DIVERSIDADE GENÉTICA, FRUTIFICAÇÃO, ATRIBUTOS DE …

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE

DIVERSIDADE GENÉTICA, FRUTIFICAÇÃO, ATRIBUTOS

DE QUALIDADE E COMPOSTOS BIOATIVOS EM

CAMBUIZEIROS DIFERENCIADOS PELA COLORAÇÃO DO

FRUTO

ANA LETÍCIA SIRQUEIRA NASCIMENTO

2019

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO


PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE


DIVERSIDADE GENÉTICA, FRUTIFICAÇÃO, ATRIBUTOS DE QUALIDADE E

COMPOSTOS BIOATIVOS EM CAMBUIZEIROS DIFERENCIADOS PELA

COLORAÇÃO DO FRUTO

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Sergipe, como parte das exigências

do Curso de Mestrado em Agricultura e

Biodiversidade, área de concentração em

Agricultura e Biodiversidade, para obtenção do

título de “Mestre em Ciências”.

Orientadora

Dra. Ana Veruska Cruz da Silva

SÃO CRISTÓVÃO

SERGIPE – BRASIL

2019

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL


Nascimento, Ana Letícia Sirqueira

N244d Diversidade genética, frutificação, atributos de qualidade e compostos bioativos

em cambuizeiros diferenciados pela coloração do fruto / Ana Letícia Sirqueira Nascimento ; orientadora Ana Veruska Cruz da Silva. – São Cristóvão, SE, 2019.

53 f. ; il.

Dissertação (mestrado em Agricultura e Biodiversidade) – Universidade Federal de Sergipe, 2019.

O

1. Agricultura. 2. Myrtaceae. 3. Fruticultura. 4. Cambuizeiro. 5. Enzimas. 6. Marcadores biológicos. I. Silva, Ana Veruska Cruz da, orient. II. Título

CDU: 631:582.776.2


DIVERSIDADE GENÉTICA, FRUTIFICAÇÃO, ATRIBUTOS DE QUALIDADE E

COMPOSTOS BIOATIVOS EM CAMBUIZEIROS DIFERENCIADOS PELA

COLORAÇÃO DO FRUTO

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Sergipe, como parte das exigências

do Curso de Mestrado em Agricultura e

Biodiversidade, área de concentração em

Agricultura e Biodiversidade, para obtenção do

título de “Mestre em Ciências”.

APROVADA em 22 de fevereiro de 2019.

Dr. Klebson Silva Santos

ITP/Unit

Prof. Dr. Evandro Neves Muniz

Embrapa Tabuleiros Costeiros/UFS

Profª. Drª. Ana Veruska Cruz da Silva

Embrapa Tabuleiros Costeiros/ PPGAGRI-UFS

(Orientadora)

SÃO CRISTÓVÃO

SERGIPE – BRASIL

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeço a Deus, Senhor misericordioso a quem clamei sempre que

me vi perdida, a quem pedi orientação em momentos de ansiedade. Nunca me senti

desamparada. Obrigada, o Senhor é o meu guia.

Aos meus pais José Antônio Barreto Nascimento e Joana D’arc Sirqueira Nascimento,

pela minha formação educacional e pessoal. Obrigada por sempre me ouvirem e ampararem em

momentos que considerei difíceis.

Ao meu esposo Moisés Almeida, por todo o seu amor, admiração, e pela presença

incansável com que me apoiou.

Ao meu irmão Ícaro Sami. Apesar das nossas implicâncias, sempre me incentivou a

alcançar meus objetivos.

A toda minha família por torcer e acreditar em mim.

À minha orientadora, Profª. Drª. Ana Veruska Cruz da Silva Muniz, por toda amizade,

paciência e dedicação com que sempre me orientou neste trabalho e em todos aqueles que

realizei durante o mestrado. Sem você, jamais teria conseguido. Agradeço a Deus por colocá-

la em meu caminho.

Aos Professores Drª. Ana da Silva Ledo e Dr. Evandro Neves Muniz por toda

contribuição profissional e convivência amiga.

Agradeço ao Dr. Klebson Silva Santos e a MsC. Andriele Mendonça pela ajuda e

ensinamentos, vocês foram fundamentais.

Aos colegas e professores do Mestrado em Agricultura e Biodiversidade da

Universidade Federal de Sergipe. Conheci muita gente legal, em especial Allana Melysse,

colega que sempre esteve presente.

À CAPES, pela concessão da bolsa durante o curso de mestrado.

À Embrapa Tabuleiros Costeiros por todo o suporte na realização das minhas pesquisas.

À Embrapa Agroindústria Tropical, em especial aos pesquisadores Edy Brito e Paulo

Riceli pela parceria.

Desejo igualmente agradecer aos amigos que fizeram e fazem parte do Laboratório de

Biologia Molecular. Vocês não mediram esforços para me ajudar, especialmente Silvio Gomes,

Adrielle Soares, Marília Vasconcelos, Tatiana Costa, Grasiela Santana, Isa Ribeiro, Alex

Souza, Jéssica Monalisa, Marina Ferreira, Priscila Santana e Camila Almeida. Ah, claro que

não vou esquecer! Milena Cardoso, você foi essencial, sempre me ajudou, ouviu e torceu por

mim!

Aos amigos do Laboratório de Cultura de Tecidos, pela parceria, em especial Inácio

Roque que sempre me ajudou com os estudos.

Aos funcionários da Reserva Particular do Patrimônio Natural (RPPN) do Caju,

especialmente Cleverson Matos por me acompanhar em todas as atividades.

A todos, meu muito obrigada!

SUMÁRIO

Página

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. i

LISTA DE TABELAS...............................................................................................................iii

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS ......................................................... iv

RESUMO.................................................................................................................................... v

ABSTRACT .............................................................................................................................. vi

1. INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................................... 1

2. REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................................... 2

2.1. A família Myrtaceae e o cambuizeiro .............................................................................. 2

2.2. Diversidade e conservação dos recursos genéticos .......................................................... 5

2.3. Atributos de qualidade dos frutos e compostos bioativos ................................................ 6

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 7

4. ARTIGO 1: DIVERSIDADE GENÉTICA DE CAMBUIZEIROS (Myrciaria floribunda

(West ex Willd.) O. Berg) DIFERENCIADOS PELA COLORAÇÃO DOS FRUTOS ......... 13

RESUMO .............................................................................................................................. 13

ABSTRACT .......................................................................................................................... 14

4.1. Introdução ...................................................................................................................... 15

4.2. Material e Métodos ........................................................................................................ 16

4.3. Resultados e Discussão .................................................................................................. 18

4.4. Conclusão ....................................................................................................................... 23

4.5. Literatura Citada ............................................................................................................ 23

5. ARTIGO 2: FRUTIFICAÇÃO E ATRIBUTOS DE QUALIDADE DE CAMBUIZEIROS

DIFERENCIADOS PELA COLORAÇÃO DOS FRUTOS .................................................... 26

RESUMO .............................................................................................................................. 26

ABSTRACT .......................................................................................................................... 27

5.1. Introdução ...................................................................................................................... 28


5.2.1. Localização da área e coleta do material ................................................................. 29

5.2.2. Frutificação.............................................................................................................. 29

5.2.3. Análises físicas e físico-químicas ........................................................................... 30


5.4. Conclusões ..................................................................................................................... 35

5.5. Referências ..................................................................................................................... 36

6. ARTIGO 3: PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DE Myrciaria

floribunda (West ex Willd.) O. Berg UTILIZANDO ÁGUA COMO SOLVENTE EXTRATOR

E SUA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE................................................................................. 39

RESUMO .............................................................................................................................. 39

ABSTRACT .......................................................................................................................... 40

6.1. Introdução ...................................................................................................................... 41


6.2.1. Material vegetal ....................................................................................................... 42

6.2.2. Reagentes e padrões ................................................................................................ 42

6.2.3. Extração convencional sob pressão atmosférica (maceração) ................................ 42

6.2.4. Extração por líquido pressurizado ........................................................................... 42

6.2.5. Determinação de compostos fenólicos totais .......................................................... 43

6.2.6. Determinação de flavonoides totais ........................................................................ 43

6.2.7. Análise por UPLC-QTOF-MSE ............................................................................... 43

6.2.8. Determinação da atividade antioxidante pelo método DPPH ................................. 43

6.2.9. Análise dos dados .................................................................................................... 44


6.4. Conclusão ....................................................................................................................... 49

6.5. Referências ..................................................................................................................... 49

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................... 53

i

LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1 Cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg)

cultivado in situ no Campo Experimental de Itaporanga d’Ajuda.

Embrapa Tabuleiros Costeiros, 2018.

3

2 Frutos de cambuzeiro de coloração roxa e laranja. 4

ARTIGO 1: DIVERSIDADE GENÉTICA DE CAMBUIZEIROS

(Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg) DIFERENCIADOS

PELA COLORAÇÃO DOS FRUTOS

Figura Página

1 (A) Folhas jovens e frutos de cambuizeiro de coloração laranja (B)

Folhas jovens e frutos de cambuizeiro de coloração roxa (C) População

natural de cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O.

Berg). Reserva Particular do Patrimônio Natural do Caju, Embrapa

Tabuleiros Costeiros, SE.

16

2 Dendrograma obtido pelo método UPGMA com base no índice de

similaridade genética pelo coeficiente de Jaccard para 25 indivíduos de

cambuizeiro diferenciados pela coloração dos frutos – laranja e roxa.

21

3 Análise de coordenadas principais (ACoP) entre os diferentes

cambuizeiros diferenciados pela coloração dos frutos – laranja e roxa.

22

4 Representação dos 25 indivíduos de cambuizeiro diferenciados pela

coloração dos frutos – laranja e roxa - em três grupos definidos pelo

Structure (∆K=3) utilizando 15 marcadores ISSR.

22

ARTIGO 2: FRUTIFICAÇÃO E ATRIBUTOS DE QUALIDADE DE

CAMBUIZEIROS DIFERENCIADOS PELA COLORAÇÃO DOS

FRUTOS

Figura Página

1 Ramos de cambuizeiro marcados para avaliação da frutificação.

Itaporanga d’Ajuda, SE, 2018.

29

2 Ramos de cambuizeiros diferenciados pela coloração dos frutos –

laranja (A) ou roxa (B), com frutos verdes, ‘de vez’ e maduros.

31

3 Avaliação da frutificação de cambuizeiros diferenciados pela

coloração dos frutos – laranja e roxa durante 91 DAA.

32

4 Processo de amadurecimento de frutos com coloração laranja (A) e

roxa (B) de cambuizeiro durante 91 dias após a antese.

33

ARTIGO 3: PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS

FENÓLICOS DE Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg

UTILIZANDO ÁGUA COMO SOLVENTE EXTRATOR E SUA

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Figura Página

1 Rendimento Global de extração por maceração e EPL, utilizando

extratos de frutos de cambí de coloração laranja e roxa.

45

2 Conteúdo de compostos fenólicos totais por maceração e EPL,

utilizando extratos de frutos de cambuí de coloração laranja e roxa.

45

ii

3 Conteúdo de flavonoides totais por maceração e EPL, utilizando

extratos de frutos de cambuí de coloração laranja e roxa.

46

4 Cromatograma de extratos de Myrciaria floribunda (West ex Willd.)

O. Berg analisados por UPLC-QToF-MSE: a) MCR (Maceração

Cambuí Roxo); b) MCL (Maceração Cambuí Laranja); c) ELPCR

(Extração Líquido Pressurizado Cambuí Roxo); d) ELPCL (Extração

Líquido Pressurizado Cambuí Laranja).

47

5 Capacidade antioxidante pelo método DPPH IC50 por maceração e

EPL, utilizando extratos de frutos de coloração laranja e roxa.

49

iii

LISTA DE TABELAS

ARTIGO 1: DIVERSIDADE GENÉTICA DE CAMBUIZEIROS

(Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg) DIFERENCIADOS

PELA COLORAÇÃO DOS FRUTOS

Tabela Página

1 Primers ISSR utilizados para avaliar a diversidade genética entre

cambuizeiros diferenciados pela coloração dos frutos – laranja e roxa -

com suas respectivas sequências e temperatura de anelamento (Ta).

17

2 Relação dos primers ISSR selecionados para avaliação da diversidade

genética entre cambuizeiros diferenciados pela coloração dos frutos –

laranja e roxa; número total de bandas (NTB); número de bandas

polimórficas (NBP) e porcentagem de polimorfismo gerados pelas

reações de PCR.

18

3 Número de indivíduos, Número de alelos observados (NA), Número de

alelos efetivos (NE), Índice de Shannon (I), Heterozigosidade esperada

(HE), Heterozigosidade observada (HO) e PIC (Conteúdo de Informação

Polimórfica) para cambuizeiros com frutos de coloração diferente –

laranja e roxa obtidos por marcadores ISSR.

19

4 Análise de variância molecular (AMOVA) entre e dentro dos dois

grupos de cambuizeiros identificados pela coloração dos frutos – laranja

e roxa.

19

5 Matriz de similaridade do coeficiente de Jaccard utilizando 15 primers

pela técnica ISSR entre 25 indivíduos de cambuizeiro diferenciados pela

coloração dos frutos – laranja e roxa.

20

ARTIGO 2: FRUTIFICAÇÃO E ATRIBUTOS DE QUALIDADE DE

CAMBUIZEIROS DIFERENCIADOS PELA COLORAÇÃO DOS

FRUTOS

Tabela Página

1 Características físicas - Peso (g), comprimento (mm), largura (mm) e

número de sementes (média ± erro padrão da média) de frutos de


34

2 Sólidos Solúveis (SS) (ºBrix), Potencial hidrogeniônico (pH), Acidez

Total Titulável (ATT) (% de ácido cítrico) e Vitamina C (mg de ácido

ascórbico. 100 g-1) (média ± erro padrão da média) de frutos de


34

ARTIGO 3: PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS

FENÓLICOS DE Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg

UTILIZANDO ÁGUA COMO SOLVENTE EXTRATOR E SUA

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Tabela Página

1 Identificação dos compostos em extratos de cambuí por UPLC-QToF-

MS

47

iv

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS

AA Atividade Antioxidante

ACoP Análise de Coordenadas Principais

AMOVA Análise da Variação Molecular

AOAC Associação Oficial de Químicos Analíticos

ATT Acidez Total Titulável

BAG Banco Ativo de Germoplasma

CTAB Brometo de Cetiltrimetilamônio

DAA Dias Após a Antese

DIC Delineamento em Blocos Casualizados

DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazil

E Estresse

ELP Extração por Líquido Pressurizado

EHW Equilíbrio de Hardy-Weinberg

FAO Food Agriculture Organization of the United Nations

FDN Fibra em Detergente Neutro

FDA Fibra em Detergente Ácido

He Heterozigosidade esperada

Ho Heterozigosidade observada

I Índice de Shannon

IAL Instituto Adolfo Lutz

ISSR Sequências Simples Repetidas Internas

MMA Ministério do Meio Ambiente

Na Número de alelos

Ne Número de alelos efetivos

NUESC Núcleo de Estudos em Sistemas Coloidais

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

pH Potencial hidrogeniônico

PIC Conteúdo de Informação Polimórfica

RAPD Polimorfismo de DNA amplificados ao acaso

RMN Resonância Magnética Nuclear

RPPN Reserva Particular do Patrimônio Natural

SEMARH Secretaria de Estado do Meio Ambiente e dos Recursos Hídricos

SS Sólidos Solúveis

SSR Sequências Simples Repetidas

TE Tris - HCl 10 mM, pH. 8,0; EDTA 1Mm

UFAL Universidade Federal de Alagoas

UPGMA Método da Média Aritmética não Ponderada

v

RESUMO

NASCIMENTO, Ana Letícia Sirqueira. Diversidade genética, frutificação, atributos de

qualidade e compostos bioativos em cambuizeiros diferenciados pela coloração do fruto. São Cristóvão: UFS, 2019. 53p. (Dissertação – Mestrado em Agricultura e Biodiversidade).*

O cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg) é uma frutífera tropical, nativa

do Brasil. Os frutos são pequenos, suculentos e apresentam potencial para consumo in natura

e industrial, com propriedades funcionais à saúde humana. Para ampliar o conhecimento sobre

a variabilidade desta espécie e dar suporte à sua domesticação, o presente trabalho foi

desenvolvido com objetivo de avaliar a diversidade genética, a frutificação, os atributos de

qualidade e compostos bioativos em cambuizeiros diferenciados pela coloração do fruto. O

material vegetal foi proveniente de população in situ localizada no Campo Experimental da

Embrapa Tabuleiros Costeiros, no município de Itaporanga d’Ajuda, SE. A diversidade

genética foi estimada por 15 primers ISSR. A avaliação da frutificação quanto aos estádios de

maturação ‘verde’, ‘de vez’ e ‘maduro’, foi conduzida de janeiro a abril de 2018, e em março

houve a colheita dos frutos, que foram avaliados de acordo com a coloração. As características

avaliadas foram: peso, comprimento e largura dos frutos; número de sementes; pH; sólidos

solúveis; acidez titulável e o teor de vitamina C. No processo de extração de compostos

fenólicos dos frutos e sua atividade antioxidante foi utilizado o método de extração sob pressão

atmosférica (maceração) e por líquido pressurizado (ELP). Foram quantificados os conteúdos

de fenóis totais, flavonoides e atividade antioxidante pelo método DPPH. Não foi encontrada

uma marca molecular específica que caracterize a coloração dos frutos, entretanto foi observada

alta diversidade genética entre os indivíduos avaliados. Houve heterogeneidade no

amadurecimento dos dois tipos de cambuizeiro. O maior pico de amadurecimento ocorreu aos

63 DAA (83,2 % dos frutos de coloração laranja e 68,3 % dos frutos de cor roxa). Os frutos

roxos apresentaram atributos físicos superiores, entretanto a polpa dos frutos laranja destacou-

se pelo maior conteúdo de acidez total titulável. O método de extração por maceração

apresentou melhor rendimento global dos extratos de frutos roxos, com 47,83 %. Todos os

extratos analisados obtiveram excelente conteúdo de compostos fenólicos, em especial os de

frutos roxos (4212,96 ± 180,55 e 3870,37 ± 353,09 mg AGE/100 g obtidos por maceração e

ELP, respectivamente). O conteúdo de flavonoides também foi bastante considerável, a ELP

obteve 693,16 ± 180,09 e 770,08 ± 103,62 mg RE/100 g em extratos de frutos roxos e laranja,

respectivamente. Não houve diferença entre os perfis fitoquímicos dos extratos de cambuí de

diferentes colorações, sendo a maioria dos compostos identificados pela análise UPLC-QTOF-

MSE derivados de ácido cafeico, ácido elágico, derivados de ácido elágico e elagitaninos. Os

extratos de frutos de coloração roxa apresentaram maior atividade antioxidade (124,6 ± 9,52

µg/mL) quando extraídos por maceração.

Palavras-chave: Myrtaceae, frutificação, ISSR, DPPH.

___________________

* Comitê Orientador: Ana Veruska Cruz da Silva – Embrapa Tabuleiros Costeiros/UFS (Orientadora).

vi

ABSTRACT

NASCIMENTO, Ana Letícia Sirqueira. Genetic diversity, fructification, quality attributes

and bioactive compounds in Myrciaria floribunda differentiated by fruit color. São

Cristóvão: UFS, 2019. 53p. (Master’s thesis in Agriculture and Biodiversity).*

Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg is a tropical fruit tree native of Brazil. The fruits

are small, succulent and have the potential for in natura and industrial consumption with

functional properties to human health. To increase the knowledge about the variability of this

species and to support its domestication, this study aimed to evaluate the genetic diversity,

fructification, quality attributes and bioactive compounds in Myrciaria floribunda

differentiated by fruit color. The plant material came from an in situ population located at the

Experimental Field of Embrapa Coastal Tablelands, in the municipality of Itaporanga d’Ajuda,

SE. Genetic diversity was estimated by 15 ISSR primers. The evaluation of the fruiting stages

‘green,’ ‘underripe’ and ‘ripe,’ was conducted from January to April 2018, and in March the

fruits were harvested, which were evaluated according to the coloration. The characteristics

evaluated were: weight, length and width; number of seeds; pH; soluble solids; titratable acidity

and vitamin C content. In the extraction process of phenolic compounds of fruits and their

antioxidant activity, the extraction method was used under atmospheric pressure (maceration)

and pressurized liquid (PLE). The contents of total phenols, flavonoids and antioxidant activity

were quantified by the DPPH method. No specific molecular mark that characterizes fruit

coloration was found; however, high genetic diversity was observed among the evaluated

individuals. There was heterogeneity in the maturation of both types of the tree. The highest

ripening peak occurred at 63 DAA (83.2 % of the orange-colored fruits and 68.3 % of the

purple-colored fruits). The purple fruits showed higher physical attributes; however the orange

fruit pulp was distinguished by the higher titratable acidity content. The maceration extraction

method showed a better overall yield of purple fruit extracts, with 47.83 %. All extracts

analyzed showed excellent content of phenolic compounds, especially purple fruits (4212.96 ±

180.55 and 3870.37 ± 353.09 mg AGE/100 g obtained by maceration and PLE, respectively).

The content of flavonoids was also quite considerable, the PLE obtained 693.16 ± 180.09 and

770.08 ± 103.62 mg RE/100 g in purple and orange fruit extracts, respectively. No difference

was found between the phytochemical profiles of the extracts of Myrciaria floribunda of

different stains, with most of the compounds identified by the UPLC-QTOF-MSE analysis

derived from caffeic acid, ellagic acid, ellagic acid derivatives and ellagitannins. The extracts

of purple fruits showed higher antioxidant activity (124.6 ± 9.52 μg/mL) when extracted by

maceration.

Key words: Myrtaceae, fruiting, ISSR, DPPH.

___________________

* Supervising Committe: Ana Veruska Cruz da Silva – Embrapa Tabuleiros Costeiros/ UFS (Adviser).

1

1. INTRODUÇÃO GERAL

O Brasil é um dos principais centros de biodiversidade de frutíferas tropicais do mundo,

atualmente ocupa a terceira posição na produção de frutas frescas, ficando atrás da China e da

Índia. As frutas mais consumidas no país são laranja, banana, uva, abacaxi, maçã e mamão, que

juntas, somam o equivalente a 73% da produção (IBGE, 2017). Além disso, o país se destaca

pela extensa diversidade de espécies frutíferas nativas que funcionam como importante

repositório químico, biológico e genético para estudos científicos e tecnológicos (SOUZA et

al., 2017). As frutíferas nativas também ocupam posição de destaque onde ocorrem por serem

fontes de alimento e sustento para produtores regionais de menor poder aquisitivo.

O Nordeste brasileiro apresenta uma das mais efetivas produções de frutas do país

devido às condições de clima e solo serem favoráveis durante todo o ano. No entanto, frutas

nativas, tais como as do bioma Mata Atlântica, apesar de apresentarem características peculiares

quanto à aparência, sabor e aroma, e propriedades nutricionais, praticamente não são exploradas

comercialmente (AGOSTINI-COSTA et al., 2006).

Em Sergipe, a área florestal da Mata Atlântica vem sendo altamente fragmentada,

ocupando apenas 7,47% da cobertura original (JESUS at al., 2014). Atualmente, o estado é

centro de estudo sobre frutíferas nativas com amplo potencial social e econômico, entre elas, o

jenipapeiro (Genipa americana L.), a mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) e o

cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg) (SILVA et al., 2018; SOARES

et al., 2018; SANTANA et al., 2016).

A família Myrtaceae é amplamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais do

mundo, com cerca de 132 gêneros e 7.000 espécies (GOVAERTS et al., 2018). No Brasil é

considerada um dos principais grupos botânicos, sendo uma das dominantes entre os conjuntos

arbóreos da Mata Atlântica, com aproximadamente 1.000 espécies incluídas em 23 gêneros

(SOBRAL et al., 2017), grande parte ainda desconhecida pela maioria da população.

O cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg) é uma frutífera nativa

do Brasil, portador de grande variabilidade dentro da espécie, permitindo diferenciação pela

coloração de seus frutos (PIO-CORRÊA, 1984), que são do tipo baga globosas, glabras e

brilhantes, de coloração laranja ou roxa quando maduros (PINHEIRO et al., 2011). A espécie

de cultivo extrativista apresenta potencial econômico e necessita de pesquisas tanto para a

preservação e conhecimento de seus recursos genéticos quanto para o desenvolvimento de

tecnologias que possibilitem a introdução de pomares comerciais e possibilidades de uso.

A espécie ainda não apresenta iniciadores de microssatélites específicos desenvolvidos,

entretanto, Santana et al. (2016) encontraram alta diversidade genética entre cambuizeiros de

uma população natural. A caracterização da diversidade genética entre indivíduos com frutos

de coloração distinta pode ser útil para avaliar a diversidade genética, elaborar estratégias de

conservação, e, ao associar com dados botânicos, químicos e funcionais, podem ser decisivos

na incorporação do cambuizeiro em sistemas produtivos regionais.

O uso de marcadores moleculares ISSR (Sequências Simples Repetidas Internas) é

bastante difundido, não sendo necessária informação genômica prévia. Sua utilização tem sido

estabelecida para diversas aplicabilidades, tanto para a biologia da conservação como para a

ecologia molecular e sistemática (GHARBAWI, 2015).

Em mirtáceas, a heterogeneidade entre plantas de uma mesma espécie quanto ao período

de floração e amadurecimento dos frutos já foi constatada, a exemplo da pitangueira (Eugenia

uniflora L.), cerejeira-do-mato (Eugenia involucrata DC.), uvalheira (Eugenia pyriformis

Cambess.), guabirobeira (Campomanesia xantocarpa O. Berg) e o araçazeiro (Psidium

cattleyanum Sabine) (DANNER et al., 2010), bem como o crescimento e desenvolvimento de

frutos como a gabiroba e o cambuí através de análises físico-químicas (SANTOS et al., 2015;

SANTOS et al., 2017).

2

Os frutos do cambuizeiro apresentam características organolépticas únicas (SILVA et

al., 2012). Durante o período de maturação, as frutas sofrem mudanças na textura, odor, sabor

e coloração, sendo a clorofila progressivamente substituída pela síntese dos pigmentos

característicos dos frutos maduros (LIMA et al., 2000). A caracterização da qualidade durante

a maturação pode ser avaliada através da determinação do teor de sólidos solúveis, coloração e

acidez titulável, que auxiliam a determinar o índice de maturação e, consequentemente, definir

o ponto de máxima qualidade para colheita (SILVA, 2015).

O estudo de frutas nativas ainda pouco exploradas se torna fonte importante para a busca

de vitaminas e compostos bioativos, bem como antioxidantes naturais, que funcionam como

agentes anti-inflamatórios de importância para a saúde humana e aproveitamento industrial

(ZOU et al., 2016). As atividades biológicas de frutos da família Myrtaceae são parcialmente

atribuídas ao elevado teor de fitoquímicos como os flavonoides, antocianinas e taninos, como

proantocianidinas e elagitaninos (FRACASSETTI et al., 2013). Os frutos do cambuizeiro são

fonte importante de vitaminas e compostos bioativos como flavonoides, especialmente a rutina,

e ácidos fenólicos (OLIVEIRA et al., 2018), como também apresentam alta atividade

antioxidante (SANTOS et al., 2017; OLIVEIRA et al., 2018).

Dessa forma, o presente trabalho foi desenvolvido com objetivo de avaliar a diversidade

genética, frutificação, atributos de qualidade e compostos bioativos em cambuizeiros

diferenciados pela coloração do fruto.

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1. A família Myrtaceae e o cambuizeiro

A família Myrtaceae é pertencente à divisão Magnoliophyta (Angiospermae) e

encontra-se distribuída em todo hemisfério sul. As maiores incidências estão na Austrália

Ocidental, Ásia Tropical e no Brasil, principalmente em ecossistemas da Mata Atlântica e

Cerrado (WILSON, 2011; GRATTAPAGLIA et al., 2012).

Do ponto de vista taxonômico, a diversidade existente nessa família é apontada como

complexa devido suas espécies apresentarem ampla variação morfológica nas folhas e

coloração dos frutos. Para Lourenço e Barbosa (2012), a falta de estudos específicos em

mirtáceas pode ocasionar uma subestimação do real número de espécies que ocorrem em uma

região, pois em herbários ainda existe ampla quantidade de materiais vegetais ainda não

identificados.

Comumente, as características da família são: folhas inteiras, opostas ou alternadas, com

glândulas oleíferas no limbo, nervura submarginal, com estruturas pequenas em forma de

escama, localizadas no caule junto à bainha das folhas denominadas estípulas. As flores são

geralmente hermafroditas, possuem maior número de estames do que de pétalas, classificadas

como polistêmones, pétalas brancas e de simetria radial (MARCHIORI e SOBRAL, 1997).

As mirtáceas brasileiras geralmente não produzem madeiras valiosas por apresentarem troncos finos, contudo podem ser utilizadas em programas de recuperação de áreas degradadas

por seus frutos serem amplamente apreciados pela avifauna, auxiliando na dispersão de

sementes (GRESSLER et al., 2006). Muitas possuem propriedades antifúngicas no controle de

patógenos (ALVES et al., 2016; ALVES et al., 2018), como também medicinais e funcionais,

essenciais à dieta humana por serem ricas em compostos bioativos e acumularem compostos

voláteis em suas folhas e frutos (ROCHA et al., 2011; GUEDES et al., 2017).

Algumas mirtáceas frutíferas possuem potencial econômico reconhecido, a exemplo da

goiabeira (Psidium guajava L.), da jabuticabeira (Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg) e da

pitangueira (Eugenia uniflora L.). Suas frutas são consumidas in natura ou processadas na

forma de sucos, doces, geleias e licores, entretanto, estas espécies representam uma simples

parcela do alto potencial econômico da família, diante da grande quantidade de espécies

3

consideradas não tradicionais, que produzem frutas comestíveis, mas que ainda são

desconhecidas quanto ao potencial nutricional, produção e comercialização (GRESSLER et al.

2006).

O cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg) é uma espécie nativa

do Brasil. Ocorre do norte ao sul do país (SOBRAL et al., 2010) e em várias formações

florestais da América do Sul (FONTES et al., 2011), como os biomas Amazônia, Caatinga,

Cerrado e Mata Atlântica. São muito frequentes na flora do Nordeste brasileiro, em Sergipe se

estende por regiões da restinga litorânea (SANTANA et al., 2016).

O termo ‘cambui’ é de origem indígena e significa ‘folha que se desprende’ sendo uma

designação comum de várias espécimes inclusas nos gêneros Myrcia e Myrciaria (ARAÚJO,

2012). A espécie apresenta variações morfológicas, gerando diversos sinônimos botânicos, tais

como Eugenia floribunda H. West ex Willd., Eugenia oneillii Lundell, Eugenia protracta

Steud., Eugenia salzmannii Benth., Myrciaria mexicana Lundell, Myrciaria oneillii (Lundell)

I.M. Johnst., Myrciaria protracta (Steud.) O. Berg, Myrciaria salzmannii (Benth.) O. Berg,

Myrciaria uliginosa O. Berg, Myrciaria verticillata O. Berg, Myrciaria ciliolata (Cambess) O.

Berg, Myrciaria tenuiramis O. Berg (LORENZI, 2009).

Muito apreciada na ornamentação e arborização paisagística, apresenta porte arbustivo

a arbóreo, com alturas que variaram de 50 cm a 6 m (COUTINHO et al., 2013), possui tronco

cilíndrico e tortuoso, com casca marmorizada e descamante, e diâmetro médio variando de 20

a 30 cm (LORENZI, 2000) (Figura 1).

FIGURA 1: Cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg) cultivado in situ no

Campo Experimental de Itaporanga d’Ajuda. Embrapa Tabuleiros Costeiros, 2018. Foto: Ana

Letícia Sirqueira Nascimento.

Suas folhas são elípticas ou lanceoladas, cartáceas ou coriáceas. As inflorescências são

reunidas em fascículo e apresentam flores hermafroditas, tetrâmeras, com pétalas brancas e

pequenas (SOUZA e MORIM, 2008). O período de floração tem início em setembro, com pico

em novembro a dezembro, e terminando nos meses de janeiro a fevereiro, enquanto que a

frutificação ocorre de outubro a fevereiro-março, com pico em dezembro (SANTOS, 2018).

4

Os frutos são do tipo baga globosas, glabras e brilhantes, de cor laranja ou roxa quando

maduros (PINHEIRO et al., 2011), com diâmetro entre 0,6-0,8 cm, casca bastante fina e a polpa

envolvendo de uma a duas sementes (LORENZI, 2000) (Figura 2).

FIGURA 2. Frutos de cambuzeiro de coloração roxa e laranja. Foto: Ana Letícia Sirqueira

Nascimento, 2018.

O cambuizeiro é uma espécie alógama, e sua reprodução e dispersão depende da

presença de polinizadores e animais dispersores. Por essa razão, há uma variabilidade dentro

das populações existentes em áreas nativas. Para o seu cultivo em áreas experimentais a

propagação geralmente é realizada por sementes e apresenta desenvolvimento lento

(SUGUINO et al., 2009). A semeadura pode ser feita em bandejas, em substrato comercial ou

substrato poroso rico em matéria orgânica. O tempo de germinação e emergência varia de 180

a 365 dias, com taxa de germinação entre 30-40% (LORENZI, 2009). As pesquisas são escassas

e recentes, e, em uma delas, Ledo et al. (2014) conseguiram a formação de plântulas aos 120

dias após inoculação in vitro.

Os frutos do cambuizeiro apresentam características organolépticas únicas (SILVA et

al., 2012), com alto teor de vitamina C (PINHEIRO et al., 2011) e ação antioxidante

(CARVALHO et al., 2012). Podem ser consumidos in natura ou utilizados na produção de

suco, geleia e fermentados, apresentando concentração de antocianinas e polifenóis superiores

aos presentes em suco de uva e vinhos de uvas tintas (BIASOTO et al., 2011; RYBKA et al.,

2011). A polpa também pode ser processada na forma desidratada ou liofilizada para uso

dietético (OLIVEIRA et al., 2018). Por serem altamente perecíveis, os frutos não podem ser coletados ainda verdes, assim,

acabam servindo apenas como fonte de renda para populações regionais, que os comercializam

em beira de estradas litorâneas (GAMA et al., 2017).

O cambuizeiro também apresenta relevância na composição química dos óleos

essenciais das folhas, flores e caules (TIETBOHL et al., 2014), rico em compostos fenólicos, e

principalmente flavonoide myrcerina-3-galoctósido, compostos que possuem excelentes

atividades biológicas, como antimicrobiano, anticolinesterásico, antioxidante, antitumoral e

inseticida.

5

2.2. Diversidade e conservação dos recursos genéticos

Conhecido pela rica e atraente biodiversidade, o Brasil é um dos mais importantes pólos

de diversidade genética de espécies vegetais do mundo. Cerca de 60 mil espécies, incluindo

entre elas 500 espécies de frutíferas nativas de importância econômica e valor potencial para

usos futuros, são encontradas no bioma Mata Atlântica, e devido ao alto nível de endemismo e

a redução de área, fazem com que seja considerado como um dos 35 hotspots de biodiversidade

do planeta (MITTERMEIER et al., 2011).

O cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg) é uma espécie da flora

nordestina de importante valor econômico, para estudos de preservação e conservação, bem

como no desenvolvimento de tecnologias que propiciem a instalação de pomares comerciais.

Em Sergipe existem algumas populações da planta, sendo a Reserva Particular do Patrimônio

Natural (RPPN) do Caju, localizada no Campo Experimental da Embrapa Tabuleiros Costeiros,

em Itaporanga d’Ajuda, importante base de estudo para a espécie, mantendo uma coleção in

situ da mesma (SANTANA et al., 2016). Em Alagoas, a Universidade Federal de Alagoas

(UFAL) dispõe de um Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de cambuizeiro, com 200 acessos

provenientes de municípios com maior incidência do fruto visando a preservação da

variabilidade genética da planta (SANTOS et al., 2017).

Nos Estados Unidos, especificamente na Flórida, existem 64 mirtáceas distribuídas em

coleções pertencentes a instituições públicas e privadas do país e, destas, 16 espécies são de

origem brasileira, entre elas, acessos de cambuizeiros, já cultivados e adaptados às condições

do ecossistema local (LUCENA et al., 2014).

O conhecimento sobre o desenvolvimento e a variação genética de espécies nativas é

fundamental, pois a domesticação e incorporação dessas espécies em sistemas produtivos estão

relacionadas às informações da distribuição da variabilidade genética em populações naturais

(COSTA et al., 2011), evitando a erosão genética, a extinção de indivíduos superiores e a

pressão extrativista sobre a natureza.

Os BAGs funcionam como uma alternativa para a conservação dos recursos genéticos

vegetais. A avaliação da diversidade genética entre os acessos de um BAG resulta em

informações sobre potenciais genitores a serem utilizados em programas de melhoramento, bem

como a identificação de duplicatas e o intercâmbio de germoplasma entre pesquisadores

(COSTA et al., 2011), conciliando os esforços de conservação da agrobiodiversidade com o

desenvolvimento sustentável (NASS, 2007).

Devido à ampla distribuição geográfica e ocorrência em diferentes tipos de vegetação,

o cambuizeiro não é considerado ameaçado de extinção (LEMOS et al., 2018), entretanto, a

diversidade genética nas populações pode ser reduzida com a fragmentação das áreas nativas

devido à desorganizada ocupação agrícola e urbana (GAMA et al., 2017).

Desta forma, a caracterização do germoplasma vegetal se torna fundamental, e pode ser

realizada por meio de descritores morfológicos e características agronômicas, entretanto a

influência abiótica impossibilita a distinção precisa entre genótipos (WANG et al., 2009). Diferentemente, os marcadores moleculares são utilizados de forma eficiente na análise

genética de plantas e na caracterização da variabilidade de populações naturais, com elevada

precisão de informações gênicas, apresentando vantagens, uma vez que podem ser obtidos em

grande número e não sofrem influência de fatores ambientais (CAIXETA et al., 2006).

Os marcadores moleculares ISSR (Sequências Simples Repetidas Internas) são

amplamente utilizados para estudos de diversidade genética de plantas. Foram desenvolvidos a

partir da necessidade de estudos genéticos sem um conhecimento prévio do genoma de estudo

(EL-AMIN e HAMZA, 2016), por meio de marcadores microssatélites ou SSR (Sequências

Simples Repetidas), sequências de nucleotídeos repetidas em tandem, cuja unidade de repetição

varia de um a seis pares de base. A técnica utilizada para o marcador ISSR é baseada em PCR

(Reação em Cadeia da Polimerase) e envolve a amplificação de sequências de DNA presentes

6

numa região de distância amplificável entre duas regiões repetidas idênticas de microssatélites

orientadas em direções opostas. Esta técnica tem sido utilizada por ser simples, eficiente,

possuir alta reprodutibilidade, gerar altos índices de polimorfismo e apresentar baixo custo

(REDDY et al., 2002; SANTOS et al., 2011; TIWARI et al., 2015).

Além disso, o ISSR tem-se mostrado eficiente em diversos estudos de análise da

variabilidade genética em frutíferas nativas, dentre elas o jenipapeiro (SILVA et al., 2014), a

mangabeira (SOARES et al., 2016), o umbu-cajazeira (SANTANA et al., 2011) e o próprio

cambuizeiro (SANTANA et al., 2016). Em avaliação de uma população natural, Santana et al.

(2016) observaram a diversidade genética entre diferentes genótipos que poderão ser utilizados

para o manejo dos recursos genéticos da espécie. Utilizando marcadores RAPD (Polimorfismo

de DNA amplificados ao acaso), Pinheiro et al. (2011) observaram alta diversidade genética em

uma população natural de cambuizeiro.

Desta forma, estes estudos apresentam grande importância, especialmente para espécies

nativas ainda pouco conhecidas, como o cambuizeiro.

2.3. Atributos de qualidade dos frutos e compostos bioativos

Informações sobre as características físico-químicas e valor nutricional dos frutos são

ferramentas básicas para incentivar o consumo e a formulação de novos produtos (Rocha et al.,

2013), logo, características como aparência, tamanho, formato, peso, quantidade de sementes,

qualidade funcional, entre outras, devem ser consideradas para satisfazerem os consumidores

da fruta (VIANA et al., 2013).

Durante o período de maturação, as frutas sofrem mudanças na textura, odor, sabor e

coloração, sendo a clorofila progressivamente substituída pela síntese dos pigmentos

característicos dos frutos maduros (LIMA et al., 2000). A caracterização da qualidade durante

a maturação pode ser avaliada através da determinação do teor de sólidos solúveis, coloração e

acidez titulável, que auxiliam a determinar o índice de maturação e, consequentemente, definir

o ponto de máxima qualidade para colheita (SILVA, 2015).

A identificação de novas fontes de vitamina C é de grande interesse para a área de

ciências da saúde, visto que a vitamina é um componente essencial às funções fisiológicas do

corpo humano (COUTINHO et al., 2013). A polpa do cambuí apresenta rica composição de

vitamina C (129,43 mg de ácido ascórbico.100 g-1) (PINHEIRO et al., 2011), e as

determinações de pH, da acidez e do teor de sólidos solúveis, contribuem para a apreciação do

sabor dos frutos. O pH, geralmente inferior a 4,5, como constatado em trabalhos de Silva et al.

(2009); Coutinho et al. (2013); Araújo et al. (2015), aumenta no decorrer do amadurecimento e

influencia as características organolépticas juntamente com a capacidade de conservação dos

frutos.

Recentes pesquisas indicaram que o consumo de frutas nativas pode reduzir ou até

mesmo impedir o desenvolvimento de enfermidades crônicas não transmissíveis, como o

câncer, Alzheimer, diabetes e doenças cardiovasculares devido à presença atuante de compostos com propriedades antioxidantes (FRACASSETTI et al., 2013; LENQUISTE et al., 2015;

PLAZA et al., 2016).

As plantas nativas e seus componentes com potencial para tratamento e prevenção são

constantemente investigados a fim de desvendar seus mecanismos de ação. De acordo com

Araújo et al. (2015), o cambuí é rico em compostos bioativos, a exemplo de carotenoides,

flavonoides e ácidos fenólicos. Este fato que está relacionado ao acúmulo de compostos

fenólicos provenientes de sua capacidade de adaptação às situações de estresse que oferecem

proteção contra o estresse oxidativo celular.

Ácidos fenólicos, como o ácido gálico e elágico, estão presentes na polpa liofilizada de

cambuí, e possibilitam o uso do extrato liofilizado como conservante e antioxidante. Oliveira

et al. (2018) identificaram carotenoides, entre eles o β-criptoxantina, 13-cis-β-caroteno, α-

7

caroteno, 9-cis-β-caroteno e β-caroteno, com alto potencial de vitamina A. O extrato liofilizado

da polpa pode ser utilizado como fonte de rutina (78,56 mg.100 g-1). A atividade antioxidante

da polpa liofilizada dos frutos de cambuí pode ser considerada alta, sendo superior ao liofilizado

de jabuticaba (Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg.), jambolão (Syzygium cumini (L) Skeels),

murta (Blepharocalyx salicifolius (Kunth) O.Berg.) e uvaia (Eugenia pyriformis Cambess.).

Em frutíferas nativas como o cambuizeiro as perdas na produção não são contabilizadas

e as alterações que ocorrem durante o amadurecimento são desconhecidas (SILVA et al., 2012).

É importante salientar que o cambuí pode se tornar uma opção atrativa para o mercado da

fruticultura brasileira, necessitando de estudos sobre o seu potencial de utilização, pois além de

apresentar importante potencial econômico, as informações obtidas podem subsidiar o cultivo

e a seleção apropriada dos melhores genótipos, tendo em vista seu aproveitamento no consumo

in natura e na indústria alimentícia (SANTOS, 2018).

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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4. ARTIGO 1: DIVERSIDADE GENÉTICA DE CAMBUIZEIROS (Myrciaria floribunda

(West ex Willd.) O. Berg) DIFERENCIADOS PELA COLORAÇÃO DOS FRUTOS

Aprovado para publicação na Revista Brasileira de Ciências Agrárias

RESUMO

O cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg) é uma frutífera nativa do

Brasil, cujos frutos apresentam potencial para consumo in natura e industrial. O objetivo do

presente trabalho foi avaliar a diversidade genética entre indivíduos diferenciados pela

coloração dos frutos - laranja e roxa, utilizando marcadores moleculares ISSR. O material

vegetal pertence a Reserva Particular do Patrimônio Natural do Caju, campo experimental da

Embrapa Tabuleiros Costeiros, no município de Itaporanga d’Ajuda, SE. Folhas jovens de 25

indivíduos (15 com frutos de cor laranja e 10 com frutos de cor roxa) foram coletadas para

extração de DNA e análise PCR-ISSR com 15 primers, os quais produziram um total de 93

bandas, sendo 95,5 % polimórficas. A similaridade média foi de 0,53, com base no coeficiente

de Jaccard. Os indivíduos menos semelhantes foram FR5 e FL8; FR5 e FL9; FR1 e FR5. Os

pares de indivíduos mais similares foram FL3 e FL4; FL4 e FL5. A análise UPGMA agrupou

os indivíduos em dois grupos. Apesar de não ter sido encontrada uma marca molecular

específica que caracterize a coloração dos frutos, há variabilidade genética entre os indivíduos

avaliados.

Palavras-chave: Myrtaceae, frutas nativas, ISSR.

14

ABSTRACT

Title: Genetic diversity of Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg differentiated by

fruit color

Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg is a native fruit of Brazil, whose fruits have the

potential for in natura and industrial consumption. Our objective was to evaluate the genetic

diversity between individuals, differentiated by fruit color – orange or purple, using molecular

ISSR markers. The plant material belongs to the Caju Private Natural Heritage Reserve,

experimental field of Embrapa Coastal Tablelands, in the municipality of Itaporanga d’Ajuda,

SE. Young leaves from 25 individuals (15 with orange fruits and 10 with purple fruits) were

collected for DNA extraction and PCR-ISSR analysis with 15 primers, which produced a total

of 93 bands, 95.5 % of them being polymorphic. The mean similarity was 0.53, based on the

Jaccard coefficient. The least similar individuals were FR5 and FL8; FR5 and FL9; FR1 and

FR5. The most similar pairs of individuals were FL3 and FL4; FL4 and FL5. The UPGMA

analysis grouped the individuals into two groups. Even though no specific molecular mark that

characterizes fruit coloration was found, there is genetic variability among the individuals

evaluated.

Keywords: Myrtaceae, native fruits, ISSR.

15

4.1. Introdução

O bioma Mata Atlântica é composto por formações florestais nativas, apresentando 35%

das espécies vegetais do Brasil. Sua biodiversidade é maior do que a de alguns continentes

inteiros (MMA, 2018), entretanto, é uma das mais ameaçadas do planeta. Nesse bioma se

encontram diversas espécies de frutíferas nativas com amplo potencial de uso. Em Sergipe, por

exemplo, pesquisas foram desenvolvidas com jenipapeiro (Genipa americana L.) (SILVA et

al., 2015; SILVA et al., 2018), cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg)

(SANTANA et al., 2016) e mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) (SANTOS et al., 2017;

SOARES et al., 2018).

Dentre as famílias botânicas encontradas, a Myrtaceae se destaca como uma das de

maior riqueza (LOURENÇO et al., 2012). Pertencem à tribo Myrteae, que formam um grupo

filogeneticamente coeso (WILSON et al., 2001), dividido em três subtribos: Eugeniinae,

Myrciinae e Myrtinae, com base na morfologia dos embriões (BERG, 1857, 1858, 1859). A

família apresenta importância na restauração de áreas alteradas, enriquecimento de florestas

secundárias e usos fitoterápicos (GOMES et al., 2017), além dos frutos serem importantes

fontes de alimentos para a fauna silvestre (GRESSLER et al., 2006).

Existe um grande número de Myrtaceae ainda não domesticadas e pouco exploradas,

entre elas a espécie Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg, conhecida como

cambuizeiro, frutífera nativa do Brasil. Apresenta flores hermafroditas, com polinização

cruzada e possível autogamia. Exibe uma grande variabilidade dentro da espécie, sendo possível

diferenciá-las pela coloração de seus frutos (PIO-CORRÊA, 1984), bagas globosas, glabras e

brilhantes, de cor que variam de roxo à laranja (PINHEIRO et al., 2011), além de apresentarem

características físicas e físico-químicas distintas de acordo com a maturação dos frutos (SILVA

et al., 2012a).

As pesquisas com a espécie são recentes. O alto teor de vitamina C (129,43 mg de ácido

ascórbico. 100 g-1) foi relatado por Pinheiro et al. (2011), sendo os frutos apreciados na

produção de sucos, geleias e fermentados com propriedades antioxidantes (RYBKA et al.,

2011). Além disso, é uma considerável fonte de alimento para ruminantes devido aos teores de

fibra (48,65 % de FDN - Fibra em Detergente Neutro e 23,60% de FDA - Fibra em Detergente

Ácido) (VOLTOLINI et al., 2011).

Ao identificar inicialmente as diferentes cores de frutos, houve uma relação direta com

os estádios de maturação (PINHEIRO et al., 2011), entretanto, a experiência em expedições de

coleta de germoplasma e as visitas constantes na população natural da Reserva do Caju, objeto

deste estudo, possibilitou a identificação de indivíduos que possuem exclusivamente frutos

roxos ou laranja. Dessa forma, a caracterização molecular será útil para avaliar a diversidade

genética, elaborar estratégias de conservação, e, ao associar com dados botânicos, químicos e

funcionais, poderão ser decisivos na incorporação da espécie em sistemas produtivos regionais.

O uso de marcadores ISSR é bastante difundido, não sendo necessária informação

genômica prévia. Sua utilização tem sido estabelecida para diversas aplicabilidades, tanto para a biologia da conservação como para a ecologia molecular e sistemática (GHARBAWI, 2015).

Em cambuizeiro, Santana et al. (2016) utilizaram 10 primers ISSR para caracterizar 50 plantas

de uma população natural em Sergipe.

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a diversidade genética de cambuizeiro,

diferenciados pela coloração dos frutos - laranja e roxa, utilizando marcadores moleculares

ISSR.

16

4.2. Material e Métodos

Folhas jovens dos cambuizeiros com frutos de coloração laranja (Figura 1A) e roxa

(Figura 1B) foram coletadas de uma população natural, conservada in situ, pertencente à

Reserva Particular do Patrimônio Natural do Caju (RPPN do Caju), campo experimental da

Embrapa Tabuleiros Costeiros, no município de Itaporanga d’Ajuda - SE (11.116585°S,

37.186742°W) (Figura 1C). O material foi coletado de 25 indivíduos, sendo 15 cambuizeiros

com frutos de coloração laranja (FL1 a FL15) e 10 de coloração roxa (FR1 a FR10).

Figura 1. (A) Folhas jovens e frutos de cambuizeiro de coloração laranja (B) Folhas jovens e

frutos de cambuizeiro de coloração roxa (C) População natural de cambuizeiro (Myrciaria

floribunda (West ex Willd.) O. Berg). Reserva Particular do Patrimônio Natural do Caju,

Embrapa Tabuleiros Costeiros, SE. Foto: A.L.S. Nascimento.

Para a extração do DNA foram usados 15 discos de folhas (Doyle & Doyle, 1990)

adaptada por Alzate-Marin et al. (2009). A qualidade do DNA extraído foi avaliada em

eletroforese em gel de agarose a 0,8 %. O gel foi corado em solução de brometo de etídio

durante 20 min, e fotodocumentado pelo equipamento Gel doc L-pix HE (Loccus

Biotecnologia, Cotia, SP, Brasil). Posteriormente, o DNA foi quantificado utilizando o

espectrofotômetro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, EUA). As amostras foram diluídas a

concentração de 10 ng/µL em solução de tampão TE (Tris-HCl 100 mM pH 7,4 e 1mM de

EDTA) e armazenadas a -20 ºC para posterior uso nas reações de PCR.

Foram testados 30 primers em gel de agarose a 2 %, dos quais 15 foram selecionados

para amplificação de DNA por meio da PCR-ISSR (Tabela 1).

17

Tabela 1. Primers ISSR utilizados para avaliar a diversidade genética entre cambuizeiros

diferenciados pela coloração dos frutos – laranja e roxa - com suas respectivas sequências e

temperatura de anelamento (Ta). Primer Sequência Ta (ºC)

UBC 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 47,0

UBC 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG 57,2

UBC 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 46,8

UBC 813 CTC TCT CTC TCT CTC TT 44,6 UBC 815 CTC TTC TCT CTC TCT CTG 47,6

UBC 816 CAC ACA CAC ACA CAC AT 55,8

UBC 818 CAC ACA CAC ACA CAC AG 57,2

UBC 823 TCT CTC TCT CTC TCT CC 57,2 UBC 835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 50,2

UBC 845 CTC TCT CTC TCT CTC TRG 48,1

UBC 856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 56,5

UBC 857 ACA CAC ACA CAC ACY G 58,8 ISSR 2 CTC TCT CTC TCT CTC TAC 51,5

ISSR 3 CTC TCT CTC TCT CTC TTG 51,5

ISSR 5 CTC TCT CTC TCT CTC TGC 51,5

Para os ensaios de PCR, o volume total da reação foi de 20 μL contendo: 1 μL de DNA

genômico (10 ng/µL), 1 μL de cada primer (25,0 pmol), 2 μL de tampão da reação 10X (100

mM Tris-HCl; pH 8,5; 500 mM KCl); 0,4 μL de dNTP (10 mM); 0,6 μL de MgCl2 (50 mM)

(4G Pesquisa e Desenvolvimento, Brasil/RS); 0,2 μL de Taq polimerase (5 U/μL) (4G Pesquisa

e Desenvolvimento, Brasil/RS) e 14,8 μL de água ultrapura autoclavada. Os DNAs foram

amplificados usando o termociclador ProFlex PCR System (Thermo Fisher Scientific, Applied

Biosystems, Foster City, CA, EUA) programado com o seguinte protocolo: desnaturação inicial

a 94 °C por 4 min, seguido de 37 ciclos de amplificação; desnaturação a 94°C por 45 s;

anelamento a diferentes temperaturas por 45 s; extensão a 72 °C por 2 min; e uma extensão

final a 72 °C por 7 min, seguido de resfriamento a 4 °C. Os produtos da amplificação foram

submetidos à eletroforese horizontal, em gel de agarose a 2%, em seguida corados em solução

de brometo de etídio (0,5 μL mL-1) durante 20 min, e fotodocumentados pelo aparelho Gel doc

L-pix (Loccus Biotecnologia, Cotia, SP, Brasil). Para padronização dos fragmentos utilizou-se

o marcador de peso molecular de 100 pb (Ludwig Biotec, Brasil/RS).

Após a análise dos géis de agarose, obteve-se uma matriz binária com base na ausência

(0) ou na presença (1) de bandas provenientes dos primers selecionados. Estimativas de

similaridades genéticas entre os indivíduos foram obtidas utilizando o coeficiente de Jaccard.

A construção do dendrograma foi obtida com o auxílio do software NTSYS-pc 2.0 baseado na

matriz de similaridade genética, utilizando o algoritmo UPGMA (Método da Média Aritmética

Não Ponderada) (ROHLF, 2001). A análise da variação molecular (AMOVA), a análise de

coordenadas principais (ACoP) e os parâmetros de diversidade genética como: o número de

alelos observados (Na); o número de alelos efetivos (Ne); heterozigosidade esperada (He);

heterozigosidade observada (Ho) e o índice de Shannon (I) foram obtidos com o auxílio do

software Genalex 6.5 (PEAKALL & SMOUSE, 2012). O Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC), a heterozigosidade esperada sob

Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) e os valores de correlação e estresse foram estimados

usando o programa GENES (CRUZ, 2016). Para evidenciar o agrupamento foi utilizado o

método de reamostragem bootstrap com 10.000 repetições a partir do software GENES.

A análise da estrutura genética dos indivíduos de Myrciaria floribunda (West ex Willd.)

O. Berg, baseada em estatística bayesiana, foi estimada utilizando o software Structure

(PRITCHARD et al., 2000). Utilizou-se o programa Structure Harvester (EARL &

VONHOLDT, 2012) para inferir o número de grupos (∆K).

18

4.3. Resultados e Discussão

Os 15 primers utilizados forneceram 93 bandas, sendo 90 polimórficas (95,5 %). O

número de bandas variou de 3 (UBC 815 e 856) a 9 (UBC 818 e 857) (Tabela 2).

Tabela 2. Relação dos primers ISSR selecionados para avaliação da diversidade genética entre

cambuizeiros diferenciados pela coloração dos frutos – laranja e roxa; número total de bandas

(NTB); número de bandas polimórficas (NBP) e porcentagem de polimorfismo gerados pelas

reações de PCR. Primers NTB NBP % Polimorfismo

807 07 07 100

809 04 04 100 811 07 07 100

813 05 05 100

815 04 03 75

816 05 05 100 818 09 09 100

823 07 07 100

835 07 07 100

845 06 05 83 856 04 03 75

857 09 09 100

ISSR 2 05 05 100

ISSR 3 07 07 100 ISSR 5 07 07 100

Total 93 90 95,5

Em população natural de cambuizeiro, Santana et al. (2016) usaram 10 primers e

obtiveram 70 bandas polimórficas (98,3 %). Para caracterização de jabuticabeiras (Plinia sp.),

Cruz et al. (2016) utilizaram 18 primers, que resultaram em 462 bandas polimórficas (99,65 %).

No estudo de diversidade genética entre 28 indivíduos de canela-de-tabuleiro (Myrcia lundiana

Kiaersk) oriundos do Parque Nacional de Itabaiana, Alves et al. (2016) testaram 35 primers que

geraram 135 bandas polimórficas (93,75 %). Avaliando a distância genética entre acessos de

goiabeiras e araçazeiros do gênero Psidium, Oliveira et al. (2014) obtiveram 216 bandas

polimórficas com o uso de 17 primers.

O valor médio do número de alelos observados (Na) foi igual a 1,88 e o do número de

alelos efetivos (Ne) 1,61. A média da heterozigosidade observada (Ho) foi de 0,36, enquanto a

esperada (He) foi 0,34. Esses resultados sugerem que há mais heterozigotos do que o esperado

pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg devido ao constante fluxo de genes de outros indivíduos

próximos. O valor médio do índice de Shannon (I) foi de 0,50 (Tabela 3). Este índice pode

variar de 0 a 1, sendo que a diversidade é considerada menor quando os valores estão mais

próximos à zero (SILVA et al., 2015). Nesse estudo, os cambuizeiros com frutos de coloração

distinta apresentaram nível intermediário de diversidade genética, semelhante ao observado por

Santana et al. (2016), que obtiveram (I) de 0,52.

Em acessos de camu-camu (Myrciaria dubia), Nunes et al. (2017) também obtiveram

nível intermediário de diversidade genética, (He) de 0,34 e (I) de 0,50. Entretanto, Almeida-

Pereira et al. (2017), estudando a diversidade genética de populações nativas de Croton

tetradenius Baill, encontraram valores inferiores, (He) de 0,30 e (I) de 0,45. O valor de He

sempre deverá ser diferente de zero, pois os indivíduos são suscetíveis a incorporação de novos

alelos por cruzamento, mesmo em populações pequenas ou fragmentadas, além de perdas

devido à deriva genética (SILVA et al., 2014).

19

Tabela 3. Número de indivíduos, Número de alelos observados (NA), Número de alelos efetivos

(NE), Índice de Shannon (I), Heterozigosidade esperada (HE), Heterozigosidade observada (HO)

e PIC (Conteúdo de Informação Polimórfica) para cambuizeiros com frutos de coloração

diferente – laranja e roxa obtidos por marcadores ISSR.

População Número de

indivíduos NA NE I HE HO PIC

Frutos de cor

laranja

15 1,87 1,59 0,49 0,33 0,35 -

Frutos de cor

roxa

10 1,88 1,62 0,51 0,35 0,37 -

Valor médio - 1,88 1,61 0,50 0,34 0,36 0,62

Total 25

A confiabilidade dos resultados foi verificada pelo valor do estresse (E), que foi de

0,016, e da correlação cofenética (0,997). A estabilidade ocorreu ao atingir 90 bandas

amplificadas. Um valor de E < 0,05 é indicativo de ótima precisão nas estimativas (KRUSKAL,

1964).

O valor médio do PIC foi 0,62. De acordo com Xie et al. (2010), o valor do PIC varia

de 0 a 0,25 para marcadores que são considerados pouco informativos; de 0,25 a 0,5 para os

que indicam moderado conteúdo informativo; e acima de 0,5 para os altamente informativos.

Este valor serve como base para a classificação e seleção dos primers que foram eficientes na

discriminação dos indivíduos. Desta forma, pode-se indicar que o polimorfismo entre as plantas

com frutos de cor laranja e roxa foi alto.

Estudando a diversidade genética em uma população natural de mangaba (Hancornia

speciosa Gomes) utilizando marcadores ISSR, Costa et al. (2015) obtiveram valor médio de

PIC de 0,37, classificando-os como moderadamente informativos. Para a moringa (Moringa

oleifera Lam), utilizando marcadores dominantes RAPD, Silva et al. (2012b) obtiveram PIC

médio de 0,22, sendo os primers considerados pouco informativos.

Por meio da AMOVA, observou-se que a diversidade genética foi maior dentro de

grupos (90 %) do que entre eles (10 %) (Tabela 4).

Tabela 4. Análise de variância molecular (AMOVA) entre e dentro dos dois grupos de

cambuizeiros identificados pela coloração dos frutos – laranja e roxa.

FONTE DE VARIAÇÃO Grau de

liberdade

Soma dos

quadrados

Quadrado

médio

Componente de

variação Total (%) P

Entre grupos 1 37,69 37,69 1,75 10 0,001

Dentro de grupos 23 382,63 16,64 16,64 90

Total 24 420,32 - 18,39 100

A incidência de diversidade entre os cambuizeiros estudados por meio de marcadores

moleculares ISSR demonstraram a eficiência da técnica para identificação de diversidade. A

similaridade média foi de 0,53. Observou-se a menor semelhança (0,25) entre os indivíduos

FR5 e FL8; FR5 e FL9; FR1 e FR5 por estarem mais distantes geograficamente. Também foi

possível visualizar que indivíduos com a mesma cor de fruto, como FR1 e FR5 podem ser

diferentes geneticamente. A maior semelhança (0,88) foi encontrada igualmente nos indivíduos

FL5 e FL6; FL12 e FL13. Os pares de indivíduos mais similares foram FL3 e FL4 (0,76); FL4

e FL5 (0,84) que apresentavam a mesma coloração dos frutos e tinham distâncias muito próximas, indicando interação quanto à dispersão do pólen normalmente realizada por insetos

(Tabela 5).

20

Tabela 5. Matriz de similaridade do coeficiente de Jaccard utilizando 15 primers pela técnica ISSR entre 25 indivíduos de cambuizeiro diferenciados

pela coloração dos frutos – laranja e roxa. Planta

Planta FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FL7 FL8 FL9 FL10 FL11 FL12 FL13 FL14 FL15 FR1 FR2 FR3 FR4 FR5 FR6 FR7 FR8 FR9 FR10

FL1 0,55 -

FL2 0,66 0,59 -

FL3 0,57 0,48 0,76 -

FL4 0,59 0,49 0,78 0,71 -

FL5 0,57 0,53 0,84 0,80 0,88 -

FL6 0,51 0,44 0,57 0,50 0,58 0,65 -

FL7 0,51 0,42 0,54 0,57 0,55 0,61 0,58 -

FL8 0,55 0,48 0,58 0,63 0,57 0,60 0,48 0,69 -

FL9 0,38 0,30 0,47 0,49 0,45 0,47 0,39 0,51 0,55 -

FL10 0,40 0,43 0,41 0,37 0,41 0,43 0,33 0,41 0,50 0,36 -

FL11 0,49 0,45 0,64 0,66 0,65 0,66 0,45 0,47 0,53 0,50 0,40 -

FL12 0,55 0,46 0,65 0,67 0,66 0,67 0,48 0,50 0,54 0,49 0,39 0,88 -

FL13 0,42 0,40 0,57 0,50 0,57 0,61 0,44 0,47 0,42 0,47 0,39 0,60 0,61 -

FL14 0,44 0,36 0,55 0,55 0,56 0,64 0,62 0,58 0,53 0,42 0,31 0,50 0,53 0,47 -

FL15 0,44 0,42 0,58 0,53 0,58 0,61 0,44 0,52 0,53 0,49 0,39 0,55 0,51 0,60 0,49 -

FR1 0,47 0,50 0,60 0,51 0,54 0,62 0,47 0,51 0,49 0,42 0,42 0,50 0,53 0,54 0,55 0,51 -

FR2 0,52 0,37 0,56 0,61 0,49 0,53 0,42 0,45 0,51 0,35 0,39 0,50 0,53 0,43 0,48 0,42 0,50 -

FR3 0,41 0,41 0,55 0,53 0,49 0,57 0,39 0,49 0,53 0,44 0,36 0,54 0,55 0,51 0,50 0,55 0,52 0,48 -

FR4 0,42 0,38 0,51 0,46 0,47 0,49 0,40 0,47 0,49 0,46 0,35 0,50 0,49 0,61 0,43 0,49 0,50 0,50 0,62 -

FR5 0,29 0,34 0,33 0,34 0,32 0,32 0,25 0,25 0,36 0,33 0,33 0,27 0,23 0,30 0,25 0,33 0,28 0,33 0,27 0,29 -

FR6 0,49 0,39 0,56 0,58 0,49 0,56 0,46 0,51 0,46 0,49 0,34 0,49 0,50 0,53 0,51 0,50 0,58 0,51 0,55 0,60 0,31 -

FR7 0,38 0,29 0,46 0,46 0,47 0,48 0,37 0,49 0,44 0,55 0,31 0,49 0,48 0,57 0,45 0,52 0,51 0,37 0,53 0,49 0,29 0,65 -

FR8 0,45 0,45 0,53 0,53 0,49 0,55 0,47 0,49 0,47 0,46 0,37 0,58 0,57 0,60 0,50 0,51 0,52 0,44 0,54 0,54 0,28 0,68 0,61 -

FR9 0,34 0,39 0,39 0,45 0,36 0,43 0,29 0,46 0,45 0,46 0,43 0,49 0,47 0,42 0,36 0,38 0,49 0,42 0,43 0,44 0,26 0,44 0,44 0,55

21

A análise UPGMA resultou na formação de dois grupos, porém não foi possível obter

separação específica entre os cambuizeiros com frutos de cor laranja e roxa (Figura 2). O

grupo 1 (G1), alocou praticamente todos os indivíduos, indicando ampla diversidade, e foi

subdividido em cinco grupos (G1-A, G1-B, G1-C, G1-D, G1-E). Grupos maiores, formados

por mais indivíduos, agrupam os pares que apresentam menores distâncias, uma vez que o

tamanho do grupo é delimitado por uma distância média entre os pares de indivíduos

(OLIVEIRA et al., 2009), e apesar do cambuizeiro apresentar o mecanismo da autogamia, a

diversidade encontrada pode ser explicada pela tendência a alogamia (OLIVEIRA et al.,

2007).

No G1-A, os pares de indivíduos FL5 e FL6; FL12 e FL13 foram os mais semelhantes,

apresentando praticamente o mesmo material genético. No G1-B, FR7 e FR9 foram os mais

próximos geneticamente. O G1-C agrupou indivíduos com frutos de coloração distinta, FL10

e FR10. Essa menor distância, e consequentemente menor variabilidade, pode ser explicada

por talvez serem provenientes de autofecundação; e os subgrupos como G1-D e G1-E foram

mais isolados e compostos por único indivíduo. Devido a maior distância genética entre os

demais, e apresentarem a mesma coloração de fruto, poderiam ser promissores em

cruzamentos.

O grupo 2 (G2) foi composto apenas pelo indivíduo FR6, o mais divergente

geneticamente. Estes indivíduos isolados possuem ampla variabilidade genética, podendo ser

usados para fins comerciais, e úteis na conservação e conhecimento dos recursos genéticos

disponíveis para a formação de bancos ativos de germoplasma e desenvolvimento do

melhoramento genético da espécie a partir de cruzamentos controlados.

Figura 2. Dendrograma obtido pelo método UPGMA com base no índice de similaridade

genética pelo coeficiente de Jaccard para 25 indivíduos de cambuizeiro diferenciados pela

coloração dos frutos – laranja e roxa.

A análise de coordenadas principais (ACoP) foi empregada para elucidar os padrões

de diversidade genética em uma trama bidimensional (Figura 3) e comprovou alguns grupos

pelo UPGMA. Nesse modelo de agrupamento foram formados oito grupos, onde se destacam

Jaccard's Similarity Index0.30 0.44 0.59 0.74 0.88

FL1

FL3

FL5

FL6

FL4

FL12

FL13

FL8

FL9

FL7

FL15

FR3

FR2

FL14

FR1

FR4

FR5

FR7

FR9

FR8

FL10

FR10

FL2

FL11

FR6

A

D

G1

G2

B

C

E

22

subgrupos, promovendo uma maior diferenciação dos indivíduos com frutos de coloração

distinta.

Figura 3. Análise de coordenadas principais (ACoP) entre os diferentes cambuizeiros

diferenciados pela coloração dos frutos – laranja e roxa.

A existência de alta variabilidade genética também foi encontrada por Pinheiro et al.

(2011), utilizando marcadores RAPD em 20 indivíduos de cambuizeiro e Santana et al.

(2016) utilizando marcadores ISSR para o estudo de 50 indivíduos em população natural de

cambuizeiro.

O emprego de mais de um método de agrupamento, em razão das diferenças na

hierarquização, otimização e ordenação dos grupos, permite que a classificação dos indivíduos

se complemente em função dos critérios que cada técnica utiliza, e impede que inferências

errôneas sejam adotadas na alocação de materiais, dentro de um determinado subgrupo de

genótipos (ARRIEL et al., 2006).

A estrutura genética foi avaliada pela análise Bayesiana. Esta análise agrupa os

indivíduos com base em distinções genéticas, sem a necessidade de uma pré-identificação

dos indivíduos com frutos de coloração laranja ou roxa. Na análise de ΔK, o valor máximo

ocorreu em K=3, sendo os indivíduos divididos em três grupos definidos pelas cores

vermelha, verde e azul (Figura 4).

Figura 4. Representação dos 25 indivíduos de cambuizeiro diferenciados pela coloração dos

frutos – laranja e roxa - em três grupos definidos pelo Structure (∆K=3) utilizando 15

marcadores ISSR.

Percebeu-se resultado concordante com as análises anteriores, onde não foi observada

distinção genética clara entre os indivíduos com frutos de coloração laranja e roxa. A maioria

23

dos indivíduos apresentou parte de cada grupo, indicando que os mesmos podem ter origem

compartilhada, resultado de um intercâmbio de genes entre os indivíduos analisados.

4.4. Conclusão

Não foi encontrada uma marca molecular específica para a coloração do fruto – laranja

ou roxa - em cambuizeiro; entretanto, há alta diversidade genética entre os indivíduos

avaliados.

4.5. Literatura Citada

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http://www.revista.ccba.uady.mx/ojs/index.php/TSA/article/view/2094.%2023%20Mar.%202018

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https://doi.org/10.1016/j.bse.2010.06.009

26

5. ARTIGO 2: FRUTIFICAÇÃO E ATRIBUTOS DE QUALIDADE DE

CAMBUIZEIROS DIFERENCIADOS PELA COLORAÇÃO DOS FRUTOS

Periódico a ser submetido: Scientia Horticulturae

RESUMO

O cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg) é uma frutífera nativa do

bioma Mata Atlântica. Seus frutos são pequenos, suculentos, de cor laranja ou roxa. O presente

trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o período de frutificação de cambuizeiros

diferenciados pela coloração dos frutos (laranja ou roxa) e os atributos de qualidade dos frutos.

Foram avaliados 20 cambuizeiros sete dias após a antese (DAA), dando início à frutificação.

Os indivíduos são oriundos da Reserva Particular do Patrimônio Natural (RPPN) do Caju,

Campo Experimental da Embrapa Tabuleiros Costeiros, Itaporanga d’Ajuda, Sergipe, Brasil.

Avaliou-se o peso, comprimento, largura, número de sementes, pH, sólidos solúveis, acidez

titulável e o teor de vitamina C. A estiagem favoreceu a frutificação, enquanto o período

chuvoso proporcionou o amadurecimento dos frutos. Houve heterogeneidade no

amadurecimento dos dois tipos de cambuizeiro. O maior pico de amadurecimento ocorreu aos

63 DAA (83,2 % dos frutos de coloração laranja e 68,3 % dos frutos de cor roxa. Os frutos

roxos apresentaram atributos físicos superiores, entretanto a polpa dos frutos laranja destacou-

se pelo maior conteúdo de ATT. Ambos os tipos de frutos apresentam características

potenciais para exploração e uso.

Palavras-chave: Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg, frutas nativas, recursos

genéticos, pós-colheita.

27

ABSTRACT

Title: Frutification and quality attributes of Myrciaria floribunda differentiated by fruit

color

Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg is a fruit tree native of the Atlantic Forest

biome. Its fruits are small, succulents, of orange or purple color. This study aimed to evaluate

the fruiting stages of Myrciaria floribunda differentiated by fruit color (orange or purple) and

the quality attributes of the fruits. Twenty trees were evaluated seven days after the anthesis

(DAA), beginning the fruitification. The individuals come from the Caju Private Natural

Heritage Reserve (RPPN), Experimental Field of Embrapa Coastal Tablelands, Itaporanga

d’Ajuda, Sergipe, Brazil. Weight, length, width, number of seeds, pH, soluble solids, titratable

acidity and vitamin C content were evaluated. Drought favored fruitification while the rainy

season provided fruit ripening. There was heterogeneity in the maturation of both types of the

tree. The highest ripening peak occurred at 63 DAA (83.2 % of the orange-colored fruits and

68.3 % of the purple-colored fruits. The purple fruits had higher physical attributes; however,

the orange fruit pulp stood out by the higher ATT content. Both types of fruit have potential

characteristics for exploration and use.

Key words: Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg, native fruits, genetic resources,

postharvest.

28

5.1. Introdução

A família botânica Myrtaceae apresenta ampla distribuição mundial e ocorre

principalmente em regiões tropicais e subtropicais do mundo, possuindo um centro de

diversidade na América do Sul (SOBRAL et al., 2015). Diversos frutos dessa família são

nativos do Brasil, país que ocupa a terceira posição na produção de frutas do mundo, sendo o

oitavo maior produtor de frutas tropicais (FAO, 2013).

O cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg) é uma frutífera nativa

do Brasil. No Nordeste do país é encontrado no bioma Mata Atlântica, principalmente em

vegetações litorâneas de restinga, sendo facilmente observado nos estados de Sergipe e

Alagoas. A planta de porte arbustivo a arbóreo apresenta frutos pequenos e suculentos, do tipo

baga globosas, glabras e brilhantes, de cor laranja ou roxa quando maduros, ricos em vitamina

C (129,43 mg de ácido ascórbico. 100 g-1) (PINHEIRO et al., 2011).

Os frutos do cambuizeiro possuem excelente sabor e aroma, boa aparência e qualidade

nutritiva, apresentando em média 77,86 % de rendimento da sua matéria fresca (SANTOS,

2010). O seu consumo pode ser in natura, ou devido às suas características físico-químicas,

processados e utilizados na produção de suco, geleias e fermentados (BIASOTO et al., 2011;

RYBKA et al., 2011).

Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg apresenta irregularidade de produção,

já sendo observado na população estudada período de até dois anos consecutivos sem

frutificação. Entretanto, Santos (2018), avaliando a fenologia de frutificação de diferentes

acessos de cambuizeiro em Alagoas, verificou que a frutificação pode ocorrer de duas a três

safras por ano. Assim, de acordo com Sakai (2001), a ocorrência desses eventos e a forma

como ocorrem podem ser críticos para a sobrevivência e o sucesso reprodutivo das plantas.

Em mirtáceas, a heterogeneidade entre plantas de uma mesma espécie quanto ao

período de floração e amadurecimento dos frutos já são constatados, a exemplo da pitangueira

(Eugenia uniflora L.), cerejeira-do-mato (Eugenia involucrata DC.), uvalheira (Eugenia

pyriformis Cambess.), guabirobeira (Campomanesia xantocarpa O. Berg) e o araçazeiro

(Psidium cattleyanum Sabine) (DANNER et al., 2010), bem como o crescimento e

desenvolvimento de frutos como a gabiroba e o cambuí através de análises físico-químicas

(SANTOS et al., 2015; SANTOS et al., 2017).

Nos últimos anos, o número de publicações sobre espécies frutíferas nativas do Brasil

tem aumentado consideravelmente (SANTOS et al., 2017; SANTOS et al., 2017b; BATISTA

et al., 2017), no entanto, estudos sobre a composição físico-química ainda são poucos. O

conhecimento desses atributos pode contribuir para a expansão do consumo e,

consequentemente, da produção de frutos, pois despertam atenção devido ao potencial de

contribuição para aspectos culturais, nutrição e conservação da biodiversidade (NANDAL e

BHARDWAJ, 2014), além de colaborarem significativamente para a geração de renda dos

agricultores familiares, em virtude da demanda crescente por frutos tropicais com novas

opções de sabores e aromas (JAARVERLD et al., 2014).

O cambuizeiro apresenta inúmeros genótipos na natureza com potencialidade de uso,

o que torna importante a caracterização dos atributos de qualidade de seus frutos explorados

exclusivamente pelo extrativismo local.

O presente trabalho foi desenvolvido com objetivo de avaliar o período de frutificação

de cambuizeiros diferenciados pela coloração dos frutos (laranja ou roxa) até o ponto de

colheita, e os atributos de qualidade dos mesmos.

29


5.2.1. Localização da área e coleta do material

Os indivíduos de Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg encontravam-se em

uma população natural, conservada in situ, na Reserva Particular do Patrimônio Natural

(RPPN) do Caju, Campo Experimental da Embrapa Tabuleiros Costeiros (11.116585°S;

37.186742°W), no município de Itaporanga d’Ajuda, SE. A área é típica de restinga, cujo solo

é do tipo espodossolo humilúvico, e clima do tipo tropical úmido, com altas temperaturas e

umidade. A precipitação total é notavelmente dividida em uma estação de inverno chuvosa

entre os meses de abril e julho, e uma estação de verão seca, que atinge do mês de outubro até

janeiro (SEMARH, 2018). A média referente aos dados de precipitação no intervalo dos anos

2000-2018 (até o mês de abril) foi de 1.504,1 mm/ano, segundo dados do pluviômetro da

própria Reserva.

5.2.2. Frutificação

A avaliação da frutificação foi realizada de janeiro a abril de 2018. Foram marcados

20 cambuizeiros adultos e em condições fitossanitárias satisfatórias, sendo 14 deles

identificados pela cor do fruto laranja e 06, pela coloração roxa. Todos os indivíduos estavam

em fase final da inflorescência, dando início à frutificação, caracterizada pelo fim da antese,

ainda sem a confirmação da existência de sementes. Em janeiro, dois ramos foram marcados

em cada planta, com fitas coloridas (Figura 1).

Figura 1. Ramos de cambuizeiro marcados para avaliação da frutificação. Itaporanga

d’Ajuda, SE, 2018. Foto: A.L.S. Nascimento.

Neles, os frutos estavam imaturos, aos sete dias após a antese (DAA). Foram efetuadas

observações semanais organizadas em planilha de campo, calculando-se as porcentagens de

indivíduos em cada estádio de maturação através da classificação ‘verde’, ‘de vez’ e ‘maduro’,

em função dos DAA.

Os dados foram avaliados por estatística descritiva para o acompanhamento do

desenvolvimento dos frutos até o ponto de colheita, comparando os dois tipos de cambuizeiro

observados, de acordo com a coloração dos frutos.

30

5.2.3. Análises físicas e físico-químicas

Os frutos foram coletados diretamente da planta, em março de 2018. Para a realização

das análises físicas foram avaliados 40 frutos de cada coloração – laranja e roxa.

Avaliou-se as características físicas: peso, comprimento, largura e número de sementes

do fruto. O peso foi mensurado por balança digital GEHAKA, modelo B64400 com precisão

de 0,1 g; o comprimento e largura, com auxílio de paquímetro digital, com precisão de 0,01

mm; e o número de sementes por contagem após a despolpa.

Os atributos físico-químicos avaliados foram: a) Sólidos Solúveis (SS), determinados

por refratômetro digital, modelo PAL-1 (Atago Co, Tokyo, Japão), conforme normas da

Associação Oficial de Químicos Analíticos (AOAC, 1992) e expressos em ºBrix; b) Potencial

hidrogeniônico (pH), realizado por meio de potenciômetro eletrônico com adição de cinco

gramas de polpa diluída em 50 mL de água destilada para aferição, conforme AOAC (1992);

c) Acidez Total Titulável (ATT), determinada por titulação manual com NaOH (0,1N) e

solução indicadora de fenolftaleína 1 %, e os valores expressos em porcentagem de ácido

cítrico, conforme metodologia do Instituto Adolfo Lutz (IAL, 2008); d) Vitamina C,

determinada a partir da titulação com solução de Tillmans, de acordo com metodologia

proposta pelo IAL (2008), e os resultados expressos em mg de ácido ascórbico. 100 g-1 de

massa fresca.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado (DIC), com dois

tratamentos e dez repetições para as análises físicas, e dois tratamentos com três repetições

para as análises físico-químicas. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância

pelo teste F, e consideradas diferentes estatisticamente quando o modelo apresentou diferença

a 5 % de probabilidade, utilizando-se o pacote estatístico SAS®.


Os padrões de frutificação do cambuizeiro são considerados sazonais, e as

características de amadurecimento dos frutos variaram de acordo com a coloração observada.

O período de inflorescência ocorreu entre o final do mês de novembro e durante todo o mês

de dezembro de 2017, com baixo índice pluviométrico (39,0 mm). De janeiro a abril de 2018

houve o período de frutificação, com crescentes índices de precipitação pluviométrica ao

decorrer dos meses (43,0; 72,0; 85,0 mm), sendo abril o mês com chuvas mais intensas (179,0

mm).

Na avaliação de frutificação realizada por Santos (2010) em populações nativas de

cambuizeiro no estado de Alagoas, as maiores porcentagens de indivíduos em plena

frutificação (frutos verdes) foram em períodos menos chuvosos, entretanto na estação chuvosa

não houve produção de frutos, semelhante ao presente estudo.

Possivelmente, em consequência da maior incidência de luz, alguns frutos

apresentaram maturação mais rápida, pois a luz solar influencia na pigmentação da epiderme,

porém foi com a crescente presença de chuvas que todos os estádios de maturação se

prolongaram, com um melhor desenvolvimento dos frutos. Os frutos suculentos normalmente

são produzidos na estação chuvosa, quando as condições de clima são favoráveis, estes se

tornam mais atrativos e disponíveis aos frugívoros, favorecendo desta forma a dispersão,

germinação e crescimento de plântulas (MENDES et al., 2011).

Independente da coloração, os frutos foram considerados muito frágeis, desprendiam-

se das plantas com facilidade quando as mesmas eram expostas a fatores abióticos,

principalmente chuvas e ventos. De uma avaliação para outra (sete dias) percebeu-se não

haver uniformidade quanto ao desenvolvimento dos frutos, mesmo com o avanço dos estádios

31

de maturação. Dessa forma, era comum a presença de todos os estádios ‘verde’, ‘de vez’ e

‘maduro’, numa mesma avaliação (Figura 2-A e B).

Figura 2. Ramos de cambuizeiros diferenciados pela coloração dos frutos – laranja (A) ou

roxa (B), com frutos verdes, ‘de vez’ e maduros. Foto: A.V.C. Silva.

Foi possível avaliar a frutificação do cambuizeiro no período proposto. A espécie pode

apresentar instabilidade, já sendo observado nessa mesma população período maior que dois

anos sem frutificar. Do início da marcação, com frutos totalmente verdes, até o ponto de

colheita, levou-se 63 DAA, entretanto, até os 91 DAA houve presença de frutos maduros,

porém em quantidades reduzidas (Figura 3).

A

B

32

Figura 3. Avaliação da frutificação de cambuizeiros diferenciados pela coloração dos frutos – laranja e roxa durante 91 DAA. Foto: A.L.S. Nascimento.

Durante o período de frutificação, os cambuizeiros com frutos de coloração laranja e

roxa apresentaram processo de amadurecimento diferente em todos os estádios de maturação

(Figura 4-A e B).

28 DAA

49 DAA

63 DAA

07 DAA

91 DAA

33

Figura 4. Processo de amadurecimento de frutos com coloração laranja (A) e roxa (B) de

cambuizeiro durante 91 dias após a antese.

A partir dos ramos marcados, aos sete DAA, todos os frutos estavam verdes, ainda sem

a existência de sementes. A frutificação foi constante, e aos 63 e 70 DAA, ainda era possível

observar a presença do estádio ‘verde’ em cambuizeiros com frutos de coloração roxa e

laranja, respectivamente. Aos 28 DAA houve similaridade no amadurecimento, 26,6 % dos

frutos foram considerados ‘de vez’ para cambuizeiros com frutos de coloração roxa, enquanto

os de cor laranja obtiveram 28,2 %. Também nesse período, alguns frutos amadureceram com

maior rapidez (10,8 e 12,2 % para frutos de coloração roxa e laranja, respectivamente). O

maior pico de amadurecimento ocorreu aos 63 DAA (83,2 % dos frutos de coloração laranja

e 68,3 % dos frutos de cor roxa), sendo considerado o melhor período para a colheita dos

frutos. Após o amadurecimento, com o passar dos dias, notou-se perda de água do fruto ainda

ligado ao pedúnculo e a posterior queda. Esse período também encerrou a presença de frutos

verdes aos 91 DAA, entretanto, 21,4 e 33,3 % para frutos de coloração laranja e roxa,

respectivamente, se encontravam totalmente maduros, sem a presença de outros estádios de

maturação.

A heterogeneidade no ciclo de frutificação de plantas da mesma espécie, porém de

tipos diferentes, pode ser um indicativo de variabilidade genética, normalmente encontrada

entre plantas propagadas sexuadamente, como o cambuizeiro. Para Danner et al. (2010), isso

possibilita o planejamento de cruzamentos em programas de melhoramento genético e o

escalonamento da colheita em cultivos comerciais.

Em pitanga (Eugenia uniflora L.), Avila et al. (2009) indicaram maior índice de

amadurecimento dos frutos aos 63 DAA, tempo semelhante ao constatado no presente

trabalho, e por Danner et al. (2010) (63 a 66 DAA) quando avaliaram a fenologia de

frutificação da guabiroba (Campomanesia xantocarpa O. Berg). Cunha et al. (2016)

observaram estádios de maturação mais prolongados para frutos de guabiraba [Campomanesia

aromatica (Aubl.)], onde aos 21 DAA os frutos eram totalmente verdes, ficando maduros aos

88 DAA, assemelhando-se a frutos de mapirunga (Eugenia tinctoria Gagnep).

Os resultados das características físicas de frutos de cambuizeiro com coloração

laranja e roxa foram apresentados na Tabela 1. Não houve diferença significativa apenas para

o número de sementes.

0

20

40

60

80

100

120

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91

(A)

Amadurecimento cambuí de

coloração laranja

VERDE DE VEZ MADURO

0

20

40

60

80

100

120

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91

(B)

Amadurecimento cambuí de

coloração roxa

VERDE DE VEZ MADURO

34

Tabela 1. Características físicas - Peso (g), comprimento (mm), largura (mm) e número de

sementes (média ± erro padrão da média) de frutos de cambuizeiros diferenciados pela coloração

dos frutos – laranja e roxa.

Coloração dos

frutos

Peso Comprimento Largura Nº de sementes

Laranja 0,53 ± 0,14 b 4,09 ± 0,33 b 4,37 ± 0,37 b 1,12 ± 0,33 a

Roxa 0,69 ± 0,16 a 4,47 ± 0,38 a 4,87 ± 0,42 a 1,20 ± 0,41 a

CV% 23,11 7,86 7,74 31,54

P 0,0001 0,0001 0,0001 0,3637

*Médias seguidas de mesma letra nas colunas não diferem significativamente pelo teste F ao

nível de 5% de probabilidade.

Em estudo de polissacarídeos em cambuí, Vriesmann et al. (2004) encontraram frutos

com peso médio de 0,13 g, valor inferior ao obtido no presente trabalho, enquanto Silva et al.

(2012) reportaram valor médio de 0,77 g em avaliação da biometria de frutos da mesma

espécie. Os frutos roxos apresentaram características mais interessantes quanto o maior

rendimento da polpa, provavelmente por existir um grau de variabilidade considerável entre

os materiais genéticos de cambuí. Para Chitarra e Chitarra (2005), frutos mais pesados, e

consequentemente, de maior tamanho, são os mais atrativos aos consumidores.

Em frutos de cambuí, Silva et al. (2012) obtiveram maiores médias de comprimento e

largura dos frutos (9,23 mm e 8,50 mm, respectivamente) quando comparados aos relatados

no presente trabalho. Cosmo et al. (2017) em estudo da morfologia de frutos de Myrceugenia

euosma (O. Berg) D. Legrand, também verificaram medidas superiores, comprimento médio

de 5,7 mm e largura de 5,3 mm, e Araujo et al. (2015) em frutos de murta (Eugenia gracillima

Kiaersk.), 10,13 mm de diâmetro longitudinal e 9,76 mm de diâmetro transversal.

A maioria dos frutos de cambuí apresenta uma semente por fruto, e em alguns casos,

até duas (LORENZI, 2000). O número de sementes não é um indicativo de maior massa, sendo

relatado por Figueiredo et al. (2013), em amora-preta (Rubus spp.), maior número de sementes

e menor massa dos frutos.

Em relação aos atributos físico-químicos avaliados, apenas a ATT diferiu

significativamente para frutos de coloração laranja e roxa (Tabela 2).

Tabela 2. Sólidos Solúveis (SS) (ºBrix), Potencial hidrogeniônico (pH), Acidez Total Titulável

(ATT) (% de ácido cítrico) e Vitamina C (mg de ácido ascórbico. 100 g-1) (média ± erro padrão

da média) de frutos de cambuizeiros diferenciados pela coloração dos frutos – laranja e roxa.

Coloração dos frutos SS pH ATT Vitamina C

Laranja 16,33 ± 1,67 a 3,87 ± 0,31 a 1,60 ± 0,16 a 117,90 ± 3,13 a

Roxa 17,13 ± 0,75 a 4,37 ± 0,12 a 1,09 ± 0,16 b 111,28 ± 7,33 a

CV % 7,54 5,68 11,84 4,92

P 0,4810 0,0582 0,0175 0,2244

*Médias seguidas de mesma letra nas colunas não diferem significativamente pelo teste F ao

nível de 5% de probabilidade.

O valor médio superior a 9 °Brix é bastante desejado do ponto de vista comercial

(MENEZES et al., 2001), sendo a quantidade presente nos frutos influenciada pelo estádio de

maturação, que tende a aumentar devido à biossíntese ou à degradação de polissacarídeos

(MELO et al., 2013). Em avaliação pós-colheita de frutos de cambuí, Pinheiro et al. (2011)

também encontraram nos frutos de coloração laranja e roxa, valores superiores (12,62 e 16,31

ºBrix). Trabalhando com uvaia (Eugenia uvalha Cambess), Scalon et al. (2004) verificaram

35

6,9 °Brix, e em cambuci (Campomanesia phaea), Bianchini et al. (2016) reportaram variação

nos frutos de 7,30 a 13,30 °Brix.

Em estudo de análise físico-química de Myrcia multiflora (Lam.) DC., espécie

pertencente à família do cambuí, Coutinho et al. (2013) encontraram pH de 3,9, valor

semelhante ao obtido em polpas de frutos laranja, com 3,87. Vriesmann et al. (2004)

obtiveram pH de 4,8, próximo à média de 4,37 apontada em polpas de frutos roxos. Os maiores

valores de polpa ácida foram superiores aos obtidos por Almeida et al. (2018) em estudo das

variedades de jabuticaba (Myrciaria grandifolia e Myrciaria jabuticaba) (3,39 e 3,10,

respectivamente), e Lima et al. (2016), de 3,47 em frutos de gabiroba (Campomanesia

lineatifolia). O pH dos frutos de cambuizeiro estão na faixa ácida dos alimentos (pH ≤ 4,5), o

que afeta a comercialização, entretanto, Silva et al. (2012) sugerem que a alta acidez está

associada a uma maior diluição do produto, o que resulta em um incremento considerável do

rendimento final a nível industrial.

A ATT apresentou resultados superiores aos reportados por Pinheiro et al. (2011), onde

as polpas de frutos laranja e roxos obtiveram 0,97 e 1,00 % de ácido cítrico, respectivamente.

Analisando propriedades físico-químicas de frutos de jabuticaba nos estádios intermediário e

maduro, Seraglio et al. (2018) encontraram valores inferiores (0,22 e 0,19 g de ácido cítrico.

100 g-1, respectivamente). Em avaliação da polpa in natura de frutas nativas como camu-camu

(Myrciaria dubia), Freitas et al. (2016) apontaram valores superiores (4,97 % de ácido cítrico).

Os ácidos orgânicos presentes nos frutos influenciam o sabor, o odor, a cor, a

estabilidade e a manutenção da qualidade. Variam de acordo com a espécie e o seu conteúdo

diminui com o amadurecimento na maioria dos frutos tropicais (LIMA et al., 2015). Produtos

mais ácidos são naturalmente mais estáveis quanto à deterioração e a proporção relativa de

ácidos orgânicos presente em frutas e vegetais varia com o grau de maturação e com as

condições de crescimento (CECCHI, 2003).

O teor de vitamina C obteve média de 111,28 ± 7,33 e 117,90 ± 3,13 mg de ácido

ascórbico. 100 g-1 para frutos roxos e laranja, respectivamente, valores semelhantes aos

encontrados por Silva et al. (2018) em frutos de uvaia (Eugeniapyriformis Cambess) (116,51

mg de ácido ascórbico. 100 g-1). Em cambuí, Pinheiro et al. (2011) obtiveram resultados

divergentes, relatando 170,21 mg de ácido ascórbico. 100 g-1 nos frutos roxos).

O teor de ácido ascórbico em frutos de cambuí não é tão alto quando comparado a

outros frutos com escala comercial, a exemplo do camu-camu (Myrciaria dubia) (1.882 mg

de ácido ascórbico. 100 g-1) e da acerola (Malpighia emarginata) (1.357 mg de ácido

ascórbico. 100 g-1) (RUFINO et al., 2010), entretanto fica comprovado o considerável teor de

vitamina C da espécie, característica potencialmente funcional à dieta humana.

5.4. Conclusões

O período de estiagem foi propício à frutificação, enquanto o período chuvoso

proporcionou o amadurecimento dos frutos para os dois tipos da planta. Houve

heterogeneidade no processo de frutificação dos cambuizeiros de acordo com a coloração dos

frutos. O maior pico de amadurecimento ocorreu aos 63 DAA (83,2 % dos frutos de coloração

laranja e 68,3 % dos frutos de cor roxa).

Os frutos roxos são maiores e mais pesados, entretanto a polpa dos frutos laranja

destacaram-se pelo maior conteúdo de ATT. Frutos de ambas as colorações apresentam

características potenciais para exploração e uso.

36

5.5. Referências

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39

6. ARTIGO 3: PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DE

Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg UTILIZANDO ÁGUA COMO

SOLVENTE EXTRATOR E SUA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Periódico a ser submetido: Food Chemistry

RESUMO

Os frutos de Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg diferenciados pela coloração

laranja e roxa foram estudados a partir da comparação da eficiência da extração por maceração

e por líquido pressurizado (ELP), utilizando água como solvente. Determinou-se o rendimento

global, compostos fenólicos e a capacidade antioxidante. O conteúdo de compostos fenólicos

e flavonoides totais foram quantificados por espectofotometria, o perfil fitoquímico por

UPLC-QTOF-MSE e a atividade antioxidante pelo método DPPH, também por

espectofotometria. O método de extração por maceração apresentou melhor rendimento global

dos extratos de frutos roxos, com 47,83 ± 3,74 %. Todos os extratos analisados obtiveram

excelente conteúdo de compostos fenólicos, em especial, os de frutos roxos (4212,96 ± 180,55

e 3870,37 ± 353,09 mg AGE/100 g obtidos por maceração e ELP, respectivamente). O

conteúdo de flavonoides também foi bastante considerável, a ELP obteve 693,16 ± 180,09 e

770,08 ± 103,62 mg RE/100 g em extratos de frutos roxos e laranja, respectivamente. Não

houve diferença entre os perfis fitoquímicos, sendo identificados derivados de ácido cafeico,

ácido elágico, derivados de ácido elágico e elagitaninos. Os extratos de frutos de coloração

roxa apresentaram maior atividade antioxidade (124,6 ± 9,52 µg/mL) quando extraídos por

maceração.

Palavras-chave: Myrtaceae, flavonoides, DPPH, perfil fitoquímico.

40

ABSTRACT

Title: Extraction process of phenolic compounds of Myrciaria floribunda (West ex Willd.)

O. Berg using water as extraction solvent and their antioxidant activity

The fruits of Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg differentiated by orange and

purple color were studied after comparing the efficiency of the extraction by maceration and

pressurized liquid (PLE), using water as solvent. The overall yield, phenolic compounds and

antioxidant capacity were determined. The content of phenolic compounds and total

flavonoids were quantified by spectrophotometry, the phytochemical profile by UPLC-

QTOF-MSE, and the antioxidant activity by the DPPH method, also by spectrophotometry.

The maceration extraction method presented a better overall yield of purple fruit extracts, with

47.83 ± 3.74 %. All the analyzed extracts showed excellent content of phenolic compounds,

especially those from purple fruits (4212.96 ± 180.55 and 3870.37 ± 353.09 mg EAG/100 g

obtained by maceration and PLE, respectively). The content of flavonoids was also quite

considerable, the PLE obtained 693.16 ± 180.09 and 770.08 ± 103.62 mg ER/100 g in purple

and orange fruit extracts, respectively. No difference was found between the phytochemical

profiles, being identified derivatives of caffeic acid, ellagic acid, ellagic acid derivatives and

ellagitannins. The extracts of purple fruits showed higher antioxidant activity (124.6 ± 9.52

μg/mL) when extracted by maceration.

Key words: Myrtaceae, flavonoids, DPPH, phytochemical profile.

41

6.1. Introdução

O cambuizeiro (Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg) é uma planta frutífera

de porte arbustivo a arbóreo, nativa do Brasil, pertencente à família Myrtaceae. Seus frutos

são globosos, de coloração laranja ou roxa quando maduros, podendo ser consumidos in

natura, ou processados na produção de sucos, geleias e fermentados. Ricos em vitamina C

(129,43 mg de ácido ascórbico. 100 g-1) (PINHEIRO et al., 2011), os frutos se destacam pelo

significativo teor de compostos fenólicos como antocianinas e flavonoides, além de

apresentarem excelente potencial antioxidante (SANTOS et al., 2017).

Entre a flora nativa brasileira, a família Myrtaceae destaca-se por apresentar espécies

que produzem frutos pequenos, consumidos apenas por populações locais e alguns animais

frugívoros, sendo encontradas desde o Amazonas até o Sul do país (SANTOS et al., 2007). A

caracterização de frutas nativas tem atraído a atenção da comunidade científica e da população

em geral juntamente com a quantificação dos seus compostos bioativos ou fitoquímicos,

essenciais para a compreensão do valor nutricional e de propriedades funcionais associadas

aos efeitos benéficos à saúde humana (CANUTO et al., 2010; SUCUPIRA et al., 2012).

A quantidade de substâncias bioativas dos frutos de cambuí tem sido superior a

encontrada em frutas como a uva utilizada na produção de suco e vinho (BIASOTO et al.,

2011). Ácidos fenólicos, como o ácido gálico e elágico estão presentes na polpa liofilizada de

cambuí, e podem ser utilizado como fonte de rutina (78,56 mg. 100 g-1) (OLIVEIRA et al.,

2018). Muitas propriedades medicinais têm sido atribuídas a folhas, flores e caules do

cambuizeiro, como atividade antimicrobiana, antitumoral e anticolinesterásica (APEL et al.,

2006; RAMOS et al., 2010; TIETBOHL et al., 2012).

Os compostos fenólicos inibem a peroxidação lipídica e o dano ultravioleta nos tecidos

vegetais (LEE & GOULD, 2002), ocorrendo principalmente como conjugados solúveis e

formas insolúveis, covalentemente ligados a frações de açúcares ou com estruturas da parede

celular (ACOSTA-ESTRADA et al., 2014). Dentre os compostos fenólicos mais encontrados

nos vegetais estão os flavonoides, representados por diferentes classes de substâncias. Esses

compostos apresentam atividade antioxidante, anti-inflamatória e anticancerígena, além de

atuarem em processos reguladores do metabolismo (CHITARRA & CHITARRA, 2005), a

exemplo da redução de marcadores de inflamação presentes em indivíduos obesos, como

citocinas e proteínas (COELHO et al., 2013; ALAM et al., 2013).

A ação antioxidante representa a propriedade mais relevante dos compostos fenólicos.

Estudos demonstram seu potencial no combate aos radicais livres, que causam estresse

oxidativo e, consequentemente, danos a tecidos e biomoléculas do organismo humano,

prevenindo a ocorrência de doenças não transmissíveis, como as crônico-degenerativas

(LAGHARI et al., 2011; ALMEIDA et al., 2011).

Esses compostos bioativos podem ser obtidos por diferentes técnicas de extração,

como a maceração e Extração por Líquido Pressurizado (ELP). Devido ao baixo custo e

simplicidade, a maceração é comumente utilizada na obtenção de extratos. O processo é

realizado sob baixa pressão utilizando agitação para melhorar sua capacidade de extração

(AZMIR et al., 2013). A ELP é considerada um processo promissor na obtenção de compostos

naturais (GARMUS et al., 2015) devido à otimização de tempo, e o efeito da alta pressão que

favorece uma maior pentração da matriz vegetal, e com isso é permitido uma maior capacidade

de extração de compostos bioativos (ENG et al., 2007).

As vantagens dessas técnicas incluem o alto rendimento de extração e o uso de

solventes seguros, como o etanol e a água, ou a mistura de ambos (HERRERO et al., 2013).

A água como solvente é isenta de danos ao meio ambiente por não ser tóxica, não corrosiva,

não inflamável, além de naturalmente abundante e disponível a baixo custo (FLÓREZ et al.,

2015; PLAZA & TURNER, 2015).

42

Desta forma, o presente trabalho foi desenvolvido para comparar a eficiência de

diferentes métodos de extração, utilizando água como solvente para obtenção do rendimento

global, quantificar os compostos fenólicos e avaliar a sua capacidade antioxidante presente

em extratos de frutos de cambuizeiros diferenciados pela coloração laranja e roxa.


6.2.1. Material vegetal

Frutos maduros de cambuizeiros diferenciados pela coloração – laranja ou roxa - foram

coletados em população nativa localizada na Reserva Particular do Patrimônio Natural

(RPPN) do Caju, pertencente ao Campo Experimental da Embrapa Tabuleiros Costeiros, no

município de Itaporanga d’Ajuda, SE (lat -11.116585º, log -37.186742º), em março de 2018.

Os frutos obtidos foram devidamente identificados e mantidos em estufa com

circulação forçada de ar a 60 ºC por 10 dias até obterem peso constante. Depois disso, foram

triturados em liquidificador industrial de alta rotação e peneirados a uma granulometria de 8

a 16 mesh. As amostras foram transportadas para o Núcleo de Estudos em Sistemas Coloidais

(NUESC) do Instituto de Tecnologia e Pesquisa/Universidade Tiradentes, em Aracaju - SE, e

armazenadas em refrigerador a 4ºC e ao abrigo de luz até o momento das extrações.

6.2.2. Reagentes e padrões

Os principais reagentes e solventes utilizados para o presente estudo foram: Metanol;

Acetonitrila; Carbonato de Cálcio; PA anidro (Dynamics®); Dimetilsulfóxido PA (Synth®),

radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilil DPPH (Sigma®); Folin Ciocauteau (Dynamics®); Acetato

de Potássio (Synth®); Nitrato de alumínio PA (Synth®); Ácido fórmico ≥ 95% (Sigma -

Aldrich®); Ácido Gálico monohidratado PA (Neon®); Rutina hidratada ≥ 94% (Sigma -

Aldrich®) e Água destilada.

6.2.3. Extração convencional sob pressão atmosférica (maceração)

As extrações por maceração foram realizadas utilizando aproximadamente 2 g dos

frutos secos de cambuí, e 60 mL de água destilada como solvente extrator sob a temperatura

controlada de 60 ºC. Todas as extrações foram realizadas com agitação magnética durante 60

min, e posteriormente, a mistura extrato/solvente filtrada em uma peneira com a granulometria

de 16 mesh (Séries de peneira Tyler, Bertel, Brasil). As amostras foram identificadas como

MCL (Maceração Cambuí Laranja) e MCR (Maceração Cambuí Roxo).

6.2.4. Extração por líquido pressurizado

As extrações por líquido pressurizado foram realizadas em uma célula extratora de aço

inoxidável com volume interno de 22 mL, ligado a uma bomba de deslocamento positivo

(Série III, Lab Aliança, EUA) para pressurização do solvente ao extrator. A temperatura da

extração foi controlada por banho termostático de recirculação (Q-214 M2, QUIMIS, Brazil).

Os Termopares (J-type, Salcas, Brazil), o transdutor de pressão (5436 Würenlos, Controlo

Huba, Suíça) e os indicadores universais (N1500, Novus, Brazil) completaram a unidade

experimental (JESUS et al., 2013). Para a realização de cada extração, 2 g de amostra seca

vegetal foram utilizadas. A água destilada foi utilizada como solvente, sendo a temperatura e

pressão fixa de 60 °C e 100 bar, com um fluxo constante de 1 mL/min-1. As amostras foram

43

identificadas como ELPCL (Extração Líquido Pressurizado Cambuí Laranja) e ELPCR

(Extração Líquido Pressurizado Cambuí Roxo).

6.2.5. Determinação de compostos fenólicos totais

Os compostos fenólicos dos extratos de cambuí foram estimados usando o método

colorímetro com Folin-Ciocalteu. Em um tubo de ensaio foi adicionado 0,5 mL de extrato (a

partir de uma solução estoque de 100 ppm diluído em metanol) com 0,5 mL de água destilada

e 2,25 mL de Folin-Ciocalteu (7 % m/v) e 1,75 mL de carbonato de sódio (7,5 % m/v).

Posteriormente, a solução foi incubada a 45 ºC por 20 min e mantida 10 min à temperatura

ambiente para leitura a 765 nm no espectrofotômetro. O ácido gálico foi usado como padrão

para a curva de calibração (5-140 μg/mL) e a concentração de compostos fenólicos foi

expressa como miligrama de ácido gálico equivalente por grama de extrato (mg AGE/100 g).

6.2.6. Determinação de flavonoides totais

O total de flavonoides foi quantificado por método colorimétrico usando solução de

nitrato de alumínio 10 % (m/v). Utilizou-se 0,5 mL da solução dos extratos (concentração dos

extratos) de cambuí misturado a uma solução de 0,1 mL de nitrato de alumínio a 10 % (m/v)

e 0,1 mL de acetato de potássio a 1 M. O volume final foi completado com 4,3 mL de metanol.

As amostras foram homogeneizadas a temperatura ambiente, e as leituras realizadas na

absorbância de 425 nm em espectrofotômetro (Synergy HT, BioTek, EUA). Uma curva de

calibração foi preparada com solução padrão de rutina (5-140 μg/mL) e os valores obtidos

expressos como miligrama de rutina equivalente por grama de extrato (mg RE/100 g).

6.2.7. Análise por UPLC-QTOF-MSE

As análises foram realizadas em cromatógrafo Acquity UPLC (Waters, EUA)

acoplado a espectrômetros de massa Quadrupole e Time-of-Flight (QTOF, Waters). Os

compostos bioativos foram separados utilizando uma coluna Waters Acquity BEH UPLC (150

mm x 2,1 mm I.D., 1,7 µm) a 40 ºC. A fase móvel foi utilizada de forma gradiente,

inicialmente, água com 0,1 % de ácido fórmico (A) e acetonitrila com 0,1 % de ácido fórmico

(B), eluindo com 2 % - 95 % de B (0-15 min); 100 % de B (15,1 a 17 min) e equilibrando com

2 % de B (17,1 a 19,1 min) a um fluxo de 0,4 mL.min-1, e um volume de injeção de 5,0 µL da

amostra. A ionização foi realizada por eletrospray (modo negativo - ESI), adquirida na faixa

de 110-1180 Da, com temperatura da fonte ajustada em 120 °C, temperatura de dessolvatação

a 350 °C, vazão de gás de dessolvatação a 500 Lh-1, extração cone de 0,5 V, e voltagem capilar

de 2,6 kV. A encefalina leucina foi usada como massa de bloqueio. O modo de aquisição foi

o MS. O instrumento foi controlado pelo software Masslynx 4.1 (Waters Corporation)

(SOUSA et al., 2016).

6.2.8. Determinação da atividade antioxidante pelo método DPPH

A determinação da atividade antioxidante por meio do radical DPPH baseia-se na

captura do radical DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) por agentes antioxidantes. A solução

do radical DPPH (60 µM) foi preparada com 2,4 mg de DPPH transferido para balão

volumétrico de 100 mL, completado com metanol, e levado ao ultrassom por 30 min para

completa diluição do reagente. Foram utilizadas 5 concentrações de cada extrato (12,5; 25;

50; 100; 200 µg/mL) a partir de uma solução estoque de 2000 ppm. A partir destas diluições,

colocou-se em tubos de ensaio, 300 µL da respectiva diluição com 2700 µL da solução do

44

radical DPPH. Cada tubo foi agitado em vórtex e após 30 min foi realizada a leitura em

espectrofotômetro (Synergy HT, BioTek, EUA) a 515 nm. O branco utilizado foi 300 µL de

metanol com 2700 µL da solução de DPPH. A atividade antioxidante (AA) foi calculada como

percentagem de inibição ou redução, a partir da seguinte equação (COSTA et al., 2016):

% AA= (𝐴𝑏𝑠𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 − 𝐴𝑏𝑠𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)

𝐴𝑏𝑠𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 × 100

Onde AbsControle é a absorbância do controle e Absamostra é a absorbância do radical na

presença do extrato.

Os resultados foram expressos como IC50 (µg/mL), sendo a quantidade de antioxidante

necessária para reduzir a concentração inicial de ra dicais em 50 %. Os valores de IC50 foram

calculados usando uma curva de regressão não linear do software Prism 5.0.

6.2.9. Análise dos dados

Todas as análises foram realizadas em triplicata. Os dados foram apresentados como

valores de média ± desvio padrão. Para identificar diferenças significativas entre as médias,

foram utilizadas as análises de variância (ANOVA), seguida do teste de Tukey pelo software

GraphPad Prism 5.0. Diferenças entre as médias no nível de 5 % (p<0,05) foram consideradas

significativas.


O rendimento global de extração obtido por maceração foi 47,83 ± 3,74 e 43,66 ± 6,09

% para frutos de coloração roxa e laranja, respectivamente, enquanto a ELP obteve 39,66 ±

1,62 % para frutos laranja e 33 ± 8,44 % para frutos de cor roxa (Figura 1). Esses valores

demonstram que apenas o rendimento global de extratos de frutos roxos apresentou diferença

significativa quanto ao método de extração.

Figura 1. Rendimento Global de extração por maceração e ELP, utilizando extratos de frutos

de cambuí de coloração laranja e roxa.

45

Para o conteúdo de compostos fenólicos totais não houve diferença significativa entre

a ELP e maceração, independente da coloração do fruto (Figura 2).

Figura 2. Conteúdo de compostos fenólicos totais por maceração e ELP, utilizando extratos

de frutos de cambuí de coloração laranja e roxa.

O conteúdo de compostos fenólicos não apresentou diferença estatística em extratos

de frutos roxos (4212,96 ± 180,55 e 3870,37 ± 353,09 mg AGE/100 g pelos métodos de

maceração e ELP, respectivamente). Extratos de frutos laranja obtidos por ELP indicaram

menor conteúdo, 2679,01 ± 161,33 mg AGE/100 g. Esses valores foram superiores aos

encontrados por Rufino et al. (2010) em extratos aquosos da polpa de frutos como jabuticaba

(Myrciaria cauliflora), jambolão (Syzygium cumini) e uvaia (Eugenia pyriformis) (440 ± 9,9;

187 ± 3,8 e 127 ± 3,3 mg AGE/100 g, respectivamente), e por Menezes et al. (2016) em

extratos de polpa de goiaba (Psidium guajava L.), utilizando metanol, e depois acetona como

solventes extratores (55,74 ± 2,23 mg AGE/100 g). Ferreira et al. (2010) avaliando extratos

de amora-preta (Rubus spp.) reportaram 241,7 ± 0,8 mg AGE/100 g utilizando uma mistura

de metanol e água como solvente extrator. Em polpa de mangaba (Hancornia speciosa

Gomes) Lima et al. (2015) obtiveram 490 mg AGE/100 g, utilizando a mistura metanol e água,

e depois acetona e água como solventes extratores.

A diferença dos teores de compostos fenólicos em frutos da mesma espécie, pode em

parte, ser explicada pela existência de compostos de diversas naturezas químicas, que variam

desde substâncias simples a altamente polimerizadas, incluindo diferentes proporções de

ácidos fenólicos, antocianinas, taninos, entre outros. Podem ainda ser encontradas em estado

de complexo com carboidratos, proteínas, ácidos orgânicos e outros componentes das plantas,

formando assim, compostos fenólicos de alto peso molecular (CÔTÉ et al., 2010).

Quanto ao conteúdo total de flavonoides, observou-se que não houve diferença

significativa tanto para os extratos de frutos laranja, quanto para os de frutos roxos nos dois

métodos de extração (Figura 3).

46

Figura 3. Conteúdo de flavonoides totais por maceração e ELP, utilizando extratos de frutos

de cambuí de coloração laranja e roxa.

No entanto, a ELP teve melhor desempenho, com 770,08 ± 103,627 mg RE/100 g

em extratos de frutos laranja, e 693,16 ± 180 mg RE/100 g em extratos de frutos roxos. Na

extração por maceração foram obtidos os conteúdos de 582,05 ± 25,64 e 582,05 ± 76,92 mg

RE/100 g para extratos de cambuí laranja e roxo, respectivamente. Santos et al. (2017)

encontraram em polpa fresca de cambuí roxo 67,46 ± 0,025 mg 100 g utilizando para a

extração uma mistura de etanol e acetona. Em frutos de cambuí com polpa e casca liofilizadas,

Oliveira et al. (2018) obtiveram 78,56 ± 0,01 mg RE/100 g, demonstrando que o conteúdo de

flavonoides se torna maior quando os frutos são extraídos secos. Jemaa et al. (2017) utilizando

metanol como solvente de extração obtiveram em polpa fresca de frutos de rosa mosqueta

(Rosa canina L.) conteúdo de flavonoides de 2,65 mg RE/g.

Através dos cromatogramas (Figura 4) pôde-se observar os picos dos compostos

tentativamente identificados. Os extratos de cambuí não mostraram diferenças visuais quanto

ao perfil fitoquímico, apesar dos diferentes métodos de extração utilizados e coloração de

fruto analisado, provavelmente devido a semelhança na composição química entre os extratos.

47

Figura 4. Cromatograma de extratos de Myrciaria floribunda (West ex Willd.) O. Berg

analisados por UPLC-QToF-MSE: a) MCR (Maceração Cambuí Roxo); b) MCL (Maceração

Cambuí Laranja); c) ELPCR (Extração Líquido Pressurizado Cambuí Roxo); d) ELPCL

(Extração Líquido Pressurizado Cambuí Laranja).

A caracterização dos extratos de cambuí resultou na identificação de diferentes

compostos fenólicos, como derivados de ácido cafeico (ácido mono e dicafeoilquínico), ácido

elágico e seus derivados conjugados, e um elagitanino. Na ausência de padrões, os diferentes

compostos foram confirmados através de análise de alta resolução utilizando o equipamento

UPLC-QToF-MSE, considerando seus íons moleculares, padrões de fragmentação e em

comparação com dados previamente descritos na literatura (Tabela 1).

Tabela 1. Identificação dos compostos em extratos de cambuí por UPLC-QToF-MS. Pico

no.

Rt

Min

[M-H]-

Observado

(m/z)

[M-H]-

Calculado

(m/z)

Íons Produto

(MS/MS)

(m/z)

Fórmula

Molecular

Ppm

(erro)

Compostos

1 2.90 353.0872 353.0873 191 C16H17O9 -0.3 Ácido 5-cafeoilquínico

2 3.71 515.1204 515.1190 353, 317, 191,

173

C25H23O12 2.7 Ácido 4,5-dicafeoilquínico

3 4.15 933.0641 933.0634 915, 631, 300 C41H25O26 0.8 Vescalagina ou isômero

Castalagina

4 4.46 433.0396 433.0304 300 C19H13O12 -2.5 Pentoside de ácido elágico

5 4.50 447.0555 447.0564 300 C20H15O12 -2.0 Ácido elágico raminosídeo

6 4.66 300.9978 300.9984 257, 229 C14H5O8 -2.0 Ácido elágico

7 4.76 617.1133 617.1143 300 C28H25O16 -1.6 Derivado de ácido elágico

8 4.92 631.1295 631.1299 300 C29H27O16 -0.6 Derivado de ácido elágico

A comparação dos padrões de fragmentação e íons moleculares observados com os

descritos na literatura utilizando espectrômetro de massas de alta resolução como o QToF-

MSE, permitem a obtenção de importantes informações estruturais sobre diversos tipos de

compostos químicos, podendo assim tornar possível a identificação estrutural de tais

compostos (GAŠIĆ et al., 2014).

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814613011825#!

48

Os compostos derivados de ácido cafeico, o ácido 5-cafeoilquínico (pico 1) e o ácido

4,5-dicafeoilquínico (pico 2), apresentaram, respectivamente, íons pseudomoleculares em m/z

353 e 515. Nestas análises foram observados íons produtos em m/z 191 para ácido 5-

cafeoilquínico, e m/z 353, 317, 191 e 173 para o ácido 4,5-cafeoilquínico. Estes resultados

estão de acordo com os obtidos por Clifford et al. (2005) em extratos de grãos de café (Coffea

arabica), e frutas do gênero Rubus e Ribes (RUIZ et al., 2015).

Nas condições experimentais utilizadas, o padrão de fragmentação observado para

o pico 3 (íon pseudomolecular em m/z 933 e íons produtos em m/z 915, 631, 300) indicou a

presença do elagitanino vescalagina ou do isômero castalagina, apesar de não permitir a

discriminação entre estes compostos, como apresentado por Fracassetti et al. (2013) em

extratos de camu-camu (Myrciaria dubia) desidratados. Assim, não foi possível determinar

de forma inequívoca o pico 3. São necessárias análises adicionais por Ressonância Magnética

Nuclear (RMN) e/ou comparação com padrões autênticos destes compostos, que ocorrem com

frequência em frutos da família Myrtaceae, como jabuticabas (Myrciaria cauliflora)

(PEREIRA et al., 2017).

A presença do elagitanino vescalagina (ou seu isômero castalagina) foi relatado pela

primeira vez em extratos do fruto de cambuí obtidos das polpas, cascas e sementes por

processos de desidratação em estufa. Os picos 4 (íons pseudomolecular em m/z 433) e 5 (íons

pseudomolecular em m/z 447) apresentaram fragmentos em m/z 300 correspondente ao íon

pseudomolecular do ácido elágico. Estes derivados foram propostos como sendo pentoside de

ácido elágico (4) e ácido elágico raminosídeo (5), já relatados em espécies da família

Myrtaceae, através dos experimentos de alta resolução (QTOF-MS e MS2) e comparação com

os resultados obtidos por Fracassetti et al. (2013), que identificaram derivados do ácido

elágico e elagitaninos em extratos de camu-camu. Neves et al. (2018) encontraram fragmento

semelhante em m/z 299,8, analisando extratos de diferentes espécies de jabuticaba (Plinia

spp.).

Através dos íons pseudomoleculares e seus fragmentos, foi possível sugerir a

presença do ácido elágico (pico 6), que apresentou um íon pseudomolecular em m/z 300 e

fragmentos em m/z 257 e 229, característicos de ácido elágico como observado por Ribeiro et

al. (2014) em extratos da polpa e casca de araçá-vermelho (Psidium cattleianum), por

Djoukeng et al. (2007) em extratos de Syzygium guineense, bem como Fracassetti et al. (2013).

Além disso, foram detectados dois derivados de ácido elágico (picos 7 e 8), que

apresentaram íons pseudomoleculares em m/z 617 (7) e m/z 631 (8), que produziram

fragmentos em m/z 300. Entretanto, não foi possível estabelecer claramente a identidade

química destes compostos por informações insuficientes fornecidas pelo padrão de

fragmentação. Em estudo conduzido por Reynertson et al. (2008), o ácido elágico também foi

encontrado em onze dos quatorze frutos comestíveis de Myrtaceae analisados, o que

demonstra a abundância deste ácido em muitos frutos desta família.

Ao avaliar a capacidade antioxidante dos extratos dos frutos de cambuí com

diferentes colorações pela captura do radical DPPH, a maior capacidade antioxidante foi

revelada em extratos de frutos roxos provenientes da maceração (124,6 ± 9,52 µg/mL),

enquanto que os extratos de frutos laranja adquiridos pelo mesmo método de extração

apresentaram menor desempenho quanto a capacidade antoxidante, sendo necessário 188,4 ±

15,30 µg/mL para reduzir a atividade do radical livre em 50 % (Figura 5).

49

Figura 5. Capacidade antioxidante pelo método DPPH IC50 por maceração e EPL, utilizando

extratos de frutos de coloração laranja e roxa.

A ELP não diferiu estatisticamente em frutos de colorações distintas, com 145,16 ±

22,74 e 158,46 ± 7,61 µg/mL em extratos de frutos laranja e roxos, respectivamente. Menezes

et al. (2016) encontraram o valor médio de 131,5 ± 12,1 µg/mL avaliando polpa de goiaba

(Psidium guajava L.). Em extratos de frutos de cambuí com coloração roxa, Santos et al.

(2017) obtiveram 41,5 g fruta/g DPPH, enquanto em polpa liofilizada, Oliveira et al. (2018)

reportaram 85,68 ± 1.10 g.g DPPH.

6.4. Conclusão

O método de extração por maceração apresentou melhor rendimento global dos

extratos de frutos roxos, com 47,83 ± 3,74 %. Todos os extratos analisados obtiveram

excelente conteúdo de compostos fenólicos, em especial, os de frutos roxos (4212,96 ± 180,55

e 3870,37 ± 353,09 mg AGE/100 g obtidos por maceração e ELP, respectivamente). O

conteúdo de flavonoides também foi bastante considerável, a ELP obteve 693,16 ± 180,09 e

770,08 ± 103,62 mg RE/100 g em extratos de frutos roxos e laranja, respectivamente.

O cromatograma UPLC-QToF obtidos a partir dos extratos preparados por

diferentes métodos de extração não apresentaram perfis fitoquímicos distintos, provavelmente

devido a semelhança na composição entre os extratos. Através das análises por UPLC-QToF-

MSE foi possível a identificação de diferentes compostos fenólicos: dois derivados de ácido

cafeico (ácido 5-cafeoilquínico e ácido 4,5-dicafeoilquínico), ácido elágico, pentoside de

ácido elágico e ácido elágico raminosídeo. Adicionalmente, foi possível sugerir a presença de

um elagitanino (vescalagina ou o isômero castalagina) e dois derivados de ácido elágico

conjugado. Os extratos de frutos de coloração roxa apresentaram maior atividade antioxidade

(124,6 ± 9,52 µg/mL) quando extraídos por maceração.

6.5. Referências

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53

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A diversidade genética entre os cambuizeiros avaliados foi alta, entretanto, não foi

encontrada uma marca molecular específica que caracterize a coloração laranja ou roxa dos

frutos.

O comportamento de amadurecimento dos frutos das duas colorações deverá ser

complementado por estudos mais aprofundados, por meio de avaliação da fenologia de

floração e frutificação, constatando desta forma, se as características descritas se reproduzem

ao longo do tempo, pois essas informações são fundamentais para o conhecimento da

diversidade genética e conservação do cambuizeiro.

Os frutos roxos são maiores e mais pesados, entretanto, frutos de ambas as colorações

apresentam características potenciais para exploração e uso.

Quando extraídos, os extratos dos frutos apresentaram melhor rendimento global por

maceração. Entretanto, a ELP obteve destaque na obtenção dos conteúdos de compostos

fenólicos e flavonoides totais. Não houve diferença entre os perfis fitoquímicos em relação

aos dois métodos de extração, sendo identificados derivados de ácido cafeico, derivados de

ácido elágico e elagitaninos. Os extratos também apresentaram excelente capacidade

antioxidante.

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