ELETROFORESE CAPILARPRINCÍPIOS E APLICAÇÕES

PROF. Dr. MARCONE AUGUSTO LEAL DE OLIVEIRA

EXPERIMENTO DE TISELIUS (1937)

Separação de parcial de proteínas constituintes do soro sanguíneo (Prêmio Nobel de 1948)

2

4239.0 rkQT

=∆

∆T – diferença entre o centro e a parede do tubo

Q – densidade de potência

(Watts/m3)

K – condutividade térmica

r – raio do tubo

1930 FRONTEIRA MÓVEL A. TISELIUS1948 PRÊMIO NOBEL Uppsala University, Suécia

Colunas de 300 µm S. HJERTÉNUppsala University, Suécia

1979 Capilares de 100 µm F. M. EVERAERTSSeparação de 16 ânions Eindhoven University of Technology, Holanda

1981 Capilares de 75 µm J. JORGENSONFSCE – teoria simplificada University of North Carolina, EUA

LIF – detector de R. ZAREfluorescência Stanford University, EUAinduzida por laser E. YEUNG

Iowa State University, EUA

Detectores E. EWINGEletroquímicos Pennsylvania State University, EUA

1984 MEKC S. TERABEKyoto University, Japão

1986 INSTRUMENTOS COMERCIAIS

1987 CGE B. KARGERNortheastern University, EUA

1991 CEC KNOX e GRANTseparação de HPA´s University of Edinburg, Escócia

1997 MICROCHIP TECHNOLOGY

PERFIL DE TEMPERATURANO INTERIOR DE UM CAPILAR

REVESTIMENTO DEPOLIIMIDACENTRO

PAREDE

TEM

PE

RA

TUR

A

0 25 175 190

DIÂMETRO, µm

r1 r2 r3

2

4239.0 rkQT

=∆

ELETROFORESE CAPILAR (CE): CONCEITO

Injeção

-+Comprimento efetivo

DetectorCátion

Ânion

Neutro

+

-

mAu

Tempo, min

www.ceandcec.com/meekc.htm

INSTRUMENTAÇÃO

1-Fonte de alta tensão 3-Reservatórios para eletrólito e amostra2-Eletrodos

5-Injeção 6-Compartimento estabilizado termicamente4-Capilares

7-Detectores

PROPRIEDADES DO CAPILAR

- sílica fundida (dióxido de silício amorfo SiO2) revestidocom poliimida ou acrilamida (15 µm);- dimensões precisas (25 a 75 µm d.i. x 330 µm d.e.);- alta constante dielétrica;- baixa condutividade elétrica;- resistência mecânica;- maleabilidade;- resistência ao ataque químico;- alta transmissão óptica para um intervalo apreciável de comprimento de onda (190 a 990 nm);- presença de FLUXO ELETROOSMÓTICO;

Si OH

O

Si O Si O

O H

Si O Si O

O H

Si O Si O

O

Si O Si

O O:

Si O Si

O

Si O Si OH

O OH

Si

OH

SILANOL

silanóis vicinais(ponte de hidrogênio)

SILOXANO

silanóis geminais

silanol isolado

silanol dissociado

Si OH + H2O

pKa = 5,9

Si O- + H+

SÍLICA FUNDIDA

SUPERFÍCIE SOLUÇÃO

MODOS

DE

INJEÇÃO

Pvácuo

hHIDROSTÁTICA

+

ELETROCINÉTICA

INJEÇÃO HIDRODINÂMICA

INJEÇÃO ELETROCINÉTICA

DETECTORES UTILIZADOS EM CE

1010--1010 –– 1010--12121010--1717 –– 1010--1919RadiométricoRadiométrico

1010--66 –– 1010--881010--1414 –– 1010--1616Índice de refração Índice de refração

1010--77 –– 1010--991010--1515 –– 1010--1616CondutividadeCondutividade

1010--77 –– 1010--10101010--1818 –– 1010--1919AmperometriaAmperometria

1010--88 –– 1010--10101010--1616 –– 1010--1717Espectrometria de massasEspectrometria de massas

1010--1313 –– 1010--16161010--1818 –– 1010--2020fluorescência induzida por laserfluorescência induzida por laser

1010--66 –– 1010--881010--1414 –– 1010--1616Fluorescência indiretaFluorescência indireta

1010--77 –– 1010--991010--1515 –– 1010--1717FluorescênciaFluorescência

1010--44 –– 1010--661010--1212 –– 1010--1515Absorvância Absorvância indiretaindireta

1010--55 –– 1010--771010--1313 –– 1010--1616Absorvância Absorvância no UV/visno UV/vis

MolaridadeMolaridade**NNoo de Molde MolDetectorDetectorLimites de detecção aproximadosLimites de detecção aproximados

* Depende sobretudo do volume de amostra injetado

I0 IT

Fonte de luz Capilar Fotodetector

abcT

A ==1log

I0

I0log = A = ε b C

I

LEI DE BEER

I

SOLUTOε = 103 L mol-1 cm–1

C = 1 mmol L-1 =FATOR DE

200

CUBETA DE 1 cm

A = 1

CAPILAR DE 50 µm

A = 0,005

MANEIRAS DE AUMENTAR A SENSIBILIDADE EM DETECÇÃO POR UV/VIS

CAPILAR RETANGULAR CÉLULA EM Z

CÉLULA DE MULTIREFLEXÃO

Bubble i.d.

CÉLULA EM FORMA DE BOLHA

DETECÇÃO DIRETA POR UV/vis

+ -

Detector

Injeção

mAu

Tempo, min

A

C

B

Comprimento efetivo

A, B e C com alta absortividade molar

www.ceandcec.com/meekc.htm

DETECÇÃO INDIRETA

DetectorÂnionCátion+

-

+ -

Injeção

Baixa absortividade

molar

Zona translúcida do solvente

Zona escura do solvente

Zona translúcida do solvente

MECANISMO DE SEPARAÇÃO

MOBILIDADE ELETROFORÉTICA

MOBILIDADE ELETROOSMÓTICA

MOBILIDADE OBSERVADA

FLUXO NORMAL

FLUXO INVERTIDO

MOBILIDADE EFETIVA

MOBILIDADE ELETROFORÉTICA

E

+++

---+

EeZF ielétrica =

eFr

iiatrito vrηπ6F =

aFr

Evµ i

i = Mobilidade do íon correspondente a sua velocidade limite vi em um campo elétrico de valor unitário

ii

ii rηπ6

qrηπ6eZ

µ ==iii vrηπ6EeZ =

ii

ii rηπ6

qrηπ6

eZµ ==

B AC

- +

Detector

Injeção

mAu

Tempo, min

Comprimento efetivo

www.ceandcec.com/meekc.htm

MOBILIDADE ELETROOSMÓTICA-FLUXO NORMAL

E

+

-

SUPERFÍCIE

IHP OHP

CAMADACOMPACTA

CAMADADIFUSA

PLANO DECISALHAMENTO

SOLUÇÃO

Si Si Si Si

++ +Camada compacta

Plano de cisalhamento

++ + + +Camada móvel

+ -ânodo cátodo

Fluxo eletrosmótico (EOF)

Parede interna do capilar

πηεζ4Evosm =

Velocidade eletroosmótica

πηεζµ4

=osm

Mobilidade eletroosmótica

επδeζ 4

=

Potencial zeta

C1αδ

Evosm

osm =µ∑=i

2ii zc

21FI

PERFIL RADIAL DA VELOCIDADE

FLUXO

ELETROOSMÓTICO

FLUXO

LAMINAR

FLUXO ELETROOSMÓTICOEM DIFERENTES MATERIAIS

PYREX

SÍLICA

TEFLON

3 4 5 6 7 8

4

3

2

1

MO

BIL

IDA

DE

ELET

RO

OSM

ÓTI

CA

(104

cm2

V-1

s-1 )

pH

MOBILIDADE OBSERVADA

osmefobs vvv +=

Evµ i

i =

osmefobs µµµ +=

mAu

Tempo, min

Detector

+ -

Injeção osmµ

+efµ osmµ

obsv

osmobs vv =

-efµ

obsv

osmµ

CO-ELETROSMÓTICO

VETOR µef DO ANALITO E A µosm ESTEJAM NA MESMA DIREÇÃO E SENTIDO

µosmµef

osmefobs µµµ +=

CONTRA-ELETROSMÓTICO

VETOR µef E µosm ESTEJAM NA MESMA DIREÇÃO, SENTIDOS CONTRÁRIOS

µosmµef

osmefobs µµµ +−=

DETECTOR

INLET OUTLET

µef

µosm

DETECTOR

INLETOUTLET

µef

µosm

DETECTOR

INLET OUTLET

µef

µosm

MOBILIDADE ELETROOSMÓTICA - FLUXO INVERTIDO

--

-

-

-

IHP

+

+

CAMADADIFUSA

-

-

-

OHP

CAMADACOMPACTA

-

-E

+

-

PLANO DECISALHAMENTO

SOLUÇÃO

DETECTOR

µef

µosm

INLETOUTLET

+-Detector

Comprimento efetivo

A

Bxx

CuuBAH ++=

C

MODOS DA ELETROFORESE

ELETROFORESE DE ZONA (CZE ou FSCE)

ELETROCROMATOGRAFIA MICELAR (MECC ou MECK)

CROMATOGRAFIA ELETROCINÉTICA EM MICROEMULSÃO (MEEKC)

ELETROFORESE CAPILAR EM GEL(CGE)

FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA CAPILAR (CIEF)

ISOTACOFORESE CAPILAR

ief rηπ6

qµ =

www.ceandcec.com/meekc.htm

ief rηπ6

qµ =

ELETROFEROGRAMAS DE ALGUMAS AMOSTRAS DE MEL

Eletrólito PDC 20 mM, CTAB 0,5 mM, pH=12,1, -20 kV, 280 nm, capilar de sílica 87 cm total (80 cm até detector) x 50µm ID.

2 3 4 5

1234

56

7

min

DETERMINAÇÃO INDIRETA DEÁCIDOS GRAXOS DE CADEIA CURTA E MÉDIA

1- ácido acético (C2)2- ácido propiônico (C3)3- ácido butírico (C4)4- ácido valérico (C5)5- ácido capróico (C6)6- ácido caprílico (C8)7- ácido cáprico (C10)

4 6 8 10 120

10

20

30

40

50

C18:0

C18:1t

C18:1c

C18:2tt

C16:0

C18:2cc

C18:3ccc

C14:0

C13:0

C12:0

min

DETERMINAÇÃO INDIRETA POR UV DE ÁCIDOS GRAXOS CIS-TRANS

ANÁLISE INDIRETA DE ÁCIDOS GRAXOS LIVRES EM AMOSTRA DE AZEITE DE OLIVA

4 5 6 7 8min

1

23

1-ácido oleico (C18:1c)2-ácido palmítico (C16:0)3-ácido linoleico (C18:2cc)

DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS POR DETECÇÃO CONDUTOMÉTRICO

DETERMINAÇÃO DE FLUOROQUINOLONAS

2 2.5 3 3.5min

1

2

3

4

5 1-Moxifloxacina2-Gatifloxacina3-Sparfloxacina4-Ciprofloxacina5-Levofloxacina

2.5 3.5 4.5 min

1

2

3

DETERMINAÇÃO DE LOZARTAN ASSOCIOADO A DIURÉTICOS

1- Losartan2- Clortalidona3-Hidroclorotiazida

FSCE

ELETROFORESE CAPILAR

•CAPILARES DE SÍLICA FUNDIDA(25-100 mm diâmetro, 30-100 cm comprimento)

•DISSIPAÇÃO EFETIVA DO CALORRAZÃO ELEVADA ÁREA/VOLUMEALTA RESISTÊNCIA ELÉTRICA (109 ohms)

•ALTA TENSÃO (5-30 kV)CAMPO ELÉTRICO ELEVADO (100-500 V/cm)CORRENTE BAIXA (< 200 µA)

•ALTA EFICIÊNCIA DE COLUNA (105-106 pratos)ALTA RESOLUÇÃO E CAPACIDADE DE PICOTEMPO DE ANÁLISE CURTO

•VÁRIOS MODOS DE SEPARAÇÃO(FSCE, NACE, MEKC, MEEKC, CEC, CGE,CIEF, CITP)

NACEMEKC

CEC

CGE

CIEFCITP

•EXTENSA GAMA DE APLICAÇÕESíons, compostos orgânicos, quirais,biomoléculas

•MEIO AQUOSO

•PEQUENO VOLUME DE AMOSTRA1-50 nL volume injetado

•FORMATO INSTRUMENTALINJEÇÃO E DETECÇÃO EM FLUXO COM COLETA DE FRAÇÕES

•OTIMIZAÇÃO SIMPLIFICADA DAS CONDIÇÕES XPERIMENTAIS

MEEKC