HGSAUFP

Desafios da Biologia Molecular

em Análises Clínicas

José Manuel Cabeda

Genefadi Farmacêutica, LdaUniversidade Fernando Pessoa

Centro Hospitalar do Porto

HGSAUFP

Áreas de Aplicação

• Situações Congénitas– Genéticas

• Diagnóstico• Diagnóstico pré-natal

– Epigenéticas

• Farmacocinética– CYP450

• Doenças adquiridas– Microbiologia

• Diagnóstico• Diagnóstico pré-natal• Resistência Fármacos• Genotipagem agente• Genotipagem

hospedeiro• epidemiológico

– Oncologia• Diagnóstico• Prognóstico• Follow-up

HGSAUFP

AplicaçõesIdentificação agentes Infecciosos

Vírus• HSV1/2• EBV• CMV• VZV• HHV-6• Enterovirus• HIV• HBV• HCV• HTLV-1• HPV• Poliomavirus (JCV e BKV)

Resistências• Meticilina• Glicopeptídeos• Rifampicina • Isoniazida• Antiretrovirais

Bactérias– Micobacterium

tuberculosis– Leptospira spp– Pneumonias atípicas

• Legionella pneumophila

• Micoplasma pneumoniae

• Chlamydia pneumoniae

– Staphylococcus spp.– Enterococcus spp.– Helicobacter pylori– Clostridium difficile

(tcdA,tcdB)– Bordetella pertussis– Borrelia burgdorferi– 16S rDNA

HGSAUFP

AplicaçõesIdentificação Agentes Infecciosos(II)

Enterovírus

HSV

Positivas13%

Negativas87% Negativas

56%

Positivas44%

B.burgdorferi M.tuberculosis

M.pneumoniaeLeptospiras

C.PneumoniaeH.pylori

Leptospira Bordetella pertussis

C.Difficile tcdA/tcdB Micobactérias

HGSAUFP

AplicaçõesIdentificação Resistências a drogas

Estirpe Tmelting (ºC)

Wild - type 61.5

Mut (A2142C) 58.0

Mut (A2142G) 53.0

Mut (A2143G) 53.6

Claritromicina (23S rDNA)

BACTÉRIARESISTÊNCI

AMUTAÇÕES

Mycobacterium

tuberculosisRifampicina

rpoB 526(CACGAC) 531 (TCGTTG) 533 (CTGCCG)

Isoniazida

katG 315 (AGCACC) 315 (AGCAAC)

Helicobacter pylori

Claritromicina

23S rDNA

HGSAUFP

AplicaçõesOncologia

• Quantificação Transcritos– bcr/abl

• Detecção Translocações– bcr/abl– pml/rar– aml/eto– Inv16– Bcl1/IgH– Bcl2/IgH

• Detecção Mutações oncológicas– BRCA1/BRCA2– P53– etc

• Resistência Drogas– Mutações bcr/abl

• Clonalidade– Linf. T (/ ou /)– Linf. B

HGSAUFP

Alterações genéticas associadas a patologias onco-hematológicas

• Translocações envolvendo os genes do TCR e Ig

• Genes hibridos resultantes de translocções

• Delecções• Inversões• Mutações pontuais• Alterações do padrão de metilação

HGSAUFP

Translocações envolvendo os genes TCR e Ig

Translocações envolvendo os genes do TCR e das Ig

Translocação Doença Gene afectado IgH t(8;14)(q24;q32) Burkitt C-Myc

t(11;14)(q13;q32) LNH-manto bcl-1 (CCND1/PRAD1)

t(14;18)(q32;q21) LNH-foliculares bcl-2 (apoptose)

t(14;19)(q32;q13) LLC-B bcl-3 (ciclina?)

t(3;14)(p27;q32)

t(5;14)(q31;q32) LLA-pre B IL-3 (citocina)

IgK t(2;8)(p12;q24) Burkitt

t(2;3)(p12;q27) LNH-célula grande bcl-6 (zinc-finger)

Ig t(8;22)(q24;q11) Burkitt

t(3;22)(q27;q11)

TCR- t(1;14)(p32;q11) Tal-1

t(10;14)(q24;q11) LLA-T TCL-3 (Hox11)

t(11;14)(p14;q11) LLA-T Rhombotin 1

t(11;14)(p13;q11) LLA-T Rhombotin 2 (TCL-2)

t(8;14)(q24;q11) LLA-T C-Myc

TCR-ß t(1;7)(p32;q35) LLA-T

t(7;9)(p34;q32) LLA-T Tal-2

t(7;11)(p35;p13) dominio LIM

t(7;9)(q34;q34.3) LLA-T & LNH TAN-1

t(;7)(q34;q34) LLA-T lck

t(7;19)(q34;p13) LLA-T LYL1

HGSAUFP

Genes hibridos resultantes de translocções

Translocação Doença Genes afectados t(9;22)(q34;q11) LMC;LLA adulto/LMA abl bcra t(15;17) (q22;q21) LMA-M3 PMLb RARd t(11;17)(q35;q21) LMA-M3 PLZFc RARd t(5;17)(q35;q21) NPMe RARd t(8;21)(q22;q22) LMA-M2 ETOc AML1 Inv(16)(p13;q22) LMA-M4Eo MYHf CBFBg t(6;9)(p23;q34) LMA,LMA-TdT+ DEK CAN inv(3)(q21;q26) LMA-M1 EVI1c t(3;3)(q21;q26) t(1;9)(q23;q13) LLA-pre B PBX1h E2A t(12;21)(p13;q22) LLA-prec.B infantis TEL AML1 t(2;5)(p23;q35) LNH-anaplásico ALKa NPMe t(4;11)(q21;q23) LLA-pre B ALLc AF4i t(1;11)(q32;q23) LAM AF1Pe t(6;11)(q27)(q23) LAM AF6i t(9;11)(p21;q23) LAM-M5,prec.B AF9i t(11;17)(q23;q21) LAM AF19 t(11;19)(q23;p13) LAM,LLA-prec. B ENLi t(8;13)(p11;q12) sindrome mieloproliferativo ZNF198 FGFR-1 a) tirosina cinase b) guanosina trifosfatase c) zinc finger d) receptor acido retinoico e) fosfoproteina f) gene da miosina g) factor de transcrição h) gene homeótico i) transdução de sinal

HGSAUFP

Bcr/abl

Os genes BCR e ABL normais, e as translocações que originam as proteínas p190 e p210 do gene quimera BCR-ABL. A proteína p210 é característica da CML, sendo a p190 a proteína BCR-ABL encontrada na maioria dos casos de ALL

HGSAUFP

pml/rar

A localização cromossómica e estrutura normal dos genes PML e RARa, e a translocação t(15;17)(q22;21) que origina o gene quimera PML-RARA.

HGSAUFP

Doenças Monogénicas

• Hemocromatose (HFE)• -Talassémia (HBB)• -Talassémia (HBA)• Anemia falciforme

(HBB)• Doenças raras (IGM)• Paramiloidose• etc

HGSAUFP

Doenças multifactoriais

• Trombose Venosa– FV-leiden– Protrombina

• Trombose Arterial– MTHFR– PAI-1

HGSAUFP

Breve História

• Anos 70-80– Métodos Hibridização– Sequenciação

• Anos 90– Automat. Extracção– Boom PCR

• Sec XXI– Real-Time-PCR– Pirosequenciação– Lab-on-a-chip

HGSAUFP

Desafios e Soluções

Preparação de Ácidos Nucleicos

Rápida, sensível, automática, fluxo contínuo

HGSAUFP

Desafios e Soluções

Amplificação de Ácidos Nucleicos

Rápida, sensível, automática, fluxo contínuoK.MullisPrémio Nobel Química1993

0

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

Num

ber o

f pub

licat

ions

1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004

Year of publication

Number PCR related publications

PCR (Research) PCR (Diagnostics)

Real-Time-PCR (Research) Real-Time-PCR (Diagnostics)

HGSAUFP

Desafios e Soluções

Amplificação e detecção simultâneas:

Real-Time

HGSAUFP

Desafios e Soluções

Quantificação e Genotipagem:Real-Time

HGSAUFP

Desafios e Soluções

Sequenciação:

HGSAUFP

Desafios e Soluções

Estudos Epidemiológicos estirpes

(Caracterização global de genomas)

HGSAUFP

“Novos” Desafios

HGSAUFP

Desafio #1

Near Patient testing

HGSAUFP

Desafio # 2

Aplicação Generalista

HGSAUFP

Microchips

Desafio # 2Aplicação Generalista

HGSAUFP

Multiplexing

Desafio # 2Aplicação Generalista

ID-Tag Mass-Tag In-chip PCR

HGSAUFP

Desafio # 2

Volume da amostra

Miniaturização

Menor custo Maior rapidez

Menor Volume

Menos Amostra utilizada

Mais testes exequíveis

Resultado com Menor

significado clínico

HGSAUFP

Desafio # 2

Aplicação Generalista

Septifast 16S rDNA + Sequenciação

HGSAUFP

Agradecimentos:

a equipa da UBM-HGSA

• José Manuel Cabeda• Ana Constança Mendes• Sandra Fernandes • Mónica Pereira• Cristina Correia• Paulo Brochado• João Rodrigues• Maria Luís Amorim

HGSAUFP

Equipa sempre renovada

• Alexandra Estevinho (HUC)• Anabela Silva (INSA)• André Fernandes (UCP)• Angela Santos (IPO)• Angélica Ramos (UA/IPATIMUP)• António Amorim (ICBAS)• Carla Cardoso (Bioportugal)• Carla Simões (IBMC)• Dora Bastos(UCP)• Elsa Lima (UCP)• Fernando Branca (Iberlab)• Filipa Ferreira (Est.TSS)• Francisco Dias (HGSA)• João Paulo (UCP)• Sónia Esteves(Lab. Pes.

Moreira)• Patricia Trabulo (ESTS

Bragança)• Luisa Boaventura (HUC)• Bruno Costa (ESTS Bragança)• Cristina (Estag. TSS)• José Miguel Oliveira (Hol.)• Margarida Monteiro (HPH)• Maria João Pinho (UM)

• Mariana Moreira(Genefadi)• Paula Carneiro (HGSA)• Paula Santos (UCP)• Pedro Mendonça (Açores)• Ruben (UCP)• Lara (UCP)• Helena Sofia Domingues (ICBAS)• Susana Moreira (ICBAS)• Susana Rocha (U.Minho)• Tânia Simões (U.Aveiro)• Vitória (UCP)• Pedro (UCP)• Bruno Roma (U.Pernambuco)• Renata Arruda (U.Pernambuco)• Maria Claudia Vicalvi (U.Pern.)• Claudia Carvalho (ICBAS)• Teresa (UMinho)• Nuno Canhoto (H.Évora)• Luisa Cavaleiro (H.Pedro Hisp.)• Carina Valente (ESTS Porto)• Fernando Alves (UFP)• Agostinho Pedro (UFP)• David Nunes (UFP)

HGSAUFP

Aplicações