DANIELLE DUMA

EFEITO INIBITÓRIO DO ÓXIDO NÍTRICO

SOBRE A ATIVIDADE DOS GLICOCORTICÓIDES

NO CHOQUE SÉPTICO.

Dissertação apresentada ao Curso de Pós Graduação em Farmacologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito Parcial para a obtenção de grau de Mestre em Farmacologia.Orientador: Prof. Dr. Jamil Assreuy

FLORIANOPOLIS

2001

“EFEITO INIBITORIO DO OXIDO NITRICO SOBRE A ATIVIDADE DOS GLICOCORTICÓIDES NO CHOQUE

SÉPTICO ”

POR

DANIELLE DUMA

Dissertação julgada e aprovada em sua forma final, pelo Orientador e membros da Banca Examinadora, composta pelos Professores Doutores:

Banca Examinadora:ly Filho(Grienta(fòr)

/UFSC - Membro Titular)

Thereza Christina Barja-Fidal^ (UERJ -Membro Titular)

Roseli Coimbra FargesíSÇ-^-Membro Titular)

Prof. Dr.^èiHaldo-ÍSaoliLTakahashi Coordenador do Programa de

Pós-Graduação em Farmacologia da UFSC

Florianópolis, 20 de fevereiro de 2001.

DUMA, Danielle. Efeito inibitório do óxido nítrico sobre a atividade dos

glicocorticóides no choque séptico. Florianópolis, 2001, 108p.

Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Curso de Pós-Graduação em

Farmacologia, Universidade Federal de Santa Catarina.

Orientador: Prof. Jamil Assreuy

Defesa: 20/02/2001

Tendo em conta que na [sepse] a forma cálcio-independente da óxido nítrico

sintase (iNOS) é induzida, que os níveis de [glicocorticóides] circulantes estão

aumentados na sepse e que o tratamento com corticóides sintéticos não

funciona em pacientes sépticos o objetivo deste estudo foi avaliar [in vivo] a

relação entre o [óxido nítrico] e o efeito da dexametasona em animais tratados

com LPS. Assim, observamos que: i) o tratamento de animais com endotoxina

aumentou os níveis de NOS cálcio-independente no pulmão, baço e rim e os

níveis de NOS cálcio-dependente na musculatura esquelética; ii) a injeção

prévia de dexametasona inibiu a expressão de NOS nos órgãos-estudados,

exceto no rim; iii) um doador de NO (SNAP) injetado previamente em animais

tratados com dexametasona + LPS decresceu o efeito inibitório do

glicocorticóide na expressão das NOS no pulmão, baço e na musculatura

esquelética; e iv) o mesmo pré-tratamento com SNAP antes de dexametasona

e LPS fez retornar os níveis séricos de NOx e a apoptose de células linfóides

do baço aos valores obtidos com a administração de LPS somente. Sabendo

da afinidade do NO por sulfidrilas livres presentes em vários alvos proteicos e

com base nos nossos resultados, sugerimos que a redução do efeito da

dexametasona causado pelo NO é um dos possíveis mecanismos

responsáveis pela falha do efeito anti-inflamatório dos glicocorticóides em

pacientes sépticos, talvez pela interação do NO com sulfidrilas críticas ao

funcionamento do [receptor] de glicocorticóides, via [S-nitrosilação],

DEDICO ESTE TRABALHO A MINHA MÃE

POR TODO AMOR, CARINHO E INCENTIVO

AO LONGO DESTES ANOS

o PROFESSOR SE LIGA À ETERNIDADE;

ELE NUNCA SABE ONDE CESSA A SUA INFLUÊNCIA

(HENRYADAMS)

Agradeço imensamente ao professor Jamil Assreuy pela

oportunidade de tê-lo como orientador: pelos valiosos ensinamentos

oferecidos nestes anos de convívio e pelas memoráveis conversas "de

final de tarde". Agradeço também por todo o carinho e comprensão nos

momentos mais difíceis de minha vida, os quais foram fundamentais para

a conclusão desta etapa.

AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais Zenilda Duma e Leônis Duma por todo o

carinho e apoio nas escolhas que fiz. Aos meus irmãos Alexandre Duma e

Cristiano Duma pelos momentos de alegria em nossos encontros.

Ao amor e companherismo compartilhados com o Sven Le Poole e pelas

palavras doces e confortantes, ditas nos momentos certos.

Ao José Eduardo Silva-Santos (Dudu), pela imensa ajuda prestada para

concretização deste projeto, pela amizade e principalmente paciência nos

infindáveis finais de semana em que realizamos experimentos juntos.

Á María Cláudia Santos da Silva, pela verdadeira amizade demonstrada

mesmo nos momentos mais confusos de nosso convívio.

Aos amigos do laboratório de Farmacologia do Oxido Nitríco: Adriana S.

Madeira, Daniel Fernandes, Márcia Ribeiro Teríuck, Renata S. Costa, Rodrígo

Quintanilha Veras, Emiliana Rodrígues, Rafael Prím e Alexandre Meyer, pelo

saudável convívio e amizade.

Aos professores do Departamento de Farmacologia, pelo aprendizado.

Em especial ao professor João Batista Calixto, pela disponibilização de sua

infra-estrutura, fundamental para realização deste projeto científico.

Aos funcionários do Departamento de Farmacologia pela ajuda prestada.

Aos colegas da pós-graduação pela troca de informações e amizade.

Ao CNPq e CAPES pelo apoio financeiro.

LISTA DE TABELAS

1. Aumento na NOS cálcio-independente

e cálcio-dependente após a administração

de LPS em vários órgãos do rato...........................................................72.

LISTA DE ABREVIATURAS

Ach - acetilcolina

ACTH - hormônio adrenocorticotrópico

CaM - calmodulina

cGMP - monofosfato cíclico de guanosina

cNOS - óxido nítrico sintase constitutiva

CRF - fator de liberação de corticotrofina

EDRF - fator de relaxamento derivado do endotélio

eNOS - óxido nítrico sintase endotelial

FAD - dinucleotídeo de flavina e adenina

FMN - mononucleotídeo de flavina

GC - glicocorticóide

GR - receptor de glicocorticóide

GIH - trifosfato de guanosina

H2O2 - peróxido de hidrogênio

HPA - eixo hipotálamo-pituitária-adrenaí

HSP - proteína de choque térmico

1L1-P - interleucina 1 p

INF-y - interferon-y

iNOS - óxido nítrico sintase induzida

LPS - lipopolissacarídeo

MR - receptor de mineralocoritóide

NADPH -nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (reduzido)

NF-kB - fator nuclear da cadeia leve k

nNOS - óxido nítrico sintase neuronal

NO - óxido nítrico

N0 2 ‘ - nitrito

N03‘ - nitrato

NOS - óxido nítrico sintase

NOx - nitrito + nitrato

O2- - ânion superóxido

O3 - ozônio

ONOO" - peroxinitrito

ROS - espécies reativas de oxigênio

RNS - espécies reativas de óxido nítrico

SNAP - S-nitroso-N-acetil-DL-penicilamina

THB4 - tetrahidrobiopterina

TNF-a - fator de necrose tumoral-a

111

1. Efeito do LPS na indução de NOS em diferentes órgãos

do rato............................................................................................................ 69

2. Perfil enzimático de NOS no pulmão de ratos

submetidos à diversos tratamentos.............................................................73

3. Perfil enzimático de NOS no baço de ratos

submetidos à diversos tratamentos.............................................................75

4. Perfil enzimático de NOS no rim de ratos

submetidos à diversos tratamentos...................... ...................................... 77

5. Perfil enzimático de NOS no musculatura

esquelética de ratos submetidos à diversos tratamentos.........................79

6. Efeitos dos diversos tratamentos no peso

do baço........................................................................................................... 81

7. Dosagem de NOx no soro de animais

submetidos à diversos tratamentos.............................................................83

LISTA DE FIGURAS

IV

Resumo

O choque séptico é uma condição potencialmente letal causada por

agentes infecciosos e é caracterizado por um estado de baixa perfusão tecidual

podendo conduzir à disfunção múltipla de órgãos e consequentemente à morte.

Tendo em conta que na sepse a forma cálcio-independente da óxido nítrico

sintase (iNOS) é induzida, que os níveis de glicocorticóides circulantes estão

aumentados na sepse e que o tratamento com corticóides sintéticos não

funciona em pacientes sépticos o objetivo deste estudo foi avaliar in vivo a

relação entre o NO e o efeito da dexametasona em animais tratados com LPS.

Assim, observamos que: i) o tratamento de animais com endotoxina aumentou

os níveis de NOS cálcio-independente no pulmão, baço e rim e os níveis de

NOS cálcio-dependente na musculatura esquelética; ii) a injeção prévia de

dexametasona inibiu a expressão de NOS nos órgãos estudados, exceto no

rim; iii) um doador de NO (SNAP) injetado previamente em animais tratados

com dexametasona + LPS decresceu o efeito inibitório do glicocorticóide na

expressão das NOS no pulmão, baço e na musculatura esquelética; e iv) o

mesmo pré-tratamento com SNAP antes de dexametasona e LPS fez retornar

os níveis séricos de NOx e a apoptose de células linfóides do baço aos valores

obtidos com a administração de LPS somente. Sabendo da afinidade do NO

por sulfidrilas livres presentes em vários alvos proteicos e com base nos

nossos resultados, sugerimos que a redução do efeito da dexametasona

causado pelo NO é um dos possíveis mecanismos responsáveis pela falha do

efeito anti-inflamatório dos glicocorticóides em pacientes sépticos, talvez pela

interação do NO com sulfidrilas críticas ao funcionamento do receptor de

glicocorticóides, via S-nitrosilação.

Summary

Septic shock is a potentially lethal condition caused by infectious agents

and is characterized by a low end-organ perfusion which may lead to multiple

organ dysfunction and death. Taking into account that in sepsis the calcium-

independent isoform of nitric oxide synthase (iNOS) is induced, that plasma

levels of glucorticoids (GC) increase in sepsis and that treatment with corticoids

fails in septic patients, the mai goal of the present work was to examine in vivo

the relationship between NO and the effect of dexamethasone in rats injected

with LPS. Our results show that; i) treatment with endotoxin increased calcium-

dependent NOS levels in the lung, in the spleen and in the kidney and of

calcium-dependent NOS in the skeletal muscle; ii) previous administration of

dexamethasone inhibited the NOS expression in all organs but the kidney; iii)

the NO donor SNAP injected previously to dexamethasone and to LPS

diminished the inhibitory effect of the corticoid on NOS expression in the lung, in

the spleen and in the skeletal muscle and iv) likewise, SNAP injected previously

to dexamethasone and LPS restored serum levels of NOx and spleen

lymphocyte apoptosis back to values found in LPS-treated animals. Taking into

account that NO has a high affinity towards free sulphydryls present in several

cell proteins and the results presently shown, we suggest that NO-induced

reduction in dexamethasone effects shall be one of the mechanisms causing

failure in the anti-inflammatory effects of corticoids in septic patients, probably

due to NO interaction with sulphydryls critical to the correct function of

glucocorticoid receptor via S-nitrosylation.

VI

ÍNDICE

Lista de Tabelas........................................................................................... iLista de Figuras............................................................................................ üLista de Abreviaturas.................................................................................. ...viResumo...........................................................................................................vSummary.........................................................................................................vi

1. Óxido Nítrico............................................................................................... 11.1 Histórico........................................................................................................ 11.2. Óxido Nítrico Sintases................................................................................. 71.2.1 NOS Neuronal ..111.2.2 NOS Endotelial ..131.2.3 NOS Induzida ..161.3 Alvos Moleculares do NO ..201.4 Ações do NO na Fisiologia e na Patologia ..252. Choque Séptico ..302.1. Introdução ..302.2. Mediadores Químicos e Fatores de Transcrição........................ ..352.2.1. Mediadores ..352.2.2 NF-kB ..362.2.3 Citocinas Pró-inflamatórias......................................... ..382.2.4 Citocinas Anti-inflamatórias... .422.2.5 Proteínas de Choque Térmico {Heat Shock Proteins) ..432.2.6. Agentes Vasoativos ..443. Hormônios da Supra-Renal ..483.1. Introdução........................................ ..483.2. Mineralocorticóides ..503.3. Glicocorticóides ..523.3.1. Síntese e Liberação...................................................... ..533.3.2. Mecanismo de Ação.................... ................................ .543.3.3. Uso no Choque Séptico ..604. Objetivos ..625. Material e Métodos...................................... ..635.1. Animais ..635.2. Perfusão e Obtenção das Amostras ..635.3. Medida da Atividade das NOS........ . ..645.3.1. Preparação dos Homogenatos dos Órgãos ou Tecidos ..645.3.2 Ensaio da Atividade das NOS pelo Método da Citrulina .655.4. Determinação dos Níveis Séricos de Nitrato + Nitrito (NOx) ..665.5. Protocolo Experimental ..675.6. Drogas .685.7. Análise Estatística .686. Resultados .696.1. Efeito do LPS na Indução de NOS em Diferentes Órgãos do Rato .696.2. Perfil Enzimático de NOS no Pulmão de Ratos Submetidos a diversos

Tratamentos ..736.3. Perfil Enzimático de NOS no Baço de Ratos Submetidos a Diversos

Tratamentos ..756.4. Perfil Enzimático de NOS no Rim de Ratos Submetidos a Diversos

Tratamentos ..77

6.5. Perfil Enzimático de NOS na Musculatura Esquelética de Ratos Submetidos a Diversos Ttratamentos ..79

6.6. Efeito dos Diversos Tratamentos no Peso do Baço .816.7. Dosagem de NOx no Soro de Animais Submetidos a Diversos

Tratamentos ..837. Discussão ..858. Conclusões........................................................ ................................. .........959. Referências Bibliográficas ..96

INTRODUÇÃO

1. OXIDO NITRICO

1.1. Histórico

O óxido nítrico (NO) é uma molécula diatômica encontrada na forma de

gás. Inicialmente o NO foi amplamente estudado por tratar-se de um

constituinte atmosférico encontrado principalmente em atmosferas poluídas e

na fumaça de cigarros (Schwartz & White, 1983).O NO pode ser formado a

partir da reação do oxigênio e do nitrogênio na atmosfera durante tempestades

com raios. Ele também reage com o ozônio (O3) na superfície terrestre,

levando à formação de dióxido de nitrogênio (NO2), um gás extremamente

tóxico para os seres vivos, uma vez que causa séria irritação pulmonar. Através

de uma reação catalisada por raios ultravioleta, 0 NO2 decompõe-se em óxido

nítrico e oxigênio. O NO por sua vez, liga-se ao O2 atmosférico resultando na

formação de ozônio (um potente oxidante encontrado em altas concentrações

em atmosferas poluídas). O O3, ao reagir com 0 NO atmosférico possibilita a

formação de novo de NO2. Este ciclo de formação e de decomposição de NO2,

que faz com que a atmosfera permaneça poluída, foi alvo de estudo por vários

grupos de pesquisadores (Goodman, 1996).

A produção de óxidos de nitrogênio por sistemas biológicos começou a

ser investigada no início do século passado. Porém, as observações feitas

naquela época foram ignoradas até o final dos anos 70 e início dos anos 80

quando, estudando a importância da formação de nitrato endógeno durante a

carcinogênese, Green et al. (1981a) confirmaram que mamíferos produziam

nitrato (NO3). Inicialmente pouca importância foi dada a este achado, pois

presumia-se que o nitrato encontrado na urina humana derivava das

nitrosoaminas presentes na alimentação. No entanto, a demonstração de que

esta produção de nitrato estava aumentada durante infecções em humanos

(Green et a i, 1981a) ou após o tratamento de animais de laboratório com

endotoxina bacteriana (Green et aí., 1981b) fez crescer o interesse de

pesquisadores acerca desta nova possibilidade de formação de NO (para

revisão ver Morris & Billiar, 1994).

Coincidentemente no mesmo período, o laboratório de Robert Furchgott

verificou que a interação da acetilcolina (Ach) com receptores muscarínicos

localizados nas células endoteliais causava um potente relaxamento do

músculo liso vascular (Furchgott & Zawadski, 1980). Este achado resolveu o

paradoxo entre o efeito vasoconstritor da acetilcolina in vitro (observado

durante anos) e seu efeito vasodilatador in vivo que, desde o início do século

passado já era observado em animais tratados por via intravenosa com Ach e

outros agonistas muscarínicos.

Surpreso, Furchgott analisou criteriosamente seus resultados e

constatou que a diferença estava na forma como a aorta era retirada dos

coelhos. Durante anos foram utilizadas tiras helicoidais de aorta de coelho nos

experimentos. Já nos experimentos em que era observado um relaxamento

induzido pela acetilcolina, a aorta de coelho era isolada na forma de anéis, de

maneira muito mais cuidadosa do que as preparações em forma de tira. Além

disso, e para complicar ainda mais a questão, nem todas as preparações

isoladas na forma de anel respondiam com relaxamento quando na presença

de acetilcolina. Então a mais importante conclusão a que chegou Furchgott,

nesta fase de seus experimentos, foi que o relaxamento em resposta à

acetilcolina nestas preparações dependia do cuidado com que os anéis eram

isolados. Ele percebeu que quando a parte interna do vaso era friccionada.

como acontecia com as preparações helicoidais, o relaxamento à acetilcolina

era eliminado. Por outro lado, quando a íntima do vaso era preservada, todas

as preparações respondiam à acetilcolina com relaxamento. Ao analisar as

preparações que não respondiam à acetilcolina com relaxamento, foi possível

observar que o endotélio encontrava-se removido das mesmas. Algum tempo

depois o próprio Furchgott demonstrou que o endotélio, estimulado por

diferentes agonistas e em diferentes espécies, liberava uma substância (ou

substâncias) lábil, de fácil difusão, não-prostanóide, que agia sobre as células

do músculo liso dos vasos sangüíneos de diferentes tecidos e espécies,

causando relaxamento (para uma revisão detalhada ver Furchgott, 1993 e

Furchgott, 1996).

A natureza humoral desta substância relaxadora, mais tarde

denominada fator relaxante derivado do endotélio (FRDE, ou EDRF, para o

termo em inglês endothelium-derived relaxing factoi), foi proposta pela primeira

vez em 1983, por Cherry et al., do mesmo grupo de Furchgott, que demonstrou

tal fenômeno através do relaxamento induzido pela bradicinina em artérias

humanas e de cães. Trabalhos subsequentes demonstraram que muitos outros

vasorelaxadores em várias preparações vasculares incluindo artérias, veias e

microvasos também necessitavam de células endoteliais para produzir

relaxamento total e ou parcial.

Enquanto a identidade do EDRF permanecia desconhecida, Stuehr &

Marietta (1985) demonstraram que macrófagos peritoniais de camundongos

produziam nitrato e nitrito em resposta ao tratamento com LPS, ilustrando pela

primeira vez a produção de óxidos de nitrogênio por uma célula específica de

mamífero. Em 1987, Hibbs et al., demonstrou que a atividade citotóxica dos

macrófagos contra certas linhagens de células tumorais dependia da L-arginina

como substrato utilizado por estes macrófagos, que a conversão de L-arginina

para nitrito e nitrato era necessária para esta atividade citotóxica dos

macrófagos e que análogos da L-arginina eram eficientes inibidores

competitivos desta via.

A descoberta do NO como mediador endógeno, e mais ainda, sua

identidade com o EDRF, por Palmer, Ferridge & Moncada (1987) também foi

confirmada por Ignarro et al. (1987). No ano seguinte Palmer et al. (1988a)

mostraram que a L-arginina era o substrato para a formação de NO pelas

células endoteliais através de experimentos utilizando bioensaios ou

quimioluminescência para detectar a liberação de NO ém células endoteliais na

presença ou não de L-arginina. Na ausência de L-arginina, num período de 24

horas, observava-se uma diminuição na liberação de NO induzida por

bradicinina, a qual era restaurada pela L- mas não D-Arginina. Além disso, este

aumento ocorrido apenas na presença de de L-arginina, sugeriu que a

formação de NO era dependente somente de L-arginina (Palmer etal., 1988a).

Estes achados sugeriram o envolvimento de uma enzima na formação do óxido

nítrico e que esta enzima pode utilizar substrato exógeno (L-arginina) quando o

estoque de L-arginina endógeno é limitado. Resultados similares foram obtidos

por Schimidt et al. (1988). Além disso, L-NMMA (N-metil-arginina), um inibidor

da formação de nitrito e nitrato em macrófagos, também inibiu a liberação de

NO de células endoteliais em cultura de maneira específica. Estes efeitos do L-

NMMA foram revertidos por L-arginina sugerindo que este inibidor compete

com a L-arginina para formação de NO por via enzimática (Palmer et al.,

1988b).

Destes estudos dois conceitos foram desenvolvidos: que o NO (mais que

nitrito e nitrato) era o responsável pela atividade citotóxica dos macrófagos e,

mais importante, que o NO era sintetizado por dois diferentes tipos celulares

exercendo funções biológicas diferentes, o relaxamento vascular e

citotoxicidade.

Desde então, a via L-arginina-óxido nítrico foi relacionada a diversos

processos biológicos em quase todos os sistemas orgânicos, como o sistema

nervoso, endócrino, imune e cardiovascular. Produzido em quantidade e

período apropriados, o NO atua como uma molécula sinalizadora essencial em

diversos processos fisiológicos, como neurotransmissão, aprendizagem,

memória e regulação do tônus vascular. Com um peso molecular igual a 30, o

NO é certamente uma das menores moléculas envolvidas em processos de

mediação celular. Embora não seja um mediador intercelular clássico (do tipo

que se liga a receptores de membrana), o NO é uma molécula que se difunde

livremente e tem seus efeitos biológicos determinados pela sua reatividade

química. Como um radical livre relativamente estável (meia-vida de 5-10

segundos), ele reage com espécies contendo elétrons não-pareados, como

oxigênio molecular, ânion superóxido (O2 ) e metais (Mayer & Hemmens,

1997). A interação que ocorre entre 0 NO e o radical 0 2 ', por exemplo, pode

gerar o ânion peroxinitrito (0N 00-) o qual, por ser muito instável e gerar

espécies semelhantes a radicais hidroxila, tem um importante papel como

mediador do estresse oxidativo em diversos estados patológicos (Dalloz et a i,

1997).

O NO é formado endogenamente via conversão da L-arginina em L-

citrulina (Ignarro, 1990; Moncada eí a/.,1991). Tal processo é mediado por um

grupo de enzimas denominadas óxido nítrico sintases (NOS), que são

comumente divididas em duas categorias: as óxido nítrico sintases constitutivas

(cNOS) e a óxido nítrico sintase induzida (iNOS) (Marletta, 1993; Nathan et al.,

1994). As enzimas constitutivas estão associadas com a formação de baixas

concentrações de NO por curtos períodos de tempo e são cálcio-dependentes.

Em contrapartida, a enzima induzida gera altas concentrações de NO por

períodos prolongados de tempo e é, funcionalmente, cálcio-independente. O

NO tem sua atividade biológica dividida em efeitos diretos e indiretos e uma

das principais razões para esta divisão são suas propriedades químicas

fundamentais. O NO tem um número ímpar de elétrons com um elétron

desemparelhado, o que o torna um radical instável mas não muito reativo

(Cotton & Wilkinson, 1989). O NO não reage rapidamente com a maioria das

substâncias biológicas, quando comparado com outros radicais como OH.

Como conseqüência, o NO tem uma meia-vida relativamente longa in vivo (5-

10 segundos) (Moncada et al, 1991). Assim, parte das suas ações são

mediadas por sua interação direta com alvos moleculares (ver abaixo)

enquanto outras necessitam da sua reação prévia com outros radicais, mais

comumente o ânion superóxido (Koppenol etal., 1992).

As propriedades físicas do NO também são importantes para entender o

efeito desta molécula em sistemas biológicos. A solubilidade do NO é

extremamente baixa em solução aquosa (1,9 mM em condições normais de

temperatura e pressão) (Dean, 1985; Armor, 1974) e sua capacidade de

difusão é de 50 |jm/s (Gally et al., 1990).

Considera-se que em sistemas biológicos o NO gerado pelas enzimas

constitutivas produz efeitos diretos enquanto que NO gerado pela enzima

induzida produz efeitos diretos e indiretos. Esta classificação simplifica a forma

como o NO reage com os sistemas biológicos para o melhor entendimento das

funções desempenhadas por ele durante processos fisiopatológicos.

1.2. Óxido Nítrico Sintases (NOS)

Três diferentes isoformas da óxido nítrico sintase (NOS) foram

identificadas como catalisadoras da oxidação da L-arginina em L-citrulina e NO.

Elas são denominadas de NOS neuronal (nNOS), NOS endotelial (eNOS) e

NOS induzida (iNOS). Por ser um gás lipossolúvel, o NO não pode ser

armazenado em vesículas para posterior liberação como os transmissores

clássicos, tendo que ser sintetizado de acordo com as necessidades celulares.

A síntese do NO ocorre através de duas etapas, iniciando-se pela oxidação da

L-arginina, que origina a N-hidroxi-L-arginina como um intermediário estável e,

na etapa final, gera L-citrulina e NO em quantidades equimolares (Stuehr et

a/., 1991) (Esquema 1). A síntese de NO é dependente da doação de

equivalentes redutores pela nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato

reduzida (NADPH) (Meletta et al., 1988), e requer oxigênio molecular como co-

substrato (Kwon etal., 1990; Mayer etal., 1991). Dois moles de O2 e 1,5 moles

de NADPH são consumidos por mole de produto formado (Mayer et al., 1991;

Stuehr et a/.,1991). Além de NADPH e O2, são necessários outros cofatores

como a tetrahidrobiopterina (THB4), os dinucleotideo (FAD) e mononucleotídeo

(FMN) de flavina, além da calmodulina , que é considerada como um ativador

alostérico da NOS, para conversão de L-arginina em L-citrulina e NO (para

revisão detalhada ver Crane etal., 1997 e Mayer & Hemmens,1997).

8

1",.NH1 .o NADPH L. O.SNADFH

H^O

. NH <>2 ..-'\ ''V -........—.......fivn». I -f. |s | _ : O

® ...S*-"":""-C0Ó'' H .N ...... "COOHaN' “COC3’ H^N'"- 'COO H- fL-arg N-OB~L-arg L-cit

Esquema 1: Etapas bioquímicas envolvidas na blossíntese de NO pelas óxido nítrico

sintases (Mayer & Hemmens, Trends Biochem. Sci., 22: 477-481, 1997).

Para produzirem NO, as NOS devem estar na forma de dímeros, com

seus monômeros alinhados em forma de “cabeça com cabeça”. O Esquema 2

ilustra um modelo geral para estrutura e composição dos domínios de ligação

de uma NOS na forma dimérica ativa, utilizando a iNOS de camundongo como

modelo. Ela mostra as duas subunidades alinhadas como descrito

anteriormente, com o domínio oxigenase de cada subunidade interagindo para

formar o dímero, e os domínios redutase posicionados de forma independente.

As NOS são enzimas que contém um grupamento heme e apresentam uma

seqüência muito similar (aproximadamente 60% de homologia) à do citocromo

P 450 redutase. As três isoformas conhecidas de NOS são classificadas de

acordo com sua localização subcelular, seqüência de aminoácidos, regulação e

papéis funcionais. O Quadro 1 ilustra as principais características das NOS.

Cada NOS é produto de um gene distinto. Todas as isoformas da NOS

possuem as mesmas características básicas em relação aos domínios

catalíticos (ver Esquema 2): o terminal carboxila contendo o domínio redutase,

com um sítio de ligação para FAD, FMN e NADPH e o terminal amino contendo

o domínio oxigenase, que contém um grupamento heme e o sítio de ligação

para o cofator THB4. Já a calmodulina liga-se na porção redutase da enzima,

próxima ao centro da NOS, separando praticamente os domínios redutase e

oxigenase. Cada isoforma da NOS apresenta uma extensão do terminal amino

diferente, o qual não é essencial para a catálise de NO e provavelmente está

relacionado á localização intracelular da enzima (para revisão detalhada ver

Griffith & Stuehr, 1995).

Esquema 2: Modelo do domínio de ligação e estrutura quaternária da iNOS,

mostrando o alinhamento dos monômeros (Stuehr, D. J., Annu. Rev. Pharmacol.

70X/C0/, 37: 339-59, 1997).

Todas as três isoformas possuem sítios de ligação para a calmodulina.

Em estudos funcionais de enzimas purificadas, a diferença existente entre a

enzima induzida e as duas outras isoformas constitutivas está na capacidade

da iNOS manter uma molécula de calmodulina ligada permanentemente,

mesmo em baixas concentrações de Ca "". Sem a ligação do complexo

cálcio/calmodulina as enzimas constitutivas são incapazes de catalisar a

formação de citrulina. Um modelo de ativação das NOS dependentes de cálcio

foi proposto baseado no fato de que o circuito, por onde fluem os elétrons

provenientes da região redutase, se fecha somente na presença de

cálcio/calmodulina. A mudança conformacional que ocorre após a interação

deste complexo ao seu sítio específico de ligação permite o alinhamento dos

centros redox com o grupamento heme da molécula, facilitando a transferência

de elétrons. A enzima na ausência de concentrações ótimas de cálcio é

considerada como inativa. Passa para um estágio ativo após a ligação do

complexo cálcio/calmodulina. Este modelo de ativação foi proposto para as

enzimas constitutivas, uma vez que a induzida já possui sua molécula de

calmodulina ligada (Hemmens & Mayer, 1997).

O primeiro inibidor da síntese de NO a ser descoberto foi a N°-

monometil-L-arginina (L-NMMA; Moncada et al., 1989). Este e vários outros

como L-nitroarginina (L-NA), L-nitroarginina metil éster (L-NAME), N°-amino-L-

arginina (L-NAA), sintetizados posteriormente, são análogos da arginina, os

quais competem pelo sítio de ligação da L-arginina. Um derivado da ornitina, o

N-iminoetil-L-ornitina (L-NIO), um substituto imidazol da ornitina, também tem a

capacidade de inibir de forma irreversível a síntese de NO. Os inibidores

diferem entre si quanto ã sua potência e farmacocinética. (ver Moncada, 1991).

10

MassaMolecular

NomeAlternativo

Cromos. Dependência de Cálcio

LocalizaçãoSubcelular

ExpressãoTecidual

Neuronal (160 kDa)

Tipo 1 nNOS bNOS

12 dependente(constitutiva)

Ligadas a proteínas específicas via domí­nio PDZ do terminal amínico

CélulasneuronaisMusculaturaesquelética

Induzida (130 kDa)

Tipo II INOS

macNOS

17 independente(induzida)

Solúvel ?Macrófagos Hepatócitos Astrócitos Músculo Liso

Endotelial (134 kDa)

Tipo ill eNOS ecNOS

7dependente(constitutiva)

Liga-se ao Goigi e às caveolas através de palmitoilação e de miristoilação

EndotélioEpitélioCardiomiócitos

Quadro 1: Principais características das óxido nítrico sintases. Adaptado de

Hemmens & Mayer, Meth. Mol. Biol., 100: 1-32, 1997.

A descoberta dos inibidores da NOS tornou-se ferramenta importante na

investigação da participação do NO em diversos estados fisiopatológicos. No

entanto, como nenhum dos inibidores conhecidos é totalmente seletivo, a

busca pela síntese de novos inibidores (seletivos) tem sido intensa.

1.2.1. NOS Neuronal

O NO foi primeiramente caracterizado como um mensageiro neuronal

por Garthwaite et al. (1988), que demonstraram que o glutamato agindo nos

receptores NMDA (N-metil-D-aspartato) de neurônios em cultura, liberava um

fator com propriedades semelhantes aos do NO. Posteriormente, Bredt &

Snyder (1990) purificaram e caracterizaram a nNOS.

A seqüência do DNA desta enzima isolada de cérebro humano e de rato

mostram uma alta identidade (-93%) e peso molecular em torno de 160 kDa,

com aproximadamente 1430 aminoácidos, apresentando no seu C-terminal

(domínio redutase) 36% de homologia com a redutase do citocromo P450. Esta

semelhança é encontrada em todas as NOS clonadas até o momento. Das três

NOS, a nNOS é a codificada pelo maior gene (em torno de 150 Kb), localizado

no cromossoma 12 (região 12q24.2) (Marsden et al., 1994). Na ausência de L-

arginina, o domínio redutase pode transferir elétrons do NADPH para o O2 e

assim formar o ânion superóxido (O2') e peróxido de hidrogênio (H2O2). Estas

espécies reativas de oxigênio (do inglês reactive oxygen species, ROS) podem

explicar as características neurotóxicas e neurodegenerativas dos aminoácidos

excitatórios. Com base nestes fatos, Bredt & Snyder (1994) propuseram que a

NOS seja uma evolução do citocromo P450. O Esquema 3 mostra ainda

possíveis sítios de fosforilação (P), como o resíduo Ser372. Na seqüência N-

11

terminal, Hendriks (1995) descreveu a presença de um domínio PDZ (que são

seqüências de aminoácidos encontradas em proteínas que fazem interação

proteína-proteína e que são muito comuns em regiões de junções celulares).

Este domínio PDZ serve como um verdadeiro “gancho” fazendo com que a

nNOS fique “ancorada” à PSD 95, uma proteína cerebral que liga

especificamente em certos canais iônicos incluindo os receptores NMDA

(Brenmam et a i, 1996) ou, no caso da musculatura esquelética, a proteínas

pertencentes ao sarcolema da membrana plasmática como, por exemplo, a a1-

sintrofina, um componente do complexo distrofina (Brenmam et a i, 1995). A

nNOS apresenta ainda uma região de “splicing” alternativo, sugerindo que em

algumas situações pode ocorrer a síntese da enzima de uma forma modificada.

A isoforma pNOS, um “splicing” alternativo da nNOS (Silvagno et a i, 1996), é

amplamente encontrada em células da musculatura esquelética, onde é

responsável por vários dos efeitos fisiológicos do músculo esquelético, como

contração, regulação da glicólise e diferenciação de miócitos (para revisão ver

Stamler & Meissner, 2001). A isoenzima neuronal é expressada por distintos

neurônios de diversas áreas do sistema nervoso central (Garthwaite & Boulton,

1995), assim como em terminais nitrérgicos (periféricos), inervando a

musculatura esquelética e muitos outros tecidos (Rand & Li, 1995).

12

13

PDZ p CaM FMN FAD NADPH

n N O S n H 2^ ^ H

0 WIYR 500 1000 1433

e N O S ■0 500 1000 1203

iN O S H 1

C IT . P 4 5 00 500

Domínio TM

1000 1153

Esquema 3: Estrutura primária das NOS sintases humanas. Adaptado de

Knowles & Moncada, Biochem. J., 298:249, 1994

1.2.2. NOS Endotelial

A primeira descrição da eNOS foi feita por Palmer e Moncada em 1988.

Desde então, a investigação da presença desta enzima em vários tecidos foi

extensivamente investigada. Através da utilização de anticorpos específicos

para NOS endotelial, estudos histoquímicos localizaram esta enzima nas

células endoteliais de artérias e veias de vários tecidos, incluindo tecidos

humanos (Pollock et a/., 1993). A expressão de eNOS também foi demonstrada

em vários tipos de células não endoteliais, incluindo neurônios do hipocampo,

neurônios motores e outras regiões do cérebro de ratos (Dinerman et a/.,1994;

Abe etal., 1997).

O estudo da sua seqüência de DNA mostrou homologia em torno de

60% com a nNOS, possuindo peso molecular em torno de 133 kDa, com

aproximadamente 1200 aminoácidos. O gene que a codifica está no

cromossomo 7 (região 7q35-7q36) e possui em torno de 4,8 Kb (Fõrstermann &

Kleinert, 1995). Existe um alto grau de conservação entre os domínios para

ligação de FAD, FMN, NADPH, CaM e de fosforilação (P). No extremo N-

terminal existe uma seqüência de aproximadamente 70 resíduos de

aminoácidos, semelhante à seqüência N-terminal encontrada na nNOS, que

permite a localização da enzima na membrana, porém através de um

mecanismo diferente. O resíduo de glicina na posição 2 é miristoilado,

resultando na associação da enzima à membrana plasmática (Busconi &

Michel, 1993; Sessa et al., 1993). Além do mais, ocorre ligação dos resíduos

C15 e C26 com o ácido palmítico (Garcia-Cardena etal., 1995; Liu eía/.,1995).

A exata contribuição de cada uma destas modificações, e como elas são

reguladas em resposta à sinais extracelulares, tem sido objetivo de vários

debates. No entanto, está claro que a ligação desta enzima com ácidos

palmítico e mirístico ocorre exclusivamente na membrana, enquanto mutantes

incapazes de fazerem estas interações com os ácidos graxos, encontram-se

exclusivamente no citosol. Além do mais, em resposta á diversos estímulos, a

eNOS pode sofrer fosforilação de um resíduo de serina resultando na

translocação da fração particulada para a fração solúvel.

A utilização de anticorpos específicos contra a eNOS permitiu a

localização da enzima em diferentes tecidos e células. In vivo, esta enzima

parece existir principalmente ligada á membrana citoplasmática nas cavéolas

de células endoteliais (Shaul et al., 1996), em artérias e veias de diferentes*

tecidos, incluindo o humano, em células epiteliais tubulares renais,

sinciciotrofoblasto de placenta humana, células intersticiais de cólon e

neurônios do hipocampo (Sessa, 1994a).

Como dito anteriormente, a ativação desta enzima pode ser regulada

pelos níveis de cálcio intracelular, através da formação do complexo

cálcio/calmodulina e interação deste corn seu sítio específico localizado do

domínio redutase da enzima. Associado a este tipo de regulação, Michel et al.

14

(1997) propõe um modelo de regulação recíproca da atividade da eNOS pela

interação da enzima com o complexo cálcio/calmodulina ou com a caveolina

(proteínas de sustentação encontrada nas cavéolas de células endoteliais). A

enzima encontra-se na sua forma ativa quando ligada ao complexo

cálcio/calmodulina. No entanto, quando a eNOS reage com a caveolina,

(através do sítio de ligação da calmodulina), ela passa para o estado inativo,

uma vez que não é mais possível a ligação do complexo cálcio/calmodulina.

Além da regulação feita pela concentração de cálcio, estudos recentes

mostram que a interação desta enzima com chaperonas de 90 KDa (hsp 90)

(Michel et al.,^ 997) também possa estar regulando a atividade da eNOS (Shah

et a i, 1999).

Apesar de ser encontrada constitutivamente nas células endoteliais,

vários compostos e variadas condições fisiológicas são capazes de regular a

expressão do gene para a enzima. Sinais físicos e químicos como o oxigênio

(Arnet et a/.,1996), exercícios físicos (Sessa et a i, 1994b) e o estresse de

cisalhamento produzido pelo sangue sobre as células endoteliais podem

produzir mudanças na liberação de NO através do controle transcripcional da

expressão de eNOS ou efeitos diretos sobre a atividade da enzima. Uma região

responsiva ao estresse de cisalhamento foi localizada na seqüência promotora

da eNOS (Mardsen et a i, 1993). Esta região possui elementos regulados pelo

fator NF-kB, metais pesados, resposta de fase aguda e esteróides. Uma

atividade basal desta região promotora foi observada em células endoteliais e

não-endoteliais que possuem a eNOS (Fõrstermann & Kleinert, 1995).

15

1.2.3. NOS Induzida

Normalmente, a isoenzima induzida não encontra-se presente em

células em condições fisiológicas, mas é expressada algumas horas após

estimulação destas células por sinais inflamatórios, como citocinas, ou

microbianos. Muitos destes estímulos podem estar interferindo na transcrição

gênica, no entanto trabalhos mostram interferência na translação e ou

estabilidade de mRNA (Krõncke etal., 1995).

Esta enzima possui um peso molecular em torno de 130 kDa, com

aproximadamente 1150 aminoácidos. O gene que a codifica está no

cromossoma de número 17 (região 17cen-q17q11; 17q11.2-q12) e possui 37

Kb (Chartrain et al., 1994). A seqüência de DNA isolada de células de

camundongo, rato e humanas possui alta homologia. Mesmo assim, entre as

espécies, a seqüência da INOS é menos conservada do que quando

comparada às formas constitutivas. Sua seqüência de DNA mostra 50% de

identidade com a nNOS e 51% com a eNOS. Assim como a nNOS, a iNOS é

predominantemente solúvel (Stuehr et al., 1991) e apresenta domínios para de

ligação de NADPH, FAD e FMN. Uma das mais importantes características, à

nível bioquímico, que distingue a isoenzima induzida das outras isoformas

constitutivas é a sua habilidade de ligar-se à calmodulina diante de pequenas

concentrações de cálcio (< 30 nM) (Cho et al., 1992). Como normalmente a

concentração intracelular de cálcio basal é bem maior que o valor descrito

acima, a iNOS é considerada uma enzima cálcio-independente. Além do mais,

esta enzima não é regulada por modificações na concentração intracelular de

cálcio, o que a torna uma enzima altamente “produtiva” devido à grande

16

quantidade de NO liberado, o qual é requerido para defesa do organismo

diante de processos infecciosos ou tumorais.

A região de fosforilação está ausente e o mRNA possui zonas de

possível “splicing” alternativo (Xie et al., 1992; Cho et al., 1992). Uma grande

variedade de células possui a capacidade de expressar a enzima após sua

devida ativação. Macrófagos, linfócitos, neutrófilos, células de Kupffer,

hepatócitos e mastócitos tanto de ratos como de camundongos são capazes de

expressar a enzima (Bandaletova et al., 1993). A descoberta da iNOS, levou a

um grande número de pesquisas na tentativa de indução e detecção da enzima

em células humanas. Entretanto, o processo de indução, em humanos, parece

ser bem diferente e não ocorrer com a mesma combinação de citocinas

utilizada para as células animais. A enzima já foi localizada, por técnicas de

imunohistoquímica, em tecidos humanos inflamados. Por exemplo,

imunoreatividade para iNOS foi detectada em macrófagos alveolares de

paciente com broncopneumonia (Tracey et al., 1994). Além deste, outros

trabalhos, realizados nos últimos anos, mostraram a expressão desta enzima

em diversos tecidos humanos (Cunha et al., 1993; Geller et al., 1993; Martin et

al., 1993).

As cascatas de sinal de transdução envolvidas na indução da INOS são

complexas e altamente tecido-específicas. O gene da INOS possui porções

com regulação diferenciada na região promotora. A região 1 possui sítios de

união para LPS e a região II para IFN-y. Esta última não regula diretamente a

expressão da NOS, mas amplifica em aproximadamente 10 vezes a expressão

codificada pela região I. Desta forma, os elementos responsivos ao LPS e IFN-y

17

atuam em duas regiões diferentes do gene e o LPS por si só é capaz de induzir

a expressão da iNOS, enquanto que o IFN-y só o faz na presença do LPS (Xie

et a i, 1993).

A expressão da enzima é um processo altamente regulado e com

controle transcripcional que varia de acordo com o tecido. Por exemplo, o

estímulo LPS/citocina é capaz de induzir fortemente a indução da síntese da

enzima em macrófagos e microglia (Nathan & Xie, 1994; Nussler eía/.,1994).

Entretanto, com os mesmos estímulos, somente uma modesta ativação é

observada em hepatócitos, célula muscular lisa e célula epitelial renal. Nestas

situações, uma combinação de citocinas se faz necessária para uma total

expressão da enzima. Desta forma, a indução da iNOS parece ser

diferencialmente regulada em células parenquimatosas e células que

participam da resposta imune (como macrófagos e microglia) (Cunha et a i,

1994; Rees et a i, 1995).

O aumento na expressão da INOS é decorrente de um aumento na

transcrição do gene da enzima e é regulado principalmente pela ligação de

fatores de transcrição, tais como o NF-kB e o fator regulador de interferon 1, a

regiões promotoras existentes no gene que codifica esta isoforma. A ativação

destes fatores de transcrição por componentes de cascatas de sinalização

parece ser o evento fundamental para a iniciação da transcrição do gene (Xie

et a i, 1994; Muisch et a i, 1993; Kamijo et a i, 1994).

Talvez a mais importante diferença entre as enzimas constitutivas

(eNOS e nNOS) e a enzima induzida (iNOS) esteja relacionada à quantidade

de NO gerado por cada uma destas enzimas. A ativação das enzimas

18

constitutivas induz a liberação de quantidades picomoles de NO, durante curtos

períodos de tempo (segundos a minutos). Por sua vez, quando expressa, a

INOS libera grandes quantidades de NO na ordem de nano à micromoles,

durante longos períodos (horas).

A associação das três isoformas da NOS com o endotélio, neurônios e

células de defesa é, no entanto, uma classificação simplista. Por exemplo, a

eNOS é encontrada não apenas em células do endotélio vascular como

também em plaquetas e em certas populações neuronais do cérebro, enquanto

a nNOS tem sido igualmente encontrada no epitélio dos brônquios e da

traquéia, bem como no músculo esquelético. Além do mais, algumas diferenças

têm sido identificadas entre iNOS obtidas de diferentes tecidos das mesmas

espécies. Por fim, enquanto a eNOS e a nNOS podem ser induzidas (ou, talvez

mais exatamente, ter seus níveis de expressão regulados), em certas situações

como durante exercício crônico, lesões em nervos ou durante a gravidez

(quando a iNOS também é induzida), a iNOS parece estar presente

constitutivamente em alguns tecidos, incluindo o epitélio brônquico de

humanos, os rins de ratos e alguns tecidos fetais (para revisão ver Moncada et

al., 1997; Michel & Feron, 1997; Cooke & Dzau, 1997).

Esta variabilidade na regulação da expressão das NOS faz com que

alguns pesquisadores se refiram a estas enzimas através da característica que

ainda as diferencia: a dependência ou não de concentrações fisiológicas de

cálcio intracelular para ativação das mesmas.

19

20

1.3. Alvos Moleculares do NO

Esta molécula diatômica participa de várias funções fisiológicas. As

propriedades tóxicas e/ou regulatórias do NO levam a confusões a respeito de

suas funções biológicas. Com o intuito de simplificar o entendimento da

química envolvida nos processos biológicos onde o NO participa (como dito

anteriormente), as interações do NO com alvos biológicos pode ser classificada

em efeitos diretos e efeitos indiretos. Este tipo de classificação leva em

consideração o tempo, a localização, a quantidade de NO produzida e a

relevância dos alvos que serão afetados. Efeitos diretos são definidos como as

reações onde o NO interage diretamente com moléculas biológicas específicas.

Efeitos indiretos são definidos como aqueles resultantes das reações de

espécies reativas de óxido nítrico (RNS), que são derivadas da auto-oxidação

do NO com vários radicais livres.

Efeitos diretos biologicamente relevantes do NO geralmente requerenri

baixas concentrações locais (< 5 ^M). Nesta concentração, o NO tem marcada

preferência para ligar-se ao grupamento heme da guanilato ciclase, ativando a

conversão de GTP a cGMP que é a base para o controle de várias funções

fisiológicas (Furchgott & Vanhoute, 1989; Ignarro et al., 1990). Efeitos indiretos

envolvem inicialmente a ligação de NO com oxigênio ou superóxido para

formar várias RNS (espécies ativas de nitrogênio). Estas RNS danificam

proteínas e o DNA, resultando em conseqüências potencialmente tóxicas ao

organismo. O NO tem um enorme potencial de reação, o que influencia uma

variedade de processos fisiológicos e fisiopatológicos. Para identificação da

reação NO-dependente, importante na modulação da resposta inflamatória e

em vários outros processos fisiopatológicos, é necessário o mapeamento das

condições relativas ao tempo, localização, e quantidade de NO e das espécies

de RNS produzidas. O entendimento básico da química envolvida nos

processos fisiológicos regulados por NO auxiliará no desenvolvimento de novas

estratégias terapêuticas para o tratamento de injúrias teciduais inflamatórias.

Um grande número de ligantes, incluindo hormônios, autacóides, drogas

e toxinas, tem o cGMP intracelular como o mediador de seus efeitos biológicos.

A produção de cGMP ocorre a partir da enzima guanilato ciclase, que catalisa a

conversão de GTP em cGMP. As duas principais categorias de enzimas

guanilato ciclases são as do tipo solúvel e do tipo ligada à membrana (Ignarro

& Kadowitz,1985; Murad, 1986).

O NO somente ativa a guanilato ciclase do tipo solúvel e é considerado o

principal modulador endógeno da atividade desta enzima. Embora a interação

precisa entre o NO e a guanilato ciclase solúvel não seja completamente

conhecida, a reação entre o NO e o grupamento heme da enzima que leva ã

formação de um complexo nitrosil-heme pentacoordenado e que altera a

configuração de um anel porfirínico, é sugerida como responsável pela indução

do estado ativado da enzima, que proporciona um aumento da conversão de

GTP em cGMP (Ignarro et a/.,1982; Ignarro et a i, 1984; para revisão ver

Ignarro eíã/., 1994).

O NO também pode interagir com o oxigênio molecular, espécies

reativas de oxigênio, proteínas contendo metais e ou grupamentos tióis que

constituem importantes alvos de interação com o NO (devido a alta reatividade

entre estes compostos) podem levar ou não a importantes efeitos biológicos.

Por exemplo, a interação do NO com o grupamento heme da hemoglobina gera

21

a metahemoglobina e a interação do NO corn a oxihemoglobina faz corn que o

NO seja faciinnente convertido a nitrato por meio de uma reação oxidativa.

Estes dois eventos estão relacionados à inativação do NO. A reação entre o

ânion superóxido e o NO, gerando peroxinitrito e radicais hidroxil, além de

servir como outro meio de inativação de NO ou do ânion superóxido, pode

estar envolvida em importantes danos oxidativos contra o próprio organismo ou

contra agentes patogênicos, dependendo das circunstâncias existentes. Já a

interação do NO com os grupamentos tióis, basicamente representados pelas

sulfidrilas de resíduos de cisteínas, que estão presentes em grande abundância

em peptídeos e proteínas, proporciona a formação de compostos S-nitrosotióis

(o principal tiol intracelular que reage com o NO é a glutationa). A formação dos

R-SNO, que podem atuar como um sistema tampão e de estoque de NO,

representam o surgimento de uma importante classe de moléculas

sinalizadoras de eventos celulares, podendo funcionar como um mecanismo

adicional de sinalização e de regulação via NO em vários sistemas biológicos

(para revisão ver Gaston, 1999). Estes compostos são considerados

verdadeiros reservatórios de NO, sendo encontrados, em condições

fisiológicas, no plasma (Stamler, 1994) e em vários tecidos (Gaston, 1993).

Desta forma, foi sugerido que os R-SNO atuam como importantes

transportadores de NO (para uma revisão ver Gaston, 1999).

As ações dos R-SNO são atribuídas principalmente à clivagem

espontânea da ligação S-N e conseqüente liberação do NO (para revisão ver

Buther & Rhodes, 1997). Em condições fisiológicas, os R-SNO liberam NO"

(íon nitrosõnio), NO' (íon nitroxila) e N 0 ‘, sendo que estas distintas formas

redox de NO exibem grandes variações quanto á sua reatividade química

22

(Stamier, 1992). A forma oxidada do NO, o NO"" ou íon nitrosônio, é

responsável por um grande número de reações eletrofílicas, em especial a

formação de R-SNO. Quimicamente, também existe a possibilidade da

transferência do NO' de um tiol para outro tiol, sendo este processo chamado

de transnitrosilação. Por outro lado, o NO' pode ser resultante da ionização do

nitroxil (HNO) (para uma revisão ver Buther et al., 1995).

Os R-SNO, como estoques endógenos de NO, são reconhecidos como

compostos envolvidos em lesão de DNA, na defesa de hospedeiros contra

parasitas, na regulação da canais iônicos e no controle da pressão arterial

(Kowaluk & Fung, 1990). A ocorrência de R-SNO como S-nitrosoalbumina, S-

nitrosoglutationa e S-nitrosocisteína foi demonstrada in vivo (Dicks et al.,^996)

e possivelmente estão implicados em condições fisiopatológicas. Por exemplo,

alguns estudos evidenciaram que R-SNO estão presentes no tecido pulmonar

humano em concentrações da ordem de nanomolar a micromolar, e que em

estados patológicos como asma e pneumonia estes níveis aumentam (Gaston

et al., 1993). A bioatividade dos R-SNO e a velocidade com que eles doam NO

pode ser aumentada pela presença de metais como por exemplo o ferro, o

cobre e o zinco. Mais ainda, várias enzimas têm sido descritas como

responsáveis pela clivagem dos R-SNO, tais como a tireoredoxina redutase, a

glutationa peroxidase, a gamaglutamil transpeptidase, a xantina oxidase e a

formaldeído desidrogenase dependente de glutationa. A relativa distribuição

destas enzimas nos diferentes tecidos pode alterar significamente a

disponibilidade de R-SNO. No processo de clivagem dos R-SNO ocorre o

aparecimento de diferentes óxidos de nitrogênio como peroxinitrito.

23

hidroxilamina, S-nitroso-cisteinil-glicina, além do próprio NO (para revisão ver

Gaston, 1999).

Em decorrência da liberação de NO de R-SNO protéicos, pode ocorrer a

formação de pontes dissulfeto entre sulfidrilas vicinais. Esta modificação pós-

translacional por sua vez pode também modular a funcionalidade de proteínas

e enzimas. A S-nitrosilação de sulfidrila de cisteínas é apontada como a maior

responsável pela modulação redox e modificações funcionais de proteínas

(Marshall et al., 2000 ). Embora exista uma grande quantidade de sulfidrilas de

cisteína em uma única proteína ou enzima, somente algumas são nitrosiladas.

Este fenômeno é atribuído ã especificidade do NO em reagir com resíduos de

cisteínas desde que elas estejam em determinadas seqüências de aminoácidos

(para revisão ver Broillet, 1999). Como exemplo de proteínas cuja

funcionalidade pode ser modificada por nitrosilação de sulfidrilas podemos

destacar os canais de K"" dependentes de cálcio na musculatura lisa vascular

(Bolotina et al., 1994), os canais de cálcio do tipo L no músculo cardíaco

(Campbell et al., 1996), os canais de Na'" presentes em baroreceptores (Li et

al., 1998) e os receptores de glicocorticóides (Galigniana et al., 1999). Além

disso, espécies reativas de NO como o NO"", podem ativar MAP-quinases pela

ativação direta de proteínas G de baixo peso molecular como a p2V^^, RAC 1

ou Cdc42. Estas espécies são também capazes de ativar diretamente alguns

eventos de sinalização como as quinases ERH, JNK E p38 (para revisão ver

Broillet, 1999).

Embora várias pesquisas envolvendo R-SNO estejam sendo realizadas,

as funções biológicas destes compostos mais estáveis que o próprio NO ainda

não estão totalmente elucidadas (Buther & Rhodes, 1997). Também existem

24

evidências de que, além das ações decorrentes da liberação de NO, os R-SNO

podem apresentar relevante atividade biológica independente desta liberação

(Kowaluk& Fung, 1990).

1.4. Ações do NO na Fisiologia e na Patologia

Inúmeros trabalhos na literatura demonstram que o óxido nítrico

apresenta relevante atividade biológica em vários sistemas biológicos como os

sistemas nervoso, imune, endócrino e cardiovascular, entre outros.

A produção de NO pelas enzimas cálcio-dependentes está envolvida

numa variedade de processos fisiológicos do sistema cardiovascular e do

sistema nervoso central (Moncada et al., 1991). Já o NO produzido pela enzima

cálcio-independente é responsável pela citotoxicidade de macrófagos contra

certos microorganismos e células tumorais, além de contribuir para o fenômeno

de imunidade não-específica (Moncada etal., 1991).

No sistema nervoso, o NO desenvolve importante papel não apenas em

funções neuronais como liberação de neurotransmissores, desenvolvimento

neuronal, regeneração, plasticidade sináptica e regulação da expressão gênica,

mas também em uma variedade de desordens nas quais a produção excessiva

de NO causa problemas neurológicos (Yun et al., 1997). Por exemplo,

inúmeras evidências implicam o NO como um mediador de neurotoxicidade,

especialmente em resposta à ativação de receptores NMDA pelo glutamato,

durante acidente vascular cerebral e em patologias como as doenças de

Alzheimer e de Huntington (para revisão ver Zhang & Snyder, 1995). Também

foi demonstrada a participação do NO em quadros de demência decorrente da

infecção pelo HIV. A proteína da membrana gp 120, encontrada na superfície

25

do vírus é capaz de matar neurônios via ativação da NOS no sistema nervoso

(Dawson eí a/., 1993).

A demonstração da existência de uma liberação fisiológica contínua de

NO no leito vascular foi feita por Rees et al. (1989), que demonstraram que a

administração de L-NMMA, um análogo da L-arginina e inibidor da NOS,

causava um estado de hipertensão arterial, o qual era totalmente revertido pela

administração de L-arginina. A importância da liberação fisiológica de NO no

controle da pressão arterial foi confirmada com a obtenção de camundongos

knockout para eNOS (Huang etal., 1995; Shesely etal., 1996).

A liberação de NO derivado do endotélio é aumentada após a ativação

de receptores distintos para acetilcolina, ADP, bradicinina, serotonina,

histamina, e outros mediadores químicos. Estímulos físicos, incluindo-se

estresse de cisalhamento (ou do termo em inglês shear stress) e hipóxia,

também são potentes indutores da liberação de NO. Tantos estímulos físicos

como os químicos levam à abertura de canais da cálcio existentes na

membrana da célula endotelial. O aumento nas concentrações intracelulares de

cálcio facilita a formação de complexos Ga^7calmodulina que, ao se ligarem à

eNOS, levam à sua ativação. O NO produzido pela célula endotelial se difunde

então para luz do vaso ou para as células musculares lisas subjacentes. Uma

vez no interior da célula muscular lisa, o NO ativa a guanilato ciclase solúvel,

estimulando a conversão de trifosfato de guanosina (GTP) a monofosfato

cíclico de guanosina (cGMP). A elevação nos níveis citoplasmáticos de cGMP

causa a ativação de uma proteína quinase-cGMP dependente (responsável

pela fosforilação da miosina). O resultado observado é o relaxamento da

musculatura lisa e conseqüente vasodilatação. O excesso de cGMP formado é

26

inativado por uma família de fosfodiesterases, que o convertem à 5'-GMP

(Loyd-Jones & Boch, 1996). O mecanismo pelo qual a liberação basal de NO é

regulada pelo estresse de cisalhamento e como a superfície luminal é capaz de

perceber as alterações no fluxo e na pressão interna dos vasos ainda não é

exatamente conhecida, mas talvez ocorra através de alterações do

citoesqueleto ou em estruturas vizinhas das células endoteliais (para revisão

ver Busse et al., 1995).

O NO produzido pelo endotélio cria um estado de vasodilatação ativa

responsável pelo controle homeostático da pressão e fluxo sangüíneos.

Existem várias evidências de que a deficiência na produção de NO contribui

para a patogênese da hipertensão (para revisão ver Vane et al., 1990).

Excessos na produção de NO, observado em pacientes.com choque séptico

são lesivos ao organismo. Este excesso leva à intensa vasodilatação e

hipotensão decorrentes do NO originado da iNOS de células endoteliais e

musculares lisas (Rees eía/.,1989).

O NO produzido pela célula endotelial e que se difunde para a luz do

vaso tem um importante papel na inibição da ativação e adesão plaquetárias. O

efeito do NO sobre as plaquetas é um mecanismo cGMP-dependente. Tanto

prostaciclina (PGI2) como NO agem sinergisticamente, reduzindo a função

plaquetária, sugerindo que a liberação de ambos pela célula endotelial tem

uma participação fundamental no controle de um processo trombótico

(Radomski et a i, 1987a-d).

A doença aterosclerótica é uma das maiores causas de mortalidade no

mundo. Atualmente já se sabe que o início de um processo aterosclerótico é

decorrente de disfunção nas células endoteliais, que perdem sua capacidade

27

de produção de NO em níveis normais. A contínua produção de NO inibe a

oxidação de LDL e a ativação e adesão das plaquetas à parede vascular,

limitando a formação de trombo (Radomski, 1987a-d), reduz a quimiotaxia e a

adesão de leucócitos para o espaço subintimal (LIoyd-Jones & Boch, 1996) e

regula a proliferação das células musculares lisas, impedindo seu crescimento

excessivo (Garg & Hassid, 1989). Esses dados sugerem que o óxido nítrico

modula o desenvolvimento e a progressão da placa aterosclerótica e que uma

queda nos níveis basais de produção de NO estão interligados com o

desenvolvimento da aterosclerose.

Se por um lado a redução da produção basal de NO pode estar

envolvida na gênese de doenças cardiovasculares, a expressão da iNOS e

conseqüente produção de maiores quantidades de NO ocorre em um grande

número de doenças. Em roedores, o NO produzido pela iNOS de macrófagos

ativados desenvolve um papel fundamental como molécula citotóxica contra

diversos parasitas e células tumorais (Moncada et al., 1991; para revisão ver

Fang, 1997). Uma expressão similar de iNOS ocorre também em macrófagos

de humanos em uma série de doenças infecciosas, o que é um importante

indício de uma participação primordial do NO na atividade citotóxica das células

de defesa em humanos (Krõncke et al., 1998). A expressão da iNOS durante

períodos prolongados e contínuos têm, no entanto, sido relacionada a algumas

doenças auto-imunes, como artrite reumatóide e esclerose múltipla, a eventos

isquêmicos (como infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral), a

processos neurodegenerativos, bem como as doenças inflamatórias crônicas

das vias aéreas (asma), dos rins (glomerulonefrites) da pele (lupus eritematoso

cutâneo, dermatites) e até mesmo a participação do NO no diabetes melitus

28

tipo 1 , com a hipótese de que a diabetes pudesse ser também uma doença

auto-imune (Cobertt et al., 1992,1993). Embora em experimentos com animais

de laboratório a inibição da iNOS melhore muitos dos sintomas relacionados às

doenças listadas anteriormente, o grau exato de benefícios e ou danos gerados

pela atividade da iNOS em humanos durante estas doenças não é

completamente compreendido (para revisão ver Krõncke, 1998).

O desenvolvimento de um processo inflamatório crônico é um importante

fator de risco no surgimento de câncer. Uma dás hipóteses é de que a ativação

crônica de células efetoras resulta na liberação de produtos como o NO, e que,

os altos níveis de NO produzidos por estas células podem reagir com aminas,

originado nitrosaminas (potentes agentes carcinogênicos), que se acumulam

no tecido. Além disso, o NO pode também causar mutações importantes no

DNA, levando à dano celular ou ao crescimento de células morfologicamente

alteradas (Lyons, 1995).

O efeito citotóxico do NO pode ocorrer também pela ligação ao

complexo Fe-S de várias proteínas essenciais ao funcionamento celular. Esta

alta afinidade por íons ferro resulta na remoção do íon dos centros Fe-S ou na

formação de espécies Fe nitrosiladas das proteínas envolvidas. Em alguns

casos, a destruição dos complexos Fe-S causa a inibição de determinadas

enzimas que participam da cadeia respiratória para produção de ATP,

acarretando a morte da célula em um momento posterior (Feldman et al.,

1993).

O NO também é capaz de inibir a enzima ribonucleotídeo redutase

(enzima responsável pela conversão de ribonucleotídeos à

desoxiribonucleotídeos), o que pode levar a uma depleção celular dos

29

precursores necessários à síntese de DNA. Sem síntese de DNA, a divisão

celular não ocorre e as células não proliferam (Hibbs & Taintor, 1986; Drapier &

Hibbs, 1988; Hibbs etal., 1990; Feldman etal., 1993).

Também é reconhecido o fato do NO ter atividade citotóxica importante,

estando envolvido na defesa do hospedeiro contra patógenos intra e

extracelulares, tais como bactérias (Green et al., 1993), protozoários (Assreuy

et al., 1994) e fungos e helmintos (James & Glaven, 1989). Entretanto, o

mecanismo responsável pela morte destes parasitas ainda é fonte de estudos.

A produção excessiva de NO parece ser uma das principais causas de

alguns dos sintomas do choque séptico (Fleming et al., 1990; Wright et al.,

1992; Wu et al., 1996). Neste caso a iNOS é expressa em células fagocíticas,

como macrófagos (Marietta ef a/.,1988; Hibbs etal., 1988; Stuehr etal., 1989) e

neutrófilos (McCall etal., 1989), bem como em células endoteliais (Radomski et

al., 1990) e células do músculo liso vascular (Knowles et al., 1990a), dentre

outras, em resposta a produtos bacterianos e ou citocinas (como o IFN-y, a IL-

1P e o TNFa, por exemplo).

2. CHOQUE SÉPTICO

2.1. Introdução

O número de casos de choque séptico vem crescendo progressivamente

nos últimos anos, tanto que atualmente é considerado como a causa de morte

mais comumente encontrada nas unidades de terapia intensiva nos Estados

Unidos da América e Europa. Isso se deve em parte à evolução da medicina ao

longo dos últimos anos, que ao promover o aumento da perspectiva de vida de

idosos e pacientes com enfermidades graves, associado ao emprego

30

descontrolado da antibióticoterapla (responsável pelo aumento do número de

bactérias resistentes), ao número de procedimentos invasivos e de pacientes

imunodeprimidos (como pacientes HlV-positivos) e à elevada freqüência de

infecções hospitalares, têm contribuído enormemente para a assustadora

incidência de choque séptico.

Embora não existam estudos estatísticos sobre a incidência da sepse e

do choque séptico no Brasil, sabe-se que nos Estados Unidos cerca de

100.000 a 300.000 pacientes desenvolvem sepse anualmente, dos quais 50%

evoluem para o choque séptico e invariavelmente morrem (Davis & Hagen,

1997; Chernow & Dinarello, 1997).

Em 1991 um novo conceito, a síndrome da resposta inflamatória ou do

inglês systemic inflammatory response syndrome (SIRS), foi criado para definir

0 estado de pacientes que exibiam episódios de resposta inflamatória

sistêmica. A SIRS é diagnosticada por uma combinação de sinais clínicos e

sintomas passíveis de avaliação. A denominação SIRS foi criada para incluir

tanto a sepse quanto doenças semelhantes provenientes de causa não-

infecciosa, como trauma, isquemia, queimadura, pancreatite e hemorragia.

Define-se um quadro de SIRS quando o paciente manifesta duas ou mais das

seguintes condições: hipertermia (temperatura maior que 38°C) ou hipotermia

(temperatura menor que 36°C); taquicardia (freqüência cardíaca maior que 90

batimentos/min); taquipnéia (freqüência respiratória cardíaca maior que 20

respirações/min ou PaC0 2 menor que 32 mmHg) e contagem de células totais

sangüínea maior que 12.000/mm^ ou menor que 4.000/mm^ ou mais de 10% de

formas imaturas (Bone etal., 1997).

31

Uma das seqüelas da SIRS ou da sepse que podem vir a surgir é a

síndrome da falência de múltiplos órgãos (MOF), que acomete 30% dos casos

dos pacientes com sepse, enquanto quase todos desenvolvem disfunção de

um órgão (Davies & Hagen, 1997). Usualmente é definida pela falência

seqüencial ou de pelo menos dois ou mais órgãos, que tornam-se incapazes de

manter a homeostasia. Descrita pela primeira vez entre os anos de 1965 e

1970, quando surgiram inúmeros trabalhos descrevendo a falência precoce de

diferentes órgãos como uma grave complicação do choque séptico (Clowes et

al., 1968; Skiliman et al., 1969; apud Thijs et al., 1996), a falência múltipla,

progressiva e seqüencial dos sistemas orgânicos é, em última análise, a

responsável pelo grande índice de mortalidade entrè pacientes sépticos. A

mortalidade de pacientes que têm três ou mais tipos de órgãos afetados é

particularmente alta (Bates et al., 1997). Os pulmões, rins, fígado, sistema

cardiovascular, sistema nervoso central e o sistema de coagulação estão

geralmente envolvidos na síndrome de falência múltipla de órgãos.

O choque séptico é um agravamento do quadro de sepse. Envolve pelo

menos dois estágios distintos de evolução. Na fase inicial, pacientes sépticos

encontram-se num estado hiperdinâmico (ocorre exacerbação da atividade

cardiovascular), caracterizado por taquicardia, aumento da frequência e do

débito cardíaco, baixa resistência vascular periférica, hipóxia, oligúria e acidose

lática (Thiemermann, 1997; Kilbourn, 1997). Com a evolução da infecção,

ocorre um aumento nas concentrações sangüíneas de catecolaminas, cortisol e

glucagon (Rackow & Astiz, 1991), resultando em taquicardia e vasoconstrição

periférica. Embora muitos pacientes acabem morrendo nos estágios iniciais da

doença, em um grande número de casos estas alterações hemodinâmicas

32

evoluem gradualmente para um estado hipodinâmico (estágio tardio do

choque), devido em grande parte à gradativa redução do desempenho

cardíaco. Ocorre uma vasodilatação progressiva associada a débito cardíaco

elevado e diminuição da resistência periférica (em alguns casos pode ocorrer

vasoplegia). Em seguida, ocorre falência cardíaca com progressiva queda no

débito cardíaco e acentuada queda da perfusão e oxigenação teciduais

(Thiemermann, 1997). Neste estágio tardio ocorre ainda hipoglicemia devido à

depleção de glicogênio hepático e inibição da gliconeogênese (Ceppi et al.,

1997). A síndrome inclui freqüentemente aumentos acentuado da atividade

plasmática de transaminases, concentrações de uréia e de bilirrubina,

indicativos de injúria renal e hepática, enquanto que o desenvolvimento de

acidose lática reflete a inadequada perfusão tecidual e o metabolismo

anaeróbico (Rackow & Astiz, 1991). A absoluta maioria dos casos de

recuperação de um choque séptico acontece com pacientes que não

adentraram nos estágios tardios da doença. A causa de morte da maioria dos

pacientes geralmente é um estado de vasodilatação irreversível combinada

com falência do miocárdio, algumas vezes acompanhada de uma arritmia

terminal (Mercier etal., 1998; Brantzaeg, 1996a).

As manifestações clínicas da sepse e do choque séptico, tais como

febre, hipercoagulação e hipotensão periférica, derivam da liberação sistêmica

de mediadores inflamatórios pelas células de defesa e células endoteliais. Os

fatores desencadeadores da ativação celular e da cascata de eventos

plasmáticos são componentes da parede celular desses organismos, como o

ácido lipoteicóico (LTA) e peptideoglicanas, derivados de bactérias Gram-

positivas (exotoxinas), ou o lipopolissacarídeo (LPS), no caso de bactérias

33

Gram-negativas (endotoxinas), que invadem tecidos do liospedeiro e, às vezes,

a corrente sangüínea. Além de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas

outros microorganismos como fungos, vírus e protozoários também podem

desenvolver papéis centrais para evolução de um quadro de sepse (Bone,

1994). Apesar de na última década ter ocorrido um aumento de casos de sepse

por bactérias Gram-positivas, infecções por bactérias Gram-negativas ainda

são as mais freqüentes.

O LPS e as exotoxinas são liberados normalmente durante a replicação

da bactéria e ou como conseqüência da sua morte, devido à lise da parede

celular. A importância do LPS como fator desencadeador da sepse foi

demonstrada após sua administração em humanos sadios, com reprodução de

alterações hemodinâmicas observadas em pacientes com sepse e em modelos

experimentais (Suffradin et al., 1989). As atividades biológicas das endotoxinas

e exotoxinas procedem da ativação dos sistemas séricos e da ativação de

células residentes, células endoteliais e dos leucócitos. Conseqüentemente

ocorre síntese e/ou liberação de mediadores endógenos (citocinas e

mediadores lipídicos), sendo a ativação das células inflamatórias o fator

predominante para o desenvolvimento da sepse (Galanos & Freudenberg,

1993). Dentre as moléculas descritas como receptores para o LPS, o antígeno

de membrana CD14 é considerado o mais influente na ativação celular pelo

LPS, estando presente em células mielóides diferenciadas como monócitos e

neutrófilos. Esse receptor é uma glicoproteína que pode estar ancorada na

membrana celular ou solúvel. Os níveis de CD14 solúvel no local da infecção

ou na circulação, bem como sua expressão na membrana celular, encontram-

se alterados em diferentes situações, como doenças infecciosas e na sepse.

34

demonstrando desta maneira a importância do CD 14 para a ação do LPS

(Antal-Szalmas et al., 1997). Contudo, o CD14 parece não ser relevante

quando LPS é administrado ou liberado em grandes quantidades, pois neste

caso a ação do LPS independe deste receptor (Malhotra & Bird, 1997). Outras

moléculas também foram descritas como receptores para o LPS, como por

exemplo a L-selectina e a integrina CD11/CD18, ambas moléculas de adesão

presentes na membrana celular de leucócitos (Malhotra & Bird, 1997).

2.2. Mediadores Químicos e Fatores de Transcrição

2.2.1. Mediadores

Um grande número de mediadores humorais é produtos liberados por

várias células estão envolvidos nos eventos imunológicos existentes no choque

séptico e têm sido responsabilizados por grande parte dos sintomas clínicos da

sepse e das formas mais severas de choque séptico (Thijs et al., 1996). Neste

grupo de substâncias incluem-se as citocinas pró-inflamatórias (como os

fatores de necrose tumoral a e P e uma vasta lista de interleucinas), o sistema

complemento e as vias extrínsecas e de contato dos sistemas fibronolítico e de

coagulação. Além disso, muitos elementos celulares como células

mononucleares, neutrófilos, células endoteliais e plaquetas desempenham

papéis de destaque no desenvolvimento desta síndrome, através da liberação

de uma ampla gama de substâncias bioativas, tais como prostaglandinas,

leucotrienos, fator de ativação plaquetária, endotelinas, radicais livres de

oxigênio, proteinases e o NO. Os efeitos biológicos destes sistemas de

mediadores são diversos e complexos. Eles podem induzir a liberação de

outros mediadores (e algumas vezes deles próprios), apresentar efeitos

35

sinergísticos, manifestar efeitos diferentes quando em combinação e através

destas interações, aumentar ou limitar o processo inflamatório (para revisão ver

Thijs etal., 1996).

Dentre os mediadores endógenos liberados primeiramente pelas células

residentes e posteriomente pelas células recrutadas para o foco infeccioso, as

citocinas desempenham um papel relevante na resposta do hospedeiro.

Citocinas como a interleucina-1 (IL-1), o TNF-a, a IL-8 e as demais quimiocinas

promovem o recrutamento de neutrófilos para o sítios inflamatórios e sua

ativação, com conseqüente aumento da atividade microbicida, sendo esta

resposta local fundamental para o controle da infecção. A evolução de uma

infecção localizada para um quadro sistêmico caracteriza-se pela presença de

citocinas pró-inflamatórias na circulação e ativação das células circulantes,

podendo também haver a presença de bactérias, endotoxinas ou exotoxinas.

As mesmas citocinas encontradas no local da infecção estão presentes na

circulação, e provêm do tecido e/ou do endotélio ou ainda dos leucócitos

sangüíneos. Esse fato é responsável pela maioria das alterações

fisiopatológicas observadas em um quadro clínico de sépse e em modelos

experimentais.

2.2.2. NF-kB

O mecanismo molecular que traduz para o núcleo os sinais mediados

pelo receptor para LPS não estão totalmente esclarecidos. Algumas proteínas-

quinases, como a proteína quinase C e as MAP-quinases (p42, p44 e p38) são

essenciais para o início do sinal de transdução ativado por LPS (Sweet &

Hume, 1996). A produção de citocinas via indução por LPS requer a ativação

36

de vários fatores de transcrição. O NF-kB e o fator nuclear interleucina 6 (NF-

IL-6 ) estão envolvidos na transcrição de uma variedade de citocinas pró-

inflamatórias (como por exemplo: IL-1, IL-6 , TNF-a e IFN-y), moléculas de

adesão e indução da iNOS (Sweet & Hume, 1996). Além disso algumas

citocinas como, IL-1 e TNF-a, podem também ativar o NF-kB, criando assim,

um feedback autoregulatório. Por estes motivos, o NF-kB é considerado uma

importante proteína na regulação da resposta de fase aguda da inflamação.

O NF-kB é um fator de transcrição encontrado em todas as células

eucarióticas. Foi primeiramente descrito em 1986, por Sen & Baltimore, como

um fator nuclear necessário para a transcrição da cadeia leve kappa de

imunoglobulinas em linfócitos B. É sabido que o NF-kB pré-formado existe no

citoplasma da grande maioria de células em sua forma inativa, ligado à uma

proteína inibitória chamada Ik-B. O Ik-B se liga ao NF-kB e mascara o sinal de

localização celular, mantendo-o no citoplasma (Verma et al., 1995; Baldwin,

1996). Através do recebimento de um sinal apropriado (como o sinal de

transdução induzido por LPS) ocorre a translocação nuclear do NF-kB por

modificação de sua subunidade inibitória. A ativação do NF-kB requer uma

sequência de fosforilações, ubiquitinações e degradação do Ik-B.

Recentemente, as Ik-B quináses (IKK) que fosforilam resíduos de serina

encontrados na porção N-terminal do Ik-B foram identificadas (Woronicz et al.,

1997). Entretanto, os mecanismos exatos da ativação destas quinases por

estimulação de monócitos ou neutrófilos com LPS permanecem

desconhecidos. É importante salientar a habilidade do NF-kB em responder

aos sinais enviados por um mediador (indução de sinal) e o fato de que sua

atividade não requer a síntese de novas proteínas, o que permite que o sinal

37

seja transmitido rapidamente. Liu et al. (1997) demonstraram a ativação (em

escala temporal) do NF-kB in vivo, via tratamento de ratos com LPS (dentre

outros estímulos), e a indução da transcrição do gene e expressão da proteína

para iNOS (também em escala temporal). Após o tratamento com LPS, o NF-

kB foi ativado em 15 minutos, o pico de resposta foi alcançado em 30 minutos e

se manteve elevado por 4 horas, indicando a rápida indução e a natureza de

sustentação da ativação do NF-kB neste modelo (Liu etal., 1997).

38

2.2.3. Citocinas Pró-Inflamatórias

O TNF-a é tido como um mediador central da sepse, uma vez que é a

primeira citocina que aparece na circulação na sepse experimental e em

humanos. A administração de i.v. TNF, em animais, induz uma síndrome com

as características da sepse e o tratamento com anticorpo anti-TNF protege

contra os efeitos letais da endotoxina em vários modelos animais (Van der Poli

& Sauerwein, 1993).

Monócitos e macrófagos são os principais produtores de TNF, mas as

células T, células NK {natural killei) e os neutrófilos podem também secretar

TNF-a. Muitas infecções e estímulos inflamatórios são capazes de estimular a

blossíntese de TNF-a, incluindo endotoxinas ou lipopolissacarídeos (LPS) e

outros produtos de bactérias, protozoários, vírus e fungos. Este processo é

extremamente controlado e, no macrófago (o principal produtor de TNF), a

regulação ocorre a nível transcripcional, pós-transcripcional e translacional

como descrito anteriormente. Hormônios glicocorticóides, administrados antes

da ativação do TNF, inibem a sua síntese por inibirem seu mRNA, impedindo

assim a translação. Após a ativação das células por LPS, os corticosteróides

não são nnais capazes de inibir a síntese de TNF. Outros fatores, como IL-4, IL-

6 , pentoxifilina e o antagonista do fator de ativação plaquetária (PAF), possuem

a capacidade de suprimir a síntese de TNF. Já o aumento da produção de TNF

pode ser aumentada por IFN-y, IL-1 e espécies reativas de oxigênio (para

revisão ver Beishuizen etal., 1999).

O TNF é produzido e secretado por células ativadas após alguns

minutos depois do contato com LPS, alcançando o pico máximo de produção

entre 90 e 120 minutos após a administração de endotoxina em voluntários

humanos. Ele ativa as funções inflamatórias de várias células não somente

como um efetor direto mas também age sinergisticamente com IL-1, IFN-y e

LPS. TNF também interage com o sistema complemento e induz a liberação

adicional de eicosanóides. Muitos efeitos mediados pelo TNF ocorrem no

endotélio, onde ele estimula a produção de substâncias vasodilatadoras como

a prostraglandina I2 (PGI2) e 0 óxido nítrico. Grandes quantidades de TNF

fazem com que as células endoteliais percam suas propriedades

anticoagulantes naturais, aumentando a taxa de deposição de fibrina. Isto pode

resultar em coagulação intravascular disseminada, podendo 0 plasma ficar

desprovido de fatores de coagulação. Em sobreposição a estes eventos, como

o TNF tem também importante atividade sobre os neutrófilos, ele promove a

aderência de células polimorfonucleares ao endotélio e as faz sofrer

degranulação e formar compostos intermediários do oxigênio, tais como o

ânion superóxido e o peróxido de oxigênio. Além disso, 0 TNF induz severas

anormalidades metabólicas, como inibição da recaptação de lipídio pelo tecido

adiposo, aumento da lipogênese no fígado, efluxo de aminoácidos da

39

musculatura esquelética e diminuição da proteólise no fígado (para revisão ver

Beishuizen etal., 1999).

A utilização de anticorpos monoclonais contra TNF-a é capaz de reduzir

a morte e a falência circulatória causada pelo choque séptico em ratos (Tracey

et al., 1987; Nassif et al., 1992; Ruetten & Thiemermann, 1997), ao passo que

a injeção de TNF-a recombinante puro é capaz de mimetizar alguns sintomas

do choque séptico (Tracey etal., 1986; Takahashi etal., 1992).

A participação da IL-1 na fisiologia da sepse foi bem demonstrada pela

observação de que um antagonista do receptor para esta citocina (IL-1ra)

reduziu a letalidade causada pela administração de endotoxina (Ohlsson et al.,

1990) ou E. coli (Wakabayashi et al., 1991) em coelhos. Duas formas de IL-1

existem: IL-1 a e IL-1 (3. Elas ligam-se aos mesmos receptores celulares e

exercem efeitos biológicos idênticos. A síntese e liberação de IL-1 em

macrófagos e outras células são iniciadas por microorganismos, endo e

exotoxinas de uma variedade de bactérias, C5a, TNF, por injúria tecidual e até

mesmo pela própria IL-1. Esta citocina age como adjuvante endógeno, servindo

como cofator durante a ativação de linfócitos, primariamente pela indução da

síntese de outras citocinas e a ativação de células T de fase estacionária.

Assim como o TNF, a lL-1 é capaz de induzir um estado semelhante ao choque

séptico em coelhos, resultando principalmente no dano pulmonar (para revisão

ver Beishuizen etal., 1999).

A baixa incidência de detecção de IL-1 durante a sepse em humanos,

provavelmente se deve à falta de um método padronizado capaz de detectar

esta citocina no sangue de diferentes indivíduos. Em voluntários humanos

normais, após a administração de uma dose intravenosa de endotoxina, é

40

possível detectar níveis de lL-1. O pico máximo de lL-1 é alcançado depois de

2 ou 3 horas, após a ativação do sistema que sinaliza a produção de IL-1. A

detecção de IL-1 circulante em pacientes com sepse é observada em apenas

37% dos pacientes, resultado este que pode estar sendo influenciado pelos

métodos de ensaio utilizados (para revisão ver Beishuizen etal., 1999).

A utilização in vivo e in vitro de antagonista do receptor IL-1 (IL-1ra) é

capaz de bloquear a atividade desta citocina. No entanto, é necessário uma

dose elevada deste antagonista, uma vez que a quantidade de receptores para

IL-1 circulantes é elevada, sem levar em consideração a densidade de

receptores necessários á produção das resposta biológicas. Como efeito da

utilização de IL-1ra, ocorre uma dramática redução na hipotensão,

provavelmente devido ao bloqueio da indução de iNOS mediada por IL-1. Uma

redução na produção de IL-1 e TNF pode também ocasionar uma redução na

progressão da infeccão do paciente em choque (para revisão ver Beishuizen et

al., 1999).

A interleucina-8 (lL-8 ), outro mediador pró-inflamatório, é uma pequena

citocina de 8 kDa. É considerada como um fator quimiotático e ativador de

neutrófilos. Alguns estudos mostram a importância desta citocina no

recrutamento de neutrófilos e ativação de sítios de inflamação, resultando na

amplificação da resposta inflamatória local, bem como do dano tecidual. Esta

citocina é secretada por vários tipos de células, incluindo fibroblastos, células

endoteliais e células mononucleares periféricas. A secreção desta citocina

pode ser estimulada por endotoxinas, IL-1 e TNF, mas não existe correlação

satisfatória para explicar a indução de IL-8 por IL-1 em pacientes sépticos (para

revisão ver Beishuizen etal., 1999).

41

2.2.4. Citocinas Anti-Inflamatórias

Os efeitos biológicos das citocinas pró-inflamatórias são balanceados

por diversas citocinas anti-inflamatórias como, IL-4, IL-6 , IL-10, IL-11, IL-13,

fator de crescimento e transformação tumoral (TGF-p), TNF solúvel, receptores

para IL-1 e antagonistas do receptores para IL-1. Dentre todas, as que se

destacam são a IL-10, a IL-4 e TGF-p. Destas, a IL-10, que elimina a

capacidade do TNF-a e da IL-8 de ativar monócitos obtidos de doadores

humanos (Brandtzaeg, 1996b), foi detectada em pacientes com choque séptico

induzido por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e em crianças com

septicemia meningocóccica (Marchant et al., 1994; Derkx et al., 1995). Gomo a

IL-10 é encontrada nos estágios iniciais do choque séptico em níveis de 10-100

vezes maiores do que de outras cininas anti-inflamatórias conhecidas, ela vem

sendo considerada uma das mais importantes citocinas anti-inflamatórias (para

revisão, ver Brandtzaeg, 1996a).

Sabe-se que o choque séptico é geralmente precedido de uma infecção

local não controlada, na qual bactérias ou produtos bacterianos ganham

acesso ã circulação sangüínea sistêmica e induzem uma resposta inflamatória

exacerbada. Como bactérias e seus produtos causam danos teciduais, o

objetivo de uma imunomodulação eficaz seria aumentar as respostas imunes

ao agente agressor. Entretanto, embora existam inúmeros mecanismos

responsáveis pelo balanceamento do processo imunológico, estes parecem

ineficientes durante um choque séptico, no qual uma reação inflamatória

descontrolada, que também culmina em. danos teciduais (Thijis et a/.,1996),

mostra-se como uma das responsáveis pela elevada letalidade deste quadro

42

patológico. A exarcebação da liberação de citocinas anti-inflamatórias também

prejudica a resolução da sepse, uma vez que ocorre uma drástica diminuição

da produção de citocinas pró-inflamatórias pelos macrófagos, necessárias para

a defesa do organismo (Volk et al., 1996).

2.2.5 Proteínas de Choque Térmico (Heat Shock Proteins)

As Heat Shock Proteins (hsp) são proteínas sintetizadas por células em

resposta ao aumento da temperatura e a vários outros estímulos que causam

estresse celular. Fazem parte de uma grande família conhecidas como

"chaperonas moleculares" (do inglês molecular chaperones). Sua principal

função é o equilíbrio da homeostasia celular (integridade conformacional e

estrutural), preservando desta forma a viabilidade celular na presença de

agressores (para revisão ver Beishuizen etal., 1999).

A indução das hsp ocorre também através de espécies reativas de

oxigênio (ROS) originadas das respostas imunológicas do organismo. Elas

conferem proteção contra estresse oxidativo e exposição a oxidantes através

do efeito de "scavenging" de radicais livres, prevenção e reparo do dano ao

DNA, inibição da produção de ROS e inibição da fosfolipase A2. Além disso, as

hsp podem modular a produção de óxido nítrico em células e participar dos

eventos responsáveis pela proteção celular durante processos inflamatórios,

como por exemplo durante 0 desenvolvimento da falência múltipla de órgãos

observada durante o choque séptico (para revisão ver Beishuizen etal., 1999).

43

2.2.6 Agentes Vasoativos

As células endoteliais desempenham várias funções fisiopatológicas. A

liberação de substâncias vasoativas como por exemplo prostaciclina, óxido

nítrico e endotelinas (por estas células) são responsáveis pela modulação do

tônus vascular. Além disso, estas substâncias estão amplamente envolvidas na

insuficiência de perfusão tecidual observada durante um quadro sepse

(Beishuizen etal., 1999).

A endotelina é um peptídeo constituído de 21 aminoácidos. É

encontrada principalmente no endotélio vascular, onde desempenha suas

atividades vasoconstritoras. Além disso, pode ser produzida por

macrófagos/monócitos em resposta a estímulos como catecolaminas

circulantes, TNF, IL-1 e IL-6 . Os receptores para endotelina também foram

encontrados nos pulmões, rins, glândula adrenal, medula, cérebro, trato

gastrointestinal, fígado e baço de várias espécies. A estimulação de células in

vitro e in vivo por endotoxinas leva ã produção de endotelinas no endotélio e

em macrófagos (Beishuizen etal., 1999).

Um número bastante elevado da casos clínicos demonstrou um aumento

nos níveis plasmáticos de endotelina durante quadros de sepse e choque

séptico, o que sugere a participação deste peptídeo no desenvolvimento de

falência múltipla dos órgãos e coagulação intravascular disseminada. Alguns

autores sugerem que a hipotensão associada à baixa resistência vascular

sistêmica, produzida durante o choque séptico, resultante da ação de

substâncias vasodilatadoras, seja o resultado dos efeitos vasodilatadores

prevalecendo sobre os efeitos vasoconstritores gerados pela endotelina. Em

44

alguns leitos (como o renal) este efeito de hipotensão não é observado. A

endotelina é uma das substâncias vasoativas responsáveis pela disfunção

renal que ocorre durante a sepse, por promover redução no fluxo sangüíneo

renal e na taxa de filtração glomerular. A vasoconstrição produzida por este

peptídeo ocorre, pois acredita-se que o estímulo gerado por endotoxinas

supera o estímulo produzido pela baixa perfusão tecidual. Assim, de alguma

forma não totalmente esclarecida, a endotelina é formada e/ou convertida à sua

forma ativa, o que faz com que este peptídeo promova uma vasoconstrição

renal seletiva (Beishuizen et al., 1999).

Como descrito anteriormente o óxido nítrico é um mensageiro

intracelular envolvido em vários processos fisiopatológicos. Nos últimos anos,

inúmeros trabalhos foram publicados demonstrando o envolvimento da "super"

produção de NO durante o desenvolvimento do choque séptico e falência

múltipla dos órgãos, sendo assim considerado como o principal fator envolvido

na vasodilatação e no dano tecidual observado no desenvolvimento desta

enfermidade (Knowles & Moncada, 1992), tanto em animais de experimentação

quanto em humanos (Tsuneyoshi etal, 1996).

A maior parte do NO importante no quadro de choque séptico tem

origem na indução da INOS (Rees et al., 1990; Salter et al., 1991). Uma vez

expressa, esta enzima é capaz de produzir altas concentrações de NO por

longos períodos. O aumento na expressão de INOS (proteína) e de seu mRNA

durante a endotoxemia é observada em vários tipos celulares, como células

endoteliais, células de Kupffer, hepatócitos, células da musculatura lisa

vascular, células renais, condrócitos, miócitos e fibroblastos. Além disso, a

indução da INOS pode ser observada também nos pulmões, aorta, coração.

45

fígado, pâncreas e rins em modelos de sepse Gram-positivo in vivo

(Kengatharan et al., 1996). No entanto é importante ser levado em

consideração que a indução desta enzima ocorre de forma diferencial, no que

se refere às citocinas e órgãos. Assim, em determinados órgãos (baço e

coração) tanto TNF quanto IL-1 parecem ser importantes para indução da

iNOS, enquanto que em outros (pulmão) nenhuma das duas parece ser a

citocina majoritária para a indução da INOS (Cunha et al., 1994).

Admite-se que a contínua e excessiva produção de NO pela indução da

iNOS seja a causa da hipotensão e da hiporresponssividade a vasoconstritores

observada no choque séptico. Dados da literatura mostram que a expressão da

INOS após o tratamento com LPS ou bactérias apresenta diferentes

características no que se refere ao intervalo necessário para indução e ao

período cuja expressão permanece detectável, de acordo com o tipo de animal

e/ou tecido analisado (Knowles et al., 1990; Salter et al., 1991; Cunha et

a/.,1994; Rees et al., 1995). Por exemplo, a expressão de iNOS em diferentes

tecidos de rato atinge seu ápice 4 a 6 horas após a administração de LPS,

decaindo a níveis muito baixos dentro de 24 horas (Knowles et al., 1990; Salter

etal., 1991). Utilizando um modelo de infusão de LPS para reproduzir a fase de

hiperdinâmica circulatória do choque séptico Gardiner et a/.(1995) sugeriram

que: i) a atividade da iNOS é temporalmente dissociada da vasodilatação

existente em ratos 24 horas após o início da infusão de LPS; e ii) o tratamento

com L-NAME (um inibidor da iNOS) não reverte os efeitos cardiovasculares do

LPS. Em conjunto, estes achados sugerem que o mecanismo da

hiporresponsividade possa ser mais complexo do que simplesmente uma alta e

contínua produção de NO.

46

Existem várias evidências clínicas comprometendo o NO como efetor

nas mudanças hemodinâmicas observadas durante o choque séptico. Elevados

níveis de cGMP, nitrito e nitrato (metabolites do NO) são alterações

bioquímicas encontradas nos pacientes sépticos (Beishuizen et al., 1999). A

confirmação da relevância do NO proveniente da iNOS no quadro séptico

recebeu confirmação com a observação que uma parcela importante da

sintomatologia da sepse é atenuada quando da utilização de inibidores das

NOS. Assim, a utilização de inibidores restabelece níveis pressóricos normais

após a administração de LPS (Kilbourn et a/.,1990; Gray et al., 1991; Rees et

al., 1998), melhora índices de sobrevivência em modelos de sepse (Wu et

a/., 1995) e atenua a falência múltipla de órgãos e a falência circulatória

decorrentes da administração de LPS em ratos (Wu et al., 1996). Finalmente,

camundongos knockout para o gene da iNOS tem sua resposta à

catecolaminas melhorada bem como sobrevivem mais em modelos

clinicamente relevantes de choque séptico (Hollemberg et al., 2000). Além

disso, embora a expressão de iNOS esteja associada também à depressão da

atividade cardíaca existente durante o choque séptico (Schulzl et al., 1992), a

inibição da NOS tem mostrado-se ineficaz em restabelecer a função cardíaca

do choque endotoxêmico (Klabunde & Coston, 1995; Keller et al., 1995). Um

problema que permeia a sugestão feita por vários autores que inibidores da

iNOS seriam benéficos (Mulder et al., 1994; Avontuur et al., 1998) no

tratamento do choque séptico é o fato de que, se do ponto cardiovascular, esta

inibição é vantajosa, o mesmo não seria verdade do ponto de vista de defesa

do organismo, já que o NO vindo desta mesma enzima é vital no combate ao

agente invasor (Hibbs et a/.,1990). Além disso, os diferentes efeitos dos

47

inibidores da síntese de NO, relativos ao nnecanismo de ação e a dose-

dependência, contribuem para ambiguidade observada no que se refere à

utilização ou não de inibidores da síntese de NO na clínica (Beishuizen et al.,

1999). Como sugerido por Wright etal. (1992) os efeitos benéficos da utilização

de inibidores da NOS parecem estar relacionados à inibição da isoforma

induzida, enquanto os efeitos deletérios relacionados à inibição das enzimas

constitutivas, principalmente da forma endotelial.

48

3. HORMÔNIOS DA SUPRA-RENAL

3.1. Introdução

O sistema endócrino é responsável pela coordenação das reações do

organismo frente às várias mudanças fisiopatológicas que podem ocorrer

durante a vida normal de um indivíduo. Um dos órgãos centrais deste complexo

sistema é a glândula adrenal (Miller & Blake Tyrrel,1995). A importância clínica

das glândulas adrenals foi descrita primeiramente por Addison em 1849, a

partir da observação de que pacientes com a glândula adrenal destruída não

conseguiam sobreviver. Estes estudos, os quais foram publicados

posteriormente (Addison, 1855; apud Goodman, 1996) tiveram continuidade

nos trabalhos realizados por Brown-Séquard, que demonstrou que a

adrenolectomia bilateral era fatal em animais de laboratório (Goodman, 1996).

Situada no final da cascata neuroendócrina, chamada de eixo

hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) (Fink,1997), a glândula adrenal é composta

por duas partes distintas: a medula adrenal (funcionalmente relacionada com o

sistema nervoso simpático; secreta os hormônios adrenalina e noradrenalina

em resposta à estimulação simpática) e o cortéx adrenal que secreta os

hormônios adrenocorticais mineralocorticóides e glicocorticóides, além de

secretar pequenas quantidades de hormônios sexuais como os hormônios

androgênicos (Guyton & Hall, 1996). As ações dos hormônios adrenocorticais

historicamente foram descritas como ações mediadas por glicocorticóides

(regulação do metabolismo de carboidratos) e ações mediadas por

mineralocorticóides (regulação do balanço eletrolítico). O principal

glicocorticóide em humanos é a hidrocortisona ou cortisol enquanto que o

principal mineraiocorticóide encontrado em humanos é a aldosterona.

Sinais originados de áreas centrais do cérebro como o hipocampo ou

amígdala modulam a síntese e liberação do fator de liberação de corticotrofina

(CRF, do inglês corticotrophin-releasing factor) e arginina vasopressina (AVP)

do hipotálamo, que então resulta na formação de um sinal do hormônio

adrenocorticotrópico (ACTH) no interior da pituitária. O ACTH estimula a

síntese e liberação de hormônios adrenocorticais por um mecanismo ainda não

totalmente esclarecido. Acredita-se que as ações do ACTH devam-se à

biossíntese de novo de hormônios adrenocorticais, uma vez que não ocorre

acúmulo de esteróides na glândula adrenal. A regulação da secreção de ACTH

e conseqüentemente, a regulação da secreção de hormônios adrenocorticais é

feita por fatores que influenciam o funcionamento do eixo HPA. Dentre eles

destacam-se o ciclo circadiano, o pico basal de liberação de hormônios

adrenocorticais ocorre pela manhã ( - 8 :0 0 h) resultante da alteração cíclica de

24h nos sinais a partir do hipotálamo que causam a secreção destes

hormônios; feedback negativo, realizado pelo produto final da estimulação da

liberação de ACTH (podendo ocorrer sobre o hipotálamo ou sobre a hipófise); e

sinais de estresse como injúria, hemorragia, infecção severa, cirurgias,

49

hipoglicemia, frio, dor e medo, aumentam a liberação de ACTH (Goodman,

1996).

Os efeitos dos hormônios adrenocorticais ou corticosteróides ou ainda

glicocorticóides, é mediado por dois distintos receptores intracelulares, o

receptor glicocorticóide (GR) e o receptor mineralocortióide (MR) (Hollenberg et

al., 1985; Arriza et al., 1987). Estes, após ativação por seus respectivos

hormônios nos tecidos alvos, regulam a expressão de genes responsivos a

glicocorticóides, alterando os níveis de determinadas proteínas. Devido a esta

interação (receptor-DNA), a resposta induzida por glicocorticóides não é

imediata ocorrendo ao longo de algumas horas. Embora os corticosteróides

ajam predominantemente aumentando a expressão de genes-alvos, existem

alguns exemplos bem documentados onde os glicocorticóides diminuem a

transcrição de destes genes-alvos. (Goodman, 1996). Em contraste a estes

efeitos diretos no DNA, recentes estudos têm demonstrado a possibilidade de

que algumas das ações dos corticosteróides ocorrem rapidamente sendo

mediadas por receptores de membrana (Wehling, 1994).

3.2. Mineralocorticóides

Como descrito anteriormente, o principal mineralocorticóide encontrado

em humanos é a aldosterona, suas principais ações estão envolvidas na

regulação do balanço eletrolítico. Este hormônio exerce cerca de 90% da

atividade mineralocorticóide da secreção adrenocortical mas o cortisol, o

principal glicocorticóide secretado pelo córtex adrenal, também fornece uma

quantidade significativa de atividade mineralocorticóide. Apesar de ser

secretado numa quantidade 80 vezes maior que a aldosterona, sua atividade

50

mineralocorticóide é de apenas 1/400 da atividade exercida pela aldosterona

(Guyton & Hall, 1996).

A função mais importante da aldosterona é promover o transporte de

sódio e de potássio através de algumas porções das paredes tubulares renais.

Uma outra função também desenvolvida pela aldosterona, porém menos

importante, é a de promover o transporte de hidrogênio nos rins. Assim, o papel

da aldosterona pode ser resumido como responsável pela conservação de

sódio no líquido extracelular e excreção de potássio pela urina. A secreção da

aldosterona é regulada principalmente a partir da concentração do íon potássio

(um aumento na concentração de potássio, por menor que seja, pode causar

um aumento na secreção de aldosterona) e do sistema renina-angiotensina

(causa 0 aumento da secreção de aldosterona em resposta à diminuição do

fluxo sangüíneo renal). Apesar de há muitos anos ser conhecido o efeito global

dos mineralocorticóides sobre o corpo, a ação básica da aldosterona sobre as

células tubulares no aumento do transporte de sódio é ainda parcialmente

conhecida. Acredita-se que devido à sua solubilidade lipídica nas membranas

celulares, a aldosterona difunde-se para o interior das células epiteliais

tubulares, onde interage com o receptor mineralocorticoíde, que através da

interação receptor-DNA, promove a transcrição de proteínas relacionadas com

o processo de transporte de sódio e potássio (Guyton & Hall, 1996).

O receptor mineralocorticóide de humanos foi clonado em 1987 (Arriza

et a i, 1987). É composto por 984 aminoácidos e possui alta afinidade por

corticosterona, aldosterona e cortisol (Krozowski & Funder, 1983). Sua

expressão é restrita a alguns tecidos como rim (seu principal sítio de ação),

cólon, glândulas salivares, glândulas sudoríoaras e hipocampo. Apesar deste

51

receptor possuir elevada afinidade por cortisol, a especifidade restrita à

aldosterona se deve à presença de uma enzima chamada 11(3-hidroxiesteróide

desidrogenase. Esta enzima, presente estrategicamente nos tecidos onde a

atividade mineralocorticóide é marcante, promove a catálise do glicocorticóide

cortisol em cortisona, um derivado corticosteróide que possui baixa afinidade

pelo receptor mineralocorticóide. Desta forma, mesmo na presença de altas

quantidades de cortisol circulante, a especifidade da aldosterona pelo MR pode

ser mantida (Goodman, 1996).

3.3. Glicocorticóides

São vários os efeitos biológicos dos glicocorticóides, dentre os quais

incluem-se regulação no metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídios;

regulação da fisiologia do sistema cardiovascular, do sistema imune, do rim, da

musculatura esquelética, e dos sistemas endócrino e nervoso.

Até recentemente, os efeitos observados pela ação dos glicocorticóides

eram relacionados apenas a seus efeitos fisiológicos (níveis normais de

glicocorticóides) e efeitos farmacológicos (altos níveis de glicocorticóides que

excedem a dose diária produzida considerada como fisiológica).

Recentemente, novos conceitos sugerem que as ações anti-inflamatórias e

imunossupressoras dos glicocorticóides, também promovem um efeito

"protetor" em condições fisiológicas, uma vez que os mediadores da resposta

imune associados à resposta inflamatória diminuem o tônus vascular, o que

pode levar a um colapso cardiovascular caso não ocorra a neutralização destas

reações pelos hormônios glicocorticóides (Goodman, 1996).

52

Os glicocorticóides sintéticos são amplamente utilizados na terapêutica,

devido às suas propriedades anti-inflamatórias e imunossupressoras. São

descritos como os anti-inflamatórios mais potentes existentes na clínica, uma

vez que seus mecanismos de ação geralmente suprimem a resposta

inflamatória desde o início do processo. Com exceção da reposição hormonal

em casos de deficiência, a utilização de glicocorticóides é basicamente

empírica e requer cuidadosa consideração em relação ao custo-benefício

oferecido por esta classe de anti-inflamatórios, uma vez que os efeitos

colaterais causados por sua administração são vários e extremamente nocivos

ao organismo (nos casos de uso contínuo).

3.3.1. Síntese e Liberação

Como descrito anteriormente os glicocorticóides são secretados a partir

da ação do ACTH sobre o córtex da adrenal. Nas células adrenocorticais o

ACTH liga-se a um receptor de membrana acoplado à proteína G, chamado

receptor ACTH. Desta forma ocorre ativação da adenilato ciclase e aumento na

concentração intracelular de cAMP (segundo mensageiro). As células

adrenocorticais, em resposta ao ACTH, aumentam a oferta de colesterol, o

substrato das enzimas esteroidogênicas, durante a fase aguda da biossíntese

de glicocorticóides que ocorre em poucos segundos após a ativação do

receptor ACTH. Durante a fase crônica, que pode ocorrer dentro de algumas

horas ou até mesmo em alguns dias após a ação do ACTH sobre seu receptor

na membrana das células, ocorre um aumento acentuado na transcrição de

enzimas esteroidogênicas. A mais importante de todas as etapas estimuladas

pelo ACTH para controlar a secreção adrenocortical é a ativação da enzima

53

proteína quinase A, que causa a conversão inicial do colesterol em pregnolona.

Esta conversão inicial é a etapa "limitadora da velocidade" de todos hormônios

adrenocorticais, o que explica porque o ACTH normalmente é necessário para

que qualquer um dos hormônios adrenocorticais seja formado (Guyton & Hall,

1996). Os mecanismos que regulam a secreção de ACTH pela hipófise anterior

já foram discutidos acima (seção3.1).

O cortisol combina-se no sangue com uma globulina chamada de

globulina fixadora do cortisol ou transcortina e, em menor extensão, com

albumina (cerca de 94% são normalmente transportados na forma fixada e

cerca de 6% na forma livre). Por outro lado, a aldosterona combina-se apenas

frouxamente com as proteínas plasmáticas, de modo que cerca de 50% estão

na forma livre. Tanto na forma combinada quanto na livre, os hormônios são

transportados pelo compartimento do líquido extracelular. Em geral os

hormônios são fixados nos tecidos alvo ou destruídos dentro de 1 ou 2 horas

no caso de cortisol, ou dentro de cerca de 30 minutos no caso da aldosterona.

Os esteróides adrenals são degradados sobretudo no fígado e conjugados

especialmente para formar glicuronídeos e, em menor extensão em sulfatos.

Cerca de 25% destes são excretados na bile e, depois, nas fezes, e os 75%

restantes, na urina. As formas conjugadas destes hormônios são inativas

(Guyton & Hall, 1996).

3.3.2. Mecanismo de Ação

O modelo clássico de ação dos glicocorticóides envolve a ligação deste

a um receptor específico no citosol, com conseqüente transporte para o núcleo

54

celular e interação com regiões específicas no DNA, promovendo a transcrição

e/ou repressão de determinados elementos responsivos à eles.

O receptor glicocorticóide (GR) humano foi clonado em 1985 ,

Hollenberg et a i. Em seguida os receptores de rato e camundongo também

foram clonados. Existe uma alta homologia estrutural entre as diferentes

espécies, em torno de 89%. Sua estrutura de aproximadamente 80-90 kDa

pode ser dividida em três domínios funcionais. A maior diferença entre os

receptores é observada no domínio N-terminal, considerado como uma região

"moduladora" envolvida na regulação da transcrição mediada por receptor.

Ainda nesta região existem resíduos de serina passíveis de regulação via

fosforilação, no entanto o efeito destas fosforilações sobre as ações dos

glicocorticóides ainda não estão totalmente esclarecidas. Perto do centro da

proteína está um segundo domínio de ligação, uma região altamente básica,

enriquecida de resíduos de cisteína, lisina e arginina. Esta região tem

aproximadamente 70 aminoácidos e nela está localizado o domínio de ligação

do receptor ao DNA (DBD, do inglês DNA binding domain). Existem também

nesta região duas projeções em forma de "dedo", as quais interagem com o

DNA, chamadas de "dedos de zinco" (do inglês zinc fingers). Estes zinc fingers,

por sua vez, são formados por um átomo de zinco ligado a quatro resíduos de

cisteínas. O terceiro e último domínio, chamado de domínio de ligação do

hormônio (HDB, do inglês hormone binding domain) está localizado no extremo

C-terminal do receptor. A ligação do glicocorticóide (GC) ocorre nesta região e

ativa as respostas biológicas mediadas pelo receptor. O GR inativado é um

complexo protéico de aproximadamente 300 kDa localizado no citosol celular e

resulta da associação do receptor a heat shock proteins. Uma molécula do

55

receptor encontra-se associado a duas moléculas de heat shock protein com

90 kDa cada , a hsp90. A ligação da hsp90 confere ao receptor uma

conformação de ligação ao esteróide de alta afinidade. Já a dissociação que

ocorre sob algumas condições como elevação da temperatura e do pH,

promove a alteração da conformação do receptor para um estado de alta

afinidade de ligação ao DNA. A ligação do esteróide ao GR também acarreta

na dissociação da hsp90 e possibilita a translocação do mesmo para o núcleo.

Além da heat shock protein de 90 kDa, outras hsp como a hsp70 e a hsp56

fazem parte do heterocomplexo que forma o GR. Na verdade, estas proteínas

existem no citosol complexadas independentes de sua ligação com o receptor.

A função da hsp70 no heterocomplexo formado a partir da ligação com o

receptor ainda não está totalmente elucidada. Sabe-se que assim como a

hsp90, esta proteína de 70 kDa também liga-se diretamente no receptor dentro

do domínio de ligação do esteróide (HBD). A hsp56, outra proteína que faz

parte do heterocomplexo GR inativado, é uma imunofilina ou proteína de

ligação para a droga imunossupressora FK506. Porém, a função da ligação

desta imunofilina ao receptor ainda não está bem esclarecida. Acredita-se que

ela esteja envolvida no processo de translocação do receptor para o núcleo

(para revisão ver Barnes, 1998 e Richards et a i, 1995). Além destas proteínas

citadas anteriormente, sabe-se da existência de outras proteínas que também

mantêm o receptor inativado, as quais ainda não foram caracterizadas.

Após a ligação do esteróide ao seu domínio de ligação ocorre a

dissociação do heterocomplexo (GR inativado) e o receptor transloca-se para o

núcleo, onde ocorre a dimerização do mes.mo que permite a interação receptor-

DNA. Alguns trabalhos têm demonstrado que a formação de homodímeros não

56

é exclusiva. Assim, foram encontrados heterodímeros formados a partir da

ligação de receptores glicocorticóides e receptores mineralocorticóides. Além

de aumentar a afinidade dos receptores pela região de ligação no DNA a

formação de heterodímeros pode ter implicações clínicas, como a possibilidade

de otimização dos tratamentos feitos com corticosteróides (para revisão ver

Trapp & Holber, 1996).

No núcleo o receptor glicocorticóide interage com sítios específicos no

DNA, chamados de elementos responsivos à glicocorticóide (GRE, do inglês

glucocorticoid response element - 5'-GGTACA-nnn-TGTGCT-3') ou elemento

responsivos ao glicocorticóide negativo (nGREs), cuja seqüência de

identificação varia muito mais (Yamamoto, 1985; Beato, 1987). O número de

genes por célula regulados diretamente, varia entre 10 e 100. No entanto sabe-

se que vários outros genes são regulados de forma indireta através da

interação com outros fatores de transcrição. Ao ligar-se ao GRE, o receptor

dimerizado inicia a seqüência de transcrição. O mecanismo pelo qual o GR

ativado encontra as regiões responsivas ao glicocorticóide dentro de um "mar

de genes" ( - 1 0 0 .0 0 0 ) não está totalmente esclarecido mas recentemente

algumas evidências sugerem que o GR dimerizado liga-se inicialmente de

forma não-especifica ao DNA. Em seguida interage com outro filamento de

DNA para então dissociar-se do primeiro sítio de ligação. Estes "pulos" são

repetidos até que sítios GRE de alta afinidade sejam encontrados. A ligação do

GR ao seu sítio GRE modifica o curso da transcrição, resultando na indução ou

repressão de determinados genes, quando ocorre a ligação com um nGRE

(para revisão ver Barnes, 1998). Os nGRE são raramente identificados em

alguns genes como o gene da pro-opimelanocortina (POMC) e o gene da

57

osteocalcina (para revisão ver Webster & Cidiowski, 1999). IVIuitos genes que

são reprimidos pelos glicocorticóides não possuem GRE sendo assim sugerido

por alguns pesquisadores que outro mecanismo deva estar envolvido neste

processo.

Este é o mecanismo mais bem descrito até então (modulação da

expressão do gene através de uma interação proteína-proteína). Através do

cross-talk com fatores de transcrição como o AP-1, a expressão de genes pode

ser controlada pelo GR sem que ocorra necessariamente a ligação do receptor

ao DNA. Neste caso, a interação com outras proteínas, possivelmente

mediadas por fatores de transcrição, previne a transativação do gene

resultando num efeito repressor. Desde a descoberta deste mecanismo em

1990 (Jonat et a i, 1990; Schüle et a i, 1990; Yang Yen et a i, 1990), um

crescente número de exemplos deste modo de ação foi descrito incluindo a

interação do GR com AP-1, NF-kB, GATA-1 e CREB (Chang et a i, 1993; Imai

et a i, 1993; Caldenhoven et a i, 1995). Este pode ser um dos mecanismos pelo

qual os glicocorticóides exercem seus efeitos anti-inflamatórios, uma vez que a

ativação da transcrição de vários mediadores da inflamação é reprimida pela

interação direta com o glicocorticóide. Os efeitos anti-inflamatórios dos

glicocorticóides parecem ocorrer através do cross-talk com NF-kB e AP-1 em

diferentes tecidos.

Esta interação proteína-proteína foi primeiramente demonstrada com o

gene da colagenase, o qual era induzido pelo fator ativador de transcrição de

proteína-1 (AP-1), um heterodímero dos produtos dos genes fos e jun. O

glicocorticóide interage com o AP-1 e previne a ativação da transcrição deste

gene. Este tipo de interação parece ser importante na regulação dá expressão

58

de vários genes que transcrevem mediadores inflamatórios, ativados inclusive,

por outros fatores de transcrição como o NF-kB, que por sua vez é responsável

pela ativação de genes que codificam citocinas, receptores para citocinas,

proteínas quimiotáticas ou moléculas de adesão, assim com IL-1(3, TNF-a, IL-2,

IL-6 , IL-8 , proteína quimiotática para macrófago (MCP-1, do inglês macrophage

chemotactic protein) dentre outros mediadores da inflamação (ver De Bosscher

etal, 2 0 0 0 ).

Outra forma de regulação da transcrição de mediadores da inflamação é

através da up-regulation de l-kBa, que como descrito anteriormente é uma

proteína inibitória do fator de transcrição NF-kB. No entanto, vale lembrar que

este mecanismo de repressão do NF-kB é altamente tecido-específico (ver De

Bosscher etal, 2000).

Recentemente cresceram as evidências que sugerem que os

glicocorticóides também interagem com a cromatina e regulam a expressão de

genes através de um modelo de competição. Vários fatores de transcrição têm

a habilidade de interagir com moléculas co-ativadoras (como por exemplo

CREB binding protein ou CBP, e p300). Estas por sua vez, possuem atividade

histona-acetiltransferase, o que resulta na acetilação de resíduos de histona e

conseqüentemente no desenrolamento da fita de DNA. Este evento permite

que ocorra a transcrição de determinados genes que codificam principalmente

mediadores pró-inflamatórios. A utilização de glicocorticóides (como droga anti-

inflamatória), através de sua interação com co-repressores promove a

deacetilação das histonas e o enovelamento da fita de DNA o que impede a

transcrição de genes. O que determina se ocorrerá ou não abertura da

cromatina para posterior transcrição é a competição entre os fatores de

59

transcrição e os glicocorticóides na corrida pela interação destes com as

CBP/p300 (Barnes, 1998).

3.3.3. Uso no Choque Séptico

Devido às propriedades anti-inflamatórias dos glicocorticóides e de sua

habilidade em afetar vários sistemas envolvidos no desenvolvimento do choque

séptico, glicocorticóides sintéticos foram utilizados em indivíduos com sepse

como uma possibilidade de tratamento. Alguns dos estudos realizados

demonstraram que os glicocorticóides sintéticos melhoraram os sintomas do

choque séptico em indivíduos, porém isto não foi observado em todos os tipos

de sepse (Thompson, 1993). Foi verificado também que na maioria dos casos,

a utilização dos glicocorticóides não melhorou o quadro dos pacientes

estudados (Bone, 1991; Cohen & Glauser, 1991).

Embora ocorra um aumento considerável na concentração de cortisol

durante o choque séptico (Molijn et a i, 1995) em resposta ao estresse

provocado pela infecção estes glicocorticóides endógenos não foram capazes

de inibir, por exemplo, a indução da iNOS. Esta falha do sistema, que é um dos

responsáveis pelo controle da resposta inflamatória no organismo, pode ser

causada pela redução do binding de glicocorticóide com as proteínas

responsáveis por seu transporte plasmático (Pugeaut et ai., 1989) ou pela

diminuição do binding de glicocorticóide com o seu receptor (Huang et ai.,

1987; Li & Xu, 1988). Recentemente este dado foi confirmado por Galigniana et

ai. (1999) que através da incubação do receptor glicocorticóide com doadores

de NO (os quais poderiam estar mimetizando o efeito do NO produzido em

grande quantidade durante o choque séptico) demonstrou que o binding do

60

receptor estava diminuído. Sabendo que o óxido nítrico tem alta afinidade por

sulfidrilas (-SH) ou resíduos de cisteína e que o receptor glicocorticóide possui

cisteínas críticas ao seu funcionamento, os autores sugeriram que: i) o NO

estava nitrosilando as cisteínas presentes no domínio de ligação do

glicocorticóide; ii) que este efeito não podia ser atribuído à dissociação do

heterocomplexo hsp90; iii) que a utilização de DTT (um anti-oxidante) revertia

este efeito; e iv) que a falha que ocorre no sistema considerado o "freio" da

resposta inflamatória pode estar atribuída ao fato de que as altas quantidades

de NO produzidas em condições patológicas estariam diminuindo a afinidade e

o número de receptores, possivelmente por S-nitrosilação de grupos -SH

críticos à ativação e ligação do glicocorticóide ao receptor GR (Galigniana et

al„ 1999).

Se assim for, novas estratégicas terapêuticas poderão ser desenvolvidas

na tentativa de reverter o quadro patológico de pacientes com choque séptico.

61

OBJETIVOS

4. Objetivos

4.1 Geral

Neste estudo, procuraremos demonstrar que a administração prévia de

NO é capaz de mudar o curso da ação de um glicocorticóide, no que se refere

à inibição da indução da INOS no choque endotóxico em ratos.

4.2 Específicos

- Avaliar o perfil de indução da iNOS e os padrões de atividade de

NOS constitutivas em diversos órgãos do rato, causado pela injeção

de LPS;

- Avaliar a capacidade inibitória de dexametasona na indução da iNOS

em animais endotóxicos;

- Avaliar o efeito de doadores de NO administrados previamente ao

iniciador do choque endotóxico (LPS);

- Avaliar o comportamento dos níveis plasmáticos de nitrato+nitrito

(NOx) em animais injetados com LPS, bem como a eventual

modificação destes achados por dexametasona e por doadores de

NO;

- Avaliar o comportamento do peso do baço em animais injetados com

LPS, bem como a eventual modificação destes achados por

dexametasona e por doadores de NO.

62

MATERIALE MÉTODOS

5. Material e Métodos

5.1 Animais

Para realização deste estudo foram utilizados ratos Wistar, fêmeas, com

3 a 4 meses de idade e pesos variando entre 170 e 220 g. Os animais foram

fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina e

mantidos no Biotério Setorial da Coordenadoria Especial de Farmacologia até a

realização dos experimentos. A temperatura ambiente (22 ± 2°C) e o ciclo de

luz claro/escuro (12/12h) foram controlados automaticamente. Os animais

tiveram livre acesso à alimentação e água até o momento do experimento.

5.2 Perfusão e Obtenção das Amostras

Todos os procedimentos a seguir foram realizados de acordo com as

diretrizes da publicação Cuidados com Animais de Laboratório dos Institutos

Nacionais de Saúde (NIH; USA). Imediatamente antes da anestesia, os animais

foram pesados. Para realização da perfusão, coleta de sangue e de amostras

de tecido para posterior análise, os animais foram anestesiados com uma

solução de uretana (1,0 g/kg), administrada pela via intramuscular. Após

abertura da cavidade toráxica, aproximadamente 1 mL de sangue foi coletado

do coração do animal. Em seguida uma agulha de escalpe conectada a um

reservatório contendo salina (NaCI 0,9%) à 37°C mantido à uma altura de

aproximadamente 1 m foi inserida no ventrículo esquerdo do coração. Para

garantir a completa perfusão foi feito um pequeno corte no ventrículo direito

permitindo o escoamento do sangue.

O sangue coletado foi incubado por 30 minutos em banho-maria a 37°C.

Em seguida os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 2000 rpm. O soro

63

foi retirado e estocado em freezer a -70°C para posterior determinação de

nit rito/nitrato.

Os órgãos (ou fragmentos deles, dependendo do caso) como, aorta,

musculatura esquelética, cérebro, coração, rim, baço e pulmão foram

cuidadosamente coletados para garantia da integridade da enzima NOS e

rapidamente armazenadas em freezer a -70°C até o momento da dosagem. O

peso do baço foi registrado após sua coleta, antes de ser congelado.

5.3 Medida da Atividade das NOS

5.3.1 Preparação dos Homogenatos dos Órgãos ou Tecidos

Para evitar-se perda da atividade enzimática, a homogeneização dos

tecidos era feita imediatamente antes do ensaio enzimático. Para preparação

dos homogenatos os órgãos foram mantidos a uma temperatura de 4°C. Este

cuidado foi necessário para evitarmos ao máximo a desnaturação enzimática.

Os órgãos foram cortados em pequenos fragmentos e imediatamente imersos

em tampão de homogeneização gelado (composto por 320 mM de sacarose,

50 mM de Tris-HCI, 1 mM de DTT, 10 pg/mL de inibidor de tripsina do feijão de

soja, SBTI, pH 7,0) numa proporção de 1:3 a 1:5 (p/v). Imediatamente antes da

homogeneização, adicionou-se o inibidor de serino-proteases, fluoreto de

fenilmetilsulfonil (PMSF) numa concentração de 10 mg/mL. Nos órgãos ou

tecidos muito pequenos, o volume de tampão de homogeneização foi ajustado

de forma a ainda conseguir-se uma boa homogeneização sem, contudo, diluir-

se a amostra em demasia. Os órgãos foram triturados em homogeneizador

mecânico (Ultra-Turrax) a uma velocidade de 10.000 rpm. O material foi

centrifugado por 15 minutos (30.000 x g) a uma temperatura de 4°C.

64

5.3.2 Ensaio da Atividade das NOS pelo IVIétodo da L-citrulina

A atividade da NOS foi medida através da conversão de (H^)-L-arginina

em (H^)-L-citrulina, onde o produto é separado do substrato graças à afinidade

diferencial de uma resina de troca iônica (descrito por Gopaiakrishna e

Nagarajan, 1980 e aplicado por Bredt e Snyder, 1990).

Para evitar-se consumo excessivo de substrato (tornando a cinética não-

linear) ou uma atividade tão baixa que aumentasse o erro das determinações, o

volume a ser ensaiado de cada homogeneizado foi variado dentro do limite de

30 pl, que é o volume máximo permitido pelo método. Quando o volume de

amostra a ser ensaiado era menor que 30 [jI, o volume restante era completado

com tampão de homogeneização. Às amostras foram adicionados 50 piL de

tampão de ensaio, misturados e incubados por 1 h em banho-maria a 37°C. O

tampão de ensaio era composto por 50 mM de KH2PO4: 1,2 mM de MgCl2; 0,25

mM de CaCl2; 60 mM de L-valina; 1,2 mM de L-citrulina e 1 mM de DTT

(preparado de antemão, aliquotado e armazenado em freezer doméstico por

até 3 meses). No dia do ensaio, os seguintes cofatores eram adicionados: 5 |jM

de L-arginina, 4 pM de flavina adenina dinucleotídeo (FAD), 4 pM de flavina

adenina mononucleotídeo (FMN), 10 |jM de tetrahidrobiopterina (THB4), 200

(jM de nicotinamida adenina difosfato reduzido (NADPH) e o equivalente a 0,1

(jCí de (H^)-L-arginina. Após o período de incubação, a reação era terminada

com a adição de 500 pL de resina (Dowex AG-50x8, forma sódica, 1:1 em

água, pH 6,7). Após agitação, os tubos eram centrifugados por 3 minutos a

5.000 rpm. Cem microlitros do sobrenadante foram retirados e adicionados à 1

mL de líquido de cintilação (58% de fluido de cintilação [6g/L de PPO -1- 0,2 g/L

de POPOP em tolueno], 34% de Triton X-100 e 8% de água de Milli-Q). O tubo

65

de ensaio foi vigorosamente agitado e em seguida a radioatividade foi

quantificada em um contador (3 de cintilação líquida. A determinação da

concentração protéica dos homogenatos foi feita através da absorção

ultravioleta no comprimento de onda de 280 nm em cubetas de quartzo.

Uma das vantagens do método da L-citrulina é que ele permite a

determinação simultânea das duas categorias de NOS, as enzimas cálcio-

dependentes e as enzimas cálcio-independentes. Para tanto, cada amostra é

ensaiada em três condições distintas, cada uma delas em um tubo distinto. A

primeira delas, no assim chamado tubo T, consiste na incubação do

homogenato com o tampão de ensaio somente. A segunda, no tubo chamado

de tubo E, consiste na incubação do mesmo volume de homogenato em

questão com o tampão de ensaio (como acima descrito) mas acrescido de 1

mM de EGTA. Na última delas, no tubo chamado de tubo E+L, o homogenato é

incubado com tampão de ensaio acrescido de 1 mM de EGTA + 1 mM de L-

NIO (ou outro inibidor potente não-seletivo das NOS). Assim, a subtração dos

resultados dos tubos T e E dos resultados dos tubos E+L, para cada amostra

de homogeneizado, desconta a contagem "não-específica". O valor de [E-

(E+L)] representa a atividade cálcio-independente e o valor {[T-(E+L)] - [E-

(E+L)]} representa a atividade cálcio-dependente.

5.4 Determinação dos Níveis Séricos de Nitrato + Nitrito (NOx)

A metodologia utilizada para a dosagem dos valores de NOx foi descrita

detalhadamente por Granger et al. (1990). Cem microlitros de soro foram

desproteinizados pela adição de 20 |j L de sulfato de zinco a 20% (p/v em

água), seguidos de 80 |jl de água de Milli-Q e mantidos a 4°C por 30 minutos.

66

Em seguida, as amostras foram centrifugadas por 20 minutos a 3.000 rpm.

Cem microlitros do sobrenadante foram retirados e incubados durante 3 horas

em estufa a 37°C em presença de nitrato redutase expressa em E. coli em

tampão fosfato de sódio 0,5 M pH 7,2 e tampão formiato de amônio 2,4 M pH

7,2. Após este período de incubação, as amostras foram novamente

centrifugadas para a remoção da bactéria, sendo então 100 |jL do

sobrenadante misturados com o mesmo volume de reagente de Griess (1% de

sulfanilamida em 10% de ácido fosfórico e 0,1% de alfa-naftil-etilenodiamina

em água de Milli-Q) em placas de 96 poços para leitura em 540 nm em um

leitor de placas. Curvas-padrão de nitrito e nitrato (0 a 150 |jM) foram feitas

simultaneamente. Como nestas condições a conversão de nitrato a nitrito foi

sempre superior a 90%, nenhuma correção dos resultados foi feita. Finalmente,

por meio de uma regressão linear, os valores foram expressos como |jM de

NOx (nitrito + nitrato).

5.5 Protocolo Experimental

Com o objetivo de avaliarmos o perfil de indução da NOS cálcio-

independente e os padrões de atividade de NOS constitutivas nos diversos

órgãos do rato causado pela injeção de LPS, os animais foram tratados e

divididos em dois grupos. O curso temporal de todo o protocolo experimental

está mostrado no Esquema 4. O primeiro deles, determinado como grupo

controle recebeu injeções de PBS estéril (250 pl, i.p.). O segundo grupo

recebeu injeções de LPS (5 mg/kg, i.p.) obtido de E. coli (sorotipo 0111:84).

Oito horas após o tratamento os animais foram anestesiados, perfundidos,

sacrificados e os órgãos e o sangue coletados como descrito anteriormente.

67

Quando houve necessidade de pré-tratamento com glicocorticóide, duas

doses de dexametasona (2 mg/Kg, s.c.) foram administradas nos animais, a

primeira 12 h e a segunda 1 h antes da administração (ver Esquema 4).

Para o tratamento dos animais com o doador de NO, o SNAP foi

administrado na dose de 3 mg/kg, s.c. 2 horas antes de cada dose de

dexametasona (ver Esquema 4).

68

-14 -12 TEMPO (h) -2 -1 ZERO + 8GRUPO

TRATAMEhíTOCONTROLE PBS PBS

DEXA PBS DEXA

LPS PBS PBS

DEXA+LPS PBS DEXA

SNAP+DEXA+LPS SNAP DEXA

PBS PBS PBS

PBS DEXA PBS

PBS PBS LPS

PBS DEXA LPS

SNAP DEXA LPS

SACRIRCIO

Esquema 4: Protocolo experimental identificando os grupos de animais e o

tratamento utilizado em cada grupo durante todo o tempo do experimento.

5.6 Drogas

S-nitroso-N-acetil-DL-penicilamina (SNAP), sintetizado pelo método de

Field et a i (1978); 21-fosfato dissódico de dexametasona (Prodome); [H^] L-

arginina (Amersham, ImCi/mL ou 37MBq/mL). Os demais reagentes

empregados foram da Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) ou Merck (São

Paulo, Brasil).

5.7 Análise Estatística

Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média

(EPM). Para a análise estatística foi utilizado a análise de variância de uma via

(ANOVA) seguida pelo teste t de Bonferroni. Um valor de P menor que 0.05 foi

considerado estatisticamente significativo.

RESULTADOS

6. Resultados

6.1 Efeito do LPS na Indução de NOS em Diferentes Órgãos do

Rato.

Na primeira série de experimentos, nosso objetivo foi fazer uma

avaliação da resposta de indução da NOS em vários órgãos para escolha

daqueles que melhor respondiam aos efeitos da administração de LPS, em

termos quantitativos de atividade da NOS. A Figura 1 ilustra o aumento

percentual na quantidade das enzimas cálcio-dependente e independente

encontradas nos diferentes órgãos de animais tratados com LPS (5 mg/Kg),

comparadas às enzimas encontradas em animais controle, isto é, injetados

apenas com PBS. A Tabela 1 apresenta os mesmos resultados, expressos

porém, sob a forma de atividade de NOS em pmol de citrulina/min/mg de

proteína. Como pode ser observado na Figura 1, Painel A, em relação à

enzima cálcio-independente, os órgãos que mostraram maior aumento na

atividade foram o pulmão, o baço e o rim (2138%, 1400% e 576% acima dos

controles, respectivamente).

Em relação à enzima cálcio-dependente, observa-se que alguns órgãos

mostraram mudança nos níveis desta NOS. Em ordem decrescente, a

musculatura esquelética, o pulmão, o baço e o cérebro tiveram elevações no

teor desta isoforma (Figura 1, Painel B).

Portanto com base nestes ensaios preliminares, decidimos escolher

avaliar o perfil enzimático frente aos diversos tratamentos que se seguirão nos

seguintes órgãos: pulmão, baço, rim e músculo esquelético.

Dois pontos precisam ser ressaltados para se ter a exata compreensão

do significado dos nossos resultados. Primeiro, o ensaio da citrulina (que ainda

69

é o método mais utilizado para medir-se atividade de NOS), como todo ensaio

enzimático, oferece à enzima as melhores condições de trabalho no que se

refere à substratos, cofatores, etc. Portanto, é impossível neste tipo de ensaio

detectar-se alterações na atividade da enzima (se por isso entendemos

alterações nos parâmetros cinéticos, Vmax e Km), já que à ela estão sendo

oferecidas condições de funcionamento ideal. Assim, é muito mais provável

que as variações que detectamos reflitam quantidade de moléculas protéicas

enzimáticas e não alterações em parâmetros cinéticos. Isto só poderia ser

detectado se purificássemos cada isoforma de cada órgão para a realização de

ensaios cinéticos adequados. O segundo ponto refere-se à dependência ou

não de cálcio para a atividade enzimática. Embora seja classicamente descrito

na literatura que as isoformas induzida e constitutiva sejam cálcio-

independente e cálcio-dependente, respectivamente, muitos outros trabalhos

mostram que há exceções a esta regra. Como estava fora do escopo deste

trabalho, não detalhamos experimentos para verificar se, por exemplo, o

aumento da NOS cálcio-dependente encontrado no pulmão após injeção de

LPS (veja Figura 1, Painel B) seria realmente um aumento desta isoforma ou

se isto significaria o aparecimento de uma atividade “induzida e cálcio-

dependente”. Entretanto, é óbvio que este tipo de estudo é muito importante, já

que um aumento de três vezes em qualquer atividade enzimática não é um

número trivial em termos biológicos.

70

71

NOS CALCIO-INDEPENDENTE

2500

.c?-°

NOS CALCIO-DEPENDENTE

300-

(0 250- Oo 2 0 0 -

§ 150-

g i o o 450H

0

/ • / /

Figura 1: Aumento na NOS cálcio-dependente e cálcio-

independente após a administração de LPS em vários órgãos do rato.

Ratos foram injetados i.p. com PBS. (grupo controle) ou com LPS (5 mg/Kg).

Após oito horas do tratamento com LPS foram sacrificados. Vários órgãos

foram coletados, congelados à -70°C, para posterior dosagem da atividade das

NOS pelo método da citrulina (como descrito na seção de Métodos). O

resultado está expresso como % de aumento da quantidade das enzimas após

a administração de LPS, em relação aos animais controle. Painel A: NO

sintases cálcio-independentes e Painel B: NO sintases cálcio-independentes. A

linha pontilhada representa a atividade constitutiva da NOS cálcio-dependente.

Tabela 1: Aumento na NOS cálcio-independente e cálcio-dependente após a

administração de LPS em vários órgãos do rato.

72

ATIVIDADE DA NOS CÁLCIO-INDEPENDENTE (pmol de citrulina/min/mg de proteína)

Órgão Controle LPS % Aumento NOS

Aorta 1,1 ±0,8 0,6 ± 0,42 0

Músculo Esquelético 1,6 ±0,5 0,7 ±0,18 0

Cérebro 2,46 ± 1,8 2,22 ±1,7 0

Coração 0,7 ± 0,24 1,2 ±0,35 171

Rim 0,17 ±0,05 0,98 ±0,19 576

Baço 0.15±0,17 2,1 ±0,2 1400

Pulmão 0,36 ±0,15 7,7 ±1,25 2138

ATIVIDADE DA NOS CÁLCIO-DEPENDENTE

Órgão Controle LPS % Aumento NOS

Aorta 1,7 ±0,63 0,83 ± 0,54 0

Músculo Esquelético 3,5 ±0,16 7,3 ±0,7 208

Cérebro 48,5 ±5,21 55,69 ±5,18 114

Coração 0,12±0,1 0,11 ±0,1 0

Rim 0,27 ± 0.09 0,24 ± 0,08 0

Baço 0,38 ±0,17 0,5 ±0,15 131

Pulmão 0,09 ± 0,06 0,13 ±0,07 150

Ratos foram injetados i.p. com PBS (grupo controle) ou com LPS (5 mg/Kg). Após oito

horas do tratamento com LPS foram sacrificados. 0 resultado da atividade enzimática das NOS realizada em diversos órgãos está expresso em pmol de cit/min/mg de

proteína e em % de aumento da quantidade das enzimas após a administração deLPS, em relação aos animais controle.

6.2 Perfil Enzimático de NOS no Pulmão de Ratos Submetidos a

Diversos Tratamentos

Podemos verificar que o tratamento de ratos com LPS causou, após

um período de 8 horas, um aumento significativo na enzima cálcio-

independente no pulmão, em torno de 21 vezes em relação à atividade

encontrada em animais do grupo controle (Figura 2, Painel A). Este aumento foi

substancialmente reduzido (praticamente à valores de animais injetados

apenas com salina) quando da utilização de um pré-tratamento com

dexametasona administrada 12 horas e 1 hora antes da administração de LPS

(5 mg/Kg). Notavelmente, o efeito inibitório da dexametasona sobre a indução

da INOS foi completamente abolido nos animais que foram tratados com SNAP

(3 mg/Kg), 2 horas antes das duas doses de dexametasona.

Em relação aos níveis da enzima cálcio-dependente, nenhuma

diferença significativamente relevante foi observada entre todos os grupos.

73

74

1 0 . 0 -(0

<1> S "a 0)I 2s “ ■S <Dd> ■° ■D O) re p ■a < > .£5 £

7.5-

5.0-

2.5-

0 . 0 '

NOS CALCIO-INDEPENDENTE

PBS LPS

A/OS CALCIO-DEPENDENTE0.75-

<0■o ■$

0 )^

i l

o

0.50-

0.25-

0 . 00 '

PBS LPS

DEXA SNAP+DEXA+LPS

Figura 2: Perfil enzimático das NOS no pulmão de ratos submetidos a

diversos tratamentos. Painel A; NOS cálcio-independente e Painel B: NOS

cálcio-dependente. Ratos foram submetidos aos diversos tratamentos (como

mostrado na seção de Métodos) e 8 horas depois da injeção de LPS o pulmão

direito e o esquerdo foram coletados e congelados à -70°C para posterior

dosagem da atividade das NOS pelo método da citrulina (como descrito na

seção de Métodos). Cada barra representa a média ± EPM de 3-6

determinações e expressa a atividade total de cada isoforma. Para a análise

estatística foi utilizada a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo

teste ide Bonferroni. * p < 0.05 em relação aos animais controle (primeira barra

ã esquerda). Atentar para as escalas diferentes para a atividade das duas

isoformas.

6.3 Perfil Enzimático de NOS no Baço de Ratos Submetidos a

Diversos Tratamentos

O perfil enzimático das duas isoformas da NOS também foi avaliado no

baço de animais submetidos aos diversos tratamentos (Figura 3). Em relação à

NOS cálcio-independente observa-se que em animais tratados com LPS, os

níveis desta isoforma aumentaram em aproximadamente 14 vezes (Figura 3,

Painel A). Diferentemente do observado no pulmão, a administração prévia de

dexametasona aos animais tratados com LPS causou um redução discreta nos

níveis desta isoforma (cerca de 38%). Esta redução entretanto foi revertida pela

utilização de SNAP previamente ao corticóide, como descrito no protocolo

experimental.

Em relação à enzima cálcio-dependente (Figura 3, Painel B) podemos

observar claramente o efeito de indução desta isoforma nos animais que

receberam dexametasona, quando comparados ao grupo controle. Um achado

interessante é o fato de que, como esperado, o tratamento com LPS não

alterou os valores desta isoforma, mas a administração do corticóide elevou

estes níveis de forma considerável. Outro detalhe importante observado nesta

Figura é o fato da enzima dependente de cálcio ter tido seus níveis elevados

para níveis equivalentes aos da enzima independente de cálcio de animais

tratados com LPS (comparar com a barra LPS somente no Painel A).

75

76

ENZIMA CALCIO-INDEPENDENTE

ENZIMA CALCIO-DEPENDENTE

(0a> S y, TJ 5 4 '

S « 3. <D -O■g Pp

U

0'

PBS LPS

DEXA SNAP+DEXA+LPS

Figura 3: Perfil enzimático das NOS no baço de ratos submetidos

a diversos tratamentos. Painel A: NOS cálcio-independente e Painel B: NOS

cálcio-dependente. Ratos foram submetidos aos diversos tratamentos (como

mostrado na seção de Métodos) e 8 horas depois da injeção de LPS o baço foi

coletado e congelado à -70°C para posterior dosagem da atividade das NOS

pelo método da citrulina (como descrito na seção de Métodos). Cada barra

representa a média ± EPM de 3-6 determinações e expressa a atividade total

de cada isoforma. Para a análise estatística foi utilizada a análise de variância

de uma via (ANOVA) seguida pelo teste t de Bonferroni. * p < 0.05 em relação

aos animais controle (primeira barra à esquerda) e # p < 0.05 em relação aos

animais tratados com dexametasona + LPS (quarta barra ã esquerda). Atentar

para as escalas de atividade das duas isoformas.

6.4 Perfil Enzimático de NOS no Rim de Ratos Submetidos a

Diversos Tratamentos

No rim, o padrão de resposta aos tratamentos utilizados não foi o

mesmo observado nos órgãos anteriormente descritos. Observa-se um nível

basal da isoforma induzida que, diferente dos demais, é proporcionalmente

grande em relação aos níveis pós-LPS (Figura 4, painel A). Após aV .

administração de endotoxina observa-se uma elevação nos níveis da isoforma

cálcio-independente (em torno de 3x). Curiosamente, o pré-tratamento com a

dexametasona não reduziu o aumento causado pelo LPS. Além disso, os

animais pré-tratados com SNAP (antes da dexametasona e do LPS)

mantiveram valores aumentados (em torno de três vezes) nos níveis desta

isoforma.

Em relação aos níveis d a . enzima cálcio-dependente, nenhuma

diferença significativamente relevante foi observada entre todos os grupos.

77

78

1 . 2 5 '

■D ' 5 1 .0 0 -

1 -S S" 0-75-

I 0.50-

^ 1 0.25J

0 .00 -

ENZIMA CALCIO-INDEPENDENTE

PBS LPS

ENZIMA CÁLCIO-DEPENDENTE0.4'

"(O<ü .EI % 0-3-

j 0 . 1 -

O.O'

PBS LPS

DEXA SNAP+DEXA+LPS

Figura 4: Perfil enzimático das NOS no rim de ratos submetidos a

diversos tratamentos. Painel A: NOS cálcio-independente e Painel B: NOS

cálcio-dependente. Ratos foram submetidos aos diversos tratamentos (como

mostrado na seção de Métodos) e 8 horas depois da injeção de LPS, o rim

(direito e esquerdo, foram coletados e congelados à -70°C para posterior

dosagem da atividade das NOS pelo método da citrulina (como descrito na

seção de Métodos). Cada barra representa a média ± EPM de 3-6

determinações e expressa a atividade total de cada isoforma. Para a análise

estatística foi utilizada a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo

teste ide Bonferroni. * p < 0.05 em relação aos animais controle (primeira barra

ã esquerda). Atentar para as escalas de atividade das duas isoformas.

6.5 Perfil Enzimático de NOS na Musculatura Esquelética de Ratos

Submetidos a Diversos Tratamentos.

A dosagem dos níveis das duas isoformas da NOS feitas na musculatura

esquelética mostrou um resultado interessante: ao contrário do observado nos

outros órgãos, o padrão de resposta no que se refere à sensibilidade ao

corticóide, à resposta à injeção de endotoxina e à resposta ao pré-tratamento

com o doador de NO foi encontrado na isoforma dependente de cálcio. Como

pode ser observado na Figura 5, Painel B, o tratamento com LPS elevou seus

níveis para cerca do dobro do controle, enquanto que a dexametasona inibiu

cerca de 90% do aumento causado pelo LPS. O pré-tratamento com o doador

de NO reverteu a inibição para praticamente os mesmos níveis vistos com o

tratamento com LPS. Portanto, viu-se na musculatura esquelética um perfil da

isoforma cálcio-dependente que é muito similar ao da isoforma cálcio-

independente nos outros órgãos. Finalmente, nenhum efeito significativamente

relevante foi observado para a isoforma cálcio-independente (Figura 5, painel

A).

79

80

ENZIMA CALCIO-INDEPENDENTE

ENZIMA CALCIO-DEPENDENTE

DEXA SNAP+DEXA+LPS

Figura 5: Perfil enzimático das NOS na musculatura esquelética de

ratos submetidos a diversos tratamentos. Painel A: NOS cálcio-

independente e Painel B: NOS cálcio-dependente. Ratos foram submetidos aos

diversos tratamentos (como mostrado na seção de Métodos) e 8 horas depois

da injeção de LPS o músculo rectus femoris e músculos adjacentes, como

gracilis e gluteos superficialis, foram coletados e congelados à -70°C,

considerados como uma única amostra, para posterior dosagem da atividade

das NOS pelo método da citrulina (como descrito na seção de Métodos). Cada

barra representa a média ± EPM de n determinações e expressa a atividade

total de cada isoforma. Para a análise estatística foi utilizada a análise de

variáncia de uma via (ANOVA) seguida pelo teste ide Bonferroni. * p < 0.05 em

relação aos animais controle (primeira barra à esquerda). Atentar para as

escalas de atividade das duas isoformas.

6.6 Efeito dos Diversos Tratamentos no Peso do Baço

Sendo o baço um rico tecido linfóide e tendo-se em conta o bem

documentado efeito dos glicocorticóides na indução de apoptose em linfócitos,

resolveu-se avaliar se o NO estaria interferindo com outra ação dos corticóides

que não a indução da NO sintase. Os resultados destes experimentos estão

mostrados na Figura 6. No grupo controle verifica-se que os baços

representam cerca de 0,33% do peso corporal dos animais. Nos animais

tratados somente com dexametasona, houve uma redução no tamanho do

baço em torno de 60%, confirmando nossa hipótese de que este órgão é

sensível ao aumento da concentração plasmática de corticóides. A injeção de

LPS causou um aumento de aproximadamente 1,5 vezes no peso do baço em

relação aos animais controle. A injeção prévia de dexametasona diminuiu o

efeito do LPS em torno de 40%. Os baços dos animais que foram pré-tratados

com o doador de NO e depois com dexametasona e LPS praticamente

dobraram de tamanho (0,26% para 0,49%), indicando que o efeito inibitório da

dexametasona deixou de existir. Assim, podemos observar em nosso

experimentos uma relativa diminuição do tamanho do baço em animais

tratados com dexametasona e elevação do peso deste órgão quando os

animais foram tratados com LPS e com o doador de NO.

81

82

SVQ.

Otf)0)Q.

0 . 6 -

0 .5 -

& 2- 0.3-s 8

0 .2 -

0 . 1-

0 . 0 -

PBS LPS * #

DEXA SNAP+DEXA+LPS

Figura 6; Variações no peso do baço em ratos submetidos a diversos

tratamentos. Painel A: animais injetados com salina e Painel B: animais

injetados com LPS (5 mg/kg). Ratos foram submetidos aos diversos

tratamentos (como mostrado na seção de Métodos) e 8 horas depois da

injeção de LPS os animais foram pesados, sacrificados, o baço foi retirado e

pesado em balança analítica. Os resultados estão expressos como % do peso

do baço em relação ao peso corporal de cada animal. Cada barra representa a

média ± EPM de 3-6 determinações. Para a análise estatística foi utilizada a

análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste t de Bonferroni.

*p < 0.05 em relação aos animais tratados somente com dexametasona

(segunda barra à esquerda) e # p < 0.05 em relação aos animais tratados com

dexametasona + LPS (quarta barra à esquerda). Atentar para as escalas de

atividade das duas isoformas.

6.7 Dosagem de NOx no Soro de Animais Submetidos a Diversos

T ratamentos

O nível de NOx sérico é pouco Indicador de quais órgãos ou tecidos

estão produzindo NO. Ainda assim, como neste trabalho estamos interessados

na produção global de NO (já que muitos tecidos não analisados aqui também

contribuem para os níveis séricos de NOx), analisamos este parâmetro frente

aos diversos tratamentos (Figura 7). A quantidade de NOx no soro de animais

tratados com LPS aumentou 52 vezes, confirmando uma grande produção de

NO. A utilização prévia de dexametasona nos animais tratados com LPS levou

os níveis de NOx praticamente à zero. O SNAP, administrado antes do

corticóide, causou um retorno nos níveis de NOx equivalente aos dos animais

com LPS somente.

83

84

DEXA+LPS SNAP+DEXA+LPS

Figura 7: Níveis de NOx no soro de ratos submetidos a diversos

tratamentos. Ratos foram submetidos aos diversos tratamentos (como

mostrado na seção de iVlétodos) e 8 horas após a injeção de LPS, retirou-se 1

ml de sangue, deixou-se coagular e retirou-se o soro que foi congelado à -

70°C para posterior dosagem. Cada barra representa a média ± EPM de 3-6

determinações e está expressa em pM, calculado a partir de uma curva-padrão

de nitrato. Para a análise estatística foi utilizada a análise de variância de uma

via (ANOVA) seguida pelo teste t de Bonferroni. * p < 0.05 em relação aos

animais controle (primeira barra à esquerda).

DISCUSSÃO

7. Discussão

Hoje não resta nenhuma dúvida que o NO é um dos principais

participantes no quadro da sepse/choque séptico (Fleming eía/.,1990; Parrat et

a/.,1998; Beishuizen eía/.,1999), tanto em animais de experimentação quanto

em humanos (Tsuneyoshi et a i, 1996). É importante ressaltar que a maior

parte do NO importante no quadro séptico é originário da enzima cálcio-

independente (Stoclet et aí., 1999). Em modelos experimentais de

administração de LPS em animais ocorre a indução da expressão desta enzima

em muitos tecidos e órgãos (Knowles et a i, 1990; Salter et a i, 1991; Cunha et

a/.,1994). Este processo inicia-se 2 horas após a administração da endotoxina,

atingindo o pico máximo de atividade enzimática entre 6 e 12 horas (Knowles et

a!., 1990; Salter et a/.,1991; Cunha et a i, 1994). A indução desta enzima

também ocorre em vários outros modelos que simulam, em maior ou menor

grau, o quadro de choque séptico humano, onde também é observado um

processo de indução da enzima NOS cálcio-independente (Spack et a/.,1997).

A indução desta enzima, contudo não é exclusividade do choque séptico, mas

ocorre em uma grande variedade de outras condições da fisiologia animal e

humana, notadamente na resposta inflamatória (Nussier & Billiar, 1993). No

nosso trabalho optamos que a obtenção do material para análise fosse feita na

oitava hora após a injeção de LPS. Esta escolha deveu-se aos fatos de que a

atividade da INOS ser máxima ao redor deste tempo e também por uma

questão de conveniência, por causa dos vários tratamentos que precederam a

injeção de LPS. Dos órgãos do rato analisados no nosso trabalho, os que

melhor responderam em termos de indução da NOS após a injeção de LPS

foram o pulmão, o baço, o rim e a musculatura esquelética. O exame atento

85

dos níveis de NOS medidos em cada um deste órgãos nos permite verificar

que há uma variação muito grande entre os níveis da enzima nos diferentes

órgãos. IVlais ainda, outros órgãos, como por exemplo a aorta, simplesmente

não mostraram quantidades mensuráveis de NOS após injeção de LPS. Cunha

et al. (1994) demonstraram que a indução diferencial de iNOS em diversos

tecidos do camundongo deve-se ao efeito diferencial de TNF-a e IL-ip. Assim

é que a indução de iNOS em determinados órgãos parece ser estritamente

dependente destas citocinas, enquanto que em outros a remoção das 'mesmas

nada acarretou, indicando que outras citocinas devem ser mais importantes.

Além disso, Rees et al. (1995) tratando camundongos com a bactéria C.

parvum demonstraram que a indução da expressão de NOS ocorre inicialmente

em macrófagos e no fígado, seguida pela indução da expressão no baço, no

coração e na aorta ao longo de vários dias (30 no total) sugerindo que a

liberação sequenciada de citocinas causou a indução escalonada

temporalmente de INOS. Desta forma, é possível que os diferentes níveis de

NOS encontrados nos vários órgãos de rato após o tratamento com LPS

devam-se à uma expressão diferencial qualitativa e temporal. Outras

possibilidades também devem ser levadas em conta, tais como diferentes

níveis de receptores de LPS, abundância relativa e vida-média do mRNA da

NOS, diferentes mecanismos de transdução de sinal e de transdução gênica,

etc. que poderiam explicar estas diferenças.

Um achado bastante curioso dentro dos nossos resultados foi a indução

de uma enzima cálcio-dependente na musculatura esquelética dos ratos

tratados com LPS. Baseado na literatura, que só descreve um tipo de NOS na

musculatura esquelética, a assim chamada pNOS, considerada como uma

86

variante da nNOS específica em músculo esquelético, cremos que a atividade

detectada no nosso ensaio possa ser atribuída à esta enzima. A função

fisiológica desta enzima ainda não está bem esclarecida, porém alguns relatos

apontam efeitos do NO gerado por esta enzima no acoplamento excitação-

contração do músculo, na auto-regulação do fluxo sangüíneo, na diferenciação

de miócitos, na respiração ,e na regulação da homeostasia da glicose. A

localização e atividade da pNOS parece ser regulada por interações proteína-

proteína e por modificações co- ou pós-translacionais (para revisão ver Stamier

& Meissner, 2001). Não há relato na literatura mostrando o efeito de LPS sobre

os níveis desta enzima, mas, no caso dela realmente ter a sua expressão

aumentada pelo LPS, isto poderia explicar a caquexia observada durante o

choque séptico, decorrente da excessiva produção de NO pela |jN0S que

acabaria por interferir em todos os processos fisiológicos da musculatura

esquelética. De qualquer modo, este resultado mostra que o papel das

chamadas NOS cálcio-dependentes deve ser reavaliado no quadro de choque

séptico, por estudos analisando a expressão de mRNA destas enzimas.

Outro achado muito curioso do nosso trabalho foi o fato de que a

dexametasona também interfere por si nos níveis de NOS cálcio-dependentes.

Assim, ao analisarmos o baço dos animais tratados somente com

dexametasona, observamos que os níveis de NOS cálcio-dependente foram

maiores quando comparados aos níveis dos animais controle. O aumento na

expressão de NOS cálcio-dependente já havia sido descrita no tecido vascular

por Nishida et al. (1992) em resposta ao estresse de cisalhamento e por

Weiner et al. (1994) em resposta ao tratamento com estrogênio. Ainda não se

87

sabe o mecanismo pelo qual o corticóide exerce este efeito talvez, por aumento

da transcrição protéica, nem qual a relevância disso para a fisiologia normal.

A resposta inflamatória é um complexo processo fisiológico essencial à

manutenção da homeostasia e consequentemente para a sobrevivência de um

organismo. É bem sabido que em situações de estresse ou em resposta a

estímulos inflamatórios, o organismo aumenta os níveis de glicocorticóides

endógenos na tentativa de reajustar a homeostasia. Também é bem conhecido

o fato de que a injeção prévia de glicocorticóides inibe vários aspectos da

resposta inflamatória (onde o quadro de sepse se insere). Assim, a inibição da

indução da expressão de NOS causada por glicocorticóides, demonstrada

inicialmente por Rees et aí. (1990) e Wright et aí. (1992) foi confirmada em

nossos resultados, já que a administração prévia de dexametasona causou

forte inibição da indução de enzimas cálcio-independentes (no pulmão e no

baço) e cálcio-dependente (na musculatura esquelética) dos animais tratados

com LPS. Mais ainda, este efeito inibitório da dexametasona sobre a indução

da NOS deve ser muito mais amplo do que nós pudemos ver, já que os níveis

séricos de NOx (que espelham o total de atividade de NOS em um organismo)

também diminuem bastante em resposta ao tratamento prévio com o corticóide.

A dexametasona entretanto falhou em inibir a indução da NOS causada

pelo LPS no rim. Embora não tenhamos uma explicação clara para esta

observação, isto poderia estar relacionado á, por exemplo, uma menor

população de receptores de corticóides encontrados neste órgão. Sabendo da

importância dos hormônios e receptores mineralocorticóides na manutenção de

vários aspectos da fisiologia renal e da imensa quantidade da enzima 11-p-

hidroxiesteróide desidrogenase presente no rim, que confere á este órgão

88

nítida predileção pela ligação com mineralocorticóides, pode ser que os

glicocorticóides tenham efeitos menores no rim. Alternativamente, a ausência

do efeito da dexametasona em inibir a indução da NOS causada pelo LPS no

rim poderia ser atribuída a um aspecto hemodinâmico/farmacocinético. Como o

rim entra em falência durante um choque séptico (Sandin, 1993), pode ser que

simplesmente não haja entrada suficiente de dexametasona para ligar-se aos

seus receptores em quantidade adequada para inibir a indução da NOS. Outra

possibilidade seria que, como acima descrito, o sistema de indução da NOS no

rim fosse diferente dos demais órgãos, por depender de citocinas ou de

mecanismos de transdução distintos dos demais.

A questão central que aparece entretanto é a seguinte: se os

glicocorticóides são tão potentes em inibir a indução da iNOS e se o NO é tão

importante na fisiopatologia do choque, porque a administração de corticóides

depois da instalação da sepse falha totalmente em mudar o curso deste

quadro clínico? (Thompson, 1993; Bone,1991; Cohen & Glauser, 1991). Porque

a utilização de drogas tão eficazes como anti-inflamatórios, após a instalação

do choque séptico, não cessa a seqüência de reações que, em 50 a 70% dos

casos, acaba por matar o paciente?

O principal achado deste estudo sugere uma resposta, pelo menos

parcial, ã esta pergunta: o próprio NO produzido em excesso durante o choque

séptico interfere nos efeitos dos glicocorticóides.

Os experimentos mostrando que a administração de SNAP, um doador

de NO, efetuada antes do corticóide (simulando a excessiva produção de NO

durante o choque séptico) reverteu totalmente o efeito anti-inflamatório da

dexametasona indica, claramente, que este mecanismo deva ser operativo

89

para explicar a falha dos GC no choque séptico. Este artifício (injeção de

SNAP) possibilitou a avaliação da ação do NO sobre os efeitos do

glicocorticóide analisada sob 3 aspectos: inibição da indução de NOS,

apoptose de células linfóides do baço e níveis séricos de NOx. Em todas as

três formas de avaliação, o doador de NO mostrou-se eficaz em impedir o

efeito do glicocorticóide, ou seja, os níveis de NOS mantiveram-se elevados no

pulmão, baço e musculatura esquelética, a diminuição do tamanho do baço

(indicando apoptose de células linfóides) causado pelo glicocorticóide não

ocorreu e os níveis séricos de NOx nos animais pré-tratados com SNAP foram

os mesmos encontrados em animais injetados somente com LPS.

Um dos possíveis mecanismos pelo qual o NO interfere no efeito do

glicocorticóide foi sugerido por Galigniana et al. (1999) em estudos realizados

in vitro, demonstrando que o binding do receptor de glicocorticóide está

diminuído de forma tempo- e concentração-dependente na presença de

doadores de NO. Os autores sugerem que a razão para a perda da capacidade

do ligante de interagir com o receptor seria a nitrosilação, pelo NO, de resíduos

de cisteína críticos ao funcionamento do GR. Esta sugestão é baseada no fato

de que a incubação simultânea de doadores de NO e DTT (agente protetor de

sulfidrilas) abole o efeito do NO sobre o binding do ligante com o GR. Esta

informação é sustentada ainda pelas seguintes evidências: i) pela capacidade

que a molécula de NO tem de reagir com vários alvos intracelulares,

principalmente sulfidrilas de cisteínas (Fang, 1997); ii) que desta interação

resulta a formação de S-nitrosotióis; e que iii) em algumas circunstâncias,

através da formação de pontes dissulfeto entre duas sulfidrilas vicinais de S-

nitrosotióis (Arnelle & Stamier, 1995), pode ocorrer a mudança conformacional

90

ou a adoção de uma conformação inativa de proteínas, que resulta no

comprometimento de suas funções fisiológicas.

No entanto, como estes estudos foram realizados somente in vitro com

receptores purificados de fibroblastos de camundongos, afirmar que este seja

realmente o mecanismo pelo qual o glicocorticóide deixa de exercer suas

funções anti-inflamatórias in vivo, seria uma extrapolação perigosa sem a

demonstração cabal da ocorrência deste mecanismo durante um choque

séptico.

Nossos resultados demonstram claramente que o NO inibe a ação do

glicocorticóide in vivo. Apesar das respostas dos órgãos terem sido diferentes

entre si, o que novamente confirma a expressão diferencial qualitativa e

temporal das NOS, não resta dúvida que o SNAP causa uma nítida reversão do

efeito do glicocorticóide (inibição da indução de NOS).

Comparado aos outros tecidos estudados, o pulmão parece ser um

órgão extremamente sensível ao efeito inibitório na indução de NOS

independente de cálcio efetuado pela dexametasona. Além disso, o mecanismo

envolvido neste processo parece ser também extremamente sensível à

presença de NO, já que a administração prévia de SNAP reverteu

completamente o efeito do glicocorticóide. Estas evidências sugerem que o

receptor esteróide envolvido no processo deva ser mais sensível ao efeito de

S-nitrosilação, quando comparado aos outros órgãos, e que cisteínas críticas

ao funcionamento do receptor possam estar S-nitrosiladas. No entanto, para

confirmarmos a veracidade destas possibilidades que coincidem com as

sugestões apresentadas no estudo feito in vitro, haverá necessidade de

91

experimentos realizados in vivo abordando o estado do receptor, em termos de

densidade e afinidade pelo ligante, em nossas condições experimentais.

Uma outra situação que talvez seja análoga à nossa seria a observação,

por outros autores, de que há uma resistência a glicocorticóides em pacientes

asmáticos (Barnes, 1998). Com base nos nossos resultados e no fato de que

vários trabalhos da literatura mostram a presença de NOS cálcio-independente

em pacientes asmáticos, é tentador sugerir que o NO possa estar inativando os

receptores de glicocorticóides, contribuindo para o agravamento do quadro

asmático. Este mecanismo talvez seja mais importante do que outros sugeridos

para explicar esta resistência, tais como níveis aumentados de cortisol

circulante, interação do receptor com fatores de transcrição e diminuição no

binding do receptor de glicocorticóide por diminuição da densidade de

receptores ou afinidade pelo ligante (Barnes, 1998).

Um dos principais mecanismos pelo qual o organismo mantém a

homeostasia em situações onde o sistema imune é ativado parece ser o

antagonismo entre NF-kB e os glicocorticóides. Sinais que ativam o NF-kB

como infecções bacterianas e virais e estresse oxidativo, são interpretadas pelo

organismo como estímulos estressantes. Estes estímulos ativam o eixo HPA,

aumentando os niveis de glicocorticóide circulantes. Sabendo-se que o NF-kB

também é ativado por intermediários reativos de oxigênio e, uma vez que estes

são liberados e produzidos durante uma resposta inflamatória, a via de

ativação do NF-kB é fisiologicamente relevante em situações de estresse. A

ativação de NF-kB por ROS pode ser inibida por agentes redutores ou

seqüestradores de ROS, incluindo ditiocarbamatos e N-acetil-L-cisteína

(Schreck, et a/., 1992). Isto sugere que o estado redox da célula pode ser um

92

mecanismo geral de up-regulation da transcrição de genes responsivos ao NF-

kB. Um complicador deste tipo de análise é o fato de que o NF-kB ativa a

transcrição de genes pró- e anti-inflamatórios. Como os corticóides inibem o

funcionamento correto do NF-kB por diversos mecanismos (vide item 3.3.2 da

Introdução), a imunossupressão causada pelos glicocorticóides serve de limite

para o dano celular que pode ser iniciado por ativação excessiva do NF-kB e

da resposta imune. Na vigência de uma inibição do GR, o sistema do NF-kB

poderia funcionar sem restrição, que é o que parece acontecer quando

injetamos SNAP previamente ao GC ou o que deve estar ocorrendo in vivo na

sepse decorrente da produção excessiva do NO.

Portanto, sabendo-se que grandes quantidades de NO são liberados

durante a sepse em animais (Rees, 1995a; nossos próprios resultados) e em

humanos (Spack et a/.,1997) e com base nos resultados de Galigniana et al.,

(1999) in vitro e nos resultados do presente trabalho in vivo, sugerimos que os

glicocorticóides falham em exercer suas ações anti-inflamatórias no choque

séptico devido à elevada produção de NO. Este NO produzido in vivo poderia

causar uma diminuição no número e afinidade de receptores pelo ligante,

possivelmente por S-nitrosilação de sulfidrilas críticas. Esta hipótese nos

permite considerar a possibilidade de resgate da funcionalidade do GR por anti-

oxidantes que, ao modificar o estado de nitrosilação de sulfidrilas críticas

poderia normalizar a função do receptor e, como a mais importante

consequência, resgatar as ações dos glicocorticóides endógenos e exógenos.

Neste ponto, é interessante perguntar se valeria a pena resgatar o

receptor de glicocorticóide da inibição efetuada pelo NO. Do ponto de vista

cardiovascular a resposta é afirmativa, porque este resgate significaria a

93

inibição da indução da NOS cálcio-independente (principalmente no músculo

liso vascular) e a consequente diminuição da hipotensão generalizada, da

hiporeatividade vascular, etc. No entanto, no que se refere às funções

imunossupressoras este resgate poderia representar um enorme problema na

recuperação de pacientes sépticos, já que o efeito inibitório da expressão de

iNOS em células de defesa poderia “desarmar” estas células para a destruição

do agente infeccioso. É fácil antever as consequências deste evento para o

curso do choque séptico. Da mesma forma, o resgate do receptor de

glicocorticóide poderia causar uma imunosupressão generalizada (que é um

efeito típico destes compostos) prejudicando toda a capacidade de defesa do

organismo frente à um agente invasor. Assim, fazemos novamente a pergunta;

seria vantajoso para o organismo resgatar os efeitos dos glicocorticóides no

choque séptico? Achamos que a resposta ainda pode ser sim, desde que

saibamos mais detalhadamente as consequências da inativação do receptores

pelo NO sobre todas as ações do corticóides, e não somente na sua ação

sobre a indução da iNOS. Neste sentido, é possível que efeitos deletérios

induzidos pelo resgate do receptor em alguns sítios possam ser compensados

por efeitos benéficos em outras células, tecidos ou sistemas. É importante

lembrar que no choque séptico, o organismo aumenta muito os níveis de

corticóides plasmáticos, talvez significando que as ações decorrentes disso

seriam benéficas para o hospedeiro, não fosse a interferência do NO com os

receptores destes compostos. Enfim, as respostas para estas perguntas

somente virão com a realização de mais pesquisas neste fascinante assunto.

94

CONCLUSÕES

8. Conclusões

Os resultados aqui apresentados demonstram que:

a administração de LPS em ratos induz a maior expressão de NOS cálcio-

independente no pulmão, no baço e no rim e aumento dos níveis séricos de

NOx;

a administração de LPS em ratos leva à expressão de NOS cálcio-

dependente na musculatura esquelética;

a injeção prévia de dexametasona inibe o aumento dos níveis de NOS

induzidos pelo LPS no pulmão, no baço e na musculatura esquelética, mas não

no rim além de diminuir os níveis séricos de NOx e causar redução no tamanho

do baço;

o pré-tratamento com SNAP de animais injetados com dexametasona +

LPS reverte o efeito de inibição da indução de NOS causado pelo corticóide em

todos os órgãos estudados, iguala os níveis de NOx aos valores encontrados

em animais tratados somente com LPS e inibe o efeito de apoptose de células

linfóides no baço;

Estes achados sugerem que:

o NO bloqueia in vivo o efeito de inibição da indução de NOS da

dexametasona provavelmente através da inativação do receptor de

glicocorticóide;

se esta inibição do efeito do glicocorticóide causada pelo NO for devida à

nitrosilação de sulfidrilas in vivo, em princípio ela poderia ser revertida pela

utilização de anti-oxidantes que resgatariam o receptor deficiente de volta às

suas funções normais.

95

REFERENCIASBIBLIOGRÁFICAS

9. Referências Bibliográficas

Abe, K.; Pan, L.; Watanabe, M.; Konno, H.; Kato, T.; Itoyama, Y. Upregulation of protein-tyrosine nitration in the anterior horn cells of amyotrophic lateral sclerosis. Neurol. Res. 19; 124-128, 1997.

Antal-Szalmas, P.; Van Strijp, J. A. G.; Weersink, A. A. J. L.; Verhoef, J.; Van Kessel, K. P. M. Quantification of surface G DI4 on human monocytes and neutrophils. J. Leuk. Biol., 61:721-728, 1997.

Armor. J. N. J. Chem. Eng. Data 19, 82, 1974.Arnelle, D.; Stamier, J.S. NO-, NO. and N0+ donation by S-nitrosothiols: Implications

for regulation of physiological functions by S-nitrosothiols and acceleration of disulfide formation. Arch. Biochem. Biophys, 318: 279-275, 1995.

Arriza, J. L.; Weinberger, C.; Cerelli, G.; Glaser, T. M.; Handelin, B. L.; Husman, D.E.; Evans, R. M. Cloning of human mineralocorticoid receptor complementary DNA: structural and functional relationship with the glucocorticoid receptor. Science, 237: 268-275, 1987.

Arnet, U.A.; McMillan, A.; Dinerman, J.L.; Ballerman, B.; Lowenstein, C.J. Regulation of endothelial nitric oxide synthase during hypoxia. J. Biol. Chem., 271: 15069- 15073, 1996.

Assreuy, J.; Cunha, F. Q.; Epperlein, M.; Noronha-Dutra, A.; O’Donnell, C. A.; Liew,F. Y.; Moncada, S. Production of nitric oxide and superoxide by activated macrophages and killing of Leishmania major. Eur. J. Immunol., 24: 672-676,1994.

Avontuur, J. A.;Tutein, N. R. P.; Van Bodegon, J. W.; Bruining, H. A. Prolonged inhibition of nitric oxide synthesis in severe septic shock: a clinical study. Grit. Care Med., 26: 660-667,1998.

Baldwin, A. S. The NF-kB e IkB protein: new discoveries and insights, Annu. Rev.Immunol. 14: 649-81, 1996.

Bandaletova, T.; Bronet, I.; Bartsch, H.; Sugimurat, T.; Esumi, H.; Ohshima, H. Immunohitochemical localization of an inducible form of nitric oxide synthase in various organs of rats treated with Propionibacterium acnes lipopolysaccharide. APMIS, 101: 330-336, 1993.

Barnes, P.J. Anti-inflammatory actions of glucocorticoids: molecular mechanisms.Clin. Sci., 94: 557-572, 1998.

Bates, D. Predicting bacteremia in patients with sepsis syndrome. J. Infect. Dis., 176: 1538-1551, 1997.

Beato, M. Induction of transcription by steroid hormones. Biochem. Biophys. Acta, 910: 95-102, 1987.

Beishuizen, A; Vermes, I.; Haanen, C. Endogenous mediators in sepsis and septic shock. Adv. Clin. Chem., 33: 55-131,1999.

Bolotina, V. M.; Najibe, S.; Palacino, J. J.; Pagano, J. P.; Cohen, R. A. Nitric oxide directly activates calcium-dependent potassium channels in vascular smooth muscle. Nature, 368: 850-853, 1994.

Bone, C. B. Gram-negative sepsis. Background, clinical features, and intervention.Chest, 100: 802-808, 1991.

Bone, C. B. Gram-positive organisms in sepsis. Arch. Intern. Med. 154: 26-34, 1994. Bone, R. C.; Grodzin C. L.; Balk, R. A. Sepsis: a new hypothesis for pathogenesis of

the disease process. Chest, 112: 235-243, 1997.Brandtzaeg, P. Significance and pathogenesis of septic shock. In\ Rietschel, E. T.;

Wagner, H. Pathophysiology of Septic Shock. Current Topics In Microbiology

96

and Immunology, 216, Berlin: Springer Verlag, 16-37, 1996a.Brandtzaeg, P.; Osnes, L.; Ovstebo, R.; Joo, G.B., Westwik, A.B.; Kierulf, P. Net

inflannmatory capacity of human septic shock plasma evaluated by a monocyte based target cell assay. J. Exp. Med., 184: 51-60, 1996b.

Bredt, D. S.; Snyder, S. H. Isolation of nitric oxide synthetase, a calmodulin-requiring enzyme. Proc. Natl. Acad. Science, USA. 87: 682-685, 1990.

Bredt, D. S.; Snyder, S. H. Nitric oxide: a physiologic messenger molecule. Ann.Rev. Biochem. 63: 175-195, 1994.

Brenman, J. E.; Chao, D. S.; Gee, S. H.; Mcgee, A. W.; Craven, S. E.; Santillano, D. R.; Wu, Z. Q.; Huang, F.; Xia, H. H.; Peters, M. F.; Froehner, S. C.; Bredt, D.S. Interaction of nitric oxide synthase with the postsynaptic density protein PSD-95 and alpha 1-synthophyn mediated by PDZ domains. Cell, 84: 757-767, 1996.

Brenman, J. E.; Chao, D. S.; Xia, H. H.; Aldape, K.; Bredt, D. S. Nitric oxide synthase complexed with dystrophin and absent from skeletal muscle sarcolemma in Duchenne muscular dystrophy. Cell, 82: 743-752, 1995.

Broillet, M.C. S-Nitrosylation of proteins. Cell. Mol. Life Sci., 55: 1036-1042, 1999. Busconi, L.; Michel, T. Endothelial nitric oxide synthase - N-terminal myristoylation

determines subcellular localization. J. Biol. Chem., 268: 8410-8413, 1993.Busse, R.; Fleming, I.; Schini, V. B. Nitric oxide formation in the vascular wall:

regulation and functional implications. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 196:7-18, 1995.

Buther, A. R.; Rhodes, P. Chemistry, analysis and biological roles of S-nitrosothiols.Anal. Biochem., 249: 1-9, 1997.

Buther, A. R.; Filtney F. W.; Williams, D. L. H. NO, nitrosonium ions, nitroxide ions, nitrosothiols and iron-nitrosyls in biology: a chemistry perspective. Science, 16: 18- 22, 1995.

Caldenhoven, E.; Liden, J.; Wissink, S.; Van de Stoipe, A.; Raaijmakers, J.; Koederman, L.; Okret, S.; Gustafsson, J. A.; Van der Saag, P. T. Negative cross­talk between RelA and the glucorticoid receptor: a possible mechanins for antiinflamatory action of glucocorticoids. Mol. Endocrinol., 9: 401-412, 1995.

Campbell D.; Stamler J. S.; Strauss H.; Redox modulation of L-type calcium channels in ferret ventricular myocytes - dual mechanism regulation by nitric oxide and S-nitrosothiols. J. Gen. Physiol., 108: 277-293, 1996.

Ceppi, E. D.; Smith, F. S.; Titheradge, M. A. Nitric oxide, sepsis and liver metabolism.Biochem. Soc. Trans., 25: 929-934, 1997.

Chang, T. J.; Scher, B. M.; Waxman, S.; Scher, W. Inhibition of mouse GATA-1 function by the glucocorticoid receptor: possible mechanins of the steroid inhibitoin of erythroleukemia cell differentiation. Mol. Endocrinol., 7: 528-542, 1993.

Chartrain, N. A.; Geller, D. A.; Koty, P. P.; Sitrin, N. F.; Nussler, A. K.; Hoffman, E. P.; Billiar, T. R.; Hutchinson, N. I.; Mudgett, J. S. Molecular cloning, structure, and chromosomal localization of the human inducible nitric oxide synthase gene. J. Biol. Chem., 269: 6765-6772, 1994.

Chernow B.; Dinarello, C. A. Introduction: surviving septic shock. Chest, 112: 320S, 1997.

Cherry,P. D.; Furchgott, R. F.;Zawadzki, J. V.; Jothianandan, D. The role of endothelial cells in the relaxation of isolated arteries by bradykinin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 2106-2110, 1983.

Cho, H. J.; Xie, 0 . W.; Calaycay, J.; Mumford, R. A.; Swiderek, K. M.; Lee, T. D.; Nathan, C. F. Calmodulin is a subunit of nitric oxide synthase from macrophages. J. Exp. Med., 176: 599-604, 1992.

97

Clarkson, R. B.; Norby, S. W.; Boyer, S.; Vahdi, N.; Smirnov, Nims, A. R. W. Wink, D. A. Biochim. Biophys. Acta, 496; 1243, 1995.

Cobett, J. A.; Sweetland, M. A.; Wang, J. L.; Lancaster, J.; MacDaniel, M. L.; Nitric oxide mediates cytokine-induced inhibition of insulin secretion by human islets of Langerhans. Proc. NatL Acad. Sci. USA., 90: 1731-1735, 1993.

Cobett, J. A.; Wang, J. L.; Hughes, J. H.; Wolf, B. A.; Sweetland, M. A.; Lancaster, J.; MacDaniel, M. L.; Nitric oxide and cGMP formation induced by interleukin 1b in islets of Langerhans: evidence for an effector role of nitric oxide in islet dysfunction. Biochem. J., 278: 229-235, 1992.

Cohen, J.; Glauser, M. P. Septic shock: treatment. Lancet, 338: 736-793, 1991.Cooke, J. P.; Dzau, V. J. Nitric oxide synthase: role in the genesis of vascular

disease. Annu. Rev. Med,, 48: 489-509, 1997.Cotton, F. A.; Wilkinson, G. "Advanced Inorganic Chemistry," p. 331. Wiley, New

York, 1989.Crane, B. R.; Arvai, A. S.; Gachhui, R.; Wu, C.; Ghosh, D. K.; Getzoff, E. D.; Stuehr,

D. J.; Tainer, J. A. The structure of nitric oxide synthase oxygenase domain and inhibitor complexes. Science, 278: 425-431, 1997.

Cunha, F.Q.; Weiser, W. Y.; David, J. R.; Moss, D. W.; Moncada, S.; Liew, F. Y. Recombinant migration inhibitory factor induces nitric oxide synthase in murine macrophages. J, Immunol., 50:1908-1912, 1993

Cunha, F. Q.; Assreuy, J; Moss, D. W.; Rees, D. D.; Leal, L. M. C.; Moncada, S; Carrier, M; O’Donnel, C. A.; Liew, F. Y. Differential induction of nitric oxide synthase in various organs of the mouse during endotoxaemia: role of TNF-Alpha and IL-1-i3. Immunology, 81: 211-215, 1994.

DalIoz, F.; Maupoil, V.; Lecour, S.; Briot, F.; Rochette, L. In Vitro studies of interactions of NO donor drugs with superoxide and hydroxyl radicals. Mol. Cell. Bioch., 177: 193-200, 1997.

Davies, M. G.; Hagen, P. Systemic inflammatory response syndrome, Br. J. Surg., 84: 920-935, 1997.

Dawson, V. L.; Dawson,T. M.; Uhl, G. R.; Snyder, S. H. Human immunodeficiency virus type 1 coat protein neurotoxicity mediated by nitric oxide in primary cortical cultures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3256-3259, 1993.

Dean, J. A. "Lange's Handbook of Chemistry." p. 10-7. McGraw-Hill. New York. 1985.

De Beider, A. J.;Radomski, M. W.; Why, H. J.; Richardson, P. J.; Bucknall, C. A.; Salas, E.;Martin, J. F.; Moncada, S. Nitric oxide synthase activities in human myocardium. Lancet, 341:84-85, 1993

De Bosscher, K.; Berghe, W. V.; Haegeman, G. Mechanism anti-inflamatory action and immunosuppression by glucocorticoids: negative interference of the activated glucocorticoid receptor with transcriptions factors. J. Neuroimmunol., 109: 16-22, 2000.

Derkx, B.; Marchant, A.; Goldman, M.; Bijimer, R.; Van Deventer, S. High levels of interleukin-10 during the initial phase of fulminant meningococcal septic shock. J. Infect. Dis., 171: 229-232, 1995.

Dicks, A. P., Williams, D. L. Generation of nitric oxide from S-nitrosothiols using protein-bound Cu2+ sources. Chem. Biol., 3:655-9, 1996.

Dinerman, J. L.; Dawson, T. M.; SchQil, M. J.; Snowman, A.; Snyder, S. H. Endothelial nitric oxide synthase localized to hippocampal pyramidal cells: implications for synaptic plasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 4214- 4218,1994.

98

Drapier, J. C.; Hibbs, J. B. Differentiation of murine macrrophages to express nonespecific for tumor cells results in L-arginine-dependent inhibition of mitochondrial iron-sulfur enzymes in the macrofage effector cell. J. Immunol., 140: 2829-2838, 1988.

Fang, F. C. Mechanisms of nitric oxide-related antimicrobial activity. J. Clin. Invest., 99: 2818-2825, 1997.

Feldman, P. I.; Griffth, O. W.; Stuehr, D. J. The surprising life of nitric oxide. Chem. & Eng., 20:26-38, 1996.

Field, L.; Dilts, R. V.; Ravichandran, R.; Lenhert, P. G.; Carnahan, G. E. An unusually stable thionitrite from N-acetyl-D,L-penicillamine; X-ray crystal and molecular structure of 2-(acetylamino)-2-carboxy-1,1-dimethylethyl thionitrite. J. Chem. Soc. Comm., 249-250, 1978.

Fink, G. Mechanims of negative and positive feedback of steroids in the hypothalamic-pituitary system. In\ Bittar, E. E., Bittar, N. (Eds.), Priciples of Medical Biology. JAI Press, pp. 29-100, 1997.

Fleming, I.; Gray, G. A.; Julou-Schaeffer, G.; Parrat, J. R.; Stoclet, J. 0. Incubation with endotoxin activates the L-arginine pathway in vascular tissue. Biochem. Biophys. Res. Commun., 171: 562-568, 1990.

Fbrstermann, U.; Kleinert, H. Nitric oxide synthase: expression and expressional control of the three isoforms. Naunyn Schimied. Arch. Pharmacol., 352: 351- 364, 1995.

Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-dependent relaxation. Circulation, 87: V3-V8, 1993.

Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. J. Amer. Med. Assoc., 276: 1186- 1188, 1996.

Furchgott, R. F; Vanhoute, P.M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. FASEB J., 3: 2007(1989).

Furchgott, R. F.; Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature, 288: 373-376, 1980.

Galanos, 0.; Freudenberg, M. A. Mechanism of endotoxin shock and endotoxin hypersensitivity. Immunobiology, 187: 346-356, 1993.

Galigniana, M. D.; Piwien-Pilipuk, G.; Assreuy, J. Inhibition of glucocorticoid receptor binding by nitric oxide. Mol. Pharmacol., 55: 317-3236, 1999.

Gaily, J. A.; Montague P. R.; Reecke, G. N.; Edelman, G. M. The NO hypothesis: possible effects of a short-lived, rapidly diffusible signal in the development and function of the nervous system Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA. 87: 3547, 1990.

Garcia-Cadena, G.; Oh, P.; Liu, J.; Schnitzer, J. S.; Sessa, W. 0. Targeting of nitric oxide synthase to endothelial cell caveolae via palmitoylation: implications for nitric oxide signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 6448-6453, 1996.

Gardiner, S. M.; Kemp, P. A.; March, J. E.; Bennett, T. Cardiac and regional haemodynamics, inducible nitric oxide synthase (NOS) activity, and the effects of NOS inhibitors in conscious, endotoxaemic rats. Br. J. Pharmacol., 116: 2005- 2016, 1995.

Garg, U. 0.; Hassid, A. Inhibition of rat mesangial cell mitogenesis by nitric oxide generating vasodilators. Am. J. Physiol., 257: F60-F66, 1989.

Garthwaite, J.; Boulton, C. L. Nitric oxide signaling in the central nervous system. Annu. Rev. Physiol., 57: 683-706, 1995.

Garthwaite, J.; Charles, S. L.; Chess-Williams, R. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as intracellular messenger

99

in the brain. Nature, 336; 385-388, 1988.Gaston, B. Nitric Oxide and thiol groups. Biochim. Biophys. Acta, 1411; 323-333,

1999.Gaston, B.; Reilly, J.; Drazen, J. M.; Fackler, J.; Ramdev, P.; Arnelle, D.; Mullins, M.

E.; Sugarbaker, D. J.; Chee, C.; Singel, D. J. Endogenous nitrogen oxides and bronchodilator S-nitrosothiols in human airways. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90; 10957-10961, 1993.

Geller, D. A.; Lowenstein, C. J.; Shapiro,R. A.; Nussler, A. K.; Di Silvio, M.; Wang, S.0.; Nakayama, D. K.; Simmons, R. L.; Snyder, S. H.; Billiar, T. R. Molecular cloning and expression of inducible nitric oxide synthase from human. Proc Natl Acad. Sci. U S A.,90;3491, 1993

Goodman, L. S.; Gilman, A. The pharmacological basis of therapeutics. 9.ed.;McGraW-Hill, pp- 1459-1470, 1996.

Gopaiakrishna, R.; Nagarajan, B. Separation and estimation of arginine-related metabolites in tissues. Anal. Biochem., 107;318-23, 1980.

Granger, D. L.; Hibbs, J. B.; Perfect, J. R.; Durack, D. T. Metabolic fate of L-arginine in relation to microbiostatic capability of murine macrophages. J. Clin. Invest., 85; 264-273, 1990.

Gray, G. A.; Schott, C; Julou-Schaeffer, G; Fleming, J; Parrat, J. R.; Stoclet, J-C. The effects of inhibitors of the L-arginine/nitric oxide pathway on endotoxin-induced loss of vascular responsiveness in anaesthetized rats. Br. J. Pharmacol., 103; 1218-1224, 1991.

Green, L. 0.; Luzuriaga, K. R.; Wagner, D. A.; Rand, W.; Istfan, N.; Young, V. R.; Tannenbaum, S. R. Nitrate biosynthesis in man. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78; 1764-7768, 1981®

Green, L. 0.; Tannenbaum, S. R.; Goldman, P. Nitrate synthesis in the germfree and conventional rat. Sci. Wash. Dc, 212; 56-58, 1981b.

Green, S. J.; Nancy, C. A.; Schreiber, R. D.; Granger, D. L.; Crawford, R. M.; Meltzer, M. S.; Fortier, A. R. Neutralization of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha blocks in vivo synthesis of nitrogen oxides from L-arginine and protection against Frasciella tularensis in Mycobacterium bovis (Beg) treated mice. J. Immunol., 149; 689-698, 1993.

Guyton, A. C.; Hall, J. E. Tratado de fisiologia médica. 9.ed. Rio de Janeiro;Guanabara Koogan, pp - 871-878, 1996.

Griffith, O. W.; Stuehr, D. J. Nitric Oxide Synthases; properties and catalytic mechanism. Annu. Ver. Physiol., 57; 707-736, 1995.

Hemmens, B.; Mayer,B. Enzymology of nitric oxide synthases. In Titheradge, M. A.Nitric oxide protocols. Humana Press; Totowa,100; 1-32, 1998.

Hendriks, W. Nitric oxide synthase contains a discs-large homologous region (DHR) sequence motif. Biochem. J., 305; 687-688, 1995.

Hibbs, J. B. Jr.; Taintor, R. R. Activated macrophage-mediated cytotoxicyty; Use of the in vitro cytotoxity assay, for study of bioenergetic and biochemical changes that developed in tumor target cell. Meth. Enzymol., 132; 508-520, 1986.

Hibbs, J. B. Jr.; Taintor, R. R.; Vavrin, Z. Macrophage cytotoxicity; role for L-arginine deiminase and imino nitrogen oxidation to nitrite. Science, 235; 473-476, 1987.

Hibbs, J. B. Jr.; Taintor, R. R.; Vavrin, Z.; Rachlin, E. M. Nitric Oxide; a cytotoxic activated macrophage effector molecule. Biochem. Biophys. Res. Commun., 157; 87-94, 1988.

Hibbs, J. B.; Taintor, R. R.; Vavrin, Z.; Granger, D. I.; Drapier, J. 0.; Amber, I. J.; Lancaster, J. R. Synthesis of nitric oxide from a terminal guanidino nitrogen atom

100

of L-arginine: a molecular mechanism regulating cellular proliferation that targets intracellular iron. In nitric oxide from L-arginine: a bioregulatory system, Ed. By Moncada, S. and Higgs, E. A., p p - 189-223, Elsevier, Amsterdam, 1990.

Hollemberg, S. M; Broussard, M; Osman, J.; Parillo, J. E. Increased microvascular reactivity and improved mortality in septic mice lacking inducible nitric oxide synthase. CIrc. Res., 86: 774-779, 2000.

Hollemberg, S. M; Weinberger, C.; Ong, E. S.; Cerelli, G.; Oro, A.; Lebo, R.; Thompson, E. B.; Rosenfeld, M. G.; Evans, R. M. Primary structure and expression of functional human glucocorticoid receptor cDNA. Nature, 318: 635- 641,1985.

Huang, Z. H.; Gao, H.; Xu, R. B. Study on glucocorticoids receptors during intestinal ischemia shock and septic shock. Cir. Shock, 23: 27-36, 1987.

Huang, P. L.; Huang, Z.; Mashimo, H.; Bloch, K. D.; Moskowitz, M. A.; Bevan, J. A.; Fishman, M. C. Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase. Nature, 377: 239-242, 1995.

Ignarro, L. J. Biosyntesis and metabolism of endothelium-derived nitric oxide. Annu. Rev. PharmacoL Toxicol., 30: 535-560, 1990

Ignarro, L. J. Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by porphyrins and metalloporphyrins. Adv. Pharmacol., 26: 35-65, 1994.

Ignarro, L. J.; Ballot, B.; Wood, K. S. Regulation of soluble guanylate cyclase activity by porphyrins and metalloporphyrins. J. Biol. Chem., 259: 6201-6207, 1984.

Ignarro, L. J.; Buga, G. M.; Wood, K. S.; Byrns, R. E.; Chaudhuri, G. Endothelium- derived relaxing factor produced and released form artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 9265-9269, 1987.

Ignarro, L. J.; Degnan, J. N.; Baricos, W. H.; Kadowitz, P. J.; Wolin, M. S. Activation of purified guanylate cyclase by nitric oxide requires heme, comparison of heme- deficient, heme-reconstituted and heme-containing forms of soluble enzyme from bovine lung. Biochem. Biophys. Acta, 718; 49-59, 1982.

Ignarro, L. J.; Kadowitz, P. J. The pharmacological and physiological role of cyclic GMP in vascular smooth muscle relaxation. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 25: 171-191, 1985.

Imai, E.; Miner, J. N.; Mitchell, J. A.; Yamamoto, K. R.; Granner, D. K. Glucocorticoid receptor-cAMP response element-binding protein interaction and the response of the phosphoenolpyruvate carboxykinase gene to glucocorticoids. J. Biol. Chem., 268:5353-5356,1993.

James, S. L.; Galven, J. Macrophage citotoxicity against schistosoluma of Schistosoma mansoni involves arginine-dependent production of reactive nitrogen

■ intermediates. J. Immunol., 143: 4208-4212, 1989.Jonat, C.; Rahmsdorf, H. J.; Park, K. K.; Cato, A. C.; Gebel, S., Ponta, H.; Herrlich, P.

Antitumor promotion and anti-inflammation: down-modulation of AP-1 (Fos/Jun) activity by glucocorticoid hormone. Cell, 62: 1189-1204, 1990.

Kamijo, R.; Harada, H.; Matsuyama, T. Requirement for transcription factor IRF-1 in NO synthase induction in macrophages. Science, 263: 1612-1615, 1994.

Keller, R. S.; Jones, J. J.; Kim, K. F.; Myers, P. R.; Adams, H. R.; Parker, J. I.; Rubin, L. J. Endotoxin-Induced myocardial dysfuncion: is there a role for nitric oxide? Shock, 4: 338-344, 1995.

Kengatharan, M.; De Kimpe, S. J.;Thiemermann, C. Analysis of the signal transduction in the induction of nitric oxide synthase by lipotheichoic acid in macrophages, Br. J. Pharmacol., 117: 1163-1170, 1996.

Kilbourn, R. G.; Jubran, A.; Gross, S. S.; Griffith, O. W.; Levi, R.; Adams, J.; Lodato,

101

R. F. Reversal of endotoxin-mediated sfiock by N°-methyl-L-arginine, an inhibitor of nitric oxide synthesis. Biochim. Biophys. Res. Commun., 172: 1132-1138, 1990

Kilbourn, R. Nitric oxide and shock, Dis. Mon. 43: 281-348, 1997.Klabunde, R. E.; Coston, A. F. Nitric oxide synthase inhibition does not prevent

cardiac depression in endotoxic shock. Shock, 3: 73-78, 1995.Klatt, P.; Schmidt, K.; Uray, G.; Mayer, B. Multiple catalytic functions of brain nitric

oxide synthase. Biochemical characterization, cofactor requirement and role of N°- hydroxy-L-arginine as an intermediate. J. Biol. Chem., 268: 14781-14787, 1993.

Koppenol, W. H.; Moreno, J. J.; Pryor, W. A.;lschiropoulos, H.; Beckman, J. S. Peroxynitrite a cloaked oxidant formed by nitric oxide and superoxide. Chem. Res. Toxicol. 5: 834-842, 1992.

Knowles, R. G.; Salter, M.; Brooks, S. L.; Moncada, S. Anti-inflammatory glucocorticoids inhibit the induction by endotoxin of nitric oxide synthase in the lung, liver and aorta of the rat. Bioch. Bioph. Res. Commun., 172: 1042-1048, 1990.

Knowles, R. G.; Merrett, M.; Salter, M.; Moncada, S. Differential induction of brain, lung and liver nitric oxide synthase by endotoxin in the rat. Biochem. J., 270: 833- 836, 1990.

Knowles, R. G.; Moncada, S. Nitric oxide is a signal in blood vessels. Trends Biochem. Sci., 17: 399-402, 1992.

Knowles, R. G.; Moncada, S. Nitric oxide synthases in mamals. Bichem. J., 298: 249-258, 1994.

Kroncke, K. D.; Fehsel, K.; Kolb-Bachofen, V. Inducible nitric oxide synthase in human diseases. Clin. Exp. Immunol., 113: 147-156, 1998.

Kroncke, K. D.; Fehsel, K.; Kolb-Bachofen, V. Inducible nitric oxide synthase and its product nitric oxide, a small molecule with complex biological activities. Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 376: 327-343, 1995.

Krozowski, Z. S.; Funder, J. W. Renal mineralocorticoid receptor from glucocorticoids independently of the 11 (3-hydroxiesteroid desidrogenase. Endocrinology, 135: 834-840, 1994.

Kowaluk, E. A.; Fung, H. L. Spontaneous liberation of nitric oxide cannot account for in vitro vascular relaxation by S-nitrosothiols. J, Pharmacol. Exp. Ther., 255:1256-64, 1990.

Kwon, N. S.; Nathan, C. F.; Gilker, C.; Griffith, O. W.; Matthews, D. E.; Stuehr, D. J. L-citrulline production from L-arginine by macrophage nitric oxide synthase. J. Biol. Chem., 265: 13442-13445, 1990.

Li, F.; Xu, R. B. Changes in canine leukocyte glucocorticoid receptors during endotoxin shock. Circ. Shock, 26: 99-105, 1988.

Li, Z.; Chapleau, M. W.; Bates, J. N.; Bielefeldt, K.; Lee, H. C.; Abboud, F. M. Nitric oxide as an autocrine regulator of sodium currents in baroreceptor neurons. Neuron, 20: 1039-1049, 1998.

Liu, J. W.; Garcia-Cadena, G.; Sessa, W. 0. Biosynthesis and palmitoylation of endothelial nitric oxide synthase: mutagenesis of palmitoylation sites, cysteines-15 and/or -26, argues against depalmitoylation-induced translocation of the enzyme. Biochemistry, 34: 12333-12340, 1995.

Liu, S. F.; Ye, X.; Malik, A. B. In vivo inhibition of nuclear factor-kB activation prevents inducible nitric oxide synthase expression and systemic hypotension in a rat model of septic shock. J. Immunol., 159: 3976-3983, 1997.

Lloyd-Jones, D. M.; Boch, K. D. The vascular biology of nitric oxide and its role in

102

atherogenesis. Annu. Rev. Med., 47: 365-375, 1996.Lyons, C. R. The role of nitric oxide in inflannmation. Adv. ImmunoL, 60: 323-371,

1995.Mackey, L. I.; Cidalowski, J. A. Molecular control of imnnune/inflannmatory responses:

interactions between Nuclear factor-kB and steroid receptor-signaling pathways. Endoc. Rev., 20: 435-459, 1999.

Marchant, A.; Deviere, J.; Byl, B.; De Groote, D.; Vincente, J. L.; Goldnnan, M.Interleukin-10 production during septicaemia. Lancet., 343: 707-708, 1994.

Marietta, M. A. Nitric oxide synthase structure and mechanism. J. BioL Chem., 268: 12231, 1993.

Marietta, M. A.; Yoon, P. S.; Yengar, R.; Leaf, C. D.; Wishnok, J. S. Macrophage oxidation of L-arginine to nitrite and nitrate: nitric oxide is an intermediate. Biochemistry, 27: 8706-8711, 1988.

Malhotra, R.; Bird, M. I. L-selectin: a novel receptor for lipopolyssacharide and its potencial role in bacterial sepsis. Bioassays, 19: 919-923, 1997.

Marsden, P. A.; Heng, H. H.; Scherer, S. W.; Stewart, R. J.; Hall, A. V.; Shi, X. M.; Tsui, L. C.; Schappert, K. T. Structure and chromosomal localization of the human constitutive endothelial nitric oxide synthase gene. J. Biol. Chem., 268: 17478- 17488, 1993.

Marsden, P. A.; Heng, H. H.; Duff, C. L.; Shi, X. M.; Tsui, L. C.; Hall, A. V. Localization of the human gene for inducible nitric oxide synthase (NOS 2) to chromosome 17011.2-012. Genomics, 19: 183-185, 1994.

Marshall, H. E.; Merchant, K.; Stamler, J. S. Nitrosation and oxidation in the regulation of gene expression. FASEB J., 14: 1889-1900, 2000.

Masters, B. S. S.; McMillan, K.; Sheta, E. A.; Nishimura, J. S.; Roman, L. J.; Martasek, P. Cytochromes P 450: 3. Neuronal nitric oxide synthase, a modular enzyme formed by convergent evolution: structure studies of a cysteine thiolate- liganded heme protein that hydroxylates L-arginine to produce NO center dot as a cellular signal, FASEB J., 10: 552-558, 1996.

Mayer, B.; Hemmens, B. Biosynthesis and action of nitric oxide in mammalian cells.Trends Biochem. Sci., 477-481, 1997.

Mayer, B.; John, M.; Heinzel, B.; Werner, E. R.; Wächter, H.; Schultz, G.; Bohme, E. Brain nitric oxide synthase is a biopterin- and flavin-containing multi-functional oxido-reductase. FEBS Lett., 288: 187-191, 1991.

McCall, T. B.; Boughton-Smith, N. K.; Palmer, R. M. J.; Whittle, B. J. R.; Moncada, S. Synthesis of nitric oxide from L-arginine by neutrophils, release and interaction with superoxide anion. Biochem. J., 261: 293-296, 1989.

Mercier, J. C.; Beaufils, F.; Hartmann, J. F. Hemodynamic patterns of meningococcal shock in children. Crit. Care Med., 16: 27-33, 1998.

Michel, T.; Feron, O. Nitric Oxide Synthases: Which, Where, How and Why? J. Clin.Invest., 100: 2146-2152, 1997.

Miller, W. L.; Blake Tyrrel, J. The adrenal cortex. In: Felig, P., Baxter, J. D., Frohman, L. A. (Eds.), Endocrinology and Metabolism. McGraw-Hill, New York, pp. 555- 711, 1995.

Molijn, G. J.; Koper, J. W.; Van Uffelen, C. J.; De Jong, H.; Brinkmann, A. O; Bruining, Lamberts, S. W. Temperature-induced down-induced of the glucocorticoid receptor in the peripheral blood mononuclear leucocyte in patients with sepsis or septic shock. Clin. Endocrinol., 43: 197-203, 1995.

Moncada, S.; Higgs, A.; Furchgott, R. XIV International Union of Pharmaclology Nomenclature in Nitric Oxide Research. Pharmacol. Rev., 49: 137-142, 1997.

103

Moncada, S.; Palmer, R. M.; Higgs, E. A. Biosynthesis of nitric oxide from L-arginine. Biochem. Pharmacol.,38: 1709-1715, 1989.

Moncada, S.; Palmer, R. M.; Higgs, E. A. Nitric Oxide: physiology, pathophysiology and phamcology. Pharmacol. Rev., 43: 109-142, 1991.

Morris, S. M. Jr.; Billiar, T. R. New insights into the regulation of inducible nitric oxide synthesis. Am. J. Physiol., 266: 829-839, 1994.

Mulder, M. F.; Van Lambalgen, A. A.; Huisman, E; Visser, J. J.; Van Den Bos, G. C.; Thijs, L. G. Protective role of NO in the regional hemodynamic changes during acute endotoxemia in rats. Am. J. Physiol., 266: 1558-1564, 1994.

Mulsch, A.; Schray-Utz, B.; Mordintvec, P. I.; Hauschildt, S.; Busse, R. Diethyldithiocarbamate inhibits induction of macrophage NO synthase, FEBS Lett., 321: 215-218, 1993.

Murad, F. Cyclic guanosine monophosphate as a mediator of vasodilation. J. Clin. Invest., 78, 1-5, 1986.

Nassif, X.; Mathison, J. C.; Wolfson, E.; Koziol, J. A.; Ulevitch, R. J., So, M. Tumor necrosis factor alpha antibody protects against lethal meningococcaemia. Mol. Microbiol., 6: 591-597, 1992.

Nathan, C., Xie, O. W. Regulation of biosynthesis of nitric oxide. J. Biol. Chem., 269: 13725-13728, 1994.

Nishida K; Harrison D. G.; Navas J. P.; Fisher, A. A.; Dockery, S. P.; Uematsu, M.; Nerem, R. M.; Alexander, R. W.; Murphy, T. J. Protein, nucleotide molecular cloning and characterization of the constitutive bovine aortic endothelial cell nitric oxide synthase. J Clin Invest.,90: 2092-2096 ,1992

Nussler, A. K.; Liu, Z. Z.; Disilvio, M.; Sweetland, M. A.; Geller, D. A.; Lancaster, J. R.; Billiar, T. R.; Freeswick, P. D.; Lowenstein, C. L.; Simmons, R. I. Hepatocyte inducible nitric oxide synthasis is influenced in vitro by cell density. Am. J. Physiol., 267: 394-401, 1994.

Nussler, A. K.; Billiar,T. R. Inflammation, immunoregulation, and inducible nitric oxide synthase. J. Leuk. Biol., 54: 171-178, 1993.

Ohisson K.; Bejork P.; Bengerfeldt, M.; Hageman, R.; Thompson R. C. Interleukin-1 receptor antagonist reduces mortality from endotoxin shock. Nature, 348: 550- 552, 1990.

Palmer, R. M. J.; Ashton, D. S.; Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine, Nature, 333: 664-666, 1988a.

Palmer, R. M. J.; Ferrige, A. G.; Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature, 327: 524-526, 1987.

Palmer, R. M. J.;Rees,D. D.; Ashton, D. S.; Moncada,S. L-arginine is the physiological precursor for the formation of nitric oxide in endothelium-dependent relaxation, Biochem. Biophys. Res. Commun., 153: 1251-1256, 1988b.

Parratt, J. R. Nitric oxide in sepsis and endotoxaemia. J. Antimic. Chemother., 41: 31-39, 1998.

Pollack, J. S.; Nakane, M.; Buttery, L. K.; Martinez, A.; Sphngall, D.; Polak, J, M.; Fortermann, U.; Murad, F. Characterization and localization of endothelial nitric oxide synthase using monoclonal antibodies. Am. J. Physiol., 265: 1379-1387, 1993.

Pugeaut, M.; Bonneton, A.; Perrot, D.; Rocle-Nicolas, B.; Lejeune, H.; Grenot, C.; Dechaud, H.; Brebant, C.; Motin, J.; Cuilleron, C. Y. Decrease immunoreactivity and binding activity of corticosteroid-binding immunoglobulin in serum in septic shock. Clin. Chem., 35: 1675-1679, 1989.

104

Rackow, E. C.; Astiz, M. E. Pathophysiology and treatment of septic shock. J. Am. Med. Assoc., 266: 548-554, 1991.

Radomski, M. W.; Palmer, R. M.; Moncada. S. Comparative pharmacology of the endothelium-derived relaxing factor, nitric oxide and prostacyclin in platelets. Br. J. Pharmacol., 92:181-187, 1987a

Radomski, M. W.; Palmer, R. M.; Moncada. S.The anti-agreegating properties of vascular endothelium: interactions between prostacyclin and nitric oxide. Br. J. Pharmacol., 92: 639-646, 1987b.

Radomski, M. W.; Palmer, R. M.; Moncada. S. The role of nitric oxide and cGMP in platelet adhesion to vascular endothelium. Biophys. Res. Commun., 148: 1482- 1489, 1987c.

Radomski, M. W.; Palmer, R. M.; Moncada. S. Endogenous nitric oxide inhibits human platelet adhesion to vascular endothelium. Lancet., 2: 1057-1058, 1987d.

Radomski, M. W.; Palmer, R. M.; Moncada. S. Glucocorticoids inhibit the expression of an inducible, but not the constitutive, nitric oxide synthase in vascular endothelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 10043-10047, 1990.

Rand, M. J.; Li, C. G. Nitric oxide as a neurotrasmitter in peripheral nerves: nature of transmitter and mechanism of transmission. Annu. Rev. Physiol., 57: 659-682,1995.

Rees, D. D. Role of nitric oxide in the vascular dysfunction of septic shock. Biochem. Soc. Trans., 23: 1025-1029, 1995.

Rees, D. D.; Cellek, S.; Palmer, R. M. J.; Moncada, S. Dexamethasone prevents the induction by endotoxin of a nitric oxide synthase and the associated effects on vascular tone: an insight into endotoxin shock. Biochem. Biophys. Res. Commun., 173:541-547, 1990.

Rees, D. D., Cunha, F. Q. , Assreuy, J., Herman, A. G.; Moncada, S. Sequencial induction of nitric oxide synthase by Corynebacterium parvum in different organs of the mouse. Br. J. Pharmacol., 114:689-693, 1995.

Rees, D. D.; Monkhouse, J. E.; Cambridge, D; Moncada, S. Nitric oxide and the haemodynamic profile of endotoxin shock in the conscious mouse. Br. J. Pharmacol., 124: 540-546, 1998.

Rees, D. D.; Palmer, R. M. J.; Moncada, S. Role of endothelium-derived nitric oxide in the regulation of blood pressure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3375-3378, 1989.

Richards, I. M.; Chin, J. E.; Leach, K. L. Glucocorticoids, In: Airways smooth muscle: neurotransmitters, amines, lipid mediators and signal transduction(Eds) Raeburn, D. and Giembycz, M. A., 1995.

Ruetten, H.; Thiemermann, C. Combination immunotherapy which neutralises the effects of TNF alpha and IL-1 beta attenuates the circulatory failure and multiple organ dysfunction caused by endotoxin in the rat. J. Physiol. Pharmacol., 48: 605-621,1997.

Salter, M; Knowles, R. G.; Moncada, S. Widespread tissue distribution, species distribution and changes in activity of Ca^‘"-independent nitric oxide synthases. FEBS Lett., 291: 145-149, 1991.

Sandin, R.; Kidney function in shock, Acta Anaesthesiol. Scand., 37: suppi 98, 14- 19, 1993.

Schulz, R.; Nava, E.; Moncada, S. Induction and potential biological relevance of a Ca^'^-independent nitric oxide synthase in the myocardium. Br. J. Pharmacol., 105: 575-580, 1992

Schwartz, S. E.; White, W. H. In "Trace Atmospheric Constituents: Properties,

105

Transformation and Fates" {S. E. Schwartz, ed.). p. 1. Wiley, New York, 1983. Sem, R.; Baltimore, D., Multiple nuclear factors interact with the imunoglobulin

enhacer sequences. Cell, 46; 705-716, 1986.Sessa, W. C. The nitric oxide synthase family of proteins. J. Vase. Res., 31; 131-

143, 1994.Sessa, W. C.; Barber, C. M.; Lynch, K. R. Mutation of N-myristoylation site converts

endothelial nitric oxide synthase from a membrane to a cytosolic protein. Circ. Res., 72: 921-924, 1993.

Sessa, W. C.; Pritchard, K.; Seyedi, N.; Wang, J.; Hintze, T. H. Chronic exercise in dogs increases coronary vascular nitric oxide production and endothelial nitric oxide synthase gene expression. Circ. Res., 74: 349-353, 1994.

Shah, V.; Wiest, R.; Garcia-Cardena, G.; Cadelina, G.; Groszmann, R. J.; Sessa, W. C. Hsp90 regulation of endothelial nitric oxide synthase contributes to vascular control in portal hypertension. Am. J. Physiol., 277; 463-468, 1999.

Shaul, P. W.; Smart, E. J.; Robinson, L. J.; German, Z.; Yuhanna, I. S.; Yimg, Y. S.; Anderson, R. G. W.; Michel, T. Acylation targets endothelial nitric oxide synthase to plasmalemmal caveolae. J. Biol. Chem., 271; 6518-6522, 1996.

Schreck, R.; Meier, B.; Mannel, D. N.; Droge, W.; Baeuerle, P. A. Dithiocarbamates as potent inhibitors of nuclear factor kappa B activation in intact cells. J. Exp. Med., 75:1181-1194, 1992.

Shesely, E. G.; Maeda, N.; Kim, H-S.; Desai, K. M.; Krege, J. H.; Laubach, V. E.; Sherman, P. A.; Sessa, W. C.; Smithies, O. Elevated blood pressures in mice lacking endothelial nitric oxide synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 13176- 13181, 1996.

Shmidt, H. H. H. W.; Klein, M. M.; Niroomand, F.; Bohme, E. Arginine is a physiological precursor of endothelium-derived nitric oxide, Eur. J. Pharmacol., 154; 213-216, 1988.

Schule, R.; Rangarajan, P.; Kliewer, S.; Ransone, L. J.; Bolado, J.; Yang, N.; Verma,I. M.; Evans, R. M. Functional antagonism between oncoprotein c-Jun and the glucocorticoid receptor. Cell, 62; 1217-1226, 1990.

Silvagno, F; Xia, H.; Bredt, D. S. Neuronal nitric-oxide synthase-mu, an alternatively spliced isoform expressed in differentiated skeletal muscle. J. Biol. Chem., 271; 11204-11208,1996.

Spack, L.; Havens, P. L.; Griffith, O. W. Mensurements of total plasma nitrite and nitrate in pediatric patients with the systemic inflammatory response syndrome. Crit. Care Med., 25:1071-1078, 1997.

Stamler, J. S. Redox signaling; nitrosylation and related target interactions with nitric oxide. Cell, 78: 931-936, 1994.

Stamler, J. S.; Meissner, G. Physiology of nitric oxide in skeletal muscle. Physiol.Rev. 81: 209-237, 2001.

Stamler, J. S.; Singel, D. J.; Loscalzo, J. Biochemistry of nitric oxide and its redox- activated forms. Science, 258; 1256-1264, 1992.

Stoclet, J-C; Muller, B.; Gyorgy, K.; Adriantsiothaina, R.; Kleschyov, A. L. The induceible nitric oxide synthase in vascular and cardiac tissue. Eur. J. Pharmacol., 375: 139-155, 1999.

Stuehr, D. J, Structure-function aspects in the nitric oxide synthases. Annu. Rev.Pharmacol. Toxicol., 37: 339-59, 1997

Stuehr, D. J.; Cho, H. J.; Weise, M. F.; Nathan, C. F. Purification and characterization of the cytokine-induced macrophage nitric oxide synthase; an FAD- and FMN- containing flavoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 7773-7777, 1991

106

Stuehr, D. J.; Kwon, N. S.; Gross, S. S.; Thiel, B. A.; Levi, R.; Nathan, C. F. Synthesis of nitrogen oxides from L-arginine by macrophage cytosol: requirement for inducible and constitutive components. Biochem. Biophys. Res. Commun., 161:420-426, 1989b.

Stuehr, D. J.; Kwon, N. S.; Nathan, C. F.; Griffith, O. W.; Feldman, P. L.; Wiseman, J. N-omega-hydroxy-L-arginine is an intermediate in the biosynthesis of nitric oxide from L-arginine. J. Biol. Chem., 266: 6259-6263, 1991.

Stuehr, D. J.; Marietta, M. A. Mammalian nitrate biosynthesis: mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 82: 7738-7742, 1985.

Suffradini, A. F.; Fromm, R. E.; Parker, M. M.;Breener, M.; Kovacs, J. A.; Wesley, R. A.; Parvilho, J. E. The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin. N. Engl. J. Med., 321:280-287, 1989.

Sweet, M. J.; Hume, D. A. Endotoxin signal transduction in macrophages. J.Leukocyte Biol., 60: 8-26, 1996.

Takahaschi, K.; Ando, K.; Ono, A.; Shimosawa, T.; Ogata, E.; Fujita, T. Tumor necrosis factor-alpha induces vascular hyporesponsiveness in sprague-dawley rats. Life Sci., 50: 1437-1444, 1992.

Thiemermann, C. Nitric oxideand septic shock, Gen. Pharmacol. 29: 159-166, 1997. Thijs, L. G.; Groeneveld, A. B. J.; Hack, 0. E. Multiple organ failure in septic shock.

Irr. Rietschel, E. T.; Wagner, H. Pathophysiology Of Septic Shock. Current Topics In Microbiology And Immunology, 216, 209-237. Berlin: Springer Verlag, 1996.

Thompson, J. Role of glucocorticosteroids in the treatment of infectious diseases.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect., 12: S68-S72, 1993.

Titheradge, M. A. Nitric oxide in septic shock, Biochim. Biophys. Acta, : 437-455, 1999.

Tracey, K. J.; Beutler, B.; Lowry, S. F. Shock and tissue injury induced by recombinant human cachectin. Science, 234: 470-474, 1986.

Tracey, K. J.; Fong, Y.; Hesse, D. G. Anti-cachetin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteremia. Nature, 330: 662-664, 187

Tracey, W. R.; Xue, C.; Klinghofer, V.; Barlow, J.; Pollock, J. S.; Förstermann, U.; Jonhs, R. A. Immunochemical detection of inducible NO synthase in human lung. Am. Physiol., 266: 722-727, 1994.

Trapp, T.; Holsber, F. Heterodimerization between mineralocorticoid and glucocorticoids receptors increase the functional diversity of corticosteroid action. TIPS, 17: April, 1996.

Tsuneyoshi, I.; Kanmura, Y.; Yoshimura, N. Nitric oxide as a mediator of reduced arterial responsiveness in septic patients. Crit. Care Med., 24: 1083-1086, 1996

Van der Poll, T.; SauenA/ein, H. P. Tumor necrosis factor-alpha: its role in the metabolic response to sepsis, Clin. Sci., 84: 247-256, 1993.

Vane, J.; Anggard, E. E.; Botting, R. M. Regulatory functions of the vascular endothelium, N. Engl. J. Med., 323: 27-36, 1990.

Verma, 1. M.; Stevenson, J. K.; Schwarz, E. M.; Van Antwerp, D.; Miyamoto, S. Rel/NF-kB/lkB family: intimate tales of association and diassociation. Genes Dev., 9: 2723-2735.

Volk, H.-D.; Reink, P.; Krausch, D.; Zuckermann, H.; Asadullah, K.; Müller, J. M.; Döcke, W.-D.; Kox, W. J., Monocyte deactivation-rationale for a new therapeutic strategy in sepsis. Intensive Care Med., 22: S474-S481, 1996.

Wakabayashi, G.; Gefand, J. A.; Burke, J. F.; Thomson, R. C.; Dinarello, C. A

107

specific receptor antagonist for Interleukin-1 prevents Escherichia co//-induced shock in rabbits. FASEB J., 5: 338-343.

Webster, J. C.; Cidlowski, J. A. Mechanims of glucocorticoid-receptor-mediated repression of gene expression, TEM, 10: 396-402, 1999.

Weiner, C. P.; Knowles, R. G.; Moncada, S. Induction of nitric oxide synthases early in pregnancy. Am. J. Obstet. Gynecol., 171:838-843, 1994.

Wehling, M. Novel aldosterone receptors: specificity-conferring mechanism at the level of the cell membrane. Steroids. 59:160-163, 1994.

Woronicz, J.; Gao, X.; Cao, Z.; Rothe, M. G. D. IkappaB kinase-beta: NF-kappaB activation and complex formation with IkappaB kinase-alpha and NIK, Science, 278:866-869,1997.

Wright, C. E.; Ress, D. D.; Moncada, S. Protective and phatological roles of nitric oxide in endotoxin shock. Cardiov. Res., 26: 48-57, 1992.

Wu, C. C.; Chen, S. J.; Szabô, C; Thiemermann, C; Vane, Jr. Aminoguanidine attenuates the delayed circulatory failure and improves sun/ival in rodent model of endotoxic shock. Br. J. Pharmacol., 114: 1666-1672, 1995

Wu, C. C.; Ruetten, H.; Thiemermann, C. Comparison of the effects of aminoguanidine and N-nitro-L-arginine methyl-ester on the multiple organ dysfunction caused by endotoxaemia in the rat. Eur. J. Pharmacol., 300: 99-104,1996.

Xie, Q. W.; Cho, H. J.; Calaycay, J.; Munford, R. A.; Swiderek, K. M.; Lee, T. D.; Ding, A.; Troso, T.; Nathan, C. Cloning and characterization of inducible nitric oxide synthase from mouse macrophages. Science, 256: 225-228, 1992.

Xie, Q. W.; Kashiwabaray, Y.; Nathan, C. Role of transcription factor NF-Kappa B/Rel in induction of nitric oxide synthase. J. Biol. Chem., 269: 4705-4708, 1994.

Xie, Q. W.; Whisnant, R.; Nathan, C. Promoter of the mouse gene encoding calcium- independent nitric oxide synthase confers inducibility by interferon gamma and bacterial lipopolysaccharide. J. Exp. Med., 177: 1779-1784, 1993.

Yamamoto, K. R. Steroid receptor regulated transcription of specifc genes and gene networks, Ann. Rev. Genet, 19: 209-252, 1985.

Yang Yen, H. F.; Chambard, J. C.; Sun, Y. L.; Smeal, T.; Schimidt, T. J.; Drouin, J.; Karin, M. Transcriptional inteference between c-Jun and the glucocorticoid receptor: mutual inhibition of DNA binding due direct protein-protein interaction. Cell, 62: 1205-1215, 1990.

Yun, H. Y.; Dawson, V. L.; Dawson, T. M. Nitric oxide in health and disease of the nervous system. Mol. Psychiatry, 2: 300-310, 1997.

Zhang, J.; Snyder, S. H. Nitric oxide in the nervous system. Annu Rev. Pharmacol. Toxicol., 35: 213-133, 1995.

108