FERNANDA ERRERO PORTO

ESTUDO CITOGENÉTICO E DE POLIMORFISMO

CROMOSSÔMICO EM POPULAÇÕES DO GÊNERO Rineloricaria

(LORICARIIDAE, SILURIFORMES) DA BACIA DO RIO PARANÁ .

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Ciências Biológicas (área de concentração – Biologia Celular), da Universidade Estadual de Maringá para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas.

Maringá-Paraná 2007

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FERNANDA ERRERO PORTO

ESTUDO CITOGENÉTICO E DE POLIMORFISMO

CROMOSSÔMICO EM POPULAÇÕES DO GÊNERO Rineloricaria

(LORICARIIDAE, SILURIFORMES) DA BACIA DO RIO PARANÁ .

ORIENTADORA: Prof .a Dr.a

Isabel Cristina Martins dos Santos

CO-ORIENTADORA: Prof .a Dr.a

Ana Luiza de Brito Portela Castro

Maringá-Paraná 2007

Dedico a Deus, a minha família e

ao meu namorado Fábio

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pelas graças recebidas e por estar sempre presente

fortalecendo-me em todos os momentos da minha vida.

Sou profundamente agradecida aos meus pais pelo amor, compreensão, por

sempre me apoiarem e me incentivarem a nunca desistir dos meus objetivos. Eles são os

responsáveis por mais essa conquista.

Aos meus irmãos Rodrigo e Luciane, pela amizade, incentivo e apoio durante

todos os anos de estudo, também agradeço ao meu cunhado Ricardo pela ajuda e auxílio

em muitos trabalhos e a minha sobrinha Isabella pela alegria que trouxe em nossas

vidas.

A meu namorado Fábio, pelo tempo dedicado a mim, pela compreensão, por

compartilhar dos momentos mais importantes da minha vida e principalmente pelo

carinho e por me fazer feliz.

A professora Isabel Cristina Martins dos Santos, pela orientação, amizade,

dedicação e paciência, principalmente por sempre estar disposta a ajudar nos trabalhos

do laboratório e nas coletas, mas vale ressaltar a admiração que tenho por ela e pelo seu

trabalho.

Ao curso de pós-graduação em Ciências Biológicas e ao Departamento de

Biologia Celular e Genética, por ter dado condições para desenvolver este trabalho.

A CAPES, pelo apoio financeiro.

A professora Ana Luiza de Brito Portela Castro por toda amizade, auxílio e pela

disposição em ajudar e dar dicas e opiniões referentes ao trabalho.

Aos membros da banca examinadora, pelas críticas e sugestões.

Ao professor Cláudio Henrique Zawadzki pela ajuda nas coletas.

Aos colegas e amigos do laboratório de citogenética de peixes pelo agradável

convívio durante todos os anos da graduação e pós-graduação, Luciana, Sônia Carvalho,

Sônia Mizogushi, Leandro, Luiz Ricardo, Alaim, Valéria, Thiago, Giseli Fidelis, Paulo,

Lana, Marli, Kátia, Paula, Josicléia, em especial agradeço ao Alexandre, Edner, Ana

Paula, Renata, Carla e Leonardo pelas contribuições para realização deste trabalho e a

Maria José pelos conselhos, convivência e amizade.

Aos amigos Giselly Lacanallo, Greicy, Suzana, Ana Paula, Rafael, Mariana,

Judy e Fabiana por todos os bons momentos vividos e tornado os meus dias na UEM

ainda melhor.

A minha amiga querida Gislaine, pelos conselhos, cumplicidade e por ser esta

amiga com quem sempre posso contar.

Aos colegas e amigos da pós-graduação.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho.

APRESENTAÇÃO

Esta dissertação é composta por dois artigos, os quais foram concluídos a partir

de estudos citogenéticos de duas espécies do gênero Rineloricaria: Rineloricaria

pentamaculata (rio Keller e córregos Tatupeba e Tauá) e Rineloricaria latirostris do

ribeirão Maringá, todos pertencentes à bacia do rio Paraná. Cada artigo está diagramado

de acordo com as normas da revista a qual será submetido para publicação.

Capítulo I - Análise citogenética em duas espécies do gênero Rineloricaria

(LORICARIIDAE, SILURIFORMES) da bacia do rio Paraná. Errero-Porto F., Portela-

Castro A. L. B., Zawadzki C. H. e Martins-Santos I. C. Artigo a ser enviado para

publicação na revista Genetica.

Capítulo II - Ocorrência de cromossomos B em Rineloricaria pentamaculata

(LORICARIIDAE, SILURIFORMES) da bacia do rio Paraná. Errero-Porto F., Portela-

Castro A. L. B., Zawadzki C. H. e Martins-Santos I. C. Artigo a ser enviado para

publicação na revista Genetics and Molecular Biology.

RESUMO

No presente trabalho foram realizados estudos citogenéticos em duas espécies do

gênero Rineloricaria: R. latirostris (ribeirão Maringá) e R. pentamaculata (rio Keller e

córregos Tatupeba e Tauá). R. latirostris mostrou número diplóide de 2n=46

cromossomos distribuídos em 14m/sm + 32st/a e número fundamental (NF) igual a 60.

A análise de Ag-NOR mostrou um sistema de NOR simples localizada na região

intersticial do braço curto do segundo par de cromossomos meta-submetacêntricos. Em

R. pentamaculata a análise das três populações mostrou um número diplóide de 2n=56

cromossomos com fórmula cariotípica de 8m/sm + 48st/a e NF=64. No entanto, um

heteromorfismo estrutural esteve presente em 3 indivíduos da população do córrego

Tauá que apresentaram fórmula cariotípica de 9m/sm + 47st/a e NF=65, devido a

presença de um cromossomo submetacêntrico grande e um acrocêntrico pequeno. Em

relação à região organizadora do nucléolo a análise pelas técnicas de Ag-NOR, CMA3 e

FISH mostrou um sistema de NOR simples para as populações de R. pentamaculata do

rio Keller e córrego Tauá, enquanto que para população do córrego Tatupeba foi

detectado NOR múltipla presentes no primeiro e quarto pares de cromossomos subtelo-

acrocêntricos (5 e 8 respectivamente). O padrão de heterocromatina constitutiva em R.

pentamaculata foi detectado principalmente nas regiões pericentroméricas; contudo,

marcações teloméricas e intersticiais também foram observadas em alguns

cromossomos. No par heteromórfico da população do córrego Tauá, a heterocromatina

foi evidenciada em posição telomérica e centromérica no cromossomo acrocêntrico e na

região telomérica no braço curto do cromossomo submetacêntrico.

Além disso, foram observados cromossomos B em Rineloricaria pentamaculata

do córrego Tauá. Estes foram do tipo acrocêntrico pequeno, menores do que os

cromossomos do complemento A, e variaram de 0 a 3 em células mitóticas de 4

indivíduos e de 0 a 7 nas células meióticas. Pela técnica de banda C pode-se observar

que os mesmos são totalmente heterocromáticos. O estudo de células meióticas,

mostrou cromossomos bivalentes e cromossomos univalentes em 54,9% das células de

três indivíduos machos.

Diante disso, os estudos realizados em Rineloricaria pentamaculata de

diferentes populações, mostraram mesmo número diplóide e fórmula cariotípica, no

entanto, cada uma delas apresentou uma característica diferente. Enquanto a populações

do rio Keller e córrego Tauá o sistema de NOR foi simples, a do córrego Tatupeba

mostrou sistema de NOR múltipla. Além disso, na população do córrego Tauá foi

detectado um polimorfismo cromossômico devido à presença de cromossomos B e

heteromorfismo estrutural pela presença de um par heteromórfico.

ABSTRACT

In the present paper citogenetic studies were accomplished two species of the

genus Rineloricaria: R. latirostris (Maringá stream) and R. pentamaculata (Keller river,

Tatupeba, and Tauá streams). R. latirostris showed diploid number of 2n=46

chromosomes distributed in 14m/sm + 32st/a and fundamental number (NF) equal 60.

The Ag-NOR analysis showed a simple NOR system located in the interstitial region in

the short arm of the meta-submetacentric chromosomes (second pair). In R.

pentamaculata analysis of all the three populations showed diploid number of 2n=56

chromosomes, with karyotypic formula of 8m/sm + 48st/a and NF=64. However, a

structural heteromorphism was present in 3 individuals (50%) of the population of the

Tauá stream that presented karyotypic formula of 9m/sm + 47st/a and NF=65, due to the

presence of a large submetacentric chromosome and a small acrocentric one. In relation

to the nucleolar organizing region the analysis of Ag-NOR, CMA3 and FISH techniques

showed a simple NOR system for the populations of R. pentamaculata of the Keller

river and Tauá streams, while the population of the Tatupeba stream presented multiple

NOR detected in the first and fourth pairs of subtelo-acrocentric chromosome (5 e 8

respectively). The constitutive heterochromatin pattern in R. pentamaculata was

distributed mainly in the pericentromeric regions; however, telomeric and interstitial

marked regions were also observed for some chromosomes. In the heteromorphic pair

of the Tauá population, the heterochromatin was present in the centromeric and

teloméric position of the acrocêntrico and in the telomérica region in the short arm of

the submetacentric chromosome.

In addition to these B chromosomes were observed in Rineloricaria

pentamaculata of the Tauá population. These chromosomes were of the small type

acrocentric and varied from 0 to 3 in mitotic cells of 4 individuals (66,66%) and from 0

to 7 in the meiotic cells. Through the C-banding technique B chromosomes were

observed to be totally heterochromatic. The study of meiotic cells showed univalent

chromosomes in 54, 9% of the cells of three male individuals.

Before the present study, Rineloricaria pentamaculata of different populations

showed the same diploid number and karyotypic formula. However, in the study, each

one presented different characteristics. While for Keller and Tauá populations the NOR

system was simple, the Tatupeba population showed a multiple NOR system. Besides

this, the population of the Tauá stream showed chromosomic polymorphism detected by

the presence of B chromosomes and structural heteromorphism.

CAPÍTULO I

ANÁLISE CITOGENÉTICA EM DUAS ESPÉCIES DO GÊNERO

Rineloricaria (LORICARIIDAE, SILURIFORMES) DA BACIA DO

RIO PARANÁ.

Fernanda Errero Porto, Ana Luiza de Brito Portela Castro, Cláudio Henrique Zawadzki e Isabel Cristina Martins dos Santos.

Análise citogenética em duas espécies do gênero Rineloricaria (Loricariidae,

Siluriformes) da bacia do rio Paraná.

Fernanda Errero Porto1, Ana Luiza de Brito Portela Castro1, Cláudio Henrique

Zawadzki2 & Isabel Cristina Martins dos Santos1.

1Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá,

Avenida Colombo 5790, 87020-900 Maringá-Pr, Brasil. (E-mail:

ferreroporto@yahoo.com.br).

2Departamento de Biologia, Universidade Estadual de Maringá, Avenida Colombo

5790, 87020-900 Maringá-Pr, Brasil.

Palavras-chave: citogenética, Loricariidae, polimorfismo, Rineloricaria.

Resumo

No presente trabalho foram realizados estudos citogenéticos em duas espécies do

gênero Rineloricaria: R. latirostris (ribeirão Maringá) e R. pentamaculata (rio Keller e

córregos Tatupeba e Tauá). R. latirostris apresentou número diplóide de 2n=46

cromossomos distribuídos em 14m/sm + 32st/a e número fundamental (NF) igual a 60.

Através da técnica de Ag-NOR foi detectado um sistema de NOR simples localizada na

região intersticial do braço curto do segundo par de cromossomos do tipo meta-

submetacêntrico. As três populações R. pentamaculata mostraram um número diplóide

de 2n=56 cromossomos com fórmula cariotípica de 8m/sm + 48st/a e NF=64. No

entanto, um heteromorfismo estrutural esteve presente em 3 indivíduos da população do

Tauá que apresentaram fórmula cariotípica de 9m/sm + 47st/a e NF=65, devido a

presença de um par de cromossomos submetacêntrico grande e um acrocêntrico

pequeno. Em relação à região organizadora do nucléolo as técnicas de Ag-NOR, CMA3

e FISH mostrou um sistema de NOR simples para as populações de R. pentamaculata

do rio Keller e córrego Tauá. Entretanto, os indivíduos da população do córrego

Tatupeba revelaram um sistema de NOR múltipla, presentes no primeiro par e quarto

par de subtelo-acrocêntricos (5 e 8 respectivamente). O padrão de heterocromatina

constitutiva em R. pentamaculata esteve distribuído principalmente nas regiões

pericentroméricas e, além disso, marcações teloméricas e intersticiais também foram

observadas para alguns cromossomos. No par heteromórfico da população do córrego

Tauá, a heterocromatina foi evidenciada em posição telomérica e centromérica no

cromossomo acrocêntrico e na região telomérica no braço curto do cromossomo

submetacêntrico.

Introdução

A família Loricariidae é uma das maiores famílias de peixes de água doce da

região Neotropical, estendendo-se da Costa Rica até o norte da Argentina,

compreendendo cerca de 683 espécies distribuídas em seis subfamílias e

aproximadamente 70 gêneros (Isbrucker, 1980; Reis, Sven & Ferraris, 2003). Estes

peixes são caracterizados por apresentarem hábitos predominantemente bentônicos,

corpo coberto por várias séries de placas ósseas e boca inferior (Isbrucker, 1980; Reis,

Sven & Ferraris, 2003). Dentre as subfamílias, destaca-se a Loricariinae, composta de

31 gêneros e 209 espécies de cascudos de pequeno porte, sendo caracterizada por

apresentar pedúnculo caudal deprimido, nadadeira adiposa ausente e com um alto

dimorfismo sexual entre as espécies (Isbrucker, 1980; Reis, Sven & Ferraris, 2003).

Estudos citogenéticos foram realizados em cinco gêneros desta subfamília: Loricaria,

Loricariichthys, Sturisoma, Rineloricaria e Harttia, revelando uma grande

variabilidade cariotípica, tanto do ponto de vista numérico, quanto em relação à

estrutura cariotípica, além de um alto número de cromossomos acrocêntricos (Artoni &

Bertollo, 2001; Alves, Oliveira & Foresti, 2003).

O gênero Rineloricaria abrange cerca de 48 espécies descritas (Froese & Pauly,

2006), no entanto, apenas algumas espécies foram estudadas citogeneticamente,

observando-se uma grande variação no número diplóide. Análise citogenética em

espécies do gênero mostrou variações do número diplóide de 2n=36 em R. latirostris

(Giuliano-Caetano, 1998) à 2n=70 cromossomos em Rineloricaria n.sp. (Alves,

Oliveira & Foresti, 2003). Em estudos realizados em duas espécies de Rineloricaria,

observou-se uma grande diversidade cariotípica em R. latirostris, com a presença de

14 citótipos diferentes, presentes em 4 populações, com número diplóide variando

entre 2n=36 a 2n=48 e manutenção do número fundamental (NF) igual a 60 (Giuliano-

Caetano, 1998). Em R. pentamaculata do rio Keller (PR), o número diplóide manteve-

se constante com 2n=56 cromossomos e NF igual a 64 (Giuliano-Caetano, 1998).

Esses dados sugerem que o principal mecanismo de evolução cariotípica no gênero

seja devido a rearranjos do tipo robertsonianos (Giuliano-Caetano, 1998).

Considerando as descrições sobre a variabilidade cromossômica existente no

grupo, este trabalho teve como objetivo o estudo citogenético de duas espécies do

gênero Rineloricaria da bacia do rio Paraná, a fim de compreender as variações

numéricas ocorridas neste gênero e estabelecer os mecanismos de rearranjos

cromossômicos envolvidos durante o processo de diferenciação do grupo, assim como

as relações evolutivas do mesmo.

Materiais e Métodos

No presente estudo foram analisadas quatro populações do gênero Rineloricaria,

sendo três de Rineloricaria pentamaculata dos córregos Tatupeba (sub-bacia do Ivaí) e

Tauá (sub-bacia do Pirapó) e rio Keller (sub-bacia do rio Ivaí) e uma população de

Rineloricaria latirostris do ribeirão Maringá (sub-bacia do rio Pirapó).

As preparações dos cromossomos mitóticos foram obtidas de células retiradas do

rim, conforme a técnica descrita por Bertollo, Takahashi & Moreira-Filho (1978). O

padrão da heterocromatina constitutiva foi caracterizado de acordo com a técnica de

banda C descrita por Sumner (1972). As regiões organizadoras do nucléolo foram

detectadas pelo método de impregnação por nitrato de prata (AgNOR) descrita por

Howell & Black (1980), coloração com cromomicina A3 (CMA3), fluorocromo GC

específico, segundo a técnica de Schmid (1980) e pela técnica de hibridação

fluorescente in situ (FISH), usando sondas de DNAr 18S, seguindo a metodologia

descrita por Heslop-Harrison et al., (1991) e Cuadrado & Jouvre (1994). Os

cromossomos foram identificados de acordo com os critérios de relação de braços (RB),

proposto por Levan, Fredga & Sandberg (1964) e classificados como metacêntricos (m),

submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a). Para o cálculo do

número fundamental (NF), os cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e foram

considerados portadores de 2 braços, enquanto os subtelocêntricos e acrocêntricos

portadores de 1 único braço.

Resultados

As três populações de R. pentamaculata estudadas mostraram um número

diplóide de 2n=56 cromossomos. Foram analisados 24 indivíduos do córrego Tatupeba,

20 do rio Keller e 6 do córrego Tauá, cuja fórmula cariotípica correspondeu a 8m/sm +

48st/a e número fundamental (NF) igual a 64 (Figura 1a). Contudo, 3 (50%) indivíduos

da população do córrego Tauá apresentaram uma fórmula cariotípica igual a 9m/sm +

47st/a e NF=65; esta diferença no cariótipo, se deve a ocorrência de um provável par

heteromórfico, sendo um submetacêntrico grande e um acrocêntrico pequeno,

encontrado em machos e fêmeas (Figura 1b). Em R. latirostris do ribeirão Maringá o

número de cromossomos foi de 2n=46 arranjados em 14m/sm + 32st/a e NF igual a 60

(Figura 2). O estudo da região organizadora do nucléolo em R. latirostris, através da

coloração por nitrato prata evidenciou NOR simples intersticial localizada no braço

curto do segundo par de cromossomos meta-submetacêntricos (Figura 3).

A análise da NOR em R. pentamaculata, através das técnicas de impregnação

por nitrato de prata (AgNOR), hibridação in situ (FISH), e cromomicina (CMA3),

revelou um sistema de NOR simples nas populações do córrego Tauá e rio Keller,

abrangendo todo o braço curto do primeiro par de cromossomos subtelo-acrocêntricos,

que frequentemente mostrou um heteromorfismo de tamanho para esta região (Figura 4:

a, b e d). Na população do córrego Tatupeba, foram evidenciados três cromossomos

marcados pela prata e CMA3 e quatro pelo FISH (primeiro par e o quarto par de

subtelo-acrocêntricos, Figura 5: a, b e d), caracterizando um sistema de NOR múltipla.

O padrão da heterocromatina constitutiva das três populações de R.

pentamaculata foi detectado principalmente em regiões pericentroméricas. Além disso,

alguns blocos de heterocromatina teloméricos e intersticiais ocorreram em

cromossomos acrocêntricos e o par portador da NOR apresentou blocos de

heterocromatina associados com esta região (Figura 4c, 5c e 6a), bem como uma

marcação intersticial no braço longo (Figura 6a).

Na população do córrego Tauá os indivíduos polimórficos apresentaram

marcações teloméricas e centroméricas no cromossomo acrocêntrico e na região

telomérica no braço curto do cromossomo submetacêntrico do par heteromórfico

(Figura 6b).

Figura 1 - Cariótipo convencional de Giemsa de Rineloricaria pentamaculata: (a)

Cariótipo representativo das populações do córrego Tatupeba, Tauá e do rio Keller e (b)

Cariótipo demonstrando um polimorfismo cromossômico na população do córrego

Tauá.

Figura 2 – Cariótipo convencional de Giemsa de Rineloricaria latirostris do ribeirão

Maringá.

Figura 3 - Metáfase somática submetida ao tratamento com nitrato de prata de

Rineloricaria latirostris do ribeirão Maringá. Setas indicando o par da NOR intersticial.

Figura 4 – Metáfases somáticas representativas das populações de R. pentamaculata do

rio Keller e córrego Tauá, obtidas pelo tratamento com nitrato de prata (a); FISH com

sonda de DNAr 18S (b); banda-C (c) e CMA3 (d). As setas indicam os cromossomos

portadores da NOR e as pontas de setas as marcações teloméricas e intersticiais.

Figura 5 – Metáfases somáticas de R. pentamaculata do córrego Tatupeba, obtidas pelo

tratamento com nitrato de prata (a); FISH com sonda de DNAr 18S (b); banda-C (c) e

CMA3(d). As setas indicam os cromossomos portadores da NOR e as pontas de setas as

marcações teloméricas e intersticiais.

Figura 6 – Banda C em cromossomos de R. pentamaculata: a) par portador NOR

representativo das três populações (córregos Tatupeba, Tauá e rio Keller); b) par de

cromossomos heteromórficos encontrados na população do córrego Tauá.

Discussão

Estudos citogenéticos são escassos na família Loricariidae tendo sido realizados

em cerca de 70 espécies, demonstrando uma alta diversidade cariotípica com número

diplóide variando de 2n=36 em R. latirostris (Giuliano-Caetano, 1998) a 2n=96 em

Upsilodus sp (Kavalco et al., 2005), indicando que fusão e fissão foram os principais

rearranjos ocorridos durante a diversificação do grupo acompanhados de outros tipos de

rearranjos que modificam o número fundamental. Contudo, o número diplóide de 2n=54

cromossomos, sendo a maioria do tipo meta-submetacêntrico, é considerado

característica primitiva para esta família e neste caso outros tipos de rearranjos têm sido

sugeridos para explicar o processo evolutivo deste grupo (Kavalco et al., 2005).

As populações de R. pentamaculata analisadas no presente trabalho

apresentaram número diplóide de 2n=56 cromossomos, sendo a maioria de subtelo-

acrocêntricos. O gênero Rineloricaria conta com 48 espécies válidas (Froese e Pauly,

2006), mas apenas 5 destas e 2 não descritas foram estudadas citogeneticamente com

número diplóide variando de 2n= 36 a 2n= 70 cromossomos (Tabela 1), indicando que

assim como na subfamília os processos de fissão e fusão cêntrica e inversão pericêntrica

foram os que mais contribuíram para evolução cariotípica do grupo (Artoni e Bertollo,

2001; Kavalco et a., 2005). Um exemplo típico da ocorrência de polimorfismo

cromossômico robertsoniano é encontrado em R. latirostris que mostra uma variação de

2n=36 a 2n=48 cromossomos (Giuliano-Caetano, 1998), cujo número de metacêntricos

é inversamente proporcional ao número diplóide e NF constante igual a 60. No gênero,

a grande diversidade e o pouco número de espécies analisadas citogeneticamente não

nos permite identificar um número cromossômico basal. Contudo, considerando que

71,4% (5 das 7) das espécies analisadas apresentam número diplóide superior a 2n=56

cromossomos (Tabela 1), podemos sugerir um número basal superior a este. Além

disso, exceto pelo caráter polimórfico presentes em algumas espécies, as análises

cariotípicas no gênero Rineloricaria mostram número de cromossomos e fórmula

cariotípica espécies-específica, que podem ser utilizadas como ferramentas auxiliares na

sistemática do grupo.

Embora o número diplóide das três populações de R. pentamaculata analisadas

no presente trabalho tenha se mantido constante, na população do córrego Tauá foi

detectado um polimorfismo cromossômico em 50% dos indivíduos, devido à presença

de um provável par de cromossomos submetacêntrico grande e um acrocêntrico

pequeno. A origem deste polimorfismo cromossômico pode ser sugerida a partir de dois

eventos consecutivos: por uma não disjunção meiótica de um par de cromossomos

acrocêntricos de tamanho médio, originando uma trissômia; seguido de fusão de um

destes cromossomos com um homólogo de um par de acrocêntricos pequenos, dando

origem ao submetacêntrico extra no complemento. Estes eventos explicam a

manutenção do número diplóide de 2n=56 cromossomos e o aumento do NF de 64

(8m/sm+48st/a) para 65 (9m/sm+47st/a). Devido à ocorrência dos dois citótipos em

simpatria e sintopia seria de se esperar que um terceiro citótipo com dois cromossomos

submetacêntricos fosse encontrado a partir de cruzamentos panmíticos (figura 7). A

ausência da terceira forma, provavelmente se deve a um maior desequilíbrio genético

pela presença de genes oriundos de 4 cromossomos acrocêntricos de tamanho médio (2

acrocêntricos médios livres e 2 que formam o submetacêntrico (figura 7), mantendo o

número diplóide mas com NF igual a 66 (10m/sm+46st/a). Contudo, não podemos

descartar que a ausência deste citótipo se deva à possibilidade de estarmos lidando com

uma pequena amostra.

Em relação à região organizadora do nucléolo as populações do córrego Tauá e

rio Keller apresentaram NOR simples na posição terminal do primeiro par de

cromossomos subtelo-acrocêntricos, para os três métodos de análise utilizados no

estudo desta região (prata, CMA3 e FISH). Esta posição da NOR é encontrada em todas

as espécies da subfamília Loricariinae estudadas até o presente momento para os

gêneros Harttia (Kavalco et al., 2005; Alves et al., 2003), Rineloricaria (Maia et al,

2006; Rodrigues et al 2006; Alves et al., 2003; Giuliano-Caetano, 1998),

Loricariichthys, (Maia et al., 2006; Scavone e Júlio Jr., 1995; Fenocchio, 1993),

Loricaria (Scavone M. D. P. e Ferreira Julio Jr., 1993/1994) e Sturisoma (Artoni e

Bertollo, 2001) e corroboram os dados da família Loricariidae, no qual esta é uma

característica encontrada na maioria das espécies, considerada como plesiomórfica no

grupo (Artoni e Bertollo, 1996). Além disso, um heteromorfismo de tamanho das

regiões organizadoras de nucléolo também foi observado nestas duas populações de R.

pentamaculata (rio Keller e córrego Tauá) e detectado em outras espécies de

Rineloricaria, tal como, R. latirostris (Giuliano-Caetano, 1998) e R. kronei (Alves,

2003), originado provavelmente por crossing-over desigual ou transposição de gene

nesta região.

Na população do córrego Tatupeba este heteromorfismo de NOR não foi

observado, mas mostrou pela análise de FISH um sistema de NOR múltipla, presente

em quatro cromossomos subtelo-acrocêntricos, enquanto que com impregnação por

nitrato de prata apenas três cromossomos se mostraram ativos. Este sistema ainda não

havia sido detectado no gênero Rineloricaria e na subfamília Loricariinae e

provavelmente, deve ter se originado por mecanismos de translocação de genes rDNA,

duplicados em tandem nas outras populações da espécie e colocados em sistema de

NOR múltipla na população do Tatupeba. Segundo Schweizer e Loidl (1987), a

proximidade entre as regiões teloméricas dentro do núcleo interfásico facilitaria a

transferência de material genético entre os cromossomos. NOR múltipla tem sido

verificada na família Loricariidae e é considerado um caráter apomórfico (Artoni et al.,

2001).

O padrão de heterocromatina constitutiva em R. pentamaculata foi semelhante

nas três populações analisadas, sendo detectados blocos pequenos de heterocromatina

teloméricas e intersticiais em alguns cromossomos e, presente, principalmente nas

regiões pericentroméricas da maioria dos cromossomos. A região da NOR apresentou-

se totalmente heterocromática, como observado em R. latirostris (Giuliano-Caetano,

1998) e em outras espécies da subfamília Loricariinae como Loricariichthys

platymetopon (Scavone & Júlio Jr., 1995) e Harttia loricariformis (Kavalco et al.,

2004). Uma banda C intersticial também esteve presente no par da NOR desta espécie

(primeiro par de subtelo-acrocêntrico). Contudo, na população do córrego Tatupeba que

apresentou NOR múltipla com rDNA distribuídos em 4 cromossomos pelo método de

FISH, sendo que em apenas 3 esta região foi banda C+, CMA3+ e corados pela prata,

indicando que a heterocromatina desta região é ricas em GC e que o cromossomo no

qual esta região foi Ag-NOR negativo, CMA3- e não heterocromática, provavelmente

deve ser o cromossomo com a NOR inativa que perdeu o segmento heterocromático

juntamente com regiões reguladoras dos genes rDNA do mesmo.

O par heteromórfico da população do córrego Tauá também mostrou marcações,

telomérica e centromérica no cromossomo acrocêntrico e em posição telomérica no

braço curto do cromossomo submetacêntrico. O padrão de marcação de heterocromatina

deste par reforça a hipótese da origem por fusão de um dos homólogos a um

submetacêntrico originado por não disjunção.

Diante disso, os estudos realizados em Rineloricaria pentamaculata de

diferentes populações, mostraram número diplóide de 2n=56 cromossomos e fórmula

cariotípica similar com particularidades na estrutura cromossômica, no entanto, cada

uma delas apresentou uma característica diferente. Enquanto a populações do rio Keller

e córrego Tauá o sistema de NOR foi simples, a do córrego Tatupeba mostrou sistema

de NOR múltipla. Além disso, na população do córrego Tauá foi detectado um

polimorfismo cromossômico em 50% dos indivíduos da população.

As diferenças na estrutura cromossômica observadas entre as três populações

associadas ao fato de que se encontram isoladas geograficamente indicam uma

divergência genética, ainda que incipiente, contribuindo para a evolução cariotípica do

gênero.

Além desta espécie, também foi realizada análise citogenética em R. latirostris

do ribeirão Maringá que mostrou número diplóide de 2n=46 com 14 cromossomos

meta-submetacêntricos e 32 subtelo-acrocêntricos. A região organizadora de nucléolo

foi intersticial localizada no segundo par de cromossomos meta-submetacêntricos e

corroboram os dados da literatura para família Loricariidae, no qual em 25% dos

indivíduos estudados foi verificado a NOR nesta posição (Kavalco et al., 2005).

Contudo, dentro do gênero foi à única espécie com NOR nesta posição. Giuliano-

Caetano (1998), analisando esta espécie em três populações do rio Mogi-Guaçu (SP),

Três Bocas (PR) e Passa-Cinco (SP) observou uma diversidade cariotípica de número

diplóide de 2n=36 a 2n=48 cromossomos e nas fórmulas cariotípicas, no entanto, com

mesmo número fundamental, indicando um polimorfismo inter e intrapopulacional

devido a rearranjos robertsonianos, que foram agrupados em 14 citótipos diferentes.

Entre aqueles com número diplóide de 2n=46 cromossomos encontrou dois citótipos

diferentes nos rios Três Bocas e Passa-Cinco, que foram denominados de I e II,

respectivamente. O cariótipo observado no presente trabalho mostra uma semelhança

correspondente ao citótipo II, estudado pela autora.

Assim, as análises citogenéticas realizadas para o grupo mostram, com exceção

de R. latirostris, um alto número diplóide variando de 2n=56 a 2n=70, com variações de

número fundamental, indicando que assim como a família os principais mecanismos de

evolução cariotípica no gênero foram os rearranjos de fusão e fissão, acompanhados por

outros que alteram a fórmula cariotípica. Além disso, a posição terminal da NOR nestas

espécies indica um caráter plesiomórfico para o grupo, enquanto que em L. latirostris a

condição de NOR intersticial seria derivada.

O número diplóide de R. latirostris embora variável (2n=36 a 2n=48) é bem

menor que nas outras espécies (2n=56 a 2n=70, tabela 1) o que pode ser considerado

como um caráter de distinção entre elas. Além disso, a NOR na posição intersticial

também é, até o momento, exclusiva de R. latirostris. Desta forma, essas duas

características podem ser utilizadas como marcador espécie-específica e, portanto, uma

ferramenta citotaxonômica auxiliar.

Tabela 1 - Diversidade cariotípica no gênero Rineloricaria.

Espécie Localidade 2n Fórmula cariotípica ref

Rineloricaria n. sp rio Betari, SP 70 2sm + 68a 2 Rineloricaria sp rio São José, RJ 62 2sm + 60st/a 4 rio Paraíba do Sul, RJ 62 2sm + 60st/a 4 R. cadeae rio Guairá, RG 66 2m + 64st/a 2 R. cadeae Arroio do Ribeirão 62 2m + 3sm + 57st/a 3 Barra do Ribeirão 62 2m + 3sm + 57st/a 3 R. kronei rio Itapocu, SC 64 6m/sm + 58st/a 2 R. latirostris rio Passa-Cinco, SP 44-47 _ 1 R. latirostris rio Mogi-Guaçu, SP 36-40 _ 1 R. latirostris ribeirão Três Bocas, PR 43-48 _ 1 R. latirostris ribeirão Maringá, PR 46 14m/sm + 32st/a 5 R. pentamaculata ribeirão Keller, PR 56 8m/sm + 48st/a 1/5 R. pentamaculata córrego Tatupeba, PR 56 8m/sm + 48st/a 5 R. pentamaculata córrego Tauá, PR 56 8m/sm + 48st/a 5 córrego Tauá, PR 56 9m/sm + 47st/a 5 R. strigilata Arroio do Ribeirão 68 2m + 6sm + 60st/a 3

1- Giuliano-Caetano (1998); 2 - Alves et al. (2003); 3 - Maia et al. (2006); 4 - Rodrigues

et al. (2006); 5 - presente trabalho.

Figura 7 – Descendência (F1) de cruzamentos panmíticos entre indivíduos de R.

pentamaculata do córrego Tauá. Os citótipos em preto foram observados nesta

população ocorrendo em simpatria e sintopia. O citótipo em vermelho não foi

encontrado nesta população.

F M

8m/sm+48st/a 8m/sm+48st/a 9m/sm +47st/a

9m/sm +47st/a 9m/sm +47st/a 10m/sm +46st/a

5m/sm +23st/a 4m/sm +24st/a 4m/sm +24st/a

9m/sm +47st/a 8m/sm+48st/a 4m/sm +24st/a 8m/sm+48st/a

4m/sm +24st/a

5m/sm +23st/a

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CAPÍTULO II

OCORRÊNCIA DE CROMOSSOMOS B EM Rineloricaria

pentamaculata (LORICARIIDAE, SILURIFORMES) DA BACIA DO

RIO PARANÁ.

Fernanda Errero Porto, Ana Luiza de Brito Portela Castro, Cláudio Henrique

Zawadzki e Isabel Cristina Martins dos Santos.

Ocorrência de cromossomos B em Rineloricaria pentamaculata (Loricariidae,

Siluriformes) da bacia do rio Paraná.

Fernanda Errero Porto, Ana Luiza de Brito Portela Castro, Cláudio Henrique Zawadzki

e Isabel Cristina Martins dos Santos.

Departamento de Biologia Celular e Genética, Departamento de Biologia,

Universidade Estadual de Maringá, Avenida Colombo 5790, 87020-900 Maringá-Pr,

Brasil. (E-mail: ferreroporto@yahoo.com.br)

Resumo

No presente trabalho foram feitas análises citogenéticas para a caracterização de

cromossomos B em Rineloricaria pentamaculata do córrego Tauá, pertencente à sub-

bacia do rio Pirapó. O número diplóide variou de 2n=56 a 2n=59 cromossomos, devido

a presença de 0 a 3 cromossomos B, que estiveram presentes em 66,66% (4 espécimes)

dos indivíduos da população. Estes cromossomos apresentaram diferenças numéricas

inter e intraindividual e mostram-se totalmente heterocromático quando submetidos à

técnica de banda C. As células meióticas em metáfase I apresentaram cromossomos

bivalentes e 0 a 7 cromossomos univalentes em três indivíduos machos. Sendo

discutidos aspectos quanto à origem e comportamento destes cromossomos.

Palavras-chave: cromossomos B, heterocromatina, Loricariinae, Rineloricaria

pentamaculata, univalentes.

Introdução

Estudos citogenéticos realizados na família Loricariidae têm demonstrado uma

grande variabilidade cariotípica, com amplitude de números diplóides desde 2n=36

cromossomos em Rineloricaria latirostris (Giuliano-Caetano, 1998) até 2n=96

cromossomos em Upsilodus sp (Kavalco et al., 2005). Além disso, para alguns grupos,

tem sido relatada uma diversidade intra e interindividual devido a alterações

cromossômicas por rearranjos do tipo fusões ou fissões cêntricas como ocorre em

Rineloricaria latirostris (Giuliano-Caetano, 1998) e pela presença de cromossomos

supranumerários, restritos às subfamílias Hypoptopomatinae em Microlepidogaster

leucofrenatus (Andreata et al., 1993) e Loricariinae em Loricaria sp e Loricaria prolixa

(Scavone e Ferreira Julio, 1993-94).

Os cromossomos supranumerários e/ou cromossomos B são geralmente

caracterizados como: elementos adicionais e não homólogos ao complemento padrão;

não essenciais à sobrevivência do indivíduo; diferem morfologicamente dos

cromossomos do complemento A e não apresentam segregação mendeliana (Jones e

Rees, 1982). A origem desses cromossomos tem sido proposta a partir de cromossomos

do complemento padrão da espécie (Jones e Rees, 1982) ou através de cruzamentos de

espécies intimamente relacionadas. (Bataglia, 1994; McAllister e Werren, 1997;

Perfectti e Werren, 2000). A influência dos cromossomos B em um determinado

indivíduo pode ser parasítica, neutra ou possivelmente benéfica (Jones e Rees, 1982).

A ocorrência de cromossomos B tem sido mostrada em muitas famílias de

peixes da região Neotropical como em: Prochilodontidae, no qual foi feito à primeira

descrição destes cromossomos em Prochilodus lineatus citado como Prochilodus

scrofa, (Pauls e Bertollo, 1983); Curimatidae (Venere e Galetti Jr., 1985); Paradontidae

(Falcão et al., 1984); Characidae (Salvador e Moreira-Filho, 1992; Moreira-Filho et al.,

2001; Fernandes e Martins-Santos, 2005), Pimelodidae (Fenocchio e Bertollo, 1990);

Callichthyidae (Oliveira et al., 1993) e Loricariidae (Andreata et al.; 1993; Scavone e

Ferreira Julio, 1993-94).

Apesar do grande número de espécies válidas para o gênero Rineloricaria,

poucos são os estudos citogenéticos realizados até o presente momento. Contudo, pode-

se perceber a existência de uma diversidade cariotípica com números diplóides variando

de 2n=36 cromossomos em R. latirostris (Giuliano-Caetano, 1998) a 2n=70

cromossomos em Rineloricaria n. sp (Alves et al., 2003). Assim como no gênero

Rineloricaria, a subfamília Loricariinae também apresenta alta variabilidade cariotípica

com número de cromossomos variando de 2n=36 em R. latirostris (Giuliano-Caetano,

1998) a 2n=74 em Sturisoma cf. nigrirostrum (Artoni e Bertollo, 2001), sendo que a

ocorrência de cromossomos B só foram observados no gênero Loricaria (Scavone e

Ferreira Julio, 1993-94). Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo o estudo,

da primeira descrição de cromossomos B no gênero Rineloricaria, através das análises

da distribuição e comportamento destes cromossomos em células mitóticas e meióticas.

Materiais e Métodos

No presente estudo, foram analisados 6 indivíduos de Rineloricaria

pentamaculata, coletados no córrego Tauá (sub-bacia do Pirapó) no município de

Maringá. Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células do rim conforme

a técnica descrita por Bertollo et al. (1978). Esta técnica consiste basicamente, no

tratamento do animal com colchicina 0,025% por quarenta minutos, para obtenção de

uma suspensão celular hipotonizada em KCL 0,075M e fixada em solução de metanol e

ácido acético (3:1). Para o estudo da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica

de Sumner (1972). Os cromossomos meióticos foram obtidos a partir das gônadas de

três espécimes machos, de acordo com a técnica de Kligerman e Bloom (1977).

Resultados e Discussão

O estudo cariotípico de Rineloricaria pentamaculata do córrego Tauá, mostrou

um número diplóide variando de 2n=56 a 2n=59 cromossomos, em 4 dos 6 indivíduos

analisados correspondendo a uma freqüência de 66,66%. Esta variação ocorreu devido a

presença 0 a 3 cromossomos extras do tipo acrocêntrico pequeno (Figura 1a, b, c), que

pela análise de banda C mostraram-se totalmente heterocromáticos, diferenciando-os

dos demais cromossomos do complemento padrão e indicando tratarem-se de

microcromossomos B (Figura 1d). Camacho et al.(2000) sugerem que as células teriam

mecanismos que promovem a rápida heterocromatinização de elementos extras logo

após a sua formação, evitando um possível pareamento entre esses elementos e os

cromossomos A, seguido da diferenciação em cromossomos B.

Apesar da alta freqüência populacional de indivíduos com cromossomos B, a

freqüência numérica intra e interindividual foi baixa, sendo que a maioria apresentou

apenas um cromossomo B por célula (Tabela 1). A variação inter e intraindividual

destes cromossomos em R. pentamaculata, reflete a alta instabilidade mitótica destes

cromossomos durante a divisão celular.

A análise de metáfases meióticas, em 3 indivíduos machos, mostrou 28

bivalentes em metáfase I e pequenos cromossomos univalentes em 54,9% das células

analisadas (Figura 2, Tabela 2). A presença destes univalentes confirma estes

cromossomos como supranumerários, sendo que estiveram presentes em número de 0 a

7 por células e que aquelas com apenas 1 univalente foram as mais freqüentes (Figura 2,

Tabela 2). Além disso, no espécime 3, no qual foi observado até 6 cromossomos

supranumerários nas células germinativas (Tabela 2), não foram observados

cromossomos B nas células somáticas (Tabela 1). Este fato juntamente com a presença

de um maior número de cromossomos B nas células germinativas (até 7) do que nas

somáticas (até 3), indicam que a instabilidade mitótica destes cromossomos, nesta

população, é maior do que a meiótica (Tabela 1 e 2). De acordo com Camacho et al.

(2000) o número reduzido de cromossomos B nas células diplóides representaria o

máximo de cromossomos B que uma espécie é capaz de tolerar em indivíduos adultos.

Errero-Porto et al., (em preparação), analisando esta mesma população de R.

pentamaculata, observaram um citótipo heteromórfico devido à presença de um par de

cromossomos do tipo submetacêntrico e acrocêntrico (9m/sm + 47st/a), que difere do

cariótipo padrão com fórmula cariotípica de 8m/sm + 48st/a. Os cromossomos B, na sua

maioria, estiveram presentes nos indivíduos heteromórficos (1M ,2F, e 6F tabela 1; 3M

tabela 2) e, provavelmente, os rearranjos de fusão cêntrica seriam os responsáveis pela

formação do cromossomo submetacêntrico do par heteromórfico, bem como pela

origem destes microcromossomos B (figura 3). Vários autores têm discutido a origem

dos cromossomos B mas, de forma geral, têm sido amplamente aceito que eles sejam

derivados do complemento padrão (Jonnes e Rees, 1982; Camacho et al., 2000). A

partir disso, Camacho et al. (2000) propõe que eles sejam um produto secundário da

evolução do cariótipo padrão, ou seja, derivados a partir de polissomia de cromossomos

A, por fragmentos cêntricos resultantes da fusão de cromossomos A ou amplificação de

um fragmento da região paracentromérica de um cromossomo A.

Na subfamília Loricariinae cromossomos B foram observados nas espécies

Loricaria sp e L. prolixa (rio Paraná), presentes em 100% dos indivíduos analisados e

com alta freqüência intra e interindividual variando entre 0-5, nas duas espécies

(Scavone e Ferreira Julio, 1993-94) e alta estabilidade mitótica, o que difere dos

cromossomos B de R. pentamaculata cuja instabilidade inter e intraindividual foi alta.

Para a família Loricariidae, além da ocorrência de cromossomos B já

mencionados em Loricariinae, há também relatos destes cromossomos em duas

populações de Microlepdogaster leucofrenatus da subfamília Hypoptopomatinae (rio

Poço Grande e rio Marumbi), no qual foi observada uma freqüência de 1-2

cromossomos B (Andreata et al., 1993), mostrando uma alta estabilidade mitótica

intraindividual.

Portanto, com relação aos cromossomos B de R. pentamaculata parece ter

origem recente no gênero e assim como a maioria dos cromossomos B, são

heterocromáticos e o seu comportamento mitótico e meiótico são mais instáveis que os

observados em espécies com cromossomos B na subfamília e mesmo dentro da família

Loricariidae.

Figura 1 - Metáfases somáticas de R. pentamaculata do córrego Tauá, contendo

cromossomos B: a) com um cromossomo B; b) com dois B; c) com três B e d) padrão

de distribuição da heterocromatina constitutiva, evidenciando um cromossomo B

totalmente heterocromático. Setas indicando os cromossomos B.

Figura 2 - Metáfases meióticas em metáfase I de R. pentamaculata: a) célula com 28

bivalentes, sem cromossomos B; b) célula com apenas um B e c) célula com três B. As

setas indicam os cromossomos B.

Figura 3 – Esquema proposto para explicar a origem dos cromossomos B em R.

pentamaculata do córrego Tauá. Rearranjos de fusão cêntrica entre dois cromossomos

acrocêntricos, formando um cromossomo submetacêntrico e fragmentos cêntricos

resultante deste processo, indicando a origem destes cromossomos.

Tabela 1: Número de células diplóide analisada em Rineloricaria pentamaculata do

córrego Tauá, mostrando a ocorrência de microcromossomos B.

Indivíduo

Número de B Total de células

(Nº) e sexo 0 1 2 3 1M 2F 3M 4F 5M 6F

14 1 1 - 12 4 1 - 15 - - - 18 - - - 16 2 - - 45 7 3 1

16 17 15 18 18 56

Total 125 14 5 1 143 % 87,41 9,79 3,49 0,69

Tabela 2: Número de células haplóides encontradas em machos de R. pentamaculata do

córrego Tauá, evidenciando a ocorrência de cromossomos B.

Indivíduo Número de B Total de células

(Nº) e sexo 0 1 2 3 4 5 6 7 1M 3M 5M

2 2 - - - - - 1 16 11 4 1 4 - 2 - 5 3 - - - - - -

5 38 8

Total 23 16 4 1 4 0 1 1 51 % 45,9 31,4 7,84 1,96 7,84 3,92 1,96

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Curimata modesta (Curimatidae, Characiformes). Brazil. J. Genet. 4: 681-687.

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