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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
EMERSON FLORES DE OLIVEIRA
ETIOLOGIA, PATOGENICIDADE, CARACTERIZAÇÃO MORFOLOGICA E MOLECULAR DE FUNGOS ASSOCIADOS A
SEMENTES DE PLANTAS DANINHAS DO CERRADO
GURUPI – TO 2015
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
EMERSON FLORES DE OLIVEIRA
ETIOLOGIA, PATOGENICIDADE, CARACTERIZAÇÃO MORFOLOGICA E MOLECULAR DE FUNGOS ASSOCIADOS A
SEMENTES DE PLANTAS DANINHAS DO CERRADO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal – área de concentração Fitossanidade.
Orientador: Prof. Dr. Gil Rodrigues dos Santos
GURUPI – TO 2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca da Universidade Federal do Tocantins
Campus Universitário de Gurupi
O48e Oliveira, Emerson Flores Etiologia, patogenicidade e caracterização molecular de fungos associados a
Sementes de plantas daninhas do cerrado / Emerson Flores Oliveira. - Gurupi, 2015. 83f.
Dissertação de Mestrado – Universidade Federal do Tocantins, Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, 2015. Linha de pesquisa: Área de concentração em Fitossanidade.
Orientador: Prof. Dr. Gil Rodrigues dos Santos .
1. Patógenos. 2. plantas invasoras. 3. doenças. I. Santos, Gil Rodrigues dos.II. Universidade Federal do Tocantins. III. Título.
CDD 632.5
Bibliotecária: Glória Maria Soares Lopes – CRB-2 / 592 TODOS OS DIREITOS RESERVADOS – A reprodução total ou parcial, de qualquer forma ou por qualquer meio deste documento é autorizado desde que citada a fonte. A violação dos direitos do autor (Lei nº 9.610/98) é crime estabelecido pelo artigo 184 do Código Penal.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
Defesa nº 05/2015
ATA DA DEFESA PÚBLICA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DE EMERSON FLORES DE OLIVEIRA, DISCENTE DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
PRODUÇÃO VEGETAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
Aos 27 dias do mês de Fevereiro do ano de 2015, às 14:00 horas, no(a) Sala de XV do Bloco Bala II, reuniu-se a Comissão Examinadora da Defesa Pública, composta pelos seguintes membros: Prof. Orientador Dr. Gil Rodrigues dos Santos do Campus Universitário de Gurupi/ Universidade Federal do Tocantins, Dr. Maruzanete Pereira de Melo / Universidade Federal do Piauí, Dra. Solange Aparecida Ságio do Campus Universitário de Gurupi/ Universidade Federal do Tocantins, Prof. Dr. Raimundo Wagner de Souza Aguiar do Campus Universitário de Gurupi/ Universidade Federal do Tocantins sob a presidência do primeiro, a fim de proceder a arguição pública da DISSERTAÇÃO DE MESTRADO de EMERSON FLORES DE OLIVEIRA, intitulada "ETIOLOGIA, PATOGENICIDADE E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE FUNGOS ASSOCIADOS SEMENTES DE PLANTAS DANINHAS DO CERRADO.". Após a exposição, a discente foi arguida oralmente pelos membros da Comissão Examinadora, tendo parecer favorável à aprovação, habilitando-o(a) ao título de Mestre em Produção Vegetal. Nada mais havendo, foi lavrada a presente ata, que, após lida e aprovada, foi assinada pelos membros da Comissão Examinadora.
Dr. MARUZANETE PEREIRA DE MELOPrimeiro examinador
Dra. SOLANGE APARECIDA SÁGIOSegundo examinador
Dr. RAIMUNDO WAGNER DE SOUZA AGUIARTerceiro examinador
Dr. GIL RODRIQUES DOS SANTOS Universidade Federal do Tocantins
Orientador e presidente da banca examinadora
Gurupi, 27 de Fevereiro de 2014.
Dr. Rodrigo Ribeiro Fidelis Coordenador do Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal
DEDICO
A minha amada esposa Aline e meus queridos filhos, Artur Henrique e Maria Helena, vocês são o bem mais precioso que tenho em minha vida, e a minha razão de cada dia seguir mais em frente.
Aos meus pais, Jose Valmor e Rosani, meus irmãos, Alexandro, Lucion e Jéssica e meu sobrinho afilhado Lucyano Matheus.
Aos meus queridos avós, Romildo Flores (in memoriam) e Eulina
Maria, Getúlio Oliveira e Cleonice Moura de Oliveira (in memoriam).
AGRADECIMENTOS
A todos que contribuíram para realização de alguma forma para
realização desse trabalho.
Ao meu orientador Doutor Gil Rodrigues dos Santos, pela orientação,
dedicação, e principalmente ter acreditado em meu potencial para condução do
presente trabalho, tendo por isso nunca medido esforços para tal finalidade.
Ao Programa de Pós Graduação em Produção Vegetal da Universidade
Federal do Tocantins pela oportunidade de realização do curso de mestrado.
Ao Dra. Solange Aparecida Ságio, pela enorme contribuição nas análises
moleculares, além das inúmeras vezes que veio a me socorrer sanado dúvidas
sobre as análises moleculares, e pelo imenso apoio prestado durante a realização
deste trabalho
Ao Dr. Maruzanete Pereira de Melo, pela grande contribuição para este
trabalho, desde a classificação morfológica dos fungos até dicas, sugestões e
ideias que foram fundamentais, e por sempre estar disposto a contribuir para as
melhorias do presente trabalho.
Ao professor Dr Rodrigo Ribeiro Fidelis, que sempre ajudou fornecendo
sementes para todos os testes.
A todos os colegas do grupo de manejo integrado de doenças: Dalmarcia,
Mateus, Ronice, Jaiza, Professor Paulo Tschoeke, Micaele, Rosângela, Jonathan,
Camila, Pedro, Fabiana e Cynthia.
A Agência de Defesa Agropecuária do Estado do Tocantins – ADAPEC,
em especial ao colegas Paulo Farencena, Rodrigo Cavalheiro, Rodrigo Bianchi,
Edson Pimentel e Marcos Motta (Marcão), que sem a ajuda dos mesmos esse
trabalho não seria possível.
A minha esposa Aline Lof, que sempre me incentivou a continuar
estudando, e sua ajuda foi fundamental para isso, essa vitória também e sua.
Ao meu companheiro das madrugadas de estudo “Chimarrão”
Muito Obrigado.
O aprendizado e como o horizonte; Não a limites
(Provérbio chinês)
9
RESUMO GERAL
As plantas daninhas competem com água, luz e nutrientes com as culturas de
importância agrícolas, e possuem vários mecanismos efetivos de propagação,
além de um extenso banco de sementes, que pode permanecer viável por longos
períodos de tempos. Além disso, podem ser hospedeiras de diversos patógenos
causadores de doenças. Apesar da importância existem poucos estudos sobre
o transporte de fungos associados as sementes das plantas daninhas. Este
trabalho teve como objetivo realizar a análise sanitária de sementes de
Spermacoce latifólia Aubl, Ipomea spp., Acanthospermum australe, Cencrhus
echinatus L., Eleusine indica, Sida rhombifolia, Pennisetum setosum, Vernonia
polyanthes, Bidens pilosa, Tridax procumbens, Echinochloa crus-pavonis,
Digitaria horizontalis. Das amostras da sementes analisadas foram identificados
13 gêneros fúngicos diferentes, sendo que o gênero Fusarium ocorreu em todas
as espécies de plantas daninhas, e o gênero de maior ocorrência nas sementes
foi Cladosporium. Ocorreram também os gêneros Curvulária, Aspergillus,
Bipolaris, Alternaria, Phoma, Nigrospora, Papularia, Penicillium e Rhizoctonia.
Também foram verificados fungos classificados na classe Oomicetes. Existem
poucos trabalhos relacionado a presença de fungos constatados nas sementes
de plantas daninhas com a sua capacidade de causar doenças na plantas
cultivadas. Desta forma este trabalho teve como objetivo avaliar a
patogenicidade de fungos isolados de sementes de 12 espécies de plantas
daninhas coletas em área tropicais as plantas daninhas hospedeiras e as plantas
cultivadas de arroz (Oryza sativa), milho (Zea mays), feijão (Phaseolus vulgaris),
feijão caupi (Vigna unguiculata) e soja (Glycine max). A maioria dos fungos
testados não apresentou patogenicidade as plantas cultivadas, porém sementes
de Pennisetum setosum e Tridax procumbens apresentaram fungos e oomicetos
com patogenicidade às plantas cultivadas. Apenas o gênero Fusarium isolado
de T. procumbes foi patogênico a sua hospedeira, provocando sintomas de
murcha. Os demais gêneros encontrados nas semente e que foram patogênicos
as plantas cultivadas porem não patogênicos as plantas, podem ser
considerados como endofíticos na sua relação com essas planta. A correta
identificação das espécies patogênicas e de suma importância para
10
conhecimento e manejo da doença, sendo essas identificações baseiam-se
principalmente em características morfológicas como formas e tamanho dos
esporos assexuais, morfologia das hifas, formação de clamidósporos e
características das celulas conidiogênicas. Diversas técnicas moleculares como
sequenciamento de nucleotídeos de DNA amplificados pela PCR (Reação de
polimerase em cadeia), partindo de genes específicos como calmodulina e β-
tubulina, além de analises de restrição através de enzimas especificas. As
tecnias morfológicas e moleculares possibilitaram a caracterização das espécies
Fusarium.verticilioides, F. proliferatum e F. semitectum, associadas à sementes
de Pennisetum setosum e F. semitectum e F. solani associadas a sementes de
Tridax procumbens
Palavras – chave: Patógenos, plantas invasoras, doenças
11
GENERAL ABSTRACT
Weeds compete for water, light and nutrients with crops of agricultural
importance, and have several effective mechanisms of propagation, and an
extensive seed bank, which can remain viable for long periods of time. In addition,
the host can be various disease-causing pathogens. There are few studies on the
transport of fungi associated the seeds of weeds. This work was aimed at making
the health analysis Spermacoce seeds latifolia Aubl, Ipomoea spp.,
Acanthospermum australe, Cencrhus echinatus L., Eleusine indica, Sida
rhombifolia Pennisetum setosum, Vernonia polyanthes, Bidens pilosa, Tridax
procumbens, raw-pavonis Echinochloa , Digitaria horizontalis. The samples of
the seeds analyzed, identified 13 different genera of fungi, and the Fusarium
occurred in all weed species, and the genre most frequent in the seeds was
Cladosporium. There were also the Curvularia, Aspergillus, Bipolaris, Alternaria,
Phoma, Nigrospora, Papularia, Penicillium and Rhizoctonia. We also checked
fungi classified in class Oomycetes. There are few studies related to the presence
of fungi observed in the weed seeds with their ability to cause disease in crops.
Thus this work was to evaluate the pathogenicity of 12 seed species of fungi
isolated weed collections in tropical area host weeds and cultivated plants of rice
(Oryza sativa), corn (Zea mays), beans (Phaseolus vulgaris ), cowpea (Vigna
unguiculata) and soybean (Glycine max). Most fungi tested showed no
pathogenicity cultivated plants, but seeds of Pennisetum setosum and Tridax
procumbens showed fungi and oomycetes with pathogenicity cultivated plants.
Only the genus Fusarium isolated from T. procumbes was pathogenic to its host,
causing symptoms of wilt. The other genera found in the seed and were
pathogenic plants grown however nonpathogenic the source material, can be
considered as endophytic in their relationship with these plant. The correct
identification of pathogenic species and of paramount importance to knowledge
and management of the disease, and these identifications are based mainly on
morphological features like shapes and size of asexual spores, hyphal
morphology, chlamydospores formation and characteristics of Conidiogenous
cell. And in molecular characteristics, in which different molecular techniques
12
such as DNA sequencing nucleotides amplified by PCR (polymerase chain
reaction) and restriction analysis by specific enzymes was used. The
morphological and molecular techniques enabled the characterization of
Fusarium verticilioides species, F. proliferatum and F. semitectum associated
with the seeds of Pennisetum setosum and F. solani and F. semitectum
associated with Tridax seeds procumbens
Keywords: Pathogens, weeds, diseases
13
SUMÁRIO
RESUMO GERAL ........................................................................................... 9
GENERAL ABSTRACT................................................................................. 11
LISTA DE TABELAS ..................................................................................... 15
Capitulo I ....................................................................................................... 15
Capitulo II ...................................................................................................... 15
Capitulo III ..................................................................................................... 15
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................... 16
Capitulo I ....................................................................................................... 16
Capitulo II ...................................................................................................... 16
Capitulo III ..................................................................................................... 17
CAPÍTULO I ..................................................................................................... 18
Micoflora associada a Sementes de plantas daninhas coletadas em áreas
tropicais .......................................................................................................... 18
RESUMO ...................................................................................................... 19
ABSTRACT ................................................................................................... 20
INTRODUÇÃO .............................................................................................. 21
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 23
RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 26
CONCLUSÕES ............................................................................................. 29
REFERENCIAS ............................................................................................ 32
CAPÍTULO II ................................................................................................... 35
Fungos associados à Sementes de plantas daninhas como patógenos de
plantas cultivadas .......................................................................................... 35
RESUMO ...................................................................................................... 36
ABSTRACT ................................................................................................... 37
INTRODUÇÃO .............................................................................................. 38
14
MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 39
RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 41
CONCLUSÕES ............................................................................................. 50
REFERENCIAS ............................................................................................ 51
CAPÍTULO III .................................................................................................. 56
Análise morfológica e molecular de Fusarium spp. isolados de sementes
de Tridax procumbes L. e Pennisetum setosum (SW. Rich.) ..................... 56
RESUMO ...................................................................................................... 57
ABSTRACT ................................................................................................... 58
INTRODUÇÃO .............................................................................................. 59
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 63
Caracterização Morfológica ....................................................................... 63
Caracterização Molecular .......................................................................... 63
Sequenciamento ....................................................................................... 63
Extração de DNA para Perfil de Restrição ................................................ 64
Condição PCR .......................................................................................... 65
Análise de Restrição ................................................................................. 65
RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 66
Caracterização Morfológica ....................................................................... 66
Caracterização Molecular .......................................................................... 69
CONCLUSÃO ............................................................................................... 75
REFERENCIAS ............................................................................................ 76
CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................. 81
15
LISTA DE TABELAS
Capitulo I
Tabela 1: Plantas daninhas coletadas para análise sanitária das sementes................................................................................................... 24
Tabela 02: Incidência de Fungos em sementes de Plantas daninhas coletadas em áreas tropicais no sul do estado do Tocantins.....................
30
Capitulo II
Tabela 01:Testes de patogenicidade de fungos isolados de sementes de plantas daninhas em Arroz (Ar), Feijão (Fe), Feijão caupi (Fc), Soja (So) e Milho (Mi).......................................................................................
42
Tabela 02:Patogenicidade de fungos encontrados associados à sementes de plantas daninhas presentes no cerrado do Tocantins..........
48
Capitulo III
Tabela 01: Identificação das espécies de Fusarium spp associadas a sementes de Pennisetum setosum...........................................................
69
Tabela 02: Identificação das espécies de Fusarium spp associadas a sementes de Tridax procumbes. ..............................................................
66
Tabela 03: Agrupamento das espécies de Fusarium de acordo com o padrão dos fragmentos de restrição da região ITS....................................
74
16
LISTA DE FIGURAS
Capitulo I
Figura 1: A - Sementes de Ipomea spp., em placas de petri, método "blotter test". B – Sementes de Bidens pilosa, em placas de petri, método "blotter test". C - Preparo e desinfecção das sementes. D – Placas de petri, contendo sementes de plantas daninhas em sala de incubaçã...................................................................................................
25
Figura 2: A - Hifas de Fusarium spp, B - Conídios de Fusarium spp em Tridax procumbens...................................................................................
31
Figura 3: A – Curvularia spp em sementes de Tridax procumbes. B - conídios de Curvulária spp isolados de sementes de Pennisetum sestosum...................................................................................................
31
Figura 4: A - Nigrospora spp, B - Papularia spp, ambos em Tridax
procumbens............................................................................................... 31
Capitulo II
Figura 1: A e B - Mancha - de - curvularia em folhas de milho; C - Curvularia spp em sementes de Pennisetum setosum., D - Conidios de Curvulária spp..........................................................................................
45
Figura 2: Podridão causada por Fusarium spp em colmo de plântulas de milho, inoculadas a partir de sementes de Penissetum setosum..........
46
Figura 3: A - Lesão de Oomiceto spp em folhas de feijão, B - Lesão de Oomiceto spp em folhas de feijão caupi, C e D - Inoculação de Oomiceto spp. em Arroz, E - Inoculação de Oomiceto spp em milho e F - Podridão de Oomiceto spp em colmo de milho ......................................................
47
17
Capitulo III
Figura 1: Padrão de alinhamento gerado pelo algoritmo Blastx............... 69
Figura 2: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação da região ITS. M: Marcador Molecular 1Kb; C+: controle positivo da reação, C-: controle negativo; 1 a 20: isolados de Fusarium ....................
69
Figura 3: Morfologia da colônia em meio BDA - (A) Fusarium proliferatum; (B) Fusarium solani; (C) Fusarium verticilioides; (D) Fusarium semitectum...............................................................................
71
Figura 4: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação da região ITS com o padrão de digestão para: (A) HpaII; (B) HaeIII; (C) EcoRI; com (M) marcador molecular de 1Kb............................................
72
18
CAPÍTULO I
Micoflora associada a Sementes de plantas daninhas
coletadas em áreas tropicais
19
Micoflora associada a sementes de plantas daninhas coletadas em áreas
tropicais
RESUMO
As plantas daninhas competem por água, luz e nutrientes com as culturas de
importância agrícolas, e possuem vários mecanismos efetivos de propagação,
além de um extenso banco de sementes, que pode permanecer viável por longos
períodos de tempos. Além disso, podem ser hospedeiras de diversos patógenos
causadores de doenças. Apesar da importância existem poucos estudos sobre
o transporte de fungos associados as sementes das plantas daninhas. Este
trabalho teve como objetivo realizar a análise sanitária de sementes de
Spermacoce latifólia Aubl, Ipomea spp., Acanthospermum australe, Cencrhus
echinatus L., Eleusine indica, Sida rhombifolia, Pennisetum setosum, Vernonia
polyanthes, Bidens pilosa, Tridax procumbens, Echinochloa crus-pavonis,
Digitaria horizontalis. As sementes foram coletadas em áreas tropicais do
ecossistema cerrado, e em seguida foram submetidas ao método do papel filtro
(“blotter test”) no delineamento inteiramente casualizado, com 12 tratamentos e
3 repetições, utilizando-se 90 sementes por tratamento, em 3 repetições de 30
sementes cada. Das amostras da sementes analisadas foram identificados 13
gêneros fúngicos diferentes, sendo que o gênero Fusarium ocorreu em todas as
espécies de plantas daninhas, e o gênero de maior ocorrência nas sementes foi
Cladosporium. Ocorreram também os gêneros Curvularia, Aspergillus, Bipolaris,
Alternaria, Phoma, Nigrospora, Papularia, Penicillium e Rhizoctonia. Também
foram verificados fungos classificados na classe Oomicetes. A diversidade de
fungos encontrados nas análises sanitárias das sementes de plantas daninhas
demonstra que a mesmas contém importantes gêneros de fungos, que podem
representam riscos de disseminação, e em alguns casos causadores de doenças
em plantas cultivadas, como os gêneros Fusarium, Rhizoctonia, Bipolaris, e
Alternaria, demonstrando o potencial do inóculo que estas mesmas podem
representar a produção agrícola das principais culturas.
Palavras – chave: Micoflora, plantas invasoras, transporte
20
Mycoflora associated with weed seed collected in tropical áreas
ABSTRACT
Weeds reduce the production of agricultural crops, and are widely known as
alternative host pathogens, and one of the most effective mechanisms for
propagation and seed bank, which can remain viable for long periods of time, and
not has knowledge of fungi associated the seeds of weeds. This work was aimed
at making the health analysis seed Spermacoce latifólia Aubl, Ipomea spp.,
Acanthospermum australe, Cencrhus echinatus L., Eleusine indica, Sida
rhombifolia, Pennisetum setosum, Vernonia polyanthes, Bidens pilosa, Tridax
procumbens, Echinochloa crus-pavonis, Digitaria horizontalis, seeds which were
collected, dried and subjected to the filter paper method "blotter test", using 90
seeds, in 3 replicates of 30 seeds each. The samples of the seeds analyzed,
identified 13 different genres, and the Fusarium occurred in all weed species, and
the gender of the greater incidence in the seeds was Cladosporium. There were
also genres Curuvlaria, Aspergillus, Bipolaris, Alternaria, Phoma, Nigrospora,
Papularia, Penicillium and Rhizoctonia, and the isolates with similar
characteristics Oomicetos. The diversity of fungi found in health analysis of weed
seeds shows that they contain important genera of fungi which may represent
spread risk, and in some cases cause diseases in cultivated plants such as genus
Fusarium, Rhizoctonia, Bipolaris, and Alternaria, demonstrating the potential of
the inoculum that they have as well as the importance of correct management of
the same.
Keywords: Mycoflora, invasive plants, transportation
21
INTRODUÇÃO
A agricultura brasileira vem ano após ano em constante crescimento,
expandindo-se para novas fronteiras agrícolas, sendo que no ano de 2014
atingiu-se 192,8 milhões de toneladas de grãos, cultivados em uma área de 56,3
milhões de hectares (IBGE, 2014). Porém mesmo com esse volume de
produção, existem vários fatores que podem influenciar negativamente nessa
produção, sendo que uma das grandes preocupações atual da agricultura, está
justamente voltada aos prejuízos causados pelas plantas daninhas nas lavouras
(Vasconcelos et al., 2012).
As plantas daninhas além de reduzir a produção das lavouras, aumentar
os custos de produção devido aos custos com métodos de manejo, também
assumem grande importância devido ao fato das mesmas serem hospedeiras de
pragas e doenças, como alguns exemplos citados por Carmo & Santos (2008),
que relata 57 espécies de plantas infestantes como hospedeiras alternativas de
Meloidogyne javanica, já Junior et al. (2012) em estudos dos sistemas
radiculares de plantas daninhas em áreas produtoras de melão isolou o fungo
Macrophomina phaseolina em 13 espécies diferentes de plantas daninhas e o
fungo Rhizoctonia solani em uma espécie de planta daninha, sendo esses fungos
responsáveis pelo colapso das ramas do meloeiro, doença que atinge as
lavouras, principalmente na região nordeste do brasil, além de vários outros que
relatam as plantas daninhas como hospedeiras de vírus, como begomovirus para
plantas de tomateiro, conforme descrito por Silva et al (2010), Assunção et al.
(2006), dentre outros.
As plantas daninhas podem atuar como hospedeiras secundárias de
fitopatógenos, servindo com fontes de inócuo e desempenhando uma
importante função na epidemiologia das doenças, entretanto pouco se conhece
sobre a importância de plantas daninhas como hospedeira alternativas de
patógenos, além das mesmas atuarem como hospedeiras, produzem
substâncias alopáticas, serem toxicas para animais, além da depreciação da
terra, danos a colheita das plantas cultivadas e efeitos prejudiciais causados
pelos métodos de controle desnecessários (Junior et al., 2012; Vasconcelos et
al., 2012).
22
Para sua disseminação e sobrevivência os patógenos também dependem
do processo de disseminação, que implica em sua movimentação,
movimentação está proporcionada na maior parte na maior parte dos casos por
agentes externos, como água, ar, homem, insetos (Amorim, et al 2011) e
sementes (Barrocas e Machado, 2010).
Barrocas & Machado (2010) exalta que em geral as sementes podem
abrigar e transportar microrganismos de todos os grupos taxonômicos,
patogênicos ou não, por isso a detecção desses organismos torna-se uma das
mais importantes ferramentas para o manejo sanitário de doenças. Porém, no
caso de plantas daninhas as mesmas dispõem de um eficiente banco de
sementes, onde constituem um sério problema a atividade agrícola, pois
garantem as infestações por um longo período de tempo, mesmo que medidas
de controle sejam adotadas (Leck, 2012), devido as mesmas disporem de
mecanismos como facilidades de dispersão, como vento, solo, preparo do solo,
água, animais, além de mecanismos como dormência e efeito alopáticos
(Carmona, 1992).
Apesar da importância de estudos nesta área buscando-se obter um
maior conhecimento desta associação. Praticamente não foram encontrados
trabalhos em áreas de cerrado em espécies típicas deste ecossistema.
Neste trabalho objetivou-se realizar a análise sanitária de sementes de
Spermacoce latifólia Aubl, Ipomea spp., Acanthospermum australe, Cencrhus
echinatus L., Eleusine indica, Sida rhombifolia, Pennisetum setosum, Vernonia
polyanthes, Bidens pilosa, Tridax procumbens, Echinochloa crus-pavonis,
Digitaria horizontalis, visando identificar os gêneros de fungos presentes nas
sementes das mesmas.
23
MATERIAL E MÉTODOS
Os trabalhos foram conduzidos no laboratório de manejo integrado de
doenças de plantas da Universidade Federal do Tocantins – Campus
Universitário de Gurupi, no período de Setembro de 2013 a Agosto de 2014, de
onde as sementes das 12 espécies de plantas daninhas (Tabela 01) foram
coletadas nas áreas de cerrado localizadas na latitude 11°44’47,18” e longitude
49°02’56,97” do campo experimental da UFT, onde as mesmas foram coletadas,
diretamente das plantas daninhas, catalogadas, corretamente identificadas.
Posteriormente foi separada uma amostra de 90 sementes de cada espécie. Em
seguida, cada amostra foi dívida em 3 sub amostras contendo 30 sementes
cada, onde foram secadas em estufa a 40ºc por 45 minutos, a fim de perder o
excesso de umidade, para evitar contaminações e não afetar a sobrevivência
dos fungos o que poderia interferir nos posteriores resultados após o
armazenamentos das sementes.
Para as análises sanitárias, foi adotado o método do papel filtro ou “blotter
test”, conforme metodologia adaptada de Neergaard (1977) para 90 sementes.
Inicialmente, foi feita assepsia das sementes em álcool (50%/30seg) e depois
em hipoclorito de sódio (1%/40seg), em seguida, foi retirado o excesso de
hipoclorito em água esterilizada contida em 3 placas de petri. Depois, as
sementes de cada espécie, foram colocadas sobre 3 camadas de papel filtro,
esterilizado no interior de cada placa de petri, sendo colocadas 90 sementes por
tratamento, distribuídas com 30 sementes por cada placa (repetição). As
sementes foram colocadas em sala de incubação (Figura 1) por 7 dias, sob a
temperatura de 25°C ± 1°C e fotoperiodo de 12 horas, onde permaneceram até
a avaliação.
Após o período de incubação, as sementes foram analisadas
individualmente com auxílio de microscópio estereoscópio binocular Physis
modelo Sqf - F, para visualização das características morfológicas das estruturas
dos fungos, sendo que, quando necessário, foram preparadas lâminas, que
foram visualizadas ao microscópio óptico trinocular Physis modelo exp 100, para
identificação. Após a identificação e com auxílio de um estilete estéril, estruturas
fungicas, foram transferidos para placas de petri, contendo meio de cultura BDA,
24
e incubados por 7 dias, à uma temperatura constante de 25ºC ± 1ºC, para nova
identificação e armazenamento para posteriores estudos com os diferentes
gêneros. Na sequência, cada fungo foi repicado e transferido para tubos de
ensaio, contendo meio de cultura BDA, de onde foram levados para conservação
em freezer a baixas temperaturas.
Tabela 1: Plantas daninhas coletadas para análise sanitária das sementes
Espécie Família
Spermacoce latifólia Aubl Rubiaceae
Ipomea sp. Convolvulaceae
Acanthospermum australe Asteraceae
Cencrhus echinatus L. Poaceae
Eleusine indica Poaceae
Sida rhombifolia Malvaceae
Pennisetum setosum Poaceae
Vernonia polyanthes Asteraceae
Bidens pilosa Asteraceae
Tridax procumbens Asteraceae
Echinochloa crus-pavonis Poaceae
Digitaria horizontalis Poaceae
Para identificação correta dos gêneros de fungos encontrados, foi
utilizada a literatura especifica para consultas, como Barnett; Hunter (1998) e
Watanabe (2010). Foram observadas estruturas dos fungos presentes na
superfície das sementes, morfologia das colônias em meio BDA, morfologia das
hifas e características de esporos assexuais (conídios) ou sexuais, onde todas
as características dos gêneros foram comparadas e fotografadas com auxílio de
câmera digital acopladas a microscópio óptico, para elaboração de pranchas,
contendo imagens das estruturas avaliadas e utilizadas na correta identificação
do gênero.
25
Figura 1: A - Sementes de Ipomea spp., em placas de petri, método "blotter test". B – Sementes
de Bidens pilosa, em placas de petri, método "blotter test". C - Preparo e desinfecção das
sementes. D – Placas de petri, contendo sementes de plantas daninhas em sala de incubação.
26
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O número de fungos identificados nas sementes de plantas daninhas
divergiram entre as espécies, sendo encontrados um total de 13 gêneros
diferentes, sendo que, alguns de fungos com importância para cultivos agrícolas,
bem como alguns isolados com características semelhantes a Oomicetos
(Tabela 2).
O gênero mais presente nas sementes analisadas foi o Cladosporium, o
qual foi verificado em todas as amostras analisadas. Este gênero, normalmente
é considerado contaminante, comumente encontrado em sementes
armazenadas, porém, existem espécies patogênicas às plantas de trigo,
maracujá e pessegueiro (Martins, et al, 2006).
O segundo gênero de maior incidência nas sementes foi o Fusarium
(Figura 02), o qual trata-se de um fungo amplamente distribuído, sendo que, a
maioria das espécies é composta por fungos que em sua grande maioria atuam
na decomposição de substratos derivados de celulose, ou possuem hábitos
saprofíticos, porém, algumas espécies podem ser patógenos de plantas, além
de serem produtoras de toxinas (Leslie; Summerell, 2008). Para a correta
identificação, levou-se em consideração a produção dos espóros assexuais
(macroconidios e microconidios), onde os microconidios são unicelulares e
uninucleados, e os macroconidios, que são mais comuns são multicelulares,
porém, uninucleados(Leslie & Summerell, 2008; Puhalla, 1981).
O gênero Curvularia (Figura 03) foi encontrado nas sementes de 7
espécies de plantas daninhas, com destaque T. procumbens, o qual apresentou
a maior taxa de incidência, com valores de 47,7 % (Tabela 02). Segundo a
literatura, o gênero Curvularia, possui mais de 40 espécies, sendo na sua grande
maioria, saprofíticos ou endofiticos, porém, algumas espécies são consideradas
fitopatogênicas, principalmente em gramíneas, nas regiões tropicais e
subtropicais (Sivanesan, 1987; Watanabe, 2010).
Phoma foi encontrado em sementes de 9 espécies de plantas daninhas,
e é considerado um gênero que possui uma vasta gama de hospedeiros, além
de ocorrer em diversas culturas de interesses econômicos (Boerema et al.,
2004). Este fungo pode provocar enormes perdas econômicas, bem como,
27
restrição do comércio, por apresentar espécies com restrições quarentenárias, o
que impede ou dificulta o comércio internacional de derivados (Aveskamp; De
Gruyter; Crous, 2008).
Alternaria foi encontrado nas sementes de 8 espécies de plantas
daninhas, com destaque também para T. procumbens, que apresentou uma taxa
de incidência de 45,5% das sementes contaminadas com o fungo (Tabela 02).
Töfoli e Domingues (2010) ressaltam que espécies do gênero Alternaria estão
entre as principais causadoras de doenças fúngicas em hortaliças, além de
mencionar os meios de sobrevivência dos fungos como restos culturais, nas
formas de micélio, esporos, clamidósporos e principalmente em sementes. Vale
ressaltar, que são escassos os relatos de contaminação de fungos do gênero
Alternaria em sementes de espécies de plantas daninhas.
Outro importante fungo encontrado em sementes de 2 espécies de
plantas daninhas, foi o Bipolaris, o qual foi verificado em sementes de P. setosum
e E. crus-pavonis, ambas espécies pertencentes a família das Poaceas (Lorenzi,
2006). Espécies do complexo Bipolaris normalmente podem causar lesões
foliares necróticas, provocando a morte dos tecidos em várias gramíneas da
mesma família, como por exemplo, a mancha de Bipolaris, importante doença
foliar da cultura do milho (Trigiano et al., 2010).
A planta daninha T. procumbens também apresentou a ocorrência do
fungo R. solani, que embora tenha ocorrido em menor incidência (10%), se trata
de um fungo de grande importância, pois além de sobreviver em restos culturais
como saprofítico, ou através de estruturas como escleródios e micélios, que
permitem que o fungo sobreviva por longos períodos de tempos (Papavizas;
Davey, 1961), também pode causar grandes perdas econômicas em várias
famílias de culturas agrícolas de grande interesse agronômico (Ceresini; Souza,
1997).
Em sementes de S. latifolia Aubl, C. echinatus L. e T. procumbens, foram
encontrados fungos com estruturas semelhantes a Oomicetos, como micélio
hialino branco a cotonoso, presença de hifas asseptadas e formação de
esporângios contendo zoospóros (Agrios, 2005). Oomicetos podem provocar
damping off (tombamentos), podridão de sementes, podridão de plântulas e
podridões radiculares, tendo como doença de ocorrência histórica a requeima da
batata, causada pelo Oomiceto Phytophthora infestans (Amorim, et al 2011).
28
Entre outros gêneros fúngicos, também foram identificados a Nigrospora,
Aspergillus, Rhizopus e Papularia. O Aspergillus pode ser considerado fungo de
armazenamento, o que pode influenciar na má qualidade ou conservação das
sementes ou grãos armazenados (Borém et al., 2006). Os gêneros Nigrospora,
Rhizopus e Papularia são fungos considerados contaminantes em sementes,
comumente encontrados em análises sanitárias de sementes (Figura 4).
Levando-se em consideração, as espécies de plantas daninhas avaliadas,
destacaram-se nas análises sanitárias as sementes de Pennisetum setosum,
Tridax procumbens e Sida rhombifolia, como sendo as espécies que mais
apresentaram contaminação nas sementes por fungos potencialmente
fitopatogênicos, (Tabela 02), tais como, Fusarium, Alternaria, Phoma,
Rhizoctonia, Bipolaris e Oomicetos. Devido aos poucos estudos encontrados, e
também, considerando-se que o presente trabalho busca apenas fazer um
levantamento inicial destes fungos presentes nas plantas daninhas comumente
adaptadas às áreas tropicais do cerrado, é de suma importância que outros
trabalhos sejam realizados, buscando-se relacionar a presença destes fungos
nas sementes, com incidência de doenças em plantas agrícolas do cerrado, bem
como medidas de manejo destas doenças, baseadas no manejo de plantas
invasoras presentes neste ecossistema.
29
CONCLUSÕES
A análise sanitária de sementes de plantas daninhas revelou a presença
de diversos gêneros de fungos considerados fitopatogênicos, indicando que,
além das plantas daninhas competirem com a cultura por água, luz, nutrientes e
espaço, as mesmas apresentam potencial risco de veiculação de patógenos
importantes para cultivos agrícolas de importância econômica.
30 Tabela 02: Incidência de Fungos em sementes de Plantas daninhas coletadas em áreas tropicais no sul do estado do Tocantins.
Espécie
Incidência de Fungos (%)
Cladosporium
spp.
Curvularia
spp.
Fusarium
spp.
Bipolaris
spp.
Phoma
spp.
Nigrospora
spp.
Aspergillus
niger
Rhizopus
spp.
Alternaria
spp.
Papularia
spp.
Aspergillus
spp.
Rhizoctonia
solani Oomicetos
Spermacoce
latifólia Aubl 71,1 0 10 0 12,2 22,2 0 0 0 0 0 0 3,3
Ipomea spp 92,2 26,6 0 0 0 2,2 0 0 3,3 0 3,3 0 0
Acanthospermum
australe 92,2 0 26,6 0 0 2,2 0 0 3,3 0 3,3 0 0
Cencrhus
echinatus L. 36,6 24,4 16,6 0 2,2 0 0 0 4,4 0 2,2 0 4,4
Eleusine indica 91,1 0 5,5 0 4,4 0 0 0 0 0 5,5 0 0
Sida rhombifolia 13,3 0 82,2 0 7,7 0 0 0 0 0 4 0 0
Pennisetum
setosum 82,2 30 17,7 7,7 6,6 4,4 3,3 2,2 2,2 1,1 0 0 0
Vernonia
polyanthes 8,9 0 5,6 0 7,8 3,3 3,3 18,9 0 0 0 0 0
Bidens pilosa 21,1 23,3 16,6 0 3,3 0 14,4 0 12,2 0 0 0 0
Tridax
procumbens 56,6 47,7 70 0 52,2 0 0 2 45,5 0 2 10 27,7
Echinochloa
crus-pavonis 60 6,7 11,1 4,4 10 0 0 0 12,2 0 0 0 0
Digitaria
horizotalis 70 13,3 6,7 0 0 0 5,6 3,3 13,3 0 21,1 0 0
Total 725,3 172 268,6 12,1 106,4 34,3 26,6 24,4 96,4 1,1 41,4 10 35,4
31
Figura 2: A - Hifas de Fusarium spp, B - Conídios de Fusarium spp em Tridax procumbens
Figura 3: A – Curvularia spp em sementes de Tridax procumbes. B - conídios de Curvulária spp isolados de sementes de pennisetum sestosum.
Figura 4: A - Nigrospora spp, B - Papularia spp, ambos em Tridax procumbens .
32
REFERENCIAS
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35
CAPÍTULO II
Fungos associados à Sementes de plantas
daninhas como patógenos de plantas cultivadas
36
Fungos associados a sementes de plantas daninhas como patógenos de
plantas cultivadas
RESUMO
Os fungos são os principais causadores de doenças em plantas, porém sendo
em sua grande maioria são organismos saprofíticos. A dispersão via sementes
pode ser considerada um dos mecanismos mais eficientes, as quais os fungos
podem estar misturados às mesmas, aderido à superfície ou localizados no
interior das sementes. Plantas daninhas além de já serem conhecidas como
hospedeiras de diversos microrganismos produzem um diversificado banco de
sementes, que servem como fonte de inóculo para fungos patogênicos. Existem
poucos trabalhos relacionado a presença de fungos constatados nas sementes
de plantas daninhas com a sua capacidade de causar doenças na plantas
cultivadas. Desta forma este trabalho teve como objetivo avaliar a
patogenicidade de fungos isolados de sementes de 12 espécies de plantas
daninhas coletas em área tropicais as plantas daninhas hospedeiras e as plantas
cultivadas de arroz (Oryza sativa), milho (Zea mays), feijão (Phaseolus vulgaris),
feijão caupi (Vigna unguiculata) e soja (Glycine max). A maioria dos fungos
testados não apresentam patogenicidade as plantas cultivadas, porém sementes
de Pennisetum setosum e Tridax procumbens apresentaram fungos e oomicetos
com patogenicidade às plantas cultivadas. Apenas o gênero Fusarium isolado
de T. procumbes foi patogênico a sua hospedeira, provocando sintomas de
murcha. Os demais gêneros encontrados nas sementes e que foram
patogênicos as plantas cultivadas porem não patogênicos as suas respectivas
hospedeiras, podem ser considerados como endofíticos na sua relação com
essas plantas. Os resultados obtidos no trabalho demonstram que sementes de
plantas daninhas podem transportar fungos patogênicos à várias plantas de
interesse agrícola, sendo necessário maior atenção dos agricultores para
promover o manejo adequado destas plantas.
Palavras – chave: Fusarium, plantas invasoras, patógenos
37
Fungi associated with the seeds of weeds as pathogens of plants grown
ABSTRACT
Fungi are the main causative agents of plant diseases, and for the most part they
are saprophyte bodies, however about 10% can cause disease in plants it is
therefore necessary for the survival and spread, these being in the form of spores,
mycelium, hyphae, sclerotia and chlamydospores, but one of the most effective
mechanisms for such dispersion are seeds, which can be mixed fungi adhered to
the same surface located inside or seeds. Weeds and are known as host
pathogens produce a diversified stock seed filling, which provides a source for
inoculum and pathogenic fungi. This study aimed to evaluate the pathogenicity of
fungi isolated from 12 weed species collected in tropical area, which were isolated
from inoculated, Fusarium, Curvularia, Alternaria, Bipolaris and isolated from
Oomycetes, which were inoculated in rice seedlings (Oryza sativa), corn (Zea
mays), bean (Phaseolus vulgaris), cowpea (Vigna unguiculata) and soybean
(Glycine max), and the pathogenic fungi present in inoculated plants own source.
Most fungi showed no pathogenicity cultivated plants, but seeds of Pennisetum
setosum and Tridax procumbens showed fungi and oomycetes with pathogenic
isolates cultivated plants, with 4 isolated pathogens of Fusarium spp, 1
pathogenic isolate of Curvularia spp and 2 isolates of pathogenic Oomycetes I
was only an isolated pathogenic caused wilt in the origin of plant. The results
show that weed seed can carry fungi with high pathogenic potential for crops,
requiring great attention and proper management.
Keywords: Fusarium, invasive plants, transportation
38
INTRODUÇÃO
De acordo com Agrios (2005) existem mais de 10.000 espécies de fungos
que podem causar doenças em plantas. Todas as plantas são atacadas por
algum tipo de fungo e cada tipo de fungo parasita pode causar doenças em um
ou mais tipos de plantas.
Para dispersão e sobrevivência os fungos utilizam-se de diferente
estratégias, como estruturas de resistência (escleródios), hifas, micélio e
esporos, bem como diferentes hábitos de sobrevivência, como organismos
saprofíticos (sobrevivem em matéria orgânica e restos culturas) até parasitas
biotróficos ou obrigatórios que sobrevivem somente no tecido vivo (Trigiano, et
al., 2010), e outros podem ser endofiticos, permanecendo no interior de folhas,
ramos e raízes sem causar prejuízos no hospedeiro (Peixoto Neto, et al., 2002)
Neergaard (1977) atribui as sementes o meio mais eficiente de
transmissão e disseminação de patógenos, devido as facilidades de locomoção
e transporte, não existindo assim barreiras geografias capazes de impedir a
disseminação dos mesmos, visto que os patógenos podem transporta-se
misturado ou aderido à superfície, ou localizado no interior das sementes.
As plantas daninhas apresentam capacidade de produzir grande
quantidade de sementes que podem hospedar patógenos de plantas cultivadas.
Além das mesmas competirem com as culturas agrícolas por agua, luz,
nutrientes e espaço (Vasconcelos, et al., 2012), possuem um banco de sementes
com alta produção, além de disporem de mecanismos como facilidades de
dispersão, como vento, solo, preparo do solo, água, animais, além de
mecanismos como dormência e efeito alopáticos (Carmona, 1995).
De acordo com a literatura consultada foi verificado que existem poucos
trabalhos relacionados a fungos presentes nas sementes de plantas daninhas
com sua capacidade de causar doenças nas plantas cultivadas e também na
planta daninhas a qual foi produzida a semente. Assim, o presente trabalho teve
como objetivo verificar a patogenicidade de fungos associados as sementes de
plantas daninhas com capacidade patogênica as plantas cultivadas.
39
MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no laboratório de manejo integrado de
doenças de plantas e em casa de vegetação da Universidade Federal do
Tocantins campus universitário de Gurupi. A análise sanitária das sementes de
12 espécies de plantas daninhas, foi realizado pela método do papel filtro ou
“blotter test” adaptados de Neergaard (1977) para 90 sementes. Foram utilizadas
3 sub amostras colocadas em placas de petri, contendo 30 sementes
previamente desinfestadas em álcool a 70% (45seg) e hipoclorito de sódio a 1%
(45seg), e em seguidas foram lavadas por 3 vezes com agua destilada para
retirar o excesso de hipoclorito. Posteriormente, as placas foram levadas a
câmara de incubação e mantidas em temperatura constante de 25ºC ± 1ºC, e
fotoperíodo de 12 horas. Após o período de incubação as sementes foram
analisadas individualmente com auxílio de microscópio estereoscópio, para
visualização das características morfológicas das estruturas dos fungos, e
quando necessário foram preparadas lâminas para visualização ao microscópio
óptico trinocular Physis modelo exp 100. Após a identificação os fungos foram
repicados para placas de petri contendo meio de cultura BDA, e incubados por
7 dias a uma temperatura de constante de 25ºC ± 1ºC, para nova identificação e
armazenamento para posteriores estudos com os gêneros. Em seguida cada
isolado transferido para tubos de ensaio contendo meio de cultura BDA, de onde
foram levados para conservação em freezer á baixa temperatura.
A patogenicidade dos fungos oriundos das sementes das plantas
daninhas foi avaliada por meio de inoculações na parte aérea de plântulas de
Arroz (Oryza sativa), Feijão (Phaseolus vulgaris), Feijão caupi (Vigna
unguiculata), Soja (Glycine max) e Milho (Zea mays), onde inoculou-se no tecido
foliar, nos pecíolos e no colmo das plântulas. Para as inoculações foram
utilizadas 10 plantas de cada espécie aos 20 dias de emergência. O substrato
das bandejas onde as plantas cresceram apresentavam mistura de 50% de
substrato comercial Plantimax ® e 50 % de areia auto clavada.
Foram utilizadas três metodologias para as inoculações, sendo:
suspensão de conídios pulverizados na parte aérea das plantas (Nechet &
Halfeld - Vieira, 2005), e a utilização de palitos de dente contaminados com
40
micélio fungico (Damincone, et. al, 1988) e introduzidos diretamente no tecido do
pecíolo e colmo das plantas, e a utilização de discos de micélio. Para
metodologia da inoculação de conídios foi utilizada a suspensão de 1 x 106
conídios/mL, pulverizado com borrifador manual sobre os tecidos da parte aérea
(folhas, pecíolos, etc.). A metodologia do palito de pente foi feita a partir da
repicagem do fungo em meio BDA, juntamente com os palitos de dentes
esterilizados colocados na mesma placa, após 10 dias os palitos foram retirados
das placas e introduzidos no pecíolo e colmo das plântulas. A terceira
metodologia utilizada foi a do disco de micélio, recortados com diâmetro de 0,5
cm, os quais foram introduzidos e fixados em pequenos ferimentos com auxílio
de alfinete estéril.
Após as inoculações as plantas permanecerem em câmara úmida por 48
horas, e em seguida foram levadas para casa de vegetação, onde após 10 dias
foram realizadas as avaliações da patogenicidade. Quando foram visualizados
os sintomas no tecido inoculado, o fungo foi reísolado e cultivado em meio BDA.
Depois o mesmo foi novamente inoculado e reísolado em meio BDA, visando o
cumprimento de todas as etapas dos postulados de “Koch”.
Apenas os fungos que foram patogênicos às plantas cultivadas tiveram a
sua patogenicidade testada na própria planta de origem, com a finalidade de
saber se o mesmo era patogênico também à planta daninha de onde a semente
foi coletada. Foram utilizadas as mesmas metodologias descritas anteriormente
para inoculação, câmara úmida, e cumprimento dos postulados de Koch.
41
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A análise sanitária das sementes de plantas daninhas identificou os
seguintes gêneros de fungos: Cladosporium, Curvularia, Fusarium, Bipolaris,
Phoma, Nigrospora, Aspergillus, Rhizopus, Alternaria, Papularia, Rhizoctonia,
além de microrganismos com características de Oomicetos (Hifas cenocíticas,
esporângios e zoospóros). No presente trabalho fungos dos gêneros Aspergillus,
Rhizopus, Papularia, Phoma, Nigrospora e Cladosporium, não foram utilizados
para testes de patogenicidade, devido ao fato de que geralmente estes gêneros
estarem relacionados na sua grande maioria à condições inadequadas de
armazenamento, ou são contaminantes em sementes (Machado, 1988).
De acordo com os resultados obtidos (tabela 01), verifica-se que das 12
espécies de plantas daninhas, somente as sementes de Pennisetum setosum e
Tridax procumbens apresentaram fungos patogênicos, apesar das outras
espécies apresentarem os mesmos gêneros de fungos que podem apenas
estarem associados as sementes, sendo portanto, considerados não
patogênicas ou contaminantes, ou ainda serem endofiticos. Deve-se considerar
que os testes de patogenicidade foram realizados em apenas cinco culturas de
interesse agronômico, mas porém alguns gêneros mesmo não tendo sido
patogênico, sabe-se que apresentam espécies que podem ser patogênicas em
condições favoráveis, como e o caso de Bipolaris que possui espécies
importantes para agricultura, causando manchas foliares desde grandes culturas
como arroz (Celmer et al., 2007; Ludwig et al., 2009; Ottoni et al., 2007), milho
e gramíneas forrageiras (Martinez; Franzener; Stangarlin, 2010; Ottoni et al.,
2007; Santos et al., 2014). O gênero Alternaria, também apresenta espécies
patogênicas à diversas plantas, como milho, girassol, tomate, cebola e alho
(Ariosa; Herrera, 1988; Leite, G. L. et al., 2003; Leite, R. M.; Amorim, 2002) .
42
Tabela 01:Testes de patogenicidade de fungos isolados de sementes de plantas daninhas em Arroz (Ar), Feijão (Fe), Feijão caupi (Fc), Soja (So) e Milho (Mi).
Origem Fungos
Patogenicidade
Ar Fe Fc So Mi
Spermacoce
latifólia Aubl
Fusarium sp. (1)* - - - - -
Fusarium sp. (2)* - - - - -
Fusarium sp. (3)* - - - - -
Oomiceto** - - - - -
Ipomea sp
Curvulária sp.*** - - - - -
Alternaria sp.*** - - - - -
Acanthospermum
australe
Fusarium sp. (1)* - - - - -
Fusarium sp. (2)* - - - - -
Alternaria sp.*** - - - - -
Cencrhus
echinatus L.
Fusarium sp. * - - - - -
Curvulária sp.*** - - - - -
Oomiceto** - - - - -
Pennisetum
setosum
Fusarium sp.(1)* + - - - +
Fusarium sp. (2)* - - - - -
Fusarium sp. (3)* - - - - -
Fusarium sp. (4)* - - - - +
Curvulária sp. (1)*** - - - - +
Curvulária sp. (2)*** - - - - -
Bipolaris sp.*** - - - - -
Alternaria sp.*** - - - - -
43
(Continuação)
Origem Fungos
Patogenicidade
Ar Fe Fc So Mi
Vernonia
polyanthes
Fusarium sp. (1)* - - - - -
Fusarium sp. (2)* - - - - -
Tridax
procumbens
Curvularia sp.*** - - - - -
Fusarium sp. (1)* - + + + -
Fusarium sp. (2)* - - - + -
Fusarium sp. (3)* - - - - -
Bipolaris sp.*** - - - - -
Alternaria sp.*** - - - - -
Oomiceto (1)** + - - - +
Oomiceto (2)** - + + - -
Echinochloa crus-
pavonis
Curvularia sp.*** - - - - -
Fusarium sp (1)* - - - - -
Fusarium sp (2)* - - - - -
Bipolaris sp*** - - - - -
Alternaria sp*** - - - - -
Digitaria
horizontalis
Curvulária sp.*** - - - - -
Fusarium sp. * - - - - -
Bipolaris sp.*** - - - - -
Alternaria sp.*** - - - - -
44
(Conclusão)
Origem Fungos
Patogenicidade
Ar Fe Fc So Mi
Eleusine indica
Fusarium sp.(1)* - - - - -
Fusarium sp. (2)* - - - - -
Sida rhombifolia
Fusarium sp. (1)* - - - - -
Fusarium sp. (2)* - - - - -
Fusarium sp. (3)* - - - - -
Fusarium sp. (4)* - - - - -
Bidens pilosa
Fusarium sp. (1)* - - - - -
Fusarium sp.(2)* - - - - -
Alternaria sp. *** - - - - -
Curvulária sp. *** - - - - -
- Não patogênico, + patogênico, (1) código isolado, * inoculação via palito de dente, **
inoculação via disco de micélio, *** inoculação via suspensão concentrada de esporos.
Foi verificado no presente trabalho que sementes de Pennisetum setosum
apresentaram três isolados de fungos patogênicos. Entre estes Curvularia spp.,
provocou manchas no limbo foliar de plantas de milho e causou a perda de área
fotossintética (figura 01). Outras espécies deste gênero, podem causar manchas
foliares em outras plantas, incluindo as forrageiras, e são transmitidas via
sementes (Santos et al., 2014). No milho, Curvulária causa a doença conhecida
como mancha de curvulária (Fernandes; De Oliveira, 1997), sendo a mesma já
conhecida e relatada em outros trabalhos (Carvalho et al., 2011; Vaz-De-Melo
et al., 2010) realizados no estado do Tocantins. Outros dois isolados
fitpatogênicos foram classificados como Fusarium spp., sendo que um deles
apresentou patogenicidade às plântulas de Arroz e Milho, o outro somente ao
Milho. O gênero Fusarium, apresenta diversas espécies com potencial
fitopatogênico, mas em geral ataca mais as gramíneas. Como patógenos desde
45
grupo encontra-se espécies do complexo Fusarium fujikuroi, onde destacam-se
as espécies de F. verticillioides, F. proliferatum e F. subglutinans (Leslie;
Summerell, 2008), responsáveis pelas podridões em colmo, e tombamento de
plântulas, podridões das radículas e grãos (Souza; Araújo; Nascimento, 2007).
Foi verificado que Fusarium spp. causou lesões em colmo de plântulas de milho
(figura 02), após 15 dias da inoculação, onde as lesões evoluíram para podridão
de todo o colmo, levando a morte de todas as plântulas inoculadas. Este
resultado demonstra a alta agressividade deste fungo, que uma vez seja
introduzido em uma área, pode comprometer seriamente o stand e o crescimento
das plantas nos cultivos comercias. Trigiano , et al. (2010), citam que fungos
deste gênero classificam-se também como patógenos habitantes de solo , onde
quando na ausência da planta hospedeira possuem hábito saprofítico, que
podem levar os mesmos a sobreviverem por longo período de tempo, dificultando
ainda mais a adoção de medidas de manejo, tornando-as poucos eficazes e com
custos elevados.
Figura 1: A e B - Mancha - de - curvularia em folhas de milho; C - Curvularia spp em sementes de Pennisetum setosum., D - Conidios de Curvulária spp.
46
Figura 2: Podridão causada por Fusarium spp em colmo de plântulas de milho, inoculadas a partir de sementes de Penissetum setosum.
A espécie T. procumbens apresentou nas sementes quatro isolados
fúngicos considerados patogênicos, sendo que dois deles foram identificados
como Fusarium spp, e os demais com características semelhantes a Oomicetos
(Hifa cenocítica, formação de esporângios com zoósporos). Os isolados
identificados como pertencentes ao gênero Fusarium apresentaram
patogenicidade as plantas leguminosas, causando sintomas de murcha e
podridão do colmo e pecíolos, sendo um isolado patogênico à soja e outro
isolado patogênico ao feijoeiro comum, feijão caupi e soja. Zhang et al. (2006)
descreveram o complexo F. solani como importante causador de lesões em
leguminosas, provocando podridões em raízes, folhas e colmos, destacando-se
a espécie de F. solani f.sp. glycines, causador da podridão vermelha da raiz em
soja ou PVR, F. solani s.sp. phaseoli, causador da podridão radicular em feijão,
embora a espécie F. solani f.sp glycines também pode causar podridão radicular
em feijão (Roy, 1997; Roy et al., 1997).
Os isolados com características de Oomicetos apresentaram
patogenicidades à plantas de famílias distintas, provocando sintomas de
47
podridões no colmo e pecíolos, levando a morte das plântulas inoculadas,
demonstrando deste forma uma alta agressividade. Entre eles um isolado foi
patogênico ao feijão (P. vulgaris) e feijão caupi (V. unguiculata) e um isolado
patogênico as gramíneas, no caso plântulas de arroz e milho (Figura 03).
Figura 3: A - Lesão de Oomiceto spp em folhas de feijão, B - Lesão de Oomiceto spp em folhas de feijão caupi, C e D - Inoculação de Oomiceto spp. em Arroz, E - Inoculação de Oomiceto spp em milho e F - Podridão de Oomiceto spp em colmo de milho.
Dentre os principais gêneros de Oomicetos causadores de podridões em
colmo e raízes, destacam-se os gêneros Pythium e Phytophtora, os quais
possuem características especificas como hifas cenocíticas e formação de
esporângio com zoósporos (Amorim, et al. 2011). No presente trabalho a
identificação não chegou ao nível especifico de gênero ou espécie, e desta
48
forma, de acordo com estas características pode-se apenas afirmar que
pertencem classe dos Oomicetos.
De acordo com Kimati et al., (2004) estes microrganismos pertencem ao
reino Chromista, tendo como representantes patógenos que podem causar
podridão em Milho (Pythium aphanidermatum, Pythium spp), Arroz (P.
arrhenomames), Feijão Caupi (P. aphanidermatum) e Feijão comum (P. spp, P.
ultimum, P. irregulare, P. paroecandrum, P. myriotylum e P. aphanidermatum)
(Kimati et al., 2004).
Os fungos que tiveram sua patogenicidade confirmada também foram
inoculadas no própria planta daninha, que produziu as sementes. De acordo com
os resultados obtidos verificou-se que apenas um isolado de Fusarium spp
provocou sintomas de murcha quando inoculado em Tridax procumbens (tabela
02). Este mesmo também causou murcha e podridão quando inoculado em
plântulas de soja.
Tabela 02:Patogenicidade de fungos encontrados associados à sementes de
plantas daninhas presentes no cerrado do Tocantins.
Planta daninha Fungo Patogenicidade
Pennisetum setosum
Fusarium spp (1)* -
Fusarium spp (4)* -
Curvularia sp (1)*** -
Tridax procumbens
Fusarium spp (1)* -
Fusarium spp (2)* +
Oomiceto (1)** -
Oomiceto (2)** -
- não patogênico + patogênico;
O fato de que o gênero Fusarium ter sido patogênico à própria planta
daninha, de onde o mesmo foi isolado demonstra que além de ser hospedeira, a
mesma pode ser afetada pelo microrganismo que foi transmitido por meio de
suas sementes. Com relação aos outros isolados, estes não apresentaram
patogenicidade às plantas daninhas, o que demonstra que os fungos podem
permanecer como endofíticos às mesmas, ou seja podem permanecer no interior
dos tecidos dos vegetais sem causar danos ou formar estruturas externas
49
visíveis (Azevedo et al., 2000), podendo colonizar folhas, ramos e raízes (Peixoto
Neto et al. 2002), ou sementes. Vale salientar que mesmo não desenvolvendo
os sintomas da doença, podem manter-se como fonte de inóculo para plantas
cultivadas. Rodrigues e Menezes (2002) em trabalhos de detecção de fungos
endofíticos em sementes de feijão caupi encontraram espécies endofiticas de
Fusarium solani, F. oxysprorum e F. moniliforme, espécies já conhecidas pela
patogenicidade à plantas (Leslie; Summerell, 2008). O gênero Fusarium também
foi relatado por (Mussi-Dias et al., 2012) como sendo endofítico à sementes de
plantas medicinais da espécie Cymbopogon citratus.
50
CONCLUSÕES
Sementes de Plantas daninhas das espécies de Tridax procumbens e
Pennisetum setosum apresentam-se potencialmente como fonte de inóculo de
fungos fitopatogênicos para culturas de interesses comercias.
O gênero Fusarium apresentou isolados patogênicos ao arroz, milho, soja,
feijão e feijão caupi, causando nas plântulas podridões do colmo e pecíolos.
Microrganismos Oomicetos encontrados em sementes de Tridax
procumbes desenvolveram podridão em colmo de plântulas de arroz, milho,
feijão e feijão caupi, demonstrando alta agressividade.
Sementes das plantas daninhas transportam fungos fitopatogênicos, o
que pode comprometer a sanidade de plantas cultivadas caso as mesmas não
forem corretamente manejadas, levando a grande prejuízos.
Os resultados obtidos no presente trabalho demonstram que as sementes
de plantas daninhas abrigam microrganismos, principalmente fungos que são
capazes de provocar doenças em plantas daninhas ou em plantas cultivadas ou
podem abrigar fungos endofíticos à planta hospedeira, mas que podem
representar fonte de inóculo para outras plantas de diferentes famílias.
51
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56
CAPÍTULO III
Análise morfológica e molecular de Fusarium spp.
isolados de sementes de Tridax procumbes L. e
Pennisetum setosum (SW. Rich.)
57
Análise morfologia e molecular de Fusarium spp. isolados de sementes
de Tridax procumbes L. e Pennisetum setosum (SW. Rich)
RESUMO
Fungos do gênero Fusarium são amplamente distribuídos ao redor do mundo,
podendo estar ou não associados a espécies vegetais, na forma saprofítica,
endofìtica ou como parasita. Espécies do referido gênero são responsáveis por
diversos por diversas doenças em plantas cultivadas, causando principalmente
podridões radicular e murchamento. A correta identificação das espécies e de
suma importância para conhecimento e manejo da doença, sendo essas
identificações baseiam-se principalmente em características morfológicas como
formas e tamanho dos esporos assexuais, morfologia das hifas, formação de
clamidósporos e características das celular conidiogênicas. Técnicas
moleculares como sequenciamento de nucleotídeos de DNA amplificados pela
PCR (Reação de polimerase em cadeia), partindo de genes específicos como
calmodulina e β-tubulina, além de analises de restrição através de enzimas
especificas tem contribuído nas identificações de diferenciações genéticas entre
as espécies. No presente trabalho foi realizado a caracterização morfológico e
molecular de isolados de Fusarium spp, oriundo das sementes de Pennisetum
setosum e Tridax procumbens, através caracteres morfológicos e moleculares
os quais foram patogênicos a culturas agrícolas. Dos fungos isolados todos
tiveram seu padrão de amplificação em torno de 600 pb com pequena variação
amplificando as regiões ITS1 e ITS4. Com o intuito de correlacionar a
caracterização molecular, através da digestão e a classificação morfológica, os
isolados foram agrupados de acordo com a identificação morfológica. As
técnicas morfológicas e moleculares possibilitaram a caracterização das
espécies Fusarium.verticilioides, F. proliferatum e F. semitectum, associadas à
sementes de Pennisetum setosum e F. semitectum e F. solani associadas a
sementes de Tridax procumbens.
Palavras – chave: Patógenos, DNA, morfologia, perfil de restrição.
58
Morphological and molecular analysis of Fusarium spp. isolated from
seeds of Tridax procumbes L. and Pennisetum setosum (SW. Rich)
ABSTRACT
Fusarium fungi are widely distributed around the world, and may or may not be
associated with plant species, the saprophytic form, or as parasitic endophytic.
Species of this genus are responsible for many diseases in several cultivated
plants, especially root rot and causing wilting. The correct identification of the
species and of paramount importance to knowledge and management of the
disease, and these identifications are based mainly on morphological features
like shapes and size of asexual spores, hyphal morphology, chlamydospores
formation and characteristics of cell Conidiogenous. Molecular techniques such
as DNA sequencing nucleotides amplified by PCR (polymerase chain reaction),
starting from specific genes such as β-tubulin and calmodulin, and by restriction
analysis of specific enzymes has contributed in the identification of genetic
differences between species. In the present work was carried out morphological
and molecular characterization of Fusarium spp isolates, oriund seeds of
Pennisetum setosum and Tridax procumbens, through morphological and
molecular characters, which were pathogenic to crops. The isolated fungi all had
their standard of amplification around 600 bp with little variation amplifying ITS1
and ITS4 regions. In order to correlate the molecular characterization by digestion
and the morphological classification, the isolates were grouped according to the
morphological. The morphological and molecular techniques enabled the
characterization of Fusarium.verticillioides species, F. proliferatum and F.
semitectum associated with the seeds of Pennisetum setosum and F. solani and
F. semitectum associated with seeds Tridax procumbens.
Keywords: Pathogens, DNA, morphology, Profile of restriction.
59
INTRODUÇÃO
Fungos do gênero Fusarium são amplamente distribuídos ao redor do
mundo, habitando todo o tipo de substrato, associado ou não às plantas ,
podendo sobreviver por longos períodos de tempo na forma saprofítica, como
restos culturais e matéria orgânica, mas também causando doenças em
diferentes espécies de vegetais, causando grandes prejuízos econômicos em
cultivos agrícolas (Leslie & Summerell., 2006).
Espécies de Fusarium foram responsáveis por causar fenômenos sociais
importantes como o surto do mal da Panamá nas extensas lavouras na América
Central, sendo que o fungo F. oxysporum f.sp. cubense devastou vários plantios
(Ploetz, 1960). Em relação ao trigo ocorreu outra importante epidemia, sendo F.
graminearum responsável pela epidemia no meio oeste americano,
conseqüentemente, registrando grandes perdas (Wildels, 2000). Na Argentina,
foi constatado surto da podridão vermelha da raiz associada à soja (Scandiani et
al., 2004).
Para identificação das espécies do gênero tradicionalmente realiza-se a
análise morfológica, com base em características como formas dos esporos,
microconidios e macroconidios, Presença ou não de hifas estéreis, coloração da
colônia, micélio aéreo ou difuso, formação ou não de clamidósporos, número de
septos por conídio, disposição dos conídios sobre as células conidiogênicas
mono ou polifiálide entre outras (Leslie; Summerell, 2008; Nelson; Toussoun;
Marasas, 1983). Porém, a identificação baseada em caracteres morfológicos
constitui-se de uma tarefa muito complexa que também pode gerar controvérsias
devido à grande variabilidade de características fenotípicas analisadas, sendo
que essas características não são concordantes com agrupamentos obtidos
através de análises moleculares (Martins, 2005).
O gênero Fusarium é o terceiro mais estudado dos fungos fitopatogênicos.
O gênero está agrupado em complexo de espécies, sendo que este agrupado é
baseado em características morfológica, filogenética e biológica (Kvas et al.,
2009). O complexo de espécies do Fusarium fujikuroi apresenta importantes
espécies fitopatogênicas associadas principalmente à plantas pertencentes ao
gênero Poaceae, causando doença ou como endófito (Leslie & Summerell,.
60
2006). No complexo de espécies de F. solani, existem várias linhagens
filogenéticas. No entanto, baseado apenas nos marcadores morfológicos estas
linhagens ou espécies não são distinguidas. O complexo de espécies do F. solani
compreende diversas espécies de patógenos associadas a um grande número
de plantas cultivadas, além de patógenos em humanos e animais. Além de existir
espécies com habilidade de produção de toxinas, endofiticas e saprófitos (Zhang
et a., 2006). Este complexo apresenta poucos marcadores morfológicos e são
escassos, para a fase anamórfica e teleomórfica (O’ Donnell & Gray, 1995).
Várias espécies de alguns complexos estão associadas às plantas
causando diversos tipos de doenças, no entanto, também estão associadas com
humanos imunodepresivos. Recententemente, F. musae agente etiológico de
podridão da coroa em frutos de banana, foi isolado associado a sangue e
biopsias (Triest et al., 2015). F. guttiforme, outra espécie do complexo Fusarium
fujikuroi, agente etiológico da fusariose em abacaxizeiro, também foi registrado
causando micoses em humanos no norte da Itália (Migheli et al., 2010).
Aproximadamente 50 espécies de Fusarium estão associadas a algum tipo de
doença em clínicas. Já foram constatados alguns membros do FFSC como: F.
verticillioides, F. napiforme, F. nygamai, F.sacchari, F. proliferatum e antophilum
associado a algum tipo de doença ou lesões em pacientes imunodepressivos
(Nussi & Anaissie., 2007).
As espécies de Fusarium além de causar doenças em plantas também
podem prejudicar a saúde humana e animal, principalmente devido à produção
de toxinas. As espécies do complexo F. verticillioides e F. thapsinum são
produtoras de fumonisinas. Estas toxinas são responsáveis por causar edema
pulmonar, abortos, alteração no crescimento de animais leucocefalamafia em
equineos (Marasas 2001). Além deste fato, acredita que fumonisinas podem ser
fator de patogenicidade. Isolados de F. verticillioides produtores de fumonisinas
causam sintomas de necrose em folhas de plântulas de milho, demonstrando
que a síntese de fumonisinas é importante na interação F. verticillioides x milho
(Glenn et al., 2008).
A identificação de Fusarium envolve três conceitos de espécies: o de
espécie morfológica baseada na similaridade dos caracteres morfológicos
observáveis, denominados de marcadores morfológicos; o de espécies
biológicas, baseado na compatibilidade sexual entre membros das mesmas
61
espécies; e o conceito de espécie filogenética baseada na análise de seqüências
gênicas.
O conceito de espécies morfológicas tem muita importância para uma
classificação inicial de biodiversidade. Caracteres estruturais e fisiológicos têm
sido usados como marcadores morfológicos para diferenciar espécies do gênero
Fusarium, mas o problema é que as espécies pertencentes ao F. fujikuroi
consiste de sete espécies biológicas designadas por letras de A a M (Leslie &
Summerell., 2006; Scalflaire et al., 2012; Van houve et al., 2011; Lima et al.,
2012). A seqüência gênica é usada para auxiliar a classificação de espécie de
Fusarium. Alguns dos mais comumente utilizados são os genes que codificam
para a beta-tubulina e fator de elongação (O`Donnel et al, 2000). A adoção de
novos modelos de classificação afeta a taxonomia do gênero já que por décadas
foi baseada simplesmente em caracteres morfológicos.
Diversas técnicas moleculares como sequenciamento de nucleotídeos de
DNA amplificados pela PCR (Reação de polimerase em cadeia), partindo de
genes específicos como calmodulina e β-tubulina (Martins, 2005), contribuíram
para correta identificação de espécies patogênicas, proporcionado melhores
ferramentas para estudo da interação planta hospedeiro, bem como tomadas de
decisões envolvendo técnicas de manejo das doenças. Para determinação de
espécies de Fusarium existem primers específicos. Para F. verticillioides, F.
proliferatum e F. subglutinans foram descritos primers específicos (Mulè et al
2004). Além disso, análise de sequenciamento e restrição da região ITS (Internal
Transcribed Spacer) tem sido amplamente utilizadas (Oliveira & Costa 2002;
Brasileiro et al. 2004; Chehri et al. 2011), esta região separa os genes 18S e
28S do rDNA e que pode ser amplificada com primers específicos ancorados
nessas duas regiões, sendo altamente conservada intra-especificamente, mas
variável entre diferentes espécies, o que possibilita a distinção ao nível
específico (Fungaro,2000). Em geral todas estas técnicas tem auxiliado na
identificação de espécies de Fusarium atuando como uma ferramenta
complementar ao processo de caracterização morfológica, minimizando os erros
de identificação.
De acordo com a literatura consultada foi constatado que existem poucos
trabalhos caracterizando espécies de Fusarium associadas a sementes de
plantas daninhas no Brasil e na literatura mundial. Desta forma, o objetivo deste
62
trabalho foi caracterizar Fusarium spp. isolados de sementes de Tridax
procumbes L. e Pennisetum setosum (SW. Rich.) através de caracteres
morfológicos e moleculares.
63
MATERIAL E MÉTODOS
Caracterização Morfológica
As análises morfológicas dos fungos foram realizadas no laboratório de
Sistemática e Ecologia de Fungos da Universidade Federal de Lavras – MG,
onde foram identificadas as espécies, Fusarium verticillioides, Fusarium
proliferatum, Fusarium solani e Fusarium semitectum, conforme tabelas 1 e 2.
A caracterização morfológica dos isolados foi realizada seguindo as
especificações descritas em Nirenberg & O’Donnell (1998) e Leslie & Summerell
(2006). Os isolados foram crescidos em placas plásticas de Petri de 6 cm de
diâmetro, nos meios batata dextrose ágar (BDA) e em synthetic poor nutrient
agar (SNA) com folha de cravo e foram incubados em BOD a 25ºC no escuro e
a 20ºC com fotoperíodo de 12 horas, respectivamente. A morfologia,
pigmentação, odor e taxa de crescimento das colônias foram avaliadas em BDA
após quatro dias da inoculação. As características micromorfológicas foram
avaliadas em SNA com folha de cravo 14 dias após a inoculação.
Caracterização Molecular
As análises moleculares dos fungos foram realizadas no laboratório de
Controle Biológico de Doenças do Casadinho, na Universidade Federal do
Tocantins – TO, onde foram feitas as análises de digestão. Já o sequenciamento
foi feito na Universidade Federal de Lavras.
Sequenciamento
A extração do DNA foi feita a partir de um isolado (F. verticilioides)
crescidos em Meio líquido de Extrato de Malte 4% por três dias a 100 rpm em
temperatura ambiente em um agitador orbital, para a produção de biomassa. A
biomassa foi filtrada e a extração do DNA foi feita utilizando-se o tampão CTAB
seguindo o protocolo descrito por Leslie e Summerell (2006).
A amplificação do fragmento do gene fator de elongação 1-α foi realizada
utilizando os primers Ef-1 (forward; 5’-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3’) e Ef-2
64
(reverse; 5’-GGAAGTAC CAGTGATCATGTT-3’) gerando um fragmento de
aproximadamente 691 pb (O’ O’Donnell et al., 1998). A sequência obtida no
sequenciamento foi comparada com outras sequências de bancos públicos no
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Essa comparação com o banco de
dados foi realizada utilizando-se o programa BlastX (Altschul et al., 1997).
Extração de DNA para Perfil de Restrição
Para a extração de DNA, primeiramente os isolados foram cultivados em
meio de cultura BDA e incubados por sete dias. Discos de BDA contendo o
micélio do fungo foram excisados e inoculados em 60 mL de meio líquido extrato
de levedura (10 g de extrato de levedura, 10 g de dextrose, 1 L de água destilada)
contendo antibiótico Cloranfenicol na concentração de 200mg/L . Posteriormente
foram mantidos em agitação (120 rpm) durante sete dias a 27 ºC, para o
crescimento do micélio. Após este período de crescimento, o micélio foi separado
do meio líquido por filtração a vácuo, após a lavagem com água destilada estéril
foi coletado e imediatamente colocado em nitrogênio líquido e macerado com o
auxílio de graal e pistilo. A extração do DNA foi efetuada pelo método CTAB
descrito por Zolan & Pukilla, 1986, com algumas modificações conforme segue.
Cerca de 0,5 g do micélio foi suspenso em 1 mL de tampão de extração CTAB
pré-aquecido a 65 °C (2% p/v de CTAB; 2,5% p/v de PVP; 2M de NaCl; 100 mM
Tris-HCl (pH 8,0), 25mM EDTA pH 8,0) e adicionado de 2% (v/v) de beta-
mercaptoetanol . Após homogeneização, as amostras foram incubadas por 40
minutos a 65 °C. Em seguida, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos
a 11.000 rpm. Após a separação do tecido da fase aquosa procedeu-se a
extração com clorofórmio / álcool isoamílico (24:1). O RNA foi degradado por
tratamento com RNase A (50 mg / ml) durante 30 min a 37 °C. O DNA foi então
precipitado pela adição de 2,5 volumes de etanol absoluto e sedimentadas por
centrifugação durante 15 min a 12.000 rpm. O sedimento foi lavado com etanol
a 70%, e re-suspenso em agua ultra pura. A concentração de DNA e a pureza
foram medidas usando um espectrofotómetro (Biowave DNA) a 260 e 280 nm. A
integridade das amostras foram verificadas em gel de agarose a 1% corado com
Blue Green ( LGC Biotecnologia) e visualizado sob uma luz UV, através de um
foto documentador (Gel Logic 112).
65
Condição PCR
Para a amplificação da região ITS dos isolados, foram utilizados os
primers ITS1 (5' -TCCGTTGGTGAACCAGCG G-3') e ITS4 (5'-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') (White et al, 1990). A reação de amplificação
foi realizada com um volume final de 20uL, sendo 4uL do Tampão, 2uL de
Cloreto de Magnésio, 1uL de dNTP (100mM), 1 uL de cada primer (F/R) com
0,3uL da enzima Gotaq (Promega) e 1 uL de DNA molde (50ng). A mistura foi
submetida a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em um termociclador
Techne TC-5000. O ciclo de amplificação se deu com uma desnaturação inicial
por 2 min a 95 ° C, seguido de 38 ciclos sendo desnaturação a 95°C por 30
segundos, anelamento por 1 minuto a 51° C , extensão por 1 minuto a 72° C
antes da extensão final de 5 minutos a 72 ° C. O produto da PCR foi visualizado
em gel de agarose a 1,4% e corado com BlueGreen ( LGC Biotecnologia),
através de um fotodocumentador (Gel Logic 112).
Análise de Restrição
Alíquotas de 10 uL dos produtos de PCR foram digeridos com 10 unidades de
enzimas de restrição HpaII, HaeIII e EcoRI, de acordo com as instruções do
fabricante (Jena Bioscience). Os fragmentos de restrição foram separados em
gel de agarose a 2,5%, por 45 minutos a 110V e 400 mA . As amostras foram
coradas com Blue Green (LGC Biotecnologia). Os fragmentos de restrição foram
visualizados sob UV e foi utilizado para estimar o tamanho dos fragmentos de
restrição. A análise de restrição foi repetido duas vezes.
66
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Caracterização Morfológica
Os isolados obtidos de Penissetum setosum e Tridax procumbes foram:
F. verticillioides, F. proliferatum e F. semitectum. F. verticillioides, a forma de
identificação destes isolados pode ser observada nas tabelas 01 e 02.
Tabela 01: Identificação das espécies de Fusarium spp associadas a sementes de Pennisetum setosum.
Isolado Espécie
Método de identificação da espécie
Morfológico Restrição Sequenciamento
Fusarium
spp(1)
Fusarium
verticillioides + + +
Fusarium
spp (2)
Fusarium
semitectum + + -
Fusarium
spp (3)
Fusarium
semitectum + + -
Fusarium
spp (4)
Fusarium
proliferatum + + -
Tabela 02: Identificação das espécies de Fusarium spp associadas a sementes de Tridax procumbes.
Isolado Espécie
Método de identificação da espécie
Morfológico Restrição Sequenciamento
Fusarium
spp(1)
Fusarium
solani + +
Fusarium
spp (2)
Fusarium
solani + + -
Fusarium
spp (3)
Fusarium
semitectum + + -
Fusarium
spp (4)
Não
identificado - - -
+ Identificado,- Não identificado, (1) Número do isolado;
67
Em relação aos caracteres morfológicos, os isolados obtidos de
Penissetum setosum (F. verticillioides, F. proliferatum e F. semitectum. F.
verticillioides), apresentam microconidios produzidos em longas cadeias e em
monofiálides, cor da colônia salmão a violeta e produção de poucos
esporodoquios. A coloração das culturas desta espécie é variável, a coloração
pode ser mais evidente com a idade da cultura. sendo este marcador pouco
informativo (Leslie & Summerell., 2006). Em relação a pigmentação em BDA,
observou-se a produção de pigmentos vermelho a róseo. Em uma única exceção
foi possível distinguir espécies de Fusarium do complexo Fusarium fujikuroi.
Isolados de F. thapsinum, produtores de pigmentos amarelos são distinguidos
de F. verticillioides, no entanto para aqueles isolados de F. thapsinum não
produtores de pigmentos são facilmente confundido com F. verticillioides ( Klittich
et al 1997). Anteriormente, os isolados que produziam microconidios em longas
cadeias e em falsa cabeça, recebia o nome de “F. moniliforme”. No entanto, este
nome esta em desuso, devido ao desmembrado em várias linhagens
filogenéticas e biológicas (Seirfeit 1996). Em diversos trabalhos, considera-se
que a espécie predominante associado ao milho causando podridão de colmo e
espigas, nas regiões tropicais é F. verticillioides. Além disso, algumas espécies
utilizam estratégias de sobrevivência colonizando plantas da família Poaceae e
atuando como endófito (Leslie et al 2004; Leslie & Summerell., 2006; Lanza et al
2014).
Na coleção de Fusarium obtido de Penisetum, 4 isolados foram
identificados como sendo F. proliferatum. Estes isolados apresentaram
microconidios produzidos em cadeias curtas, presença de polifiálides, coloração
violeta a salmão e ausência de clamidósporos. Morfologicamente, F. proliferatum
e F. fujikuroi apresentam os mesmos marcadores morfológicos. F. nygamai,
apresenta microconidios em cadeias curtas e em polifiálides, no entanto esta
espécie apresenta clamidósporos, neste caso sendo possível serem separadas
pelos marcadores morfológicos (Leslie & Summerell). F. proliferatum é agente
etiológico de podridão de colmo e espiga em milho, eventualmente esta espécie
causa podridão de colmo em outras culturas como sorgo e cana de açúcar
(Kimati et ao.,1997) F. proliferatum foi à espécie predominante em levantamento
realizado nos Estados Unidos em gramíneas selvagem do gênero Andropogon.
68
Conseqüentemente, estes isolados apresentaram produção de altos níveis de
fumonisinas, ou toxinas produzidas pelo fungos (Leslie et al., 2004). Os autores
acredita que estas plantas se comporta como fonte de inoculo para varias
espécies de Fusarium de plantas cultivadas. No Brasil, F. proliferatum, F.
verticillioides, F. thapsinum, F. andiyazi e duas novas espécies foram obtidas de
plantas assintomáticas de Brachiaria spp. Ao inocular estes isolados, todos
causaram sintomas de podridão de colmo em milho, sorgo e milheto (Melo,
2014).
Outra morfoespécie encontrada em Penisettum foi F. semitectum. Os
isolados apresentaram crescimento rápido em BDA, com coloração creme,
aspecto cotonoso, produção de macroconidios e mesoconidios em polifiálides e
produção de abundantes clamidósporos (Leslie & Summerrel., 2006). Esta
espécie não é considerada um fitopatogeno, geralmente é encontrada associada
a podridões de frutos de banana na America central (Jimenez et al., 1997). A
taxonomia de F. semitectum variou ao longo do tempo. Foi descrita pela primeira
vez em 1875 e reconhecida por Wollenweber & Reinking, Booth, Gerlach &
Nirenberg e Nelson et al. Gerlach & Nirenberg descreveram três variedades, F.
semitectum var. semitectum, F. semitectum var. majus e F.
semitectum var.violaceum. Trabalhos recentes utilizando técnicas moleculares
indicam que F. semitectum provavelmente se trata de um complexo de espécie.
Para os isolados obtidos de T. procumbes foram obtidos isolados com
morfologia de F. solani. Estes isolados apresentaram crescimento rápido em
meio de cultura de coloração creme a bege, microconidios produzidos em falcas
cabeça e em fialídes longas. Os macroconidios apresentaram 3-5 septos e
clamidosporos verrugosos. Apenas baseado nas caracteristicas morfológicas
não é possível identificar as espécies de Fusarium pertencente ao complexo
Fusarium solani-FSSC. O que se chamava Fusarium solani f.sp. glycines foi
desmembrado em espécies filogenéticas e biológicas (Aoki et al., 2003).
69
Caracterização Molecular
Através da análise do sequenciamento podemos observar que o isolado
obteve 100% de identidade com Fusarium verticillioides (Figura 1)
Figura 1: Padrão de alinhamento gerado pelo algoritmo Blastx.
A análise da sequencia do DNA, através do sequenciamento, é uma das
ferramentas moleculares mais seguras para se caracterizar um organismos a
nível molecular (Barra et al. 2011), contudo o elevado custo e difícil acesso a
plataformas de sequenciamento torna o processo oneroso, o que gera a
necessidade de utilizar técnicas alternativas rápidas e mais acessíveis, como a
análise de restrição.
A figura 2 mostra que a região ITS (utilizada posteriormente para a análise
de restrição) foi amplificada em todos os isolados, mostrando um fragmento de
aproximadamente 600 pb, sendo que esta região é variável de 400 a 900 pb para
todas as espécies de fungos (Brasileiro, et al. 2004).
Figura 2: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação da região ITS 1
e 4. M: Marcador Molecular 1Kb; C+: controle positivo da reação, C-: controle negativo;
1 a 20: isolados de Fusarium
70
Todos os isolados mantiveram o mesmo padrão de amplificação,
(aproximadamente 600 pb) com uma pequena variação. De acordo com Chehri
et al. 2011, espécies de Fusarium amplificadas usando o ITS1 e ITS4 produziram
um padrão de bandas para F.semitectum de 550pb e F.solani 600pb. Com o
intuito de correlacionar a caracterização molecular, através da digestão e a
classificação morfológica, os isolados foram agrupados de acordo com a
identificação morfologica (Figura 3).
Como observado na figura 3 há uma grande semelhança entre a
morfologia das colônias, especialmente entre Fusarium verticilioides e Fusarium
proliferatum. Para a analise de restrição, foram separados ao total 20 isolados,
sendo inicialmente classificados em: F. verticilioides (amostras 14,8,1, 2,13); F.
semitectum (amostras16,3,4,7,12,26); F. proliferatum (amostras 9,11,21); F.
solani (24,25,28) as amostras 5 e 17 não foram classificadas morfologicamente,
e as amostras 8 e 11 funcionaram como um controle, pois estas amostras vieram
de isolados cedidos pela EMPRAPA Milho e Sorgo. Os padrões de todos os
isolados de Fusarium spp. após a digestão estão apresentados na Figura 4.
71
Figura 3: Morfologia da colônia em meio BDA - (A) Fusarium proliferatum;
(B) Fusarium solani; (C) Fusarium verticilioides; (D) Fusarium semitectum.
72
Figura 4: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação da região
ITS com o perfil de restrição para: (A) HpaII; (B) HaeIII; (C) EcoRI; com (M)
marcador molecular de 1Kb.
Através da análise de restrição dos produtos amplificados da região ITS 1
e 4 com as enzimas HpaII (A) e HaeIII (B) foi possível verificar a formação de 4
grupos, no entanto para a enzima EcoRI (C) não houve padrão diferencial entre
os isolados, (Figura 3 C), produzindo os mesmos padrões para os isolados de F.
oxysporum , F. semitectum, F. equiseti , F. solani. Além disso, houve uma
diferença na análise de restrição, onde os isolados 2 e 11 não apareceram em 2
repetições. Para a digestão com EcoRI foi gerado duas bandas de
aproximadamente 300 pb e 1 banda de aproximadamente 600pb. Há relatos de
73
outros trabalhos que não identificaram padrão de restrição utilizando a mesma
Enzima EcoRI, para a identificação de espécies de Fusarium. (Brasileiro et al.,
2004; Chehri et al., 2012).
A restrição com a enzima HaeIII e HpaII produziram padrões semelhantes
de dois fragmentos para F. verticilioides (amostras 8 e 1) sendo a amostra 8 um
padrão para F. verticilioides cedido pela EMBRAPA, as amostras 13 e 3
morfologicamente haviam sido classificadas como F. verticilioides, porém não
apresentaram o mesmo padrão de digestão e portanto, não agruparam com as
demais. Para os grupos F.proliferatum (amostras 26,11,21 e 2) e F.solani
(24,2728) não houve separação através da digestão. As demais amostras foram
agrupadas em F. semitectum, que aparentemente não apresentou nenhum sítio
de restrição (Tabela 3). De acordo com estes resultados podemos observar que
foi possível a separação dos isolados de Fusarium estudados, pois a restrição
com pelo menos 2 enzimas (HaeIII e HpaII) mostrando o mesmo padrão de
digestão já suporta a hipótese da existência de diversidade genética entre as
espécies (Brasileiro et al. 2004), permitindo assim os agrupamentos. Outros
trabalhos mostram que a digestão da região ITS com HaeIII foi eficiente para a
identificação em diferentes espécies de Fusarim (Bateman et al. 1996; O'Donnel
et al., 2000). Por outro lado, o uso de maior número de enzimas, reações com
primers específicos ou até mesmo o sequenciamento faz- se necessário para a
confirmação dos agrupamentos aqui propostos.
74
Tabela 03: Agrupamento das espécies de Fusarium de acordo com o padrão dos fragmentos de restrição da região ITS 1 e 4.
Espécie Isolado
Enzimas de Restrição
HpaII HaeIII EcoRI
F.semitectum 14 600 600 280+300+600
F.verticilioides 8 500+100 500+100 280+300+600
F.verticilioides 1 500+100 500+100 280+300+600
F.proliferatum 2 300+200+100 300+200+100 280+300+600
não agrupado 13 340+260 340+260 280+300+600
F.semitectum 16 600 600 280+300+600
não agrupado 3 340+260 340+260 280+300+600
F.semitectum 4 600 600 280+300+600
F.semitectum 7 600 600 280+300+600
F.semitectum 12 600 600 280+300+600
F.proliferatum 26 300+200+100 300+200+100 280+300+600
F.semitectum 9 600 600 280+300+600
F.proliferatum 11 300+200+100 300+200+100 280+300+600
F.proliferatum 21 300+200+100 300+200+100 280+300+600
F. semitectum 5 600 600 280+300+600
F. semitectum 17 600 600 280+300+600
F.solani 24 300+200+100 300+200+100 280+300+600
F.semitectum 25 600 600 280+300+600
F.solani 27 300+200+100 300+200+100 280+300+600
F.solani 28 300+200+100 300+200+100 280+300+600
* tamanho aproximado dos fragmentos gerados (pb)
75
CONCLUSÃO
Conclui-se que as técnicas moleculares aqui utilizadas são uma
alternativa eficiente para a separação de espécies de Fusarium, especialmente
F. verticilioides sendo ambas as técnicas de classificação (moleculares e
morfológicas) complementares.
De acordo com as análises moleculares utilizadas no presente trabalho
foi possível a caracterização das espécies Fusarium.verticilioides, F. proliferatum
e F. semitectum ,associadas à sementes de Pennisetum setosum e F.
semitectum e F. solani associadas a sementes de Tridax procumbens.
76
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente trabalho demonstrou a importância das sementes das plantas
daninhas como hospedeiras de microrganismos (Fungos) com capacidade de
provocar doenças em plantas, visto que já e descrito na literatura que as mesmas
podem ser hospedeiras de pragas e doenças, porém no presente trabalho ficou
comprovado que as sementes podem transportar fungos causadores de
importantes doenças para os cultivos agrícolas.
Ferramentas de análises moleculares utilizadas no presente trabalho
identificaram as espécies Fusarium.verticilioides, F. proliferatum e F.
semitectum, associadas à sementes de Pennisetum setosum e F. semitectum e
F. solani associadas a sementes de Tridax procumbens.
Os resultados do trabalho mostram que as sementes das plantas
daninhas transportam fungos fitopatogênicos, o que pode comprometer a
sanidade de plantas cultivadas caso as mesmas não forem corretamente
manejadas, levando a grande prejuízos.