminoácidos no centro

catalít ico da enzima. De modo geral, o sít io ativo da enzima é composto

por sít io catalít ico e pelo sít io de l igação do substrato. A especificidade

do substrato é determinada pela estrutura, pelas cargas, pela polaridade

e pela hidrofi l ia do sít io de l igação do substrato. Isto se dá pelo fato de

que o substrato deve se l igar ao sít io ativo como primeiro passo da

reação, preparando a catálise. Enzimas altamente específicas, como a

catalase e a uréase, que degradam o H 2O2 e a uréia, respectivamente,

catalisam apenas um tipo de reação; entretanto, existem algumas

enzimas com uma especificidade mais ampla pelos substratos e as

serinas-proteases são um exemplo típico deste grupo de enzimas.

Utilização de enzimas em produtos industriais:

A aplicação industrial mais larga das enzimas é a da produção de

detergentes. Elas substituem os produtos cáusticos, ácidos, solventes e

tóxicos tendo ainda a vantagem de serem biodegradáveis.

As enzimas usadas com maior freqüência são as proteases

(degradam ligações peptídicas), l ipases (decompõem lipídeos), celulases

(degradam celulose e atuam nas f ibras do tecido) e as amilases

(degradam o amido e outros glucídios de outros carboidratos).

O substrato amido:

O amido é um polissacarídeo de reserva em maior quantidade nas

plantas de duas formas: a α-amilose e a amilopectina em uma proporção

aproximada de 4:1. Na digestão o amido é decomposto pelas enzimas

amilases presentes na saliva e no suco pancreático por meio de hidrólise

em carboidratos menores. O rompimento das l igações gl icosídicas α-1,4

da amilose origina uma mistura de maltose, amilopectina e gl icose. Essa

amilopectina também é rompida formando polissacarídeos chamados de

dextrinas. O amido é encontrado na forma de grãos nas sementes,

caules, raízes, entre outros, de algumas plantas como trigo, fei jão,

arroz, milho, mandioca e outras.

Espectrofotômetro e análise especrtofotométrica:

Os espectrofotômetros são instrumentos que permitem selecionar

o comprimento de onda (lâmbda) da radiação adequado à análise de um

determinado componente e medir a intensidade I do feixe emergente

que corresponde a um determinado feixe incidente Io, convertendo o

sinal recebido no detector em medida de absorbância para o

comprimento de onda da análise e desse modo determinar a

concentração de uma espécie em solução a partir do gráfico da variação

de absorbância (ou transmitância) em função da concentração de várias

soluções-padrão.

Este tipo de análise baseia-se nos princípios da espectroscopia de

absorção, na qual a concentração de uma solução é determinada a partir

do número de moléculas presentes capazes de absorver luz em um

determinado comprimento de onda. O equipamento uti l izado para essa

determinação é o espectrofotômetro que é capaz de fazer medições nas

regiões ultravioleta e visível, obtendo os valores das absorbâncias.

A precisão dos comprimentos de onda para análise é chamada de

banda de passagem, mais comum na ordem de 10nm. O espectro da

análise mais comum é de 360nm a 1000nm para a faixa visível.

METODOLOGIA:

MATERIAIS UTILIZADOS:

Cubeta;

Pipetas de 2 e 10 mL graduadas;

Erlenmeyer de 100 mL;

Bastão de vidro;

Bomba de sucção (pêra);

Tubos de ensaio;

Estante;

Espectrofotômetro a 550 nm;

Banho Maria a 42°C e a 96°C;

Solução de detergente enzimático (ASSIM) a 2%;

Tampão fosfato a 0,1M, pH = 7,0;

Amido solúvel;

Água desti lada;

Reagente DNS;

Amostra de saliva.

MÉTODOS:

o Preparar uma solução de detergente em pó (ASSIM) a 2%;

o Preparar soluções de saliva enzimática substituindo-se o detergente pela sal iva nas soluções;

o Montar tubos de ensaio conforme as tabela seguintes:

Reagentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5Detergente 2% 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mLTampão fosfato a 0,1M 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL 3 mLAmido solúvel 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mLIncubação a 42°C 0 min. 5 min. 10 min. 20 min. 30 min.Reagente DNS 1,5 mL 1,5 mL 1,5 mL 1,5 mL 1,5 mLIncubação a 96°C 5 min. 5 min. 5 min. 5 min. 5 min.Resfriamento Resfriar Resfriar Resfriar Resfriar ResfriarÁgua desti lada (H 2O) 14 mL 14 mL 14 mL 14 mL 14 mLT A B E L A D A S S O L U Ç Õ E S C O M O D E T E R G E N T E .

o Foram feitas as leituras da amostra (3 mL) em 550 nm após adições, os tempos de incubação e a diluição das amostras;

o Obtém-se uma amostra de saliva;

o D e s t a v e z p r e p a r a m - s e t u b o s d e e n s a i o c o n t e n d o s a l i v a a o i n v é s d o d e t e r g e n t e .

Reagentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3Amostra de saliva 1 mL 1 mL 1 mLTampão fosfato a 0,1M 3 mL 3 mL 3 mLAmido solúvel 2 mL 2 mL 2 mLIncubação a 42°C 5 min. 10 min. 30 min.Reagente DNS 1,5 mL 1,5 mL 1,5 mLIncubação a 96°C 5 min. 5 min. 5 min.Resfriamento Resfriar Resfriar ResfriarÁgua desti lada (H 2O) 14 mL 14 mL 14 mLT A B E L A D A S S O L U Ç Õ E S C O M A S A L I V A .

o Fazer as leituras da amostra (3 mL) em 550 nm após as adições, os tempos de incubação e a diluição das amostras.

RESULTADOS E DISCUSSÕES:

No dado experimento verif icou-se a ação da enzima amilase sobre o

substrato amido, produzindo uma mistura de maltose, amilopectina,

gl icose e uma mistura de polissacarídeos denominados dextrinas. Sendo

as enzimas biocatalizadores com grande especificidade tanto com

relação ao substrato quanto ao pH e a temperatura, foram reproduzidas

as mais próximas possíveis, as condições de manutenção da integridade

da enzima em análise. Tais condições foram proporcionadas pelo uso do

tampão fosfato de pH 7,0 e um banho-maria na temperatura de 42°C.

Ao sair do aquecimento a 42°C foi adicionado ao tubo de ensaio o

reagente DNS que proporcionou a coloração alaranjada na solução

essencial na determinação espectrofotométrica, visto que não há

absorção alguma de luz em substâncias incolores. A segunda etapa de

incubação tinha como objetivos paralisar a ação da enzima por meio de

desnaturação protéica e f ixar a cor nos produtos da reação favorecendo

assim a identif icação no aparelho da espécie que se quer determinar.

O d e t e r g e n t e e m p ó u t i l i z a d o q u e c o n t i n h a a a m i l a s e f o i o d a m a r c a A S S I M q u e a p ó s a s f a s e s

d o t e s t e a p r e s e n t o u o s r e s u l t a d o s q u e f o r a m o b t i d o s a t r a v é s d o e s p e c t r o f o t ô m e t r o e r e p r e s e n t a a

a v a l i a ç ã o d a a t i v i d a d e d a a m i l a s e e m f u n ç ã o d o t e m p o d e c o n t a t o c o m o s u b s t r a t o a m i d o s o l ú v e l

g e l a t i n i z a d o . ( T A B E L A 1 ) E ( G R Á F I C O 1 )

Absorbâncias dos produtos resultantes da ação da amilase medidas no espectrofotômetro

Tubo Tempo de incubação a 42°C Absorbância a 550 nm1 0 minutos 0,0912 5 minutos 0,0903 10 minutos 0,0304 20 minutos 0,0465 30 minutos 0,021

T A B E L A 1 : R E S U L T A D O S D A A B S O R B Â N C I A C O M A U T I L I Z A Ç Ã O D O D E T E R G E N T E A S S I M E M F U N Ç Ã O D O

T E M P O O B T I D O S C O M A U X Í L I O D O E S P E C T R O F O T Ô M E T R O .

G R Á F I C O 1 : R E S U L T A D O S D A S A B S O R B Â N C I A S C O M A S R E S P E C T I V A S M A R G E N S D E E R R O .

O ideal seria se os valores das absorbâncias assumissem uma ordem

crescente juntamente com o passar do tempo (em relação à incubação a

42°C – atividade ótima) o que indica um maior aproveitamento da ação

enzimática. Os maiores tempos de permanência na incubação a 42°C

proporcionam uma coloração mais intensa por motivos já vistos, o que

reflete na adição do reagente DNS e posteriormente na incubação a 96°C

a qual vai desnaturar as proteínas, ou seja, quanto maior o

aproveitamento enzimático mais produtos serão formados e

conseqüentemente mais intensa a coloração ao desnaturar.

No gráfico foi feita uma regressão l inear para a obtenção da reta

que mais se adaptava aos pontos que estão deslocados e não mantinham

uma constância de crescimento.

A incoerência dos dados obtidos podem ter sido decorrentes de

alguns erros na execução do experimento, como pipetagem e a

imprecisão das temperaturas do banho-maria. Além de problemas

menores, como a não solubil ização total dos reagentes.

N o s t u b o s o n d e a f o n t e d e e n z i m a ( a m i l a s e ) p a s s a a s e r a s a l i v a o b t e v e - s e r e s u l t a d o s

e s p e r a d o s , o u s e j a , c o n s t a n t e c r e s c i m e n t o c o m p r o v a n d o a a ç ã o e n z i m á t i c a e s p e r a d a . ( T A B E L A 2 ) E

( G R Á F I C O 2 ) .

Absorbâncias dos produtos resultantes da ação da amilase da saliva medidas no espectrofotômetro

Tubo Tempo de incubação a 42°C Absorbância a 550 nm1 5 minutos 0,1102 20 minutos 0,2083 30 minutos 0,295

T A B E L A 2 : R E S U L T A D O D A A B S O R B Â N C I A D A S A L I V A E M F U N Ç Ã O D O T E M P O .

G R Á F I C O 2 : R E S U L T A D O D A S A B S O R B Â N C I A S S E M N E C E S S I D A D E D A S M A R G E N S D E E R R O P E L A O B T E N Ç Ã O D E U M R E S U L T A D O P R E C I S A M E N T E L I N E A R .

CONCLUSÃO:

A partir do experimento pode-se constatar a indispensabil idade de

enzimas nas atividades biológicas, além de avaliar a veracidade de

informações contidas nos rótulos das embalagens dos detergentes

comercial izados, garantindo assim, a presença das enzimas indicadas.

Pode-se confirmar também a presença de enzimas na saliva, a

partir dos resultados obtidos com o experimento, percebendo uma

maior ação enzimática em relação ao detergente em pó devido a uma

maior concentração de enzimas na saliva que formaram mais produtos e,

conseqüentemente, após a medição no espectrofotômetro verif icamos

que os valores das absorbâncias assumiram valores maiores que os

valores das absorbâncias dos tubos com detergente em pó.

BIBLIOGRAFIA:

LEHNINGER, Albert L. Lehninger princípios de bioquímica. 4ª Ed. –

São Paulo – SAVIER, 2006;

MARZZOCO, Anita e TORRES, B. Baptista; Bioquímica básica, 2ª Ed.;

Editora Guanabara Koogan – Rio de Janeiro, 1999;

BAYNES, John; DOMINICZAK, Marek H. Bioquímica Médica. 1ª Edição

brasi leira: Editora Manole