Cultivo Celular aplicado à Oncologia
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Cultivo Celular aplicado à
Oncologia
Workshop do Projeto Própolis
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Cultivo celular aplicado à Oncologia
1. Banco de Células GPO
2. Estrutura Laboratorial
3. Linhagens Celulares
4. Testes de Avaliação
5. Resultados Publicados
6. Trabalhos em andamento
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• Infraestrutura:
Laboratório 8 – Laboratório de Embriologia Molecular e Transgênese
Laboratório 9 – Laboratório de Genômica Funcional
Grupo de Pesquisa em Oncologia
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Laboratório de Cultivo Celular
Sala do Cultivo:
• 2 Fluxo Laminar Vertical
• 1 Estufa de CO2
• Microscópio invertido
• Banho-Maria
• Centrifuga
Sala de Experimentação:
• Citômetro de Fluxo
• Leitor de placa
• Geladeira
• Botijões de Nitrogênio
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Banco de Células GPO
Linhagens de Células Humanas
A549 Carcinoma de Pulmão
5637 Carcinoma de Bexiga
HT-29 Adenocarcinoma de Colorretal
MCF-7 Adenocarcinoma de Mama
MDA-MB-231 Carcinoma de Mama
MG-63 Osteossarcoma
HeLa Adenocarcinoma Cervical
SH-SY5Y Neuroblastoma
LNCap Carcinoma de Prostata
HL-60 Leucemia Promielocítica Aguda
Outras Linhagens Celulares
CHO Ovário de Hamster Chinês
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Banco de Célula do Rio de Janeiro -
BCRJ
www.bcrj.hucff.ufrj.br/
Treinamento Banco de Células do Rio de Janeiro
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• estabelecida a partir do carcinoma da bexiga primário (grau II) de um paciente por Dr. G. Cannon em 1974;
• Meio: RPMI + 10% SFB, 37°C em 5% de CO2
• Adenocarcinoma alveolar de células epiteliais basais
• Esta linha foi iniciado em 1972 por D.J. Giard, através da cultura de tecido de carcinoma pulmonar de um homem;
• Meio de cultivo: DMEM + 10% SFB, a 37°C em 5% CO2
A549 – Carcinoma de Pulmão
5637– Carcinoma de Bexiga
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• Adenocarcinoma de Mama, retirada de mulher caucasiana de 69 anos, isolada em 1970;
• Possui expressão de receptores de estrogenio;
• Meio: RPMI + 20% SFB, 37°C em 5% de CO2
• Adenocarcinoma colorretal, retirada de mulher, caucasiana de 44 anos;
• Isolada em 1964 por J. Fogh de tumor primário;
• Meio: DMEM + 10% SFB, 37°C em 5% de CO2
HT-29– Adenocarcinoma de Colorretal
MCF-7– Adenocarcinoma de Mama
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Realização de Experimentos no Cultivo Celular
1. Novas drogas antitumorais:
Chalconas
2. Drogas antitumorais modificadas estruturalmente:
AZT: AZT-Se-Me e AZT-Se-CL
Disseleneto de Difenila
3. Drogas antitumorais Nanoencapsuladas:
Tretionoína
Metotrexato
4. Compostos com ação antitumoral:
Própolis Vermelha
5. Outras Estratégias:
BCG recombinante
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1. Morfologia
2. Ensaio de MTT
3. Colorações
4. Citometria de fluxo
5. Expressão Gênica
6. Western blotting
Formas de avaliação da ação antitumoral
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Brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio
Avalia a atividade metabólica das células;
• Teste de triagem:
amplamente utilizado na avaliação do efeito antiproliferativo de drogas tumorais;
• Baseado na capacidade das células viáveis reduzirem metabolicamente o sal de MTT;
• Formação de cristais de formazan de cor azul-púrpura, que se acumulam no citoplasma celular;
Ensaio de MTT
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Redução mitocondrial
Cristais de formazan
Células viáveis!!
Ensaio de MTT
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Cultura de células com determinado composto
Incubação do reagente MTT
Lise das células e diluição dos
cristais com DMSO
Leitura por espectrofotometria
Ensaio de MTT
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LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit
• Determina a viabilidade de células de uma população com base na integridade da membrana plasmática e atividade intracelular de esterase;
Colorações para viabilidade celular
• Células discriminadas:
Vivas com coloração verde da calceína-AM (atividade esterase intracelular);
Mortas com coloração vermelha do etídio homodímero-1 (perda de integridade da membrana plasmática);
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Controle Meio + Soro
∆leuD + Ag85B Pasteur + Ag85B
Controle BCG Pasteur
Cél. 5637; Aumento 20 X
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Guava Nexin Reagent
Guava Cell Cycle Reagent
Guava Multi Caspase SR Kit
Guava® TUNEL Assay
Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit with YO-
PRO®-1 and PI for Flow Cytometry
Citometria de Fluxo
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Guava Nexin Reagent Avaliação de apoptose inicial;
O ensaio baseia-se na translocação da fosfatidilserina para a superfície externa da membrana celular → associado ao início da apoptose;
Anexina V possui alta afinidade por fosfatidilserina;
Na Apoptóse Inicial, as moléculas de fosfatidilserina são translocadas para a superfície externa da membrana celular, então Anexina V liga-se facilmente;
O ensaio baseia-se em duas estratégias:
1) Anexina V-PE detecta fosfatidilserina na membrana de células apoptóticas;
2) 7-AAD (corante impermeável na membrana celular íntegra) penetra na membrana celular de células mortas e em apoptose tardia, indicando integridade de membrana;
Citometria de Fluxo
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Guava Nexin Reagent
Céls. não apoptóticas: Annexin V(-) e 7-AAD(-)
Céls. em Apoptose Inicial: Annexin V(+) e 7-AAD(-)
Céls. em Apoptose Tardia: Annexin V(+) e 7-AAD(+)
• Gráfico:
quadrante inferior esquerdo: céls. viáveis;
quadrante inferior direito céls em apoptose inicial;
quadrante superior direito: apoptose tardia ou necrose.
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Guava Cell Cycle Reagent
• Determina a percentagem de células em: G0/G1, S e G2/M com base no conteúdo de DNA;
• Através da coloração do DNA celular com iodeto de propídio (PI);
Células em repouso (G0/G1) contêm duas cópias de cada cromossomo, assim como as em S: permitindo intercalação PI com intensidade 1x de fluorescência;
Células em Fase G2/M possuem o DNA duplicado, portanto com intensidade 2x de fluorescência;
Citometria de Fluxo
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Guava Cell Cycle Reagent
• Histograma:
M1: células em G0/G1
M2: células em S
M3: células em G2/M
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Guava Multi Caspase SR Kit
• Diferencia células apoptóticas de células não-apoptóticas;
• As caspase desempenham um papel central na morte celular por apoptose;
• Caspases iniciadoras: -2, -8, -9, -10; Caspases efetoras: -3, -6, -7;
• Fluorocromos:
sulforrodamina-valil-alanil—aspartilfluoromethylketone (SR-VAD-FMK); a intensidade de fluorescência vermelha é proporcional a atividade de caspases;
7-AAD é um indicador da integridade da membrana;
Citometria de Fluxo
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Guava Multi Caspase SR Kit
• Céls. vivas: SR-VAD-FMK (-) e 7-AAD (-) → verde-azulado
• Apotose inicial: SR-VAD-FMK (+) e 7-AAD (-) → azul
• Apoptose tardia: SR-VAD-FMK (+) e 7-AAD (+) → rosa
• Céls. mortas: SR-VAD-FMK (- ou fraco) e 7-AAD (+) → roxo
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Guava® TUNEL Assay
Distingue duas populações: células não apoptóticas (TUNEL-negativo) de células apoptóticas (TUNEL-positivo), através da fragmentação da cromatina nuclear;
cadeias de DNA com a extremidade 3'-hidroxila exposta são enzimaticamente marcadas, Desoxinucleotidil-transferase terminal (TdT) catalisa a incorporação de bromo-desoxiuridina (BrdU), TRITC conjugado anticorpo anti-BrdU marca estas fragmentações;
M1: céls não-apoptóticas; M2: céls. apoptóticas;
Citometria de Fluxo
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PCR em Tempo Real
1. Genes relacionados a apoptose
2. Genes relacionados ao ciclo celular
3. Genes de enzimas antioxidantes
Expressão Gênica
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qRT-PCR1. Genes apoptóticos: Bax Bcl-2 Survivin
2. Genes relacionados ao ciclo celular: p53 p21
3. Genes de enzimas antioxidantes: CAT (Catalase) GPx (Glutationa Peroxidase) TRX (Thioredoxina redutase-1) GST (Glutationa-S-transferase) CuZn-SOD (Cobre-Zinco Superóxido Dismutase) Mn-SOD (Manganês Superóxido Dismutase)
AIF Endo G Caspases 3, 8 e 9
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qRT-PCR1. Genes apoptóticos:
Bax
Bcl-2
AIF
Endo G
Survivin
Caspase 8
Caspase 9
Caspase 3
Via de ativação
mitocondrial
Proteína Inibidora
de Apoptose
Caspases
Iniciadoras
Caspase
Efetora
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qRT-PCR
2. Genes relacionados ao ciclo celular:
p53
p21
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qRT-PCR3. Genes de enzimas antioxidantes:
CuZn-SOD (Cobre-Zinco Superóxido Dismutase)
Mn-SOD (Manganês Superóxido Dismutase)
CAT (Catalase)
GPx (Glutationa Peroxidase)
TRX (Thioredoxina redutase-1)
GST (Glutationa-S-transferase)
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• Detecta as proteínas de uma amostra através de anticorpos específicos
Bcl-2
Bax
p53
Western blotting
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Trabalhos publicados e em andamento do Cultivo de Células -GPO
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• Avaliação do efeito antitumoral de disseleneto de difenila e duas modificações deste composto em adenocarcinoma de cólon (HT-29);
• As modificações propostas, 3-(trifluorometil)- disseleneto de difenila e 4-metoxi difenil diseleneto, induziram citotoxicidade por apoptose nas céls HT-29.
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• Objetivo: testar uma cepa auxotróficas de BCG recombinante superexpressando
Ag85B (BCG ΔleuD /Ag85B) na citotoxicidade em carcinoma de bexiga (5637);
• Resultados: sugerem que esta modificação aumenta a citotoxicidade do BCG
recombinante in vitro;
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• Objetivo: sintetizar e testar a citotoxicidade de seis derivados de
chalcona em células de adenocarcinoma do cólon humano (HT-29);
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Nanobiotecnologia
A aplicação da Nanotecnologia na liberação de drogas possibilita a criação de novas estratégias terapêuticas, capazes de alterar o cenários
das indústrias farmacêutica e biotecnológica.
Biotecnologia Médica
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Metotrexato Alta toxicidade
Nanoformulação contendo diéster etilíco de metotrexato
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Doutoranda Virginia Yurgel
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Avaliação da atividade antitumoral in vitro de tretinoinananoencapsulada em linhagem tumoral de
adenocarcinoma de pulmão (A549)
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Doutoranda Eduarda Schultze
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• Delineamento experimental
• Resultados Preliminares
Avaliação da atividade antitumoral in vitro da Própolis Vermelha
Profa. Fabiana K Seixas
Pós-doutoranda Priscila M. M. de Leon
Doutoranda Karine R. Begnini
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Priscila Marques Moura de [email protected]
www.ufpel.edu.br/cenbiotPPGB (Programa de Pós - graduação em Biotecnologia)- UFPel
Obrigada pela atenção!