UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA CENTRO DE CINCIAS DA SADE

LABORATRIO DE TECNOLOGIA FARMACUTICA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM PRODUTOS NATURAIS E

SINTTICOS BIOATIVOS

RASSA MAYER RAMALHO CATO

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E EFEITOS BIOLGICOS DE RIPARINAS SOBRE BACTRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES

JOO PESSOA - PB

2007

I

RASSA MAYER RAMALHO CATO

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E EFEITOS BIOLGICOS DE RIPARINAS SOBRE BACTRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES

Trabalho de Tese apresentado ao Programa de Ps-Graduao em Produtos Naturais e Sintticos Bioativos do Centro de Cincias da Sade - Laboratrio de Tecnologia Farmacutica da Universidade Federal da Paraba em cumprimento s exigncias para obteno do ttulo de Doutor em Produtos Naturais e Sintticos Bioativos (Farmacologia).

Orientadores: Prof. Dr. Edeltrudes de Oliveira Lima

Prof. Dr. Jos Maria Barbosa Filho

Co-orientadora: Prof. Dr. Maria do Socorro Vieira Pereira

JOO PESSOA - PB

2007

II

RASSA MAYER RAMALHO CATO ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E EFEITOS BIOLGICOS DE RIPARINAS SOBRE

BACTRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES

Aprovada em 11/05/2007

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________ Prof. Dr. Edeltrudes de Oliveira Lima

Orientadora

__________________________________________ Prof. Dr. Margareth de Ftima Formiga Melo Diniz

Examinador

__________________________________________ Prof. Dr. Lindomar de Farias Belm

Examinador

__________________________________________ Prof. Dr. Beatriz Susana Ovruski de Ceballos

Examinador

__________________________________________ Prof. Dr. Lauro Santos Filho

Examinador

III

D E D I C A T R I A

Ao meu esposo Almir;

Aos meus filhos, Rodolfo, Rafaella e Raquel;

Aos meus pais Raff (in memorian) e Eliane.

IV

A G R A D E C I M E N T O S

A Deus.

A Almir, Rodolfo, Rafaella e Raquel por tudo que eles representam em minha vida.

Aos professores do Programa de Ps-graduao em Produtos Naturais e Sintticos

Bioativos, em particular Professora Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima e ao

Professor Dr. Jos Maria Barbosa Filho, orientadores que renem entre inmeras

qualidades sapincia e humildade.

A professora Dra. Maria do Socorro Vieira Pereira, pela pacincia e dedicao

durante todo este perodo de estudo.

A professora Dra. Bagnlia de Arajo Costa, pela dedicao e incentivo ao ensino e

pesquisa.

Aos colegas de turma, pelo companheirismo e amizade, em especial a Alessandra,

Josimar, Rossana, Thlio e Vanda, por acreditarem no PQI/UEPB.

Aos colegas do Departamento de Farmcia da UEPB.

A UEPB, por ter nos dado a oportunidade de investir na nossa qualificao

profissional.

A CAPES, por ter concedido bolsa de estudos atravs do Programa de Qualificao

Institucional PQI, possibilitando a parceria entre a UEPB/UFPB-LTF.

A todos que direta ou indiretamente contriburam na realizao deste trabalho.

V

... De tudo ficaram trs coisas, a certeza de que estaremos sempre comeando, de que preciso continuar e de que seremos interrompidos antes de terminar. Fazer da interrupo um novo caminho, da queda um passo de dana, do medo uma ponte, da procura um encontro....

Fernando Sabino

VI

S U M R I O

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.............................................................. IX LISTA DE FIGURAS............................................................................................ X LISTA DE GRFICOS ......................................................................................... XII LISTA DE QUADROS.......................................................................................... XIII LISTA DE TABELAS ........................................................................................... XIV RESUMO.............................................................................................................. XV ABSTRACT.......................................................................................................... XVI 1 INTRODUO ...................................................................................................... 17 2 OBJETIVOS.......................................................................................................... 22

2.1 Geral.............................................................................................................. 23

2.2 Especficos .................................................................................................... 23

3 REVISO DE LITERATURA ................................................................................ 24 3.1 Patognese microbiana ................................................................................. 25

3.1.1 Staphylococcus aureus.......................................................................... 25

3.1.2 Escherichia coli...................................................................................... 28

3.1.3 Pseudomonas........................................................................................ 29

3.1.4 Fungos leveduriformes .......................................................................... 29

3.2 Antimicrobianos ............................................................................................. 30

3.2.1 Mecanismos de ao de alguns antimicrobianos .................................. 32

3.3 Resistncia bacteriana aos antimicrobianos.................................................. 38

3.3.1 Mecanismos genticos de aquisio de resistncia aos

antimicrobianos ..................................................................................... 40

3.3.2 Plasmdeos............................................................................................ 42

3.3.3 Transposons (Tn) .................................................................................. 44

3.4 Aspectos botnicos e fitoqumicos da Aniba riparia (Nees) Mez

(Lauraceae) ................................................................................................... 45

3.4.1 Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae)................................................... 45

3.4.2 Alcamidas de plantas ............................................................................ 46

3.4.3 Riparinas ............................................................................................... 47

VII

4 MATERIAIS E MTODOS .................................................................................... 51 4.1 Local da pesquisa.......................................................................................... 52

4.2 Material.......................................................................................................... 52

4.2.1 Obteno dos produtos sintticos ......................................................... 52

4.2.2 Linhagens microbianas.......................................................................... 52

4.2.3 Meios de cultura .................................................................................... 53

4.2.4 Substncias ........................................................................................... 53

4.3 Mtodos......................................................................................................... 54

4.3.1 Obteno da O-metil-N-(benzoil)-tiramina (riparina I)............................ 54

4.3.2 Obteno da O-metil-N-(2-hidroxibenzoil)-tiramina (riparina II) ............. 55

4.3.3 Obteno da O-metil-N-(2,6-dihidroxibenzoil)-tiramina (riparina III) ...... 55

4.3.4 Obteno das solues de riparinas ..................................................... 56

4.3.5 Isolamento e identificao de bactrias................................................. 57

4.3.6 Suspenso bacteriana........................................................................... 57

4.3.7 Isolamento e identificao de leveduras................................................ 58

4.3.8 Suspenso de leveduras ....................................................................... 58

4.3.9 Determinao da atividade antimicrobiana Triagem........................... 59

4.3.10 Estudo do efeito das riparinas sobre a cintica bacteriana.................... 62

4.3.11 Estudo do efeito das riparinas sobre a cintica fngica......................... 64

4.3.12 Determinao da caracterizao fenotpica dos padres de

resistncia aos antimicrobianos Perfil de sensibilidade...................... 66

4.3.13 Tratamento por riparinas I, II e III, obtidas a partir da A. riparia

Avaliao da atividade curagnica ........................................................ 66

4.3.14 Estudo da relao estrutura/atividade antimicrobiana das riparinas...... 68

4.3.15 Anlise estatstica.................................................................................. 68

5 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................ 69 5.1 Resistncia antimicrobiana............................................................................ 70

5.2 Atividade antimicrobiana in vitro de riparinas ................................................ 72

5.2.1 Frente s cepas padres ATCC ............................................................ 72

5.2.2 Frente s Cepas de S. aureus............................................................... 72

5.2.3 Frente s cepas de E. coli ..................................................................... 75

5.3 Determinao da CIM e da CBM................................................................... 75

5.4 Classificao do perfil fenotpico das cepas de S. aureus............................. 79

5.5 Avaliao da relao estrutura-atividade antimicrobiana das riparinas ......... 80

VIII

5.6 Avaliao da cintica bacteriana ................................................................... 83

5.7 Avaliao da atividade antifngica in vitro de riparinas sobre linhagens de

Candida albicans ........................................................................................... 90

5.8 Avaliao da cintica fngica ........................................................................ 91

5.9 Avaliao da atividade curagnica ................................................................ 92

6 CONCLUSES .................................................................................................... 98 7 PERSPECTIVAS................................................................................................. 100 REFERNCIAS ..................................................................................................... 102 APNDICES .......................................................................................................... 123

IX

L I S T A D E A B R E V I A T U R A S E S I G L A S

AMH Agar Meller-Hinton

AS Agar Sangue

ASD Agar Sabouraud Dextrose

ATCC American Type Culture Collection

BAB Blood Agar Base

BHI Brain Heart Infusion

CBM Concentrao Bactericida Mnima

CB Cintica Bacteriana

CDC Centro de Preveno e Controle de Enfermidades

CF Cintica Fngica

CFM Concentrao Fungicida Mnima

CHM

CLSI

Caldo Mueller-Hinton

Clinical and Laboratory Standards Institute

CIM Concentrao Inibitria Mnima

CS Caldo Sabouraud

DCC Dicloro Diciano Carbodiimida

DMSO Dimetil-Sulfxido

HCl cido Clordrico

MH Meller-Hinton

MIC Minimun Concentration Inhibitory

MLS Macroldeos-Lincosamdeos-Estreptogramina

MRSA

MSSA

Staphylococcus aureus Methicillin Resistant

Staphylococcus aureus Methicillin Sensitive

MRD Mecanismo de Resistncia Multidrogas

OMS Organizao Mundial de Sade

PBP Protein Binding Penicillin

UFC Unidade Formadora de Colnia

X

L I S T A D E F I G U R A S

Figura 1. Plasmdeo de resistncia........................................................................ 44

Figura 2. Foto de exsicata de Aniba riparia ........................................................... 46

Figura 3. Reao geral para sntese de riparina I - Acoplamento do ster metlico da tiramina com o cloreto de benzoila....................................... 54

Figura 4. Reao geral para sntese de riparina II - Acoplamento de ster metlico da tiramina com o salicilato de metila........................................ 55

Figura 5. Reao geral para sntese de riparina III - Acoplamento de ster metlico da tiramina com os cidos 2,6 dihidroxibenzico ...................... 56

Figura 6. Placa de microdiluio............................................................................ 60

Figura 7. Fluxograma da cintica bacteriana......................................................... 63

Figura 8. Fluxograma da cintica fngica .............................................................. 65

Figura 9. Fluxograma para avaliao da atividade curagnica.............................. 67

Figura 10. Perfil de suscetibilidade por difuso em meio slido, da cepa de S. aureus ATCC 25923 frente s riparinas I, II e III nas concentraes

de 400(1), 200(2), 100(3) e 50(4) g/mL ................................................ 77

Figura 11. Determinao da CIM e CBM da riparina III frente a linhagens de S. aureus ATCC 25923 (1), 122U (2), 146U (3), 223U (4), 312U (5),

319U (6), 129FN (7), 233FN (8), 322FN (9), 1A (10), 46c (11), 50c

(12) nas concentraes de 400(A), 200 (B), 100 (C), 50 (D), 25 (E) e

12,5 (F) g/mL........................................................................................ 78

Figura 12. Demonstrao do crescimento bacteriano (a) e do efeito da riparina III sobre a cepa de S. aureus 319U (b) em diferentes espaos de tempo.. 88

Figura 13. Efeito bactericida da riparina III sobre S. aureus aps exposio por 24h/37C................................................................................................. 89

Figura 14. Variantes da linhagem 319U aps tratamento com riparina III, placa matriz BAB (a) e placa imprint - BAB-penicilina (b) ........................... 95

XI

Figura 15. Antibiograma da linhagem 319U antes do tratamento de cura pela exposio riparina III (a) e de sua variante sensvel penicilina

aps o tratamento (b) ............................................................................. 96

Figura 16. E-test para penicilina da linhagem de S. aureus 319U antes (a) e aps exposio riparina III confirmao de cura (b) ......................... 96

Figura 17. Determinao da CIM para penicilina por E-test em variantes 319U... 97

XII

L I S T A D E G R F I C O S Grfico 1. Comparao do efeito das riparinas frente s cepas de S. aureus e

E. coli..................................................................................................... 82

Grfico 2. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus ATCC 25923 frente s riparinas................................................................................................. 84

Grfico 3. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus 319U frente s riparinas...... 85

Grfico 4. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus 122U frente s riparinas...... 86

Grfico 5. Cintica fngica da cepa de C. albicans ATCC 76643 frente riparina III............................................................................................... 92

Grfico 6. Freqncia da eliminao da marca de resistncia penicilina por riparinas em S. aureus linhagem 319U.................................................. 95

XIII

L I S T A D E Q U A D R O S

Quadro 1. Mecanismos de resistncia aos antimicrobianos................................... 42

Quadro 2. Caractersticas gerais das riparinas obtidas a partir da Aniba riparia (Ness) Mez (Lauraceae) ........................................................................ 56

XIV

L I S T A D E T A B E L A S

Tabela 1. Identificao e origem das cepas microbianas testadas ....................... 53

Tabela 2. Comportamento das cepas de S. aureus frente aos antimicrobianos ... 71

Tabela 3. Determinao da atividade antimicrobiana in vitro de riparinas frente s cepas padres ATCC........................................................................ 72

Tabela 4. Perfil de suscetibilidade in vitro das cepas de S. aureus frente s riparinas................................................................................................. 73

Tabela 5. Comportamento das cepas de E. coli frente s riparinas ...................... 75

Tabela 6. Determinao da CIM e da CBM das riparinas frente s cepas de E. coli, P. aeruginosa e S. aureus por difuso em meio slido.............. 76

Tabela 7. Classificao dos perfis fenotpicos das cepas de S. aureus ................ 80

Tabela 8. Apresentao da relao estruturaatividade antimicrobiana de riparinas frente a S. aureus (n = 22) ...................................................... 81

Tabela 9. Avaliao do efeito das riparinas frente s cepas de S. aureus e E. coli..................................................................................................... 82

Tabela 10. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus ATCC 25923, frente s riparinas................................................................................................. 84

Tabela 11. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus 319U frente s rparinas....... 85

Tabela 12. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus 122U frente s riparinas...... 86

Tabela 13. Perfil de suscetibilidade das cepas de C. albicans frente s riparinas..... 90

Tabela 14. Cintica fngica e efeito in vitro da riparina III sobre C. albicans ATCC 76643.......................................................................................... 91

Tabela 15. Linhagens de S. aureus com marcas de resistncia para penicilina e eritromicina ............................................................................................ 93

Tabela 16. Freqncia da eliminao da marca de resistncia penicilina por riparinas em linhagens de S. aureus ..................................................... 94

XV

R E S U M O CATO, R.M.R. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E EFEITOS BIOLGICOS DE RIPARINAS SOBRE BACTRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES. Joo Pessoa, Tese de Doutorado. 2007. 126p. Universidade Federal da Paraba. A sntese de novas substncias com atividade farmacolgica representa um grande desafio, sendo o maior deles, a transformao de produtos de plantas medicinais em substncias medicamentosas. Nessa pesquisa objetivou-se avaliar a relao estrutura/atividade antimicrobiana in vitro das riparinas I, II e III, obtidas por sntese a partir da Aniba riparia (Ness) Mez (Lauraceae), planta tpica da regio amaznica, sobre cepas padro ATCC de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans e sobre cepas multirresitentes de S. aureus. Foram avaliadas a atividade antimicrobiana e a freqncia de cura de plasmdeos de resistncia penicilina e eritromicina em S. aureus. A atividade antimicrobiana foi determinada pela mensurao das Concentraes Inibitria Mnima (CIM) e Bactericida Mnima (CBM), pelas tcnicas de medio de halos, microdiluio em placas e determinao dos nveis de resistncia atravs das Cinticas Bacteriana (CB) e Fngica (CF). Duas amostras representativas de S. aureus (linhagens 319U e 122U), com marcas de resistncia plasmidial para penicilina e eritromicina foram selecionadas para avaliao da atividade curagnica sobre plasmdeos, aps 24 horas de exposio frente s riparinas, na concentrao sub-inibitria (1/2 CIM = 100 g/mL). No foi observada a eliminao da marca de resistncia para eritromicina nessas linhagens aps tratamento pelas riparinas. Apenas a riparina III foi capaz de produzir reverso fenotpica na linhagem 319U a qual teve sua marca de resistncia penicilina eliminada numa freqncia de 61,7%. Todas as riparinas apresentaram atividade antimicrobiana sobre as linhagens de S. aureus. As CIMs demonstraram que as riparinas I e II apresentaram efeito bacteriosttico sobre S. aureus enquanto que a riparina III apresentou efeito bactericida e ao curagnica eliminando a marca de resistncia para penicilina, na concentrao sub-inibitria. O desenvolvimento de novos agentes bactericidas pode ser alcanado pela elaborao racional de novas geraes de antimicrobianos visando minimizar a resistncia, atravs do descobrimento de produtos naturais e sintticos bioativos. PALAVRAS-CHAVE: Riparinas; Atividade antimicrobiana; Cura de Plasmdeos;

Bactrias; Leveduras.

XVI

A B S T R A C T

CATO, R.M.R. ANTIMICROBIAL ACTIVITY AND BIOLOGICAL EFFECTS OF RIPARINS IN BACTERIA AND YEAST-LIKE FUNGI. Joo Pessoa. Tese de Doutorado, 2007. 126p. Universidade Federal da Paraba. The synthesis of new substances with pharmacological activity represents a great challenge, and the greatest of all is the transformation of products from medicinal plants into medical substances. In this research study, the objective was to evaluate the antimicrobial structure/activity relation in vitro of riparinas I, II and III, obtained by synthesis from Aniba riparia (Ness) Mez (Lauraceae), plants which are typical of the Amazon region, over strains of standard ATCC of Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans, as well as multiresistant samples of S. aureus. The antimicrobial activity and the frequency of curing of plasmids of resistance to penicillin and to erythromycin were evaluated in S. aureus. The antimicrobial activity was determined by the measuring the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Bactericide Concentration (MBC), by using the technique for halo measurement, microdilution in plates and determining resistance levels by means of Bacterial Kinetics (BC) and Fungic Kinetics (CF). Two representative strains of S. aureus (lineages 319U and 122U) with marks of plasmidial resistance to penicillin and erythromycin were selected to the evaluate curagenic activity over plasmids, after 24 hours of being exposed to riparins, on the sub-inhibitory concentration (1/2 MIC = 100 g/mL). It was observed that only riparin III was able to produce phenotypic reversion on lineage 319U, which had its mark of resistance to penicillin eliminated on a frequency of 61,7%. The riparins presented antimicrobial activity over the lineages of S. aureus. The MICs demonstrated that riparins I and II presented a bacteriostatic effect over of S. aureus, while riparin III presented a bactericide effect and curagenic action, thus losing their mark of resistance to penicillin on a sub-inhibitory concentration. The development of new bactericide agents might be reached by the rational elaboration of new generations of antimicrobial, which aim at minimizing the resistance, through the discovery of natural and synthetic bioactive products. KEY-WORDS: Riparins; Antimicrobial activity; Curing of Plasmids; Bacteria; Yeasts.

1 I N T R O D U O

18

1 INTRODUO

O reino vegetal ocupa lugar de destaque, devido possibilidade de utilizao

diversificada, tanto para fins alimentcios quanto para fins medicamentosos. Durante

milhes de anos, os organismos includos no reino vegetal sofreram modificaes

para melhor adaptarem-se ao meio ambiente. Esses processos antomo-fisiolgicos

deu-lhes a capacidade da sntese do prprio alimento e foi chamado de metabolismo

de ordem primria, que inclui a biossntese de lipdeos, protenas e carboidratos. Os

vegetais possuem mecanismos reguladores que os ajudam a desempenhar suas

funes vitais (DI STASI, 1996; YAMADA, 1998; DIAS, 2001).

Por meio desses mecanismos, chamados em seu conjunto de metabolismo

de ordem secundria, a planta consegue elaborar substncias (metablitos

secundrios), que desempenham papis especficos em casos de estresse,

crescimento, reproduo, capacidade para repelir organismos invasores, atrair

insetos ou pssaros, que so necessrios para a polinizao e adaptao s

mudanas fsico qumicas do meio externo (BEART, et al., 1985; CARVALHO;

SARTI, 1995; MACHADO et al., 1995; DI STASI, 1996).

Devido a estas caractersticas, so atribudas diversas aes biolgicas aos

princpios qumicos vegetais, podendo-se dizer que a planta se constitui num enorme

laboratrio de sntese orgnica, fruto de milhes de anos de evoluo (DI STASI,

1996; SALL, 1996; VON POSER; MENTZ; SCHENKEL, 2000; DIAS, 2001;

MONTANARI; BALZANI, 2001). Desse laboratrio natural o homem se aproveita

para obter substncias que possam contornar a resistncia aos antimicrobianos

convencionais.

Por um longo perodo de tempo, as plantas foram usadas como as principais

fontes de produtos naturais para a manuteno da sade humana (GOTTLIEB;

BORIN, 2002). As principais classes de compostos antimicrobianos de origem

vegetal so fenis, terpenos, alcalides, lecitinas, polipeptdeos e poliacetilenos.

Alm das citadas, outras substncias de origem vegetal mostram certa atividade

antimicrobiana, como: poliaminas, isotiocianatos, tiossulfinatos e glicosdeos

(NOGUEIRA, 2000).

Com a descoberta dos antibiticos e com o avano da indstria farmacutica,

que permitiu a criao dos medicamentos obtidos de sntese, alguns produtos

19

naturais utilizados at ento, caram em desuso durante o ps-guerra. Entretanto, o

aparecimento de microrganismos resistentes s drogas, os altos nveis de resduos

txicos nos alimentos, aliados ao desequilbrio ecolgico causado pelo homem,

fizeram com que se buscassem alternativas compatveis com o modo de vida

humana, nas mais diversas facetas do bem-estar bio-psico-social.

Atualmente em todo o mundo, so aproveitados os recursos naturais com

bons resultados. Sob esse aspecto, a flora se torna o campo para a investigao de

solues satisfatrias e criativas, originando diversas pesquisas sobre produtos de

origem natural. Na literatura cientfica emergem a todo o momento, trabalhos cujo

objeto de estudo a obteno de agentes antimicrobianos de extratos vegetais

(COUTINHO et al., 2004).

Nas ltimas dcadas, devido ao desenvolvimento de tcnicas analticas de

isolamento e elucidao estrutural, foram descobertos cerca de 50.000 novos

metablitos secundrios isolados de plantas, muitos deles sem qualquer ou com

pouca avaliao com relao ao seu potencial farmacolgico. Sobre este prisma, a

busca de novos compostos vegetais com ao antimicrobiana, se apresenta como

um modelo experimental, ecologicamente correto, para se produzir substncias que

sejam eficazes e menos agressivas ao meio ambiente e aos homens, contribuindo

assim com a melhoria da qualidade de vida, conforme estabelece a Carta Europia

do Ambiente e da Sade, publicada pela OMS em 1989 (DOUX; DOUX, 1998).

O uso de plantas medicinais para o tratamento de muitas doenas est

associado medicina popular em vrias partes do mundo (ARAJO; LEON, 2001).

Aproximadamente 80% da populao dos pases subdesenvolvidos e em

desenvolvimento so quase completamente dependentes da medicina caseira

utilizando plantas para suas necessidades bsicas de sade (BARBOSA-FILHO,

1997; CAETANO et al., 2002). Grande parte da populao brasileira consome

apenas 37% dos medicamentos disponveis, dependendo quase que exclusivamente

de medicamentos de origem natural (FUNARI; FERRO, 2005).

As espcies do gnero Aniba, rvore da famlia Lauraceae, nativa da regio

amaznica conhecida popularmente como louro (CASTELO-BRANCO et al.,

2000), e pau-rosa (MARQUES, 2001), destacam-se pelo alto valor econmico,

devido constituio do leo essencial, encontrado em grande quantidade

principalmente no lenho e na casca. Aproximadamente 40 espcies de Aniba

20

ocorrem no Brasil e podem ser divididas em 3 grupos de acordo com a natureza

qumica do constituinte predominante no leo essencial: do linalol, do benzoato e do

albenzeno (MARQUES, 2001).

A quimiodiversidade e a potencialidade farmacolgica da flora brasileira so

imensurveis e permite o estudo de plantas nativas de cada regio bem como o

estudo de plantas exticas na Paraba como o caso da Aniba riparia (Ness) Mez,

rvore da famlia Lauraceae, considerada uma das mais primitivas famlias, cujos

primeiros registros datam de 2.800 a.C. sendo originrias da Grcia antiga. As

Lauraceae destacam-se das demais famlias pela sua importncia econmica, sendo

algumas espcies utilizadas na medicina popular e nas indstrias de perfumaria e

qumica (MARQUES, 2001).

Na medicina popular, as Lauraceae apresentam utilizaes variadas,

desempenhando diferentes funes contra diversas doenas. Deve-se ressaltar,

entretanto, que o uso das plantas deve ser feito com critrios e com eficcia

teraputica conhecida (MARTINS; SANTOS, 1995).

Segundo Barbosa-Filho et al. (1987), do ponto de vista fitoqumico, Aniba

riparia (Nees) Mez (Lauraceae), apresenta uma classe especial de alcalides

contendo uma funo alcamida, restrito a poucos representantes na natureza. Aps

a elucidao estrutural de um dos seus compostos o (O-metil-)-N-(2-hidroxibenzoil)

tiramina verificou-se que, biogeneticamente, esta molcula resultado da

condensao de duas substncias: o ter metlico da tiramina, agente

simpaticomimtico, e o cido saliclico, agente queratoltico e antimictico.

A partir da despertou-se a curiosidade de se verificar a potencialidade

farmacolgica deste produto natural, de modo que este e outros anlogos foram

sintetizados no Laboratrio de Tecnologia Farmacutica (LTF) da Universidade

Federal da Paraba. Trs so de ocorrncia natural e foram isoladas pela primeira

vez da Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae), sendo chamadas de riparinas I, II e III,

denominao esta para fazer referncia planta de origem. Estes produtos foram

submetidos a ensaios farmacolgicos, observando-se que o composto mais ativo da

srie sinttica o (O-metil-)-N-(2,6-dihidroxibenzoil) tiramina, riparina III (BARBOSA-

FILHO,1997).

21

A sntese de novas substncias, com atividade farmacolgica significou um

grande avano tecnolgico e o estudo qumico e farmacolgico dos produtos

naturais representa um grande desafio, sendo o maior deles, o interesse pela

transformao desses produtos obtidos de plantas medicinais em substncias

medicamentosas.

provvel que novos e revolucionrios antimicrobianos no sejam

descobertos em um futuro prximo. Porm, importante que os agentes existentes

sejam sabiamente empregados a fim de que se possa reduzir a emergncia e a

disseminao de bactrias resistentes. So necessrios estudos sobre a

concentrao inibitria mnima (CIM), concentrao bactericida mnima (CBM) e

cintica bacteriana (CB), relacionados determinao da ao curagnica na

remoo de plasmdeos, de modo que se possa impedir ou mesmo minimizar a

transferncia plasmidial de resistncia a antibiticos, levando reverso do fentipo

de resistncia para sensibilidade.

com esse propsito que essa pesquisa visa anlise dos efeitos biolgicos

das riparinas obtidas por sntese a partir da Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae),

sobre microrganismos multirresistentes, isolados de infeces humanas, animais ou

de amostras ambientais. importante tambm, avaliar a ao curagnica desses

produtos sobre plasmdeos em bactrias e sua ao sobre leveduras, possibilitando

de alguma forma a limitao da emergncia da resistncia aos antimicrobianos.

A relevncia desse estudo consiste na possibilidade de contribuir para a

preveno de linhagens multirresistentes.

2 O B J E T I V O S

23

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Esta pesquisa teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana in vitro,

dos substratos sintticos, Riparina I, II e III, inicialmente obtidos a partir da Aniba

riparia (Nees) Mez (Lauraceae) sobre cepas padres American Type Culture

Collection - ATCC de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Candida albicans e tambm sobre cepas de S. aureus de origem

humana, animal e ambiental, verificando a que grupo farmacolgico (bacteriosttico

ou bactericida) pertencem e estudar os efeitos biolgicos da ao desses compostos

sobre plasmdeos de resistncia a drogas em linhagens de S. aureus.

2.2 Especficos

Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro das riparinas I, II e III sobre amostras ambulatoriais e padres ATCC de S. aureus, E. coli, P. aeruginosa

e C. albicans.

Determinar as Concentraes: Inibitria Mnima (CIM), Bactericida Mnima (CBM) e Fungicida Mnima (CFM) das riparinas ativas, pela tcnica de

microdiluio em placas e pelo mtodo cavidade-placa, sobre as cepas

ATCC.

Determinar as Cinticas: Bacteriana (CB) e Fngica (CF) das riparinas I, II e III, sobre cepas que apresentaram sensibilidade aos respectivos substratos.

Avaliar a relao estrutura/atividade das riparinas I, II e III em amostras ambulatoriais e padro ATCC de S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e

C. albicans.

Caracterizar fenotipicamente as cepas de S. aureus, utilizadas neste estudo, com relao aos padres de resistncia a antibiticos.

Avaliar a ao das riparinas I, II e III na eliminao de plasmdeos de resistncia penicilina e eritromicina em cepas de S. aureus.

3 R E V I S O D E L I T E R A T U R A

25

3 REVISO DE LITERATURA

3.1 Patognese microbiana

Dentre os principais microrganismos responsveis por processos infecciosos,

freqentemente isolados em humanos, e que apresentam elevada resistncia aos

antimicrobianos, destacam-se: Staphylococcus aureus e Escherichia coli (TRABULSI

et al., 2006). Entretanto, outros microrganismos considerados emergentes, como

Listeria monocytogenes e fungos, tambm tm sua importncia devido gravidade

dos processos infecciosos por eles causados, principalmente quando atingem

pacientes imunossuprimidos fisiolgica ou patologicamente. Em geral, o quadro

clnico da listeriose de extrema severidade caracterizando-se primordialmente,

pela meningite e septicemia (HOFER, 2001). Entre os fungos leveduriformes,

Candida albicans a espcie isolada com maior freqncia em infeces

superficiais e/ou subcutneas (COLEMAN et al., 1998; TRABULSI et al., 2006).

3.1.1 Staphylococcus aureus

Esses microrganismos pertencem famlia Micrococaceae, so

caracterizados morfo-tintorialmente como cocos Gram-positivos que crescem

agrupados formando cachos irregulares (BROOKS; BUTEL; MORSE, 2000). O

gnero Staphylococcus constitudo por vrias espcies, sendo algumas produtoras

da enzima coagulase alm de outros componentes de superfcies, considerados

fatores de virulncia, utilizados na identificao e diferenciao deste gnero,

atravs de suas propriedades fisiolgicas, enzimticas e bioqumicas (NOVAK,

2000).

Trata-se de uma das bactrias mais resistentes no formadoras de esporos.

So relativamente termo-resistentes e capazes de sobreviver por longos perodos

em objetos inanimados secos. Essas propriedades permitem ao S. aureus

sobreviver em qualquer tipo de ambiente onde se encontram seres humanos. So

considerados como potentes patgenos e so amplamente encontrados na biota

humana, podendo causar vrios processos infecciosos piognicos, algumas vezes

levando formao de abscessos em tecidos profundos, podendo produzir

enfermidades mrbidas distintas por meio da produo de toxinas especficas

26

(TRABULSI et al., 2006; BROOKS; BUTEL; MORSE, 2000; NOVAK, 2000; KURODA

et al., 2001).

A patognese atribuda ao S. aureus devida ao nmero de fatores de

virulncia na forma de toxinas, enzimas e protenas associadas parede celular,

mediados por genes plasmidiais ou cromossmicos, que combinados conduzem

doena (CARDOSO, 1998; PEREIRA, 2000).

O potencial patognico deste microrganismo est associado diferenciada

capacidade de mutao para formas resistentes, exigindo reavaliaes peridicas de

seu perfil de susceptibilidade (ZAVADINACK-NETTO, et al., 2001). Esses

microrganismos so capazes de adquirem resistncia aos agentes antimicrobianos

quase imediatamente aps a sua introduo no mercado. Atualmente muitas cepas

so resistentes a quase todos os antimicrobianos e a perspectiva de aparecimento

de uma cepa resistente a todos os antimicrobianos disponveis, constitui uma sria

preocupao (SCHAECHTER et al., 2002).

Um dos principais aspectos da resistncia de S. aureus aos antimicrobianos,

que ela pode ser codificada cromossomicamente ou mediada por plasmdeos

(DYKE; RICHMOND,1967; SOUZA; REIS; PIMENTA, 2005; YAMADA et al., 2006),

alm do uso abusivo e indiscriminado de agentes antimicrobianos na clnica mdica

humana e veterinria que tem causado efeito seletivo no surgimento e manuteno

de resistncia s drogas (PEREIRA, 2000; COELHO et al., 2007).

Particularmente, S. aureus, possui versatilidade no desenvolvimento de

resistncia a vrios agentes antimicrobianos, contribuindo para a sua sobrevivncia

em ambientes hospitalares e difuso entre pacientes, como o caso do S. aureus

resistente meticilina (Staphylococcus aureus Methicillin Resistant - MRSA) e que

geralmente, tambm, resistente s cefalosporinas, tetraciclinas, aminoglicosdeos,

rifampicina (GILLESPIE; MCHUGH, 1997). Esses microrganismos possuem trs

diferentes mecanismos de resistncia meticilina: 1) hiperproduo de beta-

lactamases; 2) presena de uma protena ligadora de penicilina (PBP Protein

Binding Penicilin) alterada, denominada PBP 2a; 3) modificaes na capacidade de

ligao das PBPs, podendo os trs mecanismos estarem presentes numa mesma

amostra, inclusive interagindo entre si (SOUZA; REIS; PIMENTA, 2005; YAMADA et

al., 2006).

27

Os mecanismos pelos quais os genes de resistncia se movimentam entre os

microrganismos, so complexos. Em S. aureus a resistncia mltipla resulta

principalmente da presena de plasmdeos, que geralmente se encontram em

mltiplas cpias, o que permite sua transferncia em uma freqncia elevada

(FORBES; SHABERG, 1983; PEREIRA, 2000). A transferncia de resistncia

plasmidial, tambm pode envolver processos de transduo, os quais esto

relacionados ao de uma partcula viral (TRABULSI et al., 2006).

Outra estratgia da resistncia em S. aureus, a aquisio de genes de

resistncia no cromossomo, produzindo multirresistncia a maioria das drogas

usadas na prtica clnica, como o caso da linhagem de MRSA. Tambm h relatos

de envolvimento de transposons para vrias marcas de resistncia em S. aureus

(LYON; SKURRAY, 1987). Vrias pesquisas foram realizadas em amostras de

S. aureus, no intuito de se obter esclarecimentos sobre a localizao e interao dos

genes de resistncia cromossomial ou em outros elementos genticos como

plasmdeos, transposons e bacterifagos (KURODA et al., 2001).

Algumas cepas MRSA so associadas a infeces nosocomiais, no entanto

existem relatos de casos em pessoas saudveis e sem fatores de risco conhecidos

para desenvolvimento deste tipo de infeco (NAINI et al., 2003; BERNARDES,

JORGE; LEO, 2004). Algumas linhagens de S. aureus resistentes vancomicina

(VRSA) tambm apresentam resistncia a potentes -lactmicos (KURODA et al.,

2001).

No Brasil, Pereira et al. (1997), demonstraram pela primeira vez, transferncia

de resistncia tetraciclina, por conjugao mediada por fago, em linhagens de

S. aureus bovinas para linhagem de laboratrio de origem humana, indicando que a

conjugao pode desempenhar um importante papel na disseminao de resistncia

a drogas em condies naturais.

Alm da resistncia a vrios antimicrobianos, S. aureus pode ainda

apresentar resistncia a ons metlicos (arsenato, cdmio, mercrio) e a biocidas,

tais como acriflavina, cloreto de benzalcnio, cetrimida e ciclohexidina. A seleo e

manuteno destas marcas de resistncia se explicam pela presena desses

agentes, como poluentes urbanos ou industriais ou mesmo o uso hospitalar como

anti-sptico (RUSSEL,1997).

28

Para destruir as bactrias, muitos antibiticos se ligam a protenas da famlia

PBP de forma a torn-las inativas. Essas protenas esto envolvidas na construo

da parede celular dos microrganismos. Sem a parede corretamente montada, as

bactrias no podem manter sua integridade e morrem. O principal caminho usado

pelas bactrias para se tornar resistente a meticilina (oxacilina), envolve a aquisio

do gene mecA. Esse gene comanda a sntese da protena PBP2a (adquirida ou

alterada), que no desativada pelos antibiticos e capaz de formar a parede

celular da bactria. No entanto PBP2a, no age sozinha; sua atividade est

associada a vrias outras protenas codificadas pelo DNA da prpria bactria e pela

PBP2 (inata). A resistncia ocorre pela incapacidade de agentes -lactmicos se

ligarem a essa PBP interferindo na sntese da parede celular bacteriana (SOUZA;

REIS; PIMENTA, 2005).

Em bactrias Gram positivas, a resistncia a macroldeos, pode acontecer

atravs de bomba de efluxo e pela produo de uma enzima metilase que atua na

poro 23S do RNA ribossmico, codificada pelo gene erm, e pode conferir

resistncia cruzada a outras classes de drogas como lincosaminas e

estreptograminas. Este fentipo de resistncia conhecido como MLS (macroldeos-

lincosamdeos-estreptogramina) e pode ser constitutvel ou induzvel. O fentipo

constitutivo pode ser facilmente detectado pelo antibiograma, observando-se

resistncia aos macroldeos, estreptograminas e lincosaminas. Quando o fentipo

induzvel pode-se observar in vitro resistncia a eritromicina e sensibilidade

clindamicina, atravs do teste de induo, conhecido por D-teste (NCCLS, 2004).

3.1.2 Escherichia coli

O gnero Escherichia compreende vrias espcies, entretanto a nica

espcie de importncia prtica Escherichia coli a qual se caracteriza por causar

diversos processos patolgicos, tanto no seu habitat natural, o trato intestinal,

quanto fora dele. E. coli a causa mais comum de infeco urinria, sendo

responsvel por 90% ou mais das infeces adquiridas na comunidade. Pode

tambm causar, meningite em recm-nascidos e bacteremias, sendo as fontes mais

comuns os tratos urinrio e gastrointestinal, cateteres intravenosos, aparelhos

respiratrios e pele. Essa espcie compreende grande nmero de grupos e tipos

sorolgicos distintos, identificados por meio de anti-soros especficos. Atualmente,

29

vem apresentando crescente resistncia aos agentes antimicrobianos. Esta

resistncia em parte tambm plasmidial (KONEMAN et al., 2001; MIMS et al.,

2005; TRABULSI et al., 2006).

3.1.3 Pseudomonas

Gnero de microrganismos que compreende mais de 100 espcies so

bastonetes curtos e Gram-negativos. Do ponto de vista clnico, a espcie mais

importante do gnero Pseudomonas aeruginosa. Considerado um patgeno

oportunista, pode ser encontrado no solo e na gua; possui necessidades

nutricionais mnimas e capaz de sobreviver sob condies ambientais bastante

diversas. Devido a essa adaptabilidade e sua resistncia tanto intrnseca quanto

adquirida, aos antimicrobianos mais comuns, o gnero Pseudomonas, encontra no

hospital um ambiente favorvel ao seu desenvolvimento (SCHAECHTER et al.,

2002), sendo causa freqente de infeces nosocomiais, e agente causal de

inmeras infeces humanas.

P. aeruginosa um patgeno importante, principalmente em indivduos

imunocomprometidos, com fibrose cstica, queimaduras e diabetes (TRABULSI, et

al., 1999; SCHAECHTER et al., 2002). Tambm apresenta importncia em estudos

relacionados a microbiologia de alimentos, pois so microrganismos causadores de

deteriorao (FRANCO; LANDGRAF,1996).

3.1.4 Fungos leveduriformes

Dentre os fungos leveduriformes o gnero Candida destaca-se por ser

responsvel por vrias micoses oportunistas, ou seja, micoses causadas por fungos

de baixa virulncia que convivem pacificamente com o hospedeiro, mas, ao

encontrar condies favorveis, como distrbios do sistema imunodefensivo,

desenvolvem seu poder patognico invadindo tecidos. Atingem indivduos de ambos

os sexos, de todas as raas e faixas etrias (GOMPERTZ et al., 1999).

O gnero Candida responsvel por cerca de 80% das infeces fngicas no

mbito hospitalar e constitui causa relevante de infeces na corrente sangnea

(COLOMBO; GUIMARES, 2003). O agente mais freqente Candida albicans,

30

porm outras espcies como C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis

podem ser encontradas em diversos processos patolgicos (GOMPERTZ et al.,

1999). Alguns processos patolgicos envolvendo espcies emergentes, como

C. kefyr, C. rugosa, C. utilis e C. inconspicua entre outras, tambm tem sido

descritos (COLEMAN et al., 1998).

O aumento das infeces por Candida spp. deve-se entre outros fatores, aos

tratamentos com antimicrobianos de amplo espectro, ao uso de nutrio parenteral,

de cateteres intravenosos e de entubao endotraqueal. A maior freqncia ocorre

em pacientes imunossuprimidos e/ou submetidos a cirurgias de grande porte

(ZARDO; MEZZARI, 2004).

Vrios so os fatores de virulncia encontrados nas espcies de Candida,

entre eles destacam-se a produo de toxinas e enzimas proteolticas extracelulares,

que constitui os mais importantes fatores relacionados ao desencadeamento das

infeces fngicas. A produo de fosfolipases e adesinas pela C. albicans tambm

so componentes importantes no reconhecimento e disseminao hematognica

(ZARDO; MEZZARI, 2004).

3.2 Antimicrobianos

Com base nas propriedades farmacolgicas, as substncias antimicrobianas

podem ser divididas em dois grupos principais: bactericida e bacteriosttico. O

primeiro, inclui as substncias que exibem propriedades de eliminao de

microrganismos em funo da concentrao como fluorquinolonas e

aminoglicosdeos. Para este grupo, quanto maior a concentrao da droga, mais

rpida a erradicao dos microrganismos. O segundo grupo inclui as substncias

capazes de impedir a multiplicao da populao bacteriana, cujo pico das

concentraes pouco relevante. O tempo durante o qual as concentraes so

mantidas acima da Concentrao Inibitria Mnima (CIM ou MIC) crtico para a

erradicao bacteriana. Neste grupo, esto as drogas independentes da

concentrao, ou seja, so drogas dependentes do tempo de uso exposio ou

contato. Na prtica, os antimicrobianos bacteriostticos, so geralmente eficazes

(AGUIAR, 2003).

31

De um modo geral, um agente bactericida que cause a morte rapidamente de

microrganismos prefervel a um agente bacteriosttico que inibe reversivelmente o

crescimento microbiano. No entanto, a preferncia na clnica mdica e veterinria,

pelo uso de agentes bactericidas depende de vrias circunstncias relacionadas ao

processo infeccioso. Por exemplo, a eritromicina, um inibidor da sntese protica,

um agente bacteriosttico, mas interrompe bruscamente a sntese de toxinas

proticas; a penicilina, ao contrrio, bactericida, mas no imediatamente, de modo

que, durante um intervalo de tempo at que a substncia exera seu efeito ltico; e

os microrganismos continuam a produzir toxinas (AGUIAR, 2003; TRABULSI et al.,

2006).

A distino entre bacteriosttico e bactericida no deve ser tomada de forma

absoluta. Primeiro, porque a ao da droga pode diferir em distintos organismos;

segundo, porque algumas drogas apresentam cintica de ao peculiar, o que as

torna de difcil classificao. Em outros casos, a combinao de duas substncias

bacteriostticas pode induzir uma ao bactericida (SCHAECHTER et al., 2002).

importante ressaltar, a necessidade de desenvolver pesquisas que

busquem outras maneiras de atuao das drogas, tais como a capacidade de inibir

fatores de virulncia, como toxinas e adesinas. No entanto, estas drogas no

afetariam o crescimento de microrganismos in vitro e, por conseguinte sua ao se

manifestaria apenas in vivo (SCHAECHTER et al., 2002).

A farmacocintica e a farmacodinmica esto inter-relacionadas, de modo

que as propriedades farmacocinticas de uma droga caracterizam o aumento e a

queda das concentraes da droga no sangue e no tecido no decorrer do tempo. Os

parmetros farmacodinmicos integram a atividade microbiolgica e farmacocintica

de uma droga antimicrobiana, focalizando seus efeitos biolgicos, especialmente a

inibio do crescimento e a eliminao de patgenos (BURGESS, 2000).

A transferncia de material gentico entre organismos da mesma ou de

diferentes espcies desempenha um papel crucial na evoluo da resistncia aos

antimicrobianos. Por exemplo, em S. aureus, essa transferncia pode ocorrer por

transformao, transduo e processos que envolvem contato entre as clulas,

mediada por fagos ou conjugao propriamente dita. Alguns fatores podem afetar a

transferncia conjugativa de plasmdeos, como a composio do meio, pH e

temperatura. Antibiticos como a gentamicina e a vancomicina estimulam a

32

freqncia de transferncia de 10 a 20 vezes enquanto meticilina e alguns inibidores

da sntese de protenas reduzem essa freqncia (AL - MASAUDI et al., 1991).

A resistncia mediada por plasmdeos, pode ser simples, porm na maioria

das vezes mltipla, tornando a bactria, resistente a dois ou mais antimicrobianos.

Isto ocorre devido presena de genes de resistncia, para diferentes

antimicrobianos, num s plasmdeo (TRABULSI et al., 2006). Geralmente, a

multirresistncia a antimicrobianos, resulta da presena de plasmdeos em mltiplas

cpias, o que garante a sua distribuio durante a diviso celular e permite a

transferncia sem causar na maioria das vezes um custo biolgico para a clula

bacteriana (TOMAZ, 1994; PEREIRA; SIQUEIRA, 1995).

Os plasmdeos podem ser inativados ou removidos da clula, curados, depois

de serem submetidos a diferentes condies de estresse, como mudanas na

temperatura de incubao e presena de determinadas substncias adicionadas aos

meios de cultura. A eliminao de plasmdeos est bem estabelecida atravs de

uma variedade de compostos, como os corantes de acridina, brometo de etidio,

rifampicina, sal de bis-amnio, tioridazina (uma fenotiazina), assim como tambm

antibiticos inibidores da sub-unidade B da DNA-girase, novobiocina, e

coumermicina (HOOPER et al., 1984; WEISSER; WIEDMANN, 1985; PEREIRA,

2000).

Recentemente, alguns autores relataram a eliminao de resistncia aos

frmacos tetraciclina, estreptomicina e penicilina por concentraes sub-inibitrias

de fluorquinolonas, em cepas de S. aureus de origem bovina (PEREIRA et al., 2004)

e pelo extrato metanlico de Punica granatum em cepas de S. aureus (MRSA e

MSSA) de origem clnica (BRAGA et al., 2005).

3.2.1 Mecanismos de ao de alguns antimicrobianos

-lactmicos (Penicilina) Todos os -lactmicos (cefalosporinas, oxacilinas, meticilina e outras

penicilinas) caracterizam-se por apresentarem um anel -lactmico que essencial

para a sua atividade antibacteriana (MACEDO et al., 2005).

33

Embora o mecanismo de ao das penicilinas (molculas caracterizadas por

anel tiazolidnico e -lactmico), ainda no tenha sido completamente determinado,

sua atividade bactericida inclui a inibio da sntese da parede celular e a ativao

do sistema autoltico endgeno da bactria. Esse processo ocorre atravs da

inativao da transpeptidao na formao do peptideoglicano (inibidor de enzimas

autolticas) da parede celular levando lise da bactria (RANG et al., 2000;

BRAOIOS, 2005).

A ao da penicilina depende da parede celular que contm na sua

composio, peptideoglicano. Durante o processo de replicao bacteriana, a

penicilina inibe as enzimas que fazem a ligao entre as cadeias peptdicas,

impedindo, portanto, o desenvolvimento da estrutura normal do peptideoglicano.

Estas enzimas, transpeptidase, carboxipeptidase e endopeptidase, localizam-se logo

abaixo da parede celular e so denominadas PBPs. A habilidade de penetrar na

parede celular e o grau de afinidade destas protenas, com a penicilina, determinam

a sua atividade antibacteriana (RANG et al., 2000; KONEMAN et al., 2001).

As bactrias podem desenvolver resistncia aos -lactmicos atravs de trs

mecanismos: preveno da interao entre o antimicrobiano e a PBP alvo,

incapacidade de se ligar PBP e hidrlise do antimicrobiano por -lactamases.

Existem vrios tipos de enzimas -lactamases, que so classificadas pela sua

seqncia de aminocidos e divididas em quatro classes (A, B, C e D) baseadas em

suas estruturas e substratos especficos (MACEDO et al., 2005). As -lactamases

rapidamente se dissemam e so encontradas em muitos isolados clnicos tanto de

S. aureus quanto em outras espcies de Staphylococcus (RANG et al., 2000).

O uso indiscriminado da penicilina favoreceu a grande emergncia de

resistncia em S. aureus. Essa resistncia pode ser mediada por plasmdeos, tendo

diferentes causas, entre elas: produo de -lactamases, reduo da

permeabilidade da membrana externa (mais comum em microrganismos Gram

negativos) e ocorrncia de stios modificados de ligao penicilina, particularmente

importante em cepas MRSA (RANG et al., 2000; TAVARES, 2000; MASUNARI;

TAVARES, 2006).

As bactrias, por sua vez, diferem na sua composio quanto ao tipo e

concentrao de PBPs e, conseqentemente, quanto permeabilidade de suas

paredes celulares ao antibitico. Tendo-se assim, diferentes suscetibilidades

34

bacterianas penicilina. Alguns microrganismos possuem enzimas autolticas

defeituosas e so inibidos, porm no sofrem lise e so considerados como

tolerantes (RANG et al., 2000).

Quinolonas O termo quinolona foi utilizado pela primeira vez por Prince, em 1949, ao

descrever um cido carboxlico com a estrutura das quinolenas e contendo um

tomo de oxignio na posio 4 da molcula. Esta substncia foi obtida por

degradao de certos alcalides, no sendo reconhecida como uma droga com

atividade biolgica, no entanto, serviu como estrutura bsica para o

desenvolvimento de uma srie de compostos com aplicaes teraputicas

(PEREIRA, 2000).

O primeiro composto dessa classe de drogas foi o cido nalidxico (prottipo

de primeira gerao), comercializado em 1964, a partir dele, outros compostos

foram sintetizados, dentre eles destaca-se o cido pipemdico (TILLOTSON, 1996;

MIMS et al., 2005).

Um novo e decisivo avano na famlia das quinolonas ocorreu em 1980, com

a introduo das fluorquinolonas. Estes agentes compreendem um grupo de

compostos antimicrobianos, que resultam de modificaes estruturais do ncleo

quinolnico, pela introduo de tomo de flor e um grupo piperazinil. Estes radicais

conferiram as quinolonas maior espectro antimicrobiano e diminuio dos efeitos

adversos (ZUCARELLI, 1988; PEREIRA, 2000).

Todas as quinolonas agem por inibio da enzima alvo DNA-girase, uma

topoisomerase, responsvel primariamente pela introduo da superhelicoidizao

negativa do DNA, na presena de ATP. Estas alteraes no estado topolgica da

molcula do DNA desempenham importantes funes nos processos de replicao,

transcrio, recombinao. A inibio da atividade da DNA-girase pelas

fluorquinolonas, resulta na interrupo da sntese do DNA e consequentemente na

morte da clula bacteriana (TAKENOUCHI et al., 1995).

Macroldios (Eritromicina) O termo macroldio est relacionado com a estrutura formado por um anel

lactona de vrios membros ao qual se ligam um ou mais desoxi-acares. Durante

aproximadamente 40 anos, a eritromicina foi o nico antibitico macroldeo de uso

35

clinico geral. O mecanismo de ao da eritromicina, assim como de outros

macroldeos (claritromicina e azitromicina), baseado no fato que essas

substncias inibem a sntese de protenas bacterianas atravs de um efeito sobre a

translocao.

A eritromicina se liga ao RNA ribossmico 23S (rRNA) na subunidade 50S do

ribossomo e bloqueia o passo de translocao no processo de sntese de protenas

(atividade bacteriosttica), impedindo assim a liberao do RNA de transferncia

(tRNA) aps a formao da ligao de peptdeos (MIMS et al., 2005). Esse

processo pode ocorrer por modificao enzimtica - metilao do rRNA de

bactrias Gram positivas e a metilase envolvida usualmente codificada por genes

plasmidiais A eritromicina pode interferir na ligao do cloranfenicol que tambm

atua neste local. (SCHAECHTER et al., 2002).

Segundo Rang et al. (2000), alguns microrganismos resistentes, com

mutaes em componentes nessas subunidades ribossmicas, 23S e 50S, no se

ligam ao frmaco. Acredita-se que o mesmo no iniba diretamente a formao de

ligaes peptdicas, mas sim, a etapa de transferncia, atravs da qual uma

molcula de peptidil-tRNA recm sintetizada, que migra do stio aceptor sobre o

ribossomo, para o stio peptidil, ou doador. Os macroldios podem ser bactericidas

e/ou bacteriostticos.

A eritromicina um indutor de resistncia, e as cepas resistentes a esse

antibitico tambm podero ser resistentes lincomicina e clindamicina, em um

processo conhecido como resistncia MLS (macroldeos-lincosamdeos-

estreptogramina). A capacidade de induo varia entre as espcies bacterianas,

porm so mais comuns em cocos Gram positivos (MIMS et al., 2005).

Tetraciclinas As tetraciclinas formam uma famlia de grandes estruturas cclicas com vrios

stios para possveis substituies qumicas. O grupo inclui alm da tetraciclina,

clortetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina e minociclina. As tetraciclinas so

inibidores especficos do ribossomo de clulas procariticas, bloqueando o receptor

na subunidade 30S que se liga ao t-RNA durante a traduo gnica. Atuam inibindo

a sntese de protenas aps sua captao em microrganismos sensveis por

transporte ativo (RANG et al., 2000).

36

As tetraciclinas so antimicrobianos bacteriostticos, de amplo espectro,

porm muitas cepas microbianas tornaram-se resistentes a esses frmacos,

diminuindo sua utilidade. A resistncia mediada principalmente por plasmdeos

que possuem genes capazes de codificar uma protena (bomba de efluxo) que

ativamente expulsa a tetraciclina da clula; esses plasmdeos tambm podem

codificar uma protena capaz de ligar-se ao ribossomo impedindo a ao da

tetraciclina (RANG et al., 2000).

Aminoglicosdeos Os aminoglicosdeos constituem um grupo de antimicrobianos com estrutura

qumica complexa, que se assemelham entre si quanto sua atividade

antimicrobiana, caractersticas farmacocinticas e toxicidade. Possuem um dos

mais complexos mecanismos de ao de todos os antimicrobianos anti-

ribossmicos. Basicamente, ele segue trs etapas: penetrao na membrana

externa das bactrias Gram negativas; associao a um sistema de transporte ativo

de duas fases; e ligao subunidade ribossmica 30S para inibir a sntese

protica, principalmente na etapa inicial, interferindo na codificao feita pelos

ribossomos, conduzindo assim a produo de protenas no-funcionais (RANG et

al., 2000; SCHAECHTER, et al., 2002; MIMS et al., 2005).

Os dois principais mecanismos de resistncia aos aminoglicosdeos foram

descobertos em bactrias Gram negativas. O primeiro a inativao do seu

transporte, esse mecanismo de resistncia ocorre em bactrias anaerbicas e o

segundo envolve a inativao enzimtica, que considerado como o mecanismo

mais comum em amostras de origem clnica. Muitas das diferentes enzimas que

inativam essas substncias foram identificadas em linhagens de E. coli,

Pseudomonas e Staphylococcus. Normalmente, as enzimas que inativam

aminoglicosdeos so codificadas por plasmdeos ou transposons, alm disso, mais

de um desses determinantes genticos podem ser transportado em um plasmdeo

(SCHAECHTER, et al., 2002).

Antifngicos O nmero de agentes teraputicos, adequados, contra fungos (antifngicos

ou antimicticos), quando comparados s substncias antibacterianas, muito

limitado. Geralmente, os antifngicos so considerados como substncias txicas e

37

alguns no apresentam toxicidade seletiva, como o caso da maioria dos

antimicrobianos que inibem os ribossomos de fungos e so tambm ativos contra

ribossomos humanos (RANG et al., 2000). No existem, atualmente, inibidores da

sntese protica dos fungos que tambm no inibam a via equivalente nos

mamferos (MIMS et al., 2005).

Entretanto, existem antifngicos com toxicidade seletiva, dentre eles os

polinicos, anfotericina B, considerada o padro ouro, nistatina e natamicina que

se ligam com maior avidez ao ergosterol das membranas de fungos do que ao

colesterol das membranas de eucariotos superiores; os imidazis que constituem um

grupo de frmacos com maior especificidade para o citocromo P-450 desmetilase

fngica do que para a desmetilase animal, envolvida na sntese de esteris; e a

griseofulvina que considerada como um dos antifngicos mais eficazes contra

micoses superficiais e age ligando-se fortemente queratina recm-formada (RANG

et al., 2000; NOBRE et al., 2002).

Foi iniciada uma nova era no tratamento das micoses, com a introduo dos

antifngicos azlicos, especialmente, fluconazol e itraconazol que possuem boa

disponibilidade via oral e baixa incidncia de efeitos adversos (ZARDO; MEZZARI,

2004).

Tem sido observado, com freqncia, o isolamento de cepas de leveduras

com suscetibilidade diminuda ou resistente aos antifngicos. Esta resistncia pode

ser clnica, por conseqncia do baixo nvel do frmaco no tecido e no sangue,

devido interao entre frmacos ou imunodepresso do paciente, ou pode ser in

vitro, onde as cepas suscetveis se transformam em resistentes devido ao contato

prvio com o antifngico. consenso que a resistncia aos frmacos depende da

interao deste, com o hospedeiro e com o fungo. Porm fatores relacionados aos

hospedeiros so considerados como os mais importantes para o surgimento da

resistncia (SILVA; DAZ; FEBR, 2002).

O tratamento de infeces fngicas ainda dificultado por problemas de

solubilidade, estabilidade e absoro dos frmacos existentes e a busca de novos

agentes antifngicos, constitui prioridade mxima. Alm disso, a resistncia

medicamentosa cada vez maior e nenhum agente antifngico ideal se usado

isoladamente (MIMS et al., 2005).

38

3.3 Resistncia bacteriana aos antimicrobianos

A resistncia aos antimicrobianos pode ter origem gentica (cromossmica e

extra-cromossmica por conjugao, transduo, transformao e transposio) e

no gentica (relacionada ao metabolismo), e tem se tornado um fato rotineiro desde

o incio da era dos antibiticos, considerados como uma das grandes contribuies

da medicina no Sc. XX. Entretanto, essa resistncia microbiana tem acarretado

crescente morbidade e mortalidade, bem como elevao nos custos da sade. Por

esta razo a Organizao Mundial de Sade (OMS), o Centro de Preveno e

Controle de Enfermidades (CDC) e ouros rgos americanos e europeus, tm

desenhado novos programas e sistemas de vigilncia da resistncia bacteriana.

Mesmo assim, solicita-se que cada pas tenha seu prprio programa de vigilncia

nacional e local para poder realizar um melhor controle desse fenmeno (CRESPO,

2002).

Desde o incio dos anos 80, o nmero de antimicrobianos em fase de

desenvolvimento diminuiu consideravelmente, ao mesmo tempo, a resistncia

bacteriana aos antimicrobianos tem crescido de forma imensurvel. Enquanto, nos

anos 70 e 80, as bactrias Gram-negativas resistentes eram consideradas como o

principal flagelo, entretanto no final do Sc. XX, as bactrias Gram-positivas,

resistentes, tornaram-se importantes, indicando que estes microrganismos esto

cada vez mais desenvolvendo novos mecanismos de resistncia. Com o uso

excessivo de antimicrobianos, principalmente penicilina G, algumas cepas

resistentes a esse frmaco comearam a se tornar um grande problema,

principalmente dentro dos hospitais (BRAOIOS, 2005).

O desenvolvimento de agentes antimicrobianos eficazes para o tratamento de

doenas infecciosas representa uma das mais marcantes realizaes do Sc. XX.

Como conseqncia desse avano cientfico, evidenciou-se uma considervel

reduo de morbidade e mortalidade associadas. Entretanto, a emergncia

disseminada de resistncia adquirida a antimicrobianos nos ltimos anos, facilitada

por diversos fatores demogrficos tais como: crescimento populacional e

urbanizao, facilidade de deslocamento de grandes continentes populacionais,

como o turismo, por exemplo, constituem, atualmente, uma sria ameaa sade

pblica global, tanto em ambientes hospitalares quanto nas comunidades.

importante ressaltar que o desenvolvimento de qualquer novo frmaco com atividade

39

antimicrobiana vem acompanhado do aparecimento da resistncia microbiana. E que

a emergncia de patgenos resistentes, aos antimicrobianos, uma ameaa a

esses avanos (MOELLERING Jr., 2000).

A resistncia bacteriana tornou ineficaz, vrios tratamentos com

antimicrobianos anteriormente valiosos e ameaa a eficcia de novas terapias

similares. O aparecimento de resistncia resulta em vrios fatores, tais como o uso

crescente e inadequado de antimicrobianos, procedimentos invasivos, em grande

nmero de hospedeiros susceptveis e falhas no controle de infeces, ocasionado

aumento da transmisso de organismos resistentes, principalmente em ambientes

hospitalares e em pacientes imunocomprometidos (BRAOIOS, 2005).

A presso seletiva resultante da administrao de drogas antimicrobianas

pode levar ao aparecimento de cepas previamente susceptveis, que adquiriram

resistncia ou proliferao de cepas que so intrinsecamente resistentes. Em geral

a resistncia adquirida por mutao ou pela aquisio de material gentico com

cdigo de resistncia, ou seja, a informao gentica que controla a resistncia

bacteriana aos antimicrobianos codificada no DNA cromossomial e no DNA

extracromossomial, nos plasmdeos (BRAOIOS, 2005).

O uso cada vez maior de antimicrobianos na prtica clnica, assim como

tambm a enorme quantidade de antibiticos utilizados, s vezes usados

indiscriminadamente, na agricultura, na criao de peixes, aves e outros animais,

possibilita condies favorveis para a seleo de microrganismos resistentes

(TOMAZ, 1994; BRAOIOS, 2005). Essa presso ambiental proveniente do uso

excessivo de agentes antimicrobianos evidentemente contribuiu para disseminar os

determinantes de resistncia. Praticamente todas as bactrias patognicas

adquiriram genes de resistncia antimicrobiana (FILE Jr., 2000).

Muitos fatores contribuem para o desenvolvimento da resistncia bacteriana

s substncias antimicrobianas, porm um dos principais fatores a exposio

repetida, concentrao de antimicrobianos, abaixo do ideal. Dados farmacolgicos

que descrevem a relao entre concentrao da droga no soro e seus efeitos

farmacolgicos podem ser teis em esquemas de tratamento que minimizam a

probabilidade de exposio dos patgenos a nveis subletais de drogas (BURGESS,

2000).

40

3.3.1 Mecanismos genticos de aquisio de resistncia aos antimicrobianos

Mltiplos, complexos e ainda no totalmente conhecidos, so os mecanismos

reguladores da expresso de resistncia pelos quais os microrganismos podem

sobreviver aos efeitos dos antimicrobianos (MARANGONI, 1997; NOVAK, 2000).

Entre os vrios mecanismos, incluem-se os de resistncia adquirida, tais como:

alterao da estrutura molecular de antimicrobianos ou produo de enzimas que

inativam a droga ou modificam grupos funcionais farmacologicamente importantes

presentes em sua estrutura, criando funes inativas para o reconhecimento

molecular (por exemplo: -lactamases ou enzimas modificadoras de

aminoglicosdeos), alterao das protenas ligantes da penicilina ou outros pontos-

alvo nas paredes das clulas, alvos modificados da DNA-girase, mutaes de

permeabilidade, que restringe a penetrao de alguns compostos (as bombas de

resistncia multidrogas MDRs), efluxo contnuo do antibitico (resistncia a

tetraciclina e fluorquinolonas) modificaes ribossmicas e rotas metablicas

alternativas (DYKE; RICHMOND, 1967; FILE Jr., 2000; STERMITZ et al., 2000;

TEGOS et al., 2002; FUCHS, 2004; MOREIRA, 2004).

A utilizao de um ou mais desses mecanismos, permite que linhagens

bacterianas consigam reprimir a ao at dos antimicrobianos mais promissores,

independentemente da classe qumica a qual pertenam (SILVEIRA et al., 2006b).

A resistncia aos antimicrobianos pode ser mediada por intercambio gentico

e por mutaes cromossmicas. Pode ser transferida entre bactrias pelos

plasmdeos, transposons, ou pelos mecanismos de insero seqencial. Entretanto

a forma mais eficaz e poderosa de propagao da informao gentica ocorre por

intermdio dos plasmdeos R tambm conhecidos como Fatores R, que so

plasmdeos conjugativos capazes de conferir, aos microrganismos, resistncia a

diversos grupos de antimicrobianos (TRABULSI et al., 2006).

Grande parte da resistncia de diversos microrganismos, s drogas, de

natureza extracromossmica, isto , determinada por plasmdeos portadores de

genes para essa finalidade (LYON, SKURRAY, 1987). A transferncia plasmidial

pode ser dividida em quatro estgios: formao de uma unio especfica, doador-

receptor (contato efetivo); preparao para transferncia do DNA (mobilizao);

transferncia do DNA; e formao de um plasmdeo funcional replicativo no receptor.

Nem todos os plasmdeos so capazes de desenvolver todos estes estgios,

41

portanto, de acordo com sua funcionalidade os plasmdeos so classificados como:

conjugativos, mobilizveis e autotransmissveis (TRABULSI et al., 2006).

O uso constante e inadequado de antimicticos e inibidores celulares, em

geral, tm levado seleo de isolados resistentes, tornando estes frmacos pouco

eficientes (ROCHA, 2002). Os primeiros dados de resistncia aos antifngicos

ocorreram em pacientes com candidase muco-cutnea, tratados com cetoconazol,

principalmente em pacientes imunocomprometidos pela infeco com o vrus da

AIDS (Sndrome da Imunodeficincia Adquirida), pela quimioterapia de pacientes

com cncer ou nos transplantados. O desenvolvimento de resistncia aos azis

precede o uso prolongado e repetido do fluconazol na teraputica de pacientes com

candidase oral e esofgica (RUHNKE, et al, 1994).

Os principais grupos de antifngicos de uso clnico so os polienos, os

derivados azlicos e os alilaminas/tiocarbamatos, todos interagem com o ergosterol,

principal esterol presente na membrana plasmtica da maioria dos fungos (ZARDO;

MEZZARI, 2004). O ergosterol necessrio na manuteno da permeabilidade e

fluidez da membrana garantindo a modulao de enzimas ligadas membrana

plasmtica. A ausncia do ergosterol e o acmulo de seus precursores afetam a

estrutura da membrana plasmtica e a absoro de vrios nutrientes, tornando o

fungo vulnervel a danos (ROCHA, 2002).

Os principais mecanismos de resistncia aos antifngicos esto relacionados

s alteraes na rota da biossntese do ergosterol e da expresso do gene ERG 11

envolvidos na sntese da enzima 14 alfa-demetilase (14 DM) que reduz o acmulo

intracelular do frmaco e/ou inativao do mesmo (MORSCHHUSER, 2002).

necessrio conhecer os mecanismos da resistncia das espcies de

Candida para auxiliar no desenvolvimento de estratgias em novas aes

teraputicas.

O Quadro 1 apresenta de modo simplificado alguns dos mais comuns

mecanismos de resistncia aos antimicrobianos.

42

Quadro 1. Mecanismos de resistncia aos antimicrobianos

Antimicrobianos Mediao

por plasmdeos

Mecanismos de resistncia

Penicilinas e Cefalosporinas Sim

Hidrlise do anel -lactmico pelas -lactamases. Alvo alterado, permeabilidade alterada, inativao do agente.

Tetraciclinas Sim Bomba de Efluxo; Deficincia no transporte ativo da tetraciclina.

Aminoglicosdeos Sim

Modificao enzimtica da substncia pela ao de enzima codificada por plasmdeos R. Alvo alterado, permeabilidade alterada, inativao do agente.

Macroldeos (Eritromicina) Sim

Modificao enzimtica (metilao do RNA ribossmico 23S). Alvo alterado, permeabilidade alterada, inativao do agente.

Quinolonas No Mutao espontnea da DNA-girase e outras enzimas-alvo; Alterao da permeabilidade s quinolonas.

Meticilina No Modificao das protenas ligadoras de penicilina (no em -lactamases)

Azis, Anfotericina e Nistatina No

Modificao da permeabilidade da membrana citoplasmtica fngica. Alteraes na biossntese do esterol.

Griseofulvina No Modificao da sntese de cido nuclico.

Fonte: Adaptado de SCHAECHTER et al., 2002; MIMS et al., 2005.

3.3.2 Plasmdeos

A caracterizao de plasmdeos compreende entre outros estudos, a

determinao do seu grupo de incompatibilidade, a verificao de sua capacidade

de transferncia e mobilizao e determinao do seu peso. Este tipo de anlise

permite informaes sobre as relaes filogenticas e a origem de uma determinada

43

amostra bacteriana e tambm sobre os tipos de plasmdeos que ela possui

(CEBALLOS, 1984).

Entre as vrias propriedades mediadas pelos plasmdeos de maior relevncia

mdica, esto as relacionadas com a resistncia a antibiticos e aos fatores de

virulncia. Existe grande variedade de plasmdeos, diferentes em tamanho,

composio gentica e capacidade de transferncia entre bactrias. Vrios tipos

distintos de plasmdeos penicilinase podem ser encontrados em S. aureus. Essa

diferenciao est baseada na proporo da produo da enzima penicilinase e na

degradao dessa enzima extracelularmente (DYKE; RICHMOND, 1967).

Alguns plasmdeos realizam sua prpria transferncia entre bactrias da

mesma espcie ou de espcies diferentes, estes so chamados de plasmdeos de

conjugao. Muitos plasmdeos de resistncia a antibiticos, tambm so

plasmdeos de conjugao. Alguns apresentam capacidade de se replicar em

diferentes hospedeiros e propagar a resistncia s drogas entre espcies

bacterianas no-relacionadas. Esses plasmdeos contribuem para o drstico

aumento da resistncia antimicrobiana em populaes naturais (SHCAECHETER et

al., 2002).

Os plasmdeos transferveis podem possuir genes que apresentam cdigo de

transferncia em relao a uma ampla gama de drogas antimicrobianas. Assim, para

os microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos, uma nica transferncia pode

resultar na aquisio de vrios determinantes de resistncia microbiana. A

resistncia antimicrobiana um problema emergente na medicina humana e exige

uma mudana na terapia emprica e reviso das estratgias dos procedimentos de

testes. A velocidade na qual se desenvolvem os microrganismos est relacionada

sua exposio aos agentes antimicrobianos (TENOVER, 2000).

Certos plasmdeos, como o plasmdeo R, amplamente distribudo,

transportam um ou mais transposons, elementos de transposio de regies de

DNA, responsveis por resistncia a drogas (Figura 01). A capacidade desses

determinantes de saltar de um plasmdeo para outro, propicia s bactrias a

capacidade de se adaptarem a ambientes hostis, como o de hospitais, comumente

inundado por antibiticos. Nesses tipos de ambientes, as bactrias podem tornar-se

resistentes a antibiticos pela aquisio de genes de resistncia. Devido presso

seletiva, os plasmdeos R podem adquirir muitos transposons com novos genes de

44

resistncia a drogas e como muitos desses plasmdeos R so de conjugao, a

resistncia a mltiplas drogas pode disseminar-se entre vrios tipos de bactrias

(SCHAECHTER et al., 2002).

Figura 1. Plasmdeo de resistncia Fonte: Tortora et al., 2000

3.3.3 Transposons (Tn)

Elementos de transposio, ou transposons, so regies de DNA que podem

se transferir de uma regio para outra do genoma, deixando ou no uma cpia no

local antigo onde estavam. A transposio pode ser para o mesmo cromossoma,

para outro cromossoma, para um plasmdeo ou para um fago. Foram descobertos

em torno de 1950, por Barbara McClintock, inicialmente no milho e bem mais tarde

em bactrias; esto presentes em todos os organismos (SUZUKI et al., 1998;

TORTORA et al., 2000).

Os transposons podem ser divididos em duas classes: transposons

compostos, onde duas cpias de um elemento IS (Seqncia de Insero) idntico

flanqueiam genes de resistncia aos antimicrobianos, como por exemplo, a resistncia a canamicina no Tn5; e transposons simples, como o Tn3, que codifica

resistncia aos -lactmicos (MIMS et al., 2005).

Existe uma enzima associada com a transposio, denominada transposase,

que normalmente codificada pelo prprio elemento de transposio, que, portanto,

carrega consigo o mecanismo para a transposio. Outros elementos importantes da

transposio so as extremidades do mesmo, geralmente repeties invertidas na

faixa de 30bp (pares de base). A freqncia de transposio comparvel taxa de

45

mutao espontnea que ocorre nas bactrias, geralmente baixa em torno de 10-5

a 10-7 por gerao. Os transposons so teis na engenharia gentica por

transportarem genes exgenos, de possvel interesse clnico, como o gene da

resistncia a antimicrobianos (SCHAECHTER, et al., 2002; TORTORA et al., 2000).

3.4 Aspectos botnicos e fitoqumicos da Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae)

3.4.1 Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae)

A famlia Lauraceae considerada uma das famlias mais primitivas

pertencente diviso Magnoliophyta, e apresenta-se amplamente distribuda atravs

das regies tropicais e subtropicais do planeta, sendo formada por 49 gneros e

cerca de 3.000 espcies. Os primeiros registros relativos utilizao desta famlia

datam 2.800 a.C. sendo originrios da Grcia antiga. O destaque da famlia se d

pela sua importncia econmica, onde algumas espcies so utilizadas pela

indstria para fabricao de diversos produtos, porm, a maioria das espcies tem

seu uso restrito s comunidades tradicionais que detm o conhecimento emprico da

utilizao destas plantas (MARQUES, 2001).

No gnero Aniba, estabelecido por Aublet (1775), incluem-se 41 espcies

classificadas em seis subgrupos. Sua distribuio se estende desde as Antilhas,

Guianas, Andes, regies secas do centro e sul do Brasil. Algumas destas espcies,

por exemplo, A. perutilis e A. canelilla so utilizadas na marcenaria, dormentes de

trilhos e em construes durveis (LON; PERNIA, 2000).

Em estudos sobre a anatomia do lenho de oito espcies do gnero Aniba,

incluindo a Aniba riparia, foi observado a cor amarela, odor aromtico e textura

mediana (LON; PERNIA, 2000; MARQUES, 2001). A. riparia rvore de mdio

porte, com folhas cartceas e foscas em ambas as faces, Apresenta reticulao

aureolada, ramos com aproximadamente 3 mm de espessura, marrons e

lenticelados, pecolo canaliculado, engrossado na base e gema terminal menor que

4 mm, arqueadas, pelo menos os pares basais. Folha no papilosa (Figura 2)

(VICENTINI et al., 1999).

46

Figura 2. Foto de exsicata de Aniba riparia Fonte:http://fm1.fieldmuseum.org/vrrc/index.php?language=esp&page=view&id=26963&PHPSESSID=fc4166ccc9368eb31a2ecb8134721b67&PHPSESSID=fc4166ccc9368eb31a2ecb8134721b67

No Brasil A. riparia nativa da regio amaznica, podendo tambm ser

encontrada em outras regies. Dela pode-se obter um extrato dos frutos e dos

clices persistentes que possuem atividade comprovada contra Candida albicans,

Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus (MARQUES,

2001).

3.4.2 Alcamidas de plantas

A condensao qumica de um cido com uma amina resulta na formao de

uma amida. O grupo funcional amida ubquo, se encontra em todos os organismos

vivos constituindo as unies peptdicas, ou seja, a unio entre os aminocidos para

47

formao da estrutura primria das protenas, base funcional da vida (MOLINA-

TORRES; GARCIA-CHVEZ, 2001).

As amidas como produtos naturais, no so abundantes. Um exemplo

interessante deste grupo de compostos so as alcamidas que compreendem um

grupo aproximadamente de 70 estruturas conhecidas e distribudas no reino vegetal.

Do ponto de vista biogentico, as alcamidas representam uma classe distinta de

produtos naturais que se forma ao combinar duas diferentes rotas metablicas

(MOLINA-TORRES; GARCA-CHVEZ, 2001). Esto constitudas pela unio de um

cido graxo, de cadeia longa que pode ser de 8 a 18 tomos de carbono. A cadeia

geralmente aliftica ou linear, unida a uma amina proveniente de algum

aminocido por descarboxilao no momento da condensao. Dependendo do

nmero de ligaes duplas que apresentem, as alcamidas so definidas em dois

grupos principais: alcamidas alifticas, que tem apenas duplas ligaes e alcamidas

acetilnicas, com pelo menos uma ligao tripla (MOLINA-TORRES; GARCA-

CHVEZ; RAMREZ-CHVEZ, 1999) e as que apresentam anis homo ou

heterocclicos que so mais observadas na famlia Piperaceae (PARMAR et al.,

1997).

As alcamidas so consideradas como compostos bioativos, visto que uma

pequena quantidade destes compostos produz uma resposta em clulas receptoras.

So encontradas em vrios grupos de plantas, dos quais os mais importantes esto

presentes nas famlias Asteraceae, Solanaceae e Piperaceae. Cada uma delas tem

suas prprias caractersticas individuais, porm interessante citar que suas

molculas apresentam estruturas qumicas relacionadas. As alcamidas alifticas tm

demonstrado sua eficcia como compostos medicinais, saborizantes e no controle

biolgico, sendo desta forma um grupo de metablitos de grande interesse na

atualidade (MOLINA-TORRES; GARCA-CHVEZ, 2001).

3.4.3 Riparinas

Riparinas so alcamidas presentes na A. riparia e obtidas por sntese, aps

condensao de duas molculas, o ter metlico da tiramina e cido 2-

hidroxibenzico, mais conhecido como cido saliclico (BARBOSA-FILHO, 1997).

48

De acordo com Seixas (1996), a sntese das riparinas, pode ser dividida em 5

grupos:

1. Acoplamento do ter metlico da tiramina com cloreto de benzoila (riparina I),

2. Acoplamento do ter metlico da tiramina com o salicilato de metila (riparina II),

3. Acoplamento do ter metlico da tiramina com os steres dos respectivos cidos:

2,6 dihidroxibenzico (riparina III), 2,5 dihidroxibenzico (riparina IV), 2,4 dihidroxibenzico (riparina V),

4. Metilao da Riparina 3 por diazometano (riparina VI)

5. Acoplamento do ster metlico da tiramina com os cidos:

2-hidroxi-5-metoxibenzico (riparina VII), 2-hidroxi-4-metoxibenzico (riparina VII), 3-hidroxi-4-metoxibenzico (riparina IX), 3-metoxibenzico (riparina X), 3,4-dimetoxibenzico (riparina XI), 3,5-dimetoxibenzico (riparina XII), 3,4,5-trimetoxibenzico (riparina XIII), 3,4-metilrnodioxibenzico (riparina XIV).

Atividades biolgicas A descoberta de atividade antimicrobiana de amidas isoladas da A. riparia,

induziu o estudo de suas caractersticas qumicas e atividade biolgica (BARBOSA-

FILHO; SILVA; BHATTACHARYYA, 1990). Estas alcamidas naturais, riparinas,

atravs de estudos farmacolgicos in vitro, apresentaram atividade antimicrobiana,

antimalrica, schistossomicida e moluscicida (CASTELO-BRANCO,1992).

Aps a sntese, as alcamidas foram submetidas a uma triagem farmacolgica,

cujo principal efeito observado foi uma diminuio da presso arterial e freqncia

cardaca, em ratos acordados e no estressados. De todas as alcamidas avaliadas,

apenas as riparinas II, III, IV e V na dose 1mg/kg, por via intravenosa (i.v.),

apresentaram efeito significativo sobre a presso arterial (SEIXAS, 1996). As

49

riparinas mostraram tambm, potente efeito relaxante quando utilizadas em

preparaes com leo de cobaia, tero de rata e aorta de coelho (SEIXAS, 1996).

Entre outros efeitos observados pelas riparinas I, II e III, pode-se citar

atividade anti-inflamatria (ARAJO et al., 2006), relaxante muscular (MARQUES et

al., 2005), citotxica para linfoblastos L929 (SILVEIRA et al., 2006), ansioltico

(SOUSA et al., 2004; MELO et al., 2006) e anticonvulsivante (LEITE et al., 2006).

Mecanismos de ao Embora se reconhea que as riparinas possuem propriedades

antimicrobianas, poucas so as informaes de como elas atuam, de modo que o

seu mecanismo de ao ainda no foi elucidado. Porm importante enfatizar que a

caracterstica hidrofbica, de sua molcula poder permitir relacionar-se com

lipdeos da membrana celular bacteriana promovendo desarranjos estruturais e

tornando-a mais permevel. Entre outras possibilidades de mecanismo de ao,

pode-se supor: degradao da parede celular bacteriana, danos membrana

citoplasmtica, danos s protenas de membrana, diminuio da fora de prtons na

cadeia de transporte de eltrons da membrana.

A maior resistncia das bactrias Gram negativas aos antimicrobianos , em

parte, devido grande complexidade da composio da dupla camada lipdica da

sua membrana celular, em contraste com as estruturas nicas encontradas nas

membranas de glicoprotenas em bactrias Gram positivas e do -glucano, em

fungos