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Diagnóstico de Trombocitopatías por CF
Dra. Fabiana Alberto
Departamento de Hemostasia y Trombosis
Instituto de Investigaciones Hematológicas
Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires
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HEMOSTASIA
Conjunto de mecanismos fisiológicos que aseguran el mantenimiento de la integridad del sistema vascular frente a la injuria.
La hemostasia involucra:
PROTEÍNAS DE LA COAGULACIÓN (PROTEÍNAS PLASMÁTICAS SOLUBLES)
PLAQUETAS (ELEMENTOS FORMES EN SUSPENSIÓN)
ENDOTELIO VASCULAR (SUPERFICIE QUE LIMITA LA VASCULATURA)
Es un proceso dinámico, localizado en el sitio de injuria, gracias al balance entre mecanismos de activación e inactivación que actúan de manera coordinada.
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Flujo laminar
Regulación de la presión sanguínea y distribución del flujo.
MICROCIRCULACIÓN
Zona de alta fuerza de cizallamiento (shear stress)
Sección
MICROCIRCULACIÓN
Capilares
Arteriola
Vénula
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ESPONTÁNEO
EVALUACIÓN DEL SANGRADO
Cutáneo-mucoso
SITIO
FXIII
Articular o muscular SNC - cordón umbilical
VW
Trombocitopenia
Trombocitopatías
Hemofilia A / B
VW tipo 3
Déficit severos
Coagulograma normal o alterado Coagulograma alterado Coagulograma
normal
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POST-QUIRÚRGICO
Borbotones
EVALUACIÓN DEL SANGRADO
TIPO DE SANGRADO
Babeo Plaquetas o VWD
Napa, coágulo deficiente Fibrinolisis
Sutura
MOMENTO
Inmediato o precoz
Tardío
Plaquetas, VWD, factores
FXIII, Fibrinógeno, 2 AP
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Plaquetas
-Pequeñas células anucleadas (diámetro 2 m, volumen 7-9 fl)
- Concentración promedio en sangre 150 - 400 x 109 / l
- Derivan de la fragmentación de los megacariocitosde médula ósea
- Circulan en condiciones de reposo con apariencia de una lenteja.
- La integridad funcional del endotelioasegura el estado de reposo graciasa la producción de PGI2 y NO.
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Plaquetas
- Producción en condiciones fisiológicas:1011plaquetas / día
- Tiempo de vida media: 12 días
- Trombopoyetina (TPO) regula la producción.
- Síntesis de TPO: hígado, médula y riñón.
- Eliminación de TPO: por unión de alta afinidad sobre receptores plaquetarios y megacariocitos.
- La producción puede aumentar hasta 10 veces si hay aumento de la destruccióno consumo.
Plaquetas jóvenes tienen mayor volumen plaquetario
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ESTRUCTURA INTERNASistema canalicular conectado a superficie
Microtúbulos
Gránulos alfa
Gránulos densos
Glicógeno
Mitocondrias
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MALLA DE ACTINA
G-Actina (Monomero Globulares)
F-Actina (Filamentos)
Filamina A (ABP-280), talina, K-actina,
miosina I y II
CITOESQUELETO
MICROTÚBULOS
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Proteínas Adhesivas : VWF, Fg, Fn Vn, TSP-1, laminina-8
Proteínas-Coagulación : FV/Va, multimerin, FXI, proteína S,
HMWK,antithrombina
Proteínas Fibrinoliticas : Plasminogeno, PAI-I osteonectina, 2-antiplasmina, TAFI
Gránulos alfa
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- VEGF- bFGF- EGF- PDGF- EGF- MMPs
Distintas poblaciones de gránulos alfa
PROTEINAS ANGIOGENICAS
PROANGIOGENICA ANTI-ANGIOGENICA
- Endostatina- PF4- Thrombospondin-1-2-macroglobulina- PAI 1- Angiostatina
Kisucka J et al, 2009
FACTORES DE CRECIMIENTO
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GRANULOS DENSOS
ADP, ATP, SEROTONINA, HISTAMINA Ca 2+…
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GP Ic´-IIa
GP Ic-IIa
GP IIb-IIIa(receptor de fibrinógeno,
vWF)
GP Ia-IIa(receptor de colágeno)
GP Ib-IX-V(receptor de vWF)
GP VI-FcR(receptor de
colágeno)
Receptores de ADP
(P2Y1-P2Y12)
Receptores de ADR
(alfa-beta)
Receptores de tromboxano
Receptores de trombina(PAR1-PAR3)
ACTIVACION
RECEPTORES PLAQUETARIOS DE MEMBRANA. Glicoproteínas . Receptores de siete dominios de transmembrana
INTEGRINAS
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GP Ib-IX-VGP VI GP Ia-IIa
Secreción de gránulos
Síntesis de Tx
Cambios en el citoesqueleto
Activación de la integrina
Iniciación: captura, adhesión, activación
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Woulfe DS, 2005
Extensión: cohesión y secreción
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GP IIb-IIIa
GP IIb-IIIa
“La vía final común: activación de la integrina IIb-IIIa”
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Iniciación: captura, adhesión, activación
Respuesta plaquetaria a la injuria
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Extensión: cohesión y secreción
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Perpetuación: estabilización del trombo
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Regulación del crecimiento y estabilidad del trombo para lograr una respuesta óptima a la injuria
Vo
lum
en d
el t
rom
bo
Crecimiento descontrolado(hipercoagulabilidad)
Hemostasia
Estabilidad insuficiente
Oclusión
Respuesta óptima
Falla para formar un trombo estable
Riesgo de sangrado
Riesgo de trombosis
Tiempo
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Regulación del crecimiento del trombo y estabilidad para alcanzar una respuesta óptima frente a la injuria
Journal of Thrombosis and Haemostasispages 66-75, 22 JUL 2011 DOI: 10.1111/j.1538-7836.2011.04364.xhttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1538-7836.2011.04364.x/full#f3
FlujoCapa externa, permeable, plaquetas ligeramente adherentes
Zona relativamente permeable, plaquetas con grado variable de activación
Capa interna, impermeable de plaquetas degranuladas
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Journal of Thrombosis and Haemostasispages 66-75, 22 JUL 2011 DOI: 10.1111/j.1538-7836.2011.04364.xhttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1538-7836.2011.04364.x/full#f2
Regulación del crecimiento y estabilidad del trombo
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IIa
TXA2
ADP
ADR
GP VI
GP Ib-V-IX GP Ia IIa
GP IIb IIIa
Anormalidades plaquetarias (trombocitopatías)
- de los receptores para proteínas adhesivas
- de los receptorespara agonistas solubles
- de los gránulos
- de los mecanismos de transducción de señal
- de los fosfolípidos pro-coagulantes
- de las proteínas del citoesqueleto
- misceláneas, desórdenesno caracterizados
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Agonistas de uso común:
ADP (2.5-5.0 µM)
ADR (10.0 µM)
Colágeno (1.0 µg/ml)
Acido araquidónico (0.5 mM)
Ristocetina (0.5 y 1.2 mg/ml)
Agonistas especiales:
TRAP, activador del receptor de IIa (10.0 µM)
U46619, análogo del tromboxano, (1.0 µM)
Ionóforo de calcio (1.0 µM)
Agregometría
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% de agregación máxima
ADP
ADR
colágeno
AA
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AJUSTES BÁSICOS DEL SOFTWARE
ADQUISICIÓN
ESCALA DE FCS/SSC UMBRAL DE FCS
10000 eventos
CELL-QUEST
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ACTIVACIÓN PLAQUETARIA: CAMBIO DE FORMA Y AGREGACIÓN.
Plaquetas sin estimular
Plaquetas agregadas
Ausencia de agregados
Plaquetas estimuladas con ADP
Plaquetas estimuladas en presencia de un antiagregante
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CITOMETRÍA DE FLUJO
RECEPTORES DE SUPERFICIE
MARCADORES INTRAPLAQUETARIOS
MARCADORES DE ACTIVACIÓN
FUNCIONALIDAD y …………..
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TOMA DE MUESTRA - 5 mL ANTICOAGULANTE (CITRATO DE Na, ACD, EDTA-SO4Mg )
SE PRP PL
TRAZADORES + 45L BUFFER + 5L PLAQ. FLUORESCENTES
FIJACIÓN y DILUCIÓN
DILUCIÓN100.109 PLAQ/L
ESQUEMA BÁSICO DE MARCACIÓN
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. GP IIb/IIIa: Tromboastenia de Glanzmann
. GP Ib-V-IX: - Bernard-Soulier
- von Willebrand tipo plaquetario
. GP Ia/IIa
. GP VI
. GP IV
Trombocitopatías hereditarias
Anomalías de los receptores para proteínas adhesivas
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ALTERACIONES DE LA GP IIb-IIIa
• Ausencia del receptor en superficie
• Disminución del número de receptores
• Incapacidad de fijar Fibrinógeno
• Retracción del Coagulo anómala
GLICOPROTEINA IIb-IIIa• Heterodimero calcio dependiente• Integrina mas abundante en superficie• Receptor de Fibrinogeno, vW, Fibronectina
TROMBOASTENIA DE GLANZMANN
IIHEMA-ANM
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Agregación ADP 5 μM (TG)
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Agregación y liberación con colágeno 8 ug/ml (TG)
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TROMBOASTENIA DE GLAZMMAN: MARCACION EN SUPERFICIE
MM MM
KG
KG
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RETRACCION DEL COAGULO (TG)
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CUANTIFICACION DE GP DE MEMBRANA PLAQUETARIA CytoQuantTMGp ( Stago)
Microesferas: gráfico de puntos FSCH vs SSCH
Histogramas de fluorescencia
A
B
C
D
Mo
lécu
las
de
G
p/p
laq
.
IMF
Marker Media Nº GP/esferasM1 (D) 1201 63000M2 (C) 466 19000M3 (B) 112 4500M4 (A) 8 350
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Leytin V, 1996
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CD 61 (IIIa)densidad de expresión de CD 61
1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.501.5
2.0
2.5
3.0Paciente
Normal
Best-fit values Slope Y-intercept X-intercept 1/slope95% Confidence Intervals Slope Y-intercept when X=0.0 X-intercept when Y=0.0Goodness of Fit r² Sy.x
normal
0.6948 ± 0.018821.204 ± 0.03258-1.7331.439
0.6138 to 0.77571.064 to 1.344-2.186 to -1.374
0.99850.01657
paciente
0.6429 ± 0.028941.285 ± 0.04456-1.9991.555
0.2752 to 1.0110.7189 to 1.851-6.697 to -0.7147
0.99800.01488
log FSH
log F
L1
Relación de densidades
Dn: anti-log 1.204 = 16.0Dp: anti-log 1.285 = 19.3Dp/Dn x 100: 19.3/16.0 x 100 = 120%
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NegativeIIb-IIIa controlIIb-IIIa Patient
Negative Patient
1 st
2 nd
3 rd
Before surgery
1 st
2 nd
3 rd
After surgery
13-05-2005-BORDEAUX
Monitoreo terapia de reemplazo con concentrado de plaquetas, previo a cirugía, en paciente con TG.
![Page 40: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/40.jpg)
Plaquetas de tamaño pequeñoPlaquetas de tamaño pequeño
. Síndrome de Wiskot-Aldrich. Síndrome de Wiskot-Aldrich
. Trombocitopenia ligada al cromosoma X. Trombocitopenia ligada al cromosoma X
Plaquetas de tamañoPlaquetas de tamaño normalnormal
. Trombocitopenia amegacariocítica congénita. Trombocitopenia amegacariocítica congénita
. Trombocitopenia autosómica dominante. Trombocitopenia autosómica dominante
Plaquetas de tamañoPlaquetas de tamaño grandegrande
.Síndrome de Bernard Soulier.Síndrome de Bernard Soulier
.Relacionadas al MYH9 (Síndrome de Sebastian, Síndrome de Fechtner, .Relacionadas al MYH9 (Síndrome de Sebastian, Síndrome de Fechtner, Síndrome de Epstein, Anomalía de May-Haegglin)Síndrome de Epstein, Anomalía de May-Haegglin)
.Síndrome de plaquetas grises.Síndrome de plaquetas grises
.Macrotrombocitopenia del Mediterráneo.Macrotrombocitopenia del Mediterráneo
.Pseudo von Willebrand o von Willebrand.Pseudo von Willebrand o von Willebrand tipo plaquetariotipo plaquetario
TROMBOCITOPENIAS HEREDITARIASTROMBOCITOPENIAS HEREDITARIAS
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macroplaqueta
plaqueta normal
Macroplaquetas en trombocitopenia
![Page 42: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/42.jpg)
BERNARD SOULIER
•Ausencia del complejo GP Ib-IX-V
•Autosómico recesivo, infrecuente
•Con-sanguinidad, Cromosoma 17, 23 y 3
•Sangrado moderado a importante
•Trombocitopenia
•Plaquetas de mayor tamaño y deformables
•Sobrevida plaquetaria acortada
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BERNARD SOULIER
• Tiempo de sangría prolongado
• Adhesividad ausente
• Agregación ausente con Ristocetina, Botrocetina y von Willebrand bovino
GP IX CD42a
• Antígeno CD42 GP Ib CD42b y CD42c
GP V CD42d
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Paciente de 6 años, sexo femenino, que consulta por trombocitopenia crónica.Epistaxis desde el año y medio de edad, bilateral, con internación y requerimiento transfusional. Hematomas fáciles. No hubo sangrado con caída del cordón umbilical. Sin antecedentes de consaguinidad.
![Page 45: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/45.jpg)
Dispersión frontal- Tamaño (FSH)P: 202Madre: 65Control: 47
P
P
P
CD42-b (GP Ib)(IFM)P:25Madre: 171Control: 257Relación CD42b/FSHP: 0.12M: 2.6C: 5.5
CD61 (GP IIIa)(IFM)P: 389Madre: 176Control: 167Relación CD61/FSHP: 1.93M: 2.7C: 3.6
Paciente
Madre
Síndrome de BERNARD SOULLIER
CD42-b
CD61
![Page 46: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/46.jpg)
27/05/1987. Paciente de 52 años, sexo masculino, que consulta por hemorragia post extracción dentaria que requirió internación y transfusión en 1960. Presentaba sangrado profuso por heridas. En su familia una hermana presentaba epistaxis. Sus dos hijos no tenían manifestaciones de sangrado.Los estudios mostraron TS cohibido a los 10 minutos, leve trombocitopenia, ausencia de agregación con ristocetina que no corrigió con PN. Debe operarse de vesícula.Diagnóstico: trombocitopatía severa con sospecha de síndrome de Bernard-Soulier.
5/08/2008. El paciente no se operó ni se atendió en ningún centro durante este período.
Recuento de plaquetas: 124.000 mm3
Citometría
Paciente: 114 media FSH
Control normal: 49 media FSH
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Citometría
CD42b: dos poblaciones con diferente nivel de expresión de Ib, una que representa 70% del total de las plaquetas del paciente con 22% de densidad respecto del normal. La segunda población (30%), con 4% de densidad respecto del normal
CD61: idéntico nivel de expresión respecto del normal
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GP Ib-V-IX:
- von Willebrand tipo plaquetario (PT-VWD)Desordem hemorrágico, raro, autosómico dominante, debido a una mutación en GP Ib que produce una aumento de afinidad por el facotr de von Willebrabd (VWF). Con frecuencia se diagnostica mal como VWD2B por las similitudes entre estas condiciones.
Trombocitopatías hereditarias
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Giannini S, 2010
Agregación con ristocetina
Unión de VWF a plaquetas en presencia de concentraciones crecientes de ristocetina.Azul: PRP normal + ristocetina 1.2 mg/mlRojo: PRP de paciente con VWD-PTGris: PRP de pacientes con VWD-2B (n:4)
![Page 50: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/50.jpg)
Ensayos de mezclas para agregación y CF
Unión de VWF a plaquetas en presencia de de ristocetina 1mg/ml en mezclas de plaquetas lavadas y plasma.
Rojo: plaquetas lavadas control + plasma control
Verde: plaquetas lavadas control + plasma paciente
Negro:Plaquetas lavadas paciente + plasma paciente
Azul: plaquetas lavadas paciente + plasma del control
Giannini S, 2010
![Page 51: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/51.jpg)
IIHEMA-ANM
Relacionadas al MYH9 Relacionadas al MYH9 (Síndrome de Sebastian, Síndrome de Fechtner, Síndrome de Epstein, Anomalía de May-Haegglin)(Síndrome de Sebastian, Síndrome de Fechtner, Síndrome de Epstein, Anomalía de May-Haegglin)
TROMBOCITOPENIAS HEREDITARIASTROMBOCITOPENIAS HEREDITARIAS
![Page 52: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/52.jpg)
![Page 53: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/53.jpg)
Dispersión frontal- Tamaño (FSH)P: 152Control: 66
CD42-b (GP Ib)(IFM)P: 145Control: 63
Relación 42b/FSHP: 0.95C: 0.95
CD61 (GP IIIa)(IFM)P: 463Control: 168
Relación 42b/FSHP: 3.04C: 2.54
P
P
P
MYH9 ?
CD42-b
FSH
CD61
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Hipótesis de sangrado en MYH9
![Page 55: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/55.jpg)
Densidad de expresión de glicoproteínas en macrotrombocitopenias
![Page 56: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/56.jpg)
CD41CD61
CD61
Paciente: negroNormal: blancoControl negativo: gris Gresele P et al. Haematologica 2009;94:663-669
El análisis molecular revela una nueva mutación en el gen de β3 que determina una deleción, produciendo la pérdida de los aminoácidos 647-686 del ectodominio de la integrina β3.
![Page 57: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/57.jpg)
. Déficit de gránulos densos: déficit de pool de depósito, Hermansky- Pudlak, Chediak Hygashi, TAR, Wiskott-Aldrich.
. Déficit de gránulos alfa: Gray, White, Quebec, Paris-Trousseau-Jacobsen.
. Déficit combinado alfa y densos
Trombocitopatías hereditarias
Anomalías de los de los gránulos plaquetarios
![Page 58: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/58.jpg)
FgVw
ADPATP
GP
MARCACION INTRAPLAQUETARIA
PRP (300.000/ul) 5 ul en 50 ul de tampón isotónico
PRP, SE (EXTRACCIÓN CON EDTA 2% o CITRATO)
MEPACRINA, (QUINACRINA MUSTARD, 0.2 mM CF)
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
40L BUFFER, 5 L MEPA, 5 L PlQ.
40L BUFFER, 5 L BUFFER, 5 L PlQ.
INCUBACIÓN-40min
LAVADO
CITÓMETROMEPACRINA
NORMAL
MEPACRINA
PACIENTENEGATIVO
![Page 59: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/59.jpg)
SuperficieIIb
SuperficieIIIa
TotalIIb
TotalIIIa
Control depermeabilizaciónCD63
FIJACION PFA 1%10 min
MARCACION INTRAPLAQUETARIA
FgVw
ADPATP
GP FgVw
ADPATP
GP
PERMEABILIZACION SAPONINA 1%
Marcación:
- CN adecuados
- Controles positivos de permeabilización
![Page 60: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/60.jpg)
SÍNDROME DE GRAY
IIHEMA-ANM
Nurden, P. et al. Blood 2004;104:107-114Nurden, P. et al. Blood 2004;104:107-114
a-Fg INTRAPLAQUETARIO
control PACIENTE
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Anomalías en las vías de transducción de señales
. Anomalías en la vía del AA/ tromboxano A2
. Defecto en la movilización del Ca 2+
. Deficiencia en proteínas G (GQ)
. Defectos en la fosforilación de
plecstrina y metabolismo
del fosfatidilinositol…
ect, ect, ect
Trombocitopatías hereditarias
![Page 62: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/62.jpg)
Orai 1
Ca 2+
RE
Ca 2+
Ca 2+Ca 2+
IP3-R
PLC
PIP 2
IP 3 DAG+Ca 2+
PKCCALDAG-GEFI
RIAM
Rap1 GDP
Rap1 GTP TALIN
KLENDIN3
AGONISTA
TALINKLENDIN3
MOVILIZACION DE CALCIO
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MOVILIZACION DE CALCIO
Sbrana S, Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 74B:30–39 (2008)
![Page 64: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/64.jpg)
Adquisición de las muestras
Escala lineal:• para intervalos regulares• apropiada para señales que oscilan en un rango limitado (0-1.000)
Escala logarítmica:• para intervalos crecientes• cubre un rango más amplio de variación de la señal (0-10.000)
MOVILIZACION DE CALCIO
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MOVILIZACION DE CALCIO METODOLOGÍA:PL en Buffer conCa2+ ( 1mM)Incubación con FURA-2Lavado, Resuspensión
Control positivo: ionóforo de calcio
Evitar el exceso de marca: - disminuye la sensibilidad - puede resultar en compartimentalización del colorante
Sin estímulo
Col 1g/mL
Col 8g / mL
IIHEMA-ANM
Acetoximetil éster (AM) del Fluo-3
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BUFFER + Thr
HT + Thr
BERMEJO E et al, 2003
Acetoximetil éster (AM) del Fluo-3
MOVILIZACION DE CALCIO
![Page 67: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/67.jpg)
. Receptor de tromboxano A2
. Receptor adrenérgico
. Receptor del ADP, P2Y12
Trombocitopatías hereditarias
Anomalías de los receptores para agonistas solubles
![Page 68: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/68.jpg)
PGE1
AMPc
VASP VASP-P
PLAQ. ACTIVADAS PLAQ. INHIBIDAS
PKA
ACADP P2Y12
REACTIVIDAD DEL RECEPTOR P2Y12KIT-BIOCYTEX-CF
MULLER i, 2003BARRAGAN P, 2003
Anticuerpo anti VASP-P
![Page 69: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/69.jpg)
Flow cytometric analysis of intraplatelet VASP phosphorylation for the detection of clopidogrel resistance in patients with ischemic cardiovascular diseases
( IFM PGE - IFM PGE+ADP )X100 = IRP
IFM PGE.
J Thromb Haemost 2005
![Page 70: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/70.jpg)
J Thromb Haemost 2005
J Thromb Haemost 2010
DIAGNOSTICO: alteraciones en el receptor de P2Y12
TERAPÉUTICA: resistencia al clopidogrel
![Page 71: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/71.jpg)
Placa
Activación plaquetaria asociada a cambios en el flujo
Flujo estenótico
Desaceleración
AceleraciónTurbulencia
Activación plaquetaria asociada a endotelio activado
Marcadores de activación plaquetaria
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Michelson AD (Platelets, Second Edition)
Marcadores de activación plaquetaria
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Aplicación de la citometría de flujo
Marcadores de activación plaquetaria:
- expresión de marcadores de activación en la superficie de la plaqueta (ex vivo)
CD62PP-selectina
golll
Condiciones analíticas de difícil estandarización:
- anticoagulantes- tiempo de ensayo- controles negativos adecuados- expresión de resultados (% de eventos positivos, intensidad media de fluorescencia)- escasas referencias de CV intra einterensayo
IMF
% positivos
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Controls Patients Controls Patients Controls Patients0
5
10
15
20
CD62 CD63 B-FG
%p
osi
tive
pla
tele
ts
BERMEJO et al, Blood Coagul Fibrinolysis 2004; 15:1–6
RESULTADOS EN SMP (TE, PV)
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CINETICA DE UNIÓN
AGONISTAS: ADP 20M, Thr 1 a 5 U/ml, TRAP
DE RECEPTORES: PAC-1, a-FG, a-VWF, GPs
DE ACTIVACION: CD62P, CD63
IIHEMA-ANM
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0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25
% d
e p
osi
tivi
dad
IFM PAC-1 (SPD)
IFM PAC-1 (trombocitemia)
IFM PAC-1 (normal)
IFM PAC-1 (aspirina)
Tiempo (minutos)
Marcadores de activación plaquetaria
Activación de las plaquetas in vitro con agonistas en concentraciones sub-umbral para evidenciar hiperreactividad plaquetaria
trombocitemia
normal
SPD
aspirina
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Inflamación y hemostasia son procesos íntimamente ligados. Cada uno propaga e intensifica al otro. Cuando fallan los mecanismo de control, se genera el potencial para un círculo vicioso de trombogénesis e inflamación.
Hipercoagulabilidad e inflamación
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DNA CD66b CD42
DNA CD66b CD42
AGREGADOS MIXTOS PLAQ-LEUCO
![Page 79: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/79.jpg)
AGREGADOS MIXTOS PLAQ-LEUCO: ACTIVACION CON TRAP
![Page 80: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/80.jpg)
MICROPARTICULAS PLAQUETARIA: <1 μm/Annexin V+
![Page 81: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/81.jpg)
Activación plaquetaria mediada por anticuerpos: “Trombocitopenia inducida por heparina,
anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 – Heparina”
Tomer A, 1999
- Factor plaquetario 4- Anexina V
![Page 82: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/82.jpg)
Tomer A, 1999Anexina V
Control positivo
![Page 83: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/83.jpg)
Activación plaquetaria mediada por anticuerpos: “Trombocitopenia inducida por heparina,
anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 – Heparina”
Tomer A, 1999
![Page 84: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/84.jpg)
Especies reactivas del oxígeno (ROS): 2’-7’ diclorofluoresceína diacetato (DCF), liposoluble, pierde los grupos acetato en el interior de la célula, no puede salir, no fluorescente, cuando se oxida por efecto de los ROS emite fluorescencia en canal verde.
Glutatión reducido (GSH): mercury orange, se une de manera covalente a sulfidrilos(grupos(R–SH), emite fluorescencia en canal rojo.
Generación de ROS y contenido de GSH de plaquetas normales y talasémicos
Amer J, 2004
CD41 (IIb)
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DETERMINACIÓN DE ROS / GSH
M1
M1
50M1
92 M1
IFM 230
M1
IFM 170IFM 3
ROS- DCF-2-7-DICHLOROFLUORESCIN ACETATE
PROTOCOLO-1 MARCAR CON DCF-2 LAVAR-3 TRATAMIENTO (H2O2, Buffer, HON)
GSH-MO-MERCURY ORANGE
PROTOCOLO-TRATAMIENTO (H2O2, Buffer, HON)-MARCAR CON MO-LAVAR
PL+ H2O2 + HON
PL + H2O2 + BUFFER
PL+ H2O2 + HON PL + H2O2 + BUFFER
![Page 86: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/86.jpg)
CAUSA: Destrucción plaquetaria por anticuerpos que reconocen glicoproteínas específicas de la menbrana plaquetaria:IIb-IIIa, Ib-IX, Ia-IIa
TROMBOCITOPENIA INMUNE
![Page 87: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/87.jpg)
2Pool de superficie
(IgG asociada a sup. Plaq.), 100 moléculas,
unión de anticuerpos naturales que reconocen estructuras
modificadas sobre plaquetas viejas.
IgG
PLAQUETAS NORMALES
1Pool intraplaquetario
(IgG totales plaq.)20.000 moléculas
gránulos plaquetarios,adquiridas por pinocitosis
![Page 88: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/88.jpg)
INMUNOGLOBULINAS
METODOLOGIAS
•EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS TOTALES
•EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS ASOCIADOS A SUPERFICIE :
inmuno-radiometría
inmuno-fluorescencia directa
MAIPA y PAICA (especifidad del anticuerpo)
![Page 89: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/89.jpg)
Apectos metodológicos
-Obtención del plasma rico en plaquetas
- Lavado de plaquetas
-Anticuerpos: marcadores de población CD 41, CD 42,empleo de Ac anti-Igs F(ab)2
-Controles: control negativo de marcación, procesamiento en paralelo de por lo menos dos muestras normales
-Expresión de resultados: -IFM ajustando a región de FSH constante-2-INDICE: IFM / FSCH
-Valores de corte: IgG 11.0 IFM, IgM 6.0 IFM
![Page 90: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/90.jpg)
M1
Media: 36
M1
Media: 92CD41+
Control normal
Paciente
Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria:detección por citometría de flujo
![Page 91: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/91.jpg)
M1
M1
Paciente
Control normal
Negativo3 IFM
IgG10 IFM
IgG34 IFM
IgM3 IFM
IgM31 IFMNegativo
3 IFM
![Page 92: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/92.jpg)
Caso clínico:
Paciente de sexo femenino de 81 años con antecedentes de psoriasis que comienza hace un año con hematomas fáciles en miembros y tronco, sangrado en lesiones descamativas y episodios frecuentes de epistaxis que requieren en varias oportunidades tratamiento con taponamiento y cauterización. Derivada con diagnóstico presuntivo de Tromboastenia de Glanzmann.No tiene antecedentes de hemorragia post parto ni post exodoncia.TAC de cuello, tórax, abdomen y pelvis, proteinograma electroforético pendientes.
FechaFecha PlaquetasPlaquetas TSTS(Ivy)
AdhesAdhes..
LisisLisis TTPATTPA TP VIII vWF:Ag
vWF:RCo
22-11-11 239 x 109/L
2 min 8% 140 min 42 90% 110% 175% 154%
23-02-12 245 x 109/L
- - - - - - - -
05-03-12 237 x 109/L
18 min
(cohibido)- - - - - - -
Laboratorio IIHEMA
![Page 93: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/93.jpg)
Agregación 22-12-2011
![Page 94: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/94.jpg)
Agregación 22-12-2011
Liberación disminuida
Paciente derivada de otro centro que reporta un estudio de agregación tipo Tromboastenia de Glanzmann…
Se convirtió en un SPD ????
Liberación disminuida
![Page 95: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/95.jpg)
Agregación 23-02-2012
Volvimos al Glanzmann ???
Liberación disminuida
Liberación disminuida Cambio de forma
Cambio de forma
![Page 96: Diagnóstico de Trombocitopatías por CFgrupocitometria.org.ar/wp-content/uploads/2013/10/Dra... · 2013-10-19 · Diagnóstico de Trombocitopatías por CF Dra. Fabiana Alberto Departamento](https://reader033.fdocumentos.tips/reader033/viewer/2022041816/5e5ac7b9c10486359136d51d/html5/thumbnails/96.jpg)
Citometría de flujo
Paciente
FSH: 47 (media)CD 41 (GP IIb): 103.2 IMFCD 61 (GP IIIa): 156.3 IMFCD 42b (GP Ib): 198.7 IMF
Control normal
FSH: 56 (media)CD 41 (GP IIb): 100.9 IMFCD 61 (GP IIIa): 173.0 IMFCD 42b (GP Ib): 180.0 IMF
Tromboastenia de Glanzmann
Retracción Retracción coágulocoágulo
GP IIbIIIaGP IIbIIIa Fibrinógeno Fibrinógeno plaquetarioplaquetario
Tipo I ausenteausente ausenteausente ausenteausente
Tipo II disminuidadisminuida > 5%> 5% 30-60%30-60%
Variantes Alt.cualitativasAlt.cualitativas
- Hereditarias
- Adquiridas
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Agregación 05-03-2012
Trombastenia de Glanzmann !!!
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Agregación 05-03-2012
Estudio de mezclas paradetectar efecto inhibitorio
Partes iguales de PRP normaly PPP paciente.
Partes iguales de PRP normaly PPP normal no autólogo (control).
Plasma control
Plasma paciente
Plasma paciente
Plasma paciente
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50%PRP N + 50%PPP paciente
50%PRP N + 50%PPP N (no autólogo)
Inhibición de agregación enPRP normal
0 10 20 30 40 50 600
25
50
75
100
6.25%
12.5%
25%
50%
%PPP paciente en la mezcla
% in
hibi
ción
agr
egac
ión
max
ima
Inhibición dosis-dependiente, No potencia con incubación (1hora 37º)
Agregación 05-03-2012
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Inmunoglobulinas asociadas a plaquetas 05-03-2012Marcación directa sobre plaquetas lavadas con anti-IgG humana, anti-IgM humana. Selección de la población que marca para CD42 (GP Ib).
R2R1
Control Paciente
anti Ig-G anti Ig-G
CD42+ CD42+
anti Ig-Manti Ig-M
10.4 IMF176.5 IMF
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R1R2
Inmunoglobulinas asociadas a plaquetas 08-03-2012Marcación indirecta: plaquetas normales enfrentadas a plasma del paciente o plasma normal no autólogo, lavadas y resuspendidas medio tamponado. Luego marcación con anti-IgG humano o anti-IgM humana. Selección de la población que marca para CD42 (GP Ib).
anti Ig-G 240 IMFanti Ig-G
23 IMF
anti Ig-Manti Ig-M
Plaq normalesPlasma control
CD42+Plaq normalesPlasma paciente
CD42+