Aliny Antunes Barbosa Lobo Ladd Mecanismos de proliferação neuronal pós-natal no gânglio cervical cranial

de preás (Galea spixii spixii) Wagler, 1831. Neurogênese x diferenciação neuronal tardia.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências

Departamento: Cirurgia Área de concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres Orientador: Prof. Dr. Romeu Rodrigues De Souza

São Paulo 2009

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.2157 Ladd, Aliny Antunes Barbosa Lobo FMVZ Mecanismos de proliferação neuronal pós-natal no gânglio cervical cranial

de preás (Galea spixii spixii) Wagler, 1831. Neurogênese x diferenciação neuronal tardia / Aliny Antunes Barbosa Lobo Ladd. – São Paulo : A. A. B. L. Ladd, 2009.

75 f. : il.

Dissertação (mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Cirurgia, 2009.

Programa de Pós-Graduação: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres.

Área de concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres.

Orientador: Prof. Dr. Romeu Rodrigues De Souza. 1. Gânglio cervical cranial. 2. Preás. 3. Estereologia. 4. Maturação.

5. Envelhecimento. I. Título.

Mecanismos de proliferação neuronal pós-natal no gânglio cervical cranial

de preás (Galea spixii spixii) Wagler, 1831. Neurogênese x diferenciação neuronal tardia.

Esta Dissertação foi desenvolvida no Laboratório de Estereologia Estocástica

e Anatomia Química (L.S.S.C.A.) do Departamento de Cirurgia da Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo e financiada com

Bolsa Mestrado pela Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de São Paulo

(FAPESP).

São Paulo 2009

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: LADD, Aliny Antunes Barbosa Lobo Ladd Título: Mecanismos de proliferação neuronal pós-natal no gânglio cervical

cranial de preás (Galea spixii spixii) Wagler, 1831. Neurogênese x diferenciação neuronal tardia.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências

Data: ______ /______/______

Banca Examinadora

Prof. Dr. _____________________________Instituição: ________________

Assinatura: __________________________Julgamento: ________________

Prof. Dr. ____________________________ Instituição: _________________

Assinatura: __________________________Julgamento: _________________

Prof. Dr. ____________________________ Instituição:__________________

Assinatura: _________________________ Julgamento:_________________

DEDICATÓRIAS

DEDICATÓRIAS

Dedico esta etapa da minha vida, representada por este trabalho, aos meus pais, Adelson Antunes Barbosa e Ilma Gomes J. Barbosa, pois sempre disseram: “você vai conseguir; nós confiamos em você”. Vocês dois são o meu grande orgulho; são exemplos de perseverança, honestidade e amor. Tudo que fazem por mim é muito mais do que qualquer filho no mundo pode querer. Aos meus irmãos, Alym Antunes Barbosa e Alisson Antunes Barbosa, por serem meus amigos e por dedicarem a mim os mais fraternos sentimentos. Nós somos uma família e exemplo da nossa união é que fazemos com que a nossa distância seja somente física. Vocês me apoiam incondicionalmente e vão estar eternamente em tudo o que eu fizer.

Dedico igualmente este trabalho ao Fernando Vagner Lobo Ladd, meu cúmplice, marido e companheiro em tudo que faço. Seu apoio é essencial. Sem você, as páginas da minha história não teriam aventura; com você, eu nunca me sinto sozinha. Por isto, saiba que... “Eu gosto de você, e gosto de ficar com você. Meu riso é tão feliz contigo. O meu melhor amigo é o meu amor.” Marisa Monte

AGRADECIMENTOS

AGRADECIMENTOS

Durante a minha vida, lutei diariamente e, durante este

processo, percorri caminhos tortuosos, com espinhos e cheios de

pedras; sofri derrotas, decepções e, em vários momentos, até

acreditei que não seria possível. Entre tantas lutas e lições,

aprendi que às vezes conquistamos o que não estava nos planos

iniciais. Aprendi que é preciso mudar de ideia, mudar de

objetivo, que é preciso simplesmente mudar... E que em toda

conquista existe um fator que se chama TEMPO... Ele é um

professor... Nos ensina a curar as feridas, a superar desafios, a

ter saudade de quem está longe e a valorizá-los. Ele nos faz

esperar para colher o fruto com a maturidade certa, nos

proporciona conquistar o que com a nossa falta de experiência

acreditamos não ser importante, mas que é imprescindível em

qualquer conquista, a SERENIDADE... E faz com que cada luta

dure o tempo certo para conquistarmos humildade suficiente

para não acreditarmos que realizamos algo sozinho...

Por isto, neste momento, é TEMPO de agradecer...

“Para os crentes, Deus está no princípio das coisas. Para os cientistas, no final de toda reflexão.”

Max Planck

Agradeço a DEUS por me iluminar e proteger; por minha família e

por ter colocado na minha vida as oportunidades que me trouxeram até

aqui...

“Se eu vi mais longe, foi por estar de pé sobre ombros de

gigantes.” Isaac Newton

Ao Prof. Dr. Antonio Augusto Coppi Ribeiro, agradeço de forma

especial pelo constante incentivo, por acreditar na minha capacidade, por

lapidar as minhas qualidades, por corrigir os meus erros. Pela coragem de

ousar trabalhar com novas ideias e conceitos, correndo os riscos inerentes

a esta atitude. Por ser um interlocutor interessado em me ajudar com as

minhas inquietações. A você, não só agradeço, dedico admiração por todo

seu brilhantismo acadêmico... É sob sua tutela que conquistei este título.

“Nenhum de nós é tão inteligente quanto todos nós juntos.”

Warren Bennis

Agradeço aos meus colegas de Laboratório, Fernando Ladd,

Andrea Almeida, Eliane Muniz, Silvio Gomes, Luciana Abraão,

Demilto Yamaguchi, Felipe Oliveira, Tais Sasahara, Fernanda Vieira

e Ana Paula Moura, por me aturarem nos meus momentos de stress,

por aprendermos a trabalhar em grupo, nos respeitando com as nossas

excentricidades. Pela convivência mínima de 40h semanais, que tanto

contribuiu para o meu desenvolvimento profissional e pessoal pelo

exercício diário da paciência.

Em especial, agradeço ao Silvio Gomes, Luciana Abrahão por

toda a animação que a presença de vocês causa no ambiente. Estes

momentos foram e são importantes para descontrairmos.

Deixo um abraço em forma de agradecimento a Eliane Muniz, com

seu jeito simples você conquistou seu espaço, com a sua determinação

conquistou o meu respeito. Você é muito batalhadora, continue assim.

Obrigada por toda ajuda e estímulo.

Agradeço ao Prof. Moacir Franco de Oliveira pela doação dos

animais que foram objeto desta pesquisa.

Agradeço a Profa. Dra. Julia Maria Matera por todo apoio

institucional e pessoal, sem os quais eu não teria concluído este mestrado.

Ao Prof. Dr. Romeu Rodrigues de Souza, que me forneceu,

institucionalmente, a legalidade de ser matriculada. Muito obrigada!

Aos funcionários, aos quais não pretendo nomear para não ser

indelicada ao deixar de citar algum. O meu profundo agradecimento a

todos pela contribuição, seja ela de que forma for.

Agradeço a FAPESP pelo apoio financeiro que ajudou na realização

desta pesquisa.

“Quem luta contra nós reforça os nossos nervos e aguça as nossas

habilidades. O nosso antagonista é quem mais nos ajuda.” Edmund Burke

Apesar de todas as dificuldades, agradeço também à coordenação

do Curso de Pós-graduação, por estimular minha formação politizada,

que me despertou o interesse por leis, direitos e deveres de um pós-

graduando.

“Eu aprendi que para se crescer como pessoa é preciso me cercar de gente mais inteligente do que eu”.

William Shakespeare

Agradeço, de forma carinhosa, a Andréia Almeida. Orgulho-me

muito de ter sido merecedora de tão grande confiança, apoio, amizade e

de compartilhar com você interesses comuns que nos uniram ainda mais.

Agradeço e deixo um abraço às minhas amigas, Elizete Lacerda

(Ely), Maria de Lurdes (Malu) e Berenice Raquel (Berê). Vocês três foram

uma das minhas fontes de força aqui em São Paulo... São exemplos de

mulheres heroínas, que dedicaram a mim o carinho e companheirismo de

forma gratuita. Conquistei um bem precioso com vocês, a amizade.

À minha amiga e primeira professora de anatomia, Rosimeire

Alves da Silva. Você me despertou para o mundo da ciência, me ensinou

o valor da ética, me educou para ser uma mulher e uma profissional de

respeito.

“A verdadeira família é aquela unida pelo espírito e não pelo sangue.”

Luiz Gasparetto

Às meninas da minha vida, Franciely (Fran), Geovana (BB), Ana

Carolina (Aninha), Emanuely (Manu), Emily (Porpeta), que despertam

sentimentos que até o nascimento de vocês, eram por mim

desconhecidos.

À minha família-amiga de Anápolis, Goiás, Adão Ladd, Maria

Celina, Frederico Ladd. Obrigada por todo amor, apoio e incentivo.

Às minhas “irmãs” e amigas, Fabrícia e Emiliane, por cuidarem da

“nossa” família na minha ausência.

Aos meus avós, Jason e Natalina; Elza e José (in memória), que

acreditaram em mim...

À madrinha Eliane, a Deucelina (Morena) e Edésia por todo

incentivo e apoio.

De forma geral, agradeço a todos de Goiânia, Goiás, que choram,

até hoje, com a minha partida e que se alegram todas as vezes com a

minha chegada.

"...não há coisa mais difícil de se

fazer, mais duvidosa de se alcançar,

ou mais perigosa de se manejar do

que ser o introdutor de uma nova

ordem, porque quem o é, tem por

inimigos todos aqueles que se

beneficiam com a antiga ordem..."

Maquiavel, O príncipe. .

RESUMO

LADD, A. A. B. L. Mecanismos de proliferação neuronal pós-natal do gânglio cervical cranial de preás (Galea spixii spixii) Wagler, 1831. Neurogênese x diferenciação neuronal tardia. [Mechanisms of post-natal neuronal proliferation in the cranial cervical ganglion of preás (Galea spixii spixii) Wagler, 1831. Neurogenesis vs. late neuronal differentiation ]. 2009. 75f Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009

Neste estudo, foram abordados os aspectos quantitativos do gânglio cervical cranial

(GCC) esquerdo de preás (Galea spixii spixii) machos, oriundos do criatório da

Universidade Federal Rural do Semi-Árido Nordestino de Mossoró-RN. Os seguintes

parâmetros foram estimados: volume do GCC, número total e tamanho dos

neurônios (uni e binucleados) durante dois períodos do desenvolvimento pós-natal

(maturação e envelhecimento). Para tanto, utilizamos quatro grupos etários distintos

de animais: neonatos, jovens, adultos e senis. Após a eutanásia dos animais, os

GCCs foram fixados (perfusão sistêmica) com solução de formoldeído (4%) em PBS,

embebidos em solução de ágar (10%) e seccionados sistemática, uniforme e

aleatoriamente, aplicando-se o princípio de amostragem e contagem do fractionator.

Os principais resultados desta pesquisa foram: houve diferença significativa entre os

grupos etários para os parâmetros: Peso Neonato: 0,00056 ; Jovem: 0,00084;

Adulto: 0,00116; Senil: 0,00118. Comprimento Neonato: 1,294 ; Jovem: 2,076;

Adulto: 2,304; Senil: 2,082. Largura Neonato: 0,842; Jovem: 1,028; Adulto: 1,062;

Senil: 1,174. Volume ganglionar Neonato: 0,34 mm3 ; Jovem: 0,30 mm3; Adulto: 0,39

mm3; Senil: 0,63 mm3 e Volume neuronal médio de neurônios uninucleados Neonato:

2916,90 mm3 ; Jovem: 3550,00 mm3; Adulto: 7409,00 mm3; Senil: 6701,00 mm3. As

principais conclusões deste estudo foram: (i) peso, comprimento e largura do GCC

apresentaram aumento significativo de 185%, 60% e 79% respectivamente, durante

o período de maturação, enquanto durante o período de envelhecimento, o peso do

GCC apresentou queda de 33%, o comprimento um pequeno decréscimo de 10%,

entretanto a largura, durante este mesmo período, apresentou um aumento

progressivo de mais de 10%, tais alterações relacionadas com a idade refletiram no

volume ganglionar, causando hipertrofia; (ii) Essa hipertrofia do GCC de preás é

secundária ao desenvolvimento pós-natal (maturação e envelhecimento),

aumentando em 85%, acompanhado por um aumento alométrico, da ordem de 6

vezes em relação à massa corporal, aproximadamente 622%; (iii) Há hipertrofia dos

neurônios uninucleados que é secundária ao desenvolvimento pós-natal do GCC de

preás, aumentando em 154% durante o período de maturação com uma pequena

queda de 10% durante o envelhecimento. Finalmente, sugere-se que estudos

futuros possam investigar se o tamanho dos territórios de inervação destes gânglios

pode desencadear mudanças na micro e macroestrutura dos mesmos, incluindo a

possibilidade de ocorrência de neurogênese, que seria estudada por meio de

imunomarcadores específicos.

Palavras-chave: Gânglio cervical cranial, preás, estereologia, maturação,

envelhecimento, roedores.

ABSTRACT

LADD, A.A.B.L. Mechanisms of the post-natal neuronal proliferation in the cranial cervical ganglion of preás (Galea spixii spixii) Wagler, 1831. Neurogenesis vs late neuronal differentiation. [Mecanismos de proliferação neuronal pós-natal do gânglio cervical cranial de preás (Galea spixii spixii) Wagler, 1831. Neurogênese vs diferenciação neuronal. 2009. 75f Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009

This study aimed at detecting whether post-natal development would exert any effect

on the size and number of cranial cervical ganglion (CCG) neurons of male preas

(Galea spixii spixii). Twenty left CCGs from twenty preas were harvested from the

Animal Facility of the Universidade Federal Rural do Semi-Árido Nordestino,

Mossoró- RN and were divided into four different age groups: newborn, young, adult

and aged subjects. The following parameters were estimated using Cavalieri's

principle and optical fractionator and planar rotator , respectively: the volume of CCG,

total number and mean volume of uni and binucleate neurons. After euthanasia, the

CCGs were perfusion-fixed with a 4% formaldehyde solution in PBS, agar-

embedded and, SUR vibrosectioned. The ganglion volume was 0.34 mm3 (newborn),

0.30 mm3 (young), 0.39 mm3 (adult) and 0.63 mm3 (aged animals) (p= 0,012). The

mean volume of uninucleate neurons was 2,917 mm3 (newborn), 3,550 mm3 (young),

7,409 mm3 (adult) and 6,701 mm3 (aged animals) (p=0,0001). The main conclusions

of this study were: (i) The CCG hypertrophy - 85% - is the result of post-natal

development (maturation and ageing), (ii) a 154% increase (hypertrophy) in the

volume of uninucleate neurons during the maturation is followed by a 10% atrophy of

them during ageing. Future studies may investigate whether the size of the CCG's

target-organs can affect the structural foundation of CCG and, therefore, add further

fuel to the notion that a post-natal neurogenesis may indeed exist in sympathetic

ganglia.

Keywords: Cranial cervical ganglion, preas, design-based stereology, maturation,

ageing, rodents.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Fotografia de um Preá (Galea spixii spixii) adulto.-----------------------------38

Figura 2- Fotomacrografia evidenciando a cápsula conjuntiva do GCC esquerdo de preá jovem. Gânglio (Cabeça de seta) Asterisco (cápsula conjuntiva)--40

Figura 3- Fotomicrografia da secção de um GCC de um preá adulto onde se

exemplifica a aplicação do Princípio de Cavalieri para a estimativa do volume ganglionar. Giemsa. Escala de Barra 500µ.--------------------------43

Figura 4- Fotomicrografias de secções histológicas sequenciais do GCC de um preá

adulto, exemplificando a aplicação do método do disector óptico em que neurônios uni (M) e binucleados (B) foram amostrados em planos focais ópticos sucessivos (B,C). É possível identificar a posição de cada secção no eixo z na lateral (barra) esquerda da figura. Azul de Toluidina. Escala de barra: 20 µm ------------------------------------------------------------------------44

Figura 5- Fotomacrografia onde se evidencia a relação topográfica do gânglio

cervical cranial de um preá adulto na região cervical ventrolateral. Podem ser observadas as seguintes estruturas: medialmente o GCC (cabeça de seta preta), a bifurcação da artéria carótida comum e, dorsalmente, o gânglio distal do vago (cabeça de seta branca). Escala de barra 0,5 mm. ----------------------------------------------------------------------49

Figura 6- Microestrutura do gânglio cervical cranial de preá neonato (A) e senil (B)

em secções ópticas (40µm) no mesmo aumento. Onde se observam neurônios uninucleados (cabeças de seta cinzas) e binucleados (cabeças de seta pretas), os neurônios estão densamente distribuídos em neonatos, mas, em animais senis, estes neurônios estão mais espaçados e separados por tecido não neuronal (não marcado) e vasos sanguineos (v). Azul de Toluidina. Escala de barra: 20 µm.----------------51

Figura 7- Fotomicrografia de secção histológica de GCC de preá neonato (A) e senil (B), onde se evidenciam núcleos de neurônios Brd-U positivos, uninucleados (cabeça de seta preta) e binucleados (cabeça de seta branca). Pode-se observar também vasos sanguíneos (v). Reação de imunohistoquímica de campo claro com revelação por diaminobenzidina. Escala de barra 15 µm.---------------------------------------------------------------52

Figura 8- Volume do GCC em diferentes grupos etários. As diferenças entre os

grupos foram significantes (*p=0,012). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais são médias dos grupos.-----53

Figura 9- Número total de neurônios do GCC em diferentes grupos etários. As diferenças entre os grupos não foram significantes (p=0,493). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais são médias dos grupos.--------------------------------------------------------------------54

Figura 10- Número total de neurônios uninucleados do GCC em diferentes grupos

etários. As diferenças entre os grupos não foram significantes (p=0,118). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais são médias dos grupos.--------------------------------------------------------------55

Figura 11- Número total de neurônios binucleados do GCC em diferentes grupos

etários. As diferenças entre os grupos não foram significantes (p=0,261). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais as médias dos grupos.----------------------------------------------------------------55

Figura 12- Volume médio dos neurônios uninucleados do GCC em diferentes grupos

etários. As diferenças entre os grupos foram significantes (*p=0,0001). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais as médias dos grupos.----------------------------------------------------------------56

Figura 13- Volume médio dos neurônios binucleados do GCC em diferentes grupos

etários. As diferenças entre os grupos não foram significantes (p=0,402). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais as médias dos grupos.----------------------------------------------------------------57

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Peso corpóreo e peso do GCC esquerdo de preás. Os valores de cada

parâmetro são expressos pela média do grupo, seguida do seu coeficiente

de variação (CV) - São Paulo – 2009. ------------------------------------------------48

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................23 2 OBJETIVOS ..........................................................................................................27 Gerais:......................................................................................................................27 Específicos: ..............................................................................................................27 3 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................29 3.1 Características da macroestrutura e função.......................................................29 3.2 Aspectos microestruturais e quantitativos ..........................................................32 4 - MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................37 4.1 Materiais.............................................................................................................37 4.2 Métodos..............................................................................................................38 4.2.1- Administração de bromodeoxyuridina (Brd-U) ...............................................38 4.2.2 Eutanásia ........................................................................................................39 4.2.3 Dissecação e individualização do GCC...........................................................39 4.2.4 – Reação de imunohistoquímica (Estudo qualitativo)......................................40 4.2.5 - Estudo estereológico.....................................................................................41 4.2.6 Análise Estatística ...........................................................................................46 5 RESULTADOS......................................................................................................48 5.1 Anatomia Macroscópica .....................................................................................48 5.2 Microestrutura ....................................................................................................49 5.3 ESTUDOS ESTEREOLÓGICO ..........................................................................53 5.3.1 Volume ganglionar (VGCC) ...............................................................................53 5.3.2 Número Total de neurônios (N(Total)), número total de neurônios uninucleados (N(uninuc, GCC)) e binucleados (N(binuc,GCC))...................................................................54 5.3.3 Volume médio de neurônios mono NV (uninuc, GCC) e binucleados NV (binuc, GCC) 56 6 DISCUSSÃO .........................................................................................................59 6.1 Anatomia ............................................................................................................59 6.2 Microestrutura ....................................................................................................60 6.3 Estereologia .......................................................................................................60 6.3.1 Volume Ganglionar (VGCC)...............................................................................61 6.3.2 Número Total de Neurônios (N) ......................................................................62 6.3.3 Volume médio dos neurônios ( NV ) ..................................................................63 7 CONCLUSÕES .....................................................................................................66 8 SUGESTÕES PARA ESTUDOS FUTUROS.........................................................67 REFERÊNCIAS........................................................................................................69

INTRODUÇÃO

LADD, A. A. B. L.

23

1 INTRODUÇÃO

O gânglio cervical cranial (GCC) do preá foi o objeto deste estudo

experimental, que serviu como modelo para analisarmos quantitativamente a

dinâmica neuronal pós-natal. Futuramente, estes resultados preliminares servirão de

base para um estudo específico sobre a neurogênese.

O preá (Galea Spixii spixii) (WANGLER, 1831) é um pequeno roedor da classe

dos mamíferos, com comprimento de 15 a 25 cm nos adultos. Seu peso ao nascer

varia de 30 a 70g, podendo atingir entre 300g e 800g, quando adultos. Pertencente à

Ordem Rodentia; à Família Cavidae e ao Gênero Gálea; são animais desprovidos de

calda, com superfície dorsal escura, acinzentada, e ventral branca, com manchas

infraoculares e pós-auriculares também brancas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002).

São encontrados em todos os estados da região nordeste do Brasil, também em

Minas Gerais e Mato Grosso (MOOJEN, 1952). Possui hábitos crepusculares

basicamente noturnos. Vive em capinzais, entre moitas e arbustos, às vezes, perto

de áreas alagadas, onde consegue mergulhar e nadar. Alimentam-se de brotos,

folhas, sementes, tubérculos e raízes. Quando seu ambiente natural sofre

alterações, invade arrozais e hortas e é considerado como praga. (CORRADELLO,

1987).

O sistema nervoso autônomo (SNA) supre o coração, vasos sanguíneos,

órgãos intestinais, genitais, urinários e as vias respiratórias. Os nervos regulam e

coordenam funções corpóreas como a atividade secretora de glândulas e a

contração e relaxamento dos músculos. O sistema nervoso autônomo é organizado

em grupos de gânglios, os quais podem ser divididos esquematicamente em quatro

grupos: paravertebrais, pré-vertebrais, paraviscerais e intramurais. Estes gânglios

não são apenas simples estações de retransmissão, mas locais de convergência,

divergência, facilitação e inibição de impulsos nervosos (MATTHEWS, 1983;

KRENLEN, 1984; BAKEWELL, 1995; GABELLA, 2004). Nos mamíferos, o SNA

possui uma estrutura comum, sendo compreendido pelos neurônios eferentes que

inervam toda a musculatura lisa do corpo e glândulas e pelos neurônios aferentes

que recebem e transmitem reflexos e sensações dos órgãos viscerais (GABELLA,

2004).

LADD, A. A. B. L.

24

O gânglio cervical cranial (GCC) é classificado como um gânglio paravertebral

e tem sido consideravelmente estudado durante as últimas quatro décadas. Estudos

sobre estrutura e função dos gânglios autônomos utilizam o GCC devido ao seu fácil

acesso e tamanho, o que permite a sua precisa localização. O GCC situa-se

dorsalmente ao nervo vago e próximo à bifurcação da artéria carótida comum.

Responsável pela inervação de toda a área da cabeça, inervando a túnica adventícia

de todas as artérias desta região (KÖNIG e LIEBICH, 2004), emite fibras pós-

ganglionares para os nervos cranianos óculomotor (III), glossofaríngeo (IX) e vago

(X) e dá origem a fibras simpáticas pós-ganglionares que se dirigem para a glândula

pineal.

Portanto, esta pesquisa experimental pode contribuir fornecendo base de

dados para outros estudos das áreas de cirurgia e neurocirurgia, quanto à

localização, topografia e aspectos microestruturais e quantitativos do GCC em

roedores silvestres (preás), evitando assim intervenções cirúrgicas inacuradas que

podem causar injúrias na região cervical, desencadeando disfunções simpáticas,

sendo a principal delas a Síndrome de Horner, representada por um grupo de sinais

clínicos que incluem anisocoria, enoftalmia, protrusão da terceira pálpebra, ptose e

aumento da temperatura da face como resultado da vasodilitação periférica. Esta

síndrome pode acometer tanto animais (principalmente gatos, cães e equinos)

quanto humanos (BOYDELL, 1995; BELL et al. 2001; OZEL, 2004)

Os neurônios autonômicos têm sido examinados sob microscopia de luz e

eletrônica (BARTON; CAUSEY, 1958; PICK et al., 1964).

Comumente há correlação alométrica entre o tamanho neuronal e o tamanho

do corpo do animal (GABELLA, 2004). Farel (2003) cita que, em ratos, o número de

neurônios no gânglio de raiz dorsal (DRGs) lombar é quase 35% maior em adultos

do que em neonatos, sem proliferação neuronal, resultado este que sugere que os

DRGs de ratos jovens contém uma população de neurônios que não sofrem

diferenciação completa, vindo esta ocorrer tardiamente. Neste estudo, os critérios de

contagem foram baseados em resultados de experimentos com marcação

retrógrada e complementada por métodos imunohistoquímicos, usando o marcador

de mitose Brd-U (Bromodeoxyuridina) e utilizando, a seguir, métodos estereológicos

para a quantificação das estruturas imunorreativas.

Através de estudos autorradiográficos em coelhos, Filichkina (1981) observou

que gânglios paravertebrais apresentaram neurônios mono e binucleados com

LADD, A. A. B. L.

25

quase a mesma intensidade no total de síntese protéica. Entretanto, Forsman et al.,

(1989) não detectou diferenças ultraestruturais nos núcleos de ambas as células,

entretanto, análises microdensitométricas mostraram que células binucleadas do

gânglio celíaco-mesentérico de cobaias contêm o dobro de DNA em relação às

células uninucleadas.

Em relação à frequência de neurônios binucleados, Eranko (1972) cita que

em ratos ocorrem algumas mitoses nos neurônios após o nascimento, sabendo-se

que o número final de neurônios é estabelecido durante a vida fetal, e que da

primeira semana após o nascimento, em ratos, o número de neurônios principais

permanece inalterado ou mostra um pequeno decréscimo. Com isso, Forsman et al.

(1989) sugere que a ocorrência de células binucleadas pode ser devido a uma

interrupção de mitoses durante o processo de diferenciação. A determinação dos

tipos neuronais pode ser verificada também quanto a sua funcionalidade (GUADIX et

al., 1979). Células binucleadas têm sido reportadas em roedores silvestres

brasileiros 36% e 13% em capivaras jovens e adultas (RIBEIRO; DAVIS; GABELLA,

2004 e RIBEIRO, 2006), respectivamente, porém seu significado funcional ainda é

obscuro.

Desta forma, a primeira fase desta pesquisa teve como objetivo analisar

morfoquantitativamente os GCCs de preás durante quatro períodos do

desenvolvimento pós-natal (neonatos, jovens, adultos e animais de meia-idade).

Concomitantemente à análise das fases etárias com a aplicação dos métodos

estereológicos, foi possível estabelecer uma relação entre idade, número total de

neurônios (uninucleados e binucleados), volume neuronal, volume ganglionar e

massa corporal.Preliminarmente, com o uso de marcadores mitóticos específicos,

como o Brd-U (Bromodeoxyuridina) Farel (2003) e Valero (2005), investigamos no

GCC de preás a resposta destes neurônios ao Brd-U. Em um estudo mais futuro,

pretendemos investigar, quimicamente e quantitativamente, a possível ocorrência de

divisão celular durante a maturação e o envelhecimento, investigando assim a

dinâmica neuronal pós-natal bem como os fenômenos que a regem: neurogênese x

diferenciação tardia.

Contudo, os dados desta pesquisa poderão ser comparados posteriormente

com capivaras e outros roedores, podendo assim fornecer bases citoarquiteturais

para o estudo, “in vivo”, do tecido nervoso destes roedores selvagens pertencentes a

fauna brasileira.

LADD, A. A. B. L.

26

OBJETIVOS

LADD, A. A. B. L.

27

2 OBJETIVOS Este capitulo destina-se a descrever os objetivos investigados neste estudo.

Gerais:

Analisar morfoquantitativamente (por meio de métodos estereológicos) o

desenvolvimento pós-natal no gânglio cervical cranial do preá (neonatos, jovens,

adultos e animais de meia-idade)

Específicos:

Estimar os seguintes parâmetros do gânglio cervical cranial em preás durante o

desenvolvimento pós-natal:

- Volume Ganglionar (VGCC)

- Número total de neurônios uninucleados (Nuninuc)

- Número total de neurônios binucleados (Nbinuc)

- Número total de neurônios (Ntotal)

- Volume médio de neurônios mononucleados ( Nv uninuc)

- Volume médio de neurônios binucleados ( Nv binuc)

LADD, A. A. B. L.

28

REVISÃO DE LITERATURA

LADD, A. A. B. L.

29

3 REVISÃO DE LITERATURA

Nesta seção faremos, à luz da literatura científica, uma abordagem descritiva

dos conceitos relacionados à forma e função do gânglio cervical cranial, que

subsidiaram a realização deste trabalho.

3.1 Características da macroestrutura e função

O sistema nervoso autônomo, em um contexto amplo e simplificado, é

considerado como o elo entre o sistema nervoso central e os órgãos, criando vias

aferentes e eferentes de ligação. Este sistema é organizado em feixes nervosos e

grupamentos ganglionares, que podem ser esquematicamente subdivididos em

quatro grupos: paravertebrais; pré-vertebrais; paraviscerais e intramurais. Estes

gânglios não são apenas simples estações de retransmissão, mas locais de

convergência, divergência, facilitação e inibição de impulsos nervosos (NICKEL et

al., 1975; MATTHEWS, 1983; KRENLEN, 1984; BAKEWELL, 1995; GABELLA,

2004).

O gânglio cervical cranial (GCC) é um gânglio paravertebral do sistema

nervoso autônomo simpático, podendo ser reconhecido macroscopicamente como

uma protusão ao longo dos troncos nervosos cervicais, direito e esquerdo,

denominado de tronco simpático (GABELLA, 2004).

O tronco simpático é uma estrutura bilateral simétrica, estendendo-se da base

do crânio até o sacro. No pescoço, o tronco simpático cervical encontra-se dorsal ao

nervo vago e à artéria carótida comum e ventral ao processo transverso das

vértebras e músculos epiaxiais. Cada tronco simpático cervical tem no mínimo dois

gânglios proeminentes, o gânglio cervical cranial e o gânglio cervical inferior (ou

caudal) que está fundido ao primeiro ou segundo gânglio torácico, sendo

denominado de cervicotorácico ou estrelado. Esporadicamente pode ocorrer o

LADD, A. A. B. L.

30

gânglio cervical médio (HEDGER; WEBBER, 1976; BALJET; DRUKKER, 1979;

EVANS; SURPRENANT, 1996).

Ao GCC têm sido direcionadas várias pesquisas científicas, pois este possui

um extenso território de inervação, inervando estruturas cefálicas e cervicais, tais

como: íris, glândula pineal, membrana nictitante, glândula submandibular, tireóide,

língua, mucosa oral, região cutânea da face, orelha e do pescoço (FLEET ; BELL,

1991; LUEBKE ; WRIGTH, 1992; HUBBARD et al 1999; MOLLER ; LIU, 1999;

HAYAKAWA et al 2000; LADIZESKY, et al 2000) e também devido a sua fácil

localização e acesso, tamanho e vascularização.

Vários estudos macroscópicos têm evidenciado a relativa semelhança quanto

à localização e posição do GCC em diferentes espécies animais de pequeno, médio

e grande porte, podendo estar sujeitos a pequenas alterações promovidas pela

espécie e idade. (CUI-SHENG et al. 1998; KABAK et al. 2005; BAO-PING et al.

2005; KABAK 2007; FIORETTO et al., 2007).

Em ratos, Ribeiro et al (2004) descrevem a localização do GCC na região

mais cranial do pescoço, dorsalmente em contato com o nervo vago e ventralmente

com a carótida interna, apresentando formato fusiforme. Kabak (2007) confirmou a

localização do GCC em cobaias (Cavia porcellus) caudoventralmente ao gânglio

distal do nervo vago, medialmente ao músculo digástrico e hioglosso, ventrolateral

ao músculo longo da cabeça, ventral à bula timpânica, apresentando formato oval.

Em cães, o GCC está coberto pelo músculo digástrico e situado cranialmente

ao gânglio distal do vago, em formato fusiforme, apresentando 4-6 mm de

comprimento no eixo longo e 2,5 mm no eixo curto; este apresenta ligação com o

nervo hipoglosso, e próximo à artéria carótida interna. (FIORETTO et al., 2007).

Neste mesmo trabalho foi analisado o GCC de gatos que, em termos topográficos,

apresentou-se semelhante, com exceção à sua proximidade com a artéria occipital e

não a carótida interna como nos cães.

Kabak et al. (2005) observaram em suínos o GCC posicionado crânio-

ventralmente ao gânglio distal do vago, medialmente à extremidade de processo

jugular, dorsal à base da cartilagem epiglote, ventral ao Atlas e medial à raiz comum,

formada pelas artérias carótida interna e artéria occipital. As dimensões do GCC

para suínos adultos foram 17,74 mm de comprimento, 3mm de largura e 2,58mm de

espessura.

LADD, A. A. B. L.

31

Os objetivos de Bao-Ping et al. (2005) foram descrever a forma, localização e

arranjo dos ramos do GCC da espécie Bos grunniens, bovino comumente

encontrado no Tibet. Nesta espécie, o GCC tem formato fusiforme, apresentando as

seguintes medidas 19,72 mm de comprimento, 7,65mm de largura e 4,55 mm de

espessura.

Cui-Sheng et al. (1998), estudando a anatomia deste órgão em camelos

(Camelus bactrianus), encontram uma estrutura bem desenvolvida com médias de

comprimento, largura e espessura variando respectivamente entre 15-20 mm, 4-6

mm, e 3 mm. Sua localização inclui a superfície rostrolateral do músculo largo da

cabeça, ventral ao músculo esternocefálico e coberto pela glândula mandibular; e o

eixo longo paralelo ao nervo vago.

A importância clinica no estudo do GCC pode ser também caracterizada por

sua relação com algumas disfunções simpáticas, ocasionadas pela ocorrência de

injúrias na região cervical e que as desencadeiam, sendo que a principal delas

associada a este gânglio é a Síndrome de Horner, representada por um grupo de

sinais clínicos (que incluem anisocoria, enoftalmia, protrusão da terceira pálpebra,

ptose e aumento da temperatura da face como resultado da vasodilitação periférica)

relacionados com a perda momentânea ou permanente da inervação autonômica

simpática, sendo secundária a processos inflamatórios e/ou compressivos do GCC

(devido a neoplasias benignas ou malignas). Ainda, destacam-se na

morfopatogênese da Síndrome de Horner os procedimentos de causa hiatrogênica,

ou seja, intervenção cirúrgica inacurada na região cervical, ocasionando lesão no

GCC e/ou em suas fibras. Esta síndrome pode acometer tanto animais

(principalmente gatos, cães e equinos) quanto humanos (BOYDELL, 1995; BELL et

al., 2001; OZEL, 2004).

Ozel (2004) relata um caso incomum, em que uma criança, após

toracostomia, um procedimento comum aplicado em várias patologias pulmonares,

apresentou sintomas compatíveis com a Síndrome de Horner, miose, ptose e

enoftalmia devido a uma interrupção do fluxo de inervação dos neurônios pré-

gaglionares de segunda ordem. Além disso, bloqueios anestésicos locorregionais na

região cefálica e cervical podem ocasionar sintomas clínicos relacionados à esta

síndrome (ELIAS, 2000).

A relação do gânglio cervical cranial com a Síndrome de Horner está bem

descrita em um estudo de 2002, no qual uma fêmea canina Airedale Terrier de 9

LADD, A. A. B. L.

32

anos de idade foi eutanasiada e sofreu necropsia após um progressivo caso clínico

que incluía a Síndrome de Horner (caracterizada clinicamente como uma doença

inflamatória restrita a nervos periféricos, raízes nervosas e gânglios específicos),

ptose palpebral unilateral e atrofia unilateral dos músculos mastigatórios. Esta

síndrome é comumente diagnosticada em cães e gatos, sendo a sua classificação, e

sua morfopatogênese ainda desconhecidas (PANCIERA et al. 2002).

3.2 Aspectos microestruturais e quantitativos

O gânglio cervical cranial de pequenos, médios e grandes mamíferos

apresenta composição interna variável em sua arquitetura geral, dependendo da

espécie, idade e antimeria (GABELLA et al., 1988; RIBEIRO et al., 2002; RIBEIRO et

al., 2004; RIBEIRO, 2006; ABRAHÃO et al., 2009; MELO et al., 2009; TOSCANO et

al., 2009).

No GCC encontram-se vários tipos celulares SIF cells (small intensely

fluorescent cells), células endoteliais, fibroblastos, mastócitos, (GABELLA., 2004) em

acréscimo aos neurônios ganglionares principais que podem ser uni ou binucleados.

Estes últimos têm sido descritos em gânglios simpáticos de pequenos a grandes

roedores: paca (Agouti paca), capivara (Hydrochaeris hydrochaeris), cobaia (Cavia

porcelus) e lagomorfos: coelhos (Oryctolagus cuniculus); (FORSMAN et al, 1989;

SASAHARA et al., 2003; RIBEIRO et al 2004; RIBEIRO, 2006; ABRAHÃO et al.,

2009; MELO et al., 2009; TOSCANO et al., 2009).

Dos métodos morfométricos aplicáveis para amostras biológicas, o método

estereológico é no momento o mais correto (STERIO, 1984; PAKKENBERG;

GUNDERSEN, 1988; MAYHEW; GUNDERSEN, 1996; HOWARD; REED, 2005).

Muitos dados quantitativos na literatura foram obtidos com métodos que não

poderiam ser aceitos hoje (ABERCROMBIE, 1946; EBBESSON, 1968; DAVIES,

1978; GORIN; JOHNSON, 1980; PURVES et al., 1986). Naturalmente, estes dados

não podem ser desconsiderados, mas seus resultados de tal forma não são

acurados e confiáveis.

LADD, A. A. B. L.

33

Um estudo comparativo do GCC, usando métodos estereológicos confiáveis,

entre espécies adultas com tamanhos distintos variando em quase 1000 vezes (rato,

capivara e cavalo), buscando associação entre volume ganglionar, tamanho e

número total de neurônios e analisando secções semifinas embebidas em resina

plástica, observaram uma arquitetura menos complexa em GCC de ratos do que em

GCC de capivaras e cavalos (RIBEIRO et al 2006).

Como aspecto geral, o GCC apresenta-se envolto por uma cápsula de tecido

conjuntivo, composta de colágeno e fibroblastos de espessura variável, sendo que

os neurônios desses gânglios apresentaram-se separados por fibras nervosas e

capilares intraganglionares, sendo que em capivaras e cavalos os neurônios estão

compartimentalizados por invaginações da cápsula externa formando septos

profundos nos gânglios dessas duas espécies (RIBEIRO et al., 2006). O mesmo

aspecto compartimentalizado com penetrações da cápsula conjuntiva no GCC foi

observado também em outros roedores silvestres como a paca (ABRAHÃO et al.,

2008). A idade também pode afetar a dinâmica tecidual do GCC. Em cobaias (Cavia

porcellus) foi observado um aumento de tecido não neuronal com o decorrer da

idade, alterando a densidade de volume dos neurônios e também o volume do

gânglio (TOSCANO et al., 2009). Sendo a hipertrofia um mecanismo adaptativo

amplamente conhecido durante o desenvolvimento pós-natal em muitos gânglios

autonômicos de mamíferos de porte médio e grande (MIOLAN e NIEL, 1996;

GAGLIARDO et al., 2005; FIORETTO et al., 2007).

O número e volume neuronal, dois importantes parâmetros de comparação,

estão sujeitos a variações interespecíficas, relacionados à idade ou ainda a fatores

individuais. Ribeiro (2006), relata um decréscimo no número total de neurônios de

16% durante a maturação e 23% para os neurônios binucleados com aumento do

peso dos animais em 98,5%.

O número total de neurônios do GCC de rato, cavalo e capivara, obtido por

Ribeiro et al., (2004) através de quantificação estereológica, baseada na utilização

do método do disector físico para determinar a densidade neuronal e no Princípio de

Cavalieri para estimar o volume ganglionar, em que a combinação destes dois

métodos possibilita estimar-se o número total de neurônios do gânglio cervical

superior de forma acurada. Os autores observaram uma correlação alométrica para

o número de neurônios dessas diferentes espécies, sendo que o número total de

neurônios para ratos foi 18840, para capivaras foi 1520000 e para cavalos foi

LADD, A. A. B. L.

34

3390000. O gânglio da capivara mostrou certas características distintas das outras

espécies. Como fato interessante, observou-se a ocorrência em média de 13% de

neurônios binucleados no gânglio cervical de capivaras adultas. A principal

conclusão deste estudo foi de que número total de neurônios é dependente da

massa corporal do animal, entretanto, isto não é necessariamente verdadeiro em

relação ao tamanho neuronal - 9000µm3 para ratos; 32 µm3 para capivaras e 20.200

µm3 para cavalos – medidos por métodos estereológicos indiretos.

Melo et al., (2009) reportaram um aumento de 95% no número de neurônios

mononucleados de pacas (Agouti paca), roedor silvestre de porte intermediário,

durante o desenvolvimento pós-natal, acompanhado do aumento do volume do

gânglio GCC em 154% e de 50% para o volume total de neurônios do GCC. Já

Abrahão et al (2009), estudando efeitos da antimeria no GCC, observaram um efeito

interessante da interação entre o peso e idade de pacas, em que o GCC direito de

pacas senis apresentaram mais neurônios mono e binucleados que o GCC esquerdo

de todas as idades, enquanto os neurônios do GCC esquerdo foram maiores que os

neurônios do GCC direito de qualquer idade.

Devor (1985) e colaboradores, usando métodos estereológicos para

contagem, concluíram que ocorreu um aumento de 50% no número de neurônios no

do gânglio da raiz dorsal lombar (DRG) em ratos que aumentaram o peso de 250

para 400g.

De outra parte, Coggeshall et al., (1994) e Pover et al., (1994), usando o

disector físico, não encontraram evidências de aumento do número neuronal em

dois estudos feitos separadamente em ratos; se os ratos adultos tivessem mais

neurônios, este número de neurônios poderia ter sido devido à neurogênese,

diferenciação tardia ou transdiferenciação. Em um ou outro evento, existiria a

possibilidade de que os mecanismos responsáveis para a adição do neurônio

poderiam ser recrutados para compensar os danos resultantes de ferimento ou de

doença, dizem os autores. Estes resultados discrepantes podem ter ocorrido devido

a inacurácias metodológicas, ainda que usando métodos estereológicos.

Popken e Farel (1997), utilizando métodos estereológicos e não

estereológicos de quantificação neuronal, verificaram um aumento no número de

neurônios em ratos adultos em relação a neonatos. O método de contagem não

estereológico (perfis de contagem núcleo/nucléolo) indicou um aumento de 19%

(8.805 neurônios) e o disector físico mostrou um aumento de 28% (10.720

LADD, A. A. B. L.

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neurônios), contudo a diferença no número de neurônios entre ratos adultos e

neonatos pode ser devido à atividade mitótica ou à ocorrência de neurônios

incompletamente diferenciados em neonatos.

Farel (2003) também identificou um aumento de 35% no número total de

neurônios de ratos adultos quando comparados aos neonatos. A possibilidade da

neurogênese foi examinada por este autor, injetando subcutaneamente em ratos

neonatos um marcador específico para ciclo celular: bromodeoxyuridina (Brd-U). A

quantificação foi conduzida por meio de métodos estereológicos de contagem, cuja

validade e confiança têm sido confirmadas por reconstruções tridimensionais. Os

resultados revelaram que este aumento no número total de neurônios ocorreu pela

de diferenciação neuronal tardia e não devido à neurogênese (FAREL, 2003)

Este marcador celular (Brd-U) é utilizado na identificação de atividade

mitótica, pois o exame de protocolos da utilização deste marcador por MOMMA et.

al.(2002), sob microscopia eletrônica, mostrou que a marcação é sempre confinada

ao núcleo, indicando que a incorporação de Brd-u foi devido à síntese de DNA.

NGWENYA et.al (2005) descreveram as vantagens da utilização de Brd-u e os

motivos pelos quais ele está sendo amplamente utilizado para marcar células em

mitose, dentre os quais, o baixo risco de intoxicação celular e rapidez na análise

imunohistoquímica em contraste com outros métodos mais demorados, como os

autorradiográficos,e ainda permite a utilização de imunofluorescência.

Valero et al., (2005) utilizaram também como marcador de proliferação celular

o BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) para estudar a proliferação celular nuclear

antigênica. Dois grupos de marcadores de proliferação celular podem ser

distinguidos: análogos de base nitrogenada e marcador de proliferação celular

endogênica. Atualmente, o análogo de base nitrogenada (BrdU) é o mais utilizado

para demonstrar a proliferação celular.

Em verdade, efeitos dissonantes quanto a parâmetros morfométricos durante

o envelhecimento, como, por exemplo, aumento ou diminuição do número total de

neurônios é assunto para discussões interessantes, e com o advento de técnicas

modernas de estereologia e imunohistoquímica, poderemos contribuir com a

elucidação dos mecanismos envolvidos nesse processo.

LADD, A. A. B. L.

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Materiais e Métodos

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4 - MATERIAIS E MÉTODOS

Todos os procedimentos descritos neste estudo foram aprovados em

29/10/2008 pela Comissão de Bioética da Faculdade de Medicina Veterinária e

Zootecnia da Universidade de São Paulo, sob o número de protocolo 935/2006.

4.1 Materiais

Para este estudo, foram utilizados vinte gânglios (GCC) esquerdos de 20

preás (Galea spixii spixii), (Figura.1), machos, saudáveis (ausência clínica de

neuropatias), obtidos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS) da

Universidade Federal Rural do Semi-árido Nordestino (UFERSA), antiga ESAM

(Escola Superior de Agricultura), Mossoró – RN, entidade credenciada e registrada

pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis

(IBAMA) como criadouro científico sob registro n° 12.492-000404.

Os animais foram separados em quatro grupos etários, de acordo com a fase

do desenvolvimento pós-natal, sendo assim:

Grupo I (neonatos): Cinco GCC de animais com 01 a 03 dias de idade (peso

corpóreo 0,37-0,63g)

Grupo II (jovem): Cinco GCC de animais com 01 mês de idade (peso corpóreo

148-215g)

Grupo III (adultos): Cinco GCC de animais com 12 meses de idade (peso

corpóreo entre 272-427 g)

Grupo IV (Meia idade): Cinco GCC de animais de 36 meses de idade (peso

corpóreo 284-403 g)

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4.2 Métodos

4.2.1- Administração de bromodeoxyuridina (Brd-U)

Tendo como base o protocolo de VALERO et al. (2005) para a administração

de bromodeoxyuridina (Brd-U), um marcador de ciclo celular, síntese de DNA e,

portanto sugestivo de atividade mitótica (FAREL, 2003; TAUPIN, 2007), os animais

foram injetados intraperitonealmente com doses de 50 µm/g de Brd-U numa

concentração de 25mg/ml, diluídas em tampão fosfato salino (PBS) (0,1 M e pH de

7,4), nos períodos de 24 e de 2h antes de serem eutanasiados.

Figura 1- Fotografia de um Preá (Galea spixii spixii) adulto.

LADD, A. A. B. L.

39

4.2.2 Eutanásia

Os animais foram previamente tranquilizados com aplicação de azaperone

(4mg/kg) intraperitonealmente (IP), seguida da aplicação de sulfato de atropina

(0,06mg/kg) via intraperitoneal (IP). Para a eutanásia ativa, o cloridrato de quetamina

(20mg/kg) foi associado ao cloridrato de xilazina (1,5mg/kg), ambos na mesma

seringa, para indução da anestesia na mesma via citada anteriormente. Logo em

seguida, os animais receberam uma overdose de anestésico, Tiopental sódico,

(80mg/100g de peso corpóreo) (IP).

4.2.3 Dissecação e individualização do GCC

Subsequentemente às injeções de Brd-U e à eutanásia, a cavidade torácica

foi aberta e uma cânula foi inserida dentro do ventrículo esquerdo do coração até

atingir a aorta ascendente. Primeiramente foram perfundidos 100ml de solução de

lavagem composta de tampão fosfato salino (PBS) (0,1M; pH 7,4) (Synth®) contendo

heparina (1%). A aurícula direita foi seccionada para extravasamento do sangue. A

seguir, os espécimes foram perfundidos com solução fixadora composta por

formoldeído (4%) [SigmaTM] em tampão fosfato salino PBS (0,1M; pH 7,4) (Synth®) à

temperatura de 10-15 °C, com volume total perfazendo 10% do peso corpóreo.

Os GCCs esquerdos foram dissecados e removidos do animal e suas

cápsulas conjuntivas foram retiradas por microdissecação, utilizando um microscópio

cirúrgico Leica® DM com aumento de 40x. (Figura. 2). Posteriormente, os GCCs

foram pesados e medidos nos seus três eixos: comprimento, largura e espessura,

(Tabela 1) usando o paquímetro digital Digimess®. Após a mensuração dos

LADD, A. A. B. L.

40

gânglios, os mesmos foram lavados com água destilada, verticalizados (BADDELEY

et al., 1986), embebidos em uma solução aquosa de Ágar (10%) e seccionados

seriada, uniforme e sistematicamente (SURS) em micrótomo de lâmina vibratória

(vibrótomo) Leica® (VT 1000S) com 40µm de espessura. As secções foram

montadas em lâminas com aderência eletrostática e coradas com giemsa (Merck®)

para o estudo quantitativo (estereológico). Contudo, as secções foram desidratadas

em séries crescentes de etanóis, montadas sob lamínulas e observadas ao

microscópio epi-fluorescência Leica® DMR e analisadas com o auxílio de um

software estereológico (CAST®) Versão 3.0.8.0.

4.2.4 – Reação de imunohistoquímica (Estudo qualitativo)

Bromodeoxiuridina (Brd-U) é atualmente um dos métodos de eleição para

estudos de proliferação e neurogênese in vivo (DEL RIO; SORIANO, 1989). O Brd-U

é sistematicamente injetado e incorporado como um análogo da Timidina dentro do

Figura 2- Fotomacrografia evidenciando a cápsula conjuntiva do GCC esquerdo de preá jovem. Gânglio (Cabeça de seta) Asterisco (cápsula conjuntiva).100µm.

*

LADD, A. A. B. L.

41

DNA de todas as células durante a síntese de DNA (DOLBEARE, 1995, 1996). Uma

vez incorporado ao DNA da célula, o Brd-U pode ser detectado

imunohistoquimicamente em células pós-mitóticas até o final de suas vidas, exceto

naquelas células que proliferam consecutivamente, as quais diluirão

exponencialmente o sinal do Brd-U no núcleo (WARD et al., 1991).

No entanto, mais recentemente tem sido apregoado que o Brd-U não é

primariamente um marcador de células em proliferação e, sim, um marcador de

síntese de DNA. Isto traz profundas consequências no estudo e análise da

neurogênese, visto que pode conduzir a interpretações errôneas se os controles

apropriados não forem conduzidos (TAUPIN, 2007).

Brevemente, o protocolo da reação consistiu do bloqueio da peroxidase

endógena, utilizando-se peróxido de hidrogênio (0,5% em etanol 50%) durante 30

minutos, seguido de bloqueio com soro normal de cabra (10% em PBS, pH 7.4,

0,1M) durante 30 minutos, outra lavagem em PBS (15 minutos) e incubação em

anticorpo primário monoclonal “anti-mouse” bromodeoxyuridina (Brd-U) (1:100)

durante 48 horas. A seguir, procedeu-se à lavagem em PBS (15 minutos), seguido

de incubação em anticorpo secundário “goat anti-mouse” conjugado com

“horseradish peroxidase” (HRP) (1:200) durante uma hora. Os cortes foram então

novamente lavados e a reação foi desenvolvida, utilizando-se a “3,3’-

diaminobenzidine tetrahydrochloride” (DAB, Sigma®) por 45 minutos.

Posteriormente, os cortes foram lavados em PBS (15 minutos), desidratados em

séries crescentes de etanóis e xilóis e montados sob lamínula com DPX (FLUKA®) e

a seguir, visualisados por meio da estação de microscopia de luz e epifluorescência

Leica DM 6000®.(VALERO et. al. 2005).

4.2.5 - Estudo estereológico

Os parâmetros estereológicos estimados foram: volume do gânglio, número

total de neurônios e volume neuronal médio (STERIO, 1984; PAKKENBERG ;

GUNDERSEN, 1988, 1989; POVER; COGGESHAL, 1991; MAYHEW;

GUNDERSEN, 1996; HOWARD ; REED, 2005)

LADD, A. A. B. L.

42

4.2.5.1- Volume do Gânglio (VGCC)

Para estimar o volume do gânglio, foi utilizado o Princípio de Cavalieri aplicado

aos cortes histológicos do GCC (Figura.03) (MAYHEW e OLSEN, 1991; HOWARD e

REED, 2005).

Inicialmente, cada GCC foi verticalizado, embebido em solução de Ágar (10%) e

seccionado exaustivamente (40µm de espesssura) por meio de um micrótomo de

lâmina vibratória Leica® VT100S. Este procedimento gerou um conjunto de secções

com espessura média T.

Assim como Ribeiro, Davis e Gabella. (2004) para o GCC de cavalos e capivaras

e por Mayhew e Olsen (1991) para o encéfalo humano, a seguinte fórmula foi usada

para estimar o volume do gânglio:

Vg= T x K x ∑A, onde:

T = espessura média das secções ganglionares

K= distância entre as secções

A = área das seções ganglionares

O coeficiente de erro (CE) para a estimativa de volume pelo Princípio de Cavalieri

CE(VGCC) foi estimado de acordo com a fórmula modificada por Gundersen et al.

(1999).

A fórmula utilizada foi:

Variância “noise” da contagem de pontos:

Var [noise] = c. (b/√a).(√n. ΣP) Onde c é uma constante (c = 0,0724)

b/√a expressa a forma ou complexidade dos perfis analisados

n é o número de secções utilizadas ΣP é o número total de pontos utilizados para estimar a área das secções.

Variância devido a amostragem sistemática e uniformemente aleatória (surs)

Var [srs] = (3(A-var[noise])-4B+C)/240 CE = √var[total]

Os valores médios para CE (VGCC) nos grupos etários estudados: neonatos,

jovens, adultos e senil, foram, respectivamente 2,97%, 2.88%, 3,18%, 2,19%.

LADD, A. A. B. L.

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Para fins de ilustração, está representado na figura 4 o método do “optical

disector”, utilizado não somente para a quantificação do número total dos neurônios

mono e binucleados, mas, também para a amostragem das partículas, visando a

estimativa de seus volumes.

Figura 3- Fotomicrografia da secção de um GCC de um preá adulto onde se exemplifica a aplicação do Princípio de Cavalieri para a estimativa do volume ganglionar. Giemsa. Escala de Barra 500µ.

LADD, A. A. B. L.

44

Figura 4- Fotomicrografias de secções histológicas sequenciais do GCC de um preá adulto, exemplificando a aplicação do método do disector óptico em que neurônios uni (M) e binucleados (B) foram amostrados em planos focais ópticos sucessivos (B,C). É possível identificar a posição de cada secção no eixo z na lateral (barra) esquerda da figura. Azul de Toluidina. Escala de

LADD, A. A. B. L.

45

4.2.5.2 Número total de neurônios do GCC (N)

O fractionator óptico é uma combinação do fractionator, um princípio de

amostragem, com disector óptico. De acordo com o princípio do fractionator, o

número total de neurônios do GCC (N) foi estimado multiplicando-se o número total

de partículas contadas pelo inverso das frações amostradas (GUNDERSEN (1988),

GUNDERSEN (2002) E ANDERSEN (2004), utilizando-se a seguinte fórmula:

hsfasfssfQN 1.1.1.∑ −=

Onde:

ssf é a fração da amostragem das secções

asf é a fração das áreas amostradas para contagem

hsf é a fração da espessura do corte efetivamente utilizada para contagem

Q- é o número de partículas contadas pelo método do disector óptico que, neste

caso, são neurônios

Com o método descrito acima, foram estimados o número total de neurônios

uninucleados ( Nuninuc,GCC) e o número total de neurônios binucleados (Nbinuc, GCC).

Contudo, estimamos o número total de neurônios do GCC (Ntotal) obtido pelo

somatório de Nuninuc,GCC e Nbinuc, GCC.

4.2.5.3 Volume neuronal médio ( Nv ) O volume neuronal foi estimado pelo método do rotator planar. Este método

permite estimar o volume médio e a distribuição volumétrica das partículas

independentemente da sua forma, distribuição ou orientação (VEDEL, JENSEN e

GUNDERSEN, 1993).

A seguinte fórmula foi utilizada para a estimativa do volume neuronal:

∑=i

2l. t . iNv π onde, l2

i é uma distância medida a partir de um ponto fixo da

célula ou fora dela, até uma borda arbitrariamente escolhida na mesma. As

estimativas para Nv foram feitas separadamente: volume médio de neurônios

uninucleados ( Nv UNI) e volume médio de neurônios binucleados ( Nv bi).

LADD, A. A. B. L.

46

4.2.6 Análise Estatística A análise estatística foi feita com o auxílio do software estatístico Minitab 15®

(2007) e levando em conta os princípios de amostragem sistemática e

uniformemente aleatória (SURS) (GUNDERSEN et al. 1999) onde, para as variáveis

que apresentaram distribuição simétrica e igualdade de variância

(homocedasticidade), utilizamos o teste one-way ANOVA seguido pelo teste de

TUKEY e FISHER para comparações múltiplas ou “post-hoc test”. No entanto,

quando as variáveis em estudo apresentaram uma distribuição não simétrica e/ou

não apresentaram igualdade de variância, utilizamos os testes de mediana de

MOOD ou os testes de KRUSKAL–WALLIS e MANN-WHITNEY.

Diferenças entre grupos foram consideradas significativas quando (p<0,05).

No capítulo de resultados, as variáveis serão apresentadas como média (CV);

onde CV refere-se ao coeficiente de variação, sendo este o quociente entre o desvio

padrão e a média.

LADD, A. A. B. L.

47

RESULTADOS

LADD, A. A. B. L.

48

5 RESULTADOS

5.1 Anatomia Macroscópica

O gânglio cervical cranial GCC é localizado na região ventromedial da

carótida interna e também ventralmente ao gânglio distal do nervo vago. Nos preás

(Galea spixii spixii) foi facilmente identificável, macroscopicamente e

topograficamente, independentemente da idade, seguindo-se o tronco

vagosimpático até a bifurcação da artéria carótida comum na região proximal do

pescoço (Figura 5).

Tabela 1- Peso corpóreo e peso do GCC esquerdo de preás. Os valores de cada

parâmetro são expressos pela média do grupo, seguida do seu coeficiente

de variação (CV) - São Paulo – 2009.

a, b, c, Médias assinaladas com uma mesma letra não diferem entre si, estatisticamente. Porém, médias assinaladas com letras diferentes, diferem significativamente. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001

Parâmetro Neonato Jovem Adulto Senil

Peso Animal (g)

0,48 (0,22)a

187,8 (0,13)b

338,8 (0,17)c

347,0 (0,13)c**

Peso GCC(g)

0,00056

(0,15)a

0,00084 (0,06)b

0,00116 (0,13)c

0,00118 (0,07)c***

Comprimento GCC (mm)

1,294 (0,12)a

2,076 (0,10)b

2,304 (0,05)b

2,082 (0,14)b***

Largura GCC (mm)

0,842 (0,31)a

1,028 (0,14)b

1,062 (0,03)b

1,174 (0,03)c*

Espessura GCC (mm)

0,7925 (0,14)a

0,78 (0,10)a

0,8225 (0,11)a

0,862 (0,15)a

LADD, A. A. B. L.

49

5.2 Microestrutura Caracteristicamente, foi possível observar na microestrutura do GCC de preás

os seguintes tipos celulares: neurônios uninucleados, neurônios binucleados,

núcleos de células da glia, tecido conjuntivo intraganglionar, bem como, a presença

de tecido vascular. A distribuição dos neurônios nos quatro grupos etários é

diferente. Os neurônios do gânglio do grupo neonato são distribuídos mais

Figura 5 - Fotomacrografia onde se evidencia a relação topográfica do gânglio cervical cranial de um preá adulto na região cervical ventrolateral. Podem ser observadas as seguintes estruturas: medialmente o GCC (cabeça de seta preta), a bifurcação da artéria carótida comum e, dorsalmente, o gânglio distal do vago (cabeça de seta branca). Escala de barra 0,5 mm.

LADD, A. A. B. L.

50

densamente. Com o desenvolvimento pós-natal, os neurônios estão difusamente

distribuídos, entre o tecido conjuntivo intraganglionar que se torna mais visível

(Figura 6). O núcleo dos neurônios uninucleados está predominantemente no centro

da célula, podendo estar deslocado do centro em alguns casos. Nos neurônios

binucleados, os núcleos apresentam-se em pólos distintos da célula, sendo que,

para cada núcleo, houve a presença de um a dois nucléolos, tanto para neurônios

uni, quanto para neurônios binucleados.

Foi possível identificar a presença de neurônios Brd-U-positivos em GCC de

preás neonatos e senis (Figura 7).

LADD, A. A. B. L.

51

Figura 06: Microestrutura do gânglio cervical cranial de preá neonato (A) e senil (B) em secções ópticas (40µm) no mesmo aumento. Onde se observa neurônios uninucleados (cabeças de seta cinzas) e binucleados (cabeças de seta pretas). Os neurônios estão densamente distribuídos em neonatos, mas, em animais senis, estes neurônios estão mais espaçados e separados por tecido não neuronal (não marcado) e vasos sanguíneos (v). Azul de Toluidina.

V

LADD, A. A. B. L.

52

Figura 07: Fotomicrografia de secção histológica de GCC de preá neonato (A) e senil (B), onde se evidenciam núcleos de neurônios Brd-U positivos, uninucleados (cabeça de seta preta) e binucleados (cabeça de seta branca). Pode-se observar também vasos sanguíneos (v). Reação de imunohistoquímica de campo claro com revelação por diaminobenzidina. Escala de barra 15 µm.

LADD, A. A. B. L.

53

5.3 ESTUDOS ESTEREOLÓGICO Os resultados dos parâmetros estereológicos investigados serão descritos nesta

seção.

5.3.1 Volume ganglionar (VGCC)

O volume do GCC (Figura 08) para os diferentes grupos etários foi: Neonato

VGCC= 0,34 mm3 (0,45); jovem VGCC= 0,30 mm3 (0,49); Adulto VGCC= 0,39 mm3

(0,42); Senil VGCC= 0,63 mm3 (0,19). As diferenças entre os grupos foram

significantes (p= 0,012).

Figura 8- Volume do GCC em diferentes grupos etários. As diferenças entre os

grupos foram significantes (*p=0,012). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais são médias dos grupos.

LADD, A. A. B. L.

54

5.3.2 Número Total de neurônios (N(Total)), número total de neurônios uninucleados (N(uninuc, GCC)) e binucleados (N(binuc,GCC))

O número total de neurônios (N(Total)) (que é obtido pelo somatório de uni e

binucleados), o número total de neurônios mononucleados (N(uninuc,GCC)) e

binucleados (N(binuc,GCC)) foram: Neonato N(Total)=103680 (0,25), N(uninuc,GCC)=

65324,00(0.20) e N(binuc,GCC)= 38356,00 (0,35); Jovem N(Total)= 87102 (0,26),

N(uninuc,GCC)= 40083,00 (0,20) e N(binuc,GCC)= 39019,00 (0.35); Adulto N(Total)=89206

(0,35), N(uninuc,GCC)= 45226,00 (0,37) e N(binuc,GCC)= 43981,00 (0,34); Senil: N(Total)=

108540 (0,18), N(uninuc,GCC)= 54136,00 (0,21) e N(binuc,GCC)= 54404,00 (0,21) (Figuras

5, 6 e 7). As diferenças entre os grupos não foram estatisticamente significantes

N(Total)(p=0,493), N(uninuc,GCC) (p = 0,118) e N(binuc,GCC) (p=0,261). Figuras 9 a 11.

Figura 9- Número total de neurônios do GCC em diferentes grupos etários. As diferenças entre os grupos não foram significantes (p=0,493). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais são médias dos grupos.

LADD, A. A. B. L.

55

Figura 11- Número total de neurônios binucleados do GCC em diferentes grupos etários. As diferenças entre os grupos não foram significantes (p=0,261). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais as médias dos grupos.

Figura10- Número total de neurônios uninucleados do GCC em diferentes grupos etários. As diferenças entre os grupos não foram significantes (p=0,118). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais são médias dos grupos.

LADD, A. A. B. L.

56

5.3.3 Volume médio de neurônios mono ( NV (uninuc, GCC) ) e binucleados ( NV (binuc, GCC))

O volume neuronal médio foi: Neonato NV (uninuc,GCC) = 2916,90 µm3 (0,04) e

NV (binuc, GCC)= 12117,00 µm3 (0,14); Jovem NV (uninuc,GCC) = 3550,00 µm3 (0,22) e

NV (binuc, GCC)= 14430,00 µm3 (0,28) e Adulto NV (uninuc,GCC) = 7409,mm µm3 (0,05) e

NV (binuc, GCC)= 12530,mm µm3 (0,04); Senil NV (uninuc,GCC) = 6701,00 µm3 (0,10) e

NV (binuc, GCC)= 13652,00 µm3 (0,08). As diferenças entre os grupos foram

significativas para NV (uninuc,GCC) (p=0,0001), mas não foram significativas para

NV (binuc, GCC) (p = 0.402) (Figura 11 e 12).

Figura 12- Volume médio dos neurônios uninucleados do GCC em diferentes grupos etários. As diferenças entre os grupos foram significantes (*p=0,0001). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais as médias dos grupos.

LADD, A. A. B. L.

57

Figura 13: Volume médio dos neurônios binucleados do GCC em diferentes grupos etários. As diferenças entre os grupos não foram significantes (p=0,402). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais as médias dos grupos.

LADD, A. A. B. L.

58

DISCUSSÃO

LADD, A. A. B. L.

59

6 DISCUSSÃO Neste capítulo, discutiremos os parâmetros divididos nos seguintes sub-

tópicos: anatomia, microestrutura e aspectos estereológicos.

6.1 Anatomia Neste estudo foi observado que o gânglio cervical cranial (GCC) de preás

(Galea spixii spixii) não apresentou alterações relevantes quanto à sua localização e

posicionamento durante a maturação e envelhecimento, estando sua topografia em

concordância com as descrições feitas em outros roedores e mamíferos como, por

exemplo: capivaras, ratos, equinos, cães, felinos, suínos, bovinos e camelos (CUI-

SHENG et al. 1998; RIBEIRO, DAVIS e GABELLA, 2004; BAO-PING, 2005; KABAK

et al.,2005; RIBEIRO, 2006; FIORETTO et al. 2007; KABAK, 2007).

Quanto aos dados macromorfométricos, observou-se o efeito da idade,

havendo um aumento significativo de 60% e 79% referentes ao comprimento e à

largura, respectivamente, durante o período de maturação (neonatos para adultos);

para o período de envelhecimento (adulto para senil), o comprimento apresentou um

pequeno decréscimo de 10% e para a largura, durante este mesmo período,

apresentou um aumento progressivo de mais de 10%. Quanto ao peso do gânglio,

observou-se um aumento de 185% durante a maturação, havendo uma queda de

33% durante o envelhecimento. Estas alterações morfométricas (similares) também

foram observadas em outros roedores (ABRAHÃO et al 2009; TOSCANO et al,

LADD, A. A. B. L.

60

2009; MELO et al, 2009) e se refletiram no volume do gânglio, que é discutido no

item volume ganglionar, a seguir.

6.2 Microestrutura A análise microscópica qualitativa do GCC de preás durante dois períodos

distintos do desenvolvimento pós-natal (maturação e envelhecimento) revelou

diferenças quanto a sua arquitetura, onde, principalmente, pôde ser observado

qualitativamente que, durante a maturação (neonato e jovem), a distribuição dos

neurônios neste período era mais aglutinada e, durante o período de envelhecimento

(jovem e adulto), estes neurônios apresentaram-se esparçamente distribuídos.

Quanto aos tipos celulares encontrados no GCC, estes corroboram com os

estudos publicados de GCC de várias espécies, tais como: capivaras, cães, eqüinos

e gatos (RIBEIRO et al, 2004, RIBEIRO, 2006; FIORETTO et al. 2007), assim como

aqueles publicados em outros gânglios simpáticos como o celíaco-mesentérico de

cães (RIBEIRO et al. 2002) e mesentérico inferior de cães (GAGLIARDO et al.

2005). Os neurônios binucleados observados no GCC do preá foram também

documentados no GCC de outros roedores silvestres, assim como, em outros

gânglios simpáticos (FORSMAN et al, 1989; SASAHARA et al., 2003; RIBEIRO et al,

2004; RIBEIRO, 2006; ABRAHÃO et al 2009; MELO et al 2009).

6.3 Estereologia

Nesta seção iremos discutir aspectos estereológicos abordados nesta pesquisa

LADD, A. A. B. L.

61

6.3.1 Volume Ganglionar (VGCC)

O volume do GCC durante o desenvolvimento pós-natal apresentou-se maior

em preás senis do que em neonatos, jovens e adultos, com um aumento progressivo

a partir do jovem (aumento significativo de 85% durante o envelhecimento)

acompanhado por um aumento alométrico, da ordem de 6 vezes em relação à

massa corporal, aproximadamente 622% do peso de massa corpórea entre os

animais neonatos e senis. No GCC de pacas Melo et al. (2009) identificaram um

aumento de 154% no seu volume durante a maturação e envelhecimento e Toscano

et al (2009) reportaram em GCC de cobaias um aumento volumétrico de 27% nesse

mesmo período. Estes e outros autores identificaram essa hipertrofia ganglionar em

outros mamíferos e roedores silvestres que não o preá, sendo este um mecanismo

adaptativo bem conhecido do desenvolvimento pós-natal de gânglios simpáticos de

pequenos, médios e grandes mamíferos (MIOLAN e NIEL 1996; GAGLIARDO et al

2005; RIBEIRO, 2006; FIORETTO et al, 2007; ABRAHÃO et al 2009; MELO et al

2009; TOSCANO et al, 2009).

Essas alterações volumétricas são decorrentes do aumento numérico e/ou

volumétrico de estruturas intraganglionares, em adição ao tecido neuronal

(neurônios uni e binucleados), e embora não tenhamos mensurado seu volume, o

tecido não neuronal torna-se mais evidenciado, por exemplo, de tecido vascular e

conjuntivo, representados principalmente por capilares sanguíneos e fibras

colágenas e fibroblastos em concordância com o observado em outros roedores

silvestres (RIBEIROet al, 2004; RIBEIRO, 2006; ABRAHÃO et al 2009; MELO et al

2009). Outro fator que contribui com o aumento do volume do GCC, em adição ao

aumento em número e tamanho de estruturas intraganglionares, é o volume total

LADD, A. A. B. L.

62

ocupado pelos neurônios, sendo este último o fator predominante na alteração

volumétrica do GCC (ABRAHÃO et al, 2009).

6.3.2 Número Total de Neurônios (N)

Usando o princípio do “fractionator”, associado ao método do “disector” óptico

para quantificar o número de células neuronais, garantimos acurácia e rapidez na

estimativa dos parâmetros investigados (WEST et al.1991; POVER e

COGGESHALL, 1991; MAYHEW; GUNDERSEN, 1996; GUNDERSEN, 2002;

HOWARD e REED, 2005). Sendo que o número total de neurônios uni e

binucleados, bem como, o número total de neurônios (aqui representados pelo

somatório entre uni e binucleados), embora apresentem um aparente decréscimo

durante a maturação, não apresentaram diferenças significativas relacionadas à

idade, permanecendo o número dessas células constante durante a maturação e o

envelhecimento.

Acerca das mudanças neuronais decorrentes da idade, algumas partes do

sistema nervoso reagem de forma diferente por razões ainda desconhecidas, por

exemplo, no GCC de capivaras, a maturação ocasionou redução de 16% no número

total de neurônios (uni e binucleados), acompanhado de uma redução de 23% no

número total de neurônios binucleados (RIBEIRO, 2006); Toscano et al. (2009)

encontraram no GCC de cobaias uma redução de 24% e 43% para neurônios uni e

binucleados, respectivamente, e também no sistema nervoso central as alterações

mais frequentes relacionadas à idade são atrofia e perda neuronal (ESIRI, 2007) e

perda de células de purkinje e células granulares no cerebelo (ANDERSEN, 2003).

LADD, A. A. B. L.

63

Em contraste a estes dados, Popken e Farel (1997) observaram um aumento

de 30% no número total de neurônios dos gânglios da raiz dorsal (DRGs) L3-L6 de

ratos Sprague-Dawley adultos em relação aos neonatos, usando o disector físico, e

Cecchini et. al. (1993) reportaram um aumento de 40% na população neuronal de

DRGs em ratos Wistar entre 1 e 5 meses, usando métodos quantitativos

morfométricos, portanto discutíveis. Farel (2003) reportou que o aumento no número

de neurônios nos gânglios da raiz dorsal de ratos não está associado à neurogênese

e, sim, à maturação tardia ou diferenciação incompleta.

Contudo, Melo et al. (2009) documentaram em GCC de pacas um aumento

de 95% no número de neurônios uninucleados durante o desenvolvimento pós-natal,

enquanto o número de neurônios binucleados permaneceu constante durante o

mesmo período, e Gagliardo et al. (2005) reportaram um aumento de 1700% no

número total de neurônios do gânglio mesentérico caudal de cães. Esses dados,

associados à presença de neurônios binucleados, sobretudo em gânglios simpáticos

de roedores silvestres (RIBEIRO et al 2004; RIBEIRO et al 2006; ABRAHÃO et al

2009), oferecem oportunidades concretas para futuras pesquisas sobre este tema.

6.3.3 Volume médio dos neurônios ( NV )

O desenvolvimento pós-natal afetou o volume dos neurônios uninucleados,

contudo, não alterou o volume de neurônios binucleados. Foi possível observar nos

neurônios uninucleados um aumento de 154% durante o período de maturação com

uma pequena queda de 10% durante o envelhecimento.

Os dados descritos na literatura referentes às alterações volumétricas em

neurônios de gânglios simpáticos e relacionadas à idade são contraditórios entre si.

LADD, A. A. B. L.

64

Por exemplo, Ribeiro (2006) e Melo et al. (2009) não reportaram alterações etárias

no volume dos neurônios do GCC em pacas e capivaras, respectivamente. No

entanto, Gagliardo et al. (2005) encontram um aumento de 217% no tamanho dos

neurônios do gânglio mesentérico caudal de cães, e embora a hipertrofia neuronal

seja bem conhecida em algumas partes do sistema nervoso central como um

mecanismo compensatório para a perda neuronal (CABELLO et al., 2002), isto pode

ocorrer também no sistema nervoso autônomo, além de outros mecanismos que

possam garantir a homeostase funcional dos gânglios simpáticos.

LADD, A. A. B. L.

65

CONCLUSÕES

LADD, A. A. B. L.

66

7 CONCLUSÕES Com base nos métodos empregados e resultados obtidos, é possível concluir

o que se segue:

- Os seguintes dados macromorfométricos: peso, comprimento e largura do gânglio

cervical cranial sofreram alterações relacionadas com a idade e que refletiram no

volume ganglionar.

- A hipertrofia do GCC de preás é secundária ao desenvolvimento pós-natal

(maturação e envelhecimento).

- A hipertrofia dos neurônios uninucleados é secundária ao desenvolvimento pós-

natal do GCC de preás.

- Detectou-se a presença de neurônios em ciclo celular no GCC de preás neonatos e

senil, o que sugere que estas células estão mitoticamente ativas durante o período

pós-natal.

LADD, A. A. B. L.

67

8 SUGESTÕES PARA ESTUDOS FUTUROS Em face da não existência de explicações conclusivas para as alterações

quantitativas nos neurônios e gânglios simpáticos durante a maturação e o

envelhecimento, sugere-se que estudos futuros possam investigar se o tamanho dos

territórios de inervação destes gânglios pode desencadear mudanças na micro e

macroestrutura dos mesmos, incluindo a possibilidade de ocorrência de

neurogênese, que seria estudada por meio de imunomarcadores específicos.

LADD, A. A. B. L.

68

REFERÊNCIAS

LADD, A. A. B. L.

69

REFERÊNCIAS

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LADD, A. A. B. L.

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