Cromatografia em coluna
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAISINSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
RELATÓRIO II: ATIVIDADE 2
DISCIPLINA: Química Orgânica Experimental – QUI031
PROFESSOR: Bruno
ATIVIDADE 2 – CROMATOGRAFIA EM COLUNA: EXTRAÇÃO E
FRACIONAMENTO DE PIGMENTOS VEGETAIS
REALIZADA EM 02/10/2012
INTEGRANTES DA BANCADA 4 - TURMA: F3
Juliana Alves Martins
Monique Aline Ribeiro dos Santos
Belo Horizonte - MG
Outubro - 2012
I – OBJETIVOS
Extrair pigmentos vegetais e fracioná-los através da técnica de cromatografia de
absorção em coluna.
II – INTRODUÇÃO
i. β-Caroteno
Os carotenos são pigmentos orgânicos encontrados nas plantas e microrganismos
como algas e fungos. São essenciais para a vida e nenhum animal pode sintetizá-los, por isso
devem ser ingeridos na dieta.
O β-caroteno é um dos mais de 600 carotenoides presentes na natureza. Essa
substância é a mais abundante e eficaz provitamina A, é encontrada em diversas plantas e
frutas, tais como espinafres, brocólis, couve, chicória, agriões, papaias, mangas, carambolas,
nectarinas e pêssegos. Sendo que, o conteúdo de beta-caroteno de frutas e vegetais pode variar
dependendo da estação e do grau de amadurecimento.
Entre as propriedades biológicas do β-caroteno são: funções anti-oxidantes, que
ajudam a neutralizar os radicais livres, e ajuda a extinguir o oxigênio sinlgleto, uma molécula
reativa que é gerada na pele por exposição à luz ultravioleta e que pode induzir alterações pré-
cancerígenas nas células.
Os carotenoides podem perder alguma de sua atividade, durante o armazenamento
dos alimentos, devido à ação das enzimas e à exposição à luz e oxigênio. Além disso, a
desidratação dos vegetais e frutas também pode reduzir grandemente a sua atividade
biológica. A perda de atividade ocorre devido à presença de insaturações presentes na
molécula, conforme mostra a figura 1, que faz essa molécula ser bastante reativa. Entretanto
se os alimentos forem congelados, a estabilidade dos carotenoides é mantida.
Figura 1 – Molécula de Beta Caroteno
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Algumas das propriedades físico-químicas deste composto são: hidrofóbico,
lipofílico, insolúvel em água e solúvel em solventes orgânicos como acetona, álcool e
clorofórmio e o seu pigmento vai do amarelo ao vermelho.
ii. Clorofila
A clorofila é um grupo de pigmentos presentes nas células das plantas e algas e é
responsável pela coloração verde. Em sua estrutura molecular, conforme figuras 3 e 4, contém
magnésio e transporta oxigênio nas células da planta.
Figura 2 – Moléculas de clorofila a, b e c
2
O nome clorofila foi proposta por Pelletier e Caventou, em 1818, para denominar a
substância verde que se podia extrair das folhas com o auxílio do álcool. Este pigmento é
produzidos nos cloroplastos das folhas e em outros tecidos vegetais e funciona como
fotorreceptor da luz visível utilizada no processo da fotossíntese.
A clorofila absorve muito bem a luz das regiões azuis e vermelhas, refletindo a luz
verde. As diferenças aparentes nas cores dos vegetais são devidas à presença de outros
pigmentos associados, como os carotenóides, os quais sempre acompanham as clorofilas.
Existem vários tipos de molécula de clorofila, variando de acordo com o
comprimento de onda da luz que cada uma é capaz de absorver. Outros pigmentos,
denominados pigmentos acessórios, organizam-se em conjuntos cuja função primordial é
captar a energia luminosa, para conduzi-la até a clorofila.
Quimicamente, as clorofilas a e b são álcoois diterpenóides, têm estrutura
tetrapirrólica e são ésteres, derivados de diidroporfirina, que são quelatos com um íon de
magnésio localizado centralmente. Além disso, as clorofilas possuem um álcool isoprenóide
monoinsaturado, um diterpeno e o fitol, que é esterificado com o quarto anel, e se encontra na
configuração trans. O fitol representa o lado hidrofóbico da molécula, enquanto o resto da
molécula é hidrofílico. Logo, a presença do fitol confere a clorofila uma característica apolar
e lipofílica.
iii. Cromatografia em Coluna
A cromatografia é um método físico-químico de análise para a purificação,
separação, identificação e quantificação de substâncias em uma mistura. É realizada através
da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato. Uma das fases
permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela. Durante a passagem da fase
móvel sobre a fase estacionaria, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas
fases, de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase
estacionária, resultado em migrações diferenciais destes componentes.
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Entre os métodos de análise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido a
sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas, por
si mesma ou em conjunto com outras técnicas instrumentais. Além disso, a grande variedade
de combinações entre fases móveis e estacionárias torna esta técnica extremamente versátil e
de grande aplicação.
Na cromatografia em coluna um tubo de vidro é empacotado com material
adsorvente (fase estacionária) que pode ser sílica gel, alumina, carbonato de cálcio, óxido de
magnésio, carvão ativado, sacarose e amido. A coluna é colocada na posição vertical e a
solução dos compostos passa de cima para baixo arrastada por um ou mais solventes (fase
móvel). A eluição é feita de modo a obter frações que podem conter misturas de compostos ou
compostos puros.
A cromatografia em coluna fundamenta-se no fato de que os componentes de uma
mistura movem-se com solventes pela coluna com velocidades diferentes, dependendo de
fatores como a natureza de cada substância, a natureza do solvente e a atividade do
adsorvente. A separação dos constituintes de uma mistura é efetuada através da passagem do
solvente pela coluna e baseia-se na interação dos componentes da amostra e do solvente com
a superfície adsorvente. Isso é possível porque o adsorvente sólido ativo tem uma grande área
superficial e pelo fato de dispor inúmeros sítios polares podem se combinar reversivelmente
ou adsorver pequena concentração de substâncias através de forças de atração eletrostática. O
solvente movendo-se pela superfície do adsorvente compete com a amostra adsorvida e com o
adsorvente, e então desloca seus constituintes reversivelmente e continuamente pela coluna.
Este processo pode ser visualizado como uma competição entre a amostra, o solvente
e o adsorvente e pode ser expresso pelo equilíbrio a seguir:
O fluxo de solvente deve ser contínuo e a velocidade de eluição dos compostos
depende da natureza de cada um destes compostos. Sendo que, compostos polares ou
polarizáveis, tais como álcoois, ácidos carboxílicos, amidas, aminas, são adsorvidas mais
fortemente e eluidos menos prontamente do que compostos menos polares, tais como
compostos halogenados, aldeídos, cetonas, éteres e hidrocarbonetos. À medida que os 4
Amostra-Adsorvente Solvente Amostra-Solvente
compostos da mistura são separados, bandas ou zonas começam a ser formadas; cada banda
contendo somente um composto. Em geral, os compostos apolares passam através da coluna
com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os primeiros têm menor
afinidade com a fase estacionária. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com todos
os compostos da mistura, ela não se moverá. Por outro lado, se for escolhido um solvente
muito polar, todos os solutos podem ser eluídos sem serem separados. Por uma escolha
cuidadosa das condições, praticamente qualquer mistura pode ser separada. Sendo assim,
solventes pouco polares são empregados para substâncias fracamente adsorvidas enquanto
solventes polares são para aquelas fortemente adsorvidas.
A atividade do adsorvente sólido também determina a velocidade com que as
substâncias são eluidas. A atividade é determinada pelo seu conteúdo de água e pela
granulação das partículas.
Alguns solventes comumente utilizados estão listados a seguir na ordem de aumento
da polaridade.
Partindo destes princípios, pode-se realizada a extração da clorofila e o β-Caroteno
de folhas de espinafre através da cromatografia em coluna.
III – MONTAGENS E MATERIAIS UTILIZADOS
III.i. Reagentes
Coluna com torneira; Bastão de vidro;
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Hexano
Diclorometano
Clorofórmio
Éter Etílico
Acetato de Etila
Etano
Metanol
Água
Algodão;
Papel Absorvente;
Pipeta conta-gotas;
Erlenmeyer de 125,0 mL;
Proveta de 25,0 mL;
Tela de Amianto;
Tripé;
Bastão de Vidro com borracha;
Béqueres de 50,0 mL;
Almofariz com pistilo;
Suporte;
Garras e Mufas;
Espátula;
Bico de Gás;
Funil de haste longa;
Chapa elétrica.
III.i. Montagem
Figura 4 – Montagem para cromatografia em coluna
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Haste universal
erlenmeyer
garra
III – PARTE EXPERIMENTAL
III. I – PROCEDIMENTOS
i. Empacotamento da Coluna
Uma coluna de vidro foi fixada, verticalmente, em um suporte, fechou-se a
torneira e com o auxílio de um funil introduziu-se 10,0 mL de hexano. Com um
arame, foi introduzido, até a conexão do tubo com a torneira, um pequeno chumaço de
algodão.
Preparou-se uma suspensão contendo cerca de 5,0 g de sílica gel e hexano
(quantidade de hexano de forma que este ficou cerca de 5,0 mL acima da sílica), esta
foi introduzida na coluna com o auxílio de um funil e com a ajuda de um bastão de
vidro com borracha foi dadas leves pancadas na coluna para que a acomodação do
solvente ocorre de forma homogênea.
Como a coluna encheu antes da total transferência da suspensão, a
transferência foi completada simultaneamente com a retirada do eluente. Após a total
transferência da suspensão, o solvente foi recolhido até que o nível de solvente ficasse
por volta de 3,0 cm acima do topo da fase estacionária.
ii. Preparo do Extrato
Foi pesado aproximadamente 10,0 g de folhas de espinafre, removeu-se as
nervuras e ferveu estas folhas por aproximadamente 2 minutos em 100,0 mL de água
destilada.
Desprezou-se a água na pia, as folhas foram resfriadas com água gelada e
foram enxugadas utilizando papel toalha.
As folhas foram colocadas em um almofariz e adicionou-se uma mistura de
hexano e acetona 1:1. Em seguida, as folhas foram trituradas até obter um solução
verde que foi transferida para um béquer pequeno.
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No béquer contendo a solução, foi colocada duas pontas de espátula (tipo
canoa) de sílica para encorpar o extrato. Essa mistura foi colocada em uma chapa
quente, localizada na capela, para o solvente secar, sendo que, neste procedimento o
béquer foi agitado para não haver projeção.
iii. Eluição da Coluna Cromatográfica
O extrato foi adicionado no topo da coluna com o auxílio de um funil de
haste longa e a torneira foi aberta para o solvente escoar até a solução atingir o topo do
recheio, a torneira foi fechada e adicionou-se um pouco de hexano, utilizando pipeta
conta-gotas para lavar a parede da coluna. Em seguida a torneira foi aberta até o
solvente atingir novamente o topo do recheio. Este procedimento foi repetido.
Fechou-se a torneira, colocou-se o hexano até completar a coluna para
proceder a eluição. Abriu-se a coluna e recolheu o solvente até que a primeira banda
esteja bem próxima a torneira, este solvente recolhido no erlenmeyer foi chamado de
fração I. Sendo que quando o solvente contido na coluna atingia o topo do recheio foi
adicionado mais hexano para não ressecar a sílica.
Substitui-se o frasco de coleta e recolheu a fração II até o eluente perder a
cor.
Substitui-se novamente o erlenmeyr coletor, aguardou o solvente atingir o
topo do recheio, o solvente foi substituído por acetona e continuou recolhendo o
eluente até que a segunda banda esteja bem próxima a torneira, a solução contida neste
erlenmeyer foi chamada de fração III.
Substitui o frasco coletor e recolheu a fração IV. Comparou-se as cores dos
eluatos obtidos, transferiu-se as frações recolhidas para os frascos identificados na
capela.
Em seguida, remou-se o adsorvente das colunas deixando-o no local
indicado e desprezou-se todas as folhas no lixo.
IV – RESULTADOS E DISCUSSÃO
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Na parte de preparo do extrato as folhas de espinafre foram fervidas para que as
substâncias solúveis em água fossem extraídas e, como as substâncias de interesse são
orgânicas, esta água foi desprezada. Já a adição de cetona e hexano seguida de maceração das
folhas foi realizada para extrair as substâncias orgânicas.
Os eluatos obtidos apresentavam as seguintes colorações:
Tabela 1: Colorações dos eluatos obtidos
Frasco 1 Incolor
Frasco 2 Levemente amarelo
Frasco 3 Incolor
Frasco 4 verde
A adição da amostra seguida do hexano, no tubo, ocorreu a separação em duas
bandas, uma de coloração verde e a outra de coloração amarela. Sendo que a substância de
coloração amarela estava na parte inferior, conforme mostra a figura 2.
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eluente
Banda 2: verde
Banda 1: amarela
Figura 4 – Coluna após a adição da amostra e hexano
O frasco coletor 1 apresentava-se incolor devido este haver basicamente hexano e,
possivelmente, traços da substância de coloração amarela, mas isto foi imperceptível a olho
nú, já que a maior parte da substância amarela ainda estava próxima à torneira da coluna.
Já o frasco 2, possuía coloração levemente amarelada. Pelo fato desta substância
possuir esta coloração, ter sido extraída com hexano, que é um solvente apolar, e pelas
estruturas moleculares apresentadas na introdução, indica que esta substância é o caroteno
que, por ser uma substância apolar, interage menos com o adsorvente e mais com o hexano,
logo, nessa competição pelo substrato, o solvente consegue interagir de forma mais eficiente e
arrasta-o pela coluna mais facilmente.
No frasco 3, a coloração também era incolor. Entretanto neste frasco pode haver
ainda traços do beta caroteno, além disso poderia haver hexano que estaria contido na parte
interior do tubo no inicio da adição de acetona, a própria acetona e possivelmente traços da
substância verde.
No tubo 4, a coloração era esverdeada. Como esta substância apresenta esta cor, foi
extraída com acetona, que é um solvente polar, e foi adsorvido mais fortemente, indica que
esta substância é a clorofila que por sua estrutura molecular ser mais polar interage mais com
a acetona, logo na competição entre o solvente e o adsorvente o primeiro conseguir interagir
mais eficientemente com a molécula e arrastá-la no tubo.
V – CONCLUSÃO
Pela técnica de cromatografia em coluna empregando sílica como adsorvente e hexano
e acetona como eluentes foi possível a extração de clorofila e caroteno. Isso foi possível
porque estas duas últimas substâncias apresentam polaridades distintas, logo foram adsorvidas
de forma diferenciada pelo adsorvente, sendo que, a sílica adsorve melhor as substâncias mais
polares. Segue-se, ainda, que a adição do eluente menos polar interagiu de forma mais
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eficiente com o β-Caroteno logo este foi extraido pimeiro. Logo após a adição da acetona foi
extraído a clorofila por esta ser mais polar e interagir melhor com a acetona.
VI - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] COLLINS, Carol H; BRAGA, Gilbert L.; Introdução a Métodos Cromatográficos, Editora
da Unicamp, 5ª Ed., Campinas, 1993, páginas 13 a 27.
[2] TEIXEIRA, Marco Antônio, Cromatografia Gás-Líquido: princípios e aplicações,
páginas 1 a 3.
[3] SHINER, Ralph. L; FUSON, Reynold C.; CURTIN, David Y; MORRILL, Terence C.;
Identificação Sistemática dos Compostos Orgânicos Manual do Laboratório; Editora
Guanabara Dois S.A., 6ª Ed., Rio de Janeiro, 1983, páginas 331 a 343.
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QUESTIONÁRIO
1) Consulte na literatura as estruturas do caroteno e das clorofilas?
As estruturas do β-Caroteno e das clorofilas são
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2) Considerando que os carotenos apresentam cores próximas do amarelo enquanto
as clorofilas são verdes, avalie as polaridades das misturas obtidas e identifique o
conteúdo das mesmas.
Como o caroteno foi extraido com hexano, e este por sua vez é um solvente apolar, o
beta caroteno é apolar. Já a clorofila foi extraida com a acetona, e sendo este um
solvente polar, conclui-se que as clorofilas são polares.
3) Correlacione a polaridade com a estrutura química dos componentes da mistura.
As clorofilas possuem 40 carbonos, sendo 2 ciclos de 6 e 11 duplas ligações
conjugadas. Isso confere à molécular um caráter apolar. Já as clorofilas possuem
quelatos de magnésio, cetonas, estéres, aldeídos e ácidos carboxílicos que confere à
molécula um caráter polar.
4) Um aluno leu rapidamente o procedimento experimental e começou esta prática,
no entanto, ao invés de utilizar inicialmente o hexano ele confundiu e começou a
coluna com acetona. Discute o que você acha desta troca de eluentes.
A troca de eluentes não irá separar as substâncias e ambas serão arrastadas pelo
solvente. Isso ocorre poque a substância menos polar é menor adsorvida, logo a
tendência é esta ser arrastada pelo solvente, mesmo a substância sendo apolar.
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Enquanto que, apesar da clorofila ser mais adsorvida, neste caso, esta competição
favorece o eluente, logo esta também será arrastada.
5) Suponha que você tenha uma mistura de três substâncias orgânicas, sendo todas
sólidas: um álcool, um hidrocarboneto saturado e uma cetona. Proponha uma
separação cromatográfica destas substâncias utilizando sílica-gel como
adsorvente e os eluentes que achar necessário.
Tendo em vista que a ordem de polaridades destas três substâncias é:
Hidrocarboneto < acetona < álcool
No caso de ser usada a cromatografia em coluna com sílica gel, o álcool será mais
adsorvido e o hidrocarboneto será menos adsorvido. Sendo assim, deve-se proceder a
eluição primeiramente com hexano, que sendo um solvente apolar, conseguirá
interagir e arrastar o hidrocarboneto. Em seguida, a eluição deve ser com éter dietílico
que é um composto não tão polar. Isso fará com que haja a extração da cetona. Por
fim, a eluição deverá ser feita com etanol, pois este é um solvente bastante polar e
conseguirá competir mais eficientemente com o adsorvente pelo substrato e o álcool
será extraído.
6) Faça uma pesquisa sobre os adsorventes que podem ser utilizados em métodos de
separação por cromatografia em coluna, mostrando qual a diferença entre eles.
Alguns dos adsorventes que podem ser usados na cromatografia em coluna são os
seguintes:
Adsorvente Comentárioa
Negro de Fumo Considerado fraco no caso de compostos com interações do
tipo ligação de hidrogênio
Silicato de Magnésio
Alumina (Al2O3) Usado comumente no caso de compostos estáveis
Sílica-Gel Usado comumente, especialmente no caso de compostos
orgânicos mais sensíveis.
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Sulfato de Cálcio
Açúcar
Celulosa em pó Adsorvente muito fraco.
Estes adsorvente foram listados em ordem do poder do poder da adsorção. A
alumina e a sílica-gel são os usados mais habitualmente. Entretanto, adsorventes de
fase invertida também existem no mercado. Logo, com estes adsorventes, os
componentes mais polares da amostra são eluídos mais rapidamente. Já a alumina
usada comercialmente pode ser ácida, básica ou neutra. Sendo que, a alumina ácida é
útil na separação de ácidos carboxílicos e aminoácidos; a básica é utilizada para a
separação de aminas.
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