Diagn6stico Laboratorial da Talassemia Alfa em uma...

Diagn6stico Laboratorial da Talassemia Alfa em uma Familia daCidade de Natal, Rio Grande do Norte

I - Professor Adjunto da Disciplina de Hematologia Clinica, Departamento de AnaJises Clfnicas e Toxicol6gicas, Universidade Federal do RioGrande do Norte2 - Aluna do Curso de Farmacia - Habilita~ao Farmaceutico-Bioqufmico Analista Clfnico, Universidade Federal do Rio Grande do Norte

3 - Professor Substituto da Disciplinade Hernatologia C1fnica,Departamento de AnaJisesClinicas e Toxicol6gicas, Universidade Federal do RioGrande do Norte4 - Medico Hematologista, Hospital Universitario Onofre Lopes, Universidade Federal do Rio Grande do Norte

A talassemia alfa constitui um grupo de doent;as hereditarias,

de distribuit;oo mundial, causada pela deficiencia de sintese das ca-

deias alfa da hemoglobina. 0 desequilibrio na produ<;oo de cadeias

de globina resulta na forma<;oo de precipitados intra-eritrocitarios

levando a uma diminui<;oo da sobrevida dos eritrocitos. 0 fenotipodos portadores de talassemia alfa e diverso e depende do numero

de genes que sofrem delet;oo, podendo levar a cinco diferentes

genotipos talassemicos (-a/aa; -a/-a; -/aa; -/-a e -/-).0 presenteestudo teve como objetivo investigar a presen<;a de talassemia alfa

em uma familia da cidade do Natal, RN. 0 estudo foi realizadoa partir da avalia<;oo laboratorial de uma paciente de 52 anos

encaminhada ao Laboratorio de Hematologia do Departamento

de Analises Clinicas e Toxicologicas da UFRN, com suspeita c1inica

de talassemia alfa. A popula<;oo de estudo foi constituida de 13

membros, respectivamente, pai, moe e 10 irmoos do caso referencia,

todos eles naturais do estado do Rio Grande do Norte. A avaliat;oo

laboratorial constou de eritrograma, contagem de reticulocitos,

eletroforese em acetato de celulose pH 8,5, dosagem de Hb A2,

dosagem de Hb Fetal e pesquisa de agregados de hemoglobina H

em eritrocitos incubados com azul de cresil brilhante a 1% durante1 hora a 37°C. A metodologia utilizada permitiu a identifica<;oo

de cinco portadores de talassemia alfa no familia estudada (caso

referencia, moe e tres irmoos), nos quais foi evidenciada a presen<;a

de inclusoes eritrocitarias de hemoglobina H.

Summary

Laboratorial diagnosis of alpha thalassemia in afamily of Natal city, Rio Grande do Norte

Alpha thalassemia constitutes a group of inherited disorders,with worldwide distribution, caused by deficient synthesis ofa-globin chains of hemoglobin. The imbalance in the productionof globin chains forms intracellular precipitates giving rise to ashortened red cell survival. The phenotype of alpha thalassemiacarriers is varied and depends of the number of genes that aredeleted, what can lead to five different thalassemic genotypes(-alaa; -a/-a; -/aa; -/-a and -/-). With the aim to investigatethe presence of alpha thalassemia in one family of Natal city, RNthis study was accomplished from the laboratorial evaluation ofa 52-years old patient guided to the Hematology Laboratory ofClinical Analysis and Toxicology Department of Federal Univer-sity of Rio Grande do Norte state, with clinical suspect of alphathalassemia. The laboratorial evaluation included blood count(red cell count, hemoglobin, hematocrit and red cell indices),reticulocyte count, cellulose acetate electrophoresis, pH 8.5,measurement of hemoglobin A2 and Fetal and demonstration ofhemoglobin H inclusion bodies. This methodology allowed theidentification of five alpha thalassemic carriers in the studiedfamily (reference case, mother and three brothers), in which wasevidenced the presence of hemoglobin H inclusions.

Introdu~iio hemoglobinas possuem duas cadeiasalfa que se combinam com duas ca-deias beta (Hb A, a2~2)' duas cadeiasdelta (Hb A2, aiiJ ou duas cadeiasgama (Hb F, a2Y2)' As cadeias globf-nicas sac codificadas por genes orga-nizados em complexos multigenicos

5 hemoglobinas humanassac tetrameros formadospor dois pares distintos

de cadeias polipeptfdicas de globina.No indivfduo adulto, os tres tipos de

chamados de clusters, localizados noscromossomos 11 e 16. Desse modo,o cluster a ocupa cerca de 30 kb dobrac;ocurto do cromossomo 16, sendoos genes distribufdos na ordem: 5' - S2'\jfSl' \jfa2, \jfal, 0.2' 0.1' 81 - 3'. Os genesdo cluster ~esUio distribufdos ao longo

de cerca de 60 kb no brac;o curto docromossomo 11 na seguinte ordem:5' - £, f, t, 8, P - 3' (1).As talassemias sac causadas por

uma reduc;ao ou ausencia da sfntesede um dos tipos de cadeias de glo-bina que formam as hemoglobinas,acarretando um desequilfbrio nasquantidades relativas das cadeiaspolipeptfdicas. Esse desequilfbriona produc;ao de cadeias leva a umaeritropoese ineficaz e diminuic;ao dasobrevida eritrocitaria. As talassemiassac c1assificadasde acordo com 0 tipode cadeia cuja produc;ao esta prejudi-cada, onde as mais frequentes sac astalassemias alfa e beta (1, 2).A talassemia alfa resulta de um

defeito na sfntese das cadeias de alfaglobina frequentemente causada pordelec;oes envolvendo um dos genes(talassemia a+) ou ambos os genes(talassemia aD)de alfa-globina locali-zados no cluster alfa do cromossomo16 (16p13.3). as indivfduos normaistem dois genes alfa em cada cromos-somo, de modo que 0 seu genotipo erepresentado por aa/aa. Nas talasse-mias a+ um dos genes e perdido pordelec;ao(-a/aa) ou inativado por umamutac;ao de ponto (aTa/aa), sendoessa ultima denominada talassemiaalfa nao delecional. Na talassemia aDocorre a delec;ao de ambos os genesalfa (--/aa), mais comumente pordelec;oes envolvendo parte ou todogene alfa. A produc;ao desequilibradada produc;ao de cadeias alfa leva a umexcesso de cadeias gama e cadeiasbeta que formam tetrameros insta-veis (Y4 = Hemoglobina Bart's e P4 =hemoglobina H) (1-3).A heterozigose da talassemia a+

(-a/aa) caracteriza-se por delec;ao deum unico gene da a-globina e umaescassa reduc;ao da sfntese das ca-deias a-globina. Ao nascimento apre-

sentam 1 a 3% de Hb Bart's, comalterac;oes hematologicas mfnimasou ausentes no adulto. Raramentepodem ser vistas inclusoes eritroci-tarias de Hb H (4, 5).as heterozigotos da talassemia aD

(--/aa) e os homozigotos da talas-semia a+ (-a/-a) sac caracterizadospela delec;ao de dois genes alfa emum mesmo cromossomo ou em cro-mossomos distintos, respectivamente.Sao clinicamente normais, poremapresentam discretas microcitose ehipocromia na vida adulta. No perfodoneonatal tem cerca de 2 a 8% de HbBart's (4, 6).A doenc;a da Hb H e determinada

pela interac;ao das formas aD e a+(--/-a) e caracterizada por um qua-dro de anemia hemolftica cronica deseveridade variavel apresentandonfveis de hemoglobina entre 8 e 10 g/dL. No adulto, a Hb H varia entre 2 a40%, enquanto que 0 recem-nascidoapresenta concentrac;oes de Hb Bart'sentre 10 e 40% (4, 7).A homozigose da talassemia aD

(--/--) corresponde a hidropisia fetalpor Hb Bart's que tem como conse-quencia a morte intra-uterina entrea 28a e 38a semanas de gestac;aoem 25% dos fetos ou algumas horasapos 0 nascimento, por hipoxia, he-patoesplenomegalia, ascite e edemageneralizado (7).a presente estudo teve como ob-

jetivo investigar a presenc;a de talas-semia alfa em uma famflia da cidadede Natal, Rio Grande do Norte.

No perfodo de marc;o a junho de1999, foi realizado um estudo a par-tir da avaliac;ao laboratorial de umapaciente de 52 anos de idade (caso

referencia) encaminhada ao Laborato-rio de Hematologia do Departamentode Analises Clfnicas e Toxicologicasda Universidade Federal do Rio Gran-de do Norte com suspeita c1fnica detalassemia alfa e de 12 membros dafamflia, respectivamente, pai, maee 10 irmaos, todos naturais do RioGrande do Norte.As amostras foram obtidas por

punc;ao venosa e 0 sangue colocadoem tubo contendo anticoagulante(EDTA). as parametros hematolo-gicos foram analisados atraves docontador automatico de celulas CellDyn, modele 1700 e a morfologia eri-trocitaria foi avaliada por microscopiaoptica comum, em objetiva de imersao(100x), apos colorac;ao da distensaosangufnea pelo Leishman. A contagemde reticulocitos foi realizada utilizandoazul de cresil brilhante (8).Para estudar 0 perfil eletrofore-

tico, apos 0 preparo do hemolisadocom c1oroformio, as amostras foramsubmetidas a eletroforese em ace-tato de celulose utilizando tampaoTris-EDTA-borato pH 8,5. a reconhe-cimento das hemoglobinas foi feitomediante 0 emprego de pad roeseletroforeticos conhecidos analisadossimultaneamente (9). A hemoglobinaA2 foi quantificada por eletroforeseem pH alcalino, utilizando 0 tampaoTris-EDTA-Borato pH 8,5 e fitas deacetato de celulose marca Cellogel,efetuando-se a corrida eletrofore-tica sob a diferenc;a de potencialde 300 volts durante 30 minutos.Apos 0 fracionamento, as bandascorrespondentes as hemoglobinas Ae A2 foram recortadas e elufdas emsoluc;ao de NaCI a 0,9%. A leituradas densidades opticas das frac;oesde hemoglobinas foi obtida em 415nm, utilizando-se espectrofotometroColeman modele 395-UV (10). A

quantificac;ao da hemoglobina Fetal(Hb F) foi realizada pelo teste dadesnaturac;ao alcalina (11).A pesquisa de agregados de hemo-

globina H foi realizada em eritr6citosincubados com azul de cresil brilhantea 1% durante 1 hora a 370C. Foramexaminados 250 campos com apro-ximadamente 200 hemacias/campototalizando 50.000 celulas (8, 12).

Resultadose Discussiio

A metodologia utilizada permitiua identificac;ao de cinco portadores

de talassemia alfa na familia estu-dada (caso referencia, mae e tresirmaos), nos quais foi evidenciada apresenc;a de incius6es eritrocitariasde hemoglobina H.Os dados de identificac;ao e os va-

lares dos parametros hematol6gicosdos 13 membros da familia estudadaencontram-se na Tabela 1. A Tabela2 apresenta 0 perfil eletroforetico e apesquisa intra-eritrocitaria de Hb H.De acordo com a Organizac;aoMun-

dial de Saude, 0 parametro usado paradeterminar anemia e a dosagem dehemoglobina cujos valores de referendasao: 13 g/dL para homens, 12 g/dL paramulheres e crianc;as com idades entre

sete e 14 anos, e 11 g/dL para crianc;ascom idade inferior a seis anos (13).Considerando-se os valores limites

para hemoglobina estabelecidos pelaOrganizac;ao Mundial de Saude verifi-cou-se que apenas 0 caso referenda(filho 3), 0 pai e 0 filho 9 apresentaramanemia com valores de hemoglobinade 10,2 g/dL, 12,8 g/dL e 11,8 g/dL,respectivamente.Quanto aos indices hematimetricos

e contagem de reticul6citos, nao foiobservada nenhuma alterac;ao,estandotodos os valores dentro da normalida-de. Apenas 0 caso referencia mostroualterac;ao da morfologia eritrocitariacom presenc;a de discreta anisocitose

Iidade I Sexo I (orI

Hto

IHb

IHcias

IV(M I H(M I (H(M I Reticol M f I ° 0 o' °

(anos) (%) (gjdL) (xl012jL) (ft) (pg) (gjdl) (%) or 0 ogla entrocltana

Poi 77 M Pd 38 12,8 4,08 92 31 34 1 Normal

Mae 78 F Pd 38 13,3 4,57 83 29 35 0,6 Normal

Filho 1 56 M Pd 45 15,1 5,04 89 30 34 0,8 Normal

Filho 2 55 F Pd 42 13,5 4,67 90 29 32 0,7 Normal

Filho 352 F Pd 30 10,2 3,61 83 28 34 1,2

Discreta hipocromia(coso referencia) e anisocitose

Filho 4 49 F Pd 39 13,5 4,56 86 30 35 0,8 Normal

Filho 5 46 F Pd 36 12,7 4,21 86 30 35 0,9 Normal

Filho 6 45 F Pd 35 12,0 4,18 84 29 34 0,5 Normal

Filho 7 44 F Pd 39 13,3 4,53 86 29 34 0,6 Normal

Filho 8 42 F Pd 37 12,5 4,19 88 30 34 0,7 Normal

Filho 9 40 F Pd 34 11,8 3,77 90 31 35 0,9 Normal

Filho 10 36 M Pd 43 14,7 5,06 85 29 34 0,5 Normal

Filho 11 34 F Pd 37 12,8 4,08 91 31 34 0,8 Normal

e hipocromia. Os demais membros dafamflia estudada nao apresentaramnenhuma alterac;ao morfol6gica.Os indivfduos normais tem quatro

genes alfa ativos. Os fen6tipos dosindivfduos com talassemia alfa sacdiversos e dependem tanto do numerode genes deletados como do tipo dedelec;ao, variando de portador silen-cioso a indivfduos que apresentamacentuadas anormalidades hemato-16gicas(7, 12).As talassemias alfa c1assificam-se

em quatro quadros c1fnicos e labora-

toriais: portador silencioso (tres genesex ativos), trac;o talassemico alfa (doisgenes ex ativos), doenc;a da hemoglo-bina H (um gene ex ativo) e HidropisiaFetal por Hb Bart's (nenhum gene exativo) (14).Em relac;aoao perfil eletroforetico,

todos os membros da famflia estudadaapresentaram genotipo AA e nfveisnormais de Hb A2 e Hb Fetal.A pesquisa intra-eritrocitaria de

hemoglobina H foi realizada em dis-tensao sangufnea apos colorac;ao comazul de cresil brilhante, fazendo a

contagem em 50.000 eritr6citos (250campos de aproximadamente 200 eri-tr6citos), totalizando um tempo de 20minutos para cada lamina observada.As inclus6es de Hb H foram eviden-ciadas em cinco membros da familia:caso referencia, mae e tres filhos. 0numero de eritrocitos contendo inclu-s6es de Hb H variou de 0,4 a 2,8 por10.000 eritrocitos. 0 maior numero deeritr6citos com inclus6es foi verificadono filho 3 (caso referencia).o numero de eritrocitos com in-

clus6es de Hb H e influenciado pelo

~

Inclusoes intra-eritrocitarias deHemoglobina H

Poi AA 96,8 3,0 0,2 Ausentes

Mae AA 96,5 2,9 0,6 Presentes (05) *

Filho 1 AA 96,5 3,1 0,4 Ausentes


Filho 3 (coso referencio) AA 95,0 3,3 1,7 Presentes(14)*


Filho 5 AA 96,8 2,3 0,9 Presentes(02) *


Filho 7 AA 96,0 3,2 0,8 Presentes (06)*

Filho 8 AA 97,2 2,5 0,3 Presentes (07) *




* Numero de eritrocitos contendo inclus6es de Hb H para cada 50.000 celulas contadasValores de referencia (Dacie & Lewis, 1995): Hb A: 96 - 98%; Hb A,: 2,2 - 3,5% ; Hb Fetal: <1,0%

genotipo da talassemia alfa. Nosheterozigotos da a+ talassemia (-alaa) as inclus6es de Hb H sac muitoraras (1:10000 a 1:50000); elas sacmais numerosas no trac;;oalfa talasse-mico com deleC;;aode dois genes a/fa(-a/-a e --/aa), porem 0 numero decelulas contendo inclus6es nao estarelacionado com 0 numero de genesa deletados e a ausencia de inclus6esde Hb H nao exclui um diagnostico detalassemia alfa. Na doenc;;ada Hb H asinclus6es sac encontradas em mais de30% dos eritrocitos (8, 15).o portador silencioso corresponde

aos heterozigotos da a+ talassemia(-a/aa), e assintomatico e nao apre-senta manifestac;;6es hematologicas

caracteristicas. Os parametros eri-trocitarios e a distensao sangufneasac normais ou muito discretamentealterados. Geralmente so e descobertodurante um estudo familiar (15). Noperfodo neonatal podem ter 1 a 2% deHb Bart's e na vida adulta podem apre-sentar ligeira hipocromia de detecC;;aodiffcil, ou 0 sangue periferico pode serperfeitamente normal (14).Com relaC;;aoa Hb H, nao se pode

descartar um resultado com base emuma pesquisa intra-eritrocitaria nega-tiva. 0 diagnostico definitivo so podeser dado apos analise de DNA (15).Na famflia em estudo, nenhum

dos membros possufa microcitose,de acordo com observaC;;aodo VCM e

da morfologia eritrocitaria. Isto talvezos enquadre no fenotipo de portadorsilencioso que aparece, normalmente,como um quadro assintomatico.Nao foi possivel a realizaC;;aoda

analise de DNA dos pacientes, destaforma nao se pode preyer com exa-tidao quantos membros da famfliaapresentam talassemia alfa, nem qualo provavel genotipo talassemico decada um deles. iJ

Correspondencia para:

Profa. Dra. Tereza Maria

Dantas de [email protected]

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mailto:[email protected]

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