Diagnóstico das Leucemias na Infância Dra. Maria Lúcia de Martino Lee Instituto de Oncologia...
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Diagnóstico das Leucemias na Infância
Dra. Maria Lúcia de Martino Lee
Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP/EPM
Desenvolvimento das Técnicas de Coloração
• EHRLICH - 1877 NEUTRÓFILOS
Descrição morfológica das leucemias
BASÓFILOS
ACIDÓFILOS ( Eo)
SÉCULO XX
AVANÇOS TECNOLÓGICOS
Técnicas convencionais: morfologia e citoquímicaImunofenótipoCitogenética convencionalGenética molecular.Expressão genética/proteica.
Reconhecimento
da heterogenecidade das leucemias
SECULO XXI
• Reconhecimento subgrupos biologicamente homogeneos
• Identificação fatores prognósticos
• Delineamento de tratamentos mais específicos
Diagnóstico e Classificação
• Diagnóstico + classificação precisos = Essenciais para o estudo biológico e o sucesso terapêutico das leucemias infantis;
• Sistema de classificação ideal deve ser biologicamente relevante;
• Deve ser útil tanto ao onco-hematologista clínico, quanto ao pesquisador;
• Deve ser reproduzível e amplamente utilizável.
Diagnóstico das Leucemias
Morfológico
FAB
Citoquímica
POX/SB
PAS
Esterases
Imunofenotipagem
Linhagem
Sub-linhagem
Citogenética/Genética Molecular
Alterações:- estruturais- numéricas
Sangue PeriféricoSangue Periférico
Mielograma
Diagnóstico das LeucemiasAvaliação morfológica
Leucemias
SMDPTI
SHF HIVS.Chediak
Higashi
Aplasia Medular
Infiltração MO Tu
Calazar
AnemiaMeg
• Aspiração seca: a avaliação será enfocada apenas no SP e no estudo histológico da BIÓPSIA de MO.
• Cerca de 20 % dos pacientes com leucemia não apresentam blastos circulantes ao diagnóstico.
Diagnóstico das LeucemiasAvaliação morfológica
Diagnóstico e Classificação das Leucemias
• Representam 95 % das leucemias infantis• Proliferação de células imaturas: BLASTOS.• Sua enumeração na MO é fundamental para
a definição diagnóstica de leucemia aguda.
AGUDAS
CRÔNICAS
• Representam 3 a 5 % casos das leucemias infantis.
• Proliferação de células relativamente bem diferenciadas.
Avaliação Morfológica/Citoquímica
• Introduzidas na década de 60, algumas colorações citoquímicas (MPO, SBB, NSE) auxiliam na definição da linhagem e no diagnóstico de alguns subtipos de LMA.
Mieloperoxidase (MPO)
• Cora os grânulos primários dos precurssores granulocíticos e menos intensivamente dos monócitos.
• Ainda é considerada a reação “gold standard” para a diferenciação morfológica entre blastos linfóides (negativos) e mielóides (positivos).
MPO
Negro de Sudan (SBB)
• Coloração não enzimática dos fosfolipídeos das membranas dos grânulos. Interpretação de positividade paralela a MPO, porém mais intensa.
Esterases não Específicas (NSE):Esterases não específicas (NSE):
• alfa naftil acetato ( ANA ) esterase
• alfa naftil butirato (ANB) esterase
• Cruciais para a determinação de monoblastos/monócitos. É descrita em escala de 0 a + 4, e somente em níveis +3 ou +4 é caracterizado o blasto como monocítico.
• Monócitos maduros reagem menos intensamente que monoblastos.
ANB esterase
PAS
• Demais (PAS, Esterase Específica - CAE), Fosfatase Ácida, Ferro Medular): são atualmente de limitado valor diagnóstico.
Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica
Linfóides:– Representam 80 % das leucemias infantis.– Caracterizam -se pela presença na MO de >25 %
de blastos de características linfóides.
MIelóides:– Representam 20% das leucemias infantis.– Blastos constituem no mínimo 30% do total das
cels nucleadas ou não eritróides da MO ou mais de 20% de acordo OMS.
Classificação FAB (1976):• Primeira a unificar a classificação das
leucemias• Permitiu a comparação entre diferentes
protocolos terapêuticos• Atualmente,ainda é a base
citomorfológica para a classificação das LMA e SMD.
Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica
FAB
LLA LMA SMD(L1, L2, L3) (M1 – M6)
1985(M7)
(RA, RARS, AREB, AREBt, LMMC)
Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica
Classificação MIC (1986): • Classificação das LLA e posteriormente das LMA.• Baseia-se em critérios morfológicos, imunológicos
e citogenéticos.
Classificação da OMS (2001):• Inclui achados morfológicos/citoquímicos, além
de características imunofenotípicas, genéticas e clínicas específicas.
Outras classificações
Classificação Morfológica FAB LLA
L1 L2 L3
Classificação Morfológica FAB - LLA
Classificação Morfológica FAB - LMA
M3v
M4Eo a/b
LMA - M0
LMA – M1
LMA – M2
LMA - M2
LMA - M3v
LMA – M4Eo
LMA – M5
LMA – M6
LMA – M7
Proporção aproximada de casos LMA na infância por subtipos
M0 M1 M2 M3 M4 / M4Eo M5 M6 M7
2 10
25
1025
22
2 4
Imunofenotipagem das Leucemias Agudas
Dra. Maria Lúcia de Martino Lee
Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP/EPM
Imunofenotipagem das leucemias agudas (LA)
Principais finalidades
Diagnóstico das LA• Definir linhagem/
sublinhagem celular (mieloides,linfoidesB, linfoides T, NK)
• Definir estágio maturativo do blasto
• Detecção DRM
Futuro• Desenvolver e
monitorar novas terapias alvo(enzimas de superfície, moléculas de adesão, receptores de citocinas
Citometria de Fluxo Metodologia
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Citometria de Fluxo Metodologia
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Citometria de Fluxo
Vantagens do método
• Mede múltiplos parametros em células individuais
• Grande número de células analisadas com rapidez
• Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos
• Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares
Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.
Imunofenótipo da LLA
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Desenvolvimento da linhagem mielóide
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
ImunofenotipagemTriagem Inicial – Painel de Marcadores
Linhagem Marcadores Imunológicos
Linfóide B CD19 CD79a CD10 CD22
Linfóide T CD3 CD7
Mielóide Anti-MPO CD13 CD33 CD117
Não específica
CD45 CD34 tdt
Classificação Imunológica das LLA Infantis
IMF
Marcadores monoclonaisCD19/
CD79a CD10 Cy Igs CD3cy%
casos
Pró B + - - - - 1
Comum + + - - - 50-60
Pré B + + + - - 20-25
B + +/- - + - 3
T - +/- - - + 18
MLL,t(4;11)
TEL-AML,Hiperdiploidia
t(1;19)
t(8;14)
Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.
Classificação Imunológica da LLA T
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Classificação Imunológica da LLA T
Marcadores positivos• CD 3c, CD 7 • CD5, CD2, tdt• CD10 (45 %)• CD45
Marcadores positivos/negativos• CD19, CD 13, CD33
Marcadores negativos• CD79a• MPO
• CD1a, CD3, CD4, CD8 <45 % casos
• Subdividida 3 estágios maturativos: Dificíl correlação prognóstica
LLA com co-expressão de antígenos mielóides
• Crianças: 4 -35 %• Sem valor prognóstico
independente
CD22cytdt
CD19
CD10
CD79
CD33 (25%)
CD13 (23%)
CD15 (16%)
CD14 (16%)
Imunofenotipagem na LMA
Essencial:–LMA -MO–LMA - M7
Auxiliar:–LMA -M6–LMA - M3–LMA - 2 v–LMA -M4Eo–LMA - M5
Imunofenotipagem das LMAs
Marcadores negativos
MPO
CD3c
CD 79a c
CD 22 c
LMA minimamente diferenciada
Marcadores positivosCD 13CD 33
CD 117
---------------------------CD34,38,HLA-dr, tdt 1/3 dos casos
----------------------CD 11b,15, as vezes
CD2,7,19 fracos
Leucemia Megacarioblástica Aguda
Marcadores Positivos
• Plaquetários:– CD 41, CD 42,CD 61
Marcadores Negativos ou Positivos:
• Mielóides:– CD13 +, CD 33+,CD 117+
Marcadores Negativos:– anti MPO, CD 34, CD 45,HLA - DR
Eritroleucemia
Marcadores positivos
• Mielóides:
– CD117, CD13
• Eritróides:
– Glicoforina A
Marcadores negativos
• anti MPO
Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.
Leucemia Aguda de Linhagem Ambígua
• Leucemias agudas indiferenciadas
• Leucemias agudas bifenotípicas
• Leucemias agudas bi-linhagem
Leucemias Agudas Indiferenciadas
• 1 - 3% leucemias agudas
• Amplo painel de marcadores negativos
• Em geral: CD34+, HLA-DR+, CD38+, CD7+, tdt+.
Leucemias Agudas Bifenotípicas
• Concomitância de marcadores imunológicos no mesmo blasto– Mielóide + B– Mielóide + T– T + B
• 4-6% das leucemias agudas
CD19
MPO
MPO
CD19CD22
Ro
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Leucemia aguda bi-linhagem• Duas populações distintas de blastos
expressando marcadores diferentes
CD19
CD19
CD22
CD79a
CD19
CD19
CD22
CD79a
CD33MPO CD33
MPOCD13
CD33
MPO
CD33MPO
CD13
Doença Residual Mínima
• Técnicas moleculares (FISH, RT-PCR)
• Citometria de fluxo:
– fenótipos anômalos
– Assincronismo maturativo
– Infidelidade linhagem
– Anormalidades quantitativas
– Ausência de antígenos
DRM em LLA - SLE
Rowe JM. Clinical Harmatology. Harcourt Çublishers, London, 2002.
Recidiva LLA vs DRM
Rowe JM. Clinical Harmatology. Harcourt Çublishers, London, 2002.