Determinação da Determinação da actividade enzimática da actividade enzimática da

Fosfatase AlcalinaFosfatase Alcalina

Elaborado por:Elaborado por:

• Ana Carina Nogueira;• Ana Cláudia Costa;• Carla Saraiva;• Melissa Alves.

Fosfatase AlcalinaFosfatase Alcalina

• Enzima que remove grupos fosfato de diferentes moléculas (desfosforilação), principalmente os das extremidades 5’ do DNA, impedindo a sua ligação com outras moléculas de DNA;

• É mais activa em soluções alcalinas;

• É produzida por diversos órgãos e tecidos. Nesta experiência, será utilizada a da mucosa do intestino delgado do rato;

• A fosfatase alcalina é também utilizada em outras técnicas, como a marcação radioactiva e ensaios de imunodetecção.

DetecçãoDetecção da fosfatase alcalinada fosfatase alcalina

• A presença desta enzima é detectada pela reacção com o substrato incolor p-nitrofenilfosfato (pNPP);

• Os produtos desta reacção são um grupo fosfato e p-nitrofenol, cuja coloração é amarela, sendo assim detectado por absorvância a 405nm.

AbsorvânciaAbsorvância

• Quantidade matemática do processo de absorção da luz;

• É detectada usando um espectrofotómetro.

Lei de Beer-LambertLei de Beer-Lambert

A lei de Beer-Lambert, também conhecida como lei de

Beer ou lei de Beer-Lambert-Bouguer é uma relação empírica

que, na Óptica, relaciona a absorção de luz com as propriedades

do material atravessado por esta.

Isto se pode expressar de distintas maneiras:

Onde:

• A é a absorção.• Є é a constante de absortividade molar

(18500cm/M) .• l é a largura da cuvete.• c é a concentração.

Cinética enzimáticaCinética enzimática

S1 + E ES1 ES2 E + S2

• Iremos calcular velocidade máxima e constante de Michaelis-Menten (Km)

• A vantagem do uso de gráficos lineares é a quantificação precisa de Km e Vmáx através da extrapolação em linhas rectas em vez de assímptotas.

Cinética enzimática (cont.)Cinética enzimática (cont.)

Preparação de um extracto enzimático da Preparação de um extracto enzimático da mucosa intestinal de ratomucosa intestinal de rato

• Raspar a superfície interna do intestino do rato, para obter o extrato enzimático

Determinação da actividade da fosfatase Determinação da actividade da fosfatase alcalina a pH 8,5alcalina a pH 8,5

• Medir a absorvância antes e depois de adicionar a fosfatase alcalina, de modo a verificar a sua acção;

• Representar graficamente os resultados obtidos.

• Preparar uma solução com Tris-HCl, pNPP e NaCl;

Efeito da concentração de substrato na Efeito da concentração de substrato na actividade enzimáticaactividade enzimática

• Preparar 12 tubos com diferentes concentrações de reagentes;

• Ler absorvância;

• Fazer os gráficos normal e inverso da cinética da reacção em estudo e concluir sobre a mesma.