DIAGNÓSTICO “IN VITRO” - RADIOIMUNOENSAIO E ELISADIAGNÓSTICO “IN VITRO” - RADIOIMUNOENSAIO E ELISA

TIREÓIDETSHAnti-receptor TSHT3 e T4 livresTBGCalcitonina TSH neonatal

FERTILIDADE Estradiol UltrasensívelProgesterona HCG Estradiol

MARCADORES TUMORAIS

PSA total

PSA livre

ENDOCRINOLOGIA

ACTH

Aldosterona

ReninaDIABETES

Insulina

Peptídio C

TOXICOLOGIA

FARMACOLOGIA

ALÉRGENOSAC DE ALERGIAS

DOENÇAS VIRAIS E BACTERIANAS

Radioimunoensaio (RIA ou RIE)

Vantagens • Sensível, rápido e preciso• Análise quantitativa de reação Ag-AC• Limiar detecção: nanogramas (10-9 g) e picogramas (10-12g)

Limitações• Alto Custo• Vida média dos reagentes (radioisótopos)• Risco operacional

Radioisótopos mais usados• 125I - vida média de 57,5 dias e 131I – vida média de 8 dias

Etapas do teste• Cuva de calibração: diluições de substâncias com concentrações conhecidas (padrões/calibradores)• Ensaio • Contagem da radiação: ou (contador de cintilação) ou γ (contador de radiação gama)• Controle de qualidade

Tipos de RIE• RIE direto de competição com Ag marcado• RIE direto de competição com AC marcado• Ensaio Imunorradiométrico (IRMA)

Radioimunoensaio

Princípio:

• Ac que reconhece especificamente o analisado

Soro com quantidadedesconhecida de analisado

eSoro com analisado

marcado I125

ACACACACAC

+ =

Precipitado com baixas contagensSoro tem muito analisado circulante

Precipitado comaltas contagensSoro tem pouco analisado circulante

RIE direto de competição com Ag marcado

• AC ligado ao suporte sólido• Adição do Ag marcado + amostra ou padrão• Lavagem para remoção Ag não ligado• Medida da radiação

Resultados: Ag na amostra ou padrão = radiação

Ag na amostra ou padrão = radiação

RIE direto de competição com AC marcado

• AG ligado ao suporte sólido• Adição do AC marcado + amostra ou padrão (Ag)• Lavagem para remoção AC não ligado ao Ag fixado ao suporte sólido.• Medida da radiação

Resultados: Ag na amostra ou padrão = radiação

Ag na amostra ou padrão = radiação

Ensaio Imunorradiométrico (IRMA)

• Quantidade fixa Ac no fixada no suporte• Adição da amostra (quantidade Ag desconhecida) ou padrão (quantidade Ag conhecida)• Incubação • Lavagem e remoção dos Ag não ligados• Adição do 2º AC (marcado) • Lavagem e remoção dos 2º AC não ligados• Medida da radiação

Resultados: Ag na amostra ou padrão = radiação

Enzimaimunoensaio

• Quantitativo = reação AG-AC monitorado através de atividade enzimática

Vantagens:• Alta sensibilidade• Reagentes estáveis e seguros• Rapidez

Exigências para a enzima ser usada no teste:• Alta atividade específica• Produto formado estável• Fácil quantificação• Ser estável, de preço acessível e de fácil obtenção• Ex: peroxidase, fosfatase alcalina, glicose oxidase, -galactosidase, anidrase carbônica,acetilcolinesterase, glucoamilase, lisozima, malato desidrogenase, glicose-6-P-desidrogenase,ribonuclease

Métodos:ELISA (Ensaio Imunosorbente Ligado a Enzima)EMIT (Imunoensaio enzima multiplicado)Imunoblotting

ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima

Objetivo:• Quantificar um antígeno pelo uso de um AC específico ligado à enzima

ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima

1. Imobilização do AC ou AG em um meio sólido (agarose, poliacrilamida, placas poliestireno,etc)2. Bloqueio dos sítios reativos da placa com proteína (leite desnatado, soroalbumina bovina,gelatina, caseína, etc).3. Diluição da amostra4. Lavagens entre os períodos de incubação5. Para revelação da reação usar substrato cromogênico da reação enzimática(ex. H2O2, ortotoluidina, ABTS e TMB).