PROF. RICARDO MATHIAS ORLANDO

ORLANDORICARDO@HOTMAIL.COM

BELO HORIZONTE 1

CROMATOGRAFIA LIQUIDA NO

CONTROLE ANTI DOPING

Ricardo Mathias Orlando

A summary of the history of drug abuse in sports is found

in the following timeline:

1950s: Drug use seen in competitions: drug controls begin.

1960: Danish cyclist dies at Rome Olympic Games: amphetamine use.

1967: British cyclist dies at Tour de France: amphetamine use.

1967: IOC Medical Commission formed: sub-commission on doping control.

1968: Mexico City Olympic Games: first preliminary drug tests; only nonsteroidal

drugs.

1972: Munich Olympic Games: first formal drug control program; preliminary steroid

tests.

1976: Montreal Olympic Games: first formal steroid control.

1980: Moscow Olympic Games: no positive drug cases reported.

1984: Los Angeles Olympic Games.

1988: Seoul Olympic Games: stanozolol positive; unreported positives.

1992: Barcelona Olympic Games: clenbuterol positives.

1994: Chinese swimmers found positive for dihydrotestosterone.

1995: Dope testing pioneer Manfred Donike dies.

1996: Atlanta Olympic Games: Bromantan positives using high

resolution mass spectrometry (HRMS) results not reported.

Lance Armstrong net worth is 125 million of dollars and he is a

professional American cyclist

Ganhou 7 vezes consecutivas o Tour de France e foi banido do ciclismo

em 2012 pelo uso de eritropotina (EPO), testosterona e transfusão

"If somebody produces a completely new substance that should

be banned, it will take us some time to firstly identify it and then

create a test (for it).”

“One test can cost as much as $1,500, which

means that anti-doping agencies prefer to test an

individual they suspect of doping rather than

blanket test across the board”

"People who wish to cheat have different and more opportunities

to cheat than we have to resolve it in conventional ways"

ENTREVISTA DO PRESIDENTE DA WADA CRAIG REEDIE À REDE

DE TELEVISÃO CNN

21:22 9

POR QUÊ SEPARAR?

TIRAR OU REDUZIR INTERFERÊNCIAS;

REDUZIR O RUÍDO e ELEVAR O SINAL DO ANALITO;

COMPATIBILIZAR A AMOSTRA;

OBTER DADOS QUALITATIVOS ADICIONAIS (tempo de retenção);

COMO SEPARAR?

CROMATOGRAFIA A GÁS;

CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO;

ELETROFORESE;

GC-MS/MS

Trailer-borne laboratory supervised by Dr. Manfred Donike

screened athletes for drug usage during the XXth Olympic games

in Munich using eight HP 7600A Gas Chromatographs.

LC-MS/MS

DETECÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS

LIQUID CHROMATOGRAPHY (CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO)

Para compostos não voláteis e termo instáveis

Atualmente as velocidade e eficiência de separação são mais próximos do GC

Preparo de amostras menos intensivo e não precisa de derivatização

GAS CHROMATOGRAPHY (CROMATOGRAFIA A GÁS)

Primeira escolha

Grande velocidade e eficiência de separação, baixo consumo de solventes,

menor custo dos equipamentos

Bibliotecas de massas

Sensibilidade geralmente superior

MASS SPECTROMETRY (ESPECTRÔMETRO DE MASSAS)

Sistema de detecção “inequívoco”, universal e seletivo

LIQUID

CHROMATOGRAPHY

GAS

CHROMATOGRAPHY

MASS

SPECTROMETRY

Mikhail Semyonovich Tsvet, (Tsvett, Tswett, Tswet,

Zwet ou Cvet em outros idiomas) , em russo ‘’’Михаил

Семенович Цвет’’’ (1872 - 1919) foi um botânico

“russo” que inventou a cromatografia por adsorção.

Foi durante estudos sobre a clorofila das plantas que

utilizou a cromatografia.

Separou clorofila de uma mistura

de pigmentos de plantas, através de

uma coluna recheada de carbonato

de cálcio em pó, fazendo a eluição

com éter de petróleo.

Cromatografia líquida

de alta eficiência

(CLAE, HPLC)

Cromatografia líquida

de ultra eficiência

(CLUE, UHPLC)

UPLCTM

21:22 18

COLUNAS E FASES ESTACIONÁRIAS DE HPLC E UHPLC (CLAE E CLUE)

Nicoli et al 2016.

A UHPLC–HRMS method for the screening of a large number of analytes including

anabolic agents, 2-agonists, hormone antagonists and modulators, diuretics,

stimulants, narcotics, glucocorticoids and –blockers ( 180 compounds!).

The method presented has been used for the analysis of over 5000

samples in about one month and proved to be reliable.

ESTUDO DE CASO

A Waters Acquity UPLC® system equipped with a 2777 open architecture

autosampler (Waters, Milford, MA, USA) was used.

Separation was carried out on an Acquity UPLC® BEH C18 column (2.1 mm ×

50 mm, 1.7 m).

Mobile phase A consisted of 0.3% aqueous formic acid and mobile and phase

B was 0.3% formic acid in acetonitrile.

CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS

23

Cromatografia é um MÉTODO DE SEPARAÇÃO que depende

fundamentalmente da diferença de interação/distribuição dos analitos entre

uma fase que permanece móvel (FM) e outra fase que permanece estacionária

(FE), ambas em contato íntimo.

UHPLC versus HPLC

A alta ou ultra eficiência da separação está relacionada à menor

dispersão das moléculas durante sua passagem pelo sistema

cromatográfico (coluna e tubulações)

DISTRIBUIÇÃO NORMAL (CURVA DE GAUSS):

Distribuição hipotética das espécies químicas em um

volume de injeção Vinj chegando ao detector caso

não houvesse nenhum fenômeno de dispersão

Distribuição hipotética das espécies químicas

chegando ao detector m função dos diferentes

fenômenos de dispersão ao passar pelas tubulações

e pela coluna cromatográfica

O QUE É O ALARGAMENTO (DISPERSÃO) DA BANDA

Algumas chegam na

frente

Uma parte chega em um tempo médio

(tempo de retenção tR)Algumas chegam

“atrasadas” 27

Durante o movimento dentro da tubulação (antes, durante e após a coluna) as

espécies químicas se dispersam em um plug (volume) de amostra maior do que

o original em que foram injetadas.

Neste exemplo apesar da

diferença de cores todas as

espécies químicas são

iguais.

21:22 28

Concentração de dois compostos em função da distância percorrida na

coluna cromatográfica

EFEITO DO ALARGAMENTO (DISPERSÃO) DA BANDA NA CONCENTRAÇÃO

CONSEQUÊNCIAS DE UMA MAIOR DISPERSÃO DA BANDA

CROMATOGRÁFICA

■ Maior dificuldade na determinação das áreas verdadeiras dos picos

cromatografados (maior erro e a incerteza de quantificação).

29

Incerteza e erros

maiores

Incerteza e erros

menores

■ Diminui a concentração do analito que atinge o detector e reduz a

detectabilidade do método.

CONSEQUÊNCIAS DE UMA MAIOR DISPERSÃO DA BANDA

CROMATOGRÁFICA

Quantidade Mínima Detectável Massa de um analito que gera um pico com altura

igual a três vezes o nível do ruído

DETECTORES – PARÂMETRO BÁSICO DE DESEMPENHO

SIN

AL

(S)

= 3S

N

Qualquer componente do sinal gerado pelo detector

que não se origina da amostra/analito

TEORIA DO ALARGAMENTO DA BANDA

H é chamado de altura do prato: representa o grau de dispersão da

banda (largura do pico w) em função do caminho percorrido (L, comprimento

da coluna). Depende de três parâmetros físicos principais (descritos pelos

termos A, B e C) além da vazão.

CAMINHOS MÚLTIPLOS OU CAMINHOS PREFERENCIAIS

(TERMO A)

TAXA DE DIFUSÃO LONGITUDINAL (TERMO B)

TEMPO DE EQUILÍBRIO FINITO OU TAXA DE TRANSFERÊNCIA DE

MASSA (TERMO C)

wt1

wt2 > wt1

Combinação dos três parâmetros

(A, B e C) e a “vazão” empregada

(F ).

Existe uma velocidade linear (ou

vazão) ótima onde H será mínimo

e N máximo para uma dada

coluna.

Nesse gráfico são constantes: o

comprimento e diâmetro da

coluna, diâmetro da partícula,

composição da fase móvel,

temperatura, volume e massa de

injeção.CURVA DE VAN DEEMTER

■ Frequentemente emprega materiais particulados

(CLAE também emprega monolitos).

■ Partículas esféricas e de tamanho próximos

(regulares).

■ Frequentemente partículas porososas ou altamente

porosas (área superficial próxima ou superior a 500 m2

g-1).

■ Partículas pequenas (CLAE 10 a 3 m) (CLUE

< 2 m).

38

QUANTO MENOR A PARTÍCULA MENOR É A DIFERENÇA DA

TAXA DE TRANSFERÊNCIA DE MASSA (TERMO C)

Liane Maldaner; Isabel Cristina Sales Fontes Jardim, 200921:22 40

CURVA DE VAN DEEMTER

21:22 41

(A) CLAE: Coluna C18 (150 x 4,6 mm, 5

μm); vazão da FM: 1000 μL/min e volume

de injeção: 20 L. GRADIENTE: T(A:B) = T0

(100:0), T30 (40:60), T31 (100:0), T45

(100:0).

(B) CLUE: Coluna C18 (50 x 2,1 mm, 1,7

μm); vazão da FM: 610 μL/min, volume de

injeção: 1,4 μL . GRADIENTE: T (A:B) = T0

(100:0), T3,4 (40:60), T3,5 (100:0), T5,1

(100:0).

FM: A – 0,01% de ácido fórmico em H2O e

B – 0,01% de ácido fórmico em

acetonitrila:água (50:50 v/v); temperatura:

30 ºC e detecção UV.

Liane Maldaner; Isabel Cristina Sales Fontes Jardim, 2009

21:22 42

Impureza II da primaquina. Condições Cromatográficas: (A) CLAE: FM:

acetonitrila:água acidificada com 0,01% de ácido trifluoracético (25:75 v/v),

vazão de FM: 1,0 mL/min, volume de injeção: 10 μL, detecção UV a 265 nm e

temperatura: 35 ºC. (B) CLUE: as mesmas condições que em (A) com exceção

da vazão de FM: 0,5 mL/min e volume de injeção: 0,8 μL. Adaptada da ref. 21

Quer seja em uma coluna ou tubo

sem recheio (fase estacionária) ou

com recheio (coluna cromatográfica)

a dispersão do “plug” de amostra irá

ocorrer com esse perfil.

DISPERSÃO DEVIDO AO MOVIMENTO DOS LÍQUIDOS DENTRO DAS

TUBULAÇÕES

Aço inoxidável

(poli-éter-éter-cetona)

PEEK

DISPERSÃO DEVIDO AO MOVIMENTO DOS LÍQUIDOS DENTRO DAS

TUBULAÇÕES

Quanto menor o comprimento e, especialmente, menor o

diâmetro da tubulação menor será a dispersão.

A CONTRAPARTIDA DE UM MENOR DIÂMETRO DE PARTÍCULA (ALÉM DO

COMPRIMENTO E DIÂMETRO DA COLUNA) É UMA ELEVAÇÃO DA

PRESSÃO PELO QUADRADO DA VARIAÇÃO DO DIÂMETRO DA

PARTÍCULA:

Pressão em psi

Comprimento da coluna

Diâmetro da coluna

Diâmetro da partícula

vazão

Viscosidade da FM

HPLC

5000 psi

H = 1,25 µm para uma

partícula típica de 5.0 µm

UHPLC

15000 psi

H = 0,5 µm para uma

partícula típica de 1.7 µm

1.5 a 2 vezes o preço

de um HPLC

SEPARAÇÃO ISOCRÁTICA E GRADIENTE

3 TIPOS DE RESOLUÇÕES INADEQUADAS

1. Falta de resolução em todo o cromatograma

2. Falta de resolução no final do cromatograma

3. Falta de resolução no início do cromatograma

O GRADIENTE DE SEPARAÇÃO É UMA MUDANÇA DA

COMPOSIÇÃO DA FASE MÓVEL DURANTE A CORRIDA

CROMATOGRÁFICA PROMOVIDA OU POR UMA VÁLVULA OU

MUDANÇA DE VELOCIDADE DOS PISTÕES

EXEMPLO DE GRADIENTE DE SEPARAÇÃO

Fig. 1. Gradient profile and distribution of the analytes. Mobile phase

A: 0.3% formic acid in water; mobile phase B: 0.3% formic acid in

acetonitrile; flow rate: 0.3 mL/min.

Nicoli et al 2016.

1) To the urine samples (1 mL of urine sample added of 100 uL of the IS

solution and 1 mL of -glucuronidase solution (vortex-mixing, samples were

incubated for 1 h at 50 ◦C);

2) 2 mL of the 2% formic acid solution in water was

added to the samples with mixing (centrifugation).

3) The SPE procedure employed Bond-Elut Plexa PCX (60 mg, 3 mL) SPE

cartridges from Agilent Technologies (Lake Forest, CA).

PREPARO DE AMOSTRAS

EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

3) The SPE procedure employed Bond-Elut Plexa PCX (60 mg, 3 mL) SPE

cartridges from Agilent Technologies (Lake Forest, CA).

3.1) Samples were loaded onto pre-conditioned using 0.5 mL of methanol,

followed by 0.5 mL of formic acid 2% solution) SPE cartridges.

3.2) Sample loading.

3.3) Three washing steps were applied in the following order: 1 mL of 2% formic

acid in water, 1 mL of water and 1 mL of (20%, v/v) methanol in

water. Washing solvents were then removed from the cartridges

by applying vacuum.

3.4) Elution of analytes was performed using 3 mL of 3% ammonium hydroxide in

methanol:acetonitrile (50:50, v/v).

PREPARO DE AMOSTRAS

4) Samples were evaporated under a nitrogen flow for 20 min at 60 ◦C and then

re-dissolved into 100 µL of a solution composed of acetonitrile (5%, v/v) in water

containing formic acid (0.3%, v/v). Samples were processed in batches of 20

and the total sample preparation time for a single batch was 2 h.

PREPARO DE AMOSTRAS

1 mL amostra inicial e no final 100 µl

5000 amostras ÷ 20 = 250 batches

250 batches 2 horas cada = 500 horas

500 horas ÷ 30 dias = 16,7 horas por dia extraindo e

preparando as amostras para realizar o trabalho

ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQÜENCIAL

DetetorDetectorIntrodução da amostra

Fonte deionização

Analisador de massas

Aquisição de dados

Sistema de alto vácuo

BombaTurbo Molecular

DETECÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Onde a cromatografia faz sua

maior diferença

INCOMPATIBILIDADE DA FASE MÓVEL COM SISTEMAS DE

DETECÇÃO

■ Espectrômetro de massas: A fonte de ionização

■ ELETRONEBULIZAÇÃO (ESI, ELECTROSPRAY IONIZATION). Processo no qual

espécies ionizadas na fase gasosa são produzidas a partir de uma solução pela formação e

dessolvatação de minúsculas gotas altamente carregadas, que são resultantes da aplicação

de uma diferença de potencial da ordem de kV entre um capilar e um contraeletrodo, sob

pressão atmosférica.

EFEITO DE MATRIZ EM ESPECTROMETRIA DE MASSAS

CAUSAS DO EFEITO DE MATRIZ EM ESPECTROMETRIA DE MASSAS

RESOLUÇÃO E EXATIDÃO NA ESPECTROMETRIA DE

MASSAS PARA ANÁLISES CONFIÁVEIS

Figure 1. Mass resolution of R = 25,000 at m/z 200 masks the pesticide isopyrine due

to a non-resolved matrix interference (red); whereas, resolution setting of R = 100,000

at m/z 200 resolves the analyte molecule from the matrix background.

Fig. 2. Extracted ion

chromatograms of a urine

sample containing 30 ng/mL of

formoterol (m/z 345.1809)

obtained with different mass

range windows. RT: retention time

(min); AA: peak area; BP: base

peak (m/z).

500 ppm

5 ppm

ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQÜENCIAL

Resolução de 140.000 em m/z 200

Velocidade de aquisição de 12 Hz para uma resolução de 17500

Exatidão de massa: erro menor 3 ppm

Cela de colisão MS2 Filtro de massas

octapolar

Gaiola de

íons para

acumular íons

Fig. 4. Use of CID fragmentation to increase selectivity for the detection of

acebutolol: (A) urine sample spiked with acebutolol at 100 ng/mL; (B and C)

blank urine samples from different volunteers; (D) proposed fragmentation pattern.

"O ministro de Esportes russo comandou, controlou e supervisionou a

manipulação dos resultados dos atletas, ou as trocas de amostras,

com a ativa participação da FSB (serviço secreto russo), CSP (Centro

de Preparação Esportiva para atletas russos) e os laboratórios de

Moscou e Sochi".

RELATÓRIO, REDIGIDO PELO PROFESSOR CANADENSE DE

DIREITO ESPORTIVO RICHARD MCLAREN:

AGRADECIMENTOS

orlandoricardo@hotmail.com